JP2019503179A5 - - Google Patents

Description

ハイブリッドプロモーターおよびその使用

本願は、２０１６年１月２７日に米国特許商標庁に出願された米国仮特許出願第６２／３８８，３９１号からの優先権を主張する。

シークエンスリスト
本願は、ＡＳＣＩＩの形式で電子的に提出されているシークエンスリストを含むものである。このリスト全体は本明細書中参照として援用される。２０１７年１月２５日に作成された上記ＡＳＣＩＩのコピーは、ＪＵＳＴ００５１＿ＳＬ．ｔｘｔと命名されており、２５，４０８バイトの大きさである。

１．本発明の分野
本発明は、哺乳類細胞におけるタンパク質の組み換え産生に関する。

２．関連分野の論述
哺乳類細胞の培養における組み換え発現による治療用タンパク質の工業規模での産生は、規制ガイドラインと一致するまたはこれを超える組み換え発現の最大限の効率および製品品質の特徴を目指す、比較的近年での試みである。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の様々な細胞株を含む、異なる哺乳類細胞株が、組み換えタンパク質の産生に使用されている（たとえば、ＨｕらのＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１ ｉｎ ａ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（米国特許第６，２１０，９２４号）；ＧｏｅｐｆｅｒｔらのＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（米国特許第８，７７１，９８８号；およびＷｕｒｍ， Ｆ．Ｍ．， ＣＨＯ ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ− Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ， Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ １：２９６−３１１； ｄｏｉ：１０．３３９０／ｐｒ１０３０２９６ （２０１３）を参照）。

異なる遺伝子供給源由来のエンハンサーおよびプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターは、様々な宿主細胞において組み換え発現を高めるために使用されている（たとえばＨａｒｖｅｙ， Ｈｙｂｒｉｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ（国際特許公開公報第２００８／０２０９６０号；米国特許公報第２００８／１２４９２号）。

従来の研究は、ヒトＣＭＶプロモーターおよびマウスＣＭＶプロモーターが哺乳類細胞で高発現レベルの異種発現を駆動できることを示している（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ＆ Ｎａｇａｔａ， ｐＥＦ−ＢＯＳ， ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １８（１７）：５３２２ （１９９０）；Ｍａｓａｙｕｋｉ ＆ Ｔａｎａｋａ， Ｔｈｅ ＣＭＶ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ ＥＦ−１ａ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４７：１７９−１８１ （１９９７）； Ｃｈａｔｔｅｌｌａｒｄ， ＰらのＴｈｅ Ｌｕｐａｃ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍａｒｋｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（国際特許公開公報第２００６／０５８９００号）；Ｃｈａｔｔｅｌｌａｒｄ， Ｐ．らのＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｔｈｅ ｍＣＭＶ ＩＥ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（米国特許第７，８２４，９０７号；ＨｊｅｌｍｓｔｒｏｍらのＳｉｎｇｌｅ ＩＦＮ−ｂｅｔａ ｆｕｓｅｄ ｔｏ ａ ｍｕｔａｔｅｄ ＩｇＧ Ｆｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ（国際特許公開公報第２００９／０５３３６８号）；ＧａｕｃｈｅｒらのＣｅｌｌ ｌｉｎｅ ｈａｖｉｎｇ ａ ｈｉｇｈ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ｉｎ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（国際特許公開公報第２００８／０９６０７０号；ＦｌａｎｎｅｒｙらのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｌｕｂｒｉｃｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ（米国特許第７，６４２，２３６号）；ＭｏｓｙａｋらのＭｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｏｒ ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ａｇｅｎｔ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＬＩＮＧＯ−１ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｕｓｉｎｇ ａ ＬＩＮＧＯ−１ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（米国特許第７，６９３，６９８号）；Ｍｏｓｙａｋらの国際特許公開公報第２００７／０９２３７０号）。

イントロンの付加もまた、異種性のタンパク質の発現を増大させることができる（Ｌａｃｙ−Ｈｕｌｂｅｒｔ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｂｙ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｉｎｔｒｏｎｓ ｃａｎ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｅｎｅｓ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ８（８）：６４９−６５３ （２００１）； Ｂｒｉｎｓｔｅｒ， Ｒ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｒｏｎｓ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ８３６−４０ （１９８８））。ヒトおよびハムスターのＥＦ−１αプロモーターおよびイントロンは、遺伝子発現を効率的に促進することが示されている（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ＆ Ｎａｇａｔａ， ｐＥＦ−ＢＯＳ， ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８（１７）：５３２２ （１９９０）； Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｄｅｅｒ， Ｊ．， ＆ Ａｌｌｉｓｏｎ， Ｄ． Ｓ．， Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ ＥＦ−１ａｌｐｈａ Ｇｅｎｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ２０：８８０−８８９ （２００４）； Ａｌｌｉｓｏｎ， Ｄ．Ｓ．， Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｍａｋｉｎｇ ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（国際特許公開公報第２００６／０６３２９２号）； Ｏｒｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ−１ａｌｐｈａ−ｂａｓｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅ ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ， ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：５６ （２０１４））。

ヒトＥＦ−１αのイントロンと組み合わされたヒトまたはマウスのＣＭＶプロモーターの組み合わせは、イントロンを含まない発現コンストラクトを超える顕著な改善を示した（Ｋｉｍ， Ｓ．−Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ （ＥＦ−１ ａｌｐｈａ） ｆｉｒｓｔ ｉｎｔｒｏｎ ｈｉｇｈｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９３（２）：１８３−８７ （２００２））。

Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）は、細菌のトランスポゾンＴｎ１０によりコードされ、哺乳類細胞での遺伝子発現を調節するために使用されている。ＴｅｔＲは、テトラサイクリンの非存在下でＤＮＡ配列（ＴｅｔＯ）に結合する。テトラサイクリンに結合すると、ＴｅｔＲは、ＴｅｔＯに対するＴｅｔＲの結合を抑止する立体構造的な変化を起こす。Ｙａｏらは、ヒトＣＭＶエンハンサープロモーターが、ＴＡＴＡボックスと転写開始部位（ＴＴＳ）との間にＴｅｔＯを組み込むことによって、テトラサイクリンにより調節され得ることを示した（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ， ｔｅｔＲ， ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｔｅｔＲ−ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｆｕｓｉｏｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ， ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９（１３）：１９３９−５０ （１９９８）；Ｙａｏらの米国特許第５，９７２，６５０号；Ｙａｏらの国際特許公開公報第９９／００５１０号参照）。

様々な哺乳類細胞株における生物製剤の安定した生産を支援するために、大規模なバッチ培養または連続培養での哺乳類細胞によるタンパク質の高められた組み換え発現が必要とされており、本発明はこの高められた組み換え発現を提供する。

本発明は、対象とする１つまたは複数のタンパク質の組み換え発現を調節するためのハイブリッドプロモーターに関する。このハイブリッドプロモーターは、（ｉ）ｍＣＭＶエンハンサーエレメント（ｍＣＭＶ−Ｅ）およびその３’末端にＣＭＶプロモーター（ＣＭＶ−Ｐ）配列を含み、ラットＥＦ−１αイントロン配列に対し５’で操作可能に連結される、ｍＣＭＶエンハンサー配列と、
（ｉｉ）ｍＣＭＶエンハンサー配列のＣＭＶプロモーター配列の３’に、およびラットＥＦ−１αイントロン配列の５’に、操作可能に連結される介在性の第１のリーダー配列と、
（ｉｉｉ）ＥＦ−１αイントロン配列の３’に操作可能に連結される第２のリーダー配列
を含む。本発明のハイブリッドプロモーターにおけるラットＥＦ−１αイントロン配列とｍＣＭＶエンハンサー配列の組み合わせは、限定するものではないが、抗原結合タンパク質、イムノグロブリン、抗体または抗体フラグメンなどの、（たとえば疾患を治療するためのヒトの治療法としての）、生物学的な分子の工業生産に適した高い力価および高い特異的生産性を伴う、特にＣＨＯ細胞による、対象とするタンパク質の組み換え発現を促進し、いくつかの細胞株で試験された他のプロモーターよりも一般に優れていた。

したがって、本発明は、対象とする外因性タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの５’に操作可能に連結される本発明のハイブリッドプロモーター、およびオープンリーディングフレームの３’に操作可能に連結されるポリアデニル化部位を含む、発現カセットに関する。

本発明の別の態様は、上記ハイブリッドプロモーターを含む本発明の発現カセットを含む組み換え発現ベクターである。

また、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来する細胞、たとえばＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＤＸＢ１１細胞、またはＤＧ４４細胞などの、上記ハイブリッドプロモーターを伴う発現カセットを含む本発明の組み換え発現ベクターを含む哺乳類の宿主細胞も、本発明の中に含まれる。

また本発明は、対象とするタンパク質の発現を可能にする生理学的条件下での水系培地において、本発明の発現ベクターを含む哺乳類の宿主細胞を培養することと、上記培地から対象とするタンパク質を回収することとを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで対象とするタンパク質を産生する方法に関する。また本発明は、対象とするタンパク質のテトラサイクリン誘導性発現を含む、対象とするタンパク質を産生する方法を含む。

上述の概要は、本発明のすべての態様を定義すると意図されておらず、追加的な態様が、実施形態の詳細な説明などの他のセクションに記載される。本文書の全体は、統一された開示として関連していると意図され、たとえ本文書の同一の文、段落、またはセクションに特徴の組み合わせがまとめて見いだされなくても、本明細書中記載の特徴のすべての組み合わせが考慮されていることを、理解すべきである。

上記に加えて、本発明は、追加的な態様として、上記の特定の段落により定義されたバリエーションよりも狭い範囲の本発明の実施形態のすべてを、何等かの形で含む。たとえば、ある属として記載される本発明の特定の態様に関して、属のすべてのメンバーが個々に本発明の態様であることを理解すべきである。同様に、ある属として記載される態様またはある属のメンバーを選択した態様は、当該属の２つ以上のメンバーの組み合わせを包有することが、理解されるべきである。本出願人（ら）は、本明細書中記載の発明の完全な範囲を発明したが、本出願人らは、他の従来技術の研究に記載される対象を請求する意図を持つものではない。よって、特許請求の範囲内にある法定の従来技術が、特許庁または他の実体または個人による出願の参酌をもたらす場合では、本出願人（ら）は、当該法定の従来技術または法定の従来技術の明確なバリエーションを当該特許請求の範囲内から明確に排除するように当該特許請求の範囲の対象を再度定義するための、適用可能な特許法の下で補正する権利を行使する権利を保有している。このような補正された特許請求の範囲により定義される本発明のバリエーションもまた、本発明の態様として意図される。

いくつかの例示的な発現コンストラクトの概略的なマップを示す。 例示的なベクターＤの概略的なマップを示す。 図３Ａ〜Ｂは、ＤＸＢ１１細胞が８日目に１５０ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）を含むＰｒｏＣＨＯ（商標）４培養培地で産生したＦｃ―Ａタンパク質の力価（図３Ａ）および特異的生産性（図３Ｂ）を示す。各エラーバーは、１つの標本平均の標準誤差を使用して構築される。 図４Ａ〜Ｂは、ＤＸＢ１１細胞が８日目に５００ｎＭのＭＴＸでのＰｏｗｅｒＣＨＯ（商標）２培地で産生したＦｃ―Ａタンパク質の力価（図４Ａ）および特異的生産性（図４Ｂ）を示す。各エラーバーは、１つの標本平均の標準誤差を使用して構築される。 図５Ａ〜Ｂは、１０日目に、１μＭのＭＴＸでのＰｏｗｅｒＣＨＯ（商標）２培地におけるＤＧ４４および５００ｎＭのＭＴＸでのＥｘｃｅｌｌ３０２培地におけるＤＸＢ１１に関する、Ｆｃ−Ａタンパク質の力価（図５Ａ）および特異的生産性（図５Ｂ）を示す。各エラーバーは、１つの標本平均の標準誤差を使用して構築される。 ＬａｃＺの発現を駆動する本発明のｍＣＭＶエンハンサー／ｒＥＦ−１αイントロンハイブリッドプロモーターを伴うｐＪＶ５６の概略的なマップを示す。 ｍＣＭＶプロモーター（ｍＣＭＶ−Ｐ）の一部がヒトＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶ−Ｐ）およびＴｅｔＯ配列と置き換わっていることを除きｐＪＶ５６と同じである、ｐＪＶ５７の概略的なマップを示す。 ｐＪＶ５６と同じであるが、ｍＣＭＶプロモーター（ｍＣＭＶ−Ｐ）配列の一部と置き換えられた、最適化されたヒトＣＭＶプロモーター（（ｈＣＭＶ−Ｐ）；（Ｐａｔｗａｒｄｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１７３−７５ （２００９）に従う）を有する、ｐＪＶ５９の概略的なマップを示す。 最適化されたヒトＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶ−Ｐ）配列に一致させるためのＴｅｔＯ配列への変化（ＴｅｔＲ結合を維持）を除き、ｐＪＶ５７と同じである、ｐＪＶ６０の概略的なマップを示す。 ｍＣＭＶエンハンサーエレメント（「ｍＣＭＶＥ」）の３’で、ｍＣＭＶプロモーター（「ｍＣＭＶＰ」）中に挿入されたヒトＣＭＶプロモーター―Ｔｅｔオペレーター（ＴｅｔＯ；「Ｔｅｔ」）の概略図を以下に表す。この挿入は、ｈＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶＰ）配列でｍＣＭＶプロモーターの一部を置き換えた。第１のリーダー配列の相対的な位置もまた、「ＴＰＬ」により表される。 ｐＪＶ５６（配列番号１６）のセグメントおよびｐＪＶ５７（配列番号１５）のセグメントのＤＮＡ配列の概略的な比較を示す。配列番号１５に示されるｐＪＶ５７のセグメントは、部分的なｈＣＭＶプロモーター配列（配列番号２４）、および配列番号２４の３’で、ＴｅｔＯ配列（より小さなＴｅｔＯ配列の配列番号２９を含む、配列番号２３）を組み込むセグメント（配列番号９）を含む。ＴｅｔＯ配列（配列番号２９）で示される矢印は、パリンドロームのＴｅｔＲ結合部位を示す。ｍＣＭＶプロモーター（ｍＣＭＶ―Ｐ）配列およびｈＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶ―Ｐ）配列は、ＴＡＴＡボックス〜転写開始部位の配列である。配列番号２５は、ｐＪＶ５７およびｐＪＶ５６の両方で見いだされるｍＣＭＶ―Ｐ配列の３’末端であり、ｐＪＶ５７では、配列番号９に対して３’で見いだされる。転写開始は、配列番号２５の３’の部分配列ｔａｃｃｇ中のグアニン残基である。挿入されるＴｅｔＯ配列（配列番号２３）は、転写開始部位が、概してＴＡＴＡボックスの５’のＴに対して約３０塩基の３’であるため、転写開始部位に確実に影響を与えることに、留意されたい。第１のリーダー配列の相対的な位置もまた、「ＴＰＬ」により表され、ＴＰＬの５’末端のいくつかのヌクレオチド残基が示される。 ｐＪＶ５７およびｐＪＶ６０のＤＮＡ配列のセグメントの概略的な比較を示す。ｐＪＶ６０（配列番号１８）の示されるセグメントでは、対応するｐＪＶ５７（配列番号１７）のセグメント中のＴｅｔＯ配列が、Ｐａｔｗａｒｄｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１７３−７５ （２００９）による研究において転写開始部位の周りの発現を増大させた配列に一致するように変更された。 ｐＪＶ５６およびｐＪＶ５９のＤＮＡ配列のセグメントの概略的な比較を示す。このｐＪＶ５９（配列番号２０）のセグメントでは、ｐＪＶ５６（配列番号１９）中の対応する配列で最適化されたｈＣＭＶプロモーター配列が、本発明のｍＣＭＶエンハンサー／ラットＥＦ−１αイントロンハイブリッドプロモーターのバリエーションでのｍＣＭＶプロモーター（ｍＣＭＶ−Ｐ）配列の一部と置き換わった。 表記の各ベクターについて特異的なβガラクトシダーゼ発現の調節を示す。ＴｅｔＲを発現するＴ−ＲＥｘ（商標）−ＣＨＯ細胞を、ｐＪＶ５６、ｐＪＶ５７、ｐＪＶ５９、ｐＪＶ６０、または対照プラスミドｐｃＤＮＡ５／ＴＯ／ＬａｃＺで一時的にトランスフェクトした。細胞を２４時間インキュベートし、次に２４時間テトラサイクリン（Ｔｅｔ）で処理または処理しないで放置した。細胞を溶解し、ＬａｃＺを酵素学的に解析した。（−Ｔｅｔ）と比較した（＋Ｔｅｔ）との間の倍数差が、陽性対照（ｐｃＤＮＡ５／ＴＯ／ＬａｃＺ）を除き、バーの上に示される。 ＴｅｔＲに関するオープンリーディングフレームを含む、ｐＪＶ４０の概略的なマップを示す。 ｐＪＶ５６、ｐＪＶ５７、ｐＪＶ５９、ｐＪＶ６０、または対照プラスミドｐｃＤＮＡ５／ＴＯ／ＬａｃＺで一時的にトランスフェクトされた、ＴｅｔＲを発現するＣＨＯ−Ｋ１／ＴｅｔＲ細胞（クローン３Ｅ７）によるＬａｃＺの発現（βガラクトシダーゼのタンパク質）を表す。細胞を２４時間インキュベートし、次に２４時間テトラサイクリン（Ｔｅｔ）で処理または処理しないで放置した。細胞を溶解し、ＬａｃＺを酵素学的に解析した。（−Ｔｅｔ）と比較した（＋Ｔｅｔ）との間の倍数差が、バーの上に示される。 ｐＪＶ５６、ｐＪＶ５７、ｐＪＶ５９、ｐＪＶ６０、または対照プラスミドｐｃＤＮＡ５／ＴＯ／ＬａｃＺで一時的にトランスフェクトされた、ＴｅｔＲを発現するＣＨＯ−Ｋ１／ＴｅｔＲ細胞（クローン３Ｆ９）によるＬａｃＺの発現（βガラクトシダーゼのタンパク質）を表す。細胞を２４時間インキュベートし、次に２４時間テトラサイクリン（Ｔｅｔ）で処理または処理しないで放置した。細胞を溶解し、ＬａｃＺを酵素学的に解析した。（−Ｔｅｔ）と比較した（＋Ｔｅｔ）との間の倍数差が、バーの上に示される。 ｐＪＶ５６、ｐＪＶ５７、ｐＪＶ５９、ｐＪＶ６０、または対照プラスミドｐｃＤＮＡ５／ＴＯ／ＬａｃＺで一時的にトランスフェクトされた、ＴｅｔＲを発現するＣＨＯ−Ｋ１／ＴｅｔＲ細胞（クローン４Ｇ２）によるＬａｃＺの発現（βガラクトシダーゼのタンパク質）を表す。細胞を２４時間インキュベートし、次に２４時間テトラサイクリン（Ｔｅｔ）で処理または処理しないで放置した。細胞を溶解し、ＬａｃＺを酵素学的に解析した。（−Ｔｅｔ）と比較した（＋Ｔｅｔ）との間の倍数差が、バーの上に示される。

本明細書中使用されるセクションの表題は、単に構成を目的とするものであり、記載される対象を限定するように構築されるものではない。

定義
本明細書中他の定義がなされない限り、本願に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者が一般に理解する意味を有するものである。さらに、文脈によって他の意味が必要とされない限り、単数形は複数を含むものであり、複数形は単数形を含むものである。よって、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈で他の意味が明記されない限り、複数の指示対象を含む。たとえば、「１つのタンパク質（ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）」との表現は複数のタンパク質を含み、「１つの細胞（ａ ｃｅｌｌ）」との表現は、複数の細胞の集合を含む。

本発明は、対象とする１つまたは複数のタンパク質の組み換え発現を調節するためのハイブリッドプロモーターに関する。本発明のプロモーターは、ラットＥＦ−１αイントロン配列に操作可能に連結されるｍＣＭＶエンハンサー配列を含む。「ｍｕＣＭＶ」と互換可能に使用される用語「ｍＣＭＶ」は、ベータヘルペスウイルス亜科（ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｂｅｔａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）のヘルペスウイルスである、マウスのサイトメガロウイルスを指す。ｍＣＭＶは、マウスに対し宿主特異性を有するエンベロープ型の二本鎖ＤＮＡウイルスである。同様に、用語「ｈＣＭＶ」または互換可能に「ｈｕＣＭＶ」は、ヒトのサイトメガロウイルスを指す。

本発明に関して、「ｍＣＭＶエンハンサー配列」は、
（ｉ）ｍＣＭＶエンハンサーエレメント（「ｍＣＭＶ−Ｅ」）；およびこのｍＣＭＶエンハンサー配列の３’末端で、
（ｉｉ）ＣＭＶプロモーター配列（「ＣＭＶ−Ｐ」；すなわちＴＡＴＡボックスで始まり、かつＴＡＴＡボックス〜転写の開始部位を含むヌクレオチド配列のセグメント）：を含み；このＣＭＶプロモーター配列は、ｍＣＭＶ、ｈＣＭＶ、サルＣＭＶ、ラットＣＭＶ、もしくは他のいずれかの様々なＣＭＶに由来してよく、またはＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞において転写を可能するよう機能的である、最適化されたバージョンのＣＭＶ−Ｐであってよい。

用語「組み換え」は、物質（たとえば、核酸またはポリペプチド）が、ヒトの介入により人工的にまたは合成的に（すなわち天然ではなく）変更されていることを示す。この変更は、その天然の環境または状態内で、または天然の環境または状態から離れて物質に対し行われてよい。たとえば「組み換え核酸」は、たとえばクローニング、ＤＮＡシャフリングまたは他のよく知られた分子生物学的な手法の間に、核酸を組み換えることにより作製される核酸である。このような分子生物学的な手法の例は、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８２）で見いだされる。「組み換えＤＮＡ分子」は、このような分子生物学的な技術の手段により共に結合されたＤＮＡのセグメントから構成される。本明細書中で使用される用語「組み換えタンパク質」または「組み換えポリペプチド」は、組み換えＤＮＡ分子を使用して発現されるタンパク質分子を指す。「組み換え宿主細胞」は、組み換え核酸を含むおよび／または発現する細胞である。

ポリペプチド、核酸、宿主細胞などの生物学的な物質に関連して本明細書にわたり使用される用語「天然に存在する」は、天然で見いだされる物質を指す。

用語「制御配列」または「制御シグナル」は、特定の宿主細胞において、それが結合されるコード配列の発現およびプロセシングに影響を与えることができるポリヌクレオチド配列を指す。このような制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態では、原核生物に関する制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結部位を含み得る。真核生物に関する制御配列は、１つまたは複数の、転写因子に関する認識部位、転写エンハンサー配列またはエレメント、ポリアデニル化部位、および転写終結部位を含むプロモーターを含み得る。制御配列は、リーダー配列および／または融合パートナー配列を含んでよい。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡの短いアレイからなる（Ｍａｎｉａｔｉｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７ （１９８７））。プロモーターおよびエンハンサーのエレメントは、酵母、昆虫および哺乳類の細胞、およびウイルスの遺伝子を含む、様々な真核生物の供給源から単離されている（類似の調節エレメント、すなわちプロモーターは、原核生物でも見出される）。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、対象とするタンパク質を発現するためにどの細胞種を使用するかに依存する。真核生物のプロモーターおよびエンハンサーには、幅広い範囲の宿主を有するものもあり、限定した細胞種のサブセットで機能的であるものもある（論評に関しては、Ｖｏｓｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．， １１：２８７ （１９８６） ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７ （１９８７）を参照されたい）。

「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼが、１つまたは複数の下流の構造遺伝子によるメッセンジャーＲＮＡの転写を開始するために結合する部位を含むＤＮＡの領域である。プロモーターは、ＤＮＡ上の同じ鎖および上流（センス鎖の５’領域に向かって）で、遺伝子の転写開始部位の近くに位置する。プロモーターは、概して約１００〜１０００ｂｐの長さである。

一般的に、「エンハンサー」は、ある遺伝子の転写を活性化させるために１つまたは複数のアクチベータタンパク質（転写因子）と結合できるＤＮＡの短い（５０〜１５００ｂｐ）領域である。

本発明のハイブリッドプロモーターに有用なｍＣＭＶエンハンサー配列は、配列番号２のヌクレオチド配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、それはヌクレオチド位５８８で始まるＣＭＶプロモーター（ＣＭＶ−Ｐ）配列をその３’末端で含む（配列番号２において太字で下線が引かれている配列）（ＴＡＴＡボックスおよび転写開始点を含む、すなわち、ＴＡＴＡＡＧＡＧＧ ＣＧＣＧＡ Ｃ ＣＡＧＣＧ ＴＣＧＧ ＴＡＣＣＧ／／配列番号２８；下の配列番号２中で太字で下線が引かれている；配列番号２８は配列番号２６も含む）。

本発明のハイブリッドプロモーターに有用な別の例示的なｍＣＭＶエンハンサー配列は、配列番号３３のヌクレオチド配列に少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、それは５８８位で始まるＣＭＶプロモーター配列をその３’末端で含み（配列番号３３において太字で下線が引かれている配列）（ＴＡＴＡボックスおよび転写開始点、すなわち、ＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＴＴＣＧＴＣＴＣＴＡＧＡＣＧＣＣＡＡＣＣＧ／／配列番号３５；下の配列番号３３中で太字で下線が引かれている配列；配列番号３５は配列番号２４も含む）。

テトラサイクリン誘導性発現が望ましいいくつかの有用な実施形態では、本発明のハイブリッドプロモーターは、ｍＣＭＶエンハンサー配列の３’末端でＣＭＶプロモーター（ＣＭＶ−Ｐ）内に挿入される、ｍＣＭＶエンハンサー配列に対し３’で操作可能に連結される１つまたは複数のＴｅｔＯ配列を含む。「ＴｅｔＯ配列」は、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）に結合する能力を維持する、ヌクレオチド配列を意味する。ＴｅｔＯ配列は、対象とする遺伝子の転写を駆動するプロモーター中にＴｅｔＯを有していない対照、またはＴｅｔＲを有していない対照と比較して、ＴｅｔＲの存在下で、ＴｅｔＯへのＴｅｔＲの結合があり、それにより検出可能な度合に転写を妨害するように配置される。ＴｅｔＯ配列の例として、配列番号２９（ＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡ／／配列番号２９）と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する配列、または配列番号３４（ＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＣＡＧＴＴＣＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡ／／配列番号３４）と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する配列が、挙げられる。いくつかの有用な実施形態では、ＴｅｔＯ配列に対して５’または３’に追加的なヌクレオチド配列が存在してよく、またはＴｅｔＲタンパク質に結合できる能力が排除されない限り、介在性のヌクレオチドリンカー配列が存在し得る。

本発明の文脈の中での「抑制」または「抑制された」は、対象とする遺伝子の発現を駆動するプロモーター中のＴｅｔＯ結合部位にＴｅｔＲタンパク質が結合する場合に起こり、細胞（ＴｅｔＲを発現する細胞である）による対象とするタンパク質の発現の減少をもたらす、対象とする遺伝子（対象とするタンパク質をコードする遺伝子）の転写の妨害を指す。対象とする遺伝子または対象とするタンパク質の発現は、培地中のテトラサイクリンの存在下で、対象とするタンパク質の発現が、培地中のテトラサイクリンの不在下での細胞による発現の基底値よりも、少なくとも１．５倍超である場合に、「抑制解除された」と言われる。

「テトラサイクリン」は、テトラサイクリン、またはドキシサイクリン、アンヒドロテトラサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、メタサイクリン、クロルテトラサイクリン、もしくはＣＯＬ−３（化学的に修飾されたテトラサイクリン―３）などのテトラサイクリンの類似体を意味する。

本発明のハイブリッドプロモーターに有用なラットのＥＦ−１αイントロン配列は、配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

また、本発明のハイブリッドプロモーターは、操作可能な方向で、ｍＣＭＶエンハンサーの３’でおよびＥＦ−１αイントロン配列の５’で操作可能に連結される、介在性の第１のリーダー配列も含む。介在性の第１のリーダー配列は、約１０〜２００個の長さのヌクレオチド残基、より好ましくは約１０〜６０個の長さのヌクレオチド残基、またはさらにより好ましくは約２０〜５０個の長さのヌクレオチド残基であり、２０ｋｃａｌ超の安定性を伴ういずれの二次構造も欠如しており、いずれのＡＴＧ翻訳開始部位も欠如している。有用な第１のリーダー配列の例は、アデノウイルス３要素リーダー（ＴＰＬ）に由来する非翻訳（５’ＵＴＲ）リーダー配列、すなわち配列番号３のヌクレオチド配列である。

また、本発明のハイブリッドプロモーターは、操作可能な方向で、ＥＦ−１αイントロン配列の３’で操作可能に連結される第２のリーダー配列を含む。第２のリーダー配列は、約５〜２００個の長さのヌクレオチド残基、より好ましくは約１０〜２００個の長さのヌクレオチド残基、またはさらにより好ましくは約１０〜１５０個の長さのヌクレオチド残基であり、２０ｋｃａｌ超の安定性を伴ういずれの二次構造も欠如しており、いずれのＡＴＧ翻訳開始部位も欠如している。有用な第２のリーダー配列の例は、アデノウイルス３要素リーダー（ＴＰＬ）に由来する、別の非翻訳（５’ＵＴＲ）リーダー配列、すなわち配列番号５のヌクレオチド配列である。

有用なリーダー配列および設計の原則の他の例に関しては、たとえばＭｉｇｎｏｎｅ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｍＲＮＡｓ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３（３）：ｒｅｖｉｅｗｓ０００４．１−０００４．１０ （２００２））を参照されたい。この文献全体は本明細書中参照として援用される。上述の特徴を伴う任意の適切なリーダー配列を、本発明の実務に使用できる。

本発明のハイブリッドプロモーターの１つの有用な実施形態は、以下の、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むプロモーターであり、それはｍＣＭＶ ＧｅｎＢａｎｋ： Ｌ０６８１６．１、ヌクレオチド４０６７−４６８２、ラットＥＦ−１αイントロン Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＣ１５８９８７．３、ヌクレオチド２２１３７−２１７２８；および小文字で下線が引かれる介在性の第１のリーダー配列（配列番号３）；ならびにイタリック体の小文字で下線が引かれる第２のリーダー配列（配列番号５）を含む。

本発明のハイブリッドプロモーターの追加的な有用な実施形態の例として、（ｉ）配列番号３０（ｐＪＶ５７中でのように、ＴｅｔＯを含むハイブリッドプロモーター配列）、（ｉｉ）配列番号３１（ｐＪＶ５９などにおける、最適化したｈＣＭＶプロモーター配列を伴うｍＣＭＶエンハンサーエレメントを含むハイブリッドプロモーター）、および（ｉｉｉ）配列番号３２（ｐＪＶ６０中でのように、最適化されたｈＣＭＶプロモーター配列および最適化されたＴｅｔＯ配列を伴うｍＣＭＶエンハンサーエレメントを含むハイブリッドプロモーター）が挙げられる：

本明細書中で使用される、「操作可能な組み合わせで」、「操作可能な順序で」および「操作可能に連結される」との文言は、所定の遺伝子の転写を指示できる核酸分子、および／または所望のタンパク質分子の合成がもたらされるような形での核酸配列の連結を指す。この用語はまた、機能的なタンパク質が産生されるような形でのアミノ酸配列の連結を指す。たとえば、タンパク質をコードする配列に「操作可能に連結される」ベクター中の制御配列は、制御配列の転写活性と適合可能な条件下でこのタンパク質をコードする配列の発現が達成されるように、それに結合される。

「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中互換可能に使用され、ペプチド結合を介して共有結合的に連結される２つ以上のアミノ酸の分子鎖を含む。この用語は、特定の長さの産物を指すものではない。よって、「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、ポリペプチドの定義の中に含まれる。この用語は、たとえば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ポリペプチドの翻訳後修飾を含む。さらに、タンパク質のフラグメント、類似体、変異したタンパク質またはバリアントタンパク質、融合タンパク質などは、ポリペプチドの意味の中に含まれる。この用語はまた、１つまたは複数のアミノ酸の類似体または非標準のアミノ酸または天然ではないアミノ酸が、既知のタンパク質工学の技術を使用して組み換えで発現できる場合に含まれる分子も含む。さらに、融合タンパク質は、よく知られている有機化学技術により本明細書中に記載されるように誘導体化され得る。

ポリペプチド（たとえばイムノグロブリン、または抗体）の「バリアント」は、別のポリペプチド配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列中に挿入され、アミノ酸配列から欠失されかつ／またはアミノ酸配列中で置き換えられる、アミノ酸配列を含む。バリアントは融合タンパク質を含む。

用語「融合タンパク質」は、タンパク質が、１超の親のタンパク質またはポリペプチドに由来するポリペプチドの成分を含むことを意味する。概して、融合タンパク質は、１つのタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が、異なるタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列とインフレームで付加され、任意に、異なるタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチドとリンカーにより分離される、「融合遺伝子」から発現される。よって、融合遺伝子は、単一のタンパク質として、組み換え宿主細胞により発現され得る。

「分泌される」タンパク質は、分泌シグナルペプチド配列の結果としてＥＲ、分泌小胞、または細胞外空間に向かうことができるタンパク質、および、必ずしもシグナル配列を伴わずに細胞外空間へと放出されるタンパク質を指す。分泌されるタンパク質が、細胞外空間へ放出される場合、分泌されるタンパク質は、「成熟した」タンパク質を産生するための細胞外プロセシングを受け得る。細胞外空間への放出は、エキソサイトーシスおよびタンパク質切断を含む多くの機構によって起こり得る。本発明の方法の他のいくつかの実施形態では、対象とするタンパク質は、分泌されるタンパク質として宿主細胞により合成され、これは次いで細胞外空間および／または培地からさらに精製され得る。

本明細書中で使用されるように、宿主細胞で組み換えＤＮＡ技術により産生されるタンパク質に関連する場合「可溶性の」は、水溶液中に存在するタンパク質である；タンパク質がツインアルギニンのシグナルアミノ酸配列を含む場合、可溶性のタンパク質は、グラム陰性細菌宿主でペリプラズムへと輸送され、または分泌ができる真核生物の宿主細胞により、もしくは適切な遺伝子（たとえばｋｉｌ遺伝子）を有する細菌の宿主により培養培地へと分泌される。よって、可溶性のタンパク質は、宿主細胞の内側の封入体中に見いだされないタンパク質である。あるいは、文脈に応じて、可溶性タンパク質は、細胞膜に統合されて見いだされないタンパク質、または、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、対象とする水性バッファー中に他のタンパク質を含まずに生理学的条件下で懸濁される場合、有意な量の不溶性凝集物を形成することのない（すなわち総タンパク質の１０％未満、概して約５％未満の凝集物を形成する）生理学的条件下で水性バッファー中に溶解されるもしくは溶解され得るタンパク質であり、そのようなバッファーは尿素、グアニジウム塩酸塩、もしくは過塩素酸リチウムなどの界面活性剤またはカオトロピック剤を含まない。対照的に、不溶性タンパク質は、宿主細胞で細胞質顆粒（封入体と呼ばれる）の内側で変性した形態で存在するタンパク質であり、または、繰り返しになるが文脈に応じて、不溶性タンパク質は、限定するものではないが、細胞膜、ミトコンドリア膜、葉緑体膜、小胞体膜などを含む細胞膜に存在するタンパク質、もしくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、対象とする水性バッファー中に他のタンパク質を含まずに生理学的条件下で懸濁される（生理学的に適合可能な温度で）場合、有意な量の不溶性凝集物を形成する（すなわち総タンパク質の１０％以上の凝集物を形成する）生理学的条件下で、水性バッファー中にあるタンパク質であり、そのようなバッファーは尿素、グアニジウム塩酸塩、もしくは過塩素酸リチウムなどの界面活性剤またはカオトロピック剤を含まない。

用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、２つ以上のヌクレオチド残基を含む、一本鎖および二本鎖のヌクレオチドポリマーの両方を含む。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド残基は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾された形態であってよい。上記の修飾物は、ブロモウリジンおよびイノシンの誘導体などの塩基修飾物、２’，３’―ジデオキシリボースなどのリボース修飾物、ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオアート、ホスホセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホジセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホアニラダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、およびホスホロアミダード（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）などのヌクレオチド間結合修飾物を含む。

用語「オリゴヌクレオチド」は、２００以下のヌクレオチド残基を含むポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０個の長さの塩基である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０個の長さのヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、たとえば変異遺伝子の構築で使用するために、一本鎖または二本鎖であってよい。オリゴヌクレオチドは、センス鎖またはアンチセンス鎖のオリゴヌクレオチドであってよい。オリゴヌクレオチドは、検出アッセイ用に、放射標識、蛍光標識、ハプテンまたは抗原性標識を含む、標識を含んでよい。オリゴヌクレオチドは、たとえば、ＰＣＲプライマー、クローニングのプライマーまたはハイブリダイゼーションのプローブとして使用されてよい。

本明細書中で互換可能に使用される「ポリヌクレオチド配列」または「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」は、文脈に応じて、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、およびＲＮＡ、核酸、またはヌクレオチド残基の一次配列を表す文字列の一次配列を含む、ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド残基の一次配列である。いずれかの特定されたポリヌクレオチド配列から、所定の核酸配列または相補的なポリヌクレオチド配列のいずれかを決定できる。一本鎖または二本鎖であり得、センス鎖またはアンチセンス鎖を表し得る、ゲノム供給源または合成の供給源のＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。特段に他の記載がない限り、本明細書中に論述されるいずれかの一本鎖のポリヌクレオチド配列の左手側の端部は、５’末端であり；二本鎖のポリヌクレオチド配列の左手方向は、５’方向と呼ばれる。新生のＲＮＡ転写物の５’から３’への付加の方向は、転写方向と呼ばれる；ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’であるＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と呼ばれる；ＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’であるＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。

本明細書中で使用されるように、「単離された核酸分子」または「単離された核酸配列」は、（１）核酸の天然の供給源に、通常関連している少なくとも１つの混入物の核酸分子から同定されかつ分離された核酸分子、または（２）クローン化され、増幅され、タグ化され、または対象とする核酸配列を決定できるようにバックグラウンド核酸と区別された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然で見いだされる形態または状況外にある。しかしながら、単離された核酸分子は、たとえばその核酸分子が天然の細胞の染色体の位置と異なる位置にあるイムノグロブリン（たとえば抗体）を通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。

本明細書中で使用されるように、「〜をコードする核酸分子」および「〜をコードするＤＮＡ配列」との文言は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ｍＲＮＡに沿ったリボヌクレオチドの順序を決定し、またポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序も決定する。ＤＮＡ配列はよって、ＲＮＡ配列およびアミノ酸配列をコードする。

用語「遺伝子」は、生物学的な機能に関連した任意の核酸を指すように広く使用される。遺伝子は概して、コード配列および／または当該コード配列の発現に必要な制御配列を含む。用語「遺伝子」は、特異的なゲノム配列または組み換え配列、および当該配列によりコードされるｃＤＮＡまたはｍＲＮＡに当てはまる。遺伝子はまた、たとえば、他のタンパク質に関する認識配列を形成する、非発現型の核酸セグメントをも含む。転写因子などの制御タンパク質が結合する転写制御エレメントを含む非発現型の制御配列は、配列に隣接してまたはその近くで転写をもたらす。

「遺伝子の発現」または「核酸の発現」は、文脈により示されるように、ＤＮＡのＲＮＡへの転写（任意にＲＮＡの修飾、たとえばスプライシングを含む）、ＲＮＡのポリペプチドへの翻訳（場合により、その後のポリペプチドの翻訳後修飾を含む）、または転写および翻訳の両方を意味する。

本発明は、本発明のハイブリッドプロモーターを含む発現カセットに関する。真核生物の「発現カセット」は、哺乳類細胞などの真核細胞でのタンパク質の産生を可能にする発現ベクターの一部を指す。これは、ｍＲＮＡの転写に関して真核細胞で作動可能なプロモーター、対象とするタンパク質（複数可）をコードする１つまたは複数の遺伝子ならびにｍＲＮＡの終結およびプロセシングシグナルを含む。発現カセットは、選択マーカーとして有用な遺伝子を、コード配列の中に有用であるように含んでよい。本発明の発現カセットにおいて、ハイブリッドプロモーターが、対象とする外因性タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの５’で操作可能に連結され；ポリアデニル化部位が、オープンリーディングフレームの３’で操作可能に連結される。有用なポリアデニル化部位の配列の一実施形態は、ＳＶ４０ ｌａｔｅポリアデニル化部位である配列番号１４である。

発現カセットが操作可能なままである限り、他の適切な制御配列も含まれてよい。オープンリーディングフレームは任意に、１超の対象とするタンパク質に関するコード配列を含んでよい。

本明細書中で使用されるように、構造遺伝子に関連して使用される場合の用語「コード領域」または「コード配列」は、ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果としての新生のポリペプチドで見いだされるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を指す。コード領域は、真核生物において、イニシエーターのメチオニンをコードするヌクレオチドの３つ組「ＡＴＧ」により５’側で、およびストップコドンを特定する３つの３つ組（すなわちＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）の１つにより３’側で結合される。

本発明はまた、本発明の発現カセットを含む組み換え発現ベクターも包有する。

用語「ベクター」は、タンパク質コードの情報を宿主細胞中に送るために使用される任意の分子または実体（たとえば核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルス）を意味する。

本明細書中で使用される用語「発現ベクター」または「発現コンストラクト」は、望ましいコード配列および、特定の宿主細胞での操作可能に連結されたコード配列の発現に必要な適切な核酸の制御配列を含む組み換えＤＮＡ分子を指す。発現ベクターは、限定するものではないが、転写、翻訳に影響を与えるまたはそれを制御する、および、イントロンが存在する場合は、それに操作可能に連結されたコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を与える配列を含んでよい。原核生物での発現に必要な核酸配列は、プロモーター、任意にオペレーター配列、リボソーム結合部位および場合によっては他の配列を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終結およびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。分泌シグナルペプチド配列もまた、任意に、発現ベクターによりコードされ、対象とするコード配列に操作可能に連結されてよく、それにより、発現されるポリペプチドを、必要な場合に、細胞からの対象とするポリペプチドのより容易な単離のために、組み換え宿主細胞により分泌させることができる。このような技術は当該分野でよく知られている（たとえば、Ｇｏｏｄｅｙ， Ａｎｄｒｅｗ ＲらのＰｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、米国特許第５，３０２，６９７号；ＷｅｉｎｅｒらのＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ、米国特許第６，０２２，９５２号および米国特許第６，３３５，１７８号；Ｕｅｍｕｒａ らのＰｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｈｅｒｅｏｆ、米国特許第７，０２９，９０９号；Ｒｕｂｅｎらの２７ ｈｕｍａｎ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，米国特許公開公報第２００３／０１０４４００号）。対象とする複数のサブユニットタンパク質の発現のため、それぞれが異なる各モノマーに関するコード配列を含む、適切な数および割合での別々の発現ベクターを、宿主細胞を形質転換するために使用できる。他の実施形態では、単一の発現ベクターを使用して対象とするタンパク質の異なるサブユニットを発現できる。

本発明はまた、本発明の組み換え発現ベクターを含む哺乳類の宿主細胞に関する。

用語「宿主細胞」は、核酸で形質転換されている、または形質転換でき、それにより対象とする遺伝子を発現する細胞を意味する。この用語は、対象とする遺伝子が存在している限り、後代が形態または遺伝的な構成において元の親細胞と同一であるかどうかに関わらず、親細胞の後代を含む。多数の利用可能でありよく知られている宿主細胞のいずれかを、本発明の実務に使用してよい。特定の宿主の選択は、当該分野により認識される多くの要因に依存する。これらの要因として、たとえば、選択した発現ベクターとの適合可能性、ＤＮＡ分子によりコードされるペプチドの毒性、形質転換の比率、ペプチドの回収の容易さ、発現の特徴、バイオセーフティおよび費用が挙げられる。これらの要因のバランスは、すべての宿主が特定のＤＮＡ配列の発現に関して等しく有効ではないという理解と関係がなければならない。これらの一般的なガイドラインの中で、培養において有用な微生物の宿主細胞として、細菌（エシェリキア属など）、酵母（サッカロマイセス属）など）、および他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類（ヒトを含む）の細胞、たとえばＣＨＯ細胞およびＨＥＫ−２９３細胞が挙げられる。修飾をＤＮＡレベルで行ってもよい。ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、選択された宿主細胞とより適合可能なコドンに変化させてよい。大腸菌に関しては、最適化されたコドンは当該分野で知られている。コドンは制限部位を排除するように置換でき、またはサイレント制限部位（ｓｉｌｅｎｔ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）を含むように置換でき、これは選択された宿主細胞におけるＤＮＡのプロセシングを支援し得る。次に、形質転換された宿主が、培養および精製される。宿主細胞は、所望の化合物が発現されるように従来の発酵条件下で培養されてよい。このような発酵条件は、当該分野でよく知られている。

有用な哺乳類の宿主細胞株の例は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（たとえば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ， Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７： ４２１６ （１９８０））を含む、チャイニーズハムスター卵巣細胞；ＳＶ４０により形質転換されたサルの腎臓のＣＶ１細胞株（ＣＯＳ−７， ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒトの胎児腎臓細胞株（２９３細胞もしくは懸濁培養で増殖させるためにサブクローニングされた２９３細胞）［Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ３６： ５９ （１９７７）］；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４， Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２３： ２４３−２５１ （１９８０））；サルの腎臓細胞（ＣＶｌ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザルの腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６， ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒトの子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌの腎臓細胞（ＭＤＣＫ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローもしくはラットの肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ， ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒトの肺細胞（Ｗ１３８， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒトの肝細胞癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２， ＨＢ ８０６５）；マウスの***腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２， ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ， Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ３８３： ４４−６８ （１９８２））；ＭＲＣ ５細胞もしくはＦＳ４細胞；または哺乳類の骨髄腫の細胞である。

「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」は、多くの場合互換可能に使用され、本明細書中の当該表記のすべては、細胞の後代を含む。たとえば、ＣＨＯ細胞に「由来する」細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞の細胞後代であり、それはいずれかの数の世代で、元の初代細胞の親から除去されていてよく、それはまた形質転換体の後代細胞を含んでもよい。形質転換体および形質転換された細胞は、導入の回数に関わらず、初代の対象とする細胞およびそれらに由来する培養物を含む。また、後代のすべてが、計画的なまたは偶発的な変異のため、ＤＮＡ含有量において正確に同一ではない場合があることも理解される。もともと形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異後代が、含まれる。

宿主細胞は、ポリペプチド（抗原結合タンパク質、たとえば抗体を含む）の産生のために、上述の核酸またはベクターで形質転換またはトランスフェクトされ、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択する、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適宜改変される従来の栄養培地中で培養される。さらに、選択マーカーにより分離される転写ユニットの複数のコピーを有する新規のベクターおよびトランスフェクトされた細胞株は、抗体などのポリペプチドの発現に特に有用である。

用語「トランスフェクション」は、細胞による外来性または外因性のＤＮＡの取り込みを意味し、細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入された場合、「トランスフェクトされ」ている。多くのトランスフェクションの技術が、当該分野でよく知られており、本明細書中に開示される。たとえばＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， １９７３， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ｓｕｐｒａ； Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ； Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい。このような技術を使用して、１つまたは複数の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞中に導入できる。

用語「形質転換」は、細胞の遺伝的な特徴の変化を指し、細胞は、新規のＤＮＡまたはＲＮＡを含むように改変された場合、形質転換されている。たとえば、細胞が形質転換されると、それはトランスフェクション、形質導入、または他の技術を介して新規の遺伝子材料を導入することにより、その天然の状態から遺伝的に改変される。トランスフェクションまたは形質導入に続き、形質転換するＤＮＡは、細胞の染色体中に物理的に統合することにより細胞のＤＮＡと再度組み換えてもよく、または複製されることなくエピソーム部分として一時的に維持されてもよく、またはプラスミドとして独立して複製してもよい。細胞は、形質転換するＤＮＡが細胞の***とともに複製される場合に、「安定に形質転換され」ているとみなされる。

本発明はまた、対象とするタンパク質を産生する方法であって、対象とするタンパク質の発現を可能にする生理学的条件下にて水系培地中で、哺乳類の宿主細胞を培養することと、上記培地から対象とするタンパク質を回収することとを含む、方法に関する。

本発明に有用なポリペプチドを産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養されてよい。ハムＦ１０培地（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）， Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が、宿主細胞の培養に適している。さらに、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． ５８： ４４ （１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０２： ２５５ （１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同４，６５７，８６６号；同４，９２７，７６２号；同４，５６０，６５５号；もしくは同５，１２２，４６９号；ＷＯ９０１０３４３０号；国際特許公開公報第８７／００１９５号；または米国再特許（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｒｅ）第３０，９８５号に記載される培地のいずれかを、宿主細胞用の培養培地として使用してよい。これら培地のいずれかに、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、バッファー（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生剤（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ（商標）薬物など）、微量元素（マイクロモル濃度の範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー供給源を補充してよく、これにより、当該培地中のまたは培地における細胞の生理学的条件が、宿主細胞による対象とするタンパク質の発現を促進し；他のいずれかの必要な補助物質がまた、当業者に知られているであろう適切な濃度で含まれていてもよい。温度（必ずというわけではないが、通常は約３７℃）、ｐＨ（必ずというわけではないが、通常はｐＨ６．５〜７．５）、酸素供給などの培養条件は、対象とするタンパク質の発現のため選択された宿主細胞で従来通り使用される条件であり、これは当業者にとって明らかである。培養培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの適量の血清を含んでよく、または好ましくは、宿主細胞は、無血清培地での培養に適合させることができる。いくつかの実施形態では、水系培地は液体であり、これにより宿主細胞は液体培地内の細胞懸濁液で培養される。宿主細胞は、バッチ培養または連続培養システムで有効に増殖させることができる。

他の実施形態では、哺乳類の宿主細胞は、それに細胞が接着し接着層を形成する培地または基板の表面を形成するための、たとえば、寒天またはアガロースを含む、固体または半固体の水系培地で培養されてよい。

宿主細胞を培養する際、組み換えポリペプチドを、ペリプラズム空間で、細胞内で産生でき、または培地中に直接分泌できる。抗原結合タンパク質（たとえば抗体）などのポリペプチドが細胞内で産生される場合、第１のステップとして、特定のデブリである、宿主細胞または溶解したフラグメントを、たとえば遠心分離または限外濾過により除去する。

対象とするタンパク質、たとえば抗体または抗体フラグメントは、たとえば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、陽イオンもしくは陰イオン交換クロマトグラフィー、または好ましくは、アフィニティリガンドとして対象とする抗原もしくはプロテインＡもしくはプロテインＧを使用する、アフィニティクロマトグラフィーを使用して、精製できる。プロテインＡを使用して、ヒトのγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づくポリペプチドを含むタンパク質を精製できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ６２： １−１３ （１９８３））。プロテインＧは、すべてのマウスのアイソタイプおよびヒトのγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ， ＥＭＢＯ Ｊ． ５： １５６７１５７５ （１９８６））。アフィニティリガンドが結合されるマトリックスは、ほとんどの場合ではアガロースであるが、他のマトリックスが利用可能である。制御された細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの物理的に安定なマトリックスは、アガロースで達成されるよりも速い流速および短い処理時間を可能にする。タンパク質がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ． Ｔ． Ｂａｋｅｒ，ニュージャージー州フィリップスバーグ）が、精製に有用である。エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質の精製に関する他の技術もまた、回収される抗体に応じて可能である。

バッファーおよびイムノグロブリン、または他の結合アッセイの試薬をインキュベートすることに関する「生理学的な条件下」は、非共有結合反応などの生化学的な反応を起こさせる温度、ｐＨ、およびイオン強度の条件下でのインキュベーションを意味する。概して、温度は、最大で約３７℃の室温または大気温度であり、ｐＨは、６．５〜７．５である。

組成物の「生理学的に許容可能な塩」、たとえば、抗体または対象とする他のタンパク質などのイムノグロブリンの塩は、薬学的に許容可能であることが知られているまたは後に発見される、任意の塩または複数の塩を意味する。薬学的に許容可能な塩のいくつかの非限定的な例は、酢酸塩；トリフルオロ酢酸塩；ハロゲン化水素塩、たとえば塩酸塩および臭化水素酸塩；硫酸塩；クエン酸塩；マレイン酸塩；酒石酸塩；グリコール酸塩；グルコン酸塩；コハク酸塩；メシル酸塩；ベシル酸塩；没食子酸エステルの塩（没食子酸は、３，４，５トリヒドロキシ安息香酸としても知られる）、たとえばペンタガロイルグルコース（ＰＧＧ）およびエピガロカテキンガラート（ＥＧＣＧ）、コレステロール硫酸の塩、パモ酸塩、タンニン酸塩、およびシュウ酸塩である。

「反応混合物」は、インキュベーションの生理学的条件下で、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの対象とする生化学的な反応、たとえば共有結合または非共有結合の反応を起こさせる、必要なすべての試薬および因子を含む水性の混合物である。

ポリヌクレオチドの「ドメイン」または「領域」（本明細書中で互換可能に使用される）は、最大で完全なポリヌクレオチドを含むが、概して完全なポリペプチドより少ないポリペプチドを含む、ポリヌクレオチド全体の任意の部分である。ドメインは、必ずしも必要ではないが、ポリヌクレオチド鎖の残りとは独立して折りたたむことができ（たとえばＤＮＡヘパリンフォールディング）、かつ／または特定の生物学的、生化学的、もしくは構造上の機能または位置、たとえばコード領域もしくは制御領域と相関される。

タンパク質の「ドメイン」または「領域」（本明細書中で互換可能に使用される）は、最大で完全なタンパク質を含むが、概して完全なタンパク質よりも少ないタンパク質を含む、タンパク質全体の任意の部分である。ドメインは、必ずしも必要ではないが、タンパク質鎖の残りとは独立して折りたたむことができ、かつ／または特定の生物学的、生化学的、もしくは構造上の機能または位置（たとえばリガンド結合ドメイン、もしくは細胞質ドメイン、膜貫通型ドメインもしくは細胞外ドメイン）と相関される。

用語「抗体」、または互換可能に「Ａｂ」は、最も広い意味で使用され、完全に会合した抗体、モノクローナル抗体（ヒトの抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（たとえば二重特異性抗体）、ならびに、それらが所望の生物学的な活性を呈する限り上記の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗原を結合できる抗体フラグメント（たとえばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、一本鎖抗体、ジアボディ）を含む。化学的に誘導体化された抗体を含む、インタクトな分子および／またはフラグメントの多量体または凝集物が、考慮される。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２、または任意のアロタイプを含む、任意のアイソタイプのクラスまたはサブクラスの抗体が、考慮される。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有し、たとえば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３のアイソタイプは、抗体依存性の細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。

「単離された」タンパク質、たとえば抗体または抗体フラグメントなどのイムノグロブリンは、その天然の環境の、または産生細胞により分泌されている培養培地の、１つまたは複数の成分から同定および分離されているタンパク質である。いくつかの実施形態では、単離されたタンパク質は、治療、診断、予防、研究または他の用途を妨害する、その天然のまたは培養培地の環境で見いだされるタンパク質またはポリペプチドまたは他の混入物を実質的に含まない。その天然の環境または培地の「混入物」の成分は、タンパク質、たとえば抗体に関する診断または治療上の使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質（たとえばポリヌクレオチド、脂質、炭水化物）を含んでよい。概して、「単離したタンパク質」は、所定の試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％を構成する。いくつかの実施形態では、対象とするタンパク質、たとえば抗体は、（１）タンパク質の９５重量％、最も好ましくは９９重量％超まで、または（２）任意に染色、たとえばクーマシーブルーもしくは銀染色を使用して、還元条件または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一となるまで、精製される。単離された天然に存在する抗体は、タンパク質の天然の環境の少なくとも１つの構成要素が存在しないため、組み換え細胞内のｉｎ ｓｕｔｕでの抗体を含む。しかしながら、通常、対象とする単離されたタンパク質（たとえば抗体）は、少なくとも１つの精製ステップにより調製される。

本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体、すなわち集合を構成する個々の抗体が、微量で存在する可能性のある天然の状態で起こり得る変異を除き同一である、実質的に均質な抗体の集合から得られる抗体を指す。抗原結合タンパク質であるモノクローナル抗体は、特異性の高い結合剤であり、異なるエピトープを対象とする異なる抗体を概して含むポリクローナル抗体の調製物とは対照的に、個別の抗原性部位またはエピトープを対象とする。モノクローナル抗体の非限定的な例として、マウスの抗体、ウサギの抗体、ラットの抗体、ニワトリの抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒトの抗体、完全に会合した抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、抗原を結合できる抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆｖ、一本鎖抗体、ジアボディを含む）、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｉｅｓ）、ナノボディ、およびそれらが所望の生物学的な活性を呈する限り上記のＣＤＲを含む組み換えペプチド、またはそれらの変異体もしくは誘導体が挙げられる。

修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集合から得られる抗体の特徴を表し、いずれかの特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるものではない。たとえば、本発明にしたがい使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５ ［１９７５］により最初に記載されたハイブリドーマの方法により作製されてよく、または組み換えＤＮＡ方法（たとえば米国特許第４，８１６，５６７号を参照）により作製されてよい。「モノクローナル抗体」はまた、たとえば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５２：６２４−６２８［１９９１］ ａｎｄ Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１−５９７ （１９９１）に記載される技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。

「多重特異性の」結合剤または抗原結合タンパク質または抗体は、１超の抗原またはエピトープを標的とするものである。

「二重特異性の（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ、ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」または「二重機能的な（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」結合剤または抗原結合タンパク質または抗体は、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッドである。二重抗原（Ｂｉａｎｔｉｇｅｎ）結合タンパク質、抗原結合タンパク質および抗体は、多重抗原結合タンパク質、抗原結合タンパク質または多重特異性抗体の一種であり、限定するものではないが、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含む様々な方法により産生され得る（たとえば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎｎ， １９９０， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７９：３１５−３２１； Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１５４７−１５５３； Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６７：９５−１０６ （２０１５）参照）。二重特異性の抗原結合タンパク質または抗体の２つの結合部位は２つの異なるエピトープに結合し、それらは同じまたは異なるタンパク質の標的上に存在し得る。

用語「イムノグロブリン」は、それぞれが軽鎖（ＬＣ）に共有結合的に連結される、２つの二量体化した重鎖（ＨＣ）を含む完全な抗体；一本の二量体化していないイムノグロブリンの重鎖および共有結合的に連結された軽鎖（ＨＣ＋ＬＣ）、またはキメラのイムノグロブリン（軽鎖＋重鎖）‐Ｆｃヘテロトリマー（いわゆるヘミボディ）を包有する。「イムノグロブリン」はタンパク質であるが、必ずしも抗原結合タンパク質ではない。

「抗体」において、各四量体は２つの同一のポチペプチド鎖対から構成され、それぞれの対は約２２０アミノ酸（約２５ｋＤａ）の１つの「軽」鎖と約４４０アミノ酸（約５０〜７０ｋＤａ）の１つの「重」鎖とを有する。各鎖のアミノ末端部は、主に抗原認識に関与する１１０〜１１０個のまたはそれを超えるアミノ酸の「可変」（「Ｖ」）領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を定義する。可変領域は、異なる抗体間で異なる。定常領域は、異なる抗体間で同じである。各重鎖または軽鎖の可変領域内に、抗原結合タンパク質である抗体の場合に抗原に対する抗体の特異性を決定することを支援する、３つの超可変性の部分領域が存在する。しかしながら、本発明の範囲内では、イムノグロブリン、たとえば抗体、の一実施形態は、抗原結合タンパク質である必要はなく、または抗原に特異的に結合することが知られている必要はない。超可変領域間の可変ドメイン残基は、フレームワーク残基と呼ばれ、一般的に、異なる抗体間である程度相同である。イムノグロブリンは、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当てることができる。ヒトの軽鎖は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖に分類される。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合されており、ここで重鎖は約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈ． ７ （Ｐａｕｌ， Ｗ．， ｅｄ．， ２ｎｄ ｅｄ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． （１９８９））を参照されたい。本発明の範囲内では、「抗体」は、組み換え的に作製された抗体、およびグリコシル化された抗体またはグリコシル化を欠く抗体も含む。

用語「軽鎖」または「イムノグロブリン軽鎖」は、完全長の軽鎖および結合特異性を提供するのに十分な可変領域配列を有するそのフラグメントを含む。完全長の軽鎖は、可変領域ドメインＶ_Ｌ、および定常領域ドメインＣ_Ｌを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖は、κ鎖およびλ鎖を含む。

用語「重鎖」または「イムノグロブリン重鎖」は、完全長の重鎖および結合特異性を提供するのに十分な可変領域配列を有するそのフラグメントを含む。完全長の重鎖は、可変領域ドメインＶ_Ｈと、３つの定常領域ドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３とを含む。Ｖ_Ｈドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、Ｃ_Ｈドメインはカルボキシ末端にあり、ここでＣ_Ｈ３はポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、およびイプシロン（ε）に分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する。本発明の別々の実施形態では、重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭならびにＩｇＥを含む、いずれかのアイソタイプであり得る。これらのいくつかはさらに、サブクラスまたはアイソタイプ、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２、に分割され得る。異なるＩｇＧのアイソタイプは、異なるエフェクター機能（Ｆｃ領域により媒介される）、たとえば抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、を有し得る。ＡＤＣＣでは、抗体のＦｃ領域は、ナチュラルキラー細胞およびマクロファージなどの免疫エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体（Ｆｃ．ｇａｍｍａ．Ｒｓ）に結合し、これにより標的細胞の食作用または溶解をもたらす。ＣＤＣでは、抗体は、細胞表面で補体カスケードを引き起こすことにより標的細胞を殺傷する。

「Ｆｃ領域」、または本明細書中で互換可能に使用される「Ｆｃドメイン」もしくは「イムノグロブリンのＦｃドメイン」は、２つの重鎖のフラグメントを含み、これは完全な抗体において抗体のＣ_Ｈ１ドメインおよびＣ_Ｈ２ドメインを含む。この２つの重鎖フラグメントは、２つ以上のジスルフィド結合およびＣ_Ｈ３ドメインの疎水性相互作用により、共に保持される。

用語「サルベージ受容体結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のｉｎ ｖｉｖｏでの血清中の半減期の延長に関与する、ＩｇＧ分子（たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。

本発明の多くの実施形態では、対象とするタンパク質は、限定するものではないが、抗体、抗体のサブユニット、または抗体フラグメントなどの、抗原結合タンパク質である。抗体の構造および産生の詳細な説明に関しては、全体が本明細書中参照として援用されるＲｏｔｈ， Ｄ． Ｂ．， ａｎｄ Ｃｒａｉｇ， Ｎ． Ｌ．， Ｃｅｌｌ， ９４：４１１−４１４ （１９９８）を参照されたい。簡潔に述べると、重鎖および軽鎖のイムノグロブリン配列をコードするＤＮＡを産生するための工程は、発達するＢ細胞中で主に起こる。様々なイムノグロブリンの遺伝子セグメントの再構成および結合の前に、Ｖ、Ｄ、Ｊおよび定常（Ｃ）の遺伝子セグメントは一般的に、単一の染色体上で比較的近接して見いだされる。Ｂ細胞の分化の間、Ｖ、Ｄ、Ｊ（または軽鎖遺伝子の場合ＶおよびＪのみ）の遺伝子セグメントの適切なファミリーの構成員のそれぞれ１つは、重鎖および軽鎖イムノグロブリンの遺伝子の機能的に再構成された可変領域を形成するように組み換えられる。この遺伝子セグメント再構成の工程は、順次的であると思われる。まず、重鎖Ｄ―Ｊ結合部が作製され、次いで重鎖Ｖ−ＤＪ結合部および軽鎖Ｖ−Ｊ結合部が作製される。Ｖ、ＤおよびＪセグメントの再構成に加えて、軽鎖中でＶおよびＪセグメントが結合され、かつ重鎖のＤおよびＪセグメントが結合される位置での可変性組み換えにより、イムノグロブリン重鎖および軽鎖の基本的なレパートリーにおいてさらなる多様性が作製される。軽鎖中のこのような変化は概して、Ｖ遺伝子セグメントの最後のコドンおよびＪセグメントの最初のコドン内で起こる。結合における同様の不正確さは、ＤセグメントとＪ_Ｈセグメントの間の重鎖染色体上で起こり、１０個に及ぶヌクレオチドを伸長させる場合がある。さらに、ゲノムＤＮＡによりコードされないいくつかのヌクレオチドが、遺伝子セグメントＤとＪ_Ｈの間およびＶ_ＨとＤの間に挿入され得る。これらのヌクレオチドの付加は、Ｎ領域の多様性として知られている。可変領域の遺伝子セグメントにおけるこのような再構成およびこのような結合の間に起こり得る可変性組み換えの正味の効果は、一次抗体のレパートリーの産生である。

用語「超可変性」領域は、抗原結合に関与する、抗体のアミノ酸残基を指す。超過変性領域は、相補性決定領域またはＣＤＲ由来のアミノ酸残基（すなわち、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１）により記載される、軽鎖の可変ドメイン中の残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）および８９−９７（Ｌ３）、ならびに重鎖の可変ドメイン中の残基３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）および９５−１０２（Ｈ３））を含む。単一のＣＤＲであっても、ＣＤＲのすべてを含む抗原結合部位全体よりも親和性は低いが、抗原を認識し結合し得る。

超可変性の「ループ」由来の残基の代替的な定義は、軽鎖可変ドメイン中の残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）として、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６： ９０１−９１７ （１９８７）により記載される。

「フレームワーク」または「ＦＲ残基」は、超可変性領域の残基以外の可変領域の残基である。

「抗体フラグメント」は、インタクトな完全長の抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖフラグメント；ジアボディ；直鎖状抗体（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７−１０６２ （１９９５））；一本鎖抗体分子；ならびに複数の抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。

抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂフラグメント」と呼ばれ、それぞれが単一の抗原結合部位を有する、２つの同一の抗原結合フラグメントと、定常領域を含む残りの「Ｆｃ」フラグメントとを産生する。Ｆａｂフラグメントは、可変ドメインのすべて、ならびに軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆｃフラグメントは糖を提示し、抗体の１クラスをその他と区別する多くの抗体のエフェクター機能（補体および細胞の受容体を結合することなど）に寄与する。

ペプシン処理は、抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを含む２つの「一本鎖のＦｖ」または「ｓｃＦｖ」の抗体フラグメントを有するＦ（ａｂ’）_２フラグメントをもたらし、これらのドメインは単一のポリペプチド中に存在する。Ｆａｂフラグメントは、抗体のヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含む重鎖のＣＨ１ドメインのカルボキシ末端でのいくつかの追加的な残基を含む点で、Ｆａｂ’フラグメントと異なる。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、Ｆｖに抗原結合に望ましい構造を形成させることができるポリペプチドリンカーを、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にさらに含む。ｓｃＦｖの論述に関しては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １ １３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９−３１５ （１９９４）を参照されたい。

「Ｆａｂフラグメント」は、１つの軽鎖と、１つの重鎖のＣ_Ｈ１および可変領域とから構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。

「Ｆａｂ’」フラグメントは、１つの軽鎖と、Ｖ_ＨドメインおよびＣ_Ｈ１ドメインならびにＣ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインの間の領域も含む１つの重鎖の一部とを含み、２つのＦａｂ’フラグメントの２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ’）_２分子を形成できるようにする。

「Ｆ（ａｂ’）_２」フラグメントは、２つの軽鎖と、Ｃ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインの間の定常領域の一部を含む２つの重鎖とを含み、２つの重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合が形成されるようにする。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントはしたがって、２つの重鎖の間のジスルフィド結合により共に保持される２つのＦａｂ’フラグメントから構成される。

「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最少の抗体フラグメントである。この領域は、堅固な、非共有結合的に会合した、１つの重鎖および１つの軽鎖の可変ドメインの二量体からなる。この構成において、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ ＶＬの二量体の表面上の抗原結合部位を定義する。単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）は、結合部位全体よりも親和性は低いが、抗原を認識および結合する能力を有する。

「一本鎖抗体」は、重鎖および軽鎖の可変領域が柔軟なリンカーにより接続されて単一のポリペプチド鎖を形成し、抗原結合領域を形成する、Ｆｖ分子である。一本鎖抗体は、国際特許公開公報第８８／０１６４９号および米国特許第４，９４６，７７８号および同５，２６０，２０３号に詳細に論述されており、これら開示全体は本明細書中参照として援用される。

「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインを含み、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖中に存在し、Ｆｖに、抗原結合に望ましい構造を形成させることができるポリペプチドリンカーを、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインの間に任意に含む（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６， １９８８， ａｎｄ Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｉ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３， １９８８）。「Ｆｄ」フラグメントは、Ｖ_ＨドメインおよびＣ_Ｈ１ドメインからなる。

用語「ジアボディ」は、２つの抗原結合部位を伴う小さな抗体フラグメントを指し、これらのフラグメントは、同一のポリペプチド鎖（Ｖ_Ｈ Ｖ_Ｌ）において軽鎖の可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に接続される重鎖の可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む。同一の鎖上の２つのドメインの間で対形成させるには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、別の鎖の相補性ドメインと対形成しなければならず、２つの抗原結合部位を作製する。ジアボディは、たとえば欧州特許第４０４，０９７号；国際特許公開公報第９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：６４４４−６４４８ （１９９３）によって、さらに十分に記載される。

「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む、免疫学的に機能的なイムノグロブリンフラグメントである。いくつかの例では、２つ以上のＶ_Ｈ領域が、ペプチドリンカーで共有結合的につながれて二価ドメイン抗体を作製する。二価のドメイン抗体の２つのＶ_Ｈ領域は、同じまたは異なる抗原を標的としてもよい。

用語「抗原結合タンパク質」（ＡＢＰ）は、上で定義した抗体または抗体フラグメント、および対象とする標的抗原をそれらが特異的に結合するような望ましい抗原結合特性を有するＣＤＲに由来する配列を含む組み換えペプチドまたは他の化合物を含む。

一般的に、抗原結合タンパク質、たとえば抗体または抗体フラグメントは、同様の結合アッセイ条件下で、他の関連しないタンパク質に対するその親和性と比較して、対象とする抗原に対して有意に高い結合親和性を有し、結果的に当該抗原を区別できる場合、対象とする抗原に「特異的に結合する」。通常、抗原結合タンパク質は、解離定数（Ｋ_Ｄ）が１０^−８Ｍ以下である場合に、その標的抗原を「特異的に結合する」と言われる。抗原結合タンパク質は、Ｋ_Ｄが１０^−９Ｍ以下である場合「高い親和性」で抗原を特異的に結合し、Ｋ_Ｄが１０^−１０Ｍ以下である場合「非常に高い親和性」で抗原を特異的に結合する。

「抗原結合領域」または「抗原結合部位」は、特定の抗原を特異的に結合するタンパク質の一部を意味する。たとえば、抗原と相互作用し、抗原結合タンパク質にこの抗原に対するその特異性および親和性を提供するアミノ酸残基を含む抗原結合タンパク質の一部は、「抗原結合領域」と呼ばれる。抗原結合領域は概して、１つまたは複数の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）（ＣＤＲ）を含む。特定の抗原結合領域はまた、１つまたは複数の「フレームワーク」領域（「ＦＲ」）を含む。「ＣＤＲ」は、抗原の結合特異性および親和性に寄与するアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域は、抗原結合領域と抗原の間の結合を促進するためにＣＤＲの適切な立体構造を維持することを支援できる。従来の抗体では、ＣＤＲは、重鎖および軽鎖の可変領域中のフレームワーク内に埋め込まれており、それらは抗原の結合および認識に貢献する領域を構成する。イムノグロブリン抗原結合タンパク質の可変領域は、フレームワーク領域（下記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， １９９１，による指定されたフレームワーク領域１―４であるＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４；また、下記のＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， １９８７，を参照）内に、少なくとも３つの重鎖および軽鎖のＣＤＲを含む（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎ．Ｉ．Ｈ．， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄを参照；また、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， １９８７， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１−９１７； Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４２： ８７７−８８３を参照）。

用語「抗原」は、抗原結合タンパク質（たとえば、抗体またはその免疫学的に機能的なフラグメントを含む）などの選択的な結合剤により結合されることができ、さらには動物で使用されてその抗原に結合できる抗体を産生できる分子または分子の一部を指す。抗原は、異なる抗原結合タンパク質、たとえば抗体と相互作用できる１つまたは複数のエピトープを有し得る。

用語「エピトープ」は、抗原結合タンパク質（たとえば抗体）に結合される分子の一部である。この用語は、抗体またはＴ細胞受容体などの抗原結合タンパク質に特異的に結合できる任意の決定因子を含む。エピトープは、連続的または非連続的であってよい（たとえば、一本鎖ポリペプチドにおいて、ポリペプチド配列中では互いに連続ではないが、分子の状況の中で、抗原結合タンパク質により結合されるアミノ酸残基）。特定の実施形態では、エピトープは、抗原結合タンパク質を作製するために使用されるエピトープと類似の３次元構造を含むが、抗原結合タンパク質を作製するために使用されるエピトープで見いだされるアミノ酸残基を含まない、またはいくつかのみを含む点で、模倣体であり得る。多くの場合、エピトープはタンパク質上に存在するが、いくつかの例では、核酸などの他の種類の分子に存在し得る。エピトープの決定因子は、アミノ酸、糖の側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基などの化学的に活性な分子の表面の基を含んでよく、特異的な３次元構造特徴、および／または特異的な電荷特徴を有してよい。一般的に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または高分子の複合的な混合物中で標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。

用語「同一性」は、配列を整列させ比較することにより決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。「パーセント同一性」は、比較される分子におけるアミノ酸の間または核酸の間の同一の残基のパーセントを意味し、比較される分子の最少の大きさに基づき計算される。これらの計算では、アライメント中のギャップ（もし存在する場合）は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）により提示されなければならない。整列された核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用できる方法として、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （Ｌｅｓｋ， Ａ． Ｍ．， ｅｄ．）， １９８８， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ； Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， （Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｗ．， ｅｄ．）， １９９３， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ Ｉ， （Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ． Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ． Ｇ．， ｅｄｓ．）， １９９４， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ： Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ； ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， １９８７， Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， （Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．）， １９９１， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ； およびＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， １９８８， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ． ４８：１０７３に記載される方法が挙げられる。たとえば、配列同一性は、２つのポリペプチドのアミノ酸の位置の類似性を比較するために一般に使用される、標準的な方法によって決定できる。ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどのコンピュータプログラムを使用して、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチドの配列が、それらのそれぞれの残基の最適な一致のために整列される（１つもしくは両方の配列の完全長に沿って、または１つもしくは両方の配列のあらかじめ決定された部分に沿ってのいずれかで）。これらのプログラムは、デフォルトオープニングペナルティ（ｄｅｆａｕｌｔ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）およびデフォルトギャップペナルティ（ｄｅｆａｕｌｔ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）を提供し、スコアリングマトリックス、たとえばＰＡＭ２５０（標準的なスコアリングマトリックス；Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｖｏｌ． ５， ｓｕｐｐ． ３ （１９７８）を参照）を、コンピュータプログラムと併せて使用できる。たとえば、パーセント同一性は、以下のように計算できる：同一の一致の総数に１００を乗じ、次に一致した範囲内の長い方の配列の長さの合計で除算し、長い方の配列中にギャップの数を導入して、２つの配列を整列する。パーセント同一性の計算では、比較される配列は、配列間で最大の一致を提供するように整列される。

ＧＣＣプログラムパッケージは、パーセント同一性を決定するために使用できるコンピュータプログラムであり、このパッケージは、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １２：３８７； Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ）を含む。コンピュータアルゴルズムのＧＡＰは、パーセント配列同一性が決定される２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチドを整列するために使用される。配列は、それらのそれぞれのアミノ酸またはヌクレオチドの最適な一致（アルゴリズムにより決定される、「一致した範囲（ｍａｔｃｈｅｄ ｓｐａｎ）」）のために整列される。ギャップオープニングペナルティ（３×平均項（ａｖｅｒａｇｅ ｄｉａｇｏｎａｌ）として計算され、ここで「平均項」は、使用される比較マトリックスの項の平均であり；「項」は、特定の比較マトリックスによりそれぞれの完全なアミノ酸の一致に割り当てられるスコアまたは数である）およびギャップ伸長ペナルティ（これは通常、１／１０×ギャップオープニングペナルティである）、ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２などの比較マトリックスが、アルゴリズムと併せて使用される。特定の実施形態では、標準的な比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスに関してはＤａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， １９７８， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：３４５−３５２を参照；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスに関してはＨｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９：１０９１５−１０９１９を参照）もまた、アルゴリズムにより使用される。

ＧＡＰプログラムを使用してポリペプチド配列またはヌクレオチド配列のパーセント同一性を決定するための推奨されるパラメータは、以下のものを含む。
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３−４５３；
比較マトリックス：上記のＨｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， １９９２からのＢＬＯＳＵＭ６２；
ギャップペナルティ：１２（エンドギャップではペナルティを含まない）
ギャップ長ペナルティ：４
類似性の閾値：０

２つのアミノ酸配列を整列するための特定のアライメントスキームは、２つの配列の短い領域のみの一致をもたらすことがあり、この小さな整列された領域は、２つの完全長の配列間に有意な関係がなくても、非常に高い配列同一性を有し得る。よって、選択されたアライメント方法（ＧＡＰプログラム）は、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続したアミノ酸に及ぶアライメントをもたらすことが望ましい場合に、調節されてよい。

対象とするタンパク質（たとえば、抗体および抗体フラグメントを含む、イムノグロブリン）と関連して使用される場合の用語「修飾」は、限定するものではないが、１つまたは複数のアミノ酸の変化（置換、挿入または欠失を含む）；化学的な修飾；治療剤または診断剤に対するコンジュゲートによる共有結合性の修飾；標識化（たとえば、放射性核種または様々な酵素で）；ペグ化（ポリエチレングリコールでの誘導体化）などの共有結合性のポリマー付着、および非天然アミノ酸の化学的合成による挿入または置換を含む。本発明の修飾されたイムノグロブリンは、本発明の修飾されていない分子の結合（または非結合）特性を保持する。当業者に知られている方法により、抗体などのイムノグロブリン、または他のタンパク質は、「操作された」タンパク質のコード配列が本発明の発現カセットに含まれる前に、標的親和性、選択性、安定性、および／または製造可能性の改善のために、「操作され」または修飾されてよい。

イムノグロブリン（抗体および抗体フラグメントを含む）などの対象とするタンパク質と関連して使用される場合の用語「誘導体」は、治療剤または診断剤に対するコンジュゲート、標識化（たとえば、放射性核種または様々な酵素で）、ペグ化（ポリエチレングリコールでの誘導体化）などの共有結合性のポリマー付着、および非天然アミノ酸の化学的合成による挿入または置換により、共有結合的に修飾されるタンパク質を指す。本発明の誘導体は、非誘導体化分子の結合特性を保持する。

本発明の範囲内で、対象とするタンパク質は、ヒトの疾患または障害を含むが限定されない、疾患の治療のための治療的タンパク質、または「生物製剤」であってよい。「治療」または「治療する」は、障害の病態の発達を予防するまたは改変する意図で行われる介入である。よって、「治療」は、治療的処置と、予防のまたは防止の手段との両方を指す。治療を必要とするものは、すでに障害を有するもの、および障害が予防されるべきものを含む。「治療」は、軽減；寛解；症状の減少または損傷、病態もしくは症状を患者にとってより容認できるものにすること；変性または減退の速度の遅延；変性の最終点を弱めること；患者の身体または精神の状態を改善することなどの、任意の客観的または主観的なパラメータを含む、損傷、病態または症状の回復における成功のいずれかの指標を含む。症状の治療または回復は、医師または他のヘルスケア供給者による身体検査、患者による自己報告、神経精神症状試験、および／または精神医学的評価の結果を含む、客観的または主観的なパラメータに基づいてよい。

治療薬の「有効量」は一般に、症状の重症度および／もしくは頻度を低減する、症状および／もしくは根底にある原因を排除する、症状および／もしくはそれらの根底にある原因の発症を予防する、ならびに／または片頭痛からもたらされるもしくは片頭痛に関連する損傷を改善するもしくは修正するために十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、治療上の有効量または予防上の有効量である。「治療上の有効量」は、何らかの形で（すなわち「治療的有効性」を提供する形で）疾患状態（たとえば移植拒絶反応またはＧＶＨＤ、炎症、多発性硬化症、癌、循環器疾患、糖尿病、神経障害、疼痛）もしくは症状、特に疾患状態に関連する状態もしくは症状を改善するために十分な量、または疾患状態もしくは疾患と関連する他のいずれかの望ましくない症状の進行を予防する、妨害する、遅延するもしくは反転するために十分な量である。「予防上の有効量」は、対象に投与される場合に、意図した予防効果、たとえば、片頭痛または多発性硬化症の症状の発症（もしくは再発）を予防するもしくは遅延する、または片頭痛、片頭痛の症状、もしくは多発性硬化症の症状の発症（もしくは再発）の可能性を低下する、効果を有する、医薬組成物の量である。完全な治療的効果または予防的効果は、１つの用量の投与により必ず起こるわけではなく、一連の用量の投与の後にのみ起こる場合がある。よって、治療上の有効量または予防上の有効量は、１つまたは複数の投与で投与されてよい。

対象とするタンパク質は、任意のタンパク質であってよいが、多くの実施形態では、タンパク質は、薬理学的に活性なタンパク質またはペプチドである。

本発明のいくつかの実施形態では、対象とするタンパク質は、模倣性ペプチドまたはアゴニストペプチドであってよい。用語「−模倣性ペプチド」、「ペプチド模倣体」、および「アゴニストペプチド」は、対象とする天然に存在するタンパク質と同等な生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質を指す。これらの用語は、天然に存在する分子の作用を増強することによるなど、天然に存在するペプチド分子の活性を間接的に模倣するペプチドをさらに含む。

本発明のいくつかの実施形態では、対象とするタンパク質は、アンタゴニストペプチドまたは阻害剤ペプチドであってよい。用語「−アンタゴニストペプチド」、「ペプチドアンタゴニスト」、および「阻害剤ペプチド」は、対象とする受容体の生物学的活性を遮断するもしくは何等かの方法で妨害するペプチド、または対象とする受容体（限定するものではないが、イオンチャネル型の受容体もしくはＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）など）の既知のアンタゴニストもしくは阻害剤と同等な生物学的活性を有するペプチドを指す。

本発明の中で使用できる薬理学的に活性なタンパク質の例として、限定するものではないが、毒性ペプチド、ＩＬ−６結合ペプチド、ＣＤ３結合タンパク質、ＣＤ１９結合タンパク質、ＣＤ２０結合タンパク質、ＣＤ２２結合タンパク質、ＨＥＲ２結合タンパク質、ＨＥＲ３結合タンパク質、ＶＥＧＦ−Ａ結合タンパク質、ＴＮＦ−α結合タンパク質、ＥＧＦＲ結合タンパク質、ＲＡＮＫリガンド結合タンパク質、ＩＬ−１α結合タンパク質、ＩＬ−１β結合タンパク質、ＩＬ−１７Ａ結合タンパク質、ＥＰＣＡＭ（ＣＤ３２６）結合タンパク質、ＣＧＲＰペプチドアンタゴニスト、ブラジキニンＢ１受容体ペプチドアンタゴニスト、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）アゴニストペプチド、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）アンタゴニストペプチド、ａｎｇ−１結合ペプチド、ａｎｇ−２結合ペプチド、ミオスタチン結合ペプチド、エリスロポエチン−模倣性（ＥＰＯ−模倣性）ペプチド、ＦＧＦ２１ペプチド、トロンボポエチン−模倣性（ＴＰＯ−模倣性）ペプチド（たとえばＡＭＰ２またはＡＭＰＳ）、神経成長因子（ＮＧＦ）結合ペプチド、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）結合ペプチド、およびグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）−１もしくはそのペプチド模倣体またはＧＬＰ−２もしくはそのペプチド模倣体が、挙げられる。

ペプチドまたはタンパク質の「類似体」という用語は、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、内部付加、もしくは少なくとも１つのアミノ酸残基の内部欠失、および／またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端のトランケーション、もしくは付加により、天然に存在するペプチド配列と異なる配列を有するポリペプチドを指す。「内部欠失」は、Ｎ末端またはＣ末端以外の位置で天然に存在する配列由来のアミノ酸が存在しないことを指す。同様に、「内部付加」は、Ｎ末端またはＣ末端以外の位置で天然に存在する配列中のアミノ酸の存在を指す。

ＤＮＡのクローニング
ＤＮＡのクローニングは、標準的な技術（たとえば、参照として本明細書中に援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ， Ｖｏｌｓ １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照）を使用して行われる。たとえば、ｃＤＮＡライブラリーは、ポリＡ＋ｍＲＮＡ、好ましくは膜結合型ＲＮＡの逆転写により構築でき、このライブラリーは、ヒトのイムノグロブリンポリペプチドの遺伝子配列に特異的なプローブを使用してスクリーニングされる。一実施形態では、しかしながら、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＤ）を使用して、対象とするイムノグロブリンの遺伝子セグメント（たとえば軽鎖または重鎖の可変部のセグメント）をコードするｃＤＮＡ（または完全長のｃＤＮＡの一部）を増幅する。増幅された配列は、いずれかの適切なベクター、たとえば発現ベクター、ミニ遺伝子ベクター、またはファージディスプレイベクター中へ容易にクローン化できる。使用されるクローンニングの特定の方法は、対象とするイムノグロブリンポリペプチドのいくつかの部分の配列を決定することが可能である限り、重要ではないことが認識されている。

抗体の核酸の１つの供給源は、対象とする抗原で免疫された動物由来のＢ細胞を入手し、それを不死化細胞に融合することにより産生されるハイブリドーマである。あるいは、核酸は、免疫された動物のＢ細胞（または脾臓全体）から単離できる。抗体をコードする核酸のさらなる別の供給源は、たとえばファージディスプレイ技術を介して作製される、当該核酸のライブラリーである。対象とするペプチド、たとえば望ましい結合特徴を有する可変領域のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、パニングなどの標準的な技術により同定できる。

イムノグロブリンポリペプチドの全可変領域をコードする配列が決定され得る；しかしながら、場合によっては、可変領域の一部のみ、たとえばＣＤＲをコードする部分、をシークエンシングすることが適切である。シークエンシングは、標準的な技術を使用して行われる（たとえば本明細書中で参照として援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ， Ｖｏｌｓ １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ａｎｄ Ｓａｎｇｅｒ， Ｆ． ｅｔ ａｌ． （１９７７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４： ５４６３−５４６７を参照）。クローン化された核酸の配列を公開されたヒトのイムノグロブリン遺伝子およびｃＤＮＡの配列と比較することにより、当業者は、シークエンシングされた領域に応じて、（ｉ）ハイブリドーマのイムノグロブリンポリペプチド（重鎖のアイソタイプを含む）の生殖系列のセグメントの使用、および（ｉｉ）Ｎ末端の付加および体細胞変異の過程からもたらされる配列を含む、重鎖および軽鎖の可変領域の配列、を容易に決定できる。イムノグロブリン遺伝子配列情報の１つの供給源は、メリーランド州ベセスダの国立生物工学情報センター、国立医学図書館、アメリカ国立衛生研究所である。

単離されたＤＮＡは、制御配列に操作可能に連結されるか発現ベクター中に配置でき、これは次いで、組み換え宿主細胞でのモノクローナル抗体の合成のために、イムノグロブリンタンパク質を特段産生しない宿主細胞にトランスフェクトされる。抗体の組み換え産生は、当該分野でよく知られている。

核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合に、操作可能に連結される。たとえば、プレ配列または分泌リーダーに関するＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドに関するＤＮＡに操作可能に連結されており；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合、コード配列に操作可能に連結されており；またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に操作可能に連結されている。一般的に、操作可能に連結されるとは、連結されるＤＮＡ配列が連続的であり、分泌リーダーの場合、連続的でかつ読み取り状態にあることを意味する。しかしなら、エンハンサーは連続的である必要はない。連結は、簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーが、従来の実務にしたがい使用される。

多くのベクターが、当該分野で知られている。ベクターの構成成分は、以下の１つまたは複数を含み得る：シグナル配列（たとえば、抗体の分泌を目的とし得る；たとえば、ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＧＧＴ ＧＣＧＣＧＣＴＧＴ／／配列番号７であり、これはＶＫ−１シグナルペプチド配列ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ／／配列番号８をコードする）、複製起点、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子（たとえば、抗菌耐性もしくは他の薬剤耐性、補完の栄養要求欠失（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ）、または培地で利用できない重大な栄養素の供給を提供し得る）、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。これらすべては当該分野でよく知られている。

さらなる例示として、以下に番号付けされた実施形態が、本発明に含まれる。

実施形態１：ハイブリッドプロモーターであって、
（ｉ）ｍＣＭＶエンハンサーエレメント（ｍＣＭＶ−Ｅ）およびその３’末端にＣＭＶプロモーター（ＣＭＶ−Ｐ）配列を含み、ラットのＥＦ−１αイントロン配列に対し５’で操作可能に連結される、ｍＣＭＶエンハンサー配列と、
（ｉｉ）ｍＣＭＶエンハンサー配列のＣＭＶプロモーター配列の３’に、およびラットのＥＦ−１αイントロン配列の５’に、操作可能に連結される介在性の第１のリーダー配列と、
（ｉｉｉ）ラットのＥＦ−１αイントロン配列の３’に操作可能に連結される第２のリーダー配列と
を含む、ハイブリッドプロモーター。

実施形態２：ｍＣＭＶエンハンサー配列の３’末端でのＣＭＶプロモーター配列が、配列番号２４または配列番号２６のヌクレオチド配列を有するセグメントを含む、実施形態１に記載のハイブリッドプロモーター。

実施形態３：ラットのＥＦ−１αイントロン配列が、配列番号４のヌクレオチド配列を含む、実施形態１または２に記載のハイブリッドプロモーター。

実施形態４：ｍＣＭＶエンハンサー配列が、配列番号２または配列番号３３のヌクレオチド配列を含み、ラットのＥＦ−１αイントロン配列が、配列番号４のヌクレオチド配列を含む、実施形態１〜３のいずれか１項に記載のハイブリッドプロモーター。

実施形態５：第１のリーダー配列が、配列番号３のヌクレオチド配列を含む、実施形態１〜４のいずれか１項に記載のハイブリッドプロモーター。

実施形態６：第２のリーダー配列が、配列番号５のヌクレオチド配列を含む、実施形態１〜５のいずれか１項に記載のハイブリッドプロモーター。

実施形態７：ＣＭＶプロモーター配列内に挿入された１つまたは複数のＴｅｔＯ配列をさらに含む、実施形態１〜６のいずれか１項に記載のハイブリッドプロモーター。

実施形態８：配列番号１、配列番号３０、配列番号３１、または配列番号３２のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１〜７のいずれか１項に記載のハイブリッドプロモーター。

実施形態９：対象とする外因性タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの５’で操作可能に連結される、実施形態１〜８のいずれか１項に記載のハイブリッドプロモーターと、オープンリーディングフレームの３’で操作可能に連結されるポリアデニル化部位とを含む、発現カセット。

実施形態１０：実施形態９に記載の発現カセットを含む組み換え発現ベクター。

実施形態１１：実施形態１０に記載の組み換え発現ベクターを含む哺乳類の宿主細胞。

実施形態１２：さらにＴｅｔＲを発現できる、実施形態１１に記載の哺乳類の宿主細胞。

実施形態１３：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来する、実施形態１１または１２に記載の哺乳類の宿主細胞。

実施形態１４：ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＤＸＢ１１細胞、およびＤＧ４４細胞からなる群から選択される、実施形態１１〜１３のいずれかに記載の哺乳類の宿主細胞。

実施形態１５：対象とするタンパク質を産生する方法であって、
（ａ）対象とするタンパク質の発現を可能にする生理学的な条件下で水系培地において、実施形態１１〜１４のいずれかに記載の哺乳類の宿主細胞を培養することと、
（ｂ）上記培地から対象とするタンパク質を回収することと
を含む、方法。

実施形態１６：対象とするタンパク質を産生する方法であって、
（ａ）生理学的な条件下で水系培地において、実施形態７または８に記載のハイブリッドプロモーターを含む発現ベクターを含む哺乳類の宿主細胞を培養することであって、上記哺乳類の宿主細胞がＴｅｔＲを発現でき、これにより、培地中のテトラサイクリンの不在下で、対象とするタンパク質の発現が抑制される、ことと、
（ｂ）宿主細胞中でＴｅｔＲを結合するのに十分な量で水系培地にテトラサイクリンを添加することであって、それにより宿主細胞による対象とするタンパク質の発現が抑制解除される、ことと、
（ｃ）上記培地から対象とするタンパク質を回収すること
を含む、方法。

実施形態１７：水系培地が無血清である、実施形態１５または１６に記載の方法。

実施形態１８：上記哺乳類の宿主細胞を培養することが水系培地中の懸濁液において行われる、実施形態１５または１６に記載の方法。

実施形態１９：上記哺乳類の宿主細胞を培養することが固体または半固体の基板上の接着層において行われる、実施形態１５または１６に記載の方法。

以下の実施例は例示的なものであり、本発明の範囲を限定するようには全く構成されていない。

実施例
実施例１
材料および方法
ベクターの構築：すべてのベクターＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧは、対象とする外因性タンパク質「Ｆｃ−Ａ」（または「ＦＣ−Ａ」；治療上の抗炎症性抗体との例示的なＦｃ融合物）をコードするＤＮＡ配列、ＥＭＣＶウイルス由来のＩＲＥＳ、マウスのジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および上述のＳＶ４０ウイルス由来の２２１ｂｐ後期ポリアデニル化を含んだ（Ｋａｕｆｍａｎ， Ｒ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ＥＭＣ ｖｉｒｕｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９（１６）： ４４８５−４４９０ （１９９１）； Ｓｃｈｅｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｅｌｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０ ｌａｔｅ ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎａｌｙｓｅｓ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １２（１２）：５３８６−９３ （１９９２））。ＩＲＥＳとＤＨＦＲの間のジャンクションは

であり、ここで小文字は内在性ＩＲＥＳ配列を表し、ＤＦＦＲのＡＴＧ転写開始部位はイタリック体の小文字である。単一の転写物が、これらの様々なコンストラクトから開始され、これはよって、Ｆｃ―Ａ遺伝子、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、マウスＤＦＨＲ遺伝子を含み、ＳＶ４ポリアデニル化部位で終結する。

様々な転写促進配列が、上述の配列に対し５’、または５’および３’の両方のいずれかに含まれた。これは、すべてのプラスミドが、相対的な発現に関するマーカーとしてＤＨＦＲの遺伝子およびＦｃ−Ａを使用して選択されることを可能にする。すべてのプラスミドに関するプラスミド骨格は、ｐＵＣ５７−ｓｉｍｐｌｅ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ；ニュージャージー州ピスカタウェイ）であった。

いくつかの例示的なプラスミドが、図１に概略的に表示される。ベクターＣは、前述のヒトＣＭＶおよびヒトＥＦ−１αイントロン配列（Ｋｉｍ， Ｌｅｅ， Ｓｈｉｎ， Ｋａｎｇ， ＆ Ｋｉｍ， ２００２）を含んだ。ベクターＦ（図１）は、ＡＴＧに隣接する４０８３ｂｐの５’配列およびポリアデニル化部位に続く４１７４ｂｐの３’隣接配列を伴い前述の内在性のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）のＥＦ−１α遺伝子に隣接する配列（Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｄｅｅｒ， Ｊ．， ＆ Ａｌｌｉｓｏｎ， Ｄ． Ｓ．， Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ ＥＦ−１ａｌｐｈａ Ｇｅｎｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ２０：８８０−８８９ （２００４））を含んだ。ベクターＧ（図１）は、ＣＨＯのＥＦ−１α遺伝子の転写開始部位〜ＦＳＥＩ部位の２４０ｂｐの配列を欠失させ、それを位置６１５〜転写開始点のマウスＣＭＶフラグメントを含むＤＮＡフラグメントと置き換えることにより、構築された。ベクターＤ（図１）は、配列番号１（マウスＣＭＶ ＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ０６８１６．１、ヌクレオチド４０６７−４６８２、ラットＥＦ−１αイントロン Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＣ１５８９８７．３、ヌクレオチド２２１３７−２１７２８を含む）に示されるフラグメントを合成し、これらの配列をＦｃ−Ａコード配列の５’に配置することにより、構築された。ベクターＣおよびベクターＤはまた、内在性の３’非翻訳リーダー配列を置き換えるアデノウイルス３要素リーダーも含んだ（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。ｐＵＣ５７−ｓｉｍｐｌｅベクターは、図１には示されない。ベクターＤの完全なマップは、図２に示される。

細胞のエレクトロポレーションおよび培養
前述のように、長期間のエレクトロポレーションを行った（Ｂｏｄｗｅｌｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｌｏｎｇ Ｄｕｒａｔｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｃｈｉｅｖｉｎｇ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ． Ｊ． Ｓｔｅｒｉｏｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ａｎｄ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ６８（ｅ ８）， ７７−８２ （１９９９））。簡潔に述べると、２×１０^７個の細胞を、０．３ｍｌのＨＢＳバッファー（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）のポリソルベート２０）中に再懸濁し、２５ｍｇのＤＮＡを添加し、３１７５μＦの静電容量、７２０オーム、および２００ボルトでＢＴＸ ＥＭ ６００を使用して４ｍｍのギャップのキュベット中でエレクトロポレーションを行った。

ＤＸＢ１１細胞およびＤＧ４４細胞を、ＰｏｗｅｒＣＨＯ２（Ｌｏｎｚａ）、ＰｒｏＣＨＯ４（Ｌｏｎｚａ）またはＥｘ−ｃｅｌｌ ３０２（Ｓｉｇｍａ）のいずれかで、製造社の説明にしたがい培養した。細胞を、３〜４日ごとに培養し、３日間培養では４×１０^５個の細胞／ｍｌ、または４日間培養では３×１０^５個の細胞／ｍｌで播種した。

タンパク質の力価を、ＰＯＲＯＳ Ａ／２０ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムを使用するアフィニティ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、決定した。

実施例２：ＣＨＯ細胞のトランスフェクション
ＣＨＯ細胞を、Ｆｃ−Ａ融合タンパク質を発現する様々なコンストラクトを用いてトランスフェクトした。これらのコンストラクトは、図１および図２に示される。トランスフェクトされた細胞の集合を、Ｆｃ−Ａ融合タンパク質の発現に関して比較した。

ＤＸＢ１１細胞のトランスフェクション
様々なＦｃ−Ａ発現プラスミドを使用して、エレクトロポレーションを用いて、ＤＨＦＲ変異ＣＨＯ細胞株であるＤＸＢ１１をトランスフェクトした。これらの細胞を、ＰｒｏＣＨＯ４中で増殖し、ヒポキサンチンおよびチミジンを欠く培地での増殖に関してまず選択し、次いで１５０ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）で選択した。１５０ｎＭのＭＴＸで選択した細胞の集合を、１×１０^６個の細胞／ｍｌで播種し、２日目、４日目および７日目に、Ｅｘ−ｃｅｌｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯ Ｆｅｅｄ １（ＳＡＦＣ）およびグルコースを与えた。上清の液体を８日目に回収し、前述のようにｐｏｒｏｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａにより解析した。

Ｆｃ−Ａタンパク質の力価および特異的生産性（ピコグラム／細胞／日）が、図３Ａおよび３Ｂにそれぞれ示される。これらの結果は、ラットＥＦ−１αイントロンおよび適切なリーダー配列（たとえばここでは、アデノウイルス３要素リーダー；ベクターＤ）と組み合わせたマウスＣＭＶエンハンサーを含むハイブリッドプロモーターが、トランスフェクトされた細胞の集合によるＦｃ−Ａ組み換えタンパク質の発現を高めたことを示した。達成されたタンパク質の力価は、他のコンストラクトよりも優れており、特異的生産性は、他のコンストラクトを使用して得た特異的生産性と同様に良好またはそれよりも良好であった。

ベクターＤ、Ｆ、およびＧでのＤＸＢ−１１のトランスフェクション
ベクターＤ、Ｆ、およびＧ（図１）を、ＰｏｗｅｒＣＨＯ２中で増殖させたＤＸＢ１１細胞をトランスフェクトするために使用した。細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジンを欠く培地における増殖に関してまず選択し、１５０ｎＭのＭＴＸに対して増幅し、次に５００ｎＭのＭＴＸに対して再度増幅して発現をさらに高めた。これらの集合を、１×１０^６個の細胞／ｍｌで播種し、２日目、３日目および６日目にＥｘ−ｃｅｌｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯ Ｆｅｅｄ １およびグルコースを与えた。上清の液体を、８日目に回収した。図４Ａおよび図４Ｂでそれぞれ示されるように、ベクターＤでトランスフェクトされたこれら集合の力価は、ベクターＦおよびＧと比較して顕著に高かった。ベクターＤの特異的な生産性は一般に、ベクターＦおよびＧよりも高かった。

ベクターＤおよびベクターＦでのＤＧ４４およびＤＸＢ−１１のトランスフェクション
ＣＨＯ細胞を、Ｆｃ−Ａ融合タンパク質を発現するベクターＤおよびベクターＦでトランスフェクトした。Ｅｘ−ｃｅｌｌ ３０２中で増殖させたＤＸＢ１１細胞を、前述のようにトランスフェクトした。別のＤＨＦＲ変異細胞株であるＤＧ４４を、ＰｏｗｅｒＣＨＯ２中で増殖させ、ＤＸＢ１１細胞と同様にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞の集合を、それらのＦｃ−Ａの発現に関して比較した。細胞を、エレクトロポレーションを使用してトランスフェクトし、ヒポキサンチンおよびチミジンを欠く培地での増殖に関して選択し、次に１５０ｎＭのＭＴＸに対して増幅した。ＤＸＢ１１を、５００ｎＭのＭＴＸに対してさらに増幅し、ＤＧ４４細胞を、１μＭのＭＴＸに対しさらに増幅した。細胞の集合を次に、Ｅｘ−ｃｅｌｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯ Ｆｅｅｄ １を補充した増殖培地中へ１：５の希釈で播種し、３日目、６日目および８日目にＥｘ−ｃｅｌｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯ Ｆｅｅｄ １およびグルコースを与えた。上清の液体を１０日目に回収し、上述のようにｐｏｒｏｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａにより解析した。力価および特異的生産性が、それぞれ、図５Ａおよび図５Ｂに示される。

ベクターＤでトランスフェクトされたＤＸＢ１１の集合は、ベクターＦでトランスフェクトされた集合よりもＦｃ−Ａ融合タンパク質をほぼ２倍多く発現した。ベクターＤおよびＦでトランスフェクトされたＤＧ４４細胞の集合は、同様のレベルで発現した。しかしながら、ベクターＤでトランスフェクトされた集合は、わずかに高い特異的生産性を有した。ＤＸＢ１１細胞と比較して低いＤＧ４４細胞の特異的生産性は、ＤＧ４４細胞が、ＤＸＢ１１細胞よりもＭＴＸに対して感受性が低いことを暗示する。

ベクターＤはまた、アデノウイルス３要素リーダー（ＴＰＬ）に由来する５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）リーダー配列も含んだ。ＴＰＬは、ストレス条件下でタンパク質の発現を高めることが示されている（Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ， Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ｌａｔｅ ａｆｔｅｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１（１２）： ３６５５−５９ （１９８４））。これらの研究ではＴＰＬが発現を高めているかどうかは明らかでないが、他の研究は、それらが真の開始コドンの前に大きな二次構造または開始コドンを含まない限り、この位置で使用し得る５’ＵＴＲの正確なヌクレオチド配列は変動することを示している（Ｍｉｇｎｏｎｅ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｍＲＮＡｓ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３（３）：ｒｅｖｉｅｗｓ０００４．１−０００４．１０ （２００２））。

実施例３：本発明のハイブリッドプロモーターからのテトラサイクリン誘導性発現
Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）を発現する細胞において、テトラサイクリンを使用してＴｅｔオペレーター配列を含むプロモーターからの発現を調節できる（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ）。ＴＡＴＡボックスのすぐ３’でのＴｅｔオペレーター（ＴｅｔＯ）配列の導入は、ＴｅｔＲの存在下でこのプロモーターからの転写を防止する。おそらくは、ＴｅｔＲがＴｅｔＯに結合し、転写開始因子が転写開始部位と相互作用するのを阻むか、または転写開始複合体の形成を妨害する（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ）。特に、ＴｅｔＯ配列の位置決めは、ＴｅｔＲが転写を効率的に調節できるかどうかを決定する際に重要である（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ， ｔｅｔＲ， ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｔｅｔＲ−ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｆｕｓｉｏｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ， ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９（１３）：１９３９−５０ （１９９８）参照）。

Ｙａｏらは、ＴＡＴＡＴＡＡ配列の１０ｂｐ下流にＴｅｔＯ配列を配置することが、ＴＡＴＡ結合タンパク質と同じ表面へのＴｅｔＲの結合を可能にするという仮説を立てた。この仮説と一致して、Ｋｉｍらは、ｈＣＭＶ ＵＳ１１ ＴＡＴＡＡＧ配列の下流の位置０または１５でのＴｅｔＯ配列の挿入は、ＴｅｔＲの存在下での抑制を保持できないことを見出した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９： ２５６５−２５７ （１９９５）参照）。

テトラサイクリン（Ｔｅｔ）は、培養物に添加されると、ＴｅｔＲに結合し、ＴｅｔＯ配列への結合を阻害し、よって転写を可能にする。本発明のｍＣＭＶエンハンサー配列／ラットＥＦ−１αイントロンハイブリッドプロモーター配列に基づく、強力なＴｅｔ調節型プロモーターを作製するために、本出願人らはまず、ＬａｃＺ（βガラクトシダーゼタンパク質）の発現を駆動するプラスミド、ＪＶ５６＿ｐＪＶ３９＿ｐＪＶ１０＿ｐＵＣ５７Ｓを作製した（本明細書中では「ｐＪＶ５６」と略される；図６）。ＬａｃＺのオープンリーディングフレームは、配列番号１２である。

基本的な考えは、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）による調節に寄与するＴｅｔＯ結合部位を含むヒトＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶ−Ｐ）エレメントと、ｍＣＭＶプロモーター（ｍＣＭＶ−Ｐ）エレメントの配列の一部を交換することであった。このコンストラクト、ＪＶ５７＿ＪＶ５６＿ｐＪＶ３９＿ｐＪＶ１０（本明細書中では「ｐＪＶ５７」と略される；図７）は、ＬａｃＺの発現に関するテトラサイクリン感受性ＴｅｔＯ調節エレメントを含む。図１０は、ｍＣＭＶプロモーター配列に挿入されたｈＣＭＶ−Ｐ／ＴｅｔＯを概略的に示す。この挿入は、ｈＣＭＶ−Ｐプロモーター配列の一部と、ｍＣＭＶ−Ｐプロモーター配列の一部を置き換える。別のコンストラクトを、調節されないプロモーター（ハイブリッドｍＣＭＶエンハンサー／（部分的な）ｈＣＭＶプロモーター／ラットＥＦ−１αイントロン）との関連でＰａｔｗａｒｄｈａｎらにより記載されるｈＣＭＶプロモーターでの発現を増大させる変化を組み込むように作製した（Ｐａｔｗａｒｄｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１７３−７５ （２００９））。このコンストラクトは、ＪＶ５９＿ＪＶ５６＿ｐＪＶ３９＿ｐＪＶ１０（本明細書中では「ｐＪＶ５９」と略される；図８）であった。別のコンストラクト、ＪＶ６０＿ＪＶ５６＿ｐＪＶ３９＿ｐＪＶ１０（本明細書中では「ｐＪＶ６０」と略される；図９）では、ＰＪＶ５７のＴｅｔＯ配列を、Ｐａｔｗａｒｄｈａｎらによる研究において転写開始部位の周りの発現を増大させた配列に一致するように変化させた（図９および図１２参照）。

図１１は、ｍＣＭＶプロモーター（ｍＣＭＶ−Ｐ）配列を置き換えるために本出願人らが使用したｈＣＭＶ−Ｐ／ＴｅｔＯのＤＮＡ配列を示す。矢印は、パリンドロームＴｅｔＲ結合部位を示す。示されるｍＣＭＶ−ＰおよびｈＣＭＶ−Ｐプロモーター配列は、ＴＡＴＡボックス〜転写開始部位の配列である。転写の開始は、３’配列ｔａｃｃｇ中のｇ残基である。ＴｅｔＯ配列は、転写開始部位が、概してＴＡＴＡボックスの５’のＴに対して約３０塩基の３’であるため、転写開始部位に確実に影響を与えることに、留意されたい。

本出願人らは、タンパク質の発現のレベルをモニタリングするために、様々なコンストラクトからβガラクトシダーゼを発現させた。この挿入された代わりの配列は、ｍｕＣＭＶエンハンサーエレメント（ｍＣＭＶ−Ｅ）／（部分的な）ｈｕＣＭＶプロモーター／ＴｅｔＯ／ラットＥＦ−１αイントロンを含み、培地中のテトラサイクリンにより実際に調節された（たとえば、図１４、ｐＪＶ５７＋／−Ｔｅｔを参照）。さらに、コンストラクトｐＪＶ５７は、図１４に示されるように、Ｔｅｔが培地に存在した場合に、ヒトＣＭＶ／ＴｅｔＯの対照（ｐｃＤＮＡ５／ＴＯ／ＬａｃＺ； Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）よりも約１０倍多い組み換えタンパク質をもたらしたが、テトラサイクリンの非存在下では約３．５倍少ないβガラクトシダーゼをもたらした。ｐＪＶ５６でｍｕＣＭＶエンハンサー／ラットＥＦ−１αイントロンハイブリッドプロモーターを有するＴ−Ｒｅｘ ＣＨＯ細胞は、ＣＭＶエンハンサー配列のＣＭＶ−Ｐセグメント内にＴｅｔＯ配列を有さず、テトラサイクリンが培地中にあるかどうかに関わらず、同様にヒトＣＭＶ／ＴｅｔＯ対照（ｐｃＤＮＡ５／ＴＯ／ＬａｃＺ）よりも約１０倍多いタンパク質を発現した。

材料および方法
Ｔ−Ｒｅｘ（商標）−ＣＨＯ細胞
Ｔ−Ｒｅｘ−ＣＨＯ細胞株（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ． Ｒ７１８０７）を、製造社のプロトコルにしたがい、Ｈａｍ’ｓＦ１２培地＋グルタミン＋１０μｇ／ｍｌのＢｌａｓｔ中で培養した。Ｔ−Ｒｅｘ−ＣＨＯ細胞を、Ｂｏｄｗｅｌｌらにより記載される長期間のエレクトロポレーション（ＬＤＥ）法（Ｂｏｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｌｏｎｇ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｃｈｉｅｖｉｎｇ Ｈｉｇｈ Ｌｅｖｅｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ， Ｊ． Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ６８：７７−８２ （１９９９））を使用して、図６、図７、図８、および図９にそれぞれ示される、βガラクトシダーゼタンパク質を発現する様々なコンストラクトのｐＪＶ５６、ｐＪＶ５７、ｐＪＶ５９、およびｐＪＶ６０でエレクトロポレーションした。トランスフェクトした細胞を２４時間回収し、次に２４時間の間１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを伴いまたは伴わずに処理した。細胞を溶解し、βガラクトシダーゼ活性を製造社のプロトコルにしたがいβ−Ｇａｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ． Ｋ１４５５−０１）を使用してアッセイした。簡潔に述べると、ライセートを１０倍希釈し、１０μｌのアリコートを、ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ． ２３２２７）を使用してアッセイして、ライセートのタンパク質濃度を決定した。ライセートを１００倍希釈し、１０μｌのアリコートをβガラクトシダーゼ活性に関してアッセイした。すべての試料を、少なくとも二重でトランスフェクトした。特異的なβガラクトシダーゼ活性を、アッセイしたタンパク質の量に対して正規化し、モックトランスフェクトした細胞のバックグラウンド活性を、トランスフェクト試料から減算した。結果を、標準偏差を伴いグラフに示した（図１４）。

ＣＨＯ−Ｋ１／ＴｅｔＲ細胞
別々の実験で、テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（登録商標）（ニュージャージー州ピスカタウェイ）によりｐｃＤＮＡ３．１＋発現ベクター中にサブクローニングして、ベクターｐＪＶ４０＿ｐｃＤＮＡ３．１＋ｔｅｔＲ（本明細書中では「ｐＪＶ４０」と略される；図１５）を得た。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を規定通り、ＰｏｗｅｒＣＨＯ（商標）既知組成，無血清ＣＨＯ培地（Ｌｏｎｚａ， Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ． ＢＥ１２−７７１Ｑ）中で培養し、細胞を、ｐＪＶ４０に関して上述のように、ＬＤＥ法を使用してエレクトロポレーションした。トランスフェクトした集合を、ＰｏｗｅｒＣＨＯ（商標）２＋６００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ， Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ． １０１３１０２７）中で１０日間選択した。細胞を次に段階希釈し、９６ウェルのマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）９６ Ｗｅｌｌ， Ｐｒｏｄｕｃｔ ＃３３４０）に、クローニング培地（ＣＨＯ細胞用のＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２ 無血清培地；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ． １４３２６Ｃ ＳＩＧＭＡ）＋１５％の条件培地、Ｇ４１８の存在下）中ウェル当たり０．７５個の細胞で、プレーティングした。クローンの集合を１１〜１２日後に同定し、さらに３〜４日間の間、５０／５０のクローニング培地／ＰｏｗｅｒＣＨＯ（商標）２培地中で１２ウェルプレートに移した。最後に、クローンを、２４ディープウェルプレート（ＶＷＲ， Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ． Ｐ−ＤＷ−１０ＭＬ−２４−Ｃ−Ｓ）に移動させ、ＰｏｗｅｒＣＨＯ（商標）２培地＋６００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で一定して振盪（２２０ｒｐｍ）しながら増殖させた。

高レベルのＴｅｔＲを発現するクローンに関してスクリーニングするために、ＣＨＯ−Ｋ１／ＴｅｔＲクローンを、製造社のプロトコルに従いＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯトランスフェクションキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ． Ａ２９１３０）を使用して、ｐＪＶ５７でトランスフェクトした。高度に発現したＴｅｔＲ＋クローンから、いくつかのクローンをその後、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯトランスフェクションキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ． Ａ２９１３０）を使用してベクターｐＪＶ５６、ｐＪＶ５７、ｐＪＶ５９、またはｐＪＶ６０でトランスフェクトするために選択し、製造社のプロトコルにしたがい再度トランスフェクトした。トランスフェクトしたクローンを２４時間にわたり回収し、次に１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンで２４時間処理した。ＬａｃＺタンパク質産物の発現を測定するために、細胞を溶解し、βガラクトシダーゼ活性を、製造社のプロトコルに従いβ−Ｇａｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ． Ｋ１４５５−０１）を使用してアッセイした。

簡潔に述べると、ライセートを１０倍希釈し、１０μｌのアリコートを、ライセートのタンパク質濃度を決定するためにＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ． ２３２２７）を使用してアッセイした。１０μｌの希釈していないライセートを、βガラクトシダーゼ活性に関してアッセイした。すべての試料を、少なくとも２重でトランスフェクトした。特異的なβガラクトシダーゼ活性を、アッセイしたタンパク質の量に対して正規化し、モックトランスフェクトした細胞のバックグラウンド活性を、トランスフェクト試料から減算した。結果を、標準偏差を伴いグラフに示した（たとえば図１６、図１７、図１８）。

図１６（クローン３Ｅ７）、図１７（クローン３Ｆ９）、および図１８（クローン４Ｇ２）は、βガラクトシダーゼタンパク質を発現する様々なコンストラクト（ｐＪＶ５６、ｐＪＶ５７、ｐＪＶ５９、およびｐＪＶ６０）でトランスフェクトした（または陽性対照：ｐｃＤＮＡ５／ＴＯ／ＬａｃＺ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ． Ｖ１０３３−２０でトランスフェクトした）ＣＨＯ−Ｋ１／ＴｅｔＲクローンからの代表的な結果を示す。上記の通り、細胞を、製造社のプロトコルに従いＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ トランスフェクションキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ． Ａ２９１３０）を使用して、ｐＪＶ５７でトランスフェクトした。トランスフェクトしたクローンを２４時間にわたり回収し、次に１μｌのテトラサイクリンで２４時間処理した。細胞を溶解し、βガラクトシダーゼ活性を、製造社のプロトコルに従いβ−Ｇａｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ． Ｋ１４５５−０１）を使用してアッセイした。簡潔に述べると、ライセートを１０倍希釈し、１０μｌのアリコートを、ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ． ２３２２７）を使用してアッセイして、ライセートのタンパク質濃度を決定した。１０μｌの希釈していないライセートを、βガラクトシダーゼ活性に関してアッセイした。すべての試料を、少なくとも２重でトランスフェクトした。特異的なβガラクトシダーゼ活性を、アッセイしたタンパク質の量に対して正規化し、モックトランスフェクトした細胞のバックグラウンド活性を、トランスフェクト試料から減算した。特異的なβガラクトシダーゼ活性を、アッセイしたタンパク質の量に対して正規化し、モックトランスフェクトした細胞のバックグラウンド活性を、トランスフェクト試料から減算した。結果を、標準偏差を伴いグラフに示した。

結果
Ｔ−ＲＥｘ（商標）ＣＨＯ細胞
ＴｅｔＲを安定して発現する市販の細胞株であるＴ−ＲＥｘＣＨＯ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用する実験で、本出願人らは、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）により調節されるｐＪＶ５７の能力を試験するために、読み出し情報としてβガラクトシダーゼ（β―ｇａｌ）活性を測定した。図１４に示されるように、ｐＪＶ５７は、テトラサイクリンの存在（＋Ｔｅｔ）により誘導される場合、ｐＪＶ５６と同等の発現を有した。さらに、ｐＪＶ５７は、テトラサイクリンで調節される強力な発現を呈することが示されたベクターであるｐｃＤＮＡ５／ＴＯ／ＬａｃＺと比較して、テトラサイクリンの存在下で（＋Ｔｅｔ）約１０倍高いＬａｃＺの発現を有した。ｐＪＶ５７はまた、テトラサイクリンによる、３．５倍の調節された発現を示し、これは強力に調節されるプロモーターを示す重要な知見である。陽性対照ｐｃＤＮＡ５／ＴＯ／ＬａｃＺに関するＴｅｔの調節の倍数差は、誘導されないｐｃＤＮＡ５／ＴＯ／ＬａｃＺとバックグラウンドの間の信号対雑音比が低く、対照で陰性のβ―ｇａｌ活性をもたらすため、図１４には含まれなかった。

ｐＪＶ５７をさらに改善するための試みにおいて、本出願人らは、転写開始部位周辺の変化がｈＣＭＶプロモーターからの発現を低減させたことを従来の研究が示すように（Ｐａｔｗａｒｄｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２７（１２）： １１７３−１１７５ （２００９））、ＴｅｔＯ配列がｐＪＶ５７からの発現を低減し得るとの仮説を立てた。ｐＪＶ５７中のＴｅｔＯ配列を、Ｐａｔｗａｒｄｈａｎらによる研究での転写開始部位の周りの発現を増大させる配列と一致するように、変化させた（ｐＪＶ６０、図９および図１２）。さらに、これらの変化を、高親和性のＴｅｔＲ結合を維持するように設計した（異なるＴｅｔＯ変異の親和性は、Ｓｉｚｅｍｏｒｅらにより記載され、Ｈｉｌｌｅｎ ａｎｄ Ｂｅｒｅｎｓで論述される）（Ｓｉｚｅｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔｎ１０ Ｔｅｔ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｅｔ ｏｆ ｔｅｔ ｏｐｅｒａｔｏｒ ｍｕｔａｎｔｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８ （１０） ２８７５−２８８０ （１９９０）； Ｈｉｌｌｅｎ ａｎｄ Ｂｅｒｅｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｎ１０ ｅｎｃｏｄｅｄ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏ． ４８：３４５−３６９ （１９９４））を参照）。しかしながら、この最適化されたコンストラクトであるｐＪＶ６０は、Ｔ−ＲＥｘ−ＣＨＯ細胞において、ｐＪＶ５７と比較して発現を増大させるようには見えなかった（図１４）。テトラサイクリン調節型の発現は維持されていたが、３．５０倍と比較しておそらくはわずかに少ない調節（２．６８倍）であった（図１４）。

最適化ｈＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶ−Ｐ）配列は、本発明のｍＣＭＶエンハンサー配列／ラットＥＦ−１αイントロンハイブリッドプロモーター中のｍＣＭＶプロモーター（ｍＣＭＶ−Ｐ）配列を置き換えた（図１３での配列比較を参照）。ｐＪＶ５９中に組み込まれた変化は、ｐＪＶ５６と比較して発現を増大させるようには見えなかった（図１４）。よって、本出願人らは、Ｔ−ＲＥｘ−ＣＨＯ細胞において、転写開始部位周辺で変化する、強力なｍＣＭＶエンハンサー／プロモーター―ラットＥＤ−１αイントロンのコンテクストは、発現にほとんど影響しないまたは全く影響しないと、結論付けた。

ＣＨＯ−Ｋ１／ＴｅｔＲ細胞
別の実験で、ＴｅｔＲを安定して発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株を、ｐｃＤＮＡ３．１＋ベクター中にサブクローニングされたＴｅｔＲ遺伝子を有するｐＪＶ４０（図１５参照）のトランスフェクションにより、作製した。ジェネテシン耐性のＣＨＯ−Ｋ１の集合を段階希釈して、単一の細胞のコロニーを入手し、高発現のＴｅｔＲ、すなわちＴｅｔの非存在下で２倍超のＬａｃＺの抑制を有するようにスクリーニングした（データ不図示）。３つのクローンを、図１６、図１７、および図１８にそれぞれ示されるように、さらなる解析のため選択し、これらは本明細書中でＣＨＯ−Ｋ１／ＴｅｔＲと呼ばれる。これらのクローンを、対照としてｐｃＤＮＡ５／ＴＯ／ＬａｃＺ、および本発明の発現ベクター、すなわち上述のベクターｐＪＶ５６、ｐＪＶ５７、ｐＪＶ５９およびｐＪＶ６０、で一時的にトランスフェクトし、自家作製したＴｅｔＲ発現細胞を使用して、ｍＣＭＶエンハンサー配列／ラットＥＦ−１αイントロンハイブリッドプロモーターに基づきＴｅｔ調節型プロモーターエレメントの有効性を決定した。

図１６、図１７、および図１８に示されるように、３つのＣＨＯ−Ｋ１／ＴｅｔＲクローンのうちの２つにおいてｐＪＶ５６は、テトラサイクリンの存在下（＋Ｔｅｔ）で、ｐｃＤＮＡ５／ＴＯ／ＬａｃＺと比較して２〜３倍高いＬａｃＺの発現を呈した。発現レベルは試験したクローンにより様々であったが、ｐＪＶ５７中のｈＣＭＶ−Ｐ／ＴｅｔＯ配列の付加は、（−Ｔｅｔ）と比較して、テトラサイクリンの存在下（＋Ｔｅｔ）でＬａｃＺ発現の３．２４倍、９．３０倍および３．１５倍増強の度合まで、テトラサイクリンによりタンパク質発現を調節できた（図１６、図１７、および図１８それぞれのｐＪＶ５７を参照）。これは、ｈＣＭＶ−Ｐ／ＴｅｔＯ配列を含まないｐＪＶ５６に対する比較である（図１６、図１７、および図１８にそれぞれ示されるように、＋Ｔｅｔでの処理と−Ｔｅｔでの処理の間で、１．２７倍、０．９５倍、１．１９倍の差）。

興味深いことに、タンパク質発現が転写開始部位の周りの配列を最適化することにより増大し得る（Ｐａｔｗａｒｄｈａｎ ｅｔ ａｌ参照）との本出願人らの仮説と一致して、図１６、図１７、および図１８に示されるように、テトラサイクリン感受性の発現の調節は本質的に存在しないことが予測された（±Ｔｅｔの比較：０．９９倍、１．０６倍、１．００倍の差）が、ＬａｃＺの総発現は３つすべてのｐＪＶ５９トランスフェクトＣＨＯ−Ｋ１／ＴｅｔＲクローンで増大した。しかしながら、最適化プロモーターとの関連で、ＴｅｔＲ結合を維持するよう変異されたＴｅｔＯ部位の付加（ｐＪＶ６０）は、ｐＪＶ５９と比較して減少したＬａｃＺ発現（図１６、図１７）、または変化しないＬａｃＺ発現（図１８）を示した。それにもかかわらず、ＬａｃＺ発現は、テトラサイクリンの存在下で、ｐＪＶ５７と比較して３つすべてのｐＪＶ６０を有するクローンで増加した（Ｔｅｔで処理していないその対照と比較して、２．３１倍、２．８２倍および１．５６倍高い発現：それぞれ図１６、図１７、図１８）。このことは、ＴｅｔＯ配列の変異が、Ｔｅｔの非存在下でのすべてのクローンでのより高い基底のＬａｃＺ発現および＋Ｔｅｔ付加による低い倍数誘導により観察されるように、ＴｅｔＲ結合に不利な影響を与えたことを示唆する。

まとめると、図１６、図１７、および図１８に示されるように、ＣＨＯ／ＴｅｔＲ細胞でｐＪＶ５６、ｐＪＶ５７、ｐＪＶ５９、およびｐＪＶ６０のコンストラクトのすべてが、テトラサイクリンの存在下でｐｃＤＮＡ５／ＴＯ／ＬａｃＺから発現するＣＨＯ細胞（すなわち陽性対照）と比較して増大したＬａｃＺ発現を示し、ｈＣＭＶ−Ｐ／ＴｅｔＯ配列を伴う本発明のハイブリッドプロモーターを有するＣＨＯ細胞は、（−Ｔｅｔ）と比較してテトラサイクリンによりアップレギュレートされたβガラクトシダーゼ発現を有した（１．５６〜９．３０倍の差）。トランスフェクションの方法はＴ−ＲＥｘ−ＣＨＯ細胞（接着）〜ＣＨＯ−Ｋ１／ＴｅｔＲ細胞（液体水系培地中の細胞懸濁液）の間で異なっており、トランスフェクションの効率は特異的βガラクトシダーゼ活性の総合レベルで観察される差異の原因である場合があることに、留意されたい。