CN114657106B

CN114657106B - 一株植物乳植杆菌及其在防治痤疮中的应用

Info

Publication number: CN114657106B
Application number: CN202210423122.6A
Authority: CN
Inventors: 段治; 崔洪昌; 张景燕; 郭超群; 吴松洁; 李凯玲; 步欣萍
Original assignee: QINGDAO VLAND BIOTECH Inc; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: QINGDAO VLAND BIOTECH Inc; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2022-04-21
Filing date: 2022-04-21
Publication date: 2023-11-21
Anticipated expiration: 2042-04-21
Also published as: CN114657106A

Abstract

本发明提供一株新的植物乳植杆菌，其保藏号为CCTCC NO：M2021594。所提供的植物乳植杆菌分离自泡菜发酵液中，能够减轻皮肤炎症，改善皮肤健康状况，预防及缓解痤疮症状。本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi E15株对人工肠胃液具有很强的耐受性；该菌株对红霉素和氨苄西林等常见的抗生素敏感；能够发酵葡萄糖产酸不产气。通过共凝集试验和抑菌圈试验证实，植物乳植杆菌VHProbi E15能够对痤疮丙酸杆菌产生明显的抑制作用。以植物乳植杆菌VHProbi E15裂解液为唯一功效成分制备的净痘精华霜，经人体试验证实能够有效减轻轻中度痤疮严重程度。本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi E15，对机体无毒害作用，可以添加在护肤品中，用于治疗痤疮，具有广阔的应用前景。

Description

一株植物乳植杆菌及其在防治痤疮中的应用

技术领域

本发明属于益生菌筛选与应用技术领域，具体涉及一株具有治疗痤疮作用的植物乳植杆菌及其应用。

背景技术

皮肤是人体可与微生物互动的上皮表面，此表面是一种动态的界面，而非不透水的屏障，皮肤的微生物组可以延伸至真皮和真皮脂肪。人体皮肤是一个独特的环境，具有与其他灵长类不同的微生物组，皮肤微生物组具有多样性高、部位特异和稳定的特点；具体表现出某些种属占优势，而整体多样性程度较低的特点。健康皮肤的微生物分属于19个不同门和200个属，而机体皮肤不同部位微生物构成不同，比如痤疮丙酸杆菌在皮脂腺发达的皮肤区域上是一种常见菌，在不同环境的皮肤中，例如干燥的皮肤区域，则是葡萄球菌和链球菌占主导；而不同位点之间皮肤微生物共有的特性反映出皮肤生理之间的共性。

通过对痤疮发病机制研究后，科研人员普遍认为发病机制主要包括：内分泌功能失调，雄性激素分泌增多引起皮脂腺皮脂分泌增多；毛囊皮脂腺导管异常角化导致管径变狭窄，皮脂和正常脱落细胞的***受阻；局部病原体感染。目前痤疮治疗药物包括维甲酸、抗生素、皮质类固醇激素、抗雄性激素药物、抗皮脂溢药，物理治疗包括可见光及激光疗法。但现有疗法大多存在治疗费用高、治疗周期长、药物毒副作用大的问题。因此，寻找一种新型痤疮缓解方案势在必行。

益生菌是活的微生物，当施以足够数量时能够对宿主带来健康益处。益生菌作为新一代的皮肤病抗菌生物制剂已经具备替代抗生素疗法的潜力，能够弥补抗生素、激素药物治疗带来的耐药性增加、复发率高等缺点。据报道，Fabbrocini等发现，寻常痤疮患者口服益生菌混合物一个月后，血清中抗炎细胞因子IL-10水平显著提高，表明口服益生菌可以通过调节炎症反应作为寻常痤疮的辅助治疗手段。Rahmayani等发现，服用含鼠李糖乳杆菌SP1液体的患者与服用不含该菌株液体的患者相比，前者恢复了与胰岛素信号相关基因的表达，并且痤疮外观得到改善。尽管世界卫生组织规定活的微生物才能被视为益生菌，但是有证据表明热灭活的益生菌也可以发挥免疫调节作用。因此，使用益生菌制剂作为有效成分防治痤疮成为近年来的研究热点。益生菌制备的后生元可以作为一种潜在的皮肤疾病治疗策略，开发具有防治痤疮功效的益生菌株具有重要的社会效益和经济价值。

发明内容

本发明的目的是提供一株新的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)，所提供的植物乳植杆菌分离自泡菜发酵液中，能够减轻皮肤炎症，改善皮肤健康状况，预防及缓解痤疮症状。

本发明所提供的植物乳植杆菌，为植物乳植杆菌VHProbi E15株(Lactiplantibacillus plantarum VHProbi E15)，已于2021年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2021594。

所述植物乳植杆菌VHProbi E15株，其16s rDNA序列为SEQ ID NO:1。

本发明所提供的植物乳植杆菌VHProbi E15株，其Riboprinter指纹图谱如图3所示；其MALDI-TOF核糖体蛋白分子量图谱如图4所示；其RAPD指纹图谱如图5所示；rep-PCR指纹图谱如图6所示。

本发明所提供的植物乳植杆菌可用于制备功能性食品、保健品、药品或护肤品。

本发明提供的植物乳植杆菌可用于制备具有抗氧化功能的制品。

本发明提供的植物乳植杆菌可用于制备预防或治疗痤疮的制品。

本发明还提供了一种用于预防或治疗痤疮的制品，其中包含有植物乳植杆菌VHProbi E15株的活菌和/或其发酵产物。

本发明还提供了一种用于预防或治疗痤疮的制品，其中包含有植物乳植杆菌VHProbi E15株的裂解液。

本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi E15株对人工肠胃液具有很强的耐受性；该菌株对红霉素和氨苄西林等常见的抗生素敏感；该菌株能够在15℃条件下生长，45℃不生长，最大耐受盐浓度为7％，能够发酵葡萄糖产酸不产气；胆固醇降解率为16.24％；皮肤细胞黏附力为2.65。通过共凝集试验和抑菌圈试验证实，植物乳植杆菌VHProbi E15能够对痤疮丙酸杆菌产生明显的抑制作用。

以植物乳植杆菌VHProbi E15裂解液为唯一功效成分制备的净痘精华霜，经人体试验证实能够有效减轻轻中度痤疮严重程度，在使用4周后能显著减小患者的痘面积，受试者的皮肤颜色变淡。经皮水分流失速率显著下降，皮肤油脂显著减少。此外，受试者的毛孔面积/AOI面积(mm²)、皮肤角质层含水量、皮肤酸碱度与基础值相比也得到改善。净痘精华霜使用4周后能有效发挥控油祛痘，修复皮肤屏障的功效。

本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi E15，对机体无毒害作用，可以添加在护肤品中，用于治疗痤疮，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为E15菌株单菌落照片图；

图2为E15菌株API 50CH鉴定结果图；

图3为E15菌株Riboprinter指纹图谱图；

图4为E15菌株MALDI-TOF核糖体蛋白指纹图谱图；

图5为E15菌株的RAPD指纹图谱图；

图6为E15菌株的rep-PCR指纹图谱图；

图7为E15菌株与痤疮丙酸杆菌共凝集试验结果图；

图8为E15菌株抑制痤疮丙酸杆菌牛津杯试验结果图；

图9为受试者面部痤疮改善例图。

具体实施方式

本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi E15符合法规要求，经多相分类学鉴定，植物乳植杆菌VHProbi E15为一株新发现的菌株。本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi E15能够有效预防和缓解轻中度痤疮，单独使用该菌株且无需与益生元和/或其它益生菌复配即可对痤疮有缓解功效；具有重要的应用价值。

申请人于2021年5月24日将所述植物乳植杆菌VHProbi E15保藏于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2021594。

本发明所述筛选方法并不局限于实施例所述，已知的能够达到筛选目的的方法均可以，实施例的筛选说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

下面结合具体实施例对本发明做详细的描述。

实施例1植物乳植杆菌VHProbi E15的分离筛选

1、初筛

配制MRS琼脂培养基调pH 6.2-6.5，121℃高压灭菌15min。

取1mL泡菜发酵液，经无菌生理盐水稀释后放入无菌样品袋中，用匀浆仪拍打混匀；取100μL混匀液梯度稀释，涂布于MRS琼脂培养基后于37℃厌氧培养48h，待平板长出单菌落镜检。根据镜检结果，申请人共筛选出18株潜在乳酸杆菌，分别命名为E1、E2、……、E13、E14、E15、E16、E17、E18。

2、复筛

配制1L的MRS液体培养基121℃高压灭菌15min，待培养基冷却后加入3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中水浴1h制成耐酸性培养基。

将筛选得到的18株乳酸杆菌E1、E2、……、E13、E14、E15、E16、E17、E18按6％接种量分别接种于上述耐酸性培养基中，37℃条件下厌氧静置培养48h，取发酵液进行菌量计数。

结果显示，E15菌株经耐酸性培养基复筛后活菌量最多，对数值高达7.28Log CFU/mL。从而说明E15菌株耐酸能力最高。

实施例2菌株鉴定

1、菌落形态鉴定

将E15菌株接种于MRS琼脂培养基上，37℃厌氧培养24h后，可见E15单菌落呈乳白色，菌落直径在2-3mm左右，表面湿润光滑呈圆形，菌落照片如图1所示。

2、生理生化特性鉴定

本实施例中接种液的准备如下：在无菌条件下，取适量新鲜E15菌液，5000rpm/min离心5min，用PBS缓冲液洗2次，再用同体积PBS缓冲液重悬菌体后稀释50倍，作为接种液。

2.1、温度耐受性试验

取适量新鲜菌液(24h，37℃)，5000rpm离心5min，用PSP溶液洗一次，再用同体积PSP溶液重悬后稀释50倍，作为接种液。

将接种液按10％的接种量接种到10mL MRS液体培养基中，不接菌的5mL MRS液体培养基作为对照，分别置于15℃恒温培养箱培养7天，45℃恒温培养箱培养2天，观察菌液是否变浑浊。

结果显示，E15菌株在15℃正常生长，45℃不生长。

2.2、盐度耐受性试验

在无菌条件下，向96孔板中分别加入190μL盐浓度为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％的BSM液体培养基，每个盐浓度做3个平行，然后再加入10μL接种液，不接菌的孔作为对照。每孔加入50μL高压灭菌过的石蜡油以防止培养过程中水分蒸发。置于37℃恒温培养，观察培养基是否变浑浊。

结果显示，E15菌株最大耐受盐浓度为7％。

2.3、碳源代谢试验

利用API 50CH试剂条对E15菌株进行碳源代谢实验，实验方法及结果判读具体参见API 50CH试剂盒说明书。E15菌株鉴定结果为：％ID＝99且T值＝1，API结果为植物乳植杆菌，鉴定评语为极好的鉴定，代谢试验结果如图2所示。

2.4、葡萄糖产酸产气试验

本实施例中所用的培养基配方如下：

蛋白胨0.5g；酵母提取物0.3g；吐温80 0.1mL；盐溶液A 0.5mL；盐溶液B 0.5mL；乙酸钠0.5g；葡萄糖2.5g；2％溴甲酚绿(w/v)0.05mL；蒸馏水100mL；pH6.8～7.0。

将配制好的培养基分装至含有倒置小试管的大试管中，3mL/管，121℃，高压灭菌15min。

盐溶液A成分：KH₂PO₄ 10g、K₂HPO₄ 1.0g，溶于蒸馏水，定容至100mL。

盐溶液B成分：MgSO₄·7H₂O 11.5g、MnSO₄·2H₂O 2.4g、FeSO₄·7H₂O 0.68g，溶于蒸馏水，定容至100mL。

在无菌条件下，将接种液按10％的接种量接种培养基，不接菌的培养基作为对照，然后用2mL无菌液体石蜡封住顶部，置于37℃培养24h,观察培养基颜色有无变化。

结果显示：37℃培养24h后，培养基由绿色变为黄色，小倒管内无气体，说明E15菌株发酵葡萄糖产酸，不产气。

3、分子生物学鉴定

3.1 16s rDNA基因序列分析

3.1.1、基因组DNA提取

参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP302)操作。

3.1.2、16s rDNA基因扩增

引物序列：

27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA；

1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。

通过测序获得E15菌株的16s rDNA序列SEQ ID NO:1，并将该序列在NCBI数据库中进行比对，初步确定E15菌株为植物乳植杆菌。

3.2 Riboprinter指纹图谱

用一根取菌棒从琼脂培养基平板上沾取已纯化好的单菌落，将其放入有缓冲液的样品管中，用手持搅拌器搅拌使其在缓冲液中悬浮，然后将样品架放入加热器中灭活后放入Riboprinter***中，样品经过DNA制备、转膜、成像检测及数据处理后，得到细菌鉴定结果。鉴定结果显示，E15菌株为植物乳植杆菌，其Riboprinter指纹图谱结果见图3。

3.3 MALDI-TOF-MS检测菌株核糖体蛋白表达

按照0.1％的接种量在MRS液体培养基中接种新鲜菌液，37℃，150rpm培养48h后，收集菌体，无菌水洗涤4次，晾干表面水分。然后取少量新鲜菌体以薄膜的形式均匀涂布于靶板上，加1μL裂解液覆盖样品，晾干后，再加1μL基质溶液覆盖样品，晾干后，将样品靶放入质谱仪进行鉴定。用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，使样品中蛋白质电离，离子在10～20KV电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同检测蛋白质的分子量。利用Autofms 1000分析软件Autof Analyzer v1.0获取蛋白指纹图谱，E15菌株主要核糖体蛋白的离子峰为：m/z5201.363、7887.113、5734.785、7303.595、5185.929、5421.786、7878.099、3943.720。鉴定结果如图4所示。

3.4 RAPD和rep-PCR指纹图谱鉴定

3.4.1、RAPD指纹图谱鉴定

1)引物序列：GAGGGTGGCGGTTCT。

2)RAPD反应体系

表1：RAPD反应体系表

3)电泳

制备1.5％的琼脂糖凝胶板，DL2000 DNA Marker作为结果对照，稳压100V电泳80min，最后利用凝胶成像***检测电泳图。E15菌株的RAPD指纹图谱如图5所示。

3.4.2、rep-PCR指纹图谱

1)引物序列：CTACGGCAAGGCGACGCTGACG。

2)rep-PCR的反应体系

表2：rep-PCR的反应体系表

3)电泳

DL2000 DNA Marker作为结果对照。电压100V，电泳时间80min检测扩增结果。E15菌株rep-PCR指纹图谱如图6所示。

3.5全基因组测序

取新鲜E15菌液按照1％的体积比例接种到500mL MRS肉汤培养基中，37℃培养20h，8000rpm离心10min，收集菌体。菌体送到测序中心，得到该菌的全基因组序列。将全基因组序列上传至NCBI基因数据库，GenBank登录号为CP094961-CP094962。

将E15菌株的菌落形态以及生理生化特性结果上传至http://www.tgw1916.net/bacteria_logare_desktop.htmL，同时结合文献De Clerck E，et al.Systematic andapplied microbiology,2004,27(1)50公布的结果进行比对。综合分子生物学的鉴定结果，确定E15菌株为一株新的植物乳植杆菌，将其命名为植物乳植杆菌VHProbi E15(Lactiplantibacillus plantarum VHProbi E15)。

实施例3植物乳植杆菌VHProbi E15对人工胃液和人工肠液的耐受性试验

1、人工胃液的配制

分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g和NaCl 2g，加入1000mL蒸馏水，用稀盐酸调pH3.0，然后115℃灭菌20min。然后使用前加入3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中温水浴1h，以模拟人体温度。

2、人工肠液的配制

分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g、KH₂PO₄ 6.8g和牛胆盐3.0g，加入77mL的0.2mol/L的NaOH溶液，定容至1000mL，用稀盐酸或者氢氧化钠溶液调pH6.8±0.1，115℃灭菌20min。然后使用前加入1g胰酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中温水浴1h，以模拟人体温度。

3、试验方法

取2mL新鲜菌液，5000rpm/min离心5min收集菌体，菌体用生理盐水洗涤3次，再用2mL生理盐水重悬，作为接种液。取1mL接种液，加入到24mL人工肠液中，置于37℃水浴摇床(200rpm/min)3h，取样1mL，检测活菌量。

活菌计数方法按照国标《GB4789.35-2016-食品微生物检验乳酸菌检验》测定菌量，该菌株经过人工肠液消化后的活菌量(Log CFU/mL)见表3。

表3：人工胃肠液消化后的活菌量表

从表3可知，本发明筛选到的植物乳植杆菌VHProbi E15经人工胃液消化后活菌量仅有少量下降，继续经过人工肠液消化后活菌量仅降低1.2Log值左右，说明该菌株对人工肠胃液具有较强的耐受性。

实施例4植物乳植杆菌VHProbi E15的抗生素耐受性实验

1、抗生素配制：氨苄青霉素、克林霉素、红霉素、庆大霉素、链霉素、四环素、万古霉素均配制成2048μg/mL的贮存液，-20℃保存备用。使用时将贮存液用BMS液体培养基进行2倍系列梯度稀释成使用液，梯度稀释浓度为1～1024μg/mL共11个梯度。

2、接种液制备：接种液的准备：取适量新鲜菌液(24～48h，40℃培养)，5000rpm离心5min，用无菌生理盐水洗一次，再用同体积生理盐水重悬菌体后稀释50倍，作为接种液。

3、微量肉汤稀释法测定抗生素对植物乳植杆菌VHProbi E15的最小抑菌浓度MIC。

a.96孔板第1列加入不含抗生素的BMS液体培养基，作为阴性对照，向第2～12列依次加入190μL含不同浓度抗生素的BMS液体培养基，然后分别接种10μL上述接种液，做3个平行孔，并以1个孔不加菌液作为空白。

b.加入50μL石蜡油覆盖防止水分蒸发。

c.将96孔板于40℃振荡培养48h后取出，测定OD600值，用48h的结果统计抗生素对菌株的MIC值，具体结果见表4。

表4：植物乳植杆菌VHProbi E15的抗生素MIC值(μg/mL)表

从表4的结果可以看出，本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi E15对红霉素和氨苄西林等常见抗生素敏感，生物安全性良好。

实施例5植物乳植杆菌VHProbi E15体外胆固醇降解实验

1.胆固醇胶束溶液的配制：准确称取1g胆固醇，溶于无水乙醇中，并定容至100mL，在无菌条件下用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

2.称取蛋白胨10.0g牛肉膏10.0g酵母膏5.0g柠檬酸氢二铵2.0g葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g硫酸镁0.1g硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2.0g,胆盐1g，蒸馏水1000mL调节pH值7.3，115℃灭菌30min，然后加入胆固醇溶液使胆固醇终浓度为0.1％。按照0.1％的接种量接种植物乳植杆菌VHProbi E15新鲜菌液，37℃静止培养48h，然后取0.2mL菌液，加入1.8mL无水乙醇，混匀，静止10分钟，3000转离心5分钟，取上清液用于测定胆固醇含量。胆固醇测定方法按照GB/T5009.128-2003<食品中胆固醇的测定>。

结果显示：本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi E15对胆固醇的降解率达到16.24％(此为不含胆盐的数据)。

实施例6植物乳植杆菌VHProbi E15的Caco-2细胞黏附力试验

Caco-2细胞以2×10⁶cells/孔的接种量接种于六孔板，二氧化碳培养箱培养24h，用于细胞粘附实验；

将稳定期的菌株用MRS培养基重悬至5×10⁷CFU/mL；

取1mL上述菌株加入已有细胞贴壁的六孔板，二氧化碳培养箱培养2h；

PBS反复洗涤3次，去除未粘附的细菌；

加入500ul胰酶消化3分钟，再加入1.5mL细胞培养液终止消化，反复吹打，并将所得溶液收集至无菌EP管中，并将收集的溶液进行10倍，100倍，1000倍，10000倍梯度稀释，涂板计数。同时对空白组的细胞进行计数。根据以下公式计算供试菌株的粘附能力：

粘附能力(CFU/cells)＝每个培养孔内粘附的细菌总数/每个培养孔的总细胞数。

结果显示：本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi E15的细胞黏附力为2.65，标准差为0.44。

实施例7植物乳植杆菌VHProbi E15对痤疮丙酸杆菌的抑制试验

1.凝集试验

取冷冻保藏的植物乳植杆菌VHProbi E15，无菌操作，划线至MRS平板，37℃培养48～72h。将痤疮丙酸杆菌ATCC6919和痤疮丙酸杆菌ATCC11827接种至BHI肉汤培养基，37℃厌氧培养3～4d。

分别取适量上述活化好的新鲜菌液，6000rpm离心4min，浓缩适合的倍数用tris盐缓冲液洗2次，然后用同种缓冲液重悬。

取植物乳植杆菌菌悬液300μL加入24孔酶标板，再加入300μL痤疮丙酸杆菌混合悬液作为实验组，另取等量的植物乳植杆菌悬液和缓冲液混合作为对照组，每个对照及样本设2平行。将24孔板置于微孔板恒温振荡器，400rpm，室温振荡孵育至少24h。期间每振荡30min停机30min，拍照记录初始孔板状态及每次停机时的孔板状态，观察是否有凝集现象出现。

结果如图7所示：植物乳植杆菌VHProbi E15与痤疮丙酸杆菌共孵育至30h10min后出现交互凝集现象。从而表明，植物乳植杆菌VHProbi E15能有效拮抗痤疮丙酸杆菌，对其生长产生明显抑制作用。

2.抑菌圈试验

取冷冻保藏的植物乳植杆菌VHProbi E15，无菌操作，划线至MRS平板，37℃培养48～72h。待平板长出单菌落后，无菌下挑至MRS肉汤培养基中，37℃静置培养24h。取1mL菌液，5000rpm离心5min得菌泥，用无菌水漂洗2次菌泥，再用2mL无菌的1％蛋白胨溶液复溶待用。

将痤疮丙酸杆菌ATCC11827和痤疮丙酸杆菌ATCC6919接种至强化梭菌培养基，37℃，厌氧培养48h。

铺下层培养基，配置1.5％的琼脂溶液，灭菌后倒入平板中，铺满平板即可。待琼脂凝固后，均匀放置适宜个数的无菌牛津杯。铺上层培养基，上层半固体培养基：强化梭菌培养基加入0.7％琼脂和1％吐温-80，之后稍微加热使吐温-80溶解。121℃灭菌15min，待冷却至不烫手备用(45℃左右)。

将培养48h的2株痤疮丙酸杆菌等量混合，充分混匀后取0.4％(v/v)加入上层半固体培养基中，混匀后，取14mL倾注到下层培养基上。待凝固后取出牛津杯，并在平板底部标记加入的样品。取100uL菌体+蛋白胨溶液加入孔中，另加入1％蛋白胨溶液做对照。抑菌结果观察。培养72h以后，取出平板，观察有无抑菌圈，拍照并用直尺测量抑菌圈的大小。

结果如图8所示：平板均出现明显的抑菌圈，抑菌圈平均直径为29.00±1.00mm。从而说明植物乳植杆菌VHProbi E15能够对痤疮丙酸痤疮杆菌产生明显的抑制作用。

实施例8植物乳植杆菌VHProbi E15裂解液的抗痘功效试验

1.1植物乳植杆菌VHProbi E15裂解液制备

植物乳植杆菌VHProbi E15使用MRS肉汤培养至对数期；

发酵培养基：红糖2％，骨胶原蛋白肽3％，酵母粉0.3％，磷酸氢二胺0.25％；

将活化好的菌株按照1％的接种量加入发酵培养基中，37℃静置发酵24h；发酵结束后，冰浴收集菌体，超声破壁30min，离心取上清液；将上清液75℃加热15min，进行热灭活，得到裂解液。

1.2乳酸菌净痘精华霜的制备：

参照表5所述配方，使用去离子水配制乳酸菌净痘精华霜。其中，含量为8％的植物乳植杆菌VHProbi E15裂解液是乳酸菌净痘精华霜中唯一的功效组分。

表5乳酸菌净痘精华霜配方表

2、人群试验方案

选择18～25周岁且脸部有轻度或中度痤疮的健康受试者20名。受试者每日早晚洁面后使用乳酸菌净痘精华霜，共持续4周。并且分别在使用产品前、连续使用产品1周、2周、3周、4周时拍摄圈梁照片，分别在使用产品前、连续使用产品2周、4周时检测角质层水分含量、经皮水分流失速率、皮肤油脂含量和皮肤酸碱度。本次试验的环境温度为20.4℃～21.5℃，相对湿度为47.7％～51.9％。

3、样本完成情况

3.1纳入标准：

(1)健康人群，年龄在18～45岁；

(2)左右脸部都伴有轻度或中度的痤疮；

(3)能很好配合试验者，在研究期间能保持生活的规律性；

(4)能够阅读和理解知情同意书所有内容，并自愿签署知情同意书；

(5)试验期间同意不使用任何对结果有影响化妆品、药物和保健品。3.2排除标准，凡具有下列任一条件的患者必须排除进入本项研究：

(1)面部有皮肤疾病而可能影响对试验结果判断者；

(2)有高度过敏体质者；

(3)妊娠、哺乳或在试验期间打算怀孕的女性者；

(4)有严重心、肝、肾功能损害及严重免疫功能低下者；

(5)有精神疾病、严重内分泌疾病者以及口服避孕药者；

(6)30天内参加药物临床试验者或其它试验者，或近1周内有用对试验结果有影响的药物者；

(7)14天内有口服和外用可能对试验结果有影响的美容产品者；

(8)不能配合试验者；

(9)研究者认为不适于参加本研究者；

(10)其他相应的排除标准。

表6受试者信息表

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4、试验流程

1)受试者面部清洁并用纸巾吸干水分后，在21±1℃、相对湿度50±10％的功效评价室中静坐20min；

2)技术人员操作CK-MPA、Visia-CR两台仪器对受试者的受试部位进行基础值指标的测定。

5、统计方法

统计分析软件为SPSS。在不同时间点的测量值与基础值比较，采用重复测量方差分析检验水准α＝0.05。

改善率即相对使用前的变化率，计算公式如下：

使用产品1周的△1＝W1-W0；

使用产品2周的△2＝W2-W0；

使用产品3周的△3＝W3-W0；

使用产品4周的△4＝W4-W0；

使用产品1周的改善率＝△1/W0*100％；

使用产品2周的改善率＝△2/W0*100％；

使用产品3周的改善率＝△3/W0*100％；

使用产品4周的改善率＝△4/W0*100％。

其中，W0——受试区使用产品前皮肤参数基础值；

W1——受试区使用产品1周皮肤参数值；

W2——受试区使用产品2周皮肤参数值；

W3——受试区使用产品3周皮肤参数值；

W4——受试区使用产品4周皮肤参数值。

6、检测结果

6.1青春痘占比面积检测结果

表7青春痘占比面积检测结果表

表8 Visia-CR青春痘面积占比统计分析结果表

*显著性标注方法：“n.s.”表示无统计学差异，P≥0.05；P<0.05表示有显著性差异(“*”表示0.01≤P<0.05；“**”表示0.001≤P<0.01；“***”表示P<0.001)。

青春痘面积占比越小，发红症状越不明显。受试者的青春痘面积占比在使用产品4周后与基础值相比有显著性下降，59.1％的受试者的Visia-CR青春痘面积占比减少，其中61.5％受试者的Visia-CR青春痘面积减少了50％。受试者在4周内青春痘占比面积变化如图9所示。

6.2皮肤颜色测试结果

表9皮肤颜色测试结果表

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表10皮肤颜色统计分析结果表

皮肤颜色数值越小，发红症状越不明显。在使用产品4周后，有22.7％受试者皮肤颜色变淡，但是没有显著性差异。

6.3毛孔面积/AOI面积(mm²)试验结果

表11毛孔面积/AOI面积(mm2)检测结果表

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表12毛孔面积/AOI面积(mm2)统计结果表

毛孔面积/AOI面积(mm²)越小，毛孔数越少。受试者的毛孔面积/AOI面积(mm²)在使用产品4周后与基础值相比，有31.8％受试者毛孔面积/AOI面积(mm²)减小，但是不具有显著性差异。

6.4皮肤角质层水分含量试验结果

表13皮肤角质层水分含量试验结果表

表14皮肤角质层水分含量统计结果表

皮肤角质层水分含量越高，皮肤皮肤含水量越多。有59.1％的受试者使用产品4周后与基础值相比皮肤角质层含水量增加，但是不具有显著性差异。

6.5经皮水分流失试验测试

表15经皮水分流失试验测试表

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表16经皮水分流失试验统计结果表

皮肤经皮水分流失数值越低，皮肤屏障功能越好。受试者的经皮水分流失使用产品4周后与基础值相比有显著性下降(P<0.05)。其中，有68.2％的受试者经皮水分流失速率降低，有66.7％的受试者经皮水分流失速率降低20％以上。

6.6油脂含量检测结果

表17油脂含量试验结果表

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表18油脂含量试验统计结果表

油脂含量数值越小，皮肤油脂含量越少。受试者在使用产品四周后皮肤油脂含量与基础值相比有显著性下降(P<0.05),其中有72.7％的受试者皮肤油脂含量出现下降。

6.7皮肤酸碱度平衡

表19酸碱度检测结果表

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表20酸碱度检测统计结果表

正常皮肤呈弱酸性，在4.0-5.5之间。受试者在使用产品四周后与基础值相比有22.7％的受试者皮肤酸碱度出现下降，但是不具有显著性差异。

中轻度痤疮受试者在使用乳酸菌净痘精华霜4周后，青春痘占比面积显著性减少(P<0.01)，其中有59.1％的受试者的Visia-CR青春痘面积占比减少，其中61.5％受试者的青春痘面积减少了50％以上。受试者的经皮水分流失速率显著性下降(P<0.05)，有68.2％的受试者经皮水分流失速率降低，有66.7％的受试者经皮水分流失速率降低20％以上。受试者在使用产品四周后皮肤油脂含量与基础值相比有显著性下降(P<0.05),其中有72.7％的受试者皮肤油脂含量出现下降。另外，受试者的皮肤颜色、毛孔面积/AOI面积(mm²)、皮肤角质层含水量、皮肤酸碱度与基础值相比也得到改善。从而说明，植物乳植杆菌VHProbiE15裂解液在改善轻中度痤疮患者皮肤上效果明显，能达到控油祛痘的功效。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物股份有限公司青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一株植物乳植杆菌及其在防治痤疮中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1432

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cggctggttc ctaaaaggtt accccaccga ctttgggtgt tacaaactct catggtgtga 60

cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact 120

agcgattccg acttcatgta ggcgagttgc agcctacaat ccgaactgag aatggcttta 180

agagattagc ttactctcgc gagttcgcaa ctcgttgtac catccattgt agcacgtgtg 240

tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc 300

accggcagtc tcaccagagt gcccaactta atgctggcaa ctgataataa gggttgcgct 360

cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg 420

tatccatgtc cccgaaggga acgtctaatc tcttagattt gcatagtatg tcaagacctg 480

gtaaggttct tcgcgtagct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc 540

gtcaattcct ttgagtttca gccttgcggc cgtactcccc aggcggaatg cttaatgcgt 600

tagctgcagc actgaagggc ggaaaccctc caacacttag cattcatcgt ttacggtatg 660

gactaccagg gtatctaatc ctgtttgcta cccatacttt cgagcctcag cgtcagttac 720

agaccagaca gccgccttcg ccactggtgt tcttccatat atctacgcat ttcaccgcta 780

cacatggagt tccactgtcc tcttctgcac tcaagtttcc cagtttccga tgcacttctt 840

cggttgagcc gaaggctttc acatcagact taaaaaaccg cctgcgctcg ctttacgccc 900

aataaatccg gacaacgctt gccacctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc 960

cgtggctttc tggttaaata ccgtcaatac ctgaacagtt actctcagat atgttcttct 1020

ttaacaacag agttttacga gccgaaaccc ttcttcactc acgcggcgtt gctccatcag 1080

actttcgtcc attgtggaag attccctact gctgcctccc gtaggagttt gggccgtgtc 1140

tcagtcccaa tgtggccgat taccctctca ggtcggctac gtatcattgc catggtgagc 1200

cgttacccca ccatctagct aatacgccgc gggaccatcc aaaagtgata gccgaagcca 1260

tctttcaagc tcggaccatg cggtccaagt tgttatgcgg tattagcatc tgtttccagg 1320

tgttatcccc cgcttctggg caggtttccc acgtgttact caccagttcg ccactcactc 1380

aaatgtaaat catgatgcaa gcaccaatca ataccagagt tcgttcgact gc 1432

Claims

1.一种植物乳植杆菌，其特征在于，所述的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）的保藏编号为CCTCC NO：M2021594。

2.权利要求1所述的植物乳植杆菌的裂解液在制备预防或治疗痤疮的护肤品中的应用。

3.一种用于预防或治疗痤疮的护肤品，其特征在于，所述的护肤品中包含有权利要求1所述的植物乳植杆菌的裂解液。