JP2019516394A - 新規抗pd−l1抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
HCDR1配列は、TYWX1H(配列番号1)またはその少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)の配列同一性のある相同体配列であり、
HCDR2配列は、MIQPNSGGTKYNX2X3FKX4(配列番号2)またはその少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)の配列同一性のある相同体配列であり、
HCDR3配列は、GAGTVDYFDY(配列番号3)またはその少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)の配列同一性のある相同体配列であり、
LCDR1配列は、RASESVDIYGNSFMH(配列番号4)またはその少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)の配列同一性のある相同体配列であり、
LCDR2配列は、RASNLES(配列番号5)またはその少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)の配列同一性のある相同体配列であり、
LCDR3配列は、X5QSX6X7DPYT(配列番号6)またはその少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)の配列同一性のある相同体配列であり、
X1は、IまたはMであり、X2は、DまたはEであり、X3は、QまたはKであり、X4は、NまたはKであり、X5は、QまたはHであり、X6は、NまたはTであり、X7は、DまたはEである。
HFR2配列は、WVXa8QXa9PGQGLEWIG(配列番号14)であり、
HFR3配列は、Xa10Xa11TLTVDXa12SXa13Xa14TAXa15MXa16LSXa17LXa18SXa19DXa20AVYYCAR(配列番号15)であり、
HFR4配列は、WGQGXa21TLXa22Xa23SS(配列番号16)であり、
LFR1配列は、DIVLTXa24SPXa25SLXa26VSXa27GQRATIXa28C(配列番号17)であり、
LFR2配列は、WYQQKPGQXa29PKLLIY(配列番号18)であり、
LFR3配列は、GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEAXa30DXa31ATYYC(配列番号19)であり、
LFR4配列は、FGGGTKLEXa32K(配列番号20)であり、
Xa1は、QまたはLであり、Xa2は、QまたはVであり、Xa3は、SまたはPであり、Xa4は、LまたはVであり、Xa5は、VまたはKであり、Xa6は、LまたはVであり、Xa7は、T、SまたはIであり、Xa8は、W、KまたはRであり、Xa9は、RまたはAであり、Xa10は、RまたはKであり、Xa11は、VまたはAであり、Xa12は、KまたはTであり、Xa13は、SまたはIであり、Xa14は、SまたはTであり、Xa15は、YまたはSであり、Xa16は、QまたはEであり、Xa17は、S、GまたはRであり、Xa18は、TまたはRであり、Xa19は、EまたはDであり、Xa20は、SまたはTであり、Xa21は、TまたはSであり、Xa22は、SまたはTであり、Xa23は、VまたはIであり、Xa24は、QまたはHであり、Xa25は、AまたはVであり、Xa26は、AまたはTであり、Xa27は、L、AまたはVであり、Xa28は、SまたはTであり、Xa29は、S、PまたはAであり、Xa30は、D、NまたはQであり、Xa31は、VまたはTであり、Xa32は、L、TまたはIであり、Xa33は、FまたはYであり、Xa34は、TまたはQであり、Xa35は、VまたはLであり、Xa36は、DまたはSであり、Xa37は、MまたはLであり、Xa38は、TまたはSであり、Xa39は、FまたはSであり、Xa40は、DまたはQであり、Xa41は、VまたはAであり、Xa42は、VまたはIであり、Xa43は、DまたはAであり、Xa44は、TまたはSであり、Xa45は、YまたはSであり、Xa46は、GまたはRであり、Xa47は、FまたはLであり、Xa48は、SまたはNであり、Xa49は、TまたはPであり、Xa50は、QまたはEであり、Xa51は、VまたはTであり、Xa52は、FまたはYであり、Xa53は、AまたはGである。
HCDR1’配列は、DYYMN(配列番号23)、配列番号29、35、41およびその少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)の配列同一性のある相同体配列からなる群から選択され、
HCDR2’配列は、DINPNNGGTSYNX’1KFX’2G(配列番号24)、配列番号30、36、42またはその少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)の配列同一性のある相同体配列からなる群から選択され、
HCDR3’配列は、VKWGDGPFAY(配列番号25)、配列番号31、37、43およびその少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)の配列同一性のある相同体配列からなる群から選択され、
LCDR1’配列は、X’3ASQNVGAAVA(配列番号26)、配列番号32、38、44およびその少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)の配列同一性のある相同体配列からなる群から選択され、
LCDR2’配列は、SASNX’4X’5T(配列番号27)、配列番号33、39、45およびその少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)の配列同一性のある相同体配列からなる群から選択され、
LCDR3’配列は、QQYSNYPT(配列番号28)、配列番号34、40、46およびその少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)の配列同一性のある相同体配列からなる群から選択され、
X’1は、HまたはQであり、X’2は、KまたはQであり、X’3は、KまたはQであり、X’4は、RまたはLであり、X’5は、YまたはEである。
HFR2’配列は、WVX’a7QX’a8X’a9GX’a10X’a11LEWIG(配列番号48)であり、
HFR3’配列は、X’a12X’a13TVTVDX’a14SX’a15X’a16TAYMELX’a17X’a18LX’a19SX’a20DX’a21AVYYC(配列番号49)であり、
HFR4’配列は、WGQGTLVTVSX’a22(配列番号50)であり、
LFR1’配列は、DIX’a23MTQSX’a24X’a25X’a26X’a27SX’a28SVGDRVX’a29ITC(配列番号51)であり、
LFR2’配列は、WYQQKPGX’a30X’a31PKLLIY(配列番号52)であり、
LFR3’配列は、GVPX’a32RFX’a33GSGSGTDFTLTISX’a34X’a35QX’a36EDX’a37AX’a38YFC(配列番号53)であり、
LFR4’配列は、FGSGTKLGIK(配列番号54)であり、
ここで、X’a1は、QまたはEであり、X’a2は、QまたはVであり、X’a3は、AまたはPであり、X’a4は、LまたはVであり、X’a5は、VまたはKであり、X’a6は、IまたはVであり、X’a7は、KまたはRであり、X’a8は、SまたはAであり、X’a9は、HまたはPであり、X’a10は、QまたはKであり、X’a11は、SまたはGであり、X’a12は、KまたはRであり、X’a13は、AまたはVであり、X’a14は、KまたはTであり、X’a15は、S、TまたはIであり、X’a16は、SまたはRであり、X’a17は、LまたはSであり、X’a18は、SまたはRであり、X’a19は、RまたはTであり、X’a20は、EまたはDであり、X’a21は、SまたはTであり、X’a22は、AまたはSであり、X’a23は、QまたはVであり、X’a24は、QまたはPであり、X’a25は、KまたはSであり、X’a26は、FまたはSであり、X’a27は、MまたはLであり、X’a28は、TまたはAであり、X’a29は、SまたはTであり、X’a30は、QまたはKであり、X’a31は、SまたはAであり、X’a32は、SまたはDであり、X’a33は、SまたはTであり、X’a34は、SまたはNであり、X’a35は、MまたはLであり、X’a36は、SまたはPであり、X’a37は、LまたはIであり、X’a38は、DまたはTである。
本明細書において、「PD−L1」(B7−H1/CD274としても知られる)とは、プログラム細胞死リガンド1(PD−L1、例えば、Freeman et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027を参照のこと)を指す。胎盤、脾臓、リンパ節、胸腺、心臓、胎児肝臓において発現され、多数の腫瘍または癌細胞においてもみられる。「PD−L2」とは、プログラム細胞死リガンド2(PD−L2、例えば、Latchman et al. (2001) Nat. Immunol. 2:261を参照のこと)を指す。「PD−1」(CD279としても知られる)とは、プログラム細胞死1、CD28ファミリーのメンバーを指し、PDCD1遺伝子によってコードされ、T細胞の表面で発現され、T細胞の活性化および増殖を生理学的に制限するように機能する阻害性受容体である。ヒトPD−1の代表的なアミノ酸配列は、NCBI受託番号:NP_005009.2の下で開示されており、ヒトPD−1をコードする代表的な核酸配列は、NCBI受託番号:NM_005018.2の下で示されている。「PD−1リガンド」は、PD−L1およびPD−L2のいずれかまたは両方ならびに細胞によって天然に発現される任意のバリアントまたはアイソフォームおよび/または全長ポリペプチドの少なくとも1つの生物活性を有するその断片を含む。ヒトPD−L1の配列は、NCBI受託番号:NP_054862.1(代表的なアミノ酸配列)およびNCBI受託番号:NM_014143.3(代表的な核酸配列)の下で開示されている。
本開示は、抗PD−L1抗体およびその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態では、本開示は、例示的モノクローナル抗体21F11、18G4、4B6、26F5、23A11、23F11、22C9、そのキメラ抗体、ヒト化4B6、ヒト化23A11およびヒト化23F11を提供する。
ルシフェラーゼ〔luceriferases〕、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼまたはβ−D−ガラクトシダーゼ)、放射性同位元素(例えば、123I、124I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、90Y、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Biおよび32P、その他のランタニド、発光標識)、発色団部分、ジゴキシゲニン、ビオチン/アビジン、DNA分子または検出用の金が挙げられる。特定の実施形態では、ペイロードは、抗体の半減期を増大するのに役立つPEGなどの薬物動態修飾部分であり得る。その他の適したポリマーとして、例えば、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマーなどが挙げられる。特定の実施形態では、ペイロードは、磁性ビーズなどの精製部分であり得る。「細胞傷害性」部分のペイロードは、細胞にとって有害であるか、または細胞に損傷を与え得るもしくは死滅させ得る任意の薬剤であり得る。細胞傷害性部分の例として、制限するものではないが、化学療法剤、抗腫瘍剤、成長阻害剤、薬物、毒素、例えば、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン〔dihydroxy anthracin dione〕、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシンおよびその類似体、代謝拮抗剤(例えば、メトトレキサート、6−メルカププリン、6−チオグアニン、シタラビン、5−フルオロウラシルデカルバジン)、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオテパ〔thioepa〕クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド〔cyclothosphamide〕、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンCおよびシス−ジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(以前は、ダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前は、アクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、白金(例えば、シスプラチンおよびオキサリプラチン)、植物アルカロイド(例えば、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、タキサンおよびエピポドフィロトキシン)およびアントラマイシン(AMC))および有糸***阻害剤(例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン)が挙げられる。用語「負荷」または「薬物負荷」または「ペイロード負荷」とは、本明細書において、抗体あたりの薬物/ペイロードの平均数を指す。薬物負荷は、質量分析、UV/可視分光法、ELISAアッセイおよびHPLCなどの当技術分野における適した方法によって決定されるように、抗体あたり1〜20(例えば、1〜15、1〜10、2〜10、1〜8、2〜8、2〜6、2〜5または2〜4)薬物(薬物対抗体比としても)の範囲内であり得る。特定の実施形態では、薬物負荷は、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である。
本開示は、抗PD−L1抗体およびその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、本開示において提供されるCDR配列をコードする1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。
本開示は、抗PD−L1抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書において提供される抗PD−L1抗体もしくはその抗原結合断片を含む医薬組成物を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、生物学的サンプルにおいてPD−L1の存在またはレベルを検出するため有用である。生物学的サンプルは、細胞または組織を含み得る。
本開示は、抗PD−L1抗体またはその抗原結合断片および1種または複数の医薬上許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。
本開示は、抗PD−L1抗体またはその抗原結合断片を使用する方法をさらに提供する。
PD−L1抗体またはその抗原結合断片のin vivo有効性(例えば、結合活性または結合親和性)をスクリーニングおよび/または評価するために、非ヒト動物に接種されるヒトPD−L1タンパク質を発現する非ヒト腫瘍細胞を作製する。特定の実施形態では、非ヒト腫瘍細胞は、げっ歯類(例えば、マウス、ラットまたはハムスターなど)細胞である。特定の実施形態では、非ヒト腫瘍細胞は、黒色腫細胞株(B16)またはマウス結腸癌細胞株(MC38)である。非ヒト腫瘍細胞は、内因性非ヒトPD−L1遺伝子セグメントが不活性化されたヒトPD−L1タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み得る。標的遺伝子の不活性化は、タンパク質コード配列の遺伝子破壊、変異、付加、遺伝子サイレンシング(例えば、RNAi遺伝子アンチセンス)または内因性遺伝子座での遺伝子欠失(例えば、コード配列またはそれぞれの両端に位置する領域を含むコード配列の部分的もしくは完全欠失)によって引き起こされ得、それによって、非ヒト標的遺伝子の発現を排除もしくは最小化するか、またはそのリガンドによって結合されない機能的に不活性の/末端切断ポリペプチドを作製する。コーディング配列のそれぞれの両端に位置する領域は、5’および3’末端の両方で約1bp〜約500bpの範囲内であり得る、またはそれぞれの両端に位置する領域は、500bpより長いものであり得るが、本開示に従うその他の遺伝子の不活性化を含まない。「遺伝子破壊」とは、本明細書において、天然に存在する配列への1つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の付加を指す。遺伝子破壊は、マーカー/リポーター遺伝子の、タンパク質コード配列への付加または挿入であり得る。特定の実施形態では、不活性化は、不可逆的である。特定の実施形態では、不活性化は、標的遺伝子または遺伝子産物について検出可能な活性を有さない細胞をもたらす。標的遺伝子の不活性化は、当技術分野における適した手段、例えば、相同組換え、RNA干渉(RNAi)またはCRISPR/Cas9システムを使用して実施される。特定の実施形態では、ヒトPD−L1タンパク質をコードするヒトPD−L1遺伝子セグメントは、内因性非ヒトPD−L1遺伝子座中に作動可能に挿入される(遺伝子置き換え)。特定の実施形態では、ヒトPD−L1をコードする挿入されたポリヌクレオチドは、無作為に非特異的位置に組み込まれる(遺伝子増大)。なおさらなる実施形態では、ヒトPD−L1をコードするポリヌクレオチドは、エピソームとして、例えば、DNAの別個のエピソームセグメントの形態で細胞中で安定に維持され、エピソームDNAの複製は、宿主細胞周期と独立している、またはそれと同期している。
ヒトPD−L1/CD274タンパク質:組換えヒトPD−L1/CD274タンパク質(受託番号NP_054862.1)(hPD−L1−his)を、ヒト293細胞(HEK293)において発現させた。手短に述べると、C末端に6×hisタグを有する、Phe19−Arg238に由来するヒトPD−L1遺伝子のコーディング領域をトランスフェクションに使用した。His−タグ親和性カラムを使用して上清を精製した。得られた精製タンパク質をSDS pageゲルを使用して特徴付けた。このタンパク質を、ACRO Biosystemから購入した(PD1−H5229)。
1.抗原コンジュゲーションおよび免疫処置
免疫処置のために、組換えhPD−L1−Fc(またはmPD−L1−Fc)タンパク質を、種々のMabSpace免疫増強ペプチドとコンジュゲートした。手短に述べると、2〜8倍モル過剰のペプチドをスルホ−SMCC(スルホスクシンイミジル4−[N−マレイミドメチル]シクロヘキサン−1−カルボキシレート、Peirce番号22322)活性化hPD−L1−Fcタンパク質と混合し、室温で1時間インキュベートした。反応を停止させ、コンジュゲートされたタンパク質を、SDS−PAGEゲルを使用して解析し、品質管理した。
融合の4日前、各マウスに、PBS中のコンジュゲートされていないhPD−L1−FcおよびmPD−L1−Fcタンパク質を用いて腹膜内に追加免疫した。融合日に、脾臓を無菌的に採取し、臓器を単細胞懸濁液に加工した。赤血球が溶解し、脾臓細胞をDMEM(Gibco)で洗浄した。生存可能な、対数期成長骨髄腫細胞(SP2/0)を、マウス脾臓細胞と、1:4比で混合した。次いで、細胞を2回洗浄し、その後、PEGで融合した。融合後細胞をDMEMで洗浄し、10%FBS+HFCS+OPI+1X HATを補給した細胞成長培地に懸濁した。ウェルあたり200μlのこの細胞懸濁液を、96ウェル細胞培養プレートにプレーティングし、37℃の加湿10% CO2インキュベーター中で一晩インキュベートした。培養物を7日間インキュベートし、次いで、成長培地をウェルから吸引除去し、新鮮な成長培地と交換した。ハイブリドーマ上清のスクリーニングは、培地交換の2〜3日後に開始した。
1.ELISAアッセイによるPD−L1結合剤についてのスクリーニング
高結合透明ポリスチレン96ウェルプレート(Nunc)を、100μl/ウェルの、高pHコーティングバッファー中の0.5μg/ml hPD−L1−hisまたはmPD−L1−hisを用いてコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを洗浄バッファー(PBS+0.1% Tween 20(Sigma))を使用して自動プレート洗浄機で1回洗浄した。各ウェルに200μlのブロッキングバッファー(PBS+1% BSA+1%正常ヤギ血清+0.05% Tween−20)を添加し、室温で2時間インキュベートした。100μlのハイブリドーマ上清を、ELISAプレートの各ウェルに移し、室温で60分間インキュベートさせた。次いで、上記の方法を使用してプレートを3回洗浄した。100μl/ウェルの、ブロッキング溶液で希釈した、HRPがコンジュゲートされたヤギ抗マウスFc抗体(Abcam)の溶液を、プレートの各ウェルに添加した。その後、ELISAプレートを室温で60分間インキュベートさせ、次いで、プレートを250μl/ウェルの洗浄バッファーを用いて3回洗浄した。最後に、100μl/ウェルのTMBを各ウェルに添加し、0.64M H2SO4を使用して反応を停止させた。プレートを450nMでThermo Multiscan FCで読み取った。ELISA陽性ハイブリドーマウェルから得た細胞を、続いて、さらなる特徴付け研究のために細胞培養において拡大した。
高結合透明ポリスチレン96−ウェルプレート(Nunc)を、100μl/ウェルの、高pHコーティングバッファー中の2μg/ml hPD−L1−Fc(Acrobiosystems、カタログ番号PD1−H5258)を用いてコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを、洗浄バッファー(PBS+0.1% Tween 20(Sigma))を使用して自動プレート洗浄機で1回洗浄した。200μlのブロッキングバッファー(PBS+1% BSA+1%正常ヤギ血清+0.05% Tween−20)を、各ウェルに添加し、室温で2時間インキュベートした。100μlのハイブリドーマ上清をELISAプレートの各ウェルに移し、室温で60分間インキュベートさせた。次いで、プレートを上記の方法を使用して3回洗浄した。80μlの1μg/ml hPD−1−his(ACRO Biosystems、カタログ番号PD1−H5221)を、希釈バッファーとともに各ウェルに添加した。次いで、100μl/ウェルの、ブロッキング溶液で希釈した抗his−HRP(1:4000希釈、CWBIO、カタログ番号CW0285)抗体の溶液をプレートの各ウェルに添加した。その後、ELISAプレートを室温で60分間インキュベートさせ、次いで、プレートを250μl/ウェルの洗浄バッファーを用いて3回洗浄した。最後に、100μl/ウェルのTMBを各ウェルに添加し、0.64M H2SO4を使用して反応を終結させた。プレートを450nMでThermo Multiscan FCで読み取った。ELISA陽性ハイブリドーマウェルから得た細胞を、続いて、さらなる特徴付け研究のために細胞培養において拡大した(図1A〜Cを参照のこと)。
対数期IFN−r刺激された(500U/ml、2日間)HCC827細胞を集め、ブロッキングバッファー(5%BSA+PBS)に再懸濁した。2×10^5個細胞を、各チューブに添加し、次いで、PBS(1500rpm、5分、室温)を用いて1回洗浄した。100μl/チューブのハイブリドーマ上清およびブロッキングバッファーを、対応するチューブ中に添加し、4℃で1時間インキュベートした。次いで、細胞を、1ml PBSを用いて2回洗浄し、続いて、100μl/チューブの3μg/mlのビオチン化hPD−1−Fc−N297A(ACRObiosystems)を添加し、4℃で1時間インキュベートした。PBSを用いて3回洗浄した後、100μl/チューブのストレプトアビジン−PE(EBiosciences)、ブロッキングバッファー中1:200を、各チューブに添加した。細胞を4℃で1時間インキュベートし、次いで、PBSを用いて2回洗浄し、続いて、細胞を、各サンプルについて150μlのPBSに再懸濁した。次いで、細胞をFACSチューブに移し、フローサイトメトリー(ACEA Bioscience Novocyte)を使用して、抗体の細胞との結合を検出した。
高結合透明ポリスチレン96ウェルプレート(Nunc)を、100μl/ウェルの、0.5μg/mlの高pHコーティングバッファー中のhPD−L1−hisを用いてコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを、洗浄バッファーPBS+0.1% Tween 20(Sigma)を使用して自動プレート洗浄機で1回洗浄した。200μlのブロッキングバッファー(PBS+1% BSA+1%正常ヤギ血清+0.05% Tween−20)を各ウェルに添加し、室温で2時間インキュベートした。100μlのハイブリドーマ上清を、ELISAプレートの各ウェルに移し、pH7.4またはpH6.0のいずれかで、室温で60分間インキュベートさせた。次いで、pH7.4またはpH6.0のいずれかのバッファーを用い、上記の方法を使用してプレートを3回洗浄した。その後、100μl/ウェルの溶液の、pH7.4のブロッキング溶液で希釈された、HRPがコンジュゲートされたヤギ抗マウスFc抗体(Abcam)を、次いで、プレートの各ウェルに添加した。その後、ELISAプレートを、室温で60分間インキュベートさせ、次いで、プレートを、200μl/ウェルpH7.4またはpH6.0洗浄バッファーを用いて3回洗浄した。最後に、100μl/ウェルのTMBを各ウェルに添加し、0.64M H2SO4を使用して反応を終結させた。プレートを450nMでThermo Multiscan FCで読み取った。ELISA陽性ハイブリドーマウェルから得た細胞を、続いて、さらなる特徴付け研究のために細胞培養において拡大した。クローン23A11(図2A)およびクローン23F11(図2B)の結果が示されている。
1.陽性ハイブリドーマクローンのサブクローニング
所望の結合プロフィールおよび遮断活性を有するELISA陽性ハイブリドーマウェルから得た細胞を、選択し、96ウェルプレートにおいて制限希釈を使用して各々プレーティングした。これらの細胞を7日間成長させた。適切な細胞量に到達したら、各ウェルから上清を集め、抗原結合能について再スクリーニングした(実施例2におけるスクリーニングを参照のこと)。
ハイブリドーマ細胞をローラーボトルに接種し、200〜300mlのハイブリドーマ培養培地(Invitrogen)とともに14日間培養した。ハイブリドーマ細胞培養物から以下のとおりにPD−L1モノクローナル抗体(mAb)を精製した。すべての精製プロセスを、室温で実施した。1つの精製スキームを使用して、種々のmAbを精製し、アフィニティークロマトグラフィーを使用した。
高結合透明ポリスチレン96ウェルプレート(Nunc)を、100μl/ウェルの、高pHコーティングバッファー 中の0.5μg/ml hPD−L1−hisを用いてコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを、洗浄バッファー(PBS+0.1% Tween 20(Sigma))を使用して自動プレート洗浄機で1回洗浄した。洗浄した。200μlのブロッキングバッファー(PBS+1% BSA+1%正常ヤギ血清+0.05% Tween−20)を、各ウェルに添加し、室温で2時間インキュベートした。次いで、希釈バッファー(PBS+1%BSA+1%正常ヤギ血清+0.01% Tween−20)を用いて段階希釈した精製抗体を添加し、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを上記の方法を使用して3回洗浄した。100μl/ウェルの、希釈バッファー中のHRPがコンジュゲートされたヤギ抗マウスFc抗体(Abcam)の溶液を、プレートの各ウェルに添加した。その後、ELISAプレートを、室温で60分間インキュベートさせ、次いで、プレートを250μl/ウェルの洗浄バッファーを用いて3回洗浄した。最後に、100μl/ウェルのTMBを各ウェルに添加し、0.64M H2SO4を使用して終結させた。プレートを450nMでThermo Multiscan FCで読み取った(図3を参照のこと)。
1.ELISAにおける評価
高結合透明ポリスチレン96ウェルプレート(Nunc)を、100μl/ウェルの、0.5μg/ml hPD−L1−Fcからなるコーティング溶液を用いて4℃で一晩コーティングした。次いで、洗浄バッファーPBS+0.1% Tween 20(Sigma)を使用して自動プレート洗浄機で1回洗浄した。各ウェルに、200μlのブロッキングバッファー(PBS+1% BSA+1%正常ヤギ血清+0.05% Tween−20)を添加し、室温で2時間インキュベートした。次いで、希釈バッファー(PBS+1%BSA+1%正常ヤギ血清+0.01% Tween−20)を用いて段階希釈した抗体(10μg/ml〜0.0006μg/ml)を添加し、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを上記の方法を使用して3回洗浄した。1μg/mlのビオチン化hPD−1−Fc−N297A(Acrobiosystem)を添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートを3回洗浄した後、次いで、100μl/ウェルの、希釈バッファーで希釈した、HRPがコンジュゲートされたニュートラアビジン抗体(Pierce)の溶液を、プレートの各ウェルに添加した。その後、ELISAプレートを、室温で60分間インキュベートさせ、次いで、プレートを250μl/ウェルの洗浄バッファーを用いて3回洗浄した。最後に、100μl/ウェルのTMBを各ウェルに添加し、0.64M H2SO4を使用して反応を終結させた。プレートを450nMでThermo Multiscan FCで読み取った(図4Aを参照のこと)。BM−GTは、米国特許第8217849号に開示されるベンチマーク抗体(MPDL−3280A)である。
対数期IFN−r刺激された(500U/ml、2日間)HCC827細胞を集め、ブロッキングバッファー(5%BSA+PBS)に再懸濁した。2×10^5個細胞を、各チューブに添加し、次いで、PBS(1500rpm、5分、室温)を用いて1回洗浄した。100μl/チューブの、ブロッキングバッファーで希釈された抗体を、10μg/mlの最終濃度を含有するように対応するチューブ中に添加し、4℃で1時間インキュベートした。次いで、細胞を、1ml PBSを用いて2回洗浄し、続いて、100μl/チューブの3μg/mlのビオチン化hPD−1−Fc−N297A(Acrobiosystem)を添加し、4℃で1時間インキュベートした。PBSを用いて3回洗浄した後、100μl/チューブの、ブロッキングバッファーで1:200希釈したストレプトアビジン−PE(EBiosciences)を各チューブに添加した。細胞を4℃で1時間インキュベートし、次いで、PBSを用いて2回洗浄し、続いて、細胞を、各サンプルに対して150μlのPBSに再懸濁した。次いで、細胞をFACSチューブに移し、フローサイトメトリー(ACEA Bioscience Novocyte)を使用して抗体の細胞との結合を検出した(図4Bを参照のこと)。
1.FACSによって測定される、精製PD−L1抗体のHCC827との結合の用量依存性応答
対数期IFN−γ刺激された(500U/ml、2日間)HCC827細胞を集め、ブロッキングバッファー(5%BSA+PBS)に再懸濁した。2×10^5個細胞を、各チューブに添加し、次いで、PBS(1500rpm、5分、室温)を用いて1回洗浄した。100μl/チューブの、ブロッキングバッファーで段階希釈した、ハイブリドーマ上清から精製したPD−L1抗体を、対応するチューブ中に添加し、4℃で1時間インキュベートした。次いで、細胞を1ml PBSを用いて2回洗浄し、続いて、100μl/チューブのブロッキングバッファー中の二次抗体(1:400抗mIgG (H+L)−PE、Cell signaling)を添加した。細胞を4℃で1時間インキュベートし、次いで、PBSを用いて2回洗浄し、続いて、細胞を、各サンプルに対して150μlのPBS中に再懸濁した。次いで、細胞をFACSチューブに移し、抗体の細胞との結合を、フローサイトメトリー(BD Accuri C6)を使用して検出した(図5Aを参照のこと)。
対数期IFN−γ刺激された(500U/ml、2日間)HCC827細胞を集め、ブロッキングバッファー(5%BSA+PBS)に再懸濁した。2×10^5個細胞を、各チューブに添加し、次いで、PBS(1500rpm、5分、室温)を用いて1回洗浄した。100μl/チューブの、ブロッキングバッファーを用いて段階希釈した、ハイブリドーマ上清から精製したPD−L1抗体を、対応するチューブ中に添加し、4℃で1時間インキュベートした。次いで、細胞を1ml PBSを用いて2回洗浄し、続いて、100μl/チューブの3μg/mlのビオチン化hPD−1−N297Aを添加し、4℃で1時間インキュベートした。PBSを用いて3回洗浄した後、100μl/チューブの、ブロッキングバッファーで1:200希釈した(ウサギ抗hIgG−PE、Santa Cruz)を各チューブに添加した。細胞を4℃で1時間インキュベートし、次いで、PBSを用いて2回洗浄し、続いて、細胞を、各サンプルに対して150μlのPBSに再懸濁した。次いで、細胞をFACSチューブ中に移し、フローサイトメトリー(BD Accuri C6)を使用して、抗体の細胞との結合を検出した(図5Bを参照のこと)。
マウス抗ヒトPD−L1抗体軽鎖および重鎖可変領域の配列は、5’RACE(cDNA末端の迅速増幅)としても知られるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅技術によって得た。4B6/23A11/23F11/22C9/26F5/21F11/18G4抗体産生ハイブリドーマ細胞からTrizol(Invitrogen)を使用して全RNAを単離し、Superscript第一鎖合成システム(Invitrogen)およびオリゴ(DT)12〜18プライマー(Invitrogen)を使用してcDNAを合成した。マウスIgG遺伝子の可変領域を、重鎖可変領域のためにMuIgG VH3’−2およびMuIg−5’リーダープライマーを、軽鎖可変領域のためにMuIgK VL3’−1およびMuIg−5”リーダープライマーを用いて(NOVAGEN)、PCRによってクローニングした。各抗体の得られたバンドを、TOPO TAクローニングベクターにクローニングし、10種超のクローンから得たDNAを、配列決定に付し、ABI DNA塩基配列決定法機器(Perkin Elmer)を使用して決定した。Vector NTI Advance 10ソフトウェア(Invitrogen)を使用してコンセンサス配列を決定した。
上記で産生された組換えキメラ抗体タンパク質の発現および精製を、以下の方法によって実施した:1x106個細胞/mlで、10%のPluronic F−68を有するFreestyle 293発現培地で培養したHEK293E細胞を、0.5μg/mlの最終濃度を有する、等量の、重鎖ベクターおよび軽鎖ベクターDNAおよび1.0μg/mlのPEI(ポリエチレンイミン−線形、Polyscience)を用いてトランスフェクトした。DNA対PEI比は、1:2であった。最適MEMを用いて、DNAおよびPEI複合体が形成される期間は、室温で15分でなくてはならない。トランスフェクトされた細胞を、5% CO2を用い、37℃および125rpmの振盪速度でフラスコ中で培養した。トランスフェクションの22〜26時間後に1%ペプトン培地を添加した。6日目にコンディショニング培地を回収し、上清を3000rpmで30分間遠心分離した。次いで、清澄化されたコンディショニング培地を、プロテインAカラム(G.E. Healthcare)上にロードし、PBSおよび0.1% triton−X100を用いて洗浄し、最後に結合しているIgGを、pH3.5の0.1Mグリシンを含有する溶液を用いて溶出した。溶出された抗体タンパク質を、PBSに対して透析し、−80℃で保存した。内毒素を除去するために、精製したタンパク質を、Hitrap DEAEセファロースF.F.カラムを通すことによってさらに処理し、得られた抗体を、サイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200 5/150 GL、G.E. Healthcare)を使用して解析して、純度のレベルを決定した。
1.カニクイザルPD−L1タンパク質との異種間結合
高結合透明ポリスチレン96−ウェルプレート(Nunc)を、100μl/ウェルの、高pHコーティングバッファー中、5μg/mlヒトまたはカニクイザル(cyno)PD−L1−hisを用いてコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを、洗浄バッファー(PBS+0.1% Tween 20(Sigma))を使用して自動プレート洗浄機で1回洗浄した。200μlのブロッキングバッファー(PBS+1% BSA+1%正常ヤギ血清+0.05% Tween−20)を、各ウェルに添加し、室温で2時間インキュベートした。次いで、希釈バッファー(PBS+1% BSA+1%正常ヤギ血清+0.01% Tween−20)を用いて段階希釈した抗体を添加し、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを、上記の方法を使用して3回洗浄した。次いで、100μl/ウェルの、希釈バッファー中の、マウスハイブリドーマ抗体のための、HRPがコンジュゲートされたヤギ抗マウスFc抗体(Abcam)または4B6キメラ抗体のためのヤギ抗ヒトIgG Fc−HRP吸着処理済み(Abcam)の溶液を、プレートの各ウェルに添加した。その後、ELISAプレートを室温で60分間インキュベートさせ、次いで、プレートを、250μl/ウェル洗浄バッファーを用いて3回洗浄した。最後に、100μl/ウェルの、TMBを各ウェルに添加し、0.64M H2SO4を使用して反応を終結させた。プレートを、450nMでThermo Multiscan FCで読み取った(図6A〜6Eを参照のこと)。
高結合透明ポリスチレン96ウェルプレート(Nunc)を、100μl/ウェルの、高pHコーティングバッファー中の1μg/mlのマウスPD−L1−hisを用いてコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを、洗浄バッファー(PBS+0.1% Tween 20(Sigma))を使用して自動プレート洗浄機で1回洗浄した。200μlのブロッキングバッファー(PBS+1% BSA+1%正常ヤギ血清+0.05% Tween−20)を、各ウェルに添加し、室温で2時間インキュベートした。次いで、希釈バッファー(PBS+1% BSA+1%正常ヤギ血清+0.01% Tween−20)中、20μg/mlの精製ハイブリドーママウス抗体を添加し、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを、250μl/ウェルの洗浄バッファーを用いて3回洗浄した。次いで、100μl/ウェルの、希釈バッファー中の、HRPがコンジュゲートされたヤギ抗マウスFc抗体(Abcam)の溶液を、プレートの各ウェルに添加した。その後、ELISAプレートを、室温で60分間インキュベートさせ、次いで、プレートを250μl/ウェルの洗浄バッファーを用いて3回洗浄した。最後に、100μl/ウェルのTMBを各ウェルに添加し、0.64M H2SO4を使用して反応を終結させた。プレートを、450nMでThermo Multiscan FCで読み取った(図6Fを参照のこと)。
精製抗体(4B6、23A11、26F5、23F11および22C9)のヒトPD−L2タンパク質との結合を、異種間結合について上記で記載されたものと同様にELISAによって評価した。手短に述べると、高結合透明ポリスチレン96ウェルプレート(Nunc)を、それぞれ、高pHコーティングバッファー(0.16% Na2CO3+0.3% NaHCO3、pH 9.8)中の、100μl/ウェルの、0.5μg/mlのヒトPD−L1−Fc(Acrobiosystems、カタログ番号PD1−H5258)または100μl/ウェルの1μg/ml hPD−L2−Fc(Acrobiosystems、カタログ番号PD2−H5251)を用いてコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを、洗浄バッファー(PBS+0.1% Tween 20(Sigma))を使用して自動プレート洗浄機で1回洗浄した。200μlのブロッキングバッファー(PBS+1% BSA+1%正常ヤギ血清+0.05% Tween−20)を、各ウェルに添加し、室温で2時間インキュベートした。100μlの、希釈バッファー(PBS+1% BSA+1%正常ヤギ血清+0.01% Tween−20)を有する2μg/mlの精製PD−L1抗体を添加し、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを、洗浄バッファーを用いて3回洗浄した。次いで、100μl/ウェルの、希釈バッファー中のHRPがコンジュゲートされたヤギ抗マウスIgG抗体(1:20000、Abcam)の溶液を、プレートの各ウェルに添加した。その後、ELISAプレートを、室温で60分間インキュベートさせ、次いで、プレートを、250μl/ウェルの洗浄バッファーで3回洗浄した。最後に、100μl/ウェルのTMBを、各ウェルに15分間添加し、50μl/ウェルの0.16M/L硫酸を使用して反応を終結させた。プレートを、450nMでThermo Multiscan FCで読み取った(図6Gを参照のこと)。
対数期IFN−γ刺激された(500U/ml、2日間)HCC827細胞を集め、ブロッキングバッファー(5%BSA+PBS)に再懸濁した。2×10^5個細胞を、各チューブに添加し、次いで、PBS(1500rpm、5分、室温)を用いて1回洗浄した。100μl/チューブの、ブロッキングバッファーを用いて段階希釈したビオチン化PD−L1抗体を、対応するチューブ中に添加し、4℃で1時間インキュベートした。次いで、細胞を、1ml PBSを用いて2回洗浄し、続いて、100μl/チューブの、ブロッキングバッファー中の二次抗体(または1:200ウサギ抗ヒトIgG−PE(Santa Cruz)を添加した。細胞を、4℃で1時間インキュベートし、次いで、PBSを用いて2回洗浄し、続いて、細胞を、各サンプルについて150μlのPBSに再懸濁した。次いで、細胞をFACSチューブに移し、フローサイトメトリー(ACEA Bioscience Novocyte)を使用して、抗体の細胞との結合を検出した(図7を参照のこと)。「C」が付された抗体は、キメラ抗体を表し、抗体「4B6−H3L3」とは、実施例15において産生されたような、重鎖H3および軽鎖L3の組合せを有するヒト化4B6を指す。
対数期IFN−γ刺激された(500U/ml、2日間)HCC827細胞を集め、ブロッキングバッファー(5%BSA+PBS)に再懸濁した。2×10^5個細胞を、各チューブに添加し、次いで、PBS(1500rpm、5分、室温)を用いて1回洗浄した。100μl/チューブの、ブロッキングバッファーを用いて段階希釈したPD−L1抗体(図8を参照のこと)を、対応するチューブに添加し、4℃で1時間インキュベートした。次いで、細胞を、1ml PBSを用いて2回洗浄し、続いて、100μl/チューブの3μg/mlのビオチン化hPD−1−Fc−N297Aを添加し、4℃で1時間インキュベートした。PBSを用いて3回洗浄した後、100μl/チューブの、ブロッキングバッファー中のストレプトアビジン−PE 1:200(EBiosciences)を各チューブに添加した。細胞を4℃で1時間インキュベートし、次いで、PBSを用いて2回洗浄し、続いて、細胞を、各サンプルについて150μlのPBSに再懸濁した。次いで、細胞をFACSチューブに移し、フローサイトメトリー(ACEA Bioscience Novocyte)を用いて、抗体の細胞との結合を検出した。
高結合透明ポリスチレン96ウェルプレート(Nunc)を、100μl/ウェルの、0.5μg/ml hPD−L1−Fcからなるコーティング溶液を用いて、4℃で一晩コーティングした。次いで、プレートを、洗浄バッファー(PBS+0.1% Tween 20(Sigma))を使用して自動プレート洗浄機で1回洗浄し、続いて、200μlのブロッキングバッファー(PBS+1% BSA+1%正常ヤギ血清+0.05% Tween−20)を各ウェルに添加した。プレートを室温で2時間インキュベートした。次いで、希釈バッファー(PBS+1% BSA+1%正常ヤギ血清+0.01% Tween−20)中、20μg/mlの、段階希釈した競合抗体4B6、23A11、23F11、22C9および21F11を添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを、洗浄バッファーを使用して3回洗浄した。最大結合シグナルの80%をもたらす種々の濃度のビオチン化抗PD−L1抗体(例えば、18G4、23A11、4B6)を添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートを3回洗浄し、次いで、100μl/ウェルの、希釈バッファーで希釈したHRPがコンジュゲートされたニュートラアビジン抗体(Pierce)の溶液を、プレートの各ウェルに添加した。その後、ELISAプレートを室温で60分間インキュベートし、次いで、250μl/ウェルの洗浄バッファーを用いて3回洗浄した。最後に、100μl/ウェルのTMBを、各ウェルに添加し、0.64M H2SO4を使用して反応を終結させた。プレートを450nMでThermo Multiscan FCで読み取った(図9A〜図9Cを参照のこと)。
高結合透明ポリスチレン96ウェルプレートを、100μl/ウェルの、高pHコーティングバッファー中の0.5μg/mlのhPD−L1−his(Acrobiosystems)を用いてコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。次いで、コーティングされたプレートを、PBS+0.1% Tween 20(Sigma)を使用して自動プレート洗浄機で1回洗浄した。次いで、200μlのブロッキングバッファーを、各ウェルに添加し、次いで、プレートを室温で2時間インキュベートした。ブロッキングバッファーを吸引した後、pH7.4の希釈バッファーで段階希釈したキメラ抗体を添加し、プレートを室温で40分間インキュベートした。次いで、プレートを、250μl/ウェルの、7.4または5.5のpHを有する洗浄バッファーを用いて1回洗浄し、次いで、100μlの、pH7.4またはpH5.5の抗体希釈バッファーを添加し、インキュベーションを室温で2時間継続した。その後、プレートを、250μlの洗浄バッファーを用いて3回洗浄し(洗浄毎に10秒の振盪)、次いで、100μl/ウェルの、pH7.4希釈バッファー中の1:20000希釈されたHRPがコンジュゲートされたヤギ抗ヒトFc抗体(Abcam)の溶液を、プレートの各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを、250μlの洗浄バッファーを用いて3回洗浄した(洗浄毎に10秒の振盪)。最後に、100μl/ウェルのTMBを、各ウェルに添加し、0.64M H2SO4を使用して反応を終結させた。プレートを450nMでThermo Multiscan FCで読み取った(図10A〜Fを参照のこと)。
上記で得られた抗PD−L1抗体のin vivo活性を、修飾された同系マウス異種移植片腫瘍モデルを使用して評価した。マウスに、マウス結腸癌細胞株MC38および黒色腫細胞株B16を含む、マウスPD−L1遺伝子がヒトPD−L1と置き換えられているマウス腫瘍細胞を用いて皮下に接種した。抗ヒトPD−L1抗体を、3mg/kg、10mg/kgおよび/もしくは30mg/kgを、週に3回、腹腔内に(IP)、または1、3もしくは10mg/kgの用量で、週に1回静脈内に注射した。参照PD−L1抗体BM−GT(すなわち、米国特許第8217149号(Genentech)において開示されたYW243.55.S70またはMPDL3280A)およびBM−ME(すなわち、米国特許第8779108号の2.14H9OP)を、陽性対照として使用した。媒体群の腫瘍が、1000mm3の体積に達した時点で、腫瘍成長に対する抗体の効果を評価した。腫瘍体積および体重を、以下に記載されるように週に2回測定し、腫瘍成長に対する抗体の効果を、媒体群に対する腫瘍成長阻害(TGI)として算出した。
本発明者らが最近開発した高効率CRISPR/Cas9系を使用して、マウス腫瘍細胞株(B16およびMC38は、それぞれATCCから購入した)において内因性CD274/PD−L1をノックアウトした。手短に述べると、マウスCD274/PD−L1遺伝子の第1のコーディングエキソンを標的とするsgRNAを設計し、ヒットエンドラン型CRISPR/Cas9+sgRNA構築物によって細胞をトランスフェクトし、ノックアウト細胞について選択した。内因性CD274/PD−L1が完全ノックアウトされた細胞を、定常状態におけるCD274/PD−L1の細胞表面発現についてのFACS解析によって同定するか、またはインターフェロンγによって刺激し、続いて、標的とされるゲノム領域のTAクローニングおよび配列決定によって確認した。ヒトCD274/PD−L1置き換え細胞株を作製するために、ヒトCD274/PD−L1 cDNAのコード配列を、FG12由来のレンチウイルスベクターにクローニングした。次いで、マウスCD274/PD−L1ノックアウト細胞に、ヒトCD274/PD−L1を発現するレンチウイルスを感染させ、確立された細胞株におけるヒトCD274/PD−L1の高レベルの安定な発現を、FACS解析によって確認した。B16およびMC38の工学的に操作された細胞は、それぞれ、B16−hPD−L1 KI、MC38−hPD−L1 KIと名付けた。
B16細胞を、マウスPD−L1遺伝子を、ヒトPD−L1と置き換えるように工学的に操作し、B16−hPD−L1 KIと名付けた。研究に先立って、B16−hPD−L1 KI細胞を継代5回以内で継代培養し、その後、マウスに接種した。2×10^6個細胞/0.2mLを、10匹の雌のSPF等級C57BL/6マウスの各々にS.C.によって注射した。抗体(例えば、BM−GT、4B6−Cおよび23A11)の第1の用量(3mpkまたは10mpk)を、腫瘍細胞が注射された1日後に注射した。腫瘍の大きさを、ノギス(INSIZE)を使用して二次元で週に2回測定した。腫瘍成長阻害(TGI)%を、29日目に測定した値に基づいて算出した。結果をPrism GraphPadを使用して解析し、平均±S.E.M.として表した。T検定によって2群間の比較を行い、Pが<0.05である場合に、差違は、有意であると考えられる(表1を参照のこと)。
マウスPD−L1遺伝子を、ヒトPD−L1と置き換えるように工学的に操作されたMC−38細胞は、MC38−hPD−L1 KIと名付けられる。MC38/hPDL1−KI腫瘍細胞を、大気中、5% CO2を有する雰囲気下、37℃で、10%加熱不活性化ウシ胎児血清(ExCell Biology)、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン(Hyclone)を補給したRPMI1640培地(Thermo Fisher)で単層培養としてin vitroで維持した。腫瘍細胞を、トリプシン−EDTA処置(Hyclone)によって週に2回ルーチンで継代培養した。対数増殖相で成長している細胞を回収し、腫瘍接種についてカウントした。雌のSPF等級C57BL/6マウス各々に、2×10^6個細胞を右側腹部でS.C.注射によって接種した。接種のおよそ10日後、およそ100mm^3の腫瘍体積を有する40匹のマウスを選択し、5群に無作為化した(表2中のスキームを参照のこと)。次いで、マウスを、PBS、1mg/mlでPBSで製剤化された、精製抗体ハイブリドーマ由来のマウス抗体4B6、23A11、23F11、26F5各々のIP注射による10mg/体重1kgを用いて処置した。処置は、第1の注射から、週に3回、4週間継続した。動物を、CO2吸入を用いて研究の最後に犠死させた。腫瘍の大きさを、ノギス(INSIZE)を使用して2次元で週に2回測定し、体積を、式:V=0.5a×b2(式中、aおよびbは、それぞれ、腫瘍の長い直径および短い直径である)を使用してmm3で表した。結果を、Prism GraphPadを使用して解析し、平均±S.E.M.として表した。T検定によって2群間の比較を行い、Pが*<0.05および**<0.01である場合に差違は有意であると考えられる。(表3を参照のこと)。
pH依存性抗体が、腫瘍阻害においてin vivoで任意の利点を有するか否かを評価するために、本発明者らは、pH依存性抗体23F11の1種および非pH依存性結合抗体4B6−Cの1種の活性を比較した(図12Aおよび12Bを参照のこと)。これらの抗体は、強力な中和活性を有し、また、高用量で腫瘍を阻害し得る。pH依存性抗体の潜在的利点を明らかにするために、本発明者らは、抗体を低用量:IP注射による1mg/kgで試験する。手短に述べると、雌のSPF等級C57BL/6マウス各々に、2×10^6個細胞(すなわち、MC38−hPD−L1 KI)を右側腹部でS.C.注射によって接種した。接種のおよそ10日後、およそ200mm^3の腫瘍体積を有する40匹のマウスを選択し、5群に無作為化した。次いで、マウスを1mg/mlでPBSで製剤化された精製抗体各々の1mg/体重1kgでのIP注射によって、PBS、4B6−キメラ(4B6−C)、23F11、ベンチマーク抗体BM−GT(米国特許第8217149号においてYW243.55.S70またはMPDL3280Aとも名付けられた)およびBM−ME(米国特許第8779108号において2.14H9OPTとも名付けられた)を用いて処置した。処置は、各週3回施し、第1の注射後3週間継続した。動物を、CO2吸入によって研究の最後に犠死させた。腫瘍の大きさを、ノギス(INSIZE)を使用して2次元で週に2回測定し、体積を、式:V=0.5a×b2(式中、aおよびbは、それぞれ、腫瘍の長い直径および短い直径である)を使用してmm3で表した。結果を、Prism GraphPadを使用して解析し、平均±S.E.M.として表した。T検定によって2群間の比較を行い、Pが<0.05である場合に差違は有意であると考えられる。
pH依存性抗原結合特性を有する抗体が、in vivoでpH依存性結合を有さないものよりも良好に腫瘍成長を阻害し、Fcドメインの潜在的影響を排除し得ることをさらに検証するために、本発明者らは、HEK293細胞(すなわち、BM−GT)においてベンチマーク抗体と同一のIgGアイソタイプ(すなわち、ヒトIgG1)を用いて産生したキメラ抗体(すなわち、23A11−Cおよび23F11−C)を再試験した。
1.ヒト化抗体の作製、発現および精製
マウス抗体4B6、23A11および23F11の可変ドメインの配列を使用して、マウスフレームワークに対して最高の相同性を有する生殖系列配列を同定した。コンピュータモデリングを使用して、CDRグラフティングおよび逆変異を用いてヒト化バリアントを設計した。
CDRグラフティングのために、それぞれ、軽鎖についてヒト生殖系列フレームワーク配列VK/1D−13および重鎖についてVH/1−2を使用した。
VH/1−2(4B6−生殖系列、配列番号87):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR
QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYVFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIGDINPNNGGTSYNQKFQGRATVTVDKSTRTAYMELSRLRSDDTAVYYCVKWGDGPFAYWGQGTLVTVSS
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYVFTDYYMNWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTSYNQKFQGRVTVTVDTSIRTAYMELSRLRSDDTAVYYCVKWGDGPFAYWGQGTLVTVSS
VK/1D−13(4B6 LC生殖系列、配列番号88)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNNYP
DIQMTQSQSSLSASVGDRVTITCQASQNVGAAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSMQPEDIATYFCQQYSNYPTFGSGTKLGIK
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNVGAAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASNLYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYFCQQYSNYPTFGSGTKLGIK
CDRグラフティングのために、それぞれ、重鎖についてヒト生殖系列フレームワーク配列VH/1−2および軽鎖についてVK/7−3を使用した。
VH/1−2(23A11−HC−生殖系列、配列番号89):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR
QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYIFTTYWIHWVKQRPGQGLEWIGMIQPNSGGTKYNDQFKNRATLTVDKSISTAYMELSRLTSDDTAVYYCARGAGTVDYFDYWGQGTTLSISS
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTTYWIHWVRQAPGQGLEWIGMIQPNSGGTKYNDQFKNRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGAGTVDYFDYWGQGTTLSISS
VK/7−3(23A11−LC−生殖系列、配列番号90):
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSELGINLIHWYQQKPGQPPKLLIYQASNKDTGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCLQSKNFP
DIVLTQSPASLAVSVGQRATITCRASESVDIYGNSFMHWYQQKPGQSPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEANDTATYYCHQSNDDPYTFGGGTKLETK
DIVLTQSPASLAVSVGQRATITCRASESVDIYGNSFMHWYQQKPGQAPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEANDTATYYCQQSNDDPYTFGGGTKLETK
CDRグラフティングのために、それぞれ、重鎖についてヒト生殖系列フレームワーク配列VH/1−2および軽鎖についてVK/7−3を使用した。
VH/1−2(23F11生殖系列HC、配列番号91):
VQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR
QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYIFTTYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIQPNSGGTKYNEKFKKKATLTVDKSISTAYMELSRLTSDDTAVYYCARGAGTVDYFDYWGQGSTLTVSS
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTTYWMHWVRQAPGQGLEWIGMIQPNSGGTKYNEKFKKKATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGAGTVDYFDYWGQGSTLTVSS
VK/7−3(23F11生殖系列LC、配列番号92):
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSELGINLIHWYQQKPGQPPKLLIYQASNKDTGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCLQSKNFP
DIVLTQSPASLAVSVGQRATITCRASESVDIYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEANDTATYYCQQSTEDPYTFGGGTKLEIK
DIVLTQSPASLAVSVGQRATITCRASESVDIYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEANDTATYYCHQSTEDPYTFGGGTKLEIK
高結合透明ポリスチレン96ウェルプレート(Nunc)を、100μl/ウェルの、高pHコーティングバッファー中の0.5μg/mlのヒトPD−L1−his(Acrobiosystems、カタログ番号PD1−H5229)を用いてコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを、洗浄バッファー(PBS+0.1% Tween 20(Sigma))を使用して自動プレート洗浄機で1回洗浄した。200μlのブロッキングバッファー(PBS+1% BSA+1%正常ヤギ血清+0.05% Tween−20)を、各ウェルに添加し、室温で2時間インキュベートした。希釈バッファー(PBS+1% BSA+1%正常ヤギ血清+0.01% Tween−20)を用いて段階希釈したヒト化抗体(293細胞において産生された)を添加し、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを、洗浄バッファーを用いて3回洗浄した。100μl/ウェルの、希釈バッファー中のHRPがコンジュゲートされたヤギ抗ヒトFc抗体(Abcam)の溶液を、プレートの各ウェルに添加した。その後、ELISAプレートを、室温で60分間インキュベートさせ、次いで、プレートを、200μl/ウェルのpH7.4洗浄バッファーを使用して3回洗浄した。最後に、100μl/ウェルのTMBを、各ウェルに添加し、0.64M H2SO4を使用して反応を終結させた。プレートを、450nMでThermo Multiscan FCで読み取った(図17Aおよび17Bを参照のこと)。
高結合透明ポリスチレン96ウェルプレート(Nunc)を、100μl/ウェルの、1μg/ml hPD−L1−Fcからなるコーティング溶液を用いて、4℃で一晩コーティングした。次いで、プレートを、洗浄バッファー(PBS+0.1% Tween 20(Sigma))を使用して自動プレート洗浄機で1回洗浄した。200μlのブロッキングバッファー(PBS+1% BSA+1%正常ヤギ血清+0.05% Tween−20)を各ウェルに添加し、室温で2時間インキュベートした。次いで、希釈バッファー(PBS+1% BSA+1%正常ヤギ血清+0.01% Tween−20)を用いて段階希釈した抗体(すなわち、293細胞において産生されたヒト化4B6、23F11、23A11ならびに同様に293細胞において産生されたベンチマーク抗体BM−GTおよびBM−ME)を添加し、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを上記の方法を使用して3回洗浄した。1μg/mlのビオチン化hPD−1−N297A(Acrobiosystem)を添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートを3回洗浄した後、100μl/ウェルの、希釈バッファー中の1:5000希釈したHRPがコンジュゲートされたニュートラアビジン抗体(Pierce)の溶液を、プレートの各ウェルに添加した。その後、ELISAプレートを、室温で60分間インキュベートさせ、次いで、プレートを、250μl/ウェルの洗浄バッファーを用いて3回洗浄した。最後に、100μl/ウェルのTMBを各ウェルに添加し、0.64M H2SO4を使用して反応を終結させた。プレートを450nMでThermo Multiscan FCで読み取った(図18A〜18D参照のこと)。
対数期IFN−γ刺激された(500U/ml、2日間)HCC827細胞を集め、ブロッキングバッファー(5%BSA+PBS)に再懸濁した。2×10^5個細胞を、各チューブに添加し、次いで、PBS(1500rpm、5分、室温)を用いて1回洗浄した。100μl/チューブの、ブロッキングバッファーで段階希釈したヒト化PD−L1抗体(293細胞において産生された)を、対応するチューブに添加し4℃で1時間インキュベートした。次いで、細胞を、1ml PBSを用いて2回洗浄し、続いて、100μl/チューブの、ブロッキングバッファー中の二次抗体(1:200ウサギ抗ヒトIgG−PE)を添加した。細胞を4℃で1時間インキュベートし、次いで、PBSを用いて2回洗浄し、続いて、細胞を、各サンプルに対して150μlのPBSに再懸濁した。次いで、細胞をFACSチューブに移し、フローサイトメトリー(ACEA Bioscience Novocyte)を用いて抗体の細胞との結合を検出した(図19を参照のこと)。
対数期IFN−γ刺激された(500U/ml、2日間)HCC827細胞を集め、ブロッキングバッファー(5%BSA+PBS)に再懸濁した。2×10^5個細胞を、各チューブに添加し、次いで、PBS(1500rpm、5分、室温)を用いて1回洗浄した。以下の実験における小規模産生のための、100μl/チューブの、ブロッキングバッファーで段階希釈されたヒト化PD−L1抗体(293細胞において発現された抗体は、「旧」と名付け、CHO細胞において産生されたものは、「新」と名付けた。すなわち、4B6−H3L4、4B6−H4L3、23A11−H3L5 293および23F11 H4L4 293は、293細胞において産生され、23A11−H3L5 CHOおよび23F11 H4L4 CHOは、CHO細胞において産生された)を、対応するチューブに添加し、4℃で1時間インキュベートした。次いで、細胞を、1mlのPBSを用いて2回洗浄し、続いて、100μl/チューブの、3μg/mlのビオチン化hPD−1−N297Aを添加し、4℃で1時間インキュベートした。PBSを用いて3回洗浄した後、100μl/チューブの、ブロッキングバッファー中のストレプトアビジン−PE 1:200を各チューブに添加した。次いで、細胞を4℃で1時間インキュベートし、次いで、PBSを用いて2回洗浄し、続いて、細胞を、各サンプルに対して150μlのPBSに再懸濁した。次いで、細胞を、FACSチューブに移し、フローサイトメトリー(ACEA Bioscience Novocyte)を用いて抗体の細胞との結合を検出した(図20Aおよび20Bを参照のこと)。
PD−1/PD−L1媒介性T細胞活性化の阻害の軽減における、抗PD−L1抗体の能力を評価するために、本発明者らは、混合リンパ球反応(MLR)アッセイを実施した。第1の実験では、DCは、新鮮ヒト血液から単離された接着末梢血単核細胞(PBMC)に由来した。PBMCを、血清不含培地を用いて2×10^6個/mlの密度で6ウェルプレート中にプレーティングした。2時間後、懸濁液細胞を廃棄し、接着細胞を、10ng/mlのGM−CSFおよび30ng/ml IL−4を用いて処置した。培地を3日毎に交換し、6日目に20ng/mlのTNFαを添加して、DC細胞を成熟させた。7日目に、抗CD11c−PE(Biolegend)および抗HLA−DR−APC(Biolegend)を使用するFACSによって、DCの表現型を検出した。CD4+T細胞濃縮キット(Stem Cell Inc.)を使用して、別のドナーの新鮮な血液からCD4+T細胞を分離した。DCがマイトマイシンC(10μg/mlで2時間)によって処置された後、DCおよびCD4+T細胞およびPD−L1抗体を、DC 1:CD4+ T 10の比で200μl/ウェルに添加し、37℃、5% CO2インキュベーターで5日間インキュベートした。次いで、上清のIL−2およびIFN−γを、IL−2デュオセット〔duo-set〕(R&D)およびIFN−γ検出キット(Peprotech)を使用して検出した(図21Aおよび21Bを参照のこと)。T細胞の増殖を、CellTiter−Glo発光細胞生存アッセイキット(Promega)によって測定した。
CM5センサーチップを、新たに調製した1:1 50mM N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS):200mM 1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド(EDC)の7分注射(10μl/分)によって各フローセル中で活性化した。次いで、10mM 酢酸ナトリウムバッファーPH5.0中、10μg/mlの濃度の抗ヒトFc抗体(GE Healthcare)を、10μl/分で活性化されたチップ上に注入した(HBS−EPランニングバッファー:10mM HEPES、150mM NaCl、3.4mM EDTA、0.005%界面活性剤P20、pH7.4)。残存する活性カップリング部位を、10μl/分で1Mエタノールアミンの7分注射によってブロックした。各フローセルの固定化レベルは、約9000RUである。FC2において、抗ヒトFc IgG(GE Healthcare)によって抗体を200〜300RUに捕獲した。FC1を参照細胞として使用した。抗体の捕獲後、抗原を種々の濃度で注入した。抗体結合抗原の会合時間は、180秒である。表面再生条件は、Gly pH1.5において10μl/分で120秒である。捕獲された抗体を有さないものから差し引かれた捕獲された抗体のシグナルを、Biacore X100評価ソフトウェアバージョン2.0(Biacore)を用いて算出した。
高結合透明ポリスチレン96ウェルプレートを、100μl/ウェルの、高pHコーティングバッファー中、0.5μg/mlのPD−L1−his を用いてコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。次いで、コーティングしたプレートを、PBS+0.1% Tween 20(Sigma)を用いて自動プレート洗浄機で1回洗浄した。次いで、200μlのブロッキングバッファーを、各ウェルに添加し、次いで、プレートを室温で2時間インキュベートした。ブロッキングバッファーを吸引した後、pH7.4の希釈バッファーで段階希釈した抗体(すなわち、CHOまたは293細胞によって産生された23A11 H3L5、23F11 H4L4)を添加し、プレートを室温で40分間インキュベートした。次いで、プレートを250μl/ウェルの、pH7.4の洗浄バッファーを用いて1回洗浄し、次いで、100μl/ウェルの、pH7.4またはpH5.5洗浄バッファーを添加し、インキュベーションを、振盪しながら室温で2時間継続した。その後、プレートを、pH7.4の洗浄バッファーを使用して3回洗浄し、100μl/ウェルの、pH7.4希釈バッファー中の HRPがコンジュゲートされたヤギ抗ヒトFc抗体(Abcam)の溶液を、プレートの各ウェルに添加した。その後、プレートを室温で60分間インキュベートさせ、続いて、200μl/ウェルのpH7.4洗浄バッファーを用いて3回洗浄した。最後に、100μl/ウェルのTMBを各ウェルに添加し、0.64M H2SO4を使用して反応を終結させた。プレートを450nMでThermo Multiscan FCで読み取った(図22A〜図22Eを参照のこと)。
pH依存性結合親和性を、pH4、pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH7.4などの種々のpHでさらに測定した。ELISAによる測定を、上記の方法と同様に実施した。高結合透明ポリスチレン96ウェルプレートを、100μl/ウェルの、高pHコーティングバッファー中0.5μg/mlのhPD−L1−hisを用いてコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。次いで、コーティングしたプレートを、PBS +0.1% Tween 20(Amresco)を用いて自動プレート洗浄機で10秒間振盪しながら3回洗浄した。次いで、200μlのブロッキングバッファー(1% BSA(Solarbio)+1%正常ヤギ血清(Solarbio)+0.05% Tween 20(Amresco))を、各ウェルに添加し、次いで、プレートを室温で2時間インキュベートし、上記のように3回洗浄した。ブロッキングバッファーを吸引した後、100μlの、pH7.4の希釈バッファー(1% BSA (Solarbio)+1%正常ヤギ血清(Solarbio)+0.01% Tween 20 (Amresco))で段階希釈した抗体(すなわち、293細胞によって産生された23A11 H3L5、23F11 H4L4および22C9−C)を添加し、プレートを室温で40分間インキュベートした。次いで、プレートを250μl/ウェルの、pH7.4、pH6.0、pH5.5、pH5.0、pH4.5またはpH4.0の洗浄バッファーを用いて1回洗浄し、次いで、100μl/ウェルpH7.4またはpH5.5の洗浄バッファーを添加し、インキュベーションを振盪しながら室温で2時間継続した。その後、プレートをpH7.4の洗浄バッファーで3回洗浄し、100μl/ウェルの、pH7.4希釈バッファー中のHRPコンジュゲートされたヤギ抗hIgG HRP抗体(1:20000、Abcam)の溶液を、プレートの各ウェルに添加した。その後、プレートを、室温で60分間インキュベートさせ、続いて、250μl/ウェルの、pH7.4洗浄バッファーを用いて3回洗浄した。最後に、100μl/ウェルのTMBを各ウェルに15分間添加し、50μl/ウェルの0.16M/L硫酸を使用して反応を終結させた。プレートを、450nMでThermo Multiscan FCで読み取った(図23A〜23Fを参照のこと)。測定は3連で実施した。
1. 変異体ヒトPD−L1組換えタンパク質の作製
細胞外ヒトPD−L1(アミノ酸19〜238)およびヒトIgG1のFc断片のcDNAコーディングを、in vitroで合成した(配列番号107は、アミノ酸配列であり、配列番号108は、対応するDNA配列である)。以下に列挙される、指定された位置での単一アミノ酸変更を有するヒトPD−L1のバリアントを、以下に記載されるようなオーバーラップPCRによって、(表7)に示されるプライマー(Dr.Oligo BLP−192、Biolytic)を使用して増幅した。得られた断片を、それぞれ、5’および3’末端でHind IIIおよびBamH Iについて制限酵素を用いて消化した。次いで、PCR産物を、Synoアセンブリーミックス試薬(Synbio)を、製造業者の説明書に従って使用する相同組換えの方法によってpcDNA3.1(+)ベクターにクローニングした。プラスミドは、精製したQIAGEN Plasmid Megaキット(QIAGEN)であった。
METDTLLLWVLLLWVPGSTGFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERENLYFQGAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
AAGCTTgccgccaccATGGAAACCGACACTCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGGTCAACCGGGTTCACCGTGACAGTGCCCAAGGACCTGTACGTGGTGGAGTACGGCAGCAACATGACCATCGAGTGCAAGTTCCCCGTGGAGAAGCAGCTGGATCTGGCCGCCCTGATCGTGTATTGGGAGATGGAGGACAAGAACATCATCCAGTTCGTGCACGGCGAAGAGGACCTGAAGGTGCAGCACAGCAGCTACAGGCAGAGGGCCAGACTGCTGAAGGACCAGCTGTCTCTGGGAAACGCAGCTCTGCAGATCACCGACGTGAAGCTGCAGGACGCAGGAGTCTACCGCTGCATGATCAGCTACGGCGGAGCCGACTACAAGAGGATCACCGTGAAGGTCAACGCCCCCTACAACAAGATCAACCAGAGAATCCTGGTGGTGGACCCCGTGACCAGCGAGCACGAGCTGACTTGTCAGGCAGAGGGCTACCCCAAGGCCGAAGTGATTTGGACCAGCAGCGACCATCAGGTGCTGAGCGGAAAGACCACCACCACCAACAGCAAGCGGGAGGAGAAGCTGTTCAACGTGACCAGCACCCTGCGGATCAACACCACCACCAACGAGATCTTCTACTGCACCTTCCGGAGACTGGACCCAGAGGAGAACCACACAGCCGAGCTGGTCATCCCAGAACTGCCTCTGGCTCACCCTCCTAACGAGAGAGAGAATCTGTATTTTCAGGGAGCACCAGAACTGCTGGGAGGACCATCCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAACCTAAGGACACCCTGATGATTAGCAGAACACCAGAAGTCACTTGCGTGGTCGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAAGTCAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTCGAGGTGCATAATGCTAAGACCAAACCAAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTATAGGGTCGTGTCCGTCCTGACAGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAATGCAAGGTGTCTAACAAGGCCCTGCCAGCTCCCATCGAGAAGACTATTAGTAAAGCTAAGGGCCAGCCCCGCGAACCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCATCCCGAGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTCTCTCTGACTTGTCTGGTGAAGGGATTCTATCCATCAGATATCGCAGTGGAGTGGGAAAGCAATGGCCAGCCCGAGAACAATTACAAGACTACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGATGGCTCTTTCTTTCTGTATTCTAAACTGACCGTGGATAAGAGTCGGTGGCAGCAGGGGAATGTCTTTTCATGCAGCGTGATGCACGAGGCACTGCACAATCATTACACTCAGAAGTCCCTGTCACTGTCACCTGGAAAGtagGGATCC
μl
ddH2O 35
5×S15 PCRバッファー 10
10mM dNTP 1
Fプライマー 1
Rプライマー 1
PCR産物 1
S15ポリメラーゼ 1
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
50
最初の変性: 98℃ 1分
変性: 98℃ 15秒
アニーリング: 58℃ 30秒
伸長: 72℃ Kbあたり30秒
最終的な伸長: 72℃ 3分 30サイクル
ステップ2:2つの小片を一緒に接合するために
以下の反応を氷上で設定する(相同組換え):
Synoアセンブリーミックス 10μl
配列産物1 2μl
配列産物2 2μl
脱イオンH2O 6μl
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
総体積 20μl
上清を使用して、以下に記載されるようにELISAによってPD−L1抗体の結合を検出した。
高結合透明ポリスチレン96ウェルプレート(Nunc)を、100μl/ウェルの、高pHバッファー中の0.5μg/mlの抗ヒトFc抗体(Abcam)からなるコーティング溶液を用いて、室温で1時間コーティングした。次いで、プレートを、洗浄バッファー(PBS+0.1% Tween 20(Sigma))を使用して自動プレート洗浄機で1回洗浄し、続いて、200μlのブロッキングバッファー(PBS+1% BSA+1%正常ヤギ血清+0.05% Tween−20)を、各ウェルに添加した。プレートを4℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを洗浄バッファーを用いて1回洗浄し、160μlの、種々の変異体ヒトPD−L1−Fcタンパク質またはDMEM中の500ng/mlの野生型ヒトPD−L1−Fcタンパク質を含有するDMEM上清を、各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを上記の方法を使用して3回洗浄した。0.5μg/mlのマウス抗PD−L1抗体を添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートを、200μl/ウェルのpH7.4の洗浄バッファーを使用して3回洗浄した後、100μl/ウェルの、希釈バッファーで希釈したHRPがコンジュゲートされたマウスIgG抗体(1:20000、Pierce)の溶液を、プレートの各ウェルに添加した。その後、ELISAプレートを、室温で60分間インキュベートし、次いで、200μl/ウェルのpH7.4の洗浄バッファーを用いて3回洗浄した。最後に、100μl/ウェルのTMBを、各ウェルに添加し、0.64M H2SO4を使用して反応を終結させた。プレートを、450nMでThermo Multiscan FCで読み取った(図24を参照のこと)。
高結合透明ポリスチレン96ウェルプレート(Nunc)を、100μl/ウェルの、高pHバッファー中の0.5μg/mlの、その他のPD−L1抗体と対を形成し得る抗ヒトFc(マウス抗体について)または抗hPD−L1抗体からなるコーティング溶液を用いて、室温で1時間コーティングした。次いで、プレートを洗浄バッファー(PBS+0.1% Tween 20(Sigma))を使用して自動プレート洗浄機で1回洗浄し、続いて、200μlのブロッキングバッファー(PBS+1% BSA+1%正常ヤギ血清+0.05% Tween−20)を各ウェルに添加した。プレートを4℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを洗浄バッファーを用いて1回洗浄し、160μlの、種々の変異体ヒトPD−L1−Fcタンパク質またはDMEM中の500ng/mlの野生型ヒトPD−L1−Fcタンパク質を含有するDMEM上清を、各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを上記の方法を使用して3回洗浄した。0.5μg/mlの、上記で作製したビオチン化ヒト化抗PD−L1抗体(23F11−H4L4−bioおよび23A11−H3L5−bio)またはPD−1タンパク質を添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートを、200μl/ウェルのpH7.4の洗浄バッファーを使用して3回洗浄した後、次いで、100μl/ウェルの、希釈バッファーで希釈したHRPがコンジュゲートされた抗マウスFc抗体(Abcam)またはHRPがコンジュゲートされたニュートラアビジン(1:5000、Pierce)の溶液を、プレートの各ウェルに添加した。その後、ELISAプレートを、室温で60分間インキュベートし、次いで、200μl/ウェルのpH7.4の洗浄バッファーを用いて3回洗浄した。最後に、100μl/ウェルの、TMBを、各ウェルに添加し、0.64M H2SO4を使用して反応を終結させた。プレートを、450nMでThermo Multiscan FCで読み取った(図24を参照のこと)。
CHO−K1細胞における一過性の発現を使用して抗体を産生した。プロテインA親和性カラムを使用して産生された抗体を精製し、脱塩すると、抗体が、PBS中に5mg/mlで、<3ユニット/mgの内毒素レベルを有して製剤化された。得られた抗体を、SDS−PAGEゲルおよびSEC−HPLCを使用して純度について特徴付けた。
選択された抗体遺伝子の重鎖および軽鎖の可変領域を合成し、発現ベクター中にクローニングした。得られた発現構築物を使用して、血清不含培地において成長するように適応しているCHO−K1細胞をトランスフェクトした。10LのApplikonバイオリアクター中で10日成長させた後、培養培地を回収し、限外濾過膜を使用して細胞および細胞細片を除去し。清澄化した上清を限外濾過によって濃縮し、調製されたプロテインA(ヒトIgG)またはG−セファロース(マウスIgG)カラム上にアップロードした。UVモニターによるモニタリング下で、平衡バッファーを用いてベースラインまで洗浄した後、0.1Mのクエン酸、pH3.5を用いてカラムを次いで溶出し、溶出した抗体を1.0MのTris−HClバッファー、pH8.0を用いて直ちに中和し、PBS、pH7.2(Invitrogen)に対して2〜8℃で一晩、2回のバッファー交換を用いて透析した。精製抗体を、0.22μm滅菌シリンジフィルターを通して濾過し、−80℃以下でアリコートにして保存した。
ヒト化抗PD−L1抗体のin vivo活性を、実施例14に記載されたように評価した。
MC38/ヒト−PD−L1ノックイン腫瘍モデルにおけるヒト化PD−L1抗体4B6−H3L3−N297Aの抗腫瘍活性の試験を、実施例14に記載されたように実施し、結果は表10および図25に示された(PBS、BM−GTおよび4B6−H3L3−N297Aを使用する処置の結果が示された)。
この研究は、1mg/kg、3mg/kgまたは10mg/kgのいずれかで腹腔内に送達された場合に、腫瘍成長の阻害におけるヒト化抗PD−L1抗体の効果を評価するために設計されている。手短に述べると、2×10^6個のMC38/hPD−L1腫瘍細胞を、C57/BL6マウスにおいてこれまでに行ったように接種し、6日間成長させた。その時点で、80〜100mm^3の平均腫瘍体積を有するマウスを選択し、各群に8匹のマウスを有する群に無作為化した。各試験抗体を、個々のマウスに、1mg/kg、3mg/kgまたは10mg/kg(BM−GTについて)で、または等体積の23F11−H4L4(1mg/kg)で腹腔内に、6日目に出発して、週に3回投薬した。動物を、CO2吸入を用いて研究の最後(25日目)に犠死させた。腫瘍の大きさを、ノギス(INSIZE)を使用して2次元で週に2回測定し、体積を、式:V=0.5a×b2(式中、aおよびbは、それぞれ、腫瘍の長い直径および短い直径である)を使用してmm3で表した。腫瘍体積が、測定可能な大きさ未満に低下することなく、処置の開始時の腫瘍体積の<50%に低減した場合には、部分(PR)として、腫瘍量が、触知できなくなった場合には完全(CR)として腫瘍退縮を記録する(表11を参照のこと)。結果を、Prism GraphPadを使用して解析し、平均±S.E.M.として表した。T検定によって2群間の比較を行い、Pが<0.05である場合に差違は有意であると考えられる。図26Eは、種々の抗体(BM−GT、BM−ME、23A11−H3L5および23F11−H4L4)を用いて投薬された個々のマウスにおいて測定された腫瘍体積を示す。RTVは、同一マウスにおける1日目に測定された腫瘍体積と比較された相対腫瘍体積を表し、TVは、研究の最後の日(すなわち、25日目)に測定された腫瘍体積を表す。
この研究は、患者にヒト化抗体を使用するために期待する方法として静脈内に送達された場合に、腫瘍成長の阻害におけるヒト化抗体の効果を評価するために設計されている。手短に述べると、MC38/hPD−L1腫瘍細胞を、C57/BL6マウスにおいてこれまでに行ったように接種し、10日間成長させた。その時点で、180〜220mm3の平均腫瘍体積を有するマウスを選択し、各群に12匹のマウスを有する群に無作為化した。各試験抗体を、個々のマウスに、等体積の1mg/kgでIVで、0日目および15日目に投薬した。動物を、CO2吸入によって研究の最後に犠死させた。腫瘍の大きさを、ノギス(INSIZE)を使用して2次元で週に2回測定し、体積を、式:V=0.5a×b2(式中、aおよびbは、それぞれ、腫瘍の長い直径および短い直径である)を使用してmm3で表した。腫瘍体積が、測定可能な大きさ未満に低下することなく、処置の開始時の腫瘍体積の<50%に低減した場合には、部分(PR)として、腫瘍量が、触知できなくなった場合には完全(CR)として腫瘍退縮を記録する(表12を参照のこと)。結果を、Prism GraphPadを使用して解析し、平均±S.E.M.として表した。T検定によって2群間の比較を行い、Pが<0.05である場合に差違は有意であると考えられる。
PD−L1抗体を用いるIV処置で完全腫瘍クリアランスを達成したマウスが、持続的免疫応答を開始し、新規腫瘍が現れることを管理できるか否かを理解するために、本発明者らは、1mg/kgの23A11−H3L5または23F11−H4L4のいずれかを用いて10〜35日目まで投薬した場合に完全奏功を達成したマウスのサブセットにおいて、マウスに新鮮な腫瘍細胞を再負荷した。手短に述べると、これらのマウスの各々に、接種後35日に2×10^6個の新鮮な腫瘍細胞を注射した。新たに注入された腫瘍細胞は、注入の際に最初の5〜10日間は成長できたが、次いで、腫瘍は、大きさが減少し始め、50日目(再負荷の15日後)まで、任意の測定可能な腫瘍を有するマウスはなかった。これは、これらのマウスが、同一腫瘍細胞に対するメモリーを発達させ、抗体がそれらによって提示されなかったとしても、腫瘍阻害応答は、耐久性があることを実証する(図30を参照のこと)。
抗体は、その効果を発揮するために腫瘍中に浸透する必要がある。pH依存性抗体が、腫瘍中への浸透において利点を有するか否かおよび腫瘍におけるその残留時間の間に任意の差違があるか否かを評価するために、本発明者らは、in vivo画像処理研究を使用した。
2×10^6個MC38/hPD−L1細胞を、8週齢のC57BL/6マウスに皮下移植し、12匹のマウスを選択し、4群に無作為化した。腫瘍がおよそ220mm^3に成長した時点で、動物に0.2mlの抗体−色素溶液を静脈内に注射した。
チェックポイント阻害剤抗PD−L1抗体および抗VEGFR2抗体(抗血管新生)の組合せが、腫瘍成長をより良好に制御し得るか否かを評価するために、hPD−L1/MC38腫瘍を、DC101、マウスVEGFR2の中和活性を有する抗体を20mg/kgで、またはPD−L1抗体−23A11−キメラを最適下用量0.3mg/kgで、または両方を用いて処置した。手短に述べると、2×10^6個MC38/hPD−L1腫瘍細胞を、C57/BL6マウスにおいてこれまでに行ったように接種し、3日間成長させた。その時点で、各群に8匹のマウスを有する群に無作為化した。各試験抗体を、個々のマウスに、0.3mg/kgの23A11−キメラまたは20mg/kgのDC101または両方で腹腔内に、3日目に開始して、週に3回で3週間投薬した。動物を、CO2吸入を用いて研究の最後に犠死させた。腫瘍の大きさを、ノギス(INSIZE)を使用して2次元で週に2回測定し、体積を、式:V=0.5a×b2(式中、aおよびbは、それぞれ、腫瘍の長い直径および短い直径である)を使用してmm3で表した。結果を、Prism GraphPadを使用して解析し、平均±S.E.M.として表した。T検定によって2群間の比較を行い、Pが<0.05である場合に差違は有意であると考えられる。データは、組合せ処置は、腫瘍細胞の成長の阻害において、かなりより有効であることを示した(図32A〜図32Cを参照のこと)。
キャピラリーセル示差走査熱量測定(DSC)を利用して、温度増大の際のサンプルおよび参照間の熱分化を検出することによって、タンパク質の熱安定性を評価する。具体的には、液体中のタンパク質の相対的安定性の指標である熱転移中点(Tm)を測定するために使用される。抗体23F11−H4L4または23A11−H3L5(CHO細胞において産生される)を、バッファー(20mM His−His−HCl、5%スクロース、pH=6.0)を用いて1mg/mlに希釈し、DSC96ウェルトレイに添加した。10〜110°Cの温度範囲および200℃/時間のスキャン速度を用いるMicroCal VP−DSCキャピラリーセルマイクロカロリメーター(GE)を用いてサンプルを流し、結果をMicroCal VPキャピラリーDSC自動解析ソフトウェアを用いて解析した。キャピラリーセルDSC試験結果を、以下の表13に、ならびに図33Aおよび33Bに示した。
本明細書において記載される抗PD−L1抗体の結合にとってのE58の残基の重要性を、実施例18に記載したようにELISAベースの結合アッセイを使用して抗体について解析した。野生型抗PD−L1タンパク質またはE58Aを有する変異体のいずれかを産生し、同一プレート上で抗体の2種のタンパク質との相対結合を実施し、結果を、以下の表14に示す。
23F11−H4L4(CHO細胞由来)が、内部移行され得るか否かを評価するために、本発明者らは、以下の実験を実施した。二次抗体ヤギ抗ヒトFcを、pHAbアミン反応性色素(Sigma、G9845)、pH感受性色素を用いてまず標識した。この色素は、中性pHで蛍光ではないが、酸性pHで高度に蛍光になる。この色素で標識された抗体が、細胞内エンドソーム(pH6.0〜6.5)およびリソソーム(4.5〜5.5)中に内部移行されると、高度の蛍光シグナルが検出され得る。具体的には、MC38−hPD−L1細胞(MabSpace)を、10% ウシ胎児血清(Hyclone)を含有するRPMI−1640中で培養した。遠心分離することによって対数期成長細胞を集め、細胞を、96−ウェルプレート中、2×10^4個/ウェル(50μl/ウェル)の密度で播種し、細胞を一晩接着させた。次いで、2μg/mlの、pHAbアミン反応性色素を用いて標識したヤギ抗ヒトFc(Jackson ImmunoResearch、カタログ番号109−005−098)(25μl/ウェル)を、各ウェルに添加し、続いて、段階希釈した23F11−H4L4またはhIgG1(25μl/ウェル)を各ウェル中に添加した。抗体を細胞とともに37℃で6時間または24時間インキュベートさせた。インキュベーションの最後に培養培地を除去した後に、100μlのPBSを各ウェルに添加した。プレートの各ウェルにおける抗体のシグナルを、Varioskan Flash(Thermo Scientific)を使用して、Ex 532nm/Em 560nmのスペクトルで読み取ることによって決定した。グラフ中のデータは、6または24時間後に細胞において濃度依存的に、蛍光シグナルの有意な増大があることを示した。これらの結果は、23F11−H4L4は、MC38/hPD−L1細胞の表面上のhPD−L1との結合の際に効率的に内部移行され得るということを実証した(図35を参照のこと)。
Ficoll−Paque密度勾配遠心分離を使用して白血球搬出パックから末梢血単球を単離し、2% FBSを含むPBS中に再懸濁した。細胞を、培養培地で0.5×10^7個細胞/mlの密度に希釈し、次いで、抗ヒトCD3抗体(OKT3、ebioscience、カタログ番号16−0037)でコーティングされたプレートに添加した(1μg/ml、1ml/ウェル)。抗ヒトCD28(BD、カタログ番号555725)を各ウェルに添加し、次いで、細胞を、RPMI1640および10%FBSを有する6−ウェルプレート中で、37℃で3日間培養した。その後、細胞を集め、96ウェル丸底プレート中、FACSバッファー(PBS+5%BSA)に入れた。遠心分離後、上清を廃棄し、段階希釈した23F11−H4L4抗体またはN297A変異を有するhIgG1を陰性対照として添加した。プレートを4℃で1時間インキュベートし、次いで、細胞を、PBSを使用して3回洗浄した。その後、2.5μ次いで細胞を、PBSを使用して3回洗浄した。その後、2.5Chuman IgG−APC(Biolegend、カタログ番号409306)を各ウェルに添加し、プレートを4℃で1時間インキュベートし、3回洗浄し、その後、フローサイトメーター(Beckman Cytoflex)によって解析した。
これまでの実験(例えば、実施例14および20)では、同系マウスにおけるPD−1タンパク質は、マウス起源であり、免疫抑制は、hPD−L1のマウスPD−1との結合によって媒介されている。マウスPD−1がhPD−1に変更される場合に、ヒト患者において存在する状況に、MC38/hPD−L1同系モデルにおける抗体処置に何らかの差違があるか否かをさらに評価するために、本発明者らは、MC38/hPD−L1腫瘍細胞をPD−1ノックインマウスに移植した。具体的には、MC38/hPD−L1腫瘍細胞を、大気中、5% CO2の雰囲気下、37℃で、10%熱不活化ウシ胎児血清(ExCell Biology)、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン(Hyclone)を補給したRPMI1640培地(Thermo Fisher)で単層培養としてin vitroで維持した。腫瘍細胞を、トリプシン−EDTA処置(Hyclone)によって週に2回ルーチンで継代培養した。対数増殖相で成長している細胞を回収し、hPD−L1 発現確認のFACS解析および腫瘍接種のためにカウントした。5〜6週齢の各PD−1ノックイン雌マウス(C57BL/6−Pdcd/tm1 (hPDCD1)、Beijing Biocytogen Co.、Ltd)を、腫瘍発生のために、0.1mlのPBS中のPD−L1発現(2×106)が確認されたMC38/hPD−L1腫瘍細胞を用いて右側腹部で皮下に接種した。処置は、腫瘍の大きさがおよそ100mm3に到達した、接種のおよそ7日後に開始した。各群は、10匹の腫瘍を有するマウスからなっていた(図37Aを参照のこと)。試験品(すなわち、23F11−H4L4)は、3mg/ml濃度の200μlの保存溶液を吸引し、1.8mlの調剤バッファー〔formulation buffer〕(ヒスチジン20mM、スクロース250mM、ポリソルベート80 0.02%、pH6.0±0.2)に希釈して、0.3 mg/mlの作業溶液を得ることによって調製し、静脈内注射によってマウスに投与した。腫瘍の大きさを、ノギス(INSIZE)を使用して2次元で週に2回測定し、体積を、式:V=0.5a×b2(式中、aおよびbは、それぞれ、腫瘍の長い直径および短い直径である)を使用してmm3で表した。腫瘍体積が、測定可能な大きさ未満に低下することなく、処置の開始時の腫瘍体積の<50%に低減した場合には、部分(PR)として、腫瘍量が、触知できなくなった場合には完全(CR)として腫瘍退縮を記録する。各処置群における腫瘍の大きさを、表15および図37Bおよび37Cに示す。これらのデータは、抗体23F11−H4L4を用いる処置は、有意な腫瘍成長阻害につながることを実証し、処置された10匹のマウスのうち5匹において腫瘍根絶〔eradiation〕または完全奏功し、一方で、生理食塩水を用いて処置したものは、すべて成長し、マウスのいずれにおいても腫瘍退縮を有さなかった。
抗体の単回静脈内注射の際のMC38/hPD−L1腫瘍における標的タンパク質ヒトPD−L1との抗体結合の期間を測定するために、本発明者らは、FACSを使用して、抗体注射後種々の時点で腫瘍から調製された単細胞における利用可能な標的タンパク質結合部位の量を測定した。具体的には、MC38/hPD−L1腫瘍細胞を、大気中、5% CO2の雰囲気下、37℃で、10%熱不活化ウシ胎児血清(ExCell Biology)、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン(Hyclone)を補給したRPMI1640培地(Thermo Fisher)で単層培養としてin vitroで維持した。腫瘍細胞を、トリプシン−EDTA処置(Hyclone)によって週に2回ルーチンで継代培養した。対数増殖相で成長している細胞を回収し、hPD−L1発現確認のFACS解析および腫瘍接種のためにカウントした。5〜6週齢の雌のC57B/L6マウス各々を、腫瘍発生のために、0.1mlのPBS中のPD−L1発現(2×106)が確認されたMC38/hPD−L1腫瘍細胞を用いて右側腹部で皮下に接種した。処置は、腫瘍の大きさがおよそ200〜300mm3に到達した、接種のおよそ12日後に開始し、3mpkで23F11−H4L4を用いて投薬した(表17を参照のこと)。受容体占有評価のために、投与後2日目、7日目および14日目に腫瘍を採取した。腫瘍を回収し、小断片に刻み、次いで、ACCUMAX(商標)細胞剥離溶液(STEMCELLカタログ番号07921)を、10ml/0.5gの組織の濃度で添加した。次いで、腫瘍塊懸濁液を室温で1〜2時間穏やかに振盪し、インキュベーションの間、ピペットで反復的に上下させて、細胞をさらに解離させた。インキュベーションの最後に、細胞懸濁液を、40μmのナイロンメッシュに通した。次いで、細胞を、冷PBSを用いて3回洗浄し、1500rpmで5分間遠心分離した。次いで、集められた細胞を1〜2mlのPBSに再懸濁し、総細胞数をカウントした。この後、50μlの細胞懸濁液(約1000000個細胞)を、各96ウェルプレートに添加した。細胞を、FACSバッファー(PBS中、1% BSA)を用いて2回洗浄した。次いで、細胞を、2μg/mlの23F11−H4L4抗体またはPBSまたはアイソタイプ対照とともにインキュベートした。混合物を、2〜8℃で、または氷上で少なくとも30分間インキュベートし、光から保護した。細胞を、FACSバッファーを用いて3回洗浄し、その後、1500rpmで5分間遠心分離した。抗ヒトIgG FC−FITC二次抗体を添加し、2〜8℃、暗所で30分間インキュベートし、続いて、細胞を、FACSバッファーを用いて3回洗浄した。最後に、細胞を、0.5mlのFACSバッファーに再懸濁し、フローサイトメーターを使用して解析した。フローサイトメーターデータ解析ソフトウェア(Cytoflex)およびGraphPad Prismを使用し、アイソタイプ対応対照抗体染色細胞との比較で、PD−L1陽性細胞のパーセンテージおよび平均蛍光強度(MFI)を算出した。23F11−H4L4のPD−L1との)または23F11−H4L4またはBM−GT(利用可能なPD−L1結合部位を検出するため)のin vivo結合を検出するための、アイソタイプ対照hIgG1−N197A(CrownBio、AB160160)の飽和量とともに in vitroでプレインキュベートされた細胞間の相対平均蛍光強度(RMFI)の変化の割合を使用して、受容体占有(RO)を推定した。値は、適当なアイソタイプ対照hIgG1−N297Aに対して正規化した。データ(表18を参照のこと)は、3mg/kgの23F11−H4L4の単回注射は、少なくとも7日間の持続した腫瘍PD−L1占有につながり得ることを示した。他方、3mg/kgのBM−GTは、2日超の腫瘍PD−L1占有を示したが、最初のより高い占有率にもかかわらず7日未満であり、これは、23F11−H4L4のpH依存性PD−L1結合特性が、抗体が、腫瘍中に長期間留まることおよび腫瘍細胞上のPD−L1と結合することを可能にすることを実証する。
正常同系C57B/L6マウスにおいて成長したMC38/hPD−L1腫瘍を有する3匹のマウスを、腫瘍が200〜300mm3に到達した時点で、10mg/kgの23F11−H4L4単回静脈内注射を用いて処置した。腫瘍浸透および腫瘍浸潤リンパ球(TIL)解析のために、抗体投与後7日目に腫瘍を採取した。具体的には、Optimal Cutting Temperature(O.C.T.)(Tissue Tek)を、製造業者の説明書に従って使用して、腫瘍塊を調製した。6μm厚の組織切片を調製し、組織スライドをメタノールで固定化し、続いて、PBSを用いて洗浄し、次いで、0.2% TritonX−100を用いて5分間透過処理した。次いで、スライドをPBSを用いて洗浄し、ブロッキングバッファー(1×PBS中、3.0% BSA)を用いて、30〜60分間、室温でブロッキングし、続いて、スライドをPBS−Tを用いて3回、各5分間洗浄した。次いで、PBSで希釈した、Alexa Fluor 488ヤギ抗ヒトIgG(H+L)二次抗体(Thermo、カタログ番号A11013、23F11−H4L4を検出するため)、Alexa Fluor(登録商標)594抗マウスCD31抗体(Biolegend、カタログ番号102520、脈管構造を検出するため)およびAlexa Fluor(登録商標)594抗マウスCD8a抗体(Biolegend、カタログ番号100758、CD8T細胞を検出するため)を切片に適用し、暗所、4℃で一晩インキュベートさせた。二次抗体を排水し、PBS−Tを用いてスライドを3回(各5分)洗浄した後、スライドをDAPIを用いて対比染色し、ガラスカバースリップで覆い、暗所、4℃で保存した。蛍光顕微鏡(Nikon Ni−U)を使用して、対照凍結組織切片との比較で、23F11−H4L4およびTILの遺伝子座および分布を解析した。
Claims (74)
- 重鎖HCDR1、HCDR2およびHCDR3ならびに軽鎖LCDR1、LCDR2およびLCDR3配列を含む単離されたPD−L1抗体であって、
HCDR1配列は、TYWX1H(配列番号1)またはその少なくとも80%の配列同一性のある相同体配列であり、
HCDR2配列は、MIQPNSGGTKYNX2X3FKX4(配列番号2)またはその少なくとも80%の配列同一性のある相同体配列であり、
HCDR3配列は、GAGTVDYFDY(配列番号3)またはその少なくとも80%の配列同一性のある相同体配列であり、
LCDR1配列は、RASESVDIYGNSFMH(配列番号4)またはその少なくとも80%の配列同一性のある相同体配列であり、
LCDR2配列は、RASNLES(配列番号5)またはその少なくとも80%の配列同一性のある相同体配列であり、
LCDR3配列は、X5QSX6X7DPYT(配列番号6)またはその少なくとも80%の配列同一性のある相同体配列であり、
X1は、IまたはMであり、X2は、DまたはEであり、X3は、QまたはKであり、X4は、NまたはKであり、X5は、QまたはHであり、X6は、NまたはTであり、X7は、DまたはEである、単離されたPD−L1抗体。 - X1が、Iであり、X2が、Dであり、X3が、Qであり、X4が、Nであり、X5が、Qであり、X6が、Nであり、X7が、Dである、請求項2に記載の抗体。
- X1が、Mであり、X2が、Eであり、X3が、Kであり、X4が、Kであり、X5が、Qであり、X6が、Tであり、X7が、Eである、請求項2に記載の抗体。
- 配列番号7〜12またはその少なくとも80%の配列同一性のある相同体から選択される1、2、3、4、5または6種のCDRを含む、単離されたPD−L1抗体。
- HFR1、HFR2、HFR3およびHFR4の重鎖フレームワーク配列ならびにLFR1、LFR2、LFR3およびLFR4の軽鎖フレームワーク配列を含み、重鎖可変領域の配列が、式:HFR1−HCDR1−HFR2−HCDR2−HFR3−HCDR3−HFR4に従い、軽鎖可変領域の配列が、式LFR1−LCDR1−LFR2−LCDR2−LFR3−LCDR3−LFR4に従う、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体。
- HFR1配列が、Xa1VQLXa2QXa3GAEXa4Xa5KPGASVKXa6SCKASGYXa7FT(配列番号13)であり、
HFR2配列が、WVXa8QXa9PGQGLEWIG(配列番号14)であり、
HFR3配列が、Xa10Xa11TLTVDXa12SXa13Xa14TAXa15MXa16LSXa17LXa18SXa19DXa20AVXa33YCAR(配列番号15)であり、
HFR4配列が、WGXa34GXa21TXa35Xa22Xa23SS(配列番号16)であり、
LFR1配列が、Xa36IVXa37TXa24Xa38PXa25Xa39LXa26VSXa27GXa40RXa41TIXa28C(配列番号17)であり、
LFR2配列が、WYQQKPGQXa29PKLLIY(配列番号18)であり、
LFR3配列が、GXa42PXa43RFXa44GSGXa45Xa46RTDFTXa47TIXa48Xa49V Xa50AXa30DXa31AXa51YXa52C(配列番号19)であり、
LFR4配列が、FGXa53GTKLEXa32K(配列番号20)であり、
Xa1が、QまたはLであり、Xa2が、QまたはVであり、Xa3が、SまたはPであり、Xa4が、LまたはVであり、Xa5が、VまたはKであり、Xa6が、LまたはVであり、Xa7が、T、SまたはIであり、Xa8が、W、KまたはRであり、Xa9が、RまたはAであり、Xa10が、R、KまたはTであり、Xa11が、VまたはAであり、Xa12が、KまたはTであり、Xa13が、SまたはIであり、Xa14が、SまたはTであり、Xa15が、YまたはSであり、Xa16が、QまたはEであり、Xa17が、S、GまたはRであり、Xa18が、TまたはRであり、Xa19が、EまたはDであり、Xa20が、SまたはTであり、Xa21が、TまたはSであり、Xa22が、SまたはTであり、Xa23が、VまたはIであり、Xa24が、QまたはHであり、Xa25が、A、KまたはVであり、Xa26が、A、SまたはTであり、Xa27が、L、AまたはVであり、Xa28が、SまたはTであり、Xa29が、S、PまたはAであり、Xa30が、D、E、NまたはQであり、Xa31が、V、LまたはTであり、Xa32が、L、TまたはIであり、Xa33が、FまたはYであり、Xa34が、TまたはQであり、Xa35が、VまたはLであり、Xa36が、DまたはSであり、Xa37が、MまたはLであり、Xa38が、TまたはSであり、Xa39が、FまたはSであり、Xa40が、DまたはQであり、Xa41が、VまたはAであり、Xa42が、VまたはIであり、Xa43が、DまたはAであり、Xa44が、TまたはSであり、Xa45が、YまたはSであり、Xa46が、GまたはRであり、Xa47が、FまたはLであり、Xa48が、SまたはNであり、Xa49が、TまたはPであり、Xa50が、QまたはEであり、Xa51が、VまたはTであり、Xa52が、FまたはYであり、Xa53が、AまたはGである、請求項5に記載の抗体。 - Xa1が、Qであり、Xa2が、Vであり、Xa3が、Sであり、Xa4が、Vであり、Xa5が、Kであり、Xa6が、Lであり、Xa7が、Iであり、Xa8が、Kであり、Xa9が、Rであり、Xa10が、RまたはKであり、Xa11が、Aであり、Xa12が、Kであり、Xa13が、Iであり、Xa14が、Sであり、Xa15が、Yであり、Xa16が、Eであり、Xa17が、Rであり、Xa18が、Tであり、Xa19が、Dであり、Xa20が、Tであり、Xa21が、TまたはSであり、Xa22が、TまたはSであり、Xa23が、IまたはVであり、Xa24が、Qであり、Xa25が、Aであり、Xa26が、Aであり、Xa27が、Vであり、Xa28が、Tであり、Xa29が、AまたはPであり、Xa30が、Qであり、Xa31が、Tであり、Xa32が、TまたはIであり、Xa33が、Yであり、Xa34が、Qであり、Xa35が、Lであり、Xa36が、Dであり、Xa37が、Lであり、Xa38が、Sであり、Xa39が、Sであり、Xa40が、Qであり、Xa41が、Aであり、Xa42が、Iであり、Xa43が、Aであり、Xa44が、Sであり、Xa45が、Sであり、Xa46が、Rであり、Xa47が、Lであり、Xa48が、Nであり、Xa49が、Pであり、Xa50が、Eであり、Xa51が、Tであり、Xa52が、Yであり、Xa53が、Gである、請求項6に記載の抗体。
- Xa1が、Qであり、Xa2が、Vであり、Xa3が、Sであり、Xa4が、Vであり、Xa5が、Kであり、Xa6が、Lであり、Xa7が、Iであり、Xa8が、Kであり、Xa9が、Rであり、Xa10が、Rであり、Xa11が、Aであり、Xa12が、Kであり、Xa13が、Iであり、Xa14が、Sであり、Xa15が、Yであり、Xa16が、Eであり、Xa17が、Rであり、Xa18が、Tであり、Xa19が、Dであり、Xa20が、Tであり、Xa21が、Tであり、Xa22が、Sであり、Xa23が、Iであり、Xa24が、Qであり、Xa25が、Aであり、Xa26が、Aであり、Xa27が、Vであり、Xa28が、Tであり、Xa29が、Aであり、Xa30が、Qであり、Xa31が、Tであり、Xa32が、Tであり、Xa33が、Yであり、Xa34が、Qであり、Xa35が、Lであり、Xa36が、Dであり、Xa37が、Lであり、Xa38が、Sであり、Xa39が、Sであり、Xa40が、Qであり、Xa41が、Aであり、Xa42が、Iであり、Xa43が、Aであり、Xa44が、Sであり、Xa45が、Sであり、Xa46が、Rであり、Xa47が、Lであり、Xa48が、Nであり、Xa49が、Pであり、Xa50が、Eであり、Xa51が、Tであり、Xa52が、Yであり、Xa53が、Gである、請求項6に記載の抗体。
- Xa1が、Qであり、Xa2が、Vであり、Xa3が、Sであり、Xa4が、Vであり、Xa5が、Kであり、Xa6が、Lであり、Xa7が、Iであり、Xa8が、Kであり、Xa9が、Rであり、Xa10が、Kであり、Xa11が、Aであり、Xa12が、Kであり、Xa13が、Iであり、Xa14が、Sであり、Xa15が、Yであり、Xa16が、Eであり、Xa17が、Rであり、Xa18が、Tであり、Xa19が、Dであり、Xa20が、Tであり、Xa21が、Sであり、Xa22が、Tであり、Xa23が、Vであり、Xa24が、Qであり、Xa25が、Aであり、Xa26が、Aであり、Xa27が、Vであり、Xa28が、Tであり、Xa29が、Pであり、Xa30が、Qであり、Xa31が、Tであり、Xa32が、Iであり、Xa33が、Yであり、Xa34が、Qであり、Xa35が、Lであり、Xa36が、Dであり、Xa37が、Lであり、Xa38が、Sであり、Xa39が、Sであり、Xa40が、Qであり、Xa41が、Aであり、Xa42が、Iであり、Xa43が、Aであり、Xa44が、Sであり、Xa45が、Sであり、Xa46が、Rであり、Xa47が、Lであり、Xa48が、Nであり、Xa49が、Pであり、Xa50が、Eであり、Xa51が、Tであり、Xa52が、Yであり、Xa53が、Gである、請求項6に記載の抗体。
- 配列番号61に示される重鎖可変領域および配列番号62に示される軽鎖可変領域を含む、請求項1から3および5から9のいずれか一項に記載の抗体。
- 配列番号63に示される重鎖可変領域および配列番号64に示される軽鎖可変領域を含む、請求項1から3および5から9のいずれか一項に記載の抗体。
- 配列番号21に示される重鎖可変領域またはそのヒト化バージョンを含む、請求項4から9のいずれか一項に記載の抗体。
- 配列番号22に示される軽鎖可変領域またはそのヒト化バージョンを含む、請求項4から9および12のいずれか一項に記載の抗体。
- アッセイ試験によって測定される酸性pHでのPD−L1との結合およびアッセイ試験によって測定される中性pHでのPD−L1との結合を有し、酸性pHでのPD−L1との結合が、中性pHでのPD−L1との結合よりも実質的に低い、単離されたPD−L1抗体。
- 酸性pHでのPD−L1との結合が、中性pHでのPD−L1との結合の80%以下である、請求項14に記載の抗体。
- 中性pHが、7.4であり、酸性pHが、6.0、5.5、5.0、4.5または4.0である、請求項14または15に記載の抗体。
- 酸性pHがpH6.0、pH5.5またはpH5.0であり、中性pHがpH7.4である、請求項14から16のいずれか一項に記載の抗体。
- アッセイ試験が、ELISA、FACS、表面プラズモン共鳴、GSTプルダウン、エピトープ−タグ、免疫沈降、ファーウエスタン、蛍光共鳴エネルギー移動、時間分解蛍光イムノアッセイ(TR−FIA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、エンザイムイムノアッセイ、ラテックス凝集、ウエスタンブロット、免疫組織化学またはそれらの組合せのいずれかによって結合または遮断活性を測定する、請求項14から17のいずれか一項に記載の抗体。
- 先行する請求項のいずれか一項に記載の抗体と同一のエピトープと結合する、または先行する請求項のいずれか一項に記載の抗体との競合結合を有する、単離されたPD−L1抗体。
- エピトープが、以下のPD−L1のアミノ酸残基:E58、K62、N63、I64、S80およびY81のうち少なくとも1個を含む、請求項19に記載の抗体。
- エピトープが、以下のPD−L1のアミノ酸残基:R113、M115、Y123、K124およびR125のうち少なくとも1個をさらに含む、請求項19または20に記載の抗体。
- エピトープが、以下のPD−L1のアミノ酸残基の組合せ:1)E58、R113、M115、Y123およびK124、2)E58、S80、R113およびR125のうち1種を含む、請求項19から21のいずれか一項に記載の抗体。
- エピトープが、以下のPD−L1のアミノ酸残基:K62、N63、I64、Y81およびD122のうち少なくとも1個をさらに含む、請求項19から22のいずれか一項に記載の抗体。
- エピトープが、以下のPD−L1のアミノ酸残基の組合せ:1)E58、N63、I64、S80、Y81、R113およびR125、2)E58、S80、R113、M115、D122、Y123、K124およびR125、3)E58、K62、N63、S80、Y81、R113およびR125、4)E58、N63、I64、S80、Y81、R113、K124およびR125のうち1種を含む、請求項19から23のいずれか一項に記載の抗体。
- 対象においてPD−L1関連状態を処置するための方法であって、対象に、請求項1から24のいずれか一項に記載のPD−L1抗体を投与し、それによって状態を処置することを含む、方法。
- 抗体が、参照投与量の50%以下である投与量で投与され、参照投与量が、同等のin vivo治療効果を達成するように参照抗体によって決定され、参照抗体が、酸性pHおよび中性pHの両方でPD−L1との同様の結合を示し、参照抗体および抗体が、中性pHでPD−L1との同様の結合を有する、請求項25に記載の方法。
- 抗体が、参照投与頻度のものより少ない投与頻度で投与され、参照投与頻度が、同等のin vivo治療効果を達成するように参照抗体によって決定され、参照抗体が、酸性pHおよび中性pHの両方でPD−L1との同様の結合を示し、参照抗体および抗体が、中性pHでPD−L1との同様の結合を有する、請求項25または26に記載の方法。
- 抗体が、参照in vivo半減期よりも長い、標的臓器におけるin vivo半減期を有し、参照in vivo半減期が、参照抗体によって決定され、参照抗体が、酸性pHおよび中性pHの両方でPD−L1との同様の結合を示し、参照抗体および抗体が、中性pHでPD−L1との同様の結合を有する、請求項25から27のいずれか一項に記載の方法。
- 標的臓器が、血清、腎臓、肺、膵臓、肝臓、胆嚢、膀胱、皮膚、食道、卵巣、***、結腸、直腸、胃、脾臓または脳のうち1種または複数を含む、請求項28に記載の方法。
- 重鎖HCDR1’、HCDR2’およびHCDR3’ならびに軽鎖LCDR1’、LCDR2’およびLCDR3’配列を含む単離されたPD−L1抗体であって、
HCDR1’配列は、DYYMN(配列番号23)、配列番号29、35、41およびその少なくとも80%の配列同一性のある相同体配列からなる群から選択され、
HCDR2’配列は、DINPNNGGTSYNX’1KFX’2G(配列番号24)、配列番号30、36、42およびその少なくとも80%の配列同一性のある相同体配列からなる群から選択され、
HCDR3’配列は、VKWGDGPFAY(配列番号25)、配列番号31、37、43およびその少なくとも80%の配列同一性のある相同体配列からなる群から選択され、
LCDR1’配列は、X’3ASQNVGAAVA(配列番号26)、配列番号32、38、44およびその少なくとも80%の配列同一性のある相同体配列からなる群から選択され、
LCDR2’配列は、SASNX’4X’5T(配列番号27)、配列番号33、39、45およびその少なくとも80%の配列同一性のある相同体配列からなる群から選択され、
LCDR3’配列は、QQYSNYPT(配列番号28)、配列番号34、40、46およびその少なくとも80%の配列同一性のある相同体配列からなる群から選択され、
X’1は、HまたはQであり、X’2は、KまたはQであり、X’3は、KまたはQであり、X’4は、RまたはLであり、X’5は、YまたはEである、単離されたPD−L1抗体。 - X’1が、Qであり、X’2が、Qであり、X’3が、Qであり、X’4が、Rであり、X’5が、Yである、請求項30に記載の抗体。
- 配列番号65に示される重鎖可変領域および配列番号66に示される軽鎖可変領域を含む、請求項30から31のいずれか一項に記載の抗体。
- 1)HCDR1’が配列番号29であり、HCDR2’が配列番号30であり、HCDR3’が配列番号31である重鎖、
2)HCDR1’が配列番号35であり、HCDR2’が配列番号36であり、HCDR3’が配列番号37である重鎖または
3)HCDR1’が配列番号41であり、HCDR2’が配列番号42であり、HCDR3’が配列番号43である重鎖を含む、請求項30に記載の抗体。 - 1)LCDR1’が配列番号32であり、LCDR2’が配列番号33であり、LCDR3’が配列番号34である軽鎖、
2)LCDR1’が配列番号38であり、LCDR2’が配列番号39であり、LCDR3’が配列番号40である軽鎖または
3)LCDR1’が配列番号44であり、LCDR2’が配列番号45であり、LCDR3’が配列番号46である軽鎖を含む、請求項30または33に記載の抗体。 - 1)重鎖HCDR1’が配列番号29であり、HCDR2’が配列番号30であり、HCDR3’が配列番号31であり、軽鎖LCDR1’が配列番号32であり、LCDR2’が配列番号33であり、LCDR3’が配列番号34である、
2)重鎖HCDR1’が配列番号35であり、HCDR2’が配列番号36であり、HCDR3’が配列番号37であり、軽鎖LCDR1’が配列番号38であり、LCDR2’が配列番号39であり、LCDR3’が配列番号40である、または
3)重鎖HCDR1’が配列番号41であり、HCDR2’が配列番号42であり、HCDR3’が配列番号43であり、軽鎖LCDR1’が配列番号44であり、LCDR2’が配列番号45であり、LCDR3’が配列番号46である、請求項30および33から34のいずれか一項に記載の抗体。 - 配列番号55、57および59からなる群から選択される重鎖可変領域を含む、請求項30および33から35のいずれか一項に記載の抗体。
- 配列番号56、58および60からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む、請求項30および33から46のいずれか一項に記載の抗体。
- 配列番号55の重鎖可変領域またはそのヒト化バージョンおよび配列番号56の軽鎖可変領域またはそのヒト化バージョンを含む、請求項30および33から37のいずれか一項に記載の抗体。
- 配列番号57の重鎖可変領域またはそのヒト化バージョンおよび配列番号58の軽鎖可変領域またはそのヒト化バージョンを含む、請求項30および33から37のいずれか一項に記載の抗体。
- 配列番号59の重鎖可変領域またはそのヒト化バージョンおよび配列番号60の軽鎖可変領域またはそのヒト化バージョンを含む、請求項30および33から37のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項30から40のいずれか一項に記載の抗体と同一のエピトープと結合する、または請求項30から40のいずれか一項に記載の抗体との競合結合を有する、単離されたPD−L1抗体。
- エピトープが、PD−L1のアミノ酸残基:E58およびS80のうち少なくとも1個を含む、請求項41に記載の抗体。
- エピトープが、以下のPD−L1のアミノ酸残基:Y56、R113、D122、Y123およびR125のうち少なくとも1個をさらに含む、請求項41または42に記載の抗体。
- エピトープが、以下のPD−L1のアミノ酸残基の組合せ:1)E58、R113、D122、Y123およびR125、2)Y56、E58およびR113、3)E58、R113およびR125のうち1種を含む、請求項41から43のいずれか一項に記載の抗体。
- エピトープが、以下のPD−L1のアミノ酸残基:S80およびD122のうち少なくとも1個をさらに含む、請求項41から44のいずれか一項に記載の抗体。
- エピトープが、以下のPD−L1のアミノ酸残基の組合せ:1)E58、S80、R113、D122、Y123およびR125、2)E58、S80、R113およびR125のうち1種を含む、請求項41から45のいずれか一項に記載の抗体。
- 示差走査熱量測定によって測定される、摂氏76℃超の熱転移中点(Tm)を有する、単離されたPD−L1抗体。
- 熱転移中点が、摂氏90℃超である、請求項47に記載の抗体。
- 二重特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、標識化抗体、二価抗体または抗イディオタイプ抗体である、請求項1から24および30から48のいずれか一項に記載の抗体。
- ラクダ化単一ドメイン抗体、ダイアボディ、scFv、scFv二量体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv−dsFv’、Fv断片、Fab、Fab’、F(ab’)2、dsダイアボディ、ナノボディ、ドメイン抗体、単離されたCDRおよび二価ドメイン抗体からなる群から選択される抗原結合断片である、請求項1から24および30から49のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項1から24および30から50のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。
- 請求項1から24および30から50のいずれか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項52に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項53に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
- ポリヌクレオチドによってコードされる抗体を産生する、請求項54に記載の宿主細胞。
- 請求項1から24および30から50のいずれか一項に記載の抗体または請求項51に記載の医薬組成物を含むキット。
- PD−L1抗体を産生する方法であって、ポリヌクレオチドが発現される条件下で、請求項54または請求項55に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
- 請求項1から24および30から50のいずれか一項に記載のPD−L1抗体ならびに第2の治療剤を含む医薬組成物。
- 第2の治療剤が、放射線療法、化学療法、標的化療法、遺伝子療法、免疫療法、ホルモン療法、血管新生阻害、緩和ケア、手術またはそれらの組合せにおいて使用される薬剤である、請求項58に記載の医薬組成物。
- 第2の治療剤が、VEGFR2抗体である、請求項59に記載の医薬組成物。
- 対象においてPD−L1関連状態を処置する方法であって、対象に、請求項30から50のいずれか一項に記載の抗体の治療有効量を投与することを含む、方法。
- 対象においてPD−L1関連状態を処置する方法であって、対象に、請求項59から61のいずれか一項に記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
- ヒトPD−L1タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された非ヒト腫瘍細胞。
- ヒトPD−L1タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む非ヒト腫瘍細胞を産生する方法であって、ヒトPD−L1をコードするポリヌクレオチドを導入することを含む、方法。
- 内因性非ヒトPD−L1遺伝子を不活性化することをさらに含む、請求項65に記載の方法。
- ヒトPD−L1に対する抗体のin vivo有効性をスクリーニングまたは評価する方法であって、ヒトPD−L1タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む非ヒト腫瘍細胞を非ヒト動物に接種することと、非ヒト動物において抗体を非ヒト腫瘍細胞と接触させることと、非ヒト腫瘍細胞の腫瘍量を決定することとを含む、方法。
- 以下のPD−L1のアミノ酸残基の組合せ:1)E58およびS80、2)E58およびR113、3)E58およびD122、4)E58およびR125のうち1種を含むエピトープと結合する、またはそれとの競合結合を有する、単離されたPD−L1抗体。
- エピトープが、以下のPD−L1のアミノ酸残基:Y56およびY123のうち少なくとも1種をさらに含む、請求項67に記載の抗体。
- エピトープが、以下のPD−L1のアミノ酸残基の組合せ:1)E58、R113、M115、Y123およびK124、2)E58、S80、R113およびR125、3)E58、R113、D122、Y123およびR125、4)Y56、E58およびR113、5)E58、R113およびR125のうち1種を含む、請求項67または68に記載の抗体。
- エピトープが、以下のPD−L1のアミノ酸残基:K62、N63、I64およびY81のうち少なくとも1個をさらに含む、請求項67から69のいずれか一項に記載の抗体。
- エピトープが、以下のPD−L1のアミノ酸残基の組合せ:1) E58、N63、I64、S80、Y81、R113およびR125、2)E58、S80、R113、M115、D122、Y123、K124およびR125、3)E58、K62、N63、S80、Y81、R113およびR125、4)E58、N63、I64、S80、Y81、R113、K124およびR125、5)E58、S80、R113、D122、Y123およびR125のうち1種を含む、請求項67から70のいずれか一項に記載の抗体。
- PD−L1のアミノ酸残基S80からなるエピトープと結合する、またはそれとの競合結合を有する、単離されたPD−L1抗体。
- 少なくとも7日の持続したPD−L1受容体占有期間を有する、単離されたPD−L1抗体。
- ELISAによって測定される約0.03μg/mlのEC50値で活性化されたヒトT細胞と結合する、単離されたPD−L1抗体。
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