JP2019213520A - Ox40と結合する抗体およびその使用 - Google Patents
Ox40と結合する抗体およびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本出願は、2011年7月11日に出願された米国仮出願第61/506,491号(これらの全ては本明細書に参照によりそれらの全体が組み込まれている)の利益を主張する。
)、IGHV2−70*01(配列番号20)、IGHV2−70*13(配列番号21)、IGHV2−5*09(配列番号22)およびIGHV2−70*11(配列番号23)からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物であるかまたは前記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域を含む、アンタゴニスト抗体またはその断片を提供する。
物であるかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含む、アンタゴニスト抗体またはその断片を提供する。
産物であるかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含むアンタゴニスト抗体またはその断片であって、軽鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも1つのアミノ酸改変を含む、抗体またはその断片を提供する。
(a)配列番号37または38のアミノ酸配列を含む重鎖配列と、
(b)配列番号47のアミノ酸配列を含む軽鎖配列と
を含む、アンタゴニスト抗体またはその断片を提供する。
断片であって、
(a)配列番号58または59のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
(b)配列番号60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と
を含む、アンタゴニスト抗体またはその断片を提供する。
を保持するか、または対応するキメラ抗体と比較した場合に少なくとも等しいかもしくはより高いOX40結合親和性(KD)を有する、拮抗性ヒト化抗体またはその断片につい
ても記載する。さらなる態様では、本発明は、ヒトOX40細胞外領域の第2ドメイン内のエピトープと結合するアンタゴニスト抗体またはその断片を提供する。
0、例えば単離形のヒトOX40と結合する抗体またはその断片を含む。用語「ヒトOX40と結合する抗体またはその断片」は、抗体またはその抗原結合断片を含む。
常領域は、免疫グロブリンと、免疫系の様々な細胞(例えばエフェクター細胞)および古典的な補体系の第1成分(C1q)を含む宿主組織または因子との結合を媒介できる。
c領域は、残基C226またはP230をそのカルボキシル末端に含むと通常定義される(番号付けはEU番号付けシステムに従う)。ヒトIgG1について、Fc領域は、本明細書において、残基P232をそのカルボキシル末端に含むと定義される(番号付けはEU番号付けシステムに従う)(Edelman GMら、(1969)Proc Natl Acad Sci USA、63(1):78〜85頁)。Fcは、単離されたこの領域またはFcポリペプチド、例えば抗体の関係におけるこの領域のことをいうことがある。
酸改変のことをいうことを意図する。このような保存改変は、アミノ酸置換、挿入および欠失を含む。改変は、本発明の抗体に、部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介突然変異誘発などの当技術分野において知られる標準的な技術により導入できる。保存アミノ酸置換は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基でアミノ酸残基を置き換えるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えばアスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分岐側鎖(例えばスレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。よって、本発明の抗体のCDR領域内またはフレームワーク領域内の1または複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えることができ、変化した抗体(バリアント抗体)を、保持された機能について試験できる。
Sci USA、63(1):78〜85頁)。
類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。好ましくは、対象はヒトである。
第1の態様では、本発明は、配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、および/または配列番号2のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および/または配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、ならびに/あるいは配列番号4のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、および/または配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および/または配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む、ヒトOX40と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片を提供する。
形態では、非ヒト抗体からの1または複数の重鎖および/または軽鎖CDR3ドメインを含むこのような発明の抗体は、対応する親非ヒト抗体、例えばマウス抗体と(a)結合について競合でき、(b)前記抗体と同じ機能的特徴を保持し、(c)前記抗体と同じエピトープと結合し、かつ/または(d)前記抗体と同様の結合親和性を有する。
示は、配列番号19のフレームワーク領域配列と少なくとも74%同一である重鎖可変フレームワーク領域配列ならびに/または配列番号24のフレームワーク領域配列と少なくとも65%同一である軽鎖可変フレームワーク領域配列を含む、ヒトOX40と結合する拮抗性抗体またはその断片を提供する。
0(配列番号19)、IGHV2−70*01(配列番号20)、IGHV2−70*13(配列番号21)、IGHV2−5*09(配列番号22)およびIGHV2−70*11(配列番号23)からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物であるかまたは前記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域、好ましくはヒト遺伝子IGHV2−70*10
(配列番号19)の産物であるかまたは前記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域をさらに含む、ヒトOX40と結合する拮抗性抗体またはその断片を提供する。重鎖可変フレームワーク領域は、これらのヒト遺伝子の産物中に存在するかまたは前記遺伝子に由来する1または複数(例えば1、2、3および/または4つ)の重鎖フレームワーク領域配列(例えばフレームワーク1(FW1)、フレームワーク2(FW2)、フレームワーク3(FW3)および/またはフレームワーク4(FW4))を含むことがある。好ましくは、重鎖可変領域フレームワークは、IGHV2−70*10(配列番号19)、I
GHV2−70*01(配列番号20)、IGHV2−70*13(配列番号21)、IGHV2−5*09(配列番号22)およびIGHV2−70*11(配列番号23)からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物中に存在するかまたは前記遺伝子に由来するFW1、FW2および/またはFW3、より好ましくはFW1、FW2およびFW3を含む。重鎖フレームワーク領域配列は、本明細書で用いる場合、FW1(1位〜25位)、FW2(36位〜49位)、FW3(66位〜94位)およびFW4(103位〜113位)(アミノ酸の位置は、Kabatに示す番号付けシステムを利用して示す)を含む。
記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域を含み、重鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の対応する重鎖可変フレームワーク領域からの少なくとも1つのアミノ酸改変を含む、抗体およびその断片を提供する。
9*01(配列番号25)、IGKV1D−39*01(配列番号26)、IGKV3−11*02(配列番号27)およびIGKV3−20*01(配列番号28)からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物であるかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワー
ク領域、好ましくはヒト遺伝子IGKV3−11*01(配列番号24)の産物であるか
または前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含む、ヒトOX40と結合する拮抗性抗体またはその断片を提供する。軽鎖可変領域フレームワーク領域は、これらのヒト遺伝子の産物中に存在するかまたは前記遺伝子に由来する1または複数(例えば1、2、3および/または4つ)の軽鎖フレームワーク領域配列(例えばフレームワーク1(FW1)、フレームワーク2(FW2)、フレームワーク3(FW3)および/またはフレームワーク4(FW4))を含むことがある。好ましくは、軽鎖可変領域フレームワークは、V3−11*01(配列番号24)、IGKV1−39*01(配列番号25)、IGKV1D−39*01(配列番号26)、IGKV3−11*02(配列番号27)およびIGKV3−20*01(配列番号28)からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物
中に存在するかまたは前記遺伝子に由来するFW1、FW2および/またはFW3、より好ましくはFW1、FW2およびFW3を含む。軽鎖フレームワーク領域配列は、本明細書で用いる場合、FW1(1位〜23位)、FW2(35位〜49位)、FW3(57位〜88位)およびFW4(98位〜108位)(アミノ酸の位置は、Kabatに示す番号付けシステムを利用して示す)を含む。
4)の産物であるかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含む抗体またはその断片であって、軽鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも1つのアミノ酸改変を含む、抗体およびその断片を提供する。
配列番号21)、V2−5*09(配列番号22)およびV2−70*11(配列番号23)からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物であるかまたは前記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域と、V3−11*01(配列番号24)、IGKV1−39*01(配列番号25)、IGKV1D−39*01(配列番号26)、IGKV3−11*02(配列番号27)およびIGKV3−20*01(配列番号28)からなる群より選択さ
れるヒト遺伝子の産物であるかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域、好ましくはヒト遺伝子V2−70*10(配列番号19)の産物であるかまたは前記遺
伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域と、ヒト遺伝子V3−11*01(配列番号
24)の産物であるかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域とを含む。上記の異なるヒト遺伝子の産物中に存在するかまたは前記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域、および/または上記の異なるヒト遺伝子の産物中に存在するかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変領域フレームワーク領域の組み合わせも、本発明に包含される。
択され、好ましくは配列番号35、36、37および38からなる群より選択され、より好ましくは配列番号37および38からなる群より選択される重鎖配列を含む、ヒトOX40と結合する拮抗性抗体またはその断片を提供する。本開示は、配列番号39、40、41、42、43、44、45、46、47、48および49からなる群より選択され、好ましくは配列番号45、46、47および49からなる群より選択され、より好ましくは配列番号47である軽鎖配列を含む、ヒトOX40と結合する拮抗性抗体またはその断片も提供する。いくつかの実施形態では、ヒトOX40と結合する拮抗性抗体またはその断片は、配列番号32、33、34、35、36、37および38からなる群より選択される重鎖配列と、配列番号39、40、41、42、43、44、45、46、47、48および49からなる群より選択される軽鎖配列とを含む。これらの重鎖および軽鎖可変領域配列のそれぞれがヒトOX40と結合できることに鑑みて、重鎖および軽鎖可変領域配列を「様々に組み合わせ」て、本発明の抗OX40結合分子を創出できる。このような「様々に組み合わせ」た抗体のOX40結合は、実施例に記載する結合アッセイを用いて試験できる。
りに、本発明の抗体を、Fc領域内に改変を含むように工学的に改変して、血清半減期、補体結合、Fc受容体結合および/または抗原依存性細胞傷害作用のような抗体の1または複数の機能特性を典型的に変更してよい。さらに、本発明の抗体を化学的に改変(例えば1または複数の化学的部分を抗体に付けることができる)またはそのグリコシル化を変更するように改変してよい。これらの実施形態のそれぞれは、以下にさらに詳細に記載する。以下に概説するFc領域内の改変は、Fc領域中の残基のEU番号付けに従う。一実施形態では、CH1のヒンジ領域を、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変更、例えば増加または減少されるように改変する。このアプローチは、Bodmerらによる米国特許第5,677,425号にさらに記載されている。CH1のヒンジ領域中のシステイン残基の数を変更して、例えば軽鎖と重鎖の集合を容易にするか、または抗体の安定性を増加もしくは減少させる。別の実施形態では、抗体のFcヒンジ領域を変異させて、抗体の生物学的半減期を減少させる。より具体的には、抗体のブドウ球菌プロテインA(SpA)結合が天然のFc−ヒンジドメインSpA結合と比べて損なわれるようにFc−ヒンジ断片のCH2−CH3ドメイン界面領域中に1または複数のアミノ酸変異を導入する。このアプローチは、Wardらによる米国特許第6,165,745号にさらに詳細に記載されている。別の実施形態では、抗体を改変して、その生物学的半減期を増加させる。様々なアプローチが可能である。例えば、Wardへの米国特許第6,277,375号に記載されるように、以下の変異の1または複数を導入できる:T252L、T254S、T256F。代わりに、生物学的半減期を増加させるために、Prestaらによる米国特許第5,869,046号および第6,121,022号に記載されるように、IgGのFc領域のCH2ドメインの2つのループから得たサルベージ受容体結合エピトープを含有するようにCH1またはCL領域内で抗体を変更できる。さらなる実施形態では、少なくとも1つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えて、抗体のエフェクター機能(複数可)を変更することによりFc領域を変更する。例えば、エフェクターリガンドに対する抗体の親和性が変更されるが、親抗体の抗原結合能力を抗体が保持するように、アミノ酸残基234、235、236、237、297、318、320および322から選択される1または複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。親和性が変更されるエフェクターリガンドは、例えば、Fc受容体または補体のC1成分であり得る。このアプローチは、ともにWinterらによる米国特許第5,624,821号および第5,648,260号にさらに詳細に記載されている。別の例では、抗体のC1q結合が変更され、かつ/または補体依存性細胞傷害作用(CDC)が低減もしくは廃止されるようにアミノ酸残基329、331および322から選択される1または複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。このアプローチは、Idusogieらによる米国特許第6,194,551号にさらに詳細に記載されている。別の例では、CH2ドメインのN末端領域中の231位〜238位のアミノ酸内の1または複数のアミノ酸残基を変更し、そのことにより、補体と結合する抗体の能力を変更する。このアプローチは、BodmerらによるPCTパンフレットWO94/29351にさらに記載されている。なお別の例では、以下の位置での1もしくは複数のアミノ酸を改変することによりFc領域を改変して、抗体依存性細胞傷害作用(ADCC)を媒介する抗体の能力を増加させ、かつ/またはFcγ受容体に対する抗体の親和性を増加させる:238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438または439。このアプローチは、PrestaによるPCTパンフレットWO00/42072にさらに記載されている。
抗体またはその断片であって、ヒト重鎖定常領域が、ヒトIgG4(IGHG4)からのCH1領域、ヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域を含むアイソタイプバリアントを含み、ヒンジ領域が、228位のセリンからプロリンへの置換を含む、抗体またはその断片も提供する。好ましくは、アイソタイプバリアントを含むヒト化抗体は、全長抗体である。ヒトIgG4(IGHG4)からのCH1と、S228P置換を有するヒトIgG4(IGHG4)からのヒンジと、ヒトIgG4(IGHG4)からのCH2およびCH3とを含むアイソタイプバリアントを含む、ヒトOX40と結合する特に好ましいヒト化抗体またはその断片は、配列番号57のアミノ酸配列を含む重鎖配列と、配列番号47のアミノ酸配列を含む軽鎖配列とを含む。アイソタイプバリアントは、ヒトIgG1(IGHG1)(これは、通常、天然のヒトIgG1である)からのヒト重鎖定常領域を含む、ヒトOX40と結合する拮抗性抗体またはその断片と比較して、すなわち改変された重鎖定常領域に関してアイソタイプバリアントから異なるだけである、ヒトOX40と結合する拮抗性抗体またはその断片と比較して、ADCCのようなFc媒介性細胞傷害作用機序を示さないことが見出されている。
体と結合するペプチドは、例えば質量分析により同定できる。別の例では、NMR分光法またはX線結晶学を用いて、本発明の抗体と結合するエピトープを同定できる。一端同定されると、本発明の抗体と結合するエピトープ断片を、所望により、免疫原として用いて、同じエピトープと結合するさらなるアンタゴニスト抗体を得ることができる。
例えばELISA、BIAcore(登録商標)、ウェスタンブロット、RIAおよびフローサイトメトリー分析を含む、例えばヒトOX40に対する抗体の結合能力を評価するための標準的なアッセイは、当技術分野において知られている。適切なアッセイは、実施例に詳細に記載する。抗体の結合動態(例えばKDのような結合親和性)も、スキャッチャードまたはBIAcore(登録商標)システム分析によるなどの当技術分野において知られる標準的なアッセイにより評価できる。相対的結合親和性Kiは、当技術分野に
おいて知られる標準的な競合アッセイにより評価できる。
特に単離形のヒトOX40と結合する拮抗性抗体またはその断片を提供する。OX40受容体を用いる親和性測定に関する「1価」は、本明細書で用いる場合、例えばドメインがアミノ末端にて免疫グロブリンFc部分と融合する場合のように人工的に2量体化または多量体化されていない、細胞外ドメインのようなヒトOX40受容体ドメインのことをいう。好ましい態様では、本発明は、対応するキメラ抗体のOX40結合親和性(KD)の
少なくとも75%を保持するヒト化抗体またはその断片を提供する。好ましくは、ヒト化抗体またはその断片は、対応するキメラ抗体と等価な親和性でヒトOX40と結合する。「等価な親和性」は、対応するキメラ抗体のOX40結合親和性の±10%の範囲内である親和性の値を意味する。より具体的には、本発明は、対応するキメラ抗体より高い親和性でヒトOX40と結合するヒト化抗体またはその断片を提供する。本発明の好ましい態様では、例えば、実施例5および6に詳細に記載し、図4で説明するように、分析物として用いる組換え1価ヒトOX40受容体細胞外ドメイン(配列番号11)を有するプロテインA結合CM5研究グレードセンサチップ(GE Healthcare Europe GmbH、Glattbrugg、Switzerland;BR−1000−14
)上に抗体を捕捉することにより、BIAcore(登録商標)装置(GE Healthcare Europe GmbH、Glattbrugg、Switzerland)で表面プラズモン共鳴(SPR)により測定される、110nM以下、好ましくは100nM以下、より好ましくは90nM以下、より好ましくは80nM以下、さらにより好ましくは70nM以下の結合親和性(KD)を有する、ヒトOX40と結合する拮抗性抗
体またはその断片が提供される。
性障害に罹患している患者の処置のための、ヒトOX40と結合する拮抗性ヒト化抗体を提供する。さらに、患者は、OX40の発現レベルが低いことがある。好ましくは、ヒトOX40と結合する拮抗性ヒト化抗体は、IgG1(IGHG1)領域を含む。より好ましくは、ヒトOX40と結合する拮抗性ヒト化抗体は、非フコシル化IgG1領域を含む。
本開示は、ヒトOX40と結合する抗体およびその断片をコードする単離核酸、ベクターおよび核酸またはベクターを含む宿主細胞も提供する。核酸は、細胞全体、細胞溶解物または部分的に精製もしくは実質的に精製された形で存在することがある。核酸は、アルカリ/SDS処理、CsClバンド分け、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当技術分野においてよく知られている他のものを含む標準的な技法により、他の細胞構成成分または他の混入物、例えば他の細胞性核酸またはタンパク質から精製分離された場合に、「単離」または「実質的に純粋に」されている。例えばF.Ausubelら編(1987)Current Protocols in Molecular
Biology、Greene Publishing and Wiley Interscience、New Yorkを参照されたい。本発明の核酸は、例えば、DNAまたはRNAであり得、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。好ましい実施形態では、核酸は、cDNA分子である。
酸を宿主細胞に導入する方法は、当技術分野においてよく知られており、用いる宿主により変動する。技法は、それらに限定されないが、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、塩化カルシウム処理、ポリエチレンイミン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルスまたはファージ感染、リポソームへのポリヌクレオチド(複数可)の封入、および核へのDNAの直接マイクロインジェクションを含む。哺乳動物細胞の場合、トランスフェクションは一過性または安定性のいずれかであってよい。
EAら、既出を参照されたい)、これらの領域を包含するDNA断片は、標準的なPCR増幅により得ることができる。好ましい実施形態では、軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域、好ましくはカッパ定常領域であり得る。scFv遺伝子を創出するために、VHおよびVLをコードするDNA断片を、フレキシブルリンカーをコードする、例
えばアミノ酸配列(Gly4−Ser)3をコードする別の断片に作動可能に連結して、VLおよびVH領域がフレキシブルリンカーによりつながれた連続単鎖タンパク質としてVHおよびVL配列が発現できるようにする(例えばBird REら、(1988)Science、242:423〜426頁;Huston JSら、(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85:5879〜83頁;McCafferty Jら、(1990)Nature、348:552〜554頁を参照されたい)。抗体の抗体断片生成のために様々な技法が開発されている。伝統的に、これらの断片は、インタクト抗体のタンパク質分解消化により導かれた(例えばMorimoto Kら、(1992)J.Biochem.&Biophysical Methods、24:107〜117頁およびBrennan Mら、(1985)Science、229:81〜3頁を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在、組換え宿主細胞により直接生成できる。例えば、抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリーから単離できる。代わりに、Fab’−SH断片は、E.coliから直接回収でき、化学的にカップリングさせてF(ab’)2断片を形成できる(Carter Pら、(1992)Bi
o/Technology、10:163〜167頁)。別のアプローチによると、F(ab’)2断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離できる。抗体断片の生成のための他の技法は、当業者にとって明らかである。別の実施形態では、選択される抗体は、単鎖Fv断片(scFv)である。例えばWO1993/16185;米国特許第5,571,894号および米国特許第5,587,458号を参照されたい。抗体断片は、例えば米国特許第5,641,870号に例えば記載される「直鎖抗体」であってもよい。
およびneo遺伝子(G418選択のため)を含む。
harp PA(1982)J.Mol.Biol、159:601〜621頁に記載されるようにDHFR選択可能マーカーとともに用いられる)、NSO骨髄腫細胞、COS細胞およびSP2細胞を含む。特に、NSO骨髄腫細胞とともに用いるために、別の好ま
しい発現系は、WO87/04462(Wilson)、WO89/01036(Bebbington)およびEP338841(Bebbington)に開示されるGS遺伝子発現系である。組換え抗体遺伝子を哺乳動物宿主細胞に導入した場合、抗体は、宿主細胞中での抗体の発現を可能にするためまたはより好ましくは宿主細胞が成長する培養培地への抗体の分泌を可能にするために十分な期間、宿主細胞を培養することにより生成される。ヒトOX40と結合する抗体を生成するために有用な宿主細胞は、様々な培地で培養できる。ハムF10(Sigma−Aldrich Chemie GmbH、Buchs、Switzerland)、最少必須培地(MEM;Sigma−Aldrich
Chemie GmbH)、RPMI−1640(Sigma−Aldrich Chemie GmbH、Basel、Switzerland)およびダルベッコ改変イーグル培地(DMEM;Sigma−Aldrich Chemie GmbH)など市販で入手可能な培地は、宿主細胞の培養のために適切である。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培養培地から回収できる。
OX40ポリペプチドに対して作製された抗体は、よく知られており日常的なプロトコールを用いて、動物の免疫化、すなわち動物、好ましくは非ヒト動物へのポリペプチドの投与によりにより得ることができる。例えばHandbook of Experimental Immunology(Weir DM(編)、第4巻、Blackwell
Scientific Publishers、Oxford、England、1986)を参照されたい。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダまたはブタなどの多くの温血動物を免疫できる。しかし、マウス、ウサギ、ブタおよびラット、特にマウスは、一般的に最も適切である。抗体は、当業者に知られる組換えDNA技法によっても生成できる。さらに、抗体は、自然に存在する抗体の酵素または化学的切断により生成できる。本発明のヒト化抗体は、非ヒト動物(例えばマウス)からのVHおよび/またはVL領域からの1もしくは複数のCDRまたはその一部を、ヒトVHおよび/またはVL領域からの1または複数のフレームワーク領域に移行することにより構築できる。場合によって、このようにVHおよび/またはVL領域中に存在するヒトフレームワーク残基は、抗体の免疫原性を減少させ、かつ/または結合親和性を維持するために必要または所望される場合に、対応する非ヒト(例えばマウス)残基で置き換えることができる。場合によ
って、CDR中に存在する非ヒトアミノ酸残基は、ヒト残基で置き換えてよい。本発明のキメラまたはヒト化抗体は、上記のようにして調製した非ヒトモノクローナル抗体の配列に基づいて調製できる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするDNAは、対象の非ヒトハイブリドーマから得て、非マウス(例えばヒト)免疫グロブリン配列を含有するように、標準的な分子生物学的技法を用いて工学改変できる。例えば、キメラ抗体を創出するために、当技術分野において知られる方法を用いて、マウス可変領域をヒト定常領域に連結できる(例えばCabillyらへの米国特許第4,816,567号を参照されたい)。ヒト化抗体を創出するために、当技術分野において知られる方法を用いて、マウスCDR領域をヒトフレームワークに挿入できる(例えばWinterへの米国特許第5,225,539号、Queenらへの米国特許第5,530,101号;第5,585,089号;第5,693,762号および第6,180,370号を参照されたい)。
は全長軽鎖および重鎖をコードするDNAを、標準的な分子生物学的技法を用いて得て(例えばPCR増幅または対象の抗体を発現するハイブリドーマを用いるcDNAクローニング)、DNAを発現ベクターのようなベクターに挿入できる。発現ベクターおよび発現制御配列は、用いる発現宿主細胞に適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を別々のベクターに挿入できるか、またはより典型的には、両方の遺伝子を同じ発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子を発現ベクターに、標準的な方法により挿入する(例えば抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しないならば平滑端ライゲーション)。本明細書に記載する抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用いて任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を創出でき、このことは、VHセグメントがベクター内のCH1セグメント(複数可)に作動可能に連結し、VKセグメントがベクター内のCKセグメントに作動可能に連結するように、所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域を予めコードする発現ベクターに本明細書に記載する抗体の軽鎖および重鎖可変領域を挿入することによる。
抗体についてのスクリーニングを、ヒトOX40との結合を測定するためのアッセイおよび/またはOX40とそのリガンドであるOX40Lとの結合を阻止する能力を測定するためのアッセイを用いて行うことができる。結合アッセイの例は、特に、プレート上に固定化されたヒトOX40とヒトFcとの融合タンパク質を用い、融合タンパク質と結合した抗OX40抗体を検出するためのコンジュゲート2次抗体を採用するELISAである。阻止アッセイの例は、ヒトCD4細胞上のOX40へのOX40リガンド融合タンパク質結合の阻止を測定する、フローサイトメトリーに基づくアッセイである。蛍光標識2次抗体を用いて、細胞と結合するOX40リガンド融合タンパク質の量を検出する。このアッセイは、上清中の抗体が、OX40とリガンド融合タンパク質との結合を阻止するにつれてのシグナルの低減を求める。阻止アッセイのさらなる例は、プレートを被覆するOX40リガンド融合タンパク質が媒介するナイーブヒトT細胞の共刺激の阻止を、チミジン取り込みを測定することにより測定するアッセイである。抗OX40抗体の機能的活性、例えばT細胞活性化の低減を評価するためのアッセイとして、実施例3および8に記載するヒト混合リンパ球反応(MLR)を用いることができる。本発明の抗体は、当業者に知られる様々な方法で単離または精製できる。標準的な精製方法は、大気圧またはFPLCおよびHPLCのようなシステムを用いて高圧で行う、イオン交換、疎水性相互作用、親和性、サイズ分けまたはゲルろ過および逆相を含むクロマトグラフィー技法を含む。精製方法は、電気泳動、免疫学的、沈降、透析および等電点電気泳動の技法も含む。タンパク質濃縮とともに限外ろ過およびダイアフィルトレーション技法も有用である。OX40抗体を精製するために、選択された宿主細胞を、例えばモノクローナル抗体精製のためにスピナーフラスコ中で成長させることができる。上清をろ過し、濃縮した後に、プロテインA−セファロース(Pharmacia、Piscataway、NJ)を用いて親和性クロマトグラフィーを行う。溶出された抗体をゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーにより確認して、純度を確認できる。本発明の好ましい抗体は、よって、ヒトOX40と結合する単離および/または精製抗体である。
別の態様では、本発明は、細胞毒、薬物(例えば免疫抑制剤)または放射性毒素のような治療剤に連結した、ヒトOX40と結合するアンタゴニストOX40抗体またはその断片を提供する。このようなコンジュゲートは、本明細書において、「イムノコンジュゲート」という。1または複数の細胞毒を含むイムノコンジュゲートは、「免疫毒素」という。細胞毒または細胞傷害性薬剤は、細胞に有害な(例えば死滅させる)任意の薬剤を含む。例は、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサント
ロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにそれらの類似体またはホモログを含む。治療剤は、例えば、代謝拮抗薬(例えばメトトレキセート、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、シタラビン、5−フルオロウラシルデカルバジン)、アルキル化剤(例えばメクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンCならびにシス−ジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えばダウノルビシン(以前のダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えばダクチノマイシン(以前のアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン(AMC))および有糸***阻害剤(例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン)も含む。本発明の抗体と連結できる治療用細胞毒の他の例は、デュオカルマイシン、カリチアマイシン、マイタンシンおよびオーリスタチン、ならびにそれらの誘導体を含む。カリチアマイシン抗体コンジュゲートの例は、市販で入手可能である(Mylotarg(登録商標);American Home Products)。細胞毒は、本発明の抗体と、当技術分野において利用可能なリンカー技法を用いて連結できる。細胞毒と抗体とをコンジュゲートするために用いられているリンカーの型の例は、それらに限定されないが、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィドおよびペプチド含有リンカーを含む。例えばリソソーム区画内の低pHによる切断に感受性またはカテプシン(例えばカテプシンB、C、D)のような腫瘍組織において優先的に発現されるプロテアーゼのようなプロテアーゼによる切断に感受性であるリンカーを選択できる。細胞毒の型、リンカーおよび治療剤と抗体をコンジュゲートする方法についてのさらなる議論について、Saito Gら、(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55:199〜215頁;Trail PAら、(2003)Cancer Immunol.Immunother.52:328〜337頁;Payne G(2003)Cancer Cell、3:207〜212頁;Allen TM(2002)Nat.Rev.Cancer,2:750〜763頁;Pastan IおよびKreitman RJ(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs、3:1089〜1091頁;Senter PDおよびSpringer CJ、(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53:247〜264頁も参照されたい。本発明の抗体は、放射活性同位体に連結して、ラジオイムノコンジュゲートともよばれる細胞傷害性放射性医薬品を作製することもできる。診断または治療用に用いるために抗体とコンジュゲートできる放射活性同位体の例は、それらに限定されないが、ヨウ素131、インジウム111、イットリウム90およびルテニウム177を含む。ラジオイムノ
コンジュゲートを調製するための方法は、当技術分野において確立されている。ラジオイムノコンジュゲートの例は、Zevalin(登録商標)(EDEC Pharmaceuticals)およびBexxar(登録商標)(Corixa Pharmaceuticals)を含んで市販で入手可能であり、同様の方法を用いて、本発明の抗体を用いてラジオイムノコンジュゲートを調製できる。本発明の抗体イムノコンジュゲートを用いて所定の生物学的応答を改変でき、薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってよい。このようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素もしくはジフテリア毒素のような酵素活性毒素またはその活性断片;腫瘍壊死因子もしくはインターフェロン−γのようなタンパク質;あるいは例えばリンホカイン、インターロイキン−1(「IL−1」)、インターロイキン−2(「IL−2」)、インターロイキン−6(「IL−6」)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(「GM−CSF」)、顆粒球コロニー刺激因子(「G−CSF」)もしくは他の増殖因子のような生物学的応答改変物質を含むことがある。
nal Antibodies And Cancer Therapy、Reisfeldら(編)、243〜56頁(Alan R.Liss,Inc.1985)中のArnonら、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」;Controlled Drug Delivery(第2版)、Robinsonら(編)、623〜53頁(Marcel Dekker,Inc.1987)中のHellstromら、「Antibodies For Drug Delivery」;Monoclonal Antibodies’84:Biological And Clinical Applications、Pincheraら(編)、475〜506頁(1985)中のThorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review」;Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、Baldwinら(編)、303〜16頁(Academic Press 1985)中の「Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」ならびにThorpe PEおよびRoss WC(1982)Immunol.Rev.62:119〜58頁を参照されたい。
別の態様では、本発明は、本発明のアンタゴニスト抗体またはその断片と薬学的に許容される担体とを含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。このような組成物は、1もしくは組み合わせ(例えば2以上の異なる)抗体、および/または本発明のイムノコンジュゲート、および/または上記のような細胞毒、薬物(例えば免疫抑制剤)もしくは放射性毒素のような治療剤を含むことがある。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープと結合するか、または相補的な活性を有する抗体の組み合わせ(またはイムノコンジュゲート)を含み得る。本発明の医薬組成物は、併用治療において投与することもでき、すなわち他の薬剤と組み合わせることができる。例えば、併用治療は、少なくとも1つの他の抗炎症剤または免疫抑制剤と組み合わせた本発明のアンタゴニストOX40抗体を含み得る。
載している。
本発明のアンタゴニスト抗体は、OX40媒介性障害の診断および処置を含む、多数のin vitroおよびin vivoの診断および治療用の利用性がある。例えば、これらの分子は、in vitroもしくはex vivoで培養中の細胞に、または例えばin vivoでヒト対象に投与して、様々なOX40媒介性障害を処置、防止および診断できる。好ましい対象はヒトであり、OX40活性により媒介される障害(OX40媒介性障害)を有する患者を含む。本発明のアンタゴニスト抗体は、患者のOX40共刺激状態とは独立して、患者を処置するために効果的であり得る。より好ましい対象はヒトであり、低レベルのOX40を発現する患者を含む。
性障害を処置するための方法であって、対象に治療有効量のアンタゴニスト抗体またはその断片を投与するステップを含む方法を提供する。例示的なOX40媒介性障害は、感染症(ウイルス、細菌、真菌および寄生虫)、感染症に伴う内毒素ショック、関節炎、関節リウマチ、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒合、脳卒中、I型糖尿病、ライム病、関節炎、髄膜脳炎、自己免疫性ぶどう膜炎、中枢および末梢神経系の免疫媒介性炎症性障害、例えば多発性硬化症、ループス(例えば全身性エリテマトーデス)およびギラン−バレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化胞隔炎、グレーブス病、IgA腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、膵炎、外傷(手術)、移植片対宿主疾患(GVHD)、移植片拒絶、虚血性疾患を含む心血管疾患、例えば心筋梗塞およびアテローム動脈硬化症、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節症、歯周炎、低酸症ならびに視神経脊髄炎を含む。
リーニング方法であって、
(a)患者血液試料から末梢血単核細胞(PBMC)を精製するステップと、
(b)PBMCをフローサイトメトリー分析に供するステップと、
(c)CD4+および/またはCD8+T細胞中のOX40陽性細胞の数を決定し、前記数を対照レベルと比較するステップと
を含む方法も提供する。
本開示の別の実施形態では、OX40媒介性障害の処置のための、本発明のアンタゴニスト抗体もしくはその断片、組成物またはイムノコンジュゲートを含む製造品が提供される。製造品は、容器と、容器上のまたは容器に付随するラベルまたは添付文書を含むことがある。適切な容器は、例えば瓶、バイアルまたはシリンジを含む。容器は、ガラスまたはプラスチックのような様々な材料から形成してよい。容器は、状態を処置するために効果的であり得る組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有することがある(例えば容器は、皮下注射針が突き刺すことができるストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも1つの活性物質は、本明細書に記載するアンタゴニスト抗体であってよい。ラベルまたは添付文書は、組成物を、がんのような所望の状態を処置するために用いることができることを示してよい。一実施形態では、ラベルまたは添付文書は、アンタゴニスト抗体を含む組成物を用いてOX40媒介性障害を処置できることを示してよい。
先行する項において記載する任意の補助治療であってよい(例えば血栓溶解剤、血小板凝集抑制薬、化学療法剤、血管新生抑制薬、抗ホルモン化合物、心臓保護剤および/またはサイトカインを含む、哺乳動物における免疫機能の調節物質)。代わりにまたはさらに、製造品は、注射用の静菌水(BWFI)、リン酸塩緩衝食塩水、リンゲル液およびブドウ糖液のような薬学的に許容される緩衝液を含む第2(または第3)容器をさらに含んでよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針およびシリンジを含む、商業的および使用者の視点から望まれる他の物質をさらに含んでよい。
組換えヒトOX40−Fcタンパク質を生成するために、ヒトTNFRSF4についてのcDNAをimaGenes(クローン番号:RZPDB737H0329D;Berlin、Germany)から購入した。このcDNAを鋳型として用いて、ヒトTNFRSF4細胞外ドメインのDNAコード領域(配列番号11)をPCR増幅した。別のPCR反応では、ヒトIgG1のFc領域(EU位223〜451)をPCRにより増幅して、5’GSGGGリンカーおよび3’SA−6×Hisリンカーならびにクローニングのための制限部位を付加した。2つの得られた産物を、次いで、フランキングプライマーを用いるオーバーラップ伸長PCRを用いて融合して、米国特許第5924939号に記載されるIgドナーアクセプター断片(第1イントロン)を有するヒトCMVプロモーター、OriP配列(Koons MDら、(2001)J Virol.75(22):10582〜92頁)、SV40エンハンサーおよびKim Dら、(2003)Biotechnol.Prog.19(5):1620〜2頁に記載されるガストリンターミネーターと融合したSV40ポリAを含有する、InvitrogenからのpcDNA3.1(−)プラスミドに基づく改変哺乳動物発現ベクター(Invitrogen AG、Basel、Switzerland、Cat.No.V795−20)への後続のクローニングのための制限部位を付加した。この組換えプラスミドは、哺乳動物細胞でのヒトTNFRSF4細胞外ドメイン−Fc融合タンパク質の発現と、ヒトTNFRSF4タンパク質の天然のシグナルペプチドにより駆動される細胞培養培地への分泌とを可能にした。組換えタンパク質生成のために、上記の組換えベクターを懸濁馴化HEK293細胞(ATCC番号CRL1573)に、jetPEI(商標)トランスフェクション試薬(Polyplus−transfection S.A.、Strasbourg、France;流通業者:Brunschwig、Basel、Switzerland)を用いてトランスフェクトした。細胞培養上清を5日後に回収し、AKTA FPLCシステム(GE Healthcare Europe GmbH、Glattbrugg、Switzerland)上で操作されるプロテインA親和性精製カラム(HiTrapプロテインAセファロースカラム;GE Healthcare Europe GmbH、Glattbrugg、Switzerland)を用いてさらに精製した。
外領域(配列番号11)をPCRにより増幅して、3’GSG−6×Hisリンカーおよびクローニングのための制限部位を付加した。PCR産物を、その後、上記の改変pcDNA3.1(−)プラスミドにクローニングした。この組換えプラスミドは、哺乳動物細胞でのヒトOX40−hisタンパク質の発現と、ヒトTNFRSF4タンパク質の天然のシグナルペプチドにより駆動される細胞培養培地への分泌とを可能にした。タンパク質生成のために、組換えベクターを懸濁馴化HEK293細胞(ATCC番号CRL1573)に、jetPEI(商標)トランスフェクション試薬(Polyplus−transfection S.A.、Strasbourg、France;流通業者:Brunschwig、Basel、Switzerland)を用いてトランスフェクトした。細胞培養上清をトランスフェクションの5日後に回収し、AKTA FPLCシステム(GE Healthcare Europe GmbH、Glattbrugg、Switzerland)上で操作されるNi2+−NTA親和性精製カラム(HiTrap Ni2+−NTAセファロースカラム;GE Healthcare Europe GmbH、Glattbrugg、Switzerland)を用いて精製した。組換えヒトOX40−FcおよびOX40−hisタンパク質は、SDS−PAGEにより判断して95%純粋であることが見出され、使用前にリン酸塩緩衝食塩水(PBS)に緩衝液をさらに交換した。
、Switzerland)、HAT(Sigma−Aldrich Chemie GmbH、Buchs、Switzerland)および1%増殖因子(ハイブリドカイン、Interchim/Uptima、Montlucon、France)を補ったDMEM−10培地(Invitrogen AG、Basel、Switzerland)中にマウスマクロファージを含有する、96ウェル平底プレートに播種した。
陽性選択したそれぞれのハイブリドーマについて、トータルRNAを調製し、cDNAに逆転写し、VHおよびVL遺伝子をそれぞれPCRにより増幅した。これらのPCR産物を、レスキューベクター(pDriveベクター;QIAGEN AG、Hombrechtikon、Switzerland;Cat.No.231124)にライゲーションして、個別のPCR産物のDNA配列決定および選択したハイブリドーマの単クローン性または多クローン性の決定を可能にした。このベクターにより、IPTGおよびX−galを含有するLB寒天プレート上での青/白の選択が可能になった(LacZαペプチドによるX−galの分解のために、挿入断片を有さないコロニーは青色であった)。陽性(白)細菌クローンから組換えプラスミドを調製し、ベクター主鎖に特異的な標準的DNA配列決定プライマー(M13rev、M13fwd、T7またはSP6)を用いて配列決定した。DNA配列を、最終的に、哺乳動物細胞での対象の抗体の組換え発現のために発現ベクターにサブクローニングした。
トータルRNAを、2〜10×106細胞から、QIAGENからのRNeasyミニ
キット(QIAGEN AG、Hombrechtikon、Switzerland;Cat.No.74106)を製造者のプロトコールに従って用いて単離した。試料を、NanoDrop ND−1000分光光度計(WITEC AG、Littau、Switzerland)を用いて定量した。
上記のトータルRNA調製物を、cDNAにさらに逆転写し、VHおよびVL断片をPCRにより、縮合プライマーの2つの異なる混合物(それぞれ1つがマウス免疫グロブリン重鎖可変断片および可変重鎖接合領域の全ての異なるサブファミリーの回収、または全てのマウス免疫グロブリン軽鎖カッパ可変断片および可変軽鎖カッパ接合領域の回収を可能にした)を用いて増幅した。逆転写および増幅のために用いたプライマーは、Microsynth(Balgach、Switzerland)により合成され、HPLC精製された(表1〜4)。逆転写およびPCR増幅はともに、QIAGENワンステップRT−PCRキット(QIAGEN AG、Hombrechtikon、Switzerland;Cat.No.210212)を用いて同時に行った。この技法は特異的プライマーを用いたので、それぞれのmRNA試料を、次いで、2重に処理して、VHまたはVL断片のいずれかの個別の逆転写および増幅を可能にした。RNアーゼフリー水に30μlの最終容量で溶解した2μgのトータルRNAを、10μlのQIAGENワンステップRT−PCR緩衝液の5×ストック溶液、2μlのdNTPミックス(10mMの濃度)、3μlのプライマーミックス(10μMの濃度)および2μlのQIAGENワンステップRT−PCR酵素ミックスと混合した。最終混合物を、次いで、PCRチューブ
に入れ、以下の設定を用いてPCRサーモサイクラー(BioRad iCyclerバージョン4.006、Bio−Rad Laboratories AG、Reinach、Switzerland)でサイクルにかけた:
50℃にて30分
95℃にて15分
40サイクル:94℃にて30秒
55℃にて30秒
72℃にて1分
72℃にて10分
4℃にて保持
PCR産物を、2%アガロースゲルに泳動させた。DNA電気泳動の後に、対象の断片(およそ450bp)をアガロースゲルから切り出し、Macherey−Nagel NucloSpin抽出IIキット250(Macherey−Nagel、Oensingen、Switzerland;Cat.No.740609.250)を用いてさらに抽出した。DNA配列決定のために、抽出したPCR産物を上記のレスキューベクター(pDriveベクター、QIAGEN AG、Hombrechtikon、Switzerland;Cat.No.231124)にクローニングし、E.coli TOP10株(Invitrogen AG、Basel、Switzerland;Cat.No.C404006)を形質転換した。
陽性コロニーを、Macherey−Nagel方形ウェルブロックプレート(Macherey−Nagel、Oensingen、Switzerland;Cat.No.740488.24)中に播種し、100μg/mlアンピシリンを補った1.5mlのLuria Bertani(LB)培地中で37℃にて1晩(振とう250RPM)培養した。次の日に、DNAミニプレップ抽出を、NucleoSpinマルチ8プラスミドキット(Macherey−Nagel、Oensingen、Switzerland;Cat.No.740620.5)を用いて行った。
試料を、DNA配列決定のために、DNA配列決定サービス業者であるFasteris(Plan−les−Ouates、Switzerland)に送った。標準的なプライマーであるM13rev、M13fwd、T7、SP6を用いた(表5)。DNA配列を分析するために、クローンマネージャ9プロフェッショナル版(Scientific&Educational Software、NC、USA)およびBioEdit配列アラインメントエディタ(Hall,TA(1999)Nucl.Acids.Symp.Ser.41:95〜98頁)を用いた。
哺乳動物細胞での組換え発現のために、単離マウスVHおよびVL断片を、アセンブリベースのPCR法を用いて、キメラ免疫グロブリンとしてフォーマットした。これらのキメラ抗体は、マウス重鎖可変ドメインがヒトIgG1重鎖定常ドメイン(γ1、ヒンジ、γ2およびγ3領域)と融合した重鎖と、マウス軽鎖可変ドメインがヒトカッパ定常ドメイン(Cκ)と融合した軽鎖とからなる。PCRにより集合させたマウス可変およびヒト定常部分を、その後、実施例1にて言及したが、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパリーダーペプチドを採用してタンパク質分泌を駆動したことが異なるInvitrogenからの改変pcDNA3.1(−)ベクターに基づく改変哺乳動物発現ベクターにクローニングした。免疫グロブリン候補のタンパク質生成のために、等量の重鎖および軽鎖ベクターD
NAを、懸濁馴化HEK−293(ATCC番号:CRL−1573)に同時トランスフェクトした。細胞培養上清を5日後に回収し、AKTA FPLCシステム上で操作されるプロテインA親和性精製カラム(HiTrapプロテインAセファロースカラム)(ともにGE Healthcare Europe GmbH、Glattbrugg、Switzerlandから)を用いて精製した。
OX40特異的抗体検出ELISA:
ハイブリドーマおよび組換え抗体候補による抗体力価、特異性および生成を、直接ELISAにより決定した。簡単に述べると、96ウェルマイクロタイタープレート(Costar USA、流通業者VWR AG、Nyon、Switzerland)をPBS中2μg/mlでの100μlの組換えヒトOX40−hisで被覆した(OX40−hisタンパク質の作製について実施例1を参照されたい)。プレートを4℃にて1晩インキュベートし、次いで、PBS2%BSA(ウシ血清アルブミン、PAA Laboratories、Pasching、Austria)を用いて室温(RT)にて1時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を除去し、ハイブリドーマ上清または精製抗体を加えた。プレートをRTにて30分間インキュベートし、次いで、PBS0.01%Twee
n−20(Sigma−Aldrich Chemie GmbH、Buchs、Switzerland)で9回洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ヤギ抗マウスH+L検出抗体(Sigma−Aldrich Chemie GmbH、Buchs、Switzerland)を1:1000の希釈で加えた。ヒトFcを有する組換えキメラ抗体(実施例2を参照されたい)を検出するために、HRP標識ウサギ抗ヒトIgG抗体(Sigma−Aldrich Chemie GmbH、Buchs、Switzerland)を1:1000の希釈で検出抗体として用いた。プレートを30分間室温(RT)にてインキュベートし、PBS0.01%Tween−20で9回洗浄し、TMB基質(Bio−rad Laboratories AG、Reinach、Switzerland)をプレートに加え、6分後にH2SO4を加えることにより反応を停止した。吸光度を次いで450nmにてマイクロプレートリーダー(Biotek、USA;流通業者:WITTEC AG、Littau、Switzerland)で読み取った。図1Aは、キメラ1D4抗体およびキメラ2F8抗体がOX40−his被覆タンパク質を認識することを示す。
組換えヒトOX40リガンドタンパク質(OX40L)を以下のようにして作製した:ヒトTNFSF4についてのcDNA(クローン名:IOH46203)をimaGenes(Berlin、Germany)から購入し、ヒトTNFSF4リガンドの細胞外部分(アミノ酸51〜183)(番号付けはUniprot Q6FGS4配列に従う)を、フランキング制限部位とともに増幅した。ASAリンカーおよび8−Hisタグ配列を5’端に包含する得られたPCR産物を、その後、CMVプロモーター、ウシ成長ホルモンポリアデニル化およびマウスVJ2Cリーダーペプチドを有して組換えタンパク質の分泌を駆動する、Invitrogen(Invitrogen AG、Basel、Switzerland)からの改変バージョンのpREP4ベクターにクローニングした。組換えタンパク質生成のために、組換えベクターを懸濁馴化HEK293細胞(ATCC番号CRL1573)に、jetPEI(商標)トランスフェクション試薬(Polyplus−transfection S.A.、Strasbourg、France;流通業者:Brunschwig、Basel、Switzerland)を用いてトランスフェクトした。細胞培養上清を5日後に回収し、AKTA FPLCシステム(GE Healthcare Europe GmbH、Glattbrugg、Switzerland)上で操作されるプロテインA親和性精製カラム(HiTrapプロテインAセファロースカラム;GE Healthcare Europe GmbH、Glattbrugg、Switzerland)を用いて精製した。
TEC AG、Littau、Switzerland)で読み取った。図1Bは、キメラ1D4抗体がOX40とOX40Lとの間の相互作用を用量依存的様式で阻止できるが、キメラ2F8抗体はOX40とOX40Lとの間の相互作用を阻止できないことを示す。
2名の異なるドナーからの血液を、クエン酸塩を抗凝固剤として含む3本の10mL S−Monovette(Sarstedt、Numbrecht、Germany)に回収した。ドナー第1号からの細胞をエフェクター細胞として用い、ドナー第2号からの細胞を標的細胞として用いた。2名のドナーからのPBMC(末梢血単核細胞)を、製造者の使用説明に従って50mL Blood−Sep−Filterチューブ(流通業者:Brunschwig、Basel、Switzerland)を用いて精製した。細胞を、FBSを含まないロズウェルパーク記念研究所(RPMI、PAA Laboratories、Pasching、Austria)培地で2回洗浄した。標的細胞を、50μg/mlのマイトマイシンC(Sigma−Aldrich Chemie GmbH、Buchs、Switzerland)と37℃にて30分間インキュベートした。細胞を、次いで、FBSを含まないRPMIで3回洗浄し、RPMI、10%FBS(PAA Laboratories、Pasching、Austria)、2mM L−グルタミン(Lonza、Leuven、Belgium)、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン(Biochrom AG、Berlin、Germany)中に1×106細胞/mLにて再懸濁した。96ウェルU底マイクロプレ
ート(TPP、Trasadingen、Switzerland)中に、50’000の標的細胞および80’000のエフェクター細胞を、各ウェルに100μlの最終容量で分配した。100μlの抗体希釈物をウェルに加えた。プレートを37℃にて5%CO2インキュベータ中で7日間インキュベートした。MLRの開始の7日後に、0.5μC
iの3Hチミジン(Perkin Elmer)で細胞をパルスした。パルスの18時間
後に、細胞を採集し、取り込まれた放射活性を、Wallacベータカウンタで定量した。図2は、キメラ1D4抗体が陽性対照よりも高い程度までMLRを用量依存的な様式で阻止できることを示す。
ヒト細胞
ヒト白血球を含有するフィルタを、La Chaux−de−Fonds、Switzerlandの血液採取センター(Centre de Transfusion Sanguine et Laboratoire de Serologie、rue Sophie−Mairet 29、CH−2300)から回収した。細胞を、10U/mLのリケミン(Drossapharm AG、Lucern、Switzerland)を含有する60mLのPBSを逆に流すことによりフィルタから取り出した。PBMCを、次いで、製造者の使用説明に従って50mL Blood−Sep−Filterチューブ(流通業者:Brunschwig、Basel、Switzerland)を用いて精製した。細胞を、FBS(PAA Laboratories、Pasching、Austria)を含むロズウェルパーク記念研究所(RPMI、PAA Laboratories、Pasching、Austria)培地で3回洗浄した。細胞を、3×106細胞/mlにて、24ウェルプレート(TPP、Trasadingen、Sw
itzerland)中で、RPMI、10%FBS(PAA Laboratories、Pasching、Austria)、2mMウルトラグルタミン(Lonza、Leuven、Belgium)、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン(Biochrom AG、Berlin、Germany)、10μg/m
lのフィトヘマグルチニン(PHA;Sigma−Aldrich Chemie GmbH、Buchs、Switzerland)+100U/mLのrHu IL−2(プロリュウキン、Novartis、Basel、Switzerland)に再懸濁した。48時間後に、細胞を回収し、以下に記載するようにしてフローサイトメトリーにより分析した。
GmbH、Braunschweig、Germanyから)を、RPMI、10%FBS中で培養した。2×105細胞を、96ウェルV底プレート(TPP、Trasad
ingen、Switzerland)に分配し、1300rpmにて3分間遠心分離した。上清を捨て、細胞を回収し、以下に記載するようにしてフローサイトメトリーにより分析した。
カニクイザルからの全血(Eric Rouiller教授、Laboratory of Neurophysiology、University of Fribourg、Fribourg、Switzerlandから得た)を、クエン酸塩チューブ(BD Biosciences、Allschwil、Switzerland)に回収した。2mLのPBSを3mLの血液と混合し、混合物を、10mlの85:15のフィコール:PBS混合物(GE Healthcare Europe GmbH、Glattbrugg、Switzerland)の頂部に重層した。試料を室温にて休止せずに20分間遠心分離した。PBMC層を回収し、PBSで3回洗浄した。細胞を3×106
細胞/mLにてダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、PAA Laboratories、Pasching、Austria)、10%FBS(PAA Laboratories、Pasching、Austria)、非必須アミノ酸(PAA Laboratories、Pasching、Austria)、1mMピルビン酸ナトリウム(PAA Laboratories、Pasching、Austria)、2mMウルトラグルタミン(Lonza、Belgium)、100U/mlペニシリン(Biochrom AG、Germany)、100μg/mlストレプトマイシン(Biochrom AG、Germany)に再懸濁した。1mLの細胞懸濁液を24ウェルプレート(TPP、Trasadingen、Switzerland)に分配し、10ug/mlのPHA(PHA/M、Sigma−Aldrich Chemie GmbH、Buchs、Switzerland)、100U/mLのrHu IL−2(プロリュウキン、Novartis、Basel、Switzerland)を加えた。細胞を50時間、37℃にて、5%CO2インキュベータ中でインキュベートした。活性化PBMC
を回収し、PBS/2.5%FBS(FACS緩衝液)に再懸濁した。50μlのFAC
S緩衝液中の5000細胞を96ウェルV底プレートに分配し、ビオチン化抗ヒトOX40−キメラ1D4抗体またはビオチン化アイソタイプ対照抗体またはビオチン化した、ヒツジで産生させた市販の抗ヒトOX40(BD Biosciences、Allschwil、Switzerland)をウェルに25μg/mlにて加えた。試料を氷上で20分間インキュベートし、次いで、細胞を冷FACS緩衝液で2回洗浄し、1:20希釈でのストレプトアビジン−PE(BD Biosciences、Allschwil、Switzerland)と氷上で15分間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液で1回洗浄し、次いで、300μlのFACS緩衝液に再懸濁した。2μlの容量のヨウ化プロピジウム(PI;Sigma−Aldrich Chemie GmbH、Buchs、Switzerland)を各試料に加えて、死滅細胞を除外した。細胞を、フローサイトメトリーにより分析した(Cyan、Beckman Coulter International S.A.、Nyon、Switzerland)。
動的結合親和性定数(KD)を、プロテインA捕捉抗体上で、実施例1に記載するような組換えヒスチジンタグ付加ヒトOX40受容体細胞外ドメインを分析物として用いて測定した。測定は、BIAcore 2000(GE Healthcare−BIAcore、Uppsala、Sweden)で室温にて行い、BiaEvaluationソフトウェア(BIAcore;v4.1)を用いて分析した。
NaCl、EDTA 3mM、0.005%サーファクタントP20、pH7.4)中で15nMの最終濃度まで希釈した。10μlのこの希釈ストックを、続いて、プロテイ
ンA CM5チップの流路2に、200〜250RUに達するまで注入した(30μl/分)。この捕捉ステップの後に、組換えヒスチジンタグ付加ヒトOX40受容体細胞外ドメインを異なる濃度(50nM〜0.4μM)にて流路1および2(流路1は参照として用いる)に30μl/分の流速で注入した。それぞれの結合事象の後に、表面を、グリシン緩衝液pH1.5を1分間注入することにより(10μl/分)再生した。
ヒトアクセプターフレームワーク、逆突然変異ならびにヒトCDRグラフト化アクセプターフレームワークの結合特性を実質的に保持および/または改善する変異の選択を含む、抗ヒトOX40マウス抗体1D4のヒト化について本明細書に記載する。
相同性一致を用いて、1D4 CDRにグラフトするヒトアクセプターフレームワークを選択した。データベース、例えばヒトおよびマウスの免疫グロブリン遺伝子座からの生殖系列可変遺伝子のデータベース(IMGTデータベース(the international ImMunoGeneTics information system(登録商標);Lefranc MPら、(1999)Nucleic Acids Res.27(1):209〜12頁;Ruiz Mら、(2000)Nucleic Acids Res.28(1):219〜21頁;Lefranc MP(2001)Nucleic Acids Res.29(1):207〜9頁;Lefranc MP(2003)Nucleic Acids Res.31(1):307〜10頁;Lefranc MPら、(2005)Dev.Comp.Immunol.29(3):185〜203頁;Kaas Qら、(2007)Briefings in Functional Genomics & Proteomics、6(4):253〜64頁)もしくはVBASE2(Retter Iら、(2005)Nucleic Acids Res.33、データベース版D671〜D674)もしくはKabatデータベース(Johnson Gら、(2000)Nucleic Acids Res.28:214〜218頁)または出版物(例えばKabat EAら、既出)を用いて、マウス重鎖および軽鎖V領域が属するヒトサブファミリーを同定し、アクセプター分子として用いるために最もよくフィットするヒト生殖系列フレームワークを決定できる。アクセプターとして用いるためのこれらのサブファミリー内での重鎖および軽鎖可変配列(VHおよびVL)の選択は、配列相同性および/またはグラフト後に6つのCDRの適当な相対的提示を保存する助けとなるCDR1およびCDR2領域の構造の一致に基づくことができる。
ワークとヒト重鎖可変ドメインサブファミリー2のメンバーとの間の良好な相同性が示される。CDRおよびフレームワーク配列両方の最高の相同性および同一性は、生殖系列配列:IGHV2−70*10(配列番号19)、IGHV2−70*01(配列番号20)、IGHV2−70*13(配列番号21)、IGHV2−5*09(配列番号22)およびIGHV2−70*11(配列番号23)について観察され、これらは全て、CDR3
までの配列全体について73%を超える配列同一性を有した。IGHV2−70*10、
IGHV2−70*01およびIGHV2−70*13は、74%の配列同一性を有し、IGHV2−5*09およびIGHV2−70*11は、それぞれ73.5%および73%の配列同一性を有する。
号24)(65.3%同一)、IGKV1−39*01(配列番号25)(64.9%同
一)、IGKV1D−39*01(配列番号26)(64.9%同一)、IGKV3−1
1*02(配列番号27)(64.2%同一)およびIGKV3−20*01(配列番号28)(62.5%同一)について観察された。
IGKV3−11*01(配列番号24)可変ドメインを、1D4 CDRへのアクセプ
ターとして選択した。IGHV2−70*10は、フレームワーク1領域中での1D4と
の相同性が優れているので、他のヒト重鎖可変ドメインを超えて選択した。
グメント配列を、上記のIMGT検索から同定した。ヒトIGHV2−70*10フレー
ムワーク領域、1D4マウスCDRおよびヒトアクセプターと最良に一致するJHを有する、得られたヒト−マウスハイブリッド重鎖可変配列を、本明細書において、配列番号29を有する重鎖可変ドメインVH1という。同様に、この第1ヒト化抗体候補について用いたヒト−マウスハイブリッド軽鎖可変ドメインは、ヒトIGKV3−11*01フレー
ムワーク領域、1D4マウスCDRおよびヒトアクセプターと最良に一致するJKを有し、本明細書において、配列番号30を有する軽鎖可変ドメインVL1という。VH1およびVL1を包含する第1ヒト化抗体は、本明細書において、VH1/VL1抗体と略記する。
VH1およびVL1についてのコードDNA配列(cDNA)を、scFvフォーマットにおいてGENEART AG(Regensburg、Germany)により合成して、そのことにより、単一DNA配列が両方の可変ドメイン(配列番号31)を包含することを可能にした。個別の可変ドメインcDNAは、このscFv構築物からPCRにより引き出し、PCRアセンブリ技法を用いて、それらのそれぞれの定常ドメインcDNA配列(複数可)の上流でさらに組み立てた。最後に、完全重鎖および軽鎖cDNAを、CMVプロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを有する改変pcDNA3.1ベクター(Invitrogen、CA、USA)に基づく独立ベクターにライゲーションした。軽鎖特異的ベクターは、対象の軽鎖可変ドメインcDNAをカッパ軽鎖定常ドメインcDNAの前にBamHIおよびBsiWI制限酵素部位を用いてライゲーションすることにより、ヒトカッパアイソタイプ軽鎖の発現を可能にしたが、重鎖特異
的ベクターは、工学改変して、対象の重鎖可変ドメインcDNAを、ヒトIGHG1 CH1、IGHG1ヒンジ領域、IGHG1 CH2およびIGHG1 CH3定常ドメインをコードするcDNA配列の前に、BamHIおよびSalI制限酵素部位を用いてライゲーションできるようにした。重鎖および軽鎖両方の発現ベクターにおいて、分泌は、BamHI部位を含有するマウスVJ2Cリーダーペプチドにより駆動した。BsiWI制限酵素部位は、カッパ定常ドメイン中にあり、SalI制限酵素部位は、IGHG1 CH1ドメイン中で見出される。
1D4マウス抗体からのCDRの単純なグラフト化によりヒトOX40と結合しない候補が得られたので(表6および図4)、ヒト残基がマウス残基で置換される突然変異誘発を開始した。このプロセスは逆突然変異とよばれ、モノクローナル抗体のヒト化において最も予測不可能な手順である。これは、親和性を保存し、同時にヒト化抗体における免疫原性の可能性を最小限にするために、保持する必要があるマウス抗体からの重要なフレームワーク残基の同定および選択を必要とする。表7、表8および図5は、マウス抗体フレームワークとヒト抗体フレームワークとの間で異なる残基(Kabat番号付け)を示す。CDRの高次構造または可変ドメイン間充填に影響し得る残基は、抗体親和性に最も高い影響を与え得るので、特に興味の対象である。
によりアッセイした。
ヒト化抗体の耐熱性を、示差走査熱量分析(DSC)を用いて測定した。モノクローナル抗体融解プロファイルは、それらのアイソタイプの特徴である(Garber EおよびDemarest SJ(2007)Biochem.Biophys.Res.Commun.355:751〜7頁)が、FAB断片の中間融解温度は、全長IgGの関係においてさえ容易に同定できる。FAB部分のこのような中間融解温度を用いて、ヒト化候補のモノクローナル安定性をモニタリングした。
ヒト化抗OX40抗体のエピトープの特徴を決定するために、VH6/VL9抗体を、様々なヒト−ラットOX40キメラタンパク質を用いて、ヒトOX40細胞外領域の規定されたドメインにマッピングした。
ラットおよびヒト−ラットOX40タンパク質を、実施例1に記載した方法に従ってFc融合タンパク質としてフォーマットした。ELISAのために、PBS中2μg/mLのOX40タンパク質で、4℃にて1晩、高結合96ウェルプレート(Coastar)
を被覆した。プレートを、PBS2%ウシ血清アルブミン(BSA)でブロッキングした後に、VH6/VL9抗体またはアイソタイプ対照抗体とインキュベートした。プレートを、次いで、洗浄し、ヤギ−抗ヒトIg F(ab’)2断片特異的−HRP(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd、Newmarket、UK)とインキュベートした。洗浄の後に、プレートをTMB基質(Bio−Rad Laboratories AG、Reinach、Switzerland)とインキュベートして、抗体結合を明らかにした。反応を、2M H2SO4を加えることにより停止し、光学密度を450nM(OD 450nM)にて、Synergy HT2分光光度計(Biotek、USA;流通業者:WITTEC AG、Littau、Switzerland)で読み取った。
その起源に関係なく、OX40細胞外領域は、ドメイン1、2、3および4とよばれる4つの構造モジュールに分けられている(Compaan DMおよびHymowitz
SG(2006)Structure、14(8):1321〜30頁)。ヒトOX40の細胞外領域(ヒトTNFRSF4のアミノ酸29〜214、番号付けはUniprot P43489配列に従う)に対応するキメラOX40タンパク質を、4つのドメインの1または複数をヒト配列とラット配列との間で交換することにより構築した。例えば、キメラRHRR OX40タンパク質は、第2ドメインが対応するヒトドメイン配列で置き換えられたラットOX40細胞外領域に対応する。
in vitro免疫反応を抑制するVH6/VL9抗体の効力を、1方向同種混合リンパ球反応(MLR)において試験した。MLRは、アロ反応性T細胞活性化および増殖のin vitroモデルである(O’Flaherty Eら、(2000)Immunology、100(3):289〜99頁;DuPont BおよびHansen JA(1976)Adv.Immunol.23:107〜202頁)。2名の無関係のドナーからの末梢血単核細胞(PBMC)を混合した場合に、T細胞は、同種主要組織適合性(MHC)分子の認識により活性化される。この活性化は、Tリンパ球の増殖をもたらす。MLR反応は、T細胞標的化免疫抑制薬の効果を実証するために広く用いられている(Bromelow KVら、(2001)J.Immunol.Methods、247(1〜2):1〜8頁)。シクロスポリンのような免疫抑制薬は、T細胞活性化を阻害することにより主に働く。VH6/VL9抗体による阻止効果を試験することに加えて、MLRの阻害に対する抗体依存性細胞傷害作用(ADCC)のような細胞傷害性機序の寄与も調べた。VH6/VL9抗体の3つの異なる抗体フォーマット:IGHG1フォーマット(本明細書においてVH6/VL9という)、非フコシル化IGHG1(IgG1)フォーマット(本明細書において非フコシル化VH6/VL9という)およびIGHG
4(IgG4)フォーマット(本明細書においてVH6/VL9 IGHG4 S228Pという)を、このアッセイにおいて試験した。IGHG1(IgG1)抗体は、ADCCのような細胞傷害作用機序について有能であることが知られている。非フコシル化IGHG1抗体は、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)のような細胞傷害性細胞上で発現されるFcγRIIIaに対する親和性がより高いので、ADCC活性の増進を示すことが知られている(Mizushima Tら、(2011)Genes Cells、16(11):1071〜80頁)。対照的に、IGHG4(IgG4)抗体は、ADCCのようなFc媒介性細胞傷害作用機序を有さないことが知られている。
IGHG1 CH1、IGHG1ヒンジ領域、IGHG1 CH2およびIGHG1 CH3定常ドメインをコードするcDNA配列を、実施例6に記載する重鎖特異的ベクター中のIGHG4 CH1、S228P置換を有するIGHG4ヒンジ領域、IGHG4
CH2およびIGHG4 CH3定常ドメインをコードするcDNA配列で置き換えることにより、置換S228Pを有するIGHG4免疫グロブリンフォーマット化を達成した。置換S228Pは、ヒトIGHG4重鎖cDNA鋳型に、標準的なPCR突然変異誘発技法により導入した。得られた重鎖は、配列番号57を有する。非フコシル化VH6/VL9 IGHG1抗体の生成は、WO2010/095031パンフレットの実施例14に記載するプロトコールに従った。
2名の異なるヒトドナーからの血液を、抗凝固剤としてクエン酸塩を含む3本の10mL S−Monovette(Sarstedt、Numbrecht、Germany)に回収した。2名のヒトドナーからの末梢血単核細胞(PBMC)を、製造者の使用説明に従って50ML Blood−Sep−Filterチューブ(流通業者:Brunschwig、Basel、Switzerland)を用いて精製した。細胞を、FBSを含まないロズウェルパーク記念研究所(RPMI、PAA Laboratories、Pasching、Austria)培地で2回洗浄した。2名のドナーからの刺激細胞を、50μg/mlのマイトマイシンC(Sigma−Aldrich Chemie GmbH、Buchs、Switzerland)との37℃にて30分間のインキュベーションにより調製した。細胞を、次いで、FBSを含まないRPMIで3回洗浄し、RPMI、10%FBS(PAA Laboratories、Pasching、Austria)、2mM L−グルタミン(Lonza、Leuven、Belgium)、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン(Biochrom AG、Berlin、Germany)中に1×106細胞/mLにて再懸濁し
た。レスポンダー細胞を、96ウェルU底マイクロプレート(TPP、Trasadingen、Switzerland)中でRPMI、10%FBS、L−グルタミン、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン中に再懸濁した。50’000の刺激細胞および80’000のレスポンダー細胞を、各ウェルに100μlの最終容量で分配した。100μlの抗体希釈物(または培地のみ)をウェルに加えた。プレートを37℃にて5%CO2インキュベータ中で7日間インキュベートした。最後の1
8時間、0.5μCiの3Hチミジン(Perkin Elmer、Basel Swi
tzerland)で細胞をパルスした。細胞をフィルタマットフィルタ(Perkin
Elmer)上に採集し、取り込まれた放射活性を、Wallacベータカウンタ(Perkin Elmer)で定量した。
図8に示す結果は、VH6/VL9抗体が、2名の異なる個体(レスポンダー)についてのMLRを、およそ100ng/mLのEC50値で効率的に阻害できることを実証する。結果は、用いる抗体フォーマットに依存して異なる応答も示し、阻止および細胞傷害性
機序の寄与における差が、異なる個体からのMLRにおいて観察される。
異種間移植片対宿主(GVH)反応は、ヒト患者における骨髄移植後に観察される同種間移植片対宿主疾患(GVHD)についてのモデルである。GVH反応は、同種または異種MHC認識の結果として宿主環境を攻撃する、グラフト化免疫細胞により媒介される急性免疫応答である(Murphy WJら、(1996)Semin.Immunol.8(4):233〜41頁)。Tリンパ球は、GVH反応の主なエフェクター細胞である。VH6/VL9抗体の免疫抑制効力を、ヒトPBMCを用いるSCIDマウスの再構築に基づく異種GVHDモデルにおいて試験した。このモデルでは、ヒトPBMCおよび主にTリンパ球が、マウス宿主細胞に対して強い応答を開始する。この反応は、特に、体重減少を伴う重度の皮膚および腸の炎症を導く。このモデルの最も適当な読出しは、動物の生存である。
動物(SCIDマウス)を、致死量以下で照射した後に、30百万のヒトPBMCを用いて腹腔内で再構築した。また、TMベータ1抗体を週2回注射することにより、マウスNK細胞をマウスから枯渇させた。VH6/VL9抗体、Enbrel(登録商標)または媒体を用いる処置を、毎週5回の連続する用量をi.v.で与え、PBMC注射の2日前に開始した。動物は、媒体(PBS)、または10mg/kgもしくは1mg/kgのVH6/VL9抗体、または8mg/kgのEnbrel(登録商標)(ヒトIgG1のFc成分と融合したヒト可溶性TNF受容体2の融合タンパク質、Amgen−Pfizer)のいずれかで処置した。動物を、体重減少、下痢、毛皮の外観および全体的な挙動を含むGVHD症状について毎週3回確認して評点した。症状が重度すぎると考えられるならば、動物を道徳的に屠殺した。
図9は、VH6/VL9抗体が、より低い1mg/kg用量であっても、GVHD反応
を非常に有力に抑制したことを示す。驚くべきことに、VH6/VL9抗体は、ヒトにおけるGVHDについての認識された治療であるEnbrel(登録商標)を超える、改善された効力を示した(Xhaard Aら、(2011)Bull.Cancer、98(8):889〜99頁;Simpson D(2001)Expert Opin.Pharmacother.2(7):1109〜17頁)。1または10mg/kgのVH6/VL9抗体で処置した動物の生存時間中央値は、媒体処置群(表10)と比較して4倍長く、Enbrel(登録商標)と比較して2倍長かった。さらに、この結果は、VH6/VL9抗体が、アゴニスト活性を有さないことを強調する。なぜなら、アゴニスト性抗OX40抗体は、同種マウスGVHDモデルにおいてGVHDを悪化させると報告されているが(Valzasina Bら、(2005)Blood、105(7):2845〜51頁;Blazar BRら、(2003)Blood、101(9):3741〜8頁)、この事象は本研究で観察されなかったからである。
Claims (67)
- ヒトOX40と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片であって、下記を含むアンタゴニスト抗体またはその断片:
配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、および/または配列番号2のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および/または配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3;ならびに/あるいは
配列番号4のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、および/または配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および/または配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3。 - 配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号2のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3;ならびに/あるいは
配列番号4のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む、
請求項1に記載の抗体またはその断片。 - マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項1または2に記載の抗体またはその断片。
- ヒト化抗体である、請求項1または2に記載の抗体またはその断片。
- 配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列を含む、請求項1または2に記載の抗体またはその断片。
- 配列番号7の重鎖可変領域配列の非CDR領域と少なくとも80%同一である重鎖可変領域配列の非CDR領域を含む、請求項1または2に記載の抗体またはその断片。
- 配列番号35、36、37および38からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖配列を含む、請求項1または2に記載の抗体またはその断片。
- 重鎖配列が、配列番号35、36、37または38からなる群より選択される重鎖配列の重鎖可変領域配列の非CDR領域と少なくとも80%同一である非CDR領域を含む、請求項7に記載の抗体またはその断片。
- 配列番号58、59、79および80からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列を含む、請求項1または2に記載の抗体またはその断片。
- 配列番号58、59、79および80からなる群より選択される重鎖可変領域配列の非CDR領域と少なくとも80%同一である重鎖可変領域配列の非CDR領域を含む、請求項1または2に記載の抗体またはその断片。
- IGHV2−70*10(配列番号19)、IGHV2−70*01(配列番号20)、IGHV2−70*13(配列番号21)、IGHV2−5*09(配列番号22)およびIGHV2−70*11(配列番号23)からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物で
あるかまたは前記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域を含む、請求項1または2に記載の抗体またはその断片。 - 抗体またはその断片が、ヒト遺伝子IGHV2−70*10(配列番号19)の産物で
あるかまたは前記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域を含み、重鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の対応する重鎖可変フレームワーク領域からの少なくとも1つのアミノ酸改変を含む、請求項1または2に記載の抗体またはその断片。 - 抗体またはその断片が、配列番号32のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含み、重鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の対応する重鎖可変フレームワーク領域からの少なくとも1つのアミノ酸改変を含む、請求項1または2に記載の抗体またはその断片。
- アミノ酸改変が、23位、35b位、48位、50位、60位および62位からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換を含み、各群メンバーのアミノ酸位置がKabat番号付けに従って示される、請求項12または13に記載の抗体またはその断片。
- アミノ酸改変が、23S、35bG、48L、50H、60Nおよび62Aからなる群より選択されるアミノ酸置換を含み、各群メンバーのアミノ酸位置がKabat番号付けに従って示される、請求項12または13に記載の抗体またはその断片。
- 配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む、請求項1または2に記載の抗体またはその断片。
- 配列番号8の軽鎖可変領域配列の非CDR領域と少なくとも80%同一である軽鎖可変領域配列の非CDR領域を含む、請求項1または2に記載の抗体またはその断片。
- 配列番号45、46、47および49からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含む、請求項1または2に記載の抗体またはその断片。
- 軽鎖配列が、配列番号45、46、47または49からなる群より選択される軽鎖配列の軽鎖可変領域配列の非CDR領域と少なくとも80%同一である非CDR領域を含む、請求項18に記載の抗体またはその断片。
- 配列番号60、86、87および89からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む、請求項1または2に記載の抗体またはその断片。
- 配列番号60、86、87および89からなる群より選択される重鎖可変領域配列の非CDR領域と少なくとも80%同一である軽鎖可変領域配列の非CDR領域を含む、請求項1または2に記載の抗体またはその断片。
- IGKV3−11*01(配列番号24)、IGKV1−39*01(配列番号25)、IGKV1D−39*01(配列番号26)、IGKV3−11*02(配列番号27)およびIGKV3−20*01(配列番号28)からなる群より選択されるヒト遺伝子の産
物であるかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含む、請求項1または2に記載の抗体またはその断片。 - 抗体またはその断片が、ヒト遺伝子IGKV3−11*01(配列番号24)の産物で
あるかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含み、軽鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも1つのアミノ酸改変を含む、請求項1または2に記載の抗体またはその断片。 - 抗体またはその断片が、配列番号39のアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含み、軽鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の対応する軽鎖可変フレームワーク領域からの少なくとも1つのアミノ酸改変を含む、請求項1または2に記載の抗体またはその断片。
- アミノ酸改変が、1位、33位、34位、46位、47位、54位、56位および71位からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換を含み、各群メンバーのアミノ酸位置がKabat番号付けに従って示される、請求項23または24に記載の抗体またはその断片。
- アミノ酸改変が、1Q、33M、34H、46P、47W、54L、56Sおよび71Yからなる群より選択されるアミノ酸置換を含み、各群メンバーのアミノ酸位置がKabat番号付けに従って示される、請求項23または24に記載の抗体またはその断片。
- アミノ酸改変が、アミノ酸位置31位でのアミノ酸欠失を含み、アミノ酸位置がKabat番号付けに従って示される、請求項23または24に記載の抗体またはその断片。
- (a)配列番号37または配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖配列と、
(b)配列番号47のアミノ酸配列を含む軽鎖配列と
を含む、請求項2に記載の抗体またはその断片。 - (a)配列番号58または配列番号59のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列と、
(b)配列番号60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列と
を含む、請求項2に記載の抗体またはその断片。 - 重鎖CDRの少なくとも1つおよび/または軽鎖CDRの少なくとも1つが、少なくとも1つのアミノ酸改変を含む、請求項1から29のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
- 重鎖および/または軽鎖定常領域をさらに含む、請求項1から30のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
- ヒト重鎖定常領域が、IGHG1、非フコシル化IGHG1およびIGHG4からなる、ヒト免疫グロブリンの群から選択される、請求項31に記載の抗体またはその断片。
- 抗体が、1価抗体である、請求項1から31のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
- 抗体が、全長抗体である、請求項1から31のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
- 抗体が、Fab、Fab’、Fab’−SH、Fd、Fv、dAb、F(ab’)2、scFv、2重特異性単鎖Fv2量体、ダイアボディ、トリアボディおよび同じまたは異なる抗体と遺伝子的に融合したscFvからなる群より選択される抗体断片である、請求項1から31のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
- 抗体が、親抗体のFc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含むバリアントFc領域を含み、バリアントFc領域を含む抗体が、親抗体と比較して変更されたエフェクター機能を示す、請求項1から31のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
- 110nM以下の親和性(KD)でヒトOX40と結合する、請求項1から36のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
- 対応するキメラ抗体のOX40結合親和性(KD)の少なくとも75%を保持する、請
求項1から36のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。 - 対応するキメラ抗体と比較した場合に、等しいかまたはより高いOX40結合親和性(KD)を有する、請求項1から36のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
- 抗体が、75℃を超えるFAB断片耐熱温度を有する、請求項1から36のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
- ヒトOX40と結合する抗体またはその断片であって、
請求項1から36のいずれか一項に記載の抗体と同じエピトープと結合する、
抗体またはその断片。 - 請求項1から36のいずれか一項に記載の抗体と結合する、ヒトOX40細胞外ドメイン上のエピトープ。
- ヒトOX40細胞外ドメインが、ドメイン2(配列番号76)である、請求項42に記載のエピトープ。
- 請求項1から41のいずれか一項に記載の抗体またはその断片をコードする単離核酸。
- 配列番号61もしくは62の核酸配列を含む、重鎖可変領域をコードするDNA;および/または
配列番号63の核酸配列を含む、軽鎖可変領域をコードするDNA
を含む、請求項44に記載の単離核酸。 - 請求項44または45に記載の単離核酸を含むベクター。
- 請求項44もしくは45に記載の単離核酸または請求項46に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 核酸が発現され、抗体が生成されるように、請求項47に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、ヒトOX40と結合する抗体またはその断片を生成する方法。
- 請求項44または45に記載の単離核酸によりコードされる、ヒトOX40と結合する抗体またはその断片。
- 請求項1から41のいずれか一項に記載の抗体またはその断片と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
- 治療剤に連結した請求項1から41のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を含むイムノコンジュゲート。
- 請求項51に記載のイムノコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む組成物。
- 別の医薬活性物質をさらに含む、請求項50または52に記載の組成物。
- 対象におけるOX40媒介性障害を処置するための方法であって、対象に治療有効量の請求項1から41のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を投与するステップを含む方法。
- OX40媒介性障害が、感染症(ウイルス、細菌、真菌および寄生虫)、感染症に伴う内毒素ショック、関節炎、関節リウマチ、喘息、COPD、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒合、脳卒中、I型糖尿病、ライム病、関節炎、髄膜脳炎、自己免疫性ぶどう膜炎、中枢および末梢神経系の免疫媒介性炎症性障害、例えば多発性硬化症、ループス(例えば全身性エリテマトーデス)およびギラン−バレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化胞隔炎、グレーブス病、IgA腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、他の自己免疫障害、膵炎、外傷(手術)、移植片対宿主疾患(GVHD)、移植片拒絶、虚血性疾患を含む心血管疾患、例えば心筋梗塞およびアテローム動脈硬化症、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節症、歯周炎、低酸症ならびに視神経脊髄炎からなる群より選択される、請求項54に記載の方法。
- OX40媒介性障害が、感染症(ウイルス、細菌、真菌および寄生虫)、感染症に伴う内毒素ショック、関節炎、関節リウマチ、喘息、気管支炎、インフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、肺炎、COPD、特発性肺線維症(IPF)、原因不明の線維化胞隔炎(CFA)、特発性線維化間質性肺炎、肺気腫、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒合、脳卒中、I型糖尿病、ライム病、関節炎、髄膜脳炎、自己免疫性ぶどう膜炎、中枢および末梢神経系の免疫媒介性炎症性障害、例えば多発性硬化症、ループス(例えば全身性エリテマトーデス)およびギラン−バレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化胞隔炎、グレーブス病、IgA腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、他の自己免疫障害、膵炎、外傷(手術)、移植片対宿主疾患(GVHD)、移植片拒絶、虚血性疾患を含む心血管疾患、例えば心筋梗塞およびアテローム動脈硬化症、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節症、歯周炎、低酸症ならびに視神経脊髄炎からなる群より選択される、請求項54に記載の方法。
- 対象が、低いOX40発現レベルを有する、請求項54から56のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体が、ヒト重鎖定常領域IGHG1を有する抗体と比較して、細胞傷害作用が増進している、請求項54から56のいずれか一項に記載の方法。
- 医薬品としての請求項1から41のいずれか一項に記載の抗体またはその断片の使用。
- OX40媒介性障害の処置のための医薬品の調製における、請求項1から41のいずれか一項に記載の抗体またはその断片の使用。
- OX40媒介性障害が、GVHDであり、抗体またはその断片が、GVHDの抑制においてEnbrel(登録商標)より効果的である、請求項60に記載の抗体またはその断片の使用。
- 医薬品として用いるための、請求項1から41のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
- OX40媒介性障害を処置するための方法において用いるための、請求項1から41のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
- OX40媒介性障害を処置するための方法において用いるための、請求項1から41のいずれか一項に記載の抗体またはその断片であって、OX40媒介性障害が、GVHDであり、抗体またはその断片が、GVHDの抑制においてEnbrel(登録商標)より効果的である、抗体またはその断片。
- 請求項1から41のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片、請求項50、52もしくは53に記載の組成物または請求項51に記載のイムノコンジュゲートを含む、OX40媒介性障害の処置のための製造品。
- 請求項1から30のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片、請求項50、52もしくは53に記載の組成物または請求項51に記載のイムノコンジュゲートを含む、OX40媒介性障害の処置のためのキット。
- OX40の発現レベルが低い患者を検出するin vitroスクリーニング方法であって、下記を含む方法:
(a)患者血液試料から末梢血単核細胞(PBMC)を精製するステップ、
(b)PBMCをフローサイトメトリー分析に供するステップ、および
(c)CD4+および/またはCD8+T細胞中のOX40陽性細胞の数を決定し、前記数を対照レベルと比較するステップ。
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