DE10122140A1 - Rekombinante Fusionsproteine und deren Trimere - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Anmeldung betrifft rekombinante Fusionsproteine mit der Eigenschaft, Trimere bilden zu können, wobei die rekombinanten Fusionsproteine mindestens eine Komponente A und mindestens eine Komponente B aufweisen, wobei die Komponente B trimerisierende Eigenschaften und die Komponente A biologische Eigenschaften aufweisten,sowie Trimere dieser rekombinanten Fusionsproteine. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von derartigen Trimeren zur Herstellung eines Arzneimittels bzw. deren Verwendung zur In-vitro-Diagnose bzw. zur Herstellung eines In-vitro-Diagnosenmittels. Auch DNA-Sequenzen, die für ein derartiges Fusionsprotein kodieren, sowie Expressionsvektoren und Wirtszellen, die die DNA-Sequenz bzw. den Expressionsvektor enthalten, sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Fusionsproteine, mit der Eigenschaft, Trime­ re bilden zu können, wobei die rekombinanten Fusionsproteine mindestens eine Komponente A und mindestens eine Komponente B aufweisen, wobei die Komponente B einen trimerisie­ rende Eigenschaften und die Komponente A biologische Eigenschaften aufweist, sowie Tri­ mere dieser rekombinanten Fusionsproteinen. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von derartigen Trimeren zur Herstellung eines Arzneimittels bzw. deren Ver­ wendung zur In-vitro-Diagnose bzw. zur Herstellung eines in vitro Diagnosemittels. Auch DNA-Sequenzen, die für ein derartiges Fusionsprotein kodieren, sowie Expressionsvektoren und Wirtszellen, die die DNA-Sequenz bzw. den Expressionsvektor enthalten, sind Gegens­ tand der vorliegenden Erfindung.

Proteine, die physiologisch als Trimere auftreten, sind in der Natur in großer Zahl vorhanden. Aufgrund von Wechselwirkungen an den Oberflächen dieser in Lösung trimerisierenden Pro­ teine kann es zu spontanen oder aber auch zu bspw. kinetisch verzögerten, weil konzentrati­ ons- oder milieuabhängigen Zusammenlagerungen von Proteinen kommen. Hierfür sind hyd­ rophobe Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen, kovalente Bindungen, bspw. Disulfidbrücken, und/oder Coulomb-Kräfte verantwortlich.

Daneben aber sind bei gewissen Proteinen Strukturmotive anzutreffen, die zur Bildung von spezifischen strukturbedingten intermolekularen Supersekundärstrukturen und damit - neben anderen Multimerisierungszuständen - zu Proteintrimeren führen. Die Formation von Super­ sekundärstrukturen beruht auf charakteristischen Aminosäuresequenzen der diese Trimere bildenden Proteine. Als Supersekundärstrukturen wären beispielsweise sog. "Coiled-Coil- Tripelhelices" zu nennen, die eine Trimerisierung von Proteinen durch Interaktionen von cha­ rakteristischen α-Helices, die bei jedem der die Coiled-Coil-Form ausbildenden Proteine auf­ treten, bewirken. Die Coiled-Coil-Tripelhelix als intermolekulare "Trimerisierungsdomäne" von Proteinen stellt sich strukturell als dreisträngige, umeinander gewundene Superhelix dar. Derartige Coiled-Coil-Motive mit Tripelhelix-Charakter treten insbesondere bei extrazellulä­ ren Proteintrimeren auf, ganz besonders aber bei Proteinen bzw. Proteinkomplexen des Bin­ degewebes.

So etwa beschreiben Beck et al. (J. Mol. Biol. (1996) 256, 909-923) ein Bindegewebsprotein, das sog. Cartilage Matrix Protein (CMP), dessen Aggregation zu einem Homotrimer auf einer Tripelhelix, die das Resultat der Zusammenlagerung von drei komplementären Helices (je­ weils als Bestandteil eines Polypeptids) darstellt, mit Coiled-Coil-Muster beruht. Charakteris­ tisch für die Aminosäuresequenz einer solchen eine Tripelhelix bildenden Helix ist dabei das Heptadmuster (abcdefg)_n. Deren Aminosäuren in den Positionen a und d tragen gewöhnlich apolare Seitenketten und erlauben dadurch die Ausbildung der oben beschriebenen superheli­ kalen Struktur, hier als Tripelhelix aus drei Helices.

Weiterhin treten auch bei Proteinen aus der Kollagenfamilie spezifische strukturbedingte Multimerisierungsphänomene durch die Ausbildung von Supersekundärstrukturen auf. Dabei ist die Struktur von Kollagenfasern durch das Tropokollagen gekennzeichnet, das aus drei helikalen verdrillten Polypeptiden besteht. Auch die Protofibrille eines Haares ist aus einer Tripelhelix aus α-Keratin mit dem Motiv "Coiled-Coil", allerdings linksgängig, aufgebaut.

Darüber hinaus sind aufgrund ihrer Sequenzhomologien in ihren jeweiligen multimerisieren­ den Sequenzabschnitten die Proteine C1q, Kollagen α1 (X), α2 (VII), das Überwinterungs­ protein, ACRP30, das innere Ohrstrukturprotein, das Cerebellin und das Multimerin als Prote­ infamilie unter der Bezeichnung C1q-Familie zusammengefaßt worden (Kischore und Reid, Immunopharmacol., 42 (1999) 15-21), die strukturbedingt als höhere Aggregate von bspw. Trimeren vorliegen. Unter den in dieser Familie auftretenden Proteinen mit Multimerisierung­ seigenschaften ist bspw. die Struktur des aus dem Komplementsystem bekannten Proteins C1q durch Monomere charakterisiert, die jeweils eine globuläre sog. "Kopf"-Domänen und einen "kollagenähnlichen" helikalen Sequenzabschnitt aufweisen. Über diesen helikalen Se­ quenzabschnitt, der eine Coiled-Coil-Tripelhelix bildet, trimerisieren die Monomere. Sechs dieser C1q-Trimere formen wiederum ein Oligomer, wobei wiederum die Oligomerisierung der Proteintrimere auf Interaktionen zwischen den einzelnen Coiled-Coil-Tripelhelices beruht. Im Ergebnis führt diese strukturelle Anordnung beim Protein bzw. multi-(oligo-)merisierten Proteinkomplex C1q zu einem als "Bouquet" bezeichneten Aufbau, wobei sichergestellt wird, daß 18 globuläre, C-terminal angeordnete "Kopf"-Domänen zu einem Hexamer von Trimeren verbunden werden.

Eine ähnliche Struktur wie beim Protein C1q ist auch beim Protein ACRP30, gleichfalls ein Protein aus der C1q-Familie, anzutreffen (Hu et al., J. Biol. Chem., Vol. 271, Nr. 18, 10697- 10703, 1996). Bei diesem von Adipozyten sekretierten Serumprotein handelt es sich mit ü­ berwiegender Wahrscheinlichkeit um Quattromere von Trimeren, wobei, wie auch beim C1q- Protein, globuläre C-terminale Domänen über kollagenähnliche Tripelhelices verbunden wer­ den. Mutmaßlich vier dieser Tripelhelices formen schließlich wiederum ein Oligomer durch entsprechende Interaktionen. In der Veröffentlichung von Shapiro und Scherer (Current Bio­ logy 1998, 8: 335-338) findet sich die mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse ermittelte Struktur eines Homotrimers von ACRP30 dargestellt.

Weiterhin sind aus der Literatur Proteine aus der Klasse der Collectine bekannt, die durch eine kollagenartige Domäne, eine Halsregion und darüber hinaus durch eine globuläre carbo­ xyterminale Lectinbindungsdomäne charakterisiert sind. Auch die Collectine treten physiolo­ gisch als Oligomere von Trimeren auf. So trimerisieren beispielsweise die Proteine Lung Sur­ factant Protein A (SP-A) und das Mannose-Bindungsprotein (MBP), jeweils aus der Familie der Collectine, durch die Interaktionen ihrer "kollagenähnlichen" Domäne und liegen schließ­ lich als Hexamere von Trimeren vor (Epstein et al., Current Opinion in Immunology, Vol. 8, Nr. 1, 1996, 29-35). Demgemäß bilden also auch die unter der Bezeichnung Collectine be­ kannten Proteine Oligomere (bspw. Hexamere) von Multimeren (bspw. Trimere) aus.

Aus der Literatur ist zudem zu entnehmen, daß zahlreiche physiologisch als Signalmoleküle wirkende Proteine ein biologisches Signal nur in bestimmten Zuständen transduzieren kön­ nen. So ist beispielsweise membranständig angeordnetes FasL biologisch, d. h. apoptotisch, wirksam, während nach Abspaltung des extrazellulären Proteinabschnitts von dem membran­ ständigen Abschnitt (sog. sFasL) diese nicht-membrangebundene sFasL-Fraktion physiolo­ gisch keine apoptotische Wirkung auf Zielzellen mehr hervorrufen kann. In der Veröffentli­ chung von Schneider et al. (J. Exp. Med., Vol. 187, Nr. 8, 1998, 1205-1213) wurde beschrie­ ben, daß die biologische Wirkung von sFasL-Trimeren, die - wie zuvor erläutert - nach Abspaltung vom membranständigen Proteinabschnitt erhalten werden, gleichwohl durch den Einsatz von vernetzenden Antikörpern in Hinblick auf deren physiologische Funktion reakti­ viert werden kann. Hierzu wurde ein Fusionsprotein, bestehend aus der Trimerisierungsdo­ mäne von FasL, einer kurzen Linkersequenz und einer Flag-Markierung (mit der Flag- Aminosäuresequenz (Ein-Buchstaben-Code) DYKDDDDK) konstruiert, exprimiert, und der­ artige nicht-strukturbedingt (also nicht über spezifische Sekundärstruktur-Interaktionen mit dem Ergebnis der Bildung einer Supersekundärstruktur) trimerisierte Fusionsproteine durch gegen die Flag-Markierung gerichtete Antikörper vernetzt.

In der nicht veröffentlichten deutschen Patentanmeldung DE 199 63 859 werden Bi- oder Oli­ gomere von Di-, Tri-, Quattro- oder Pentameren, also Aggregate höherer Ordnung, offenbart, die aus rekombinanten Fusionsproteinen aufgebaut sind, die zwei Komponenten A und B um­ fassen. Um bspw. die biologische (apoptotische) Wirksamkeit von TNF-Cytokinen zu erhö­ hen, können gemäß der DE 199 63 859 die rekombinanten Fusionsproteine als Komponente A bspw. ein TNF-Cytokin aufweisen und als Komponente B einen Proteinabschnitt, der die re­ kombinanten Fusionsproteine zu Aggregate höherer Ordnung verbindet.

Wenn auch bei vielen medizinischen Indikationen derartige Komplexe mit hoher apoptoti­ scher Wirkung erwünscht sind, ist es gleichwohl zur Behandlung zahlreicher Erkrankungen erforderlichen, Substanzen zur Verfügung zu stellen, die die Auslösung apoptotischer Ereig­ nisse zuverlässig blockieren. Aus der Veröffentlichung von Suda et al. (J. Exp. Med. 1997, 186, S. 2045-2050) ist bekannt, daß lösliche FasL-Trimere die Apoptose, die durch ein oli­ gomerisierte Moleküle induziert wird, unter gewissen Umständen blockieren können. Sub­ stanzen auf bspw. Proteinbasis, die zuverlässig am Rezeptor selbst die Auslösung bspw. apop­ totischer Ereignisse blockieren können, nicht-nativer Natur sind und daher besser gegen eine physiologische Degradation in vivo geschützt sind, sind im Stand der Technik jedoch nicht bekannt.

Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, solche Substanzen zur Verfügung zu stellen, die als Biomoleküle eine biologisch blockierende Funktion am Rezeptor selbst entfal­ ten können, so daß bspw. die Auslösung der apoptotischen Signaltransduktionskette unter­ drückt wird.

Die vorliegende Aufgabe wird durch den Gegenstand des Anspruchs 1, nämlich durch Trime­ re rekombinanter Fusionsproteine, die mindestens eine Komponente A und mindestens eine Komponente B aufweisen, wobei die Komponente A ein Protein oder einen Proteinabschnitt mit biologischer Funktion, insbesondere mit Bindungsfunktion, umfaßt und die Komponente B ein Protein oder einen Proteinabschnitt umfaßt, das/der die rekombinanten Fusionsproteine ohne Wirkung von Drittmolekülen trimerisiert, d. h. ein Trimer von biologisch wirksamen Komponenten A erzeugt. Erfindungsgemäß werden also Trimere zur Verfügung gestellt, die keine Aggregate höherer Ordnung, bspw. Dimere von Trimeren, bilden können, sondern vielmehr in Lösung im wesentlichen, mindestens zu 90%, vorzugsweise zu mindestens 95% und ganz besonders bevorzugt zu mindestens 99%, jeweils bezogen auf die Gesamtzahl der Trimere, als trimerisierte rekombinante Fusionsproteine vorliegen.

Unter einem Protein oder Proteinabschnitt mit biologischer Funktion (Komponente A im Fu­ sionsprotein) sind insbesondere Proteine, die eine Ligandenfunktion, ganz besonders für An­ tikörper oder Rezeptoren, haben (also als Bindungspartner mit einem oder mehr Molekül(en) in Wechselwirkung treten können), modifizierte Aminosäuresequenzen, z. B. Aminosäurese­ quenzen mit kovalent oder nicht-kovalent angekoppelten Wirkstoffen (ggf. organisch- chemischer Natur), Antikörper oder Abschnitte von Antikörpern mit Paratopen oder auch Hormone, bspw. Peptidhormone, zu verstehen. Hierbei beruht die vorliegende Erfindung auf der Erkenntnis, daß insbesondere Signalproteine, die oder deren Abschnitte oder Derivate erfindungsgemäß als Komponente A eingesetzt werden, biologisch erst als Aggregate höherer Ordnung aktiv sind, dagegen als Trimere in vitro und in vivo an Rezeptoren binden, diese aber nicht aktivieren, sondern vielmehr kompetitiv die Bindungsstellen besetzen und kein biologisch aktivierendes Signal auslösen können, sondern ausschließlich blockieren.

Bei physiologisch membranständigen Signalproteinen, bspw. bei TNF-Cytokinen, werden als Komponente A eines trimerisierenden rekombinante Signalproteins Spaltprodukte, die die extramembranösen, insbesondere die extrazellulären Proteinabschnitte, umfassen, bevorzugt. Aber auch Aminosäuresequenzen, die als Antigene wirken können, können als Komponente A im rekombinanten Fusionsprotein eingesetzt werden. Schließlich können als Komponente A auch Rezeptoren, z. B. Rezeptoren aus der TNF-Rezeptorfamilie (bspw. FasR), oder Ab­ schnitte bzw. Derivate solcher Rezeptoren zum Einsatz kommen, die gleichfalls Bindungs­ funktion haben (damit also als Bindungspartner mit einem anderen Molekül, bspw. membran­ ständigem FasL, in Wechselwirkung treten) und i. S. der vorliegenden Erfindung daher auch unter den Begriff "Ligand" fallen. Derartige bindungsfähige Fragmente von biologischen Re­ zeptoren eignen sich insbesondere zur Verwendung als Arzneimittel, wenn der komplementä­ re biologische Ligand beim Patienten in unphysiologisch hohen Konzentrationen vorliegt.

In einer bevorzugten Ausführungsform können die Komponenten A die in erfindungsgemä­ ßen Trimeren vorliegen, identische Komponenten A (Homotrimere) oder unterschiedliche Komponenten A (Heterotrimere) aufweisen, d. h. es können verschiedene rekombinante Fusi­ onsproteine ein erfindungsgemäßes Trimer bilden. Auf diese Weise können Proteine mit ver­ schiedenen Komponenten A, ggf. mit unterschiedlicher biologischer Funktion, im erfindungs­ gemäßen Trimer verbunden sein. Hierbei können die Komponenten A von zwei rekombinan­ ten Proteinen identisch sein und das dritte Fusionsprotein hinsichtlich seiner Komponente A abweichen oder auch alle drei Fusionsproteine sich in Hinblick auf die Komponente A unter­ scheiden. Auf diese Weise werden durch die Wahl, die Anordnung, die spezifische Kombina­ tion und/oder durch die Anzahl der Komponenten A im Trimer typischerweise fein modulier­ te inhibitorische, ggf. in Kombination mit aktivierenden, Wirkungen erzielt werden können.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Komponente A im rekombinanten Fusionsprotein um ein Peptidhormon, einen Wachstumsfaktor, ein Cytokin, ein Interleukin oder einen Abschnitt derselben, vorzugsweise um einen bindungsfähigen Ab­ schnitt. Aber auch funktionelle Derivate der vorgenannten Peptide, Proteinabschnitte und/oder Proteine können als Komponente A im rekombinanten Fusionsprotein, das Bestand­ teil eines erfindungsgemäßen Trimers ist, zum Einsatz kommen.

Als funktionelle Derivate von biologisch aktiven Proteinen, Proteinabschnitten oder Peptiden werden insbesondere solche Proteine bezeichnet, die die biologische Funktion, insbesondere die Bindungseigenschaft an den Interaktionspartner, bspw. den membranständigen Rezeptor, aufrechterhalten, gleichwohl aber Sequenzunterschiede zu den entsprechenden nativen Se­ quenzen aufweisen. Bei diesen Sequenzabweichungen kann es sich um eine oder mehr Inser­ tion(en), Deletion(en) und/oder Substitution(en) handeln, wobei eine Sequenzhomologie von mindestens 70% bevorzugt und eine Sequenzhomologie von mindestens 85% zwischen dem eingesetzten Derivat und der nativen Sequenz stärker und mindestens 90% ganz besonders bevorzugt ist. Insbesondere fallen unter den Begriff der funktionellen Derivate solche Amino­ säuresequenzen, die gegenüber den physiologischen Sequenzen konservative Substitution aufweisen. Als konservative Substitutionen werden solche Substitutionen bezeichnet, bei denen Aminosäuren gegeneinander ausgetauscht werden, die aus der gleichen Klasse stammen. Insbesondere gibt es Aminosäuren mit aliphatischen Seitenketten, positiv oder negativ gela­ denen Seitenketten, aromatischen Gruppen in der Seitenketten oder Aminosäuren, deren Sei­ tenketten Wasserstoffbrücken eingehen können, bspw. Seitenketten, die eine Hydroxyfunkti­ on besitzen. Das bedeutet, daß bspw. eine Aminosäure mit einer polaren Seitenkette durch eine andere Aminosäure mit einer gleichfalls polaren Seitenkette ersetzt wird oder beispiels­ weise eine durch eine hydrophobe Seitenkette gekennzeichnete Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit gleichfalls hydrophober Seitenkette substituiert wird (z. B. Serin (Threonin) durch Threonin (Serin) bzw. Leucin (Isoleucin) durch Isoleucin (Leucin)). Insertionen und Substitutionen sind insbesondere an solchen Sequenzpositionen möglich, die keine Verände­ rung der dreidimensionalen Struktur hervorrufen oder den Bindungsbereich betreffen. Eine Veränderung einer dreidimensionalen Struktur durch Insertion(en) oder Deletion(en) ist bspw. mit Hilfe von CD-Spektren (Zirkulardichroismus-Spektren) leicht überprüfbar (Urry, 1985, Absorption, circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modern Physical Methods in Biochemistry, Neuberger et al. (Hrgb.), Elsevier, Amsterdam). Geeignete Verfahren zur Her­ stellung von Proteinen mit Aminosäuresequenzen, die gegenüber der (den) nativen Sequenzen Substitutionen aufweisen, werden bspw. in den Druckschriften US 4,737,462, US 4,588,585, US 4,959,314, US 5,116,943, US 4,879,111 und US 5,017,691 offenbart. Die Herstellung von Derivaten ist insbesondere auch bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben, wobei Codons weggelassen, er­ gänzt oder ausgetauscht werden können. Derivate können insbesondere auch solche Proteine sein, die stabilisiert sind, um der physiologischen Degradation zu entgehen, bspw. durch Sta­ bilisierung des Proteinrückgrats durch Substitution der amidartigen Bindung, bspw. auch durch den Einsatz von β-Aminosäuren.

Unter einem Liganden werden i. S. der vorliegenden Erfindung alle an Bindungsreaktionen beteiligten Moleküle verstanden. Bei einem Liganden kann es sich demnach auch um ein normalerweise als Rezeptor bezeichnetes Protein handeln. Auch ein solcher Rezeptor kann "Ligand" i. S. dieser Erfindung sein, bspw. wenn er an seinen Interaktionspartner, z. B. ein Signalmolekül, bindet.

Besonders bevorzugt ist ein Trimer von rekombinanten Fusionsproteinen dann, wenn die Komponente A im rekombinanten Fusionsprotein ein Cytokin aus der Familie TNF-Cytokine, ein Abschnitt eines solchen TNF-Cytokins oder ein funktionelles Derivat eines TNF-Cytokins oder eines entsprechenden TNF-Cytokin-Abschnitts ist. Dabei kann die biologische Wirkung der eingesetzten TNF-Cytokine bei den Zielzellen durch Bindung an die entsprechenden Re­ zeptoren in vivo (z. B. bei der Bindung in Form eines Aggregats höherer Ordnung) bspw. a­ poptotische, proliferative oder aktivierende Wirkungen hervorrufen, typischerweise als Tri­ mer dann aber nur noch die Bindung an den jeweiligen Rezeptor sicherstellen, jedoch nicht mehr die aktivierende Funktion ausüben. In einer nicht abschließenden Aufzählung kommen als TNF-Cytokine und damit als Komponente A im Fusionsprotein insbesondere die Proteine OX40L, RANKL, TWEAK, Lta, Ltab2, LIGHT, CD27L, 41-BB, GITRL, APRIL, VEGI und BAFF bzw. deren Abschnitte oder Derivate in Betracht. Ganz besonders bevorzugt sind die Proteine CD40L, FasL, TRAIL, TNF (insbesondere TNF, das an den Rezeptor TNF-R2 bin­ det), CD30L und EDA bzw. deren Abschnitte oder Derivate. Als Komponente A im rekombi­ nanten Fusionsprotein werden dabei bevorzugt extrazelluläre Abschnitte der vorgenannten membranständigen TNF-Cytokine oder deren funktionelle Derivate verwendet. Ganz beson­ ders bevorzugt sind diese Spaltprodukte dann, wenn insbesondere deren Bindungsdungsver­ mögen an den jeweiligen Rezeptor erhalten bleibt. Auch funktionelle Derivate, im oben genannten Sinn, der vorgenannten TNF-Cytokine oder Abschnitte der TNF-Cytokine können als Komponente A des Fusionsproteins zum Einsatz kommen. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Komponente A des rekombinanten Fusionsproteins, das Bestandteil des erfindungsgemäßen Trimers ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus hFasL (AA 139-281), hTRAIL (AA 95-281), hCD40L (AA 116-261) und m oder hTNFα (AA 77-235).

Erfindungsgemäß ergeben sich demnach folgende Möglichkeiten: Die für ein rekombinantes Fusionsprotein, das Bestandteil eines erfindungsgemäßen Oligomers werden soll, ausgewählte Komponente A liegt bereits als solche in Lösung als Trimer. Die Komponente B wird in ei­ nem solchen Fall die Trimerisierung der Komponenten A nur noch verstärken. Diese Situati­ on findet sich bspw. dann, wenn die Komponente A, bspw. ein TNF-Ligand bzw. ein Ab­ schnitt oder Derivat desselben, die bereits in Lösung typischerweise trimerisiert ist, durch die Komponente B in seiner trimeren Gestalt weiter stabilisiert werden soll. Für den Fall jedoch, daß die Komponente A eines rekombinanten Fusionsproteins als solche in Lösung bzw. in vivo keine durch Oberflächen-Wechselwirkung vermittelte Trimerstruktur zeigt, wird die Komponente B erfindungsgemäß eine Trimerisierung der Komponente A der rekombinanten Fusionsproteine sicherstellen müssen. Letzteres tritt bspw. typischerweise dann ein, wenn als Komponente A des rekombinanten Fusionsproteins nur Abschnitte des nativen Proteins verwendet werden, die als solche nicht trimerisieren können oder zumindest in vivo nicht als Trimer vorliegen, weil bspw. das Gleichgewicht stark auf die Seite des Monomers verschoben ist, also bspw. Abschnitte von Cytokinen, insbesondere C-terminale Abschnitte (bspw. umfas­ send mindestens 100 AS (jeweils gerechnet vom C-Terminus), vorzugsweise mindestens 120 AS und insbesondere bevorzugt mindestens 150 AS vom C-Terminus) von FasL, CD40L, CD30L, TRAIL, EDA oder TNF.

Bei der Komponente A des rekombinanten Fusionsproteins kann es sich aber in einer bevor­ zugten Ausführungsform auch um eine Aminosäuresequenz nach Maßgabe der vorliegenden Erfindung handeln, die dazu geeignet ist, als Träger für einen Rezeptoragonisten oder Rezep­ torantagonisten zu fungieren. So etwa kann ein als pharmakologischer Wirkstoff aktives, kleines organisch-chemisches Molekül typischerweise kovalent an eine derartige Aminosäu­ resequenz angekoppelt werden, beispielsweise über eine Etherbindung an Threonin oder Se­ rin, eine amidartige Bindung oder über eine Esterbindung. Derartige angekoppelte Agonisten oder Antagonisten können die Bindungskonstante eines erfindungsgemäßen Trimers erhöhen, vorzugsweise auf Werte von mindestens 10^-9 M^-1, oder die biologische Wirkung modulieren, insbesondere das inhibitorische Verhalten eines erfindungsgemäßen Trimers, insbesondere in Hinblick auf die Inhibition der Auslösung der apoptotischen Signalkaskade, verstärken. Dar­ über hinaus kann ein erfindungsgemäßer Trimer als Träger pharmakologisch wirksamer Sub­ stanzen eingesetzt werden. Auf diese Weise kann ein pharmakologischer Wirkstoff durch die Wahl eines entsprechenden erfindungsgemäßen Trägertrimers selektiv in räumliche Nachbar­ schaft bestimmter Zellen, die den pharmakologischen Angriffsort dieser Wirkstoffe darstellen gebracht werden. In Betracht kommt bspw. die Kopplung eines derartigen Wirkstoffes an ein FasL-Trimer, wobei die Bindung des FasL-Trimers den FasR blockiert (und damit erfin­ dungsgemäß die Apoptose inhibiert, der Zelle damit das Überleben sichert), während der Wirkstoff unmittelbar auf die Zielzelle aufgebracht wird. Eine Verwendung eines diesbezüg­ lichen Systems könnte sich bspw. ergeben, wenn als Wirkstoff cytotoxische Substanzen mit dem Trimer verknüpft werden, die einen Angriff von Immunzellen gegen die Zielzellen ver­ hindern, bspw. bei degenerativen, insbesondere neurodegenerativen Erkrankungen, vor allem Morbus Parkinson oder Morbus Alzheimer. Im Falle von Morbus Parkinson kann auf diese erfindungsgemäße Weise der Untergang der Dopamin erzeugenden Zellen in der Substantia Nigra verhindert werden. Allgemein wird daher der Einsatz derartiger Systeme von erfin­ dungsgemäßem Träger und ggf. kovalent angekoppelter Wirkstoffkomponente als Arzneimit­ tel in der Human- oder Veterinärmedizin offenbart.

Bei der Komponente B des rekombinanten Fusionsproteins wird es sich typischerweise um ein Protein aus der Familie der C1q-Proteine oder der Collectine handeln. Besonders bevor­ zugt sind die Proteine der C1q- oder der Collectinfamilie als Bestandteil des rekombinanten Fusionsproteins, nämlich als Komponente B, dann, wenn nur deren Trimerisierungsdomäne, nicht aber deren Oligomerisierungsdomäne als Bestandteil des rekombinanten Fusionsprotein transkribiert bzw. translatiert wird. Vorzugsweise wird die Komponente B im rekombinanten Fusionsprotein auch die für die vorgenannten Proteine im nativen Zustand charakteristische globuläre "Kopf"-Domäne nicht enthalten. Die vorgenannte Komponente B in einem erfin­ dungsgemäßen rekombinanten Fusionsprotein wird also eine Sequenz aufweisen, die typi­ scherweise nur den bspw. kollagenartigen Abschnitt enthält, der die Funktionalität zur Trime­ risierung durch Ausbildung einer Tripelhelix aufweist, nicht aber jene Sequenzabschnitte, die darüber hinaus die Fähigkeit besitzen, mit anderen Tripelhelices eine Bi- oder Oligomerstruk­ tur (bspw. ein Tetra- oder Hexamer von bspw. Tripelhelices) einzugehen.

Typischerweise wird daher das trimerisierende Fusionsprotein nur die für die Trimeriserung verantwortlichen Domänen der Proteine aus den Familien der C1q-Proteine oder Collectine als Komponente B aufweisen, während deren jeweilige "Kopf"-Domänen durch andere, gleichfalls eine biologische Funktion wahrnehmende Proteine oder Proteinabschnitte als Komponente A ersetzt werden. Der Begriff "rekombinantes Fusionsprotein" ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung also so zu verstehen, daß die mindestens eine Komponente A und die mindestens eine Komponente B im rekombinanten Fusionsprotein artifiziell fusioniert sind, d. h., daß ein Fusionsprotein i. S. der vorliegenden Erfindung keinem natürlich auftreten­ den Protein entspricht.

Auch funktionelle, d. h. trimerisierende, Derivate von Proteinen aus der C1q-Protein-Familie oder der Familie der Collectine bzw. funktionelle Derivate von Abschnitten der vorgenannten Proteine können als Komponente B für die Aggregation von rekombinanten Fusionsproteinen zu Trimeren zum Einsatz kommen. Dabei wird beispielsweise die Komponente B die entspre­ chenden Sequenzabschnitte der Proteine C1q, MBP, SP-A ("lung surfactant protein A"), SP-D ("lung surfactant protein D"), BC (Bovines Serumconglutinin), CL43 (Bovines Collectin-43) und/oder ACRP30 oder auch von funktionellen Derivaten dieser Proteinabschnitte enthalten.

Besonders bevorzugt sind Trimere von rekombinanten Fusionsproteinen dann, wenn die Komponente B des rekombinanten Fusionsproteins einen Proteinabschnitt des Proteins C1q oder des Proteins ACRP30 mit einem Sequenzabschnitt von mindestens 8 AS Länge, typi­ scherweise mindestens 20 AS Länge aus den kollagenartigen Sequenzbereichen, die eine Tri­ pelhelix bilden, oder ein funktionelles Derivat derselben aufweist. Als ganz besonders bevor­ zugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellen sich Trimere von rekombinanten Fusionsproteinen dar, deren Komponente B eine Aminosäuresequenz gemäß Fig. 1 (einge­ rahmte Sequenz, AS 45 bis 111) oder ein funktionelles Derivat dieser murinen (m: murin) Aminosäuresequenz (bspw. die analoge humane Sequenz oder die analoge Sequenz eines an­ deren Säugetiers) bzw. einen Abschnitt dieser Sequenz enthält.

Insbesondere bevorzugt sind Trimere solcher Fusionsproteine, die Sequenzen aus verschiede­ nen Wirtsorganismen aufweisen. Ganz besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße Aggrega­ te dann, wenn sie aus chimären Fusionsproteinen stammen, wobei die Komponente A aus einer anderen Tierart stammt als die Komponente B. Derart kann es vorteilhaft sein, daß die Komponente A einer Aminosäuresequenz aus der Maus, Ratte, Schwein oder einem anderen Vertebraten, insbesondere aus einem Säuger, oder einem funktionellen Derivat derselben ent­ spricht und die Komponente B humanen Ursprungs ist oder umgekehrt. Andererseits bevor­ zugt können die Sequenzen der Komponente A und der Komponente B in einem erfindungs­ gemäßen Fusionsprotein, das ein erfindungsgemäßes Trimer bildet, aber auch aus der glei­ chen Tierart stammen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Tri­ merisierung der rekombinanten Fusionsproteine durch eine kurze Aminosäuresequenz von mehr als 6 Aminosäuren, vorzugsweise von 8 bis 30, ganz besonders bevorzugt von 8 bis 20 Aminosäuren, die in den rekombinanten Fusionsproteinen als Komponente B vorhanden ist. Die durch diese kurzen Aminosäuresequenzen erreichte Trimerisierung von Fusionsproteinen, beruht typischerweise auf der Ausbildung von Supersekundärstrukturen, insbesondere auf der Ausbildung von "coiled-coil"-Tripelhelices. Hierzu sind bspw. alle Sequenzabschnitte von Proteinen geeignet, die durch Ausbildung von Supersekundärstrukturen Trimere generieren, z. B. typische Kollagen-artige Tripelhelices bzw. Abschnitte derselben (wie sie z. B. bei den Proteinen CMP, COMP, Kollagen oder Laminin).

Da die zur Trimerisierung führende Komponente B des rekombinanten Fusionsproteins erfin­ dungsgemäß im wesentlichen keine höheren Aggregate bilden sollte, sollte die Komponente B typischerweise keinen Cysteinrest aufweisen, der eine intermolekulare Disulfidbrücke ausbil­ den kann. Vorzugsweise wird die Komponente B in einem rekombinanten Fusionsprotein daher keinen Cysteinrest oder nur solche Cysteinreste, die eine intramolekulare Disulfidbrü­ cke, also im rekombinanten Fusionsprotein selbst, besitzen, um zu vermeiden, daß unter oxi­ dierenden Bedingungen eine kovalente Verknüpfung mit dem mindestens einen Cysteinrest eines Fusionsproteins eines anderen Trimers auftreten kann.

Das Fusionsprotein kann neben den Komponenten A und B zusätzliche Sequenzabschnitte aufweisen. Bevorzugt sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung in diesem Zusammenhang sog. Tag-Sequenzen, beispielsweise mindestens ein Flag-Tag, also die Aminosäurenfolge DYKDDDDK, und/oder aber auch beispielsweise mindestens ein His-Tag (enthaltend mehre­ re konsekutive Histidine, bspw. mindestens 5) und/oder weitere Tag- oder antigenische Se­ quenzen. Darüber hinaus können die einzelnen Abschnitte (Komponenten A, B oder Tagse­ quenzen, wobei auch zwei oder mehr Komponenten A im erfindungsgemäßen Fusionsprotein auftreten können) eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins durch Linkersequenzen vonein­ ander getrennt sein. Diese Linkersequenzen (mindestens 2 AS, vorzugsweise mindestens 5 AS) dienen zur strukturellen Abtrennung der verschiedenen funktionellen Komponenten im rekombinanten Fusionsprotein und können bevorzugt auch eine "Scharnier"-Funktion über­ nehmen, d. h. eine Aminosäuresequenz flexibler Struktur darstellen. Ganz besonders bevozugt sind solche Linker, die mindestens eine proteolytische Schnittstelle enthalten, die es erlaubt, die Komponenten A von den Komponenten B abzutrennen. Bei der proteolytischen Schnitt­ stelle im Linker handelt es sich vorzugsweise um eine Thrombin-Konsensussequenz.

Die Komponente A kann grundsätzlich C- oder N-terminal von der Komponente B angeord­ net sein, vorzugsweise C-terminal. Die Tag-Sequenzen können an jeder Position eins erfin­ dungsgemäßen rekombinanten Fusionsprotein auftreten, vorzugsweise am N-Terminus.

Als weiterer Erfindungsgegenstand der vorliegenden Erfindung werden auch Verfahren of­ fenbart, die zur Blockierung von zellulären extramembranösen Rezeptoren dienen. Derartige Verfahren zeichnen sich durch Rekombination mindestens einer Komponente A, die einem Protein oder Proteinabschnitt mit biologischer Funktion entspricht, mit mindestens einer tri­ merisierenden Komponente B aus, wobei zunächst (a) ein derartiges rekombinantes Fusionsprotein, bspw. in einem Expressionsvektor, exprimiert wird, (b) isoliert wird und dann (c) für in vitro Untersuchungen einer Zellkultur, bspw. einer Zellsuspension, zugegeben wird. Damit ist das vorliegende Verfahren geeignet, für in vitro Untersuchungen, Zellen bspw. vor dem apoptotischen Zelltod zu bewahren. Derartige Zellen mit verfahrensgemäß gebundenen erfin­ dungsgemäßen Trimeren können dann für weitere in vitro Untersuchungen eingesetzt werden oder auch zur Herstellung eines Arzneimittels dienen. Im Falle einer hohen Bindungskonstan­ te können derartige in vitro behandelte Zellen retransplantiert werden. Bspw. kommt eine derartige Vorgehensweise bei Autoimmunerkrankungen oder degenerativen Erkrankungen in Betracht, um die Zellen vor einem apoptotischen Untergang in vivo zu bewahren.

Ganz besonders bevorzugt ist ein Verfahren obiger Art dann, wenn die Komponente A ein TNF-Cytokin, ein Abschnitt eines TNF-Cytokins oder ein funktionelles Derivat eines solchen Proteins oder Proteinabschnitts ist.

Trimere der vorliegenden Erfindung kommen zur Herstellung eines Arzneimittels bzw. zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen zum medizinischen, d. h. sowohl zum human- als auch zum veterinärmedizinischen Einsatz, in Betracht, insbesondere wenn die Komponen­ te A ein Signalprotein oder ein Abschnitt eines solchen oder ein Derivat des Proteins oder Abschnitts ist. Ein weites Spektrum von Erkrankungen oder Störungen kann mit den erfin­ dungsgemäß beanspruchten Trimeren (Hetero- oder Homotrimere) behandelt werden. Ihre Verwendung ist insbesondere dann gegeben, wenn erhöhte extrazelluläre Konzentrationen der entsprechenden physiologischen Liganden oder eine Erhöhung der Zahl der membranständi­ gen Rezeptoren bei einem Krankheitsbild auftreten/auftritt. Hierbei kann es sich auch um er­ höhte Konzentrationen von membranständigen Signalmolekülen, bspw. TNF-Cytokinen (bspw. FasL), auf den Zellen selbst oder von löslichen Signalmolekülen, bspw. nach Protea­ sespaltung löslichem TNF-Cytokin, handeln. In einer keinesfalls abschließenden Aufzählung können derartige erfindungsgemäße Trimere bspw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von hyperinflammatorischen Störungen, Autoimmunerkrankungen, Erkrankun­ gen, die auf hyperapoptotischen Reaktionen beruhen, oder degenerativen, insbesondere neu­ rodegenerativen Erkrankungen (bspw. Morbus Parkinson), ggf. auch viralen Infektionen ein­ gesetzt werden. Erfindungsgemäße Trimere sind dann ganz besonders geeignet, wenn die Er­ krankung eine Behandlung erforderlich macht, die die biologische Wirkung von nativen Cy­ tokinen verhindern möchte, also zur Blockade entsprechender Cytokin-Rezeptoren dient. Als Beispiele wäre zu nennen: Behandlung von viraler Hepatits (HBV, HCV), Alkohol-induzierte Hepatitis-Erkrankungen, cholestatische Hepatitis, Morbus Wilson, Hepatitis wegen Störung des Autoimmunsystems, von Abstoßungsreaktionen nach Lebertransplantation, GvHD, TEN (toxische epidermale Nekrolyse), Hashimoto Thyroiditis oder Multiple Sklerose.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind DNA-Sequenzen, die für Fusions­ proteine der vorgenannten Art kodieren. Derartige DNA-Sequenzen werden in Expressions­ vektoren exprimiert, wobei auch die entsprechenden Expressionsvektoren, die eine DNA- Sequenz für die erfindungsgemäßen Fusionsproteine enthalten, Gegenstand der Erfindung sind. Weiterhin gehören zur vorliegenden Erfindung solche Wirtszellen, die mit DNA- Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Fusionsproteine kodieren, transfiziert sind. Ganz besonders bevorzugt sind in diesem Zusammenhang Wirtszellen, die mit Expressionsvektoren transfiziert sind, wobei die Expressionsvektoren wiederum DNA-Sequenzen enthalten, die für die erfindungsgemäßen Fusionsproteine kodieren. Alle vorgenannten Gegenstände nach die­ ser Erfindung kommen als Arzneimittel bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels, insbesonde­ re zur Behandlung von Erkrankungen, die in der vorliegenden Patentanmeldung offenbart sind, ggf. als Bestandteil einer Zusammensetzung in Betracht.

Die erfindungsgemäßen Trimere bzw. die weiteren Gegenstände der vorliegenden Erfindung werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt so zur Herstellung eines Arznei­ mittels bzw. zur Behandlung der vorgenannten Erkrankungen oder Störungen verwendet, daß sie zur parenteralen, d. h. beispielsweise subkutanen, intramuskulären, intraarteriellen oder intravenösen, oder oralen oder intranasalen oder analen, intraperitonealem, vaginalen oder bukkalen, intrazerebralen, intraokularen Verabreichung (Injektion oder Infusion), ggf. auch zur topischen Applikation, geeignet sind.

Die erfindungsgemäßen Trimere bzw. Wirtszellen, die erfindungsgemäße Trimere bilden, oder die DNA-Sequenzen, die für rekombinante Fusionsproteine codieren, die Trimere bilden können, oder entsprechende Expressionsvektoren können jeweils als solche als Arzneimittel dienen bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels herangezogen werden. Sie können aber auch in Kombination mit anderen aktiven Wirkstoffkomponenten bzw. pharmazeutischen Hilfs-, Träger- oder Zusatzstoffen als Arzneimittel zum Einsatz kommen. Die erfindungsgemäßen Trimere oder die weiteren Erfindungsgegenstände können damit als Bestandteile in Kombina­ tion mit pharmazeutisch akzeptablen Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffen kombiniert wer­ den. Offenbart werden nach Maßgabe der vorliegenden Erfindung daher auch (pharmazeutische) Zusammensetzungen, enthaltend erfindungsgemäße Gegenstände, insbesondere erfin­ dungsgemäße Trimere. Entsprechende Herstellungswege sind bei "Remington's Pharmaceuti­ cal Sciences" (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980) offenbart, das vollinhaltlich Bestandteil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung ist. Für die parenterale Verabreichung kommen als Trägerstoffe bspw. steriles Wasser, sterile Kochsalzlösungen, Polyalkylenglykole, hydroge­ nierte Naphthalen und insbesondere biokompatible Lactidpolymere, Lac­ tid/Glycolidcopolymer oder Polyoxyethylen-/Polyoxypropylencopolymere in Betracht. Erfin­ dungsgemäße Zusammensetzungen können Füllsubstanzen oder Substanzen, wie Lactose, Mannitol, Substanzen zur kovalenten Anknüpfung von Polymeren, wie z. B. Polyethylengly­ kol an erfindungsgemäße Inhibitoren, Komplexierung mit Metallionen oder Einschluß von Materialien in oder auf besondere Präparationen von Polymerverbindung, wie z. B. Polylaktat, Polyglykolsäure, Hydrogel oder auf Liposomen, Mikroemulsion, Micellen, unilamelare oder multilamelare Vesikel, Erythrozyten-Fragmente oder Sphäroplasten, enthalten. Die jeweiligen Ausführungsformen der Zusammensetzungen werden abhängig vom physikalische Verhalten, beispielsweise in Hinblick auf die Löslichkeit, die Stabilität, Bioverfügbarkeit oder Abbau­ barkeit gewählt. Konstrollierte oder konstante Freisetzung der erfindungsgemäßen Wirkstoff­ komponente in der Zusammensetzung schließt Formulierungen auf der Basis lipophiler De­ pots ein (z. B. Fettsäuren, Wachse oder Öle). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden auch Beschichtungen erfindungsgemäßer Substanzen oder Zusammensetzungen, enthaltend solche Substanzen, nämlich Beschichtungen mit Polymeren offenbart (z. B. Poloxamere oder Poloxamine). Weiterhin können erfindungsgemäßen Substanzen bzw. Zusammensetzungen protektive Beschichtungen, z. B. Proteaseinhibitoren oder Permeabilitätsverstärker, aufweisen.

Erfindungsgemäße Trimere finden bevorzugt auch Verwendung im Bereich der In-vitro- Diagnose oder aber beispielsweise für biochemische Reinigungsverfahren. Zu denken ist an den Einsatz von erfindungsgemäßen Trimeren im Rahmen von biochemischen Reinigungs­ verfahren, insbesondere chromatographischen Verfahren, bspw. auf Reinigungssäulen, die mit derartigen Komplexen bepackt sein können, um bspw. Zellen, die die korrespondierenden extrazellulären Rezeptoren exprimieren, isolieren zu können. Damit wird im Rahmen der vor­ liegenden Erfindung die Verwendung von derartigen Komplexen auch zu Nachweiszwecken offenbart.

Als weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung werden vorliegend Fusionsproteine be­ schrieben, die zur Trimerisierung von geeignet sind, sofern das rekombinante Fusionsprotein mindestens eine Komponente A und mindestens eine Komponente B enthält, wobei die Kom­ ponente A ein Protein oder einen Proteinabschnitt mit biologischer Funktion, insbesondere mit Ligandenfunktion für Antikörper oder Rezeptoren enthält, und die Komponente B einen trimerisierenden Abschnitt oder ein funktionelles Derivat eines solchen Abschnitts eines Pro­ teins, wie als Bestandteil der erfindungsgemäßen Trimere oben beschrieben, enthält. Damit werden erfindungsgemäß alle jene rekombinaten Fusionsproteine offenbart, die zuvor als Be­ standteile von erfindungsgemäßen Trimeren offenbart sind. Die obige Offenbarung - im Zu­ sammenhang mit erfindungsgemäßen Trimeren - zu den Komponenten A und B bzw. zur Konstruktion eines rekombinanten Fusionsproteins korrespondiert daher mit den Ausfüh­ rungsformen eines erfindungsgemäßen rekombinanten Proteins selbst. So ist die Komponente B eines erfindungsgemäßen rekombinanten Fusionsproteins typischerweise ein Proteinab­ schnitt ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Familie der C1q-Proteine oder der Col­ lectine bzw. aus der Familie der kollagenartigen Proteine, wobei die Komponente B des re­ kombinanten Fusionsproteins vorzugsweise ausschließlich einen trimerisierenden Abschnitt enthält, aber keine die Trimere oligimerisierende Struktur oder globuläre "Kopf"-Domäne aufweist. Typischerweise wird die Komponente B daher mindestens eine Aminosäuresequenz mit dem Heptadmuster (abcdefg)" aufweisen, das strukturell eine eine Tripelhelix bildenden Helix bildet, deren Aminosäuren in den Positionen a und d vorzugsweise apolare Seitenketten tragen und dadurch die Ausbildung der oben beschriebenen superhelikalen Struktur, hier als Tripelhelix aus drei Helices erlauben. Derartige Sequenzen aus mindestens einem Heptad­ muster, vorzugsweise mindestens zwei können bspw. aus einem der folgenden Protein Kera­ tin, Kollagen, C1q, MBP, SP-A, SP-D, BC, CL43 oder ACRP30 stammen. Auch ein funktio­ nelles Derivat eines solchen Abschnitts der vorgenannten Proteine kann im Rahmen der vor­ liegenden Erfindung zum Einsatz kommen, wobei die oben gewählte Definition eines funkti­ onellen Derivats für die Komponente A entsprechend auch für die Komponente B gilt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Inhibitor, der als Hexamer (2 × 3) durch Ausbildung einer Disulfidbrücke in Lösung in vitro vorliegt (ApoFasL-060). In vivo liegt dieser Inhibitor - ggf. in oxidierendem Milieu - als Trimer vor oder verhält sich wie ein Trimer und entfaltet auf diese Weise inhibitorische Eigenschaften. ApoFasL-060 besteht aus einer N-terminalen Flag-Sequenz, einem Linker und einem spezifischen Linker sowie den AS 103 bis 138 aus hFasL und den AS 139 bis 281 (Komponente A), ebenfalls aus hFasL (s. Fig. 1). Analog kann ein Inhibitor der Art von ApoFasL-060 auch als Komponente A die entspre­ chenden Bindungsabschnitte anderer TNF-Cytokine tragen, bspw. OX40L, RANKL, TWEAK, Lta, Ltab2, LIGHT, CD27L, 41-BB, GITRL, APRIL, VEGI und BAFF bzw. deren Abschnitte oder Derivate in Betracht. Ganz besonders bevorzugt sind die Proteine CD40L, FasL, TRAIL, TNF (insbesondere TNF, das an den Rezeptor TNF-R2 bindet), CD30L und EDA bzw. deren Abschnitte oder Derivate, insbesondere deren jeweilige humane Sequenzen.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Figuren näher erläutert:

Fig. 1 zeigt die Konstruktion die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen FasL- Chimären (FasL-199, FasL-060 und FasL-267) im Ein-Buchstaben-Code. Die beiden Protein­ chimären FasL-199 und FasL-267 enthalten einen Bestandteil des Proteins ACRP30, eines Plasmaproteins, das strukturell ähnlich dem Komplement-Faktor C1q ist und von Adipozyten produziert wird. Das Protein ACRP30 hat nativ eine Länge von 247 Aminosäuren, wobei sie am N-Terminus eine Sekretionssignalsequenz (AS 1 bis 17), mit einer nachfolgenden Se­ quenz von 27 Aminosäuren (AS 18 bis 44), die für die Oligomerisierung des Proteins verant­ wortlich ist, aufweist. Der nachfolgende Abschnitt (AS 45 bis 110) des nativen Proteins ent­ hält 22 kollagenartige Sequenzwiederholungen, die demnach die "coiled-Coil"-Domäne bil­ den. Diese coiled-Coil-Domäne sorgt im nativen Zustand für die Trimerisierung.

Die Proteinchimäre FasL-199 (Kontrolle) wurde mit Hilfe einer PCR-Amplifizierung kon­ struiert und enthält die vollständige Oligomerisierungsdomäne von murinem ACRP30 (mACRP30) (Aminosäuren 18 bis 110). C-terminal hiervon das FasL-Chimärenprotein die Trimerisierungsdomäne von FasL (Aminosäuren 139 bis 281). Linker-Sequenzen befinden sich zwischem dem N-terminalen Flag-Tag und dem mACRP30-Abschnitt sowie zwischen mACRP30 (Komponente B) und dem humanen hFasL-Abschnitt (Komponente A) (LQ).

Das Chimärenprotein FasL-267 entspricht weitestgehend dem Konstrukt FasL-199, weist je­ doch eine Deletion des mACRP30-Abschnitts auf. Es enthält nicht die Oligomerisierungsdo­ mäne (Aminosäuren 18 bis 44) von ACRP30. Die Deletionsmutante wurde durch PCR Ver­ fahren aus dem EST-Klon AA673154 hergestellt. Die Deletion der Aminosäuren 18 bis 44 von mACRP30 bewirkt, daß das Konstrukt als Trimer vorliegt, wie durch die Gelitration­ sexperimente gezeigt.

Das Chimärenprotein FasL-060 weist am N-Terminus eine Flag-Sequenz, gefolgt von einem Linker (GPGQVQLQ), einem spezifischen Linker, der eine Disulfidbrücke bilden kann, die AS 103 bis 138 von humanem FasL (hFasL) und schließlich als Komponente A die AS 139 bis 281 von hFasL auf. Je nach Ausbildung der Disulfidbrücke verhält sich ApoFasL-060 als Trimer oder als Hexamer.

Fig. 2 zeigt in Fig. 2A die Aktivität von ApoFasL-060 und ApoFasL-267 in vitro in Hin­ blick auf die Überlebensfähigkeit von Bjab-Zellen. Aufgetragen auf der y-Achse ist jeweils die Absorbanz bei OD 490 nm, aufgetragen auf der x-Achse jeweils (in logarithmischer Dar­ stellung) ist die Konzentration der zugegebenen Fusionsproteine für den Zytotoxizitätstest. Die optische Dichte bei 490 nm ist ein Maß für die Lebensfähigkeit der Zellen (hohe optische Dichte entspricht einer geringen apoptotischer Wirkung der zugegebenen Substanzen und damit einer hohen Lebensfähigkeit der Zellen). Dargestellt sind die Kurvenverläufe für As­ says mit ApoFasL-267 (o), ApoFasL-060 (▱), jeweils ohne Zugabe von kreuzvernetzendem Antikörper, oder jeweils unter Zugabe von kreuzvernetzendem Antikörper (., ∎). FasL-267 allein ist auch bei hohen Konzentrationen (d. h. geringer Verdünnung) für die Zellen nicht zytotoxisch - im Unterschied zu FasL-267 mit kreuzvernetzendem Antikörper.

Fig. 2B zeigt in einer Darstellung wie in Fig. 2A die inhibitorische Aktivität von ApoFasL- 267 (o) und ApoFasL-060 (▱). Um die inhibitorische Aktivität bestimmen zu können, wurden zur Auslösung der Apoptose oligomerisiertes FasL bei einer Konzentration von 50 ng/ml in allen Versuchen hinzugegeben.

Fig. 2C zeigt die Ergebnisse von Affinitätsuntersuchungen, und zwar vergleichend die Affi­ nität von FasL-199 und FasL-267 gegenüber Bjab-Zellen. Hierbei konkurrieren ApoFasL-267 und FasL-199 mit ZB4-Antikörpern um die Bindung an Fas auf BJAB-Zellen. Aufgetragen ist der Prozentsatz von gebundenem ZB4 (einem anti-Fas-Antikörper) gegen die Konzentration von FasL-199 (▱) bzw. FasL-267 (o). Innerhalb der Meßungenauigkeiten ergab sich kein Un­ terschied in Hinblick auf das Affinität der beiden FasL-Liganden. Damit konnte gezeigt wer­ den, daß der Unterschied der beiden Liganden in Hinblick auf deren Zytotoxizität nicht auf unterschiedlicher Bindungsaffinität an den Rezeptor beruht.

Fig. 3 zeigt die Ergebnisse von in vivo-Experimenten, und zwar die Wirkung der ApoFasL- 060-Inhibition auf die durch agonistischen anti-Fas-Antikörper J02 induzierte Hepatolyse. Fig. 3A zeigt die Ergebnisse von Versuchen, bei denen Mäusen intravenös entweder Apo- FasL-060 (25 µg/Maus) oder Kochsalzlösung (Kontrolle) vor der intravenösen Injektion von 5 µg J02-Antikörper injiziert wurde. Die ausgefüllten Balken in Fig. 3A stellen die Serumti­ ter (in U/ml) von ALT und die offenen Balken von AST als Ergebnisse der Messungen vier Stunden nach iv Injektion dar. Die rechte Auftragung gibt das Ergebnis des Kontrollversuchs wieder. In Fig. 3B ist die Überlebensrate von Mäusen dargestellt, die 10 µg J02-Antikörper erhalten haben, und zwar nach Vorbehandlung mit Kochsalzlösung (ausgefüllte Balken) oder mit ApoFasL-060 (20 µg) (hellgraue Balken, jeweils 2. von links) oder nur mit ApoFasL-060 (dunkelgraue Balken, jeweils dritter von links) oder mit ApoFasL-060 und kreuzvernetzen­ dem Antikörper (mittelgraue Balken, jeweils rechts), in Abhängigkeit von der Zeit nach Ver­ abreichung (2 h, 4 h, 24 h). Nach 4 h ist keine der Mäuse, die ausschließlich agonistischen J02- Antikörper erhalten hat (schwarze Balken), am Leben, während der Inhibitor (hellgraue Bal­ ken) das Überleben der Mäuse nahezu vollständig ermöglicht. Damit verhindert ApoFasL-060 die Letalwirkung des agonistischen anti-Fas-Antikörpers J02 in Mäusen. Durch kreuvernet­ zenden Antikörper wird die inhibitorische Wirkung von ApoFasL-060 (mittelgraue Balken) wieder aufgehoben.

Fig. 4 zeigt die Wirkung von ApoFasL-267 nach einem durch oligomerisiertes FasL indu­ zierten Leberschaden. Fig. 4 stellt die Ergebnisse aus Versuchen dar, bei denen den Mäusen intravenös entweder Kochsalzlösung oder 25 µg von ApoFasL-267 vor der intravenösen In­ jektion von oligomerisiertem FasL (FasL-199) injiziert wurde. Die Serumtiter von ALT (aus­ gefüllte Balken) und AST (offene Balken) wurden nach Ablauf von vier Stunden analysiert. Wiederum stellen die Balken die jeweiligen Titer in U/ml dar. Die Auftragungen in der Mitte und rechts in Fig. 4 zeigen die Ergebnisse nach Gabe von agonistischem, d. h. Apoptose aus­ lösendem FasL, die linke Auftragung stellt den Vergleichsversuch ohne Gabe von agonisti­ schem FasL dar. Neben den Ergebnissen von Kontrollexperimenten sind somit in Fig. 4 die Ergebnisse von Versuchen mit FasL-199 ohne protektiven Liganden und von FasL-199 in Kombination mit protektivem Liganden FasL-267 dargestellt.

In Fig. 5 ist die Wirkung von löslichem FasL im Falle einer AAP-induzierten Hepatitis dar­ gestellt. Den Mäusen wurde intravenös entweder ApoFasL-267 (Fig. 5A) oder ApoFasL-060 (Fig. 5B und 5C) vor der intraperitonealen Injektion von AAP (300 mg/kg) injiziert. Aufgetragen sind in den Fig. 5A und 5B die Titer (U/ml) von ALT (ausgefüllte Balken) und AST (offene Balken), die jeweils fünf Stunden nach der Injektion gemessen wurden. Die lin­ ken Auftragungen in den Fig. 5A und 5B entsprechen den Vergleichsversuchen, während die rechte (Fig. 5A) bzw. in Fig. 5B die mittlere und die rechte Auftragung die Resultate nach Gabe der erfindungsgemäßen Inhibitoren darstellen. Fig. 5C zeigt die relative Abnah­ me der Aminotransferase-Titer im Vergleich zu scheinbehandelten (Kontroll)-Tieren (100%).

Fig. 6 stellt die Wirkung von ApoFasL-267 und ApoFasL-060 auf eine mit AAP behandelte Mäuseleber dar. Die Mäuse wurden, wie vorangehend in Fig. 5 beschrieben, behandelt. 24 Stunden nach der Hepatitis-Induktion wurden die Lebern seziert und histologisch ausgewer­ tet. Fig. 6 enthält drei Abbildungen von histologischen Schnitten (Zugabe von AAP, Zugabe von AAP und ApoFasL-267 und schließlich ein Vergleichsansatz (Kontrolle) nach Zugabe von Kochsalzlösung). Die Behandlung der Mäuse mit ApoFasL-267 (oder ApoFasL-060, nicht dargestellt) verhindert Leberschädigungen, wie aus einem Vergleich mit dem histologi­ schen Schnitt aus den Kontrolltieren erkennbar ist. Dagegen zeigen die Lebern von aus­ schließlich mit AAP behandelten Tieren Nekrose und Apoptose im zentralen Venula-Bereich, sinusoidaler entzündlicher Blutandrang und vakuolisierte Hepatocyten.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher erläu­ tert:
Die folgenden experimentellen Gegebenheiten (a) bis (f) sind, soweit einschlägig und nicht entsprechende a. a. O. offenbarte Modifizierungen gelten, für die sechs nachfolgenden Ausfüh­ rungsbeispiele heranzuziehen:

(a) Vektorkonstruktionen für die FasL-, TRAIL-, TNFα- und CD40L-Fusionsproteine

Die Trimerisierungsdomäne von FasL (AS 139-281) wurde aus humaner cDNA unter Ver­ wendung der Oligonukleotide JT398 (ACT GCA GGA AAA AAA GGA GCT G) und J290 (CAA CAT TCT CGG TGC CTG TAA C) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde in pCRII (InVitrogen) ligiert und die kodierenden Sequenz, eingerahmt von den Restriktionsschnittstel­ len PstI und EcoRI, dann, enthaltend ein für das Signalpeptid von Hämagglutinin codierendes DNA-Fragment, einschließlich 6 Basen der im 5'-Bereich unübersetzten Sequenz (CAA AAC ATG GCT ATC ATC TAC CTC ATC CTC CTG TTC ACC GCT GTG CGG GGC) sowie das Flag-Epitop (GAT TAC AAA GAC GAT GAC GAT AAA), den Linker (GGA CCC GGA CAG GTG CAG), die Restriktionsschnittstellen PstI, SalI, XhoI und BamHI, zwischen die Restriktionsschnittstellen HindIII und BamHI eines modifizierten pCRIII-Vektors (P5038, InVitrogen, NV Leek, Niederlande) subkloniert, in dem die Basen 720-769 deletiert wurden (PS 038).

Der Expressionsvektor für FasL-199 wurde in folgender Weise konstruiert. Mittels des EST- Klons AA673154 wurde zunächst eine PCR-Amplifikation mit Hilfe der Oligonukleotide JT1147 (ACA ATG CAT GAA GAT GAC GTT ACT AC) und JT1148 (AGA CTG GAG AGC GGC TTC TCC AGG) durchgeführt. Die für die Aminosäuren 18 bis 111 des murinen ACRP30 kodierende Sequenz, eingerahmt von den Restriktionsschnittstellen NsiI und PstI in die PstI-Schnittstelle des für trimeren FasL kodierenden Vektors kloniert (dergestalt, daß die fusionierte NsiI/PstI-Schnittstelle auf der 5'-Seite der kodierenden Sequenz lag). Der Vektor zur Expression des Fusionsproteins FasL-167 (mit den AS 44-111 von mACRP30) wurde mit Hilfe des alternativen 5'-Oligonukleotids JT1421 (AAA ATG CAT GCA GGC ATC CCA GGA C) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde in ein PCR-"blunt" system ligiert und die Nsi/PstI-Kassette in den FasL-enthaltenden Vektor - wie oben beschrieben - subkloniert. Andere Fusionsproteine mit alternativen TNF-Cytokinen in Kombination mit ACRP30 wur­ den durch Substituierung der entsprechenden Sequenz von FasL im Expressionsvektor FasL- ACRP30 mit der jeweiligen Ligandensequenz in die Restriktionsschnittstellen PstI und EcoRI erstellt.

(b) Expression und Reinigung der rekombinanten Proteine

HEK293-Zellen wurden mit Hilfe de Calciumphosphat-Methode stabil transfiziert. Nach drei Tagen Inkubation wurden die HEK293-Zellen für zwei Wochen in einem Selektionsmedium kultiviert, das 800 µg/ml G418 enthielt (siehe auch a. a. O: Schneider et al., J. Exp. Med. 1998). Diese stabil transfizierten Klone wurden entnommen und in 96 well"-Platten in Selek­ tionsmedien verteilt. Die Überstände wurden mit Hilfe der anti-Flag Western-Blot-Technik in Hinblick auf die Präsenz des rekombinaten Proteins untersucht.

Die stabil transfizierten Zellen wurden für die Dauer von 10 bis 14 Tagen in 800 ml eines nicht-selektiven Mediums in Flaschen aufgezogen. Die Kultur wurde zentrifugiert und der Überstand filtersterilisiert. Fusionsproteine von FasL mit murinem ACRP30 (FasL-267 oder FasL-199) wurden dann in der folgenden Weise aufgereinigt. Die Überstände wurden mit NaCl und CaCl₂ versetzt (Endkonzentrationen von 150 mM bzw. 2 mM) und der pH-Wert mittels Salzsäure/Natronlauge auf 7,0 eingestellt. Daraufhin wurde das rekombinante Protein auf eine 1 ml M2-Agarose-Säule (Sigma, Schweiz) aufgebracht (0,5 ml/min, 48 h, 4°C), die Säule mit 10 Volumina TBS, enthaltend 2 mM CaCl₂, gewaschen und schließlich in TBS- EDTA (10 mM) (0,1 ml/min, 4°C) oder 50 mM Citrat-NaOH (pH 2,5) (1 ml/min, 4°C) eluiert und ggf. mit 0,2 Volumina von 1 M Tris-HCl (pH 8) neutralisiert. Der Puffer wurde gegen PBS in Konzentratoren mit einer 30 kDA-Grenze (Millipore) ausgetauscht. Die Konzentration von gereinigten Proteinen wurde durch das Bicinchoninsäure-Verfahren (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard bestimmt und die Reinheit der Proben durch SDS-PAGE und Coomassie-Blue-Färbung ermittelt.

(c) Zellen

Die humanen T-Lymphoplastom-Jurkat-Zellen, BJAB Burkitt-Lymphomzellen oder Raji- Zellen wurden in RPMI, begleitet von 10% FCS, aufgezogen. Die human-embryonischen Nierenzellen 293 wurden in einem DMEM Mehrstoffmix F12 (1 : 1), angereichert mit 2% FCS, kultiviert. Alle Medien enthielten Antibiotika (Penicillin und Streptomycin bei 5 µg/ml jeweils und Neomycin bei 10 µg/ml).

(d) Zytotoxischer Assay

Der zytotoxische Assay wurde im wesentlichen, wie zuvor bei Schneider et al. (J. Biol. Chem. 272: 18827-18833, 1997) beschrieben durchgeführt. Hierbei wurden 50.000 Zellen für die Dauer von 16 Stunden in 100 µl Medium inkubiert, wobei das Medium die angezeigten Ligandenkonzentrationen in Gegenwart oder Abwesenheit von 1 µg/ml M2-Antikörper ent­ hielt. Die Zellüberlebensraten wurden mit Hilfe von PMS/MTS (Phenanzinmethosulfat 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl]-5-[3-carboxymethoxyphenyl]-2-[4-sulfophenyl]-2H-tetrazolium, Salz) (Promega Corp., Madison, WI) bestimmt. Die Farbentwicklung wurde für die erforder­ liche Zeit (typischerweise 1-3 Stunden) zugelassen. Die Absorbanz wurde bei 490 nm gemes­ sen. Die optische Dichte bei 490 nm ist ein Maß für die Lebensfähigkeit der Zellen (hohe op­ tische Dichte entspricht einer geringen apoptotischer Wirkung der zugegebenen Substanzen und damit einer hohen Lebensfähigkeit der Zellen).

(e) Behandlung der Mäuse

Weiblichen Balb/c-Mäusen (8 bis 10 Wochen alt) wurden die verschiedenen Konstrukte in­ travenös injiziert. Das Ausbluten der Mäuse erfolgte nach den angegeben Zeitintervallen mit nachfolgender Quantifizierung der Titer der Aminotransferasen AST und ALT (Aspartatami­ notransferase und Alaninaminotransferase)

(f) Materialien

Die anti-Flag-M1- bzw. anti-Flag-M2-Antikörper, gekoppelt an Agarose wurden von Sigma (Buchs, Schweiz) erworben. Die Antikörper J02 wurden von Pharmingen und die Zellkultur- Reagenzien von Life Sciences (Basel, Schweiz) erworben.

(g) Bindungsstudie

Die Affinität von ApoFasL-267 und FasL-199 wurde unter Verwendung eines Kompetition­ sassays bestimmt. Die monoklonalen anti-Fas-Antikörper ZB4 wurden hierzu mit 100 µCi (125I) durch die iodo-Gen-Methode (Pierce, Rockford, IL) markiert. Dies führte zu einer spe­ zifischen Aktivität von 1,5 µCi/µg Protein. 1 × 105 Bjab-Zellen wurden mit radiomarkiertem ZB4 und nicht-markierten Kompetitoren in serieller Verdünnung (100 µg/ml bis 10 ng/ml) für 1 h bei 37°C inkubiert. Nach drei Waschgängen mit kaltem PBS, das 1% BSA enthielt, wurde die an die Zellen gebundene Radioaktivität mit einem γ-Zähler bestimmt und als Prozentsatz von gebundenem cpm ausgedrückt. Alle Experimente wurden dreifach ausgeführt.

Im übrigen wird hinsichtlich der Beschreibung der für die Durchführung der Ausführungsbei­ spiele eingesetzten Methoden ausdrücklich auf Schneider et al. (J. Exp. Med., Vol. 187, Nr. 8, 1998, 1205-1213) und die dort als Referenzen zitierten Publikationen verwiesen.

1. Ausführungsbeispiel

Es wurde ein rekombinantes Fusionsprotein (1, FasL-199) exprimiert, das die Aminosäuren 139 bis 281 des hFasL (h: human) als Komponente A und N-terminal von der Aminosäure 139 der Komponente A als Komponente B eine 94 AA lange Sequenz (AS 18 bis 111 von mACRP30) aufwies. Darüber hinaus wurde am N-Terminus des Fusionsproteins (N-Terminal von der Komponente B) eine Flag-Sequenz mit den Aminosäuren DYKDDDDK und einer zwischen dem Flag-Tag und der Komponente B angeordneten Linkersequenz GPGQVQLQLH angekoppelt (s. Fig. 1) exprimiert. Komponente A und B sind durch die Linkersequenz LQ getrennt.

Für Vergleichsversuche wurde ein Fusionsprotein (2, FasL-267) exprimiert, das N-terminal gleichfalls die vorgenannte Flag-Sequenz mit der gleichen C-terminal folgenden Linkerse­ quenz und daran C-terminal angeschlossen die Aminosäuren 139 bis 281 von hFasL aufwies. Fusionsprotein (1) unterschied sich von Fusionsprotein (2) demnach durch eine Deletion, die den spezifischen Linker und die Aminosäuren 103 bis 138 von hFasL umfaßte (Fig. 1).

Die Vektorkonstruktion der Fusionsproteine (1) und (2) erfolgte nach der oben beschriebenen Verfahrensweise. Die Expression und Reinigung der Fusionsproteine erfolgte nach dem unter (b) dargestellten Verfahren.

Der Multi- bzw. Oligomersierungsgrad der gereinigten Fusionsproteine (1 bzw. 2) wurde durch Elektronenmikroskopie bestimmt. Hierbei ergab sich, dass FasL-199 als Hexamer (2 × 3mer), entsprechende Messungen für FasL-267 ergaben Resultate für ein Trimer und für ApoFasL-060 ebenfalls ein Hexamer.

2. Ausführungsbeispiel

Inihibitorische Wirkung von ApoFasL-060 und ApoFasL-267 auf die Fas-vermittelte Apopto­ se in vitro.

Es wurden gemäß (c) gezüchtete Bjab-Burkitt-Lymphoma-Zellen entnommen und einem zy­ totoxischen Assay gemäß (d) unterzogen. Für diese Zellinie wurde der Assay jeweils mit stei­ genden Konzentrationen von trimerisierten Fusionsproteinen ApoFasL-060 uns ApoFasL-267 in Gegenwart oder Abwesenheit von anti-Flag-M2-Antikörpern (Sigma, Buchs, Schweiz) durchgeführt (Fig. 2A), indem die Absorbanz bei OD 490 nm bestimmt wurde. Die einge­ setzten Inhibitoren ApoFasL-060 und ApoFasL-267 sind in Fig. 1 dargestellt (s. 1. Ausfüh­ rungsbeispiel).

Beide Inhibitoren zeigen ähnliche Zelltod-induzierende Eigenschaften, wenn sie mit gegen den Flag-Tag gerichtete Antikörper kreuzvernetzt werden (Fig. 2A). ApoFasL-060 induziert den Zelltod auch dann, wenn keine kreuzvernetzenden Antikörper vorhanden sind aufgrund seiner Aggregatstruktur. Damit zeigen die Ergebnisse des 2. Ausführungsbeispiels, daß Apo- FasL-060 und ApoFasL-267 jeweils an den Fas-Rezeptor binden können, jedoch deren Oli­ gomerisierung zur Transduktion des Todessignals erforderlich ist. Hierbei ist die verringerte Zytotoxizität der beiden Inhibitoren nicht auf eine verringerte Affinität gegenüber dem Fas- Rezeptor zurückzuführen, da deren Affinität gegenüber oligomerisiertem FasL (FasL- 199) nicht verringert ist.

Darüber hinaus wurden Bjab-Zellen mit steigenden Konzentrationen von ApoFasL-267 prä­ inkubiert und anschließend FasL-199 zur Induktion der Apoptose hinzugefügt (s. Fig. 2B). Hierbei zeigte sich, daß der durch FasL-199 induzierte Zelltod durch ApoFasL-267 verhindert werden kann. Die Messreihe lässt erkennen, daß ApoFasL-267 als trimeres Molekül den Zell­ tod in vitro mit einer inhibitorischen Konzentration (IC) von 100 ng/ml verhindern kann. Während also das in trimerer Form vorliegende ApoFasL-267 die Apoptose durch die Blo­ ckade des Rezeptors verhindert, kann das aggregierende ApoFasL-060 die FasL- 199 induzier­ te Apoptose in vitro nicht verhindern, da es aufgrund seiner Struktur selbst Apoptose­ induzierend wirkt.

3. Ausführungsbeispiel In vivo Versuche nach Hepatolyse-Induktion A. Wirkung von ApoFasL-060

Hierzu wurden Mäusen agonistische J02-anti-Fas-Antikörper injiziert, die bei den derart be­ handelten Mäusen zum Exitus durch fulminant verlaufendes Leberversagen führten. Die He­ patolyse bei diesen Mäusen wurde durch die hohen Serumtiter von Aminotransferasen (AST und ALT) nachgewiesen. Experimentell wurden die Mäuse mit ApoFasL-060 (1 mg/kg) vor­ behandelt, wodurch das Tier nach Gabe von J02-Antikörpern vor der von diesen ausgelösten Leberversagen (Hepatolyse) bewahrt wurden (s. Fig. 3A). Die protektive Wirkung von A­ poFasL-060 war erwartungsgemäß dosisabhängig. Bei einer Gabe von 5 µg J02-Antikörper konnten AST- und ALT-Titer wie bei jenen Mäusen, die als Kontrolle dienten, beobachtet werden. Bei einer Dosis von 10 µg J02-Antikörper war eine überwiegende Schutzwirkung zu beobachten (Reduktion der AST- und ALT-Titer von ungefähr 90%). Im Ergebnis zeigte sich, daß ApoFasL-060 eo ipso nicht toxisch ist, sofern nicht ein kreuzvernetzender Antikörper (Fig. 3B) eingesetzt wurde, so daß auch hier die Zelltod inhibierende Wirkung auf der Bin­ dung an den Fas-Rezeptor ohne Auslösung des Todessignals beruht.

Die Letaldosis von J02-Antikörper (10 µg/pro Maus, intravenös injiziert) verursachten bei allen untersuchten Mäusen innerhalb von vier Stunden den Exitus (Fig. 3B). Die Vorbe­ handlung dieser Tiere mit ApoFasL-060 reduzierte die Mortalität dramatisch - die Überle­ bensrate beträgt 86% nach 24 Stunden. Der Inhibitor ApoFasL-060 (allein injiziert) erweist sich als nicht toxisch - allerdings nach Co-Injektion mit kreuzvernetzendem Antikörper wirkt er hochtoxisch, mit einer Mortalitätsrate von 80% nach vier Stunden.

B. Wirkung von ApoFasL-267

In diesem Ausführungsbeispiel wurde den Mäusen entweder Kochsalzlösung (als Kontrolle) oder ApoFasL-267 vor der Injektion von FasL-199 injiziert. Anschließend wurde ein hepato­ lytischer Befund dieser derart behandelten Mäuse nach den jeweiligen Serumtitern von AST und ALT beurteilt (siehe Fig. 4). Die mit ApoFasL-267 vorbehandelten Mäuse sind gegen die Hepatolyse, die durch das oligomere FasL (FasL-199) induziert wird, geschützt. Die FasL-induzierte Hepatolyse ist bei den zur Kontrolle eingesetzten Tieren sehr schnell (inner­ halb von zwei Stunden) nach der Gabe von FasL-199 zu beobachten, nämlich mit Ami­ notransferase-Titern, die um den Faktor 10 erhöht sind. Die Vorbehandlung der Tiere mit A­ poFasL-267 verhindert demnach nach Maßgabe der AST bzw. ALT-Serumtiter bestimmten Leberschaden der Tiere.

4. Ausführungsbeispiel Inhibition der Acetaminophen (AAP)-induzierten Hepatitis

Acetaminophen (AAP), ein Schmerzmittel, induziert bekanntermaßen fulminantes Leberver­ sagen. Der molekulare Mechanismus beruht auf Fas-vermittelter Apoptose. Es wurde im vor­ liegenden Ausführungsbeispiel daher untersucht, ob trimeres ApoFasL-267 und/oder hexame­ res ApoFasL-060 die Leberzellen vor AAP-induziertem Zelltod bewahren kann. Hierzu wur­ de den Mäusen eine subletale Dosis von AAP (0,3 g/kg) intraperitoneal injiziert. Fünf Stun­ den später wurden etwaige Leberschäden durch Bestimmung der Serumtiter von ALT und AST ermittelt. Die ALT- bzw. AST-Titer wurden entsprechend den IFCC-Richtlinien (Inter­ national Federation of Clinical Chemistry) als enzymatischer Test bestimmt. Die Gabe von ApoFasL-267 oder ApoFasL-060 verhinderte eine AAP-bedingte Erhöhung der AST- oder ALT-Titer. Im Vergleich zu unbehandelten Mäusen ergab sich zum Beobachtungszeitpunkt eine deutliche Verringerung der Aminotransferase-Titer (75 bis 90%) bei den erfindungsge­ mäß vorbehandelten Mäusen.

Der protektive Effekt der Vorbehandlung mit ApoFasL-060 erwies sich als dosisabhängig (s. Fig. 5B und 5C). Im Fall einer Verabreichung von 25 µg ApoFasL-060 (1 mg/kg) war keine AAP-induzierte Hepatolyse zu beobachten, im Fall einer Injektion von 12,5 µg ergaben sich leicht erhöhte Aminotransferase-Titer, also ein leichter Leberschaden, noch niedrigere Dosen, z. B. 6 µg/Maus führten zu einem Verlust an protektiver Wirkung. Bei diesen niedri­ gen Dosen ergab sich kein Unterschied zu den Kontrolltieren, die nur mit Kochsalz-Lösung behandelt worden waren. Dies erlaubt die Feststellung, daß es sich bei der beobachteten Inhi­ bition um eine kompetitive Besetzung der Bindungsstellen auf dem Rezeptor handelt.

Die AAP-induzierte Leberschädigung wurde histologisch untersucht (Fig. 6A). Hierbei sind zu nennen: Nekrose und Apoptose im zentralen Venula-Bereich, sinusoidaler entzündlicher Blutandrang, vakuolisierte Hepatocyten. Dagegen, wie in der Fig. 6B gezeigt, sind im Falle einer Vorbehandlung mit ApoFasL-267 (oder ApoFasL-060, nicht dargestellt) keine derarti­ gen Leberschädigungen erkennbar.

Claims (19)

1. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins, dadurch gekennzeichnet, daß das re­ kombinante Fusionsprotein mindestens eine Komponente A und mindestens eine Komponente B aufweist, wobei die Komponente A ein Protein oder ein Proteinab­ schnitt mit biologischer Funktion, insbesondere mit Ligandenfunktion für Antikörper, für lösliche oder membranständige Signalmoleküle oder für Rezeptoren oder ein Anti­ körper oder Abschnitt eines Antikörpers, umfasst und die Komponente B ein Protein oder einen Proteinabschnitt umfasst, der die Komponente A trimerisiert.

2. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich­ net, daß die Komponenten A der rekombinanten Fusionsproteine im Trimer identisch oder verschieden sind.

3. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Komponente A der rekombinanten Fusionsproteine ein Peptid­ hormon, ein Wachstumsfaktor, ein Zytokin, ein Interleukin, ein Abschnitt derselben oder ein funktionelles Derivat der vorgenannten Sequenzen ist.

4. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins nach einem der vorgenannten Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente A des rekombinanten Fusionspro­ teins ein Zytokin aus der Familie der TNF-Zytokine, ein Abschnitt eines solchen TNF- Zytokins oder ein funktionelles Derivat eines TNF-Zytokins bzw. eines Abschnitts ei­ nes solchen TNF-Zytokins ist.

5. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins nach einem der vorgenannten Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente A des rekombinanten Fusionspro­ teins ein TNF-Zytokin oder ein Abschnitt eines TNF-Zytokins, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus CD40L, FasL TRAIL, TNF-α, CD30L, OX40L, RANKL, TWEAK, Lta, Ltab2, LIGHT, CD27L, 41-BB, GITRL, APRIL, EDA, VEGI und BAFF, oder ein funktionelles Derivat der vorgenannten Sequenzen ist.

6. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins nach einer der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente B einen Proteinabschnitt umfasst, der mindestens ein Heptadmuster einer Kollagendomäne aufweist.

7. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins nach einem der vorgenannten Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente B einen Abschnitt des Proteins ACRP30 umfaßt, einschließlich der Trimerisierungsdomäne, ohne höhere Aggregate von Trimeren bilden zu können.

8. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins nach einem der vorgenannten Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente B eine Aminosäuresequenz, wie gemäß Fig. 1 für die Sequenz von Aminosäure 44 bis 111 von ACRP30 angegeben, oder ein funktionelles Derivat derselben enthält, wobei Fig. 1 Bestandteil des An­ spruchs ist.

9. Trimer einer rekombinanten Fusionsproteins nach einem der vorgenannten Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Fusionsprotein die FasL-267-Sequenz gemäß Fig. 1 aufweist, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

10. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins nach einem der vorgenannten Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Fusionsprotein zwischen Kompo­ nente A und Komponente B eine Linkersequenz aufweist.

11. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins nach einem der vorgenannten Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß die Linkersequenz das Dipeptid LQ aufweist.

12. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins nach einem der vorgenannten Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Fusionsprotein eine vorzugsweise N-terminale Tag-Sequenz aufweist.

13. Trimer eines rekombinanten Fusionsproteins, dadurch gekennzeichnet, daß mindes­ tens zwei der drei im Trimer enthaltenen rekombinanten Fuionsproteine verschiedene Komponenten B aufweisen.

14. Verwendung von Trimeren nach einem der Ansprüche 1-13 zur Herstellung eines Arzneimittels.

15. Verwendung von Trimeren nach einem der Ansprüche 1-13 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von viraler Hepatitis (HBV, HCV), Alkohol-induzierter Hepatitis, cholestatische Hepatitis, Wilsons Krankheit, autoimmuner Hepatitis, Absto­ ßungsreaktion bei Lebertransplantation, Erkrankungen, die auf hyperapoptotischen Reaktionen beruhen, degenerativen Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativen Erkrankungen, Entzündungserkrankungen, toxischer epidermaler Nekrolyse (TEN), Multiple Sklerose, Hashimoto Thyroiditis, GvHD.

16. Rekombinantes Fusionsprotein, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Fusi­ onsprotein eine Komponente A und eine Komponente B enthält, wobei die Kompo­ nente A ein Protein oder einen Proteinabschnitt mit biologischer Funktion, insbeson­ dere mit Ligandenfunktion für Antikörper oder Rezeptoren oder einen Antikörper oder Abschnitt eines Antikörpers oder für lösliche oder membranständige Signalmoleküle, ist und die Komponente B einen trimerisierenden Abschnitt oder ein funktionelles De­ rivat eines solchen Abschnitts eines Proteins, insbesondere ausgewählt aus der Grup­ pe, bestehend aus der Familie der C1q-Proteine und der Collectine, enthält.

17. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für ein rekombinantes Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 13 codiert.

18. Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß der Expressionsvektor eine DNA- Sequenz nach Anspruch 17 enthält.

19. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 18 transfiziert ist.