JP2023507115A - 治療における使用のためのデュアルインターロイキン－２／ｔｎｆ受容体アゴニスト - Google Patents

Abstract

本明細書には、制御性Ｔ細胞を優先的に増殖させて活性化させる、且つ大規模生産に適した、ＩＬ－２分子又は変異タンパク質とＴＮＦＲアゴニストとの組合せ、及びＦｃ結合ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子など、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子を含む複合体が提供される。また、本明細書には、本開示の組成物の製造及び使用方法も提供される。

Description

転写因子Ｆｏｘｐ３の発現によって特定される制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は、自然免疫細胞及び適応免疫細胞の両方の活性化及び応答を制限する任務に特化したＣＤ４ Ｔ細胞のサブセットである。Ｆｏｘｐ３遺伝子の欠失又は機能喪失型変異は、ヒト及びマウスの両方で、ＩＰＥＸ（免疫調節異常・多腺性内分泌障害・腸疾患、Ｘ連鎖性）と呼ばれる、多臓器に現れる、多くの場合に致死的な早期発症型自己免疫障害を引き起こす。Ｆｏｘｐ３欠損動物では、様々な種類の炎症反応が自然に調節解除されることから、Ｔｒｅｇ細胞が正常な免疫恒常性の維持に必要であることが示唆される。Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、多発性硬化症（ＭＳ）及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの幾つかのヒト自己免疫障害では、末梢血から単離されたＴｒｅｇ細胞の数又は抑制機能のいずれかに欠陥が見られる。Ｔｒｅｇ細胞は免疫応答に支配的に影響を与え得るため、自己免疫の間のその数、機能又は安定性を正方向に標的化することは、魅力的な治療手法である。

Ｔｒｅｇ細胞の維持は、２つの主要なシグナル伝達経路、即ち、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びＩＬ－２受容体シグナル伝達に決定的に依存し、これらのシグナル伝達経路のいずれを欠いても、Ｔｒｅｇ細胞の恒常性及び機能は著しく損なわれる。他の細胞と比較すると、Ｔｒｅｇ細胞は高レベルの高親和性ＩＬ－２受容体サブユニット（ＩＬ－２Ｒα、ＣＤ２５）を発現する。ＩＬ－２がＴｒｅｇ細胞の分化、生存及び機能の鍵となるサイトカインであるというこの考えに基づき、多くの研究で、この経路を選択的に標的化することに治療可能性があるかどうかを決定しようと試みられている。臨床では、慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、Ｔ１Ｄ並びにＳＬＥなどの幾つかの炎症性疾患の治療に低用量ＩＬ－２が評価されており、Ｔｒｅｇ細胞数を増大させると同時に、疾患活動性の低下も伴うことが示されている。したがって、Ｔｒｅｇ数を増大させる改良された方法が所望されている。

本明細書には、配列番号１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むヒトＩＬ－２ポリペプチドと、抗ＯＸ４０、抗ＤＲ３、及びＴＮＦ複合体からなる群から選択される腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）アゴニストとを含む、高収率製造が可能な、且つ薬理活性のあるヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）キメラ分子が記載される。ヒト治療薬として用いられるかかる分子を作製しようとする取り組みの中で、幾つもの予期せぬ予測不可能な観察結果が発生した。本明細書に記載される組成物及び方法は、この取り組みの成果であった。

一部の実施形態において、本発明は、Ｆｃと、配列番号１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むヒトＩＬ－２ポリペプチドと、抗ＯＸ４０、抗ＤＲ３、及びＴＮＦからなる群から選択される腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）アゴニストとを含むＦｃ融合タンパク質である。

一部の実施形態において、本発明は、炎症性疾患又は自己免疫疾患を患う対象を処置する方法であって、前記対象に、配列番号１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むヒトＩＬ－２ポリペプチドと、抗ＯＸ４０、抗ＤＲ３、及びＴＮＦ複合体からなる群から選択される腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）アゴニストとを含むヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）キメラ分子、又はＦｃと、配列番号１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むヒトＩＬ－２ポリペプチドと、抗ＯＸ４０、抗ＤＲ３、及びＴＮＦからなる群から選択される腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）アゴニストとを含むＦｃ融合タンパク質の治療有効量を投与することを含む方法である。

ＴＮＦＲアゴニスト（抗ＯＸ４０、組換えＴＮＦ、又は抗ＤＲ３）と組み合わせたＩＬ－２で刺激したときのＴｒｅｇの増殖を示す。（Ａ）Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で標識したヒトＰＢＭＣを指示される試薬で４日間刺激した後、フローサイトメトリー分析を行った。ヒストグラムは以下の順番に並べている（下から上に）：刺激なし、１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３、２０Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２、ＩｇＧ、ＴＮＦＲアゴニスト（抗ＯＸ４０、組換えＴＮＦ、抗ＤＲ３）、ＴＮＦＲアゴニスト＋ＩＬ－２で刺激。ヒストグラムはＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋）でゲーティングした。陽性対照抗ＣＤ３プロット及びＴＮＦＲアゴニストの組合せ（抗ＯＸ４０、組換えＴＮＦ、及び抗ＤＲ３）のみが、Ｔｒｅｇの増殖を示した。 ＰＢＭＣに対する抗ＯＸ４０及びＩＬ－２のヒストグラムプロットを示す。（Ａ）ＣＴＶで標識したヒトＰＢＭＣを指示される滴定用量の抗ＯＸ４０（クローン１５Ａ９）で４日間刺激した後、フローサイトメトリー分析を行った。ヒストグラムはＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋）でゲーティングした。ＣＤ３で刺激した細胞はロバストな増殖を示し、このアッセイの陽性対照として供する。ＩＬ２又は対照ＩｇＧによる刺激によっては、いかなるＣＴＶ希釈も生じない。抗ＯＸ４０単独では、指示される用量のいずれによっても増殖は観察されなかった。しかしながら、抗ＯＸ４０及びＩＬ２を使用して刺激を組み合わせると、ＣＴＶ希釈によって見られるとおりのＴｒｅｇ細胞増殖につながる。（Ｂ）（Ａ）のデータの要約。グラフは、条件毎の１ドナーからの３レプリケートを示す。これらの刺激に対するＴ細胞の応答もまた判定し、高用量の抗ＯＸ４０／ＩＬ２処置では、極めて低いレベルのＴ細胞増殖しか観察されなかった。 ＰＢＭＣに対する抗ＯＸ４０及びＩＬ－２のヒストグラムプロットを示す。（Ａ）ＣＴＶで標識したヒトＰＢＭＣを指示される滴定用量の抗ＯＸ４０（クローン１５Ａ９）で４日間刺激した後、フローサイトメトリー分析を行った。ヒストグラムはＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋）でゲーティングした。ＣＤ３で刺激した細胞はロバストな増殖を示し、このアッセイの陽性対照として供する。ＩＬ２又は対照ＩｇＧによる刺激によっては、いかなるＣＴＶ希釈も生じない。抗ＯＸ４０単独では、指示される用量のいずれによっても増殖は観察されなかった。しかしながら、抗ＯＸ４０及びＩＬ２を使用して刺激を組み合わせると、ＣＴＶ希釈によって見られるとおりのＴｒｅｇ細胞増殖につながる。（Ｂ）（Ａ）のデータの要約。グラフは、条件毎の１ドナーからの３レプリケートを示す。これらの刺激に対するＴ細胞の応答もまた判定し、高用量の抗ＯＸ４０／ＩＬ２処置では、極めて低いレベルのＴ細胞増殖しか観察されなかった。 ＰＢＭＣに対するＴＮＦ及びＩＬ－２のヒストグラムプロットを示す。（Ａ）ＣＴＶで標識したヒトＰＢＭＣを指示される滴定用量のＴＮＦで４日間刺激した後、フローサイトメトリー分析を行った。ヒストグラムはＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋）でゲーティングした。ＴＮＦ単独では、指示される用量のいずれによっても増殖は観察されなかった。しかしながら、ＴＮＦ及びＩＬ２による刺激を組み合わせると、ＣＴＶ希釈によって見られるとおりのＴｒｅｇ細胞増殖につながる。（Ｂ）（Ａ）のデータの要約。グラフは、条件毎の１ドナーからの３レプリケートを示す。これらの刺激に対するＴ細胞の応答もまた判定し、ＴＮＦ／ＩＬ２処置では、全ての用量で極めて低いレベルのＴ細胞増殖しか観察されなかった。 ＰＢＭＣに対するＴＮＦ及びＩＬ－２のヒストグラムプロットを示す。（Ａ）ＣＴＶで標識したヒトＰＢＭＣを指示される滴定用量のＴＮＦで４日間刺激した後、フローサイトメトリー分析を行った。ヒストグラムはＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋）でゲーティングした。ＴＮＦ単独では、指示される用量のいずれによっても増殖は観察されなかった。しかしながら、ＴＮＦ及びＩＬ２による刺激を組み合わせると、ＣＴＶ希釈によって見られるとおりのＴｒｅｇ細胞増殖につながる。（Ｂ）（Ａ）のデータの要約。グラフは、条件毎の１ドナーからの３レプリケートを示す。これらの刺激に対するＴ細胞の応答もまた判定し、ＴＮＦ／ＩＬ２処置では、全ての用量で極めて低いレベルのＴ細胞増殖しか観察されなかった。 ＰＢＭＣに対する抗ＤＲ３及びＩＬ－２のヒストグラムプロットを示す。（Ａ）ＣＴＶで標識したヒトＰＢＭＣを指示される滴定用量の抗ＤＲ３で４日間刺激した後、フローサイトメトリー分析を行った。ヒストグラムはＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋）でゲーティングした。抗ＤＲ３単独では、指示される用量のいずれ用量によっても増殖は観察されなかった。しかしながら、抗ＤＲ３及びＩＬ２による刺激を組み合わせると、Ｔｒｅｇ細胞増殖につながる。（Ｂ）（Ａ）のデータの要約。グラフは、条件毎の１ドナーからの３レプリケートを示す。これらの刺激に対するＴ細胞の応答もまた判定し、抗ＤＲ３／ＩＬ２処置では、全ての用量で極めて低いレベルのＴ細胞増殖しか観察されなかった。 ＰＢＭＣに対する抗ＤＲ３及びＩＬ－２のヒストグラムプロットを示す。（Ａ）ＣＴＶで標識したヒトＰＢＭＣを指示される滴定用量の抗ＤＲ３で４日間刺激した後、フローサイトメトリー分析を行った。ヒストグラムはＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋）でゲーティングした。抗ＤＲ３単独では、指示される用量のいずれ用量によっても増殖は観察されなかった。しかしながら、抗ＤＲ３及びＩＬ２による刺激を組み合わせると、Ｔｒｅｇ細胞増殖につながる。（Ｂ）（Ａ）のデータの要約。グラフは、条件毎の１ドナーからの３レプリケートを示す。これらの刺激に対するＴ細胞の応答もまた判定し、抗ＤＲ３／ＩＬ２処置では、全ての用量で極めて低いレベルのＴ細胞増殖しか観察されなかった。 ＰＢＭＣに対する抗ＧＩＴＲ及びＩＬ－２のヒストグラムプロットを示す。（Ａ）ＣＴＶで標識したヒトＰＢＭＣを指示される滴定用量の抗ＧＩＴＲで４日間刺激した後、フローサイトメトリー分析を行った。ヒストグラムはＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋）でゲーティングした。抗ＧＩＴＲ単独では、極めて低いレベルの増殖が観察された。しかしながら、抗ＧＩＴＲ及びＩＬ２による刺激を組み合わせると、より顕著なＴｒｅｇ細胞増殖につながる。（Ｂ）（Ａ）のデータの要約。グラフは、条件毎の１ドナーからの３レプリケートを示す。これらの刺激に対するＴ細胞の応答もまた判定し、抗ＧＩＴＲ／ＩＬ２処置では、全ての用量で僅かなレベルのＴ細胞増殖しか観察されなかった。 ＰＢＭＣに対する抗ＧＩＴＲ及びＩＬ－２のヒストグラムプロットを示す。（Ａ）ＣＴＶで標識したヒトＰＢＭＣを指示される滴定用量の抗ＧＩＴＲで４日間刺激した後、フローサイトメトリー分析を行った。ヒストグラムはＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋）でゲーティングした。抗ＧＩＴＲ単独では、極めて低いレベルの増殖が観察された。しかしながら、抗ＧＩＴＲ及びＩＬ２による刺激を組み合わせると、より顕著なＴｒｅｇ細胞増殖につながる。（Ｂ）（Ａ）のデータの要約。グラフは、条件毎の１ドナーからの３レプリケートを示す。これらの刺激に対するＴ細胞の応答もまた判定し、抗ＧＩＴＲ／ＩＬ２処置では、全ての用量で僅かなレベルのＴ細胞増殖しか観察されなかった。 幾つかの異なるフォーマットのキメラＯＸ－４０抗体及びＩＬ－２分子の図を示す。 ４日目及び１５日目に測定した、ＯＸ－４０抗体と、それに結合するＩＬ－２分子を用いてＴｒｅｇ、活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞、及びＮＫ細胞のレベルを測定するインビボマウス研究を示す。この研究は、ＩＬ－２単独、抗ＯＸ－４０単独、又はキメラ分子、並びに対照を投与したマウスを示す。

本明細書中で用いられる節の見出しは、単に構成を目的とするものに過ぎず、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書の本文内に引用される全ての参考文献は、それらの全体が参照によって明示的に組み込まれる。

標準的な技術を、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養及び形質転換、タンパク質精製等に用いることができる。酵素反応及び精製技術は、製造者の仕様書に従って、又は当該技術において一般的に達成されるように、若しくは本明細書中に記載されるように実行されてよい。以下の手順及び技術は、概して、当該技術において周知の従来の方法に従って、並びに本明細書全体を通して引用され、且つ考察されている種々の一般的且つより具体的な参考文献に説明されているように実行されてよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕｅｌ，３^ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．参照。この文献は、あらゆる目的について、参照によって本明細書中に組み込まれる。特定の定義が提供されない限り、本明細書中に記載される分析化学、有機化学、並びに医薬品化学及び薬化学に関連して用いられる命名法、及びこれらのラボ手順及び技術は、当該技術において周知であり、且つ一般的に用いられるものである。標準的な技術は、化学合成、化学分析、医薬調製物、製剤、及び送達、並びに患者の処置に用いることができる。

ＩＬ－２は、３つの膜貫通受容体サブユニット、即ち、ＩＬ－２結合時に一緒になって細胞内シグナル伝達イベントを活性化させるＩＬ－２Ｒβ及びＩＬ－２Ｒγ、並びにＩＬ－２とＩＬ－２Ｒβγとの間の相互作用を安定化させる働きをするＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα）に結合する。ＩＬ－２Ｒβγによって送られるシグナルには、ＰＩ３キナーゼ、Ｒａｓ－ＭＡＰキナーゼ、及びＳＴＡＴ５経路のものが含まれる。

組織中に典型的に存在する低濃度のＩＬ－２に対してＴ細胞が応答するには、ＣＤ２５の発現が必要である。ＣＤ２５を発現するＴ細胞には、自己免疫性炎症の抑制に必須のＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）と、ＣＤ２５を発現するために活性化されているＦＯＸＰ３－ Ｔ細胞との両方が含まれる。ＦＯＸＰ３－ＣＤ２５＋ Ｔエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）は、ＣＤ４＋細胞又はＣＤ８＋細胞のいずれであってもよく、これらは両方とも、炎症、自己免疫、臓器移植片拒絶反応、又は移植片対宿主病に寄与し得る。正常なＴ－ｒｅｇ細胞の成長及び生存には、並びにＦＯＸＰ３高発現には、ＩＬ－２の刺激を受けたＳＴＡＴ５シグナル伝達が決定的に重要である。

定常状態では、他の免疫細胞と比較したとき、Ｔｒｅｇ細胞はまた、高い表面レベルの幾つかのＴＮＦ（腫瘍壊死因子）受容体ファミリーメンバー、最も注目すべきは、ＴＮＦＲ２、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＣＤ３０及びＤＲ３も発現することが発見されている。Ｔｒｅｇ細胞上でのこれらのＴＮＦ受容体、特に、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ及びＴＮＦＲ２の発現は、ＴＣＲシグナル伝達強度と直接相関し、これらの受容体が、ＩＬ－２に対する感受性の増大並びに共刺激シグナルの提供により、胸腺でのＴｒｅｇ細胞発生を増強することが示されている。ＩＬ－２シグナル伝達もまた、これらのＴＮＦＲの発現に影響を与える。ここで本発明者らは、これらの２つの経路間における相乗作用を発見した。

末梢におけるＴｒｅｇ細胞のＴＮＦＲシグナル伝達の影響については、その調節が多様な効果をもたらしていることに伴い、不明な点が多い。例えば、ＯＸ４０がＴｒｅｇ細胞に会合すると、Ｆｏｘｐ３発現の喪失につながり、Ｔｒｅｇ細胞機能が低下した一方、ＴＮＦＲ２シグナル伝達は、Ｔｒｅｇ細胞の数及び機能の維持に関係があるとされている。本発明では、ＴＮＦＲ２、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０及びＤＲ３など、ＴＮＦＲのアゴニストをＩＬ－２刺激と組み合わせると、Ｔｒｅｇ細胞増殖が増大することを示す。ＴＮＦＲリガンドの発現は、概して炎症シグナルの検知後に抗原提示細胞によって上方制御され、及び活性化時にはＴ細胞によってＩＬ－２が分泌されるため、炎症に際しては、これらが協働してロバストなＴｒｅｇ細胞増殖へと駆り立てている可能性がある。本発明の一部の実施形態は、ＴＮＦＲアゴニストとＩＬ－２との間のキメラ融合分子であり、これはＴｒｅｇ細胞増殖に選択的な薬剤であり得る。一部の実施形態では、このキメラ分子がＦｃ分子に結合される。一部の実施形態において、本発明は、ＴＮＦＲアゴニストとＩＬ－２分子又は変異タンパク質との共投与によってＴｒｅｇを増大させる方法である。

ＩＬ－２
本明細書に記載されるＩＬ－２分子には、野生型及び野生型ヒトＩＬ－２のバリアントが含まれる。本明細書で使用されるとき、「野生型ヒトＩＬ－２」、「野生型ＩＬ－２」、又は「ＷＴ ＩＬ－２」は、以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味するものとする：
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＸＱＳＩＩＳＴＬＴ
式中、Ｘは、Ｃ、Ｓ、Ｖ、又はＡである（配列番号１）。

バリアントは、野生型ＩＬ－２アミノ酸配列中に１つ以上の置換、欠失、又は挿入を含むものであってよく、国際公開第２０１００８５４９５号パンフレット、国際公開第２０１４１５３１１１号パンフレット、国際公開第２０１６１６４９３７号パンフレット、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４６２０２号明細書、国際公開第１９９９０６０１２８号パンフレット、国際公開第２００２０００２４３号パンフレット、国際公開第２０１２１０７４１７号パンフレット、国際公開第２００５０８６７９８号パンフレット、国際公開第２００５０８６７５１号パンフレット、及び国際公開第２００６０８９０６４号パンフレット（これらは、本明細書によって全体として参照により援用される）に記載されるＩＬ－２変異タンパク質バリアントを含む。ＩＬ－２変異タンパク質の例は、以下のアミノ酸配列を有する変異Ｖ９１Ｋを含む：
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＫＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＸＱＳＩＩＳＴＬＴ
式中、Ｘは、Ｃ、Ｓ、Ｖ、又はＡである（配列番号２）。

残基は、本明細書中で、１文字アミノ酸コードに続いてＩＬ－２アミノ酸位置によって指定されており、例えば、Ｋ３５は、配列番号２の３５位にあるリジン残基である。置換は、本明細書中で、１文字アミノ酸コードに続いてＩＬ－２アミノ酸位置、それに続いて置換する１文字アミノ酸コードによって指定されており、例えば、Ｋ３５Ａは、配列番号２の３５位にあるリジン残基の、アラニン残基による置換である。

ＩＬ－２変異タンパク質
本明細書中で提供されるのは、ＴＮＦＲアゴニストとの組合せで、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を優先的に刺激するヒトＩＬ－２分子及び変異タンパク質である。本明細書中で用いられる「制御性Ｔ細胞を優先的に刺激する」は、変異タンパク質又は抗体が、ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３－Ｔ細胞よりもＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の増殖、生存、活性化、及び／又は機能を促進することを意味する。Ｔｒｅｇを優先的に刺激する能力を測定する方法は、末梢血白血球のフローサイトメトリーによって測定することができ、ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の、総ＣＤ４＋Ｔ細胞中のパーセンテージの増大、ＦＯＸＰ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の、総ＣＤ８＋Ｔ細胞中のパーセンテージの増大、ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞の、ＮＫ細胞と比較したパーセンテージの増大、及び／又は他のＴ細胞上でのＣＤ２５発現の増大と比較した、ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞の表面上でのＣＤ２５の発現レベルのより大きな増大が観察される。また、Ｔｒｅｇ細胞の優先的増殖は、ビスルフィットで処理したゲノムＤＮＡ由来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物の配列決定によって検出されるような、全血から抽出されたＤＮＡ中の脱メチル化ＣＤ３遺伝子と比較した、脱メチル化ＦＯＸＰ３プロモータＤＮＡ（すなわち、Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域、又はＴＳＤＲ）の発現の増大として検出することができる（Ｊ．Ｓｅｈｏｕｌｉ，ｅｔ ａｌ． ２０１１．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：２，２３６－２４６）。

ＴＮＦＲアゴニストとの組合せで、Ｔｒｅｇ細胞を優先的に刺激するＩＬ－２分子及び変異タンパク質によれば、対象又は末梢血試料におけるＣＤ３＋ＦｏｘＰ３－ Ｔ細胞に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋ Ｔ細胞の比率が、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％、又は少なくとも１０００％増大する。

ＩＬ－２変異タンパク質の例として、以下を含むＩＬ－２変異タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない：配列番号２に示されるアミノ酸配列におけるＶ９１Ｋ、Ｎ３０Ｓ、Ｎ３０Ｄ、Ｙ３１Ｈ、Ｙ３１Ｓ、Ｋ３５Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ｌ、Ｄ８４Ｒ／Ｅ６１Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ａ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｎ８８Ｋ／Ｍ１０４Ｌ、Ｖ９１Ｈ／Ｍ１０４Ｌ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｖ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｒ／Ｍ１０４Ｖ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｒ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｅ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｒ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｅ、Ｖ９１Ｈ／Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｔ、Ｈ１６Ｅ／Ｖ９１Ｈ／Ｍ１０４Ｖ、Ｖ９１Ｈ／Ｄ２０Ａ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｈ／Ｈ１６Ｒ／Ｅ１６Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｖ、Ｈ１６Ｅ／Ｖ９１Ｈ、Ｖ９１Ｈ／Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｖ、Ｈ１６Ｅ／Ｖ９１Ｈ／Ｍ１０４Ｔ、Ｈ１６Ｅ／Ｖ９１Ｈ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ／Ｈ１６Ｅ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｒ／Ｍ１０４Ｌ、Ｈ１６Ｅ／Ｖ９１Ｈ／Ｅ１６Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ／Ｈ１６Ｒ、Ｄ２０Ｗ／Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ、Ｖ９１Ｈ／Ｈ１６Ｒ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｒ、Ｄ２０Ｗ／Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ａ、Ｖ９１Ｈ／Ｄ２０Ａ／Ｅ１６Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｌ、Ｖ９１Ｈ／Ｄ２０Ａ、Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ／Ｄ２０Ａ、Ｖ９１Ｈ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｈ／Ｍ１０４Ｖ、Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｎ８８Ｋ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｎ８８Ｋ／Ｅ６１Ｑ、Ｖ９１Ｈ／Ｅ６１Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｎ８８Ｋ、Ｄ２０Ａ／Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｔ、Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｔ、Ｈ１６Ｅ／Ｎ８８Ｋ、Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｖ、Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｌ、Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｔ、Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｖ、Ｎ８８Ｋ／Ｍ１０４Ｖ、Ｎ８８Ｋ／Ｅ６１Ｑ、Ｄ２０Ａ／Ｅ６１Ｑ、Ｈ１６Ｒ／Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｗ／Ｅ６１Ｑ、Ｈ１６Ｅ／Ｅ６１Ｑ、Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｌ、Ｎ８８Ｋ／Ｍ１０４Ｔ、Ｄ２０Ａ／Ｈ１６Ｅ、Ｄ２０Ａ／Ｈ１６Ｅ／Ｅ１６Ｑ、Ｄ２０Ａ／Ｈ１６Ｒ／Ｅ１６Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ｗ、Ｖ９１Ａ／Ｈ１６Ａ、Ｖ９１Ａ／Ｈ１６Ｄ、Ｖ９１Ａ／Ｈ１６Ｅ、Ｖ９１Ａ／Ｈ１６Ｓ、Ｖ９１Ｅ／Ｈ１６Ａ、Ｖ９１Ｅ／Ｈ１６Ｄ、Ｖ９１Ｅ／Ｈ１６Ｅ、Ｖ９１Ｅ／Ｈ１６Ｓ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ａ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｄ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｓ、Ｖ９１Ｓ／Ｈ１６Ｅ、Ｌ１２Ｇ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１２Ｑ、Ｌ１２Ｓ、Ｑ１３Ｇ、Ｅ１５Ａ、Ｅ１５Ｇ、Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ａ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｍ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｓ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｈ１６Ｙ、Ｌ１９Ａ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｅ、Ｌ１９Ｇ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｒ、Ｌ１９Ｓ、Ｌ１９Ｔ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｆ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｔ、Ｄ２０Ｗ、Ｍ２３Ｒ、Ｎ３０Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｒ８１Ａ、Ｒ８１Ｇ、Ｒ８１Ｓ、Ｒ８１Ｔ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ｉ、Ｄ８４Ｍ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｒ、Ｄ８４Ｓ、Ｄ８４Ｔ、Ｓ８７Ｒ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｆ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｍ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｖ、Ｎ８８Ｗ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｅ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｓ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ、及び／又はＥ９５Ｇ置換。本発明のＩＬ－２分子及び変異タンパク質は、場合によっては、Ｃ１２５Ａ置換を含む。また、野生型ＩＬ－２配列に対する更なる変異の数を引き下げることは有利である場合があるが、本発明は、以下に加えて、切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）並びに／又は追加的な挿入、欠失、及び／若しくは置換を含むＩＬ－２変異タンパク質を含む：Ｖ９１Ｋ、Ｎ３０Ｓ、Ｎ３０Ｄ、Ｙ３１Ｈ、Ｙ３１Ｓ、Ｋ３５Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ｌ、Ｄ８４Ｒ／Ｅ６１Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ａ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｎ８８Ｋ／Ｍ１０４Ｌ、Ｖ９１Ｈ／Ｍ１０４Ｌ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｖ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｒ／Ｍ１０４Ｖ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｒ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｅ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｒ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｅ、Ｖ９１Ｈ／Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｔ、Ｈ１６Ｅ／Ｖ９１Ｈ／Ｍ１０４Ｖ、Ｖ９１Ｈ／Ｄ２０Ａ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｈ／Ｈ１６Ｒ／Ｅ１６Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｖ、Ｈ１６Ｅ／Ｖ９１Ｈ、Ｖ９１Ｈ／Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｖ、Ｈ１６Ｅ／Ｖ９１Ｈ／Ｍ１０４Ｔ、Ｈ１６Ｅ／Ｖ９１Ｈ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ／Ｈ１６Ｅ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｒ／Ｍ１０４Ｌ、Ｈ１６Ｅ／Ｖ９１Ｈ／Ｅ１６Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ／Ｈ１６Ｒ、Ｄ２０Ｗ／Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ、Ｖ９１Ｈ／Ｈ１６Ｒ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｒ、Ｄ２０Ｗ／Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ａ、Ｖ９１Ｈ／Ｄ２０Ａ／Ｅ１６Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｌ、Ｖ９１Ｈ／Ｄ２０Ａ、Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ／Ｄ２０Ａ、Ｖ９１Ｈ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｈ／Ｍ１０４Ｖ、Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｎ８８Ｋ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｎ８８Ｋ／Ｅ６１Ｑ、Ｖ９１Ｈ／Ｅ６１Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｎ８８Ｋ、Ｄ２０Ａ／Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｔ、Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｔ、Ｈ１６Ｅ／Ｎ８８Ｋ、Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｖ、Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｌ、Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｔ、Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｖ、Ｎ８８Ｋ／Ｍ１０４Ｖ、Ｎ８８Ｋ／Ｅ６１Ｑ、Ｄ２０Ａ／Ｅ６１Ｑ、Ｈ１６Ｒ／Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｗ／Ｅ６１Ｑ、Ｈ１６Ｅ／Ｅ６１Ｑ、Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｌ、Ｎ８８Ｋ／Ｍ１０４Ｔ、Ｄ２０Ａ／Ｈ１６Ｅ、Ｄ２０Ａ／Ｈ１６Ｅ／Ｅ１６Ｑ、Ｄ２０Ａ／Ｈ１６Ｒ／Ｅ１６Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ｗ、Ｖ９１Ａ／Ｈ１６Ａ、Ｖ９１Ａ／Ｈ１６Ｄ、Ｖ９１Ａ／Ｈ１６Ｅ、Ｖ９１Ａ／Ｈ１６Ｓ、Ｖ９１Ｅ／Ｈ１６Ａ、Ｖ９１Ｅ／Ｈ１６Ｄ、Ｖ９１Ｅ／Ｈ１６Ｅ、Ｖ９１Ｅ／Ｈ１６Ｓ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ａ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｄ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｓ、Ｖ９１Ｓ／Ｈ１６Ｅ、Ｌ１２Ｇ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１２Ｑ、Ｌ１２Ｓ、Ｑ１３Ｇ、Ｅ１５Ａ、Ｅ１５Ｇ、Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ａ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｍ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｓ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｈ１６Ｙ、Ｌ１９Ａ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｅ、Ｌ１９Ｇ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｒ、Ｌ１９Ｓ、Ｌ１９Ｔ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｆ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｔ、Ｄ２０Ｗ、Ｍ２３Ｒ、Ｎ３０Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｒ８１Ａ、Ｒ８１Ｇ、Ｒ８１Ｓ、Ｒ８１Ｔ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ｉ、Ｄ８４Ｍ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｒ、Ｄ８４Ｓ、Ｄ８４Ｔ、Ｓ８７Ｒ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｆ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｍ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｖ、Ｎ８８Ｗ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｅ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｓ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ、及び／又はＥ９５Ｇ置換。但し、前記変異タンパク質がＴｒｅｇを優先的に刺激する活性を維持する場合に限る。ゆえに、実施形態として、Ｔｒｅｇ細胞を優先的に刺激し、且つＶ９１Ｋ、Ｎ３０Ｓ、Ｎ３０Ｄ、Ｙ３１Ｈ、Ｙ３１Ｓ、Ｋ３５Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ｌ、Ｄ８４Ｒ／Ｅ６１Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ａ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｎ８８Ｋ／Ｍ１０４Ｌ、Ｖ９１Ｈ／Ｍ１０４Ｌ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｖ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｒ／Ｍ１０４Ｖ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｒ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｅ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｒ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｅ、Ｖ９１Ｈ／Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｔ、Ｈ１６Ｅ／Ｖ９１Ｈ／Ｍ１０４Ｖ、Ｖ９１Ｈ／Ｄ２０Ａ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｈ／Ｈ１６Ｒ／Ｅ１６Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｖ、Ｈ１６Ｅ／Ｖ９１Ｈ、Ｖ９１Ｈ／Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｖ、Ｈ１６Ｅ／Ｖ９１Ｈ／Ｍ１０４Ｔ、Ｈ１６Ｅ／Ｖ９１Ｈ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ／Ｈ１６Ｅ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｒ／Ｍ１０４Ｌ、Ｈ１６Ｅ／Ｖ９１Ｈ／Ｅ１６Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ／Ｈ１６Ｒ、Ｄ２０Ｗ／Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ、Ｖ９１Ｈ／Ｈ１６Ｒ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｒ、Ｄ２０Ｗ／Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ａ、Ｖ９１Ｈ／Ｄ２０Ａ／Ｅ１６Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｌ、Ｖ９１Ｈ／Ｄ２０Ａ、Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ／Ｄ２０Ａ、Ｖ９１Ｈ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｈ／Ｍ１０４Ｖ、Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｎ８８Ｋ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｎ８８Ｋ／Ｅ６１Ｑ、Ｖ９１Ｈ／Ｅ６１Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｎ８８Ｋ、Ｄ２０Ａ／Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｔ、Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｔ、Ｈ１６Ｅ／Ｎ８８Ｋ、Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｖ、Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｌ、Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｔ、Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｖ、Ｎ８８Ｋ／Ｍ１０４Ｖ、Ｎ８８Ｋ／Ｅ６１Ｑ、Ｄ２０Ａ／Ｅ６１Ｑ、Ｈ１６Ｒ／Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｗ／Ｅ６１Ｑ、Ｈ１６Ｅ／Ｅ６１Ｑ、Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｌ、Ｎ８８Ｋ／Ｍ１０４Ｔ、Ｄ２０Ａ／Ｈ１６Ｅ、Ｄ２０Ａ／Ｈ１６Ｅ／Ｅ１６Ｑ、Ｄ２０Ａ／Ｈ１６Ｒ／Ｅ１６Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ｗ、Ｖ９１Ａ／Ｈ１６Ａ、Ｖ９１Ａ／Ｈ１６Ｄ、Ｖ９１Ａ／Ｈ１６Ｅ、Ｖ９１Ａ／Ｈ１６Ｓ、Ｖ９１Ｅ／Ｈ１６Ａ、Ｖ９１Ｅ／Ｈ１６Ｄ、Ｖ９１Ｅ／Ｈ１６Ｅ、Ｖ９１Ｅ／Ｈ１６Ｓ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ａ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｄ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｓ、Ｖ９１Ｓ／Ｈ１６Ｅ、Ｌ１２Ｇ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１２Ｑ、Ｌ１２Ｓ、Ｑ１３Ｇ、Ｅ１５Ａ、Ｅ１５Ｇ、Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ａ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｍ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｓ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｈ１６Ｙ、Ｌ１９Ａ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｅ、Ｌ１９Ｇ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｒ、Ｌ１９Ｓ、Ｌ１９Ｔ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｆ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｔ、Ｄ２０Ｗ、Ｍ２３Ｒ、Ｎ３０Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｒ８１Ａ、Ｒ８１Ｇ、Ｒ８１Ｓ、Ｒ８１Ｔ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ｉ、Ｄ８４Ｍ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｒ、Ｄ８４Ｓ、Ｄ８４Ｔ、Ｓ８７Ｒ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｆ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｍ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｖ、Ｎ８８Ｗ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｅ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｓ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ、及び／又はＥ９５Ｇ置換を有するアミノ酸配列を含み、そして配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一のＩＬ－２変異タンパク質が挙げられる。特に好ましい実施形態において、そのようなＩＬ－２変異タンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。

アミノ酸配列について、配列同一性及び／又は類似性は、当該技術において知られている標準的な技術、例えば、限定されないが、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：２４４４の類似法の検索、これらのアルゴリズムの、コンピュータによる実現（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７－３９５により記載されている、好ましくはデフォルト設定を用いたＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラムを用いることによって、又は目視によって判定される。好ましくは、同一性パーセントは、以下のパラメータに基づくＦａｓｔＤＢによって算出される：ミスマッチペナルティが１；ギャップペナルティが１；ギャップサイズペナルティが０．３３；且つ結合ペナルティが３０、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ”，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ １２７－１４９（１９８８），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．。

有用なアルゴリズムの一例が、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブペアワイズアラインメントを用いて、関連配列の群から多重配列アラインメントを作成する。これにより、アラインメントを作成するのに用いられるクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１－３６０のプログレッシブアラインメント法の簡易版を用いる；当該方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３により記載されるものと類似している。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータとして、３．００のデフォルトのギャップ加重、０．１０のデフォルトのギャップ長加重、及び加重エンドギャップが挙げられる。

有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９３４０２；及びＫａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３－５７８７に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０－４８０から入手したＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムである。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２は、幾つかの検索パラメータを用いており、その大部分がデフォルト値に設定されている。調整可能なパラメータは、以下の値に設定されている：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝ＩＩ。アラインメントの目的上、特許請求される本発明は、アラインメントアルゴリズムとしてこれらのパラメータ及びＢＬＡＳＴを優先的に利用する。ＨＳＰ Ｓパラメータ及びＨＳＰ Ｓ２パラメータは、ダイナミック値であり、対象となる配列が検索されている、特定の配列の組成及び特定のデータベースの組成に依存して、プログラム自体によって確立される；しかしながら、感度を増大させるように値が調整されてよい。

追加の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２によって報告されているようなギャップ入りＢＬＡＳＴである。ギャップ入りＢＬＡＳＴは、ＢＬＯＳＵＭ－６２置換スコア；９に設定された閾値Ｔパラメータ；ギャップなし伸長をトリガーするための２ヒット法、ｋのギャップ長への１０＋ｋのコストのチャージ；１６に設定されたＸ_ｕ、及びデータベース検索ステージについて４０に設定され、且つアルゴリズムの出力ステージについて６７に設定されたＸ_ｇを用いる。ギャップ入りアラインメントは、約２２ビットに対応するスコアによってトリガーされる。

アミノ酸配列変異を導入するための部位又は領域は予め決まっていてもよいが、変異それ自体は予め決まっている必要はない。例えば、所与の部位での変異の性能を最適化するために、ランダム変異誘発が、標的コドン又は標的領域にて行われて、発現されるＩＬ－２変異タンパク質が、所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングされてよい。知られている配列を有するＤＮＡ内の所定部位にて置換変異を形成する技術は周知であり、例えばＭ１３プライマー変異誘発及びＰＣＲ変異誘発がある。変異体のスクリーニングは、例えば、本明細書中に記載されるアッセイを用いて行われてよい。

アミノ酸置換は、典型的には単一残基のものである；挿入は通常、約１～約２０個のアミノ酸残基程度であろうが、それよりも大幅に大きな挿入が許容され得る。欠失は、約１～約２０個のアミノ酸残基に及ぶが、一部の場合には、欠失がはるかに大きくなってもよい。

置換、欠失、挿入、又はそれらのあらゆる組合せが用いられて、最終的な誘導体又はバリアントに達してよい。一般に、これらの変化は、分子、特に抗原結合タンパク質の免疫原性及び特異性の変更を最小限に抑えるために、数個のアミノ酸に対して行われる。しかしながら、特定の状況では、より大きな変化が許容され得る。保存的置換が、表１として示される以下のチャートに従って一般に行われる。

機能又は免疫学的同一性の実質的な変化は、表１に示されるものよりも保存性が低い置換を選択することによって形成される。例えば：変更の領域内のポリペプチド骨格の構造、例えば、アルファへリックス構造若しくはベータシート構造；標的部位での分子の電荷若しくは疎水性；又は側鎖の嵩に対してより大きな影響を及ぼす置換が形成されてよい。一般にポリペプチドの特性に最大の変化をもたらすと予想される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリル若しくはトレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、若しくはアラニルと（又はそれによって）置換される；（ｂ）システイン若しくはプロリンが、他のあらゆる残基と（又はそれによって）置換される；（ｃ）電気陽性側鎖を有する残基、例えば、リジル、アルギニル、若しくはヒスチジルが、電気陰性残基、例えば、グルタミル若しくはアスパルチルと（又はそれによって）置換される；又は（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが、側鎖を有していない残基、例えばグリシンと（又はそれによって）置換されるものである。

バリアントは、典型的には天然に存在する類似体と同じ定性的生物活性を呈し、同じ免疫応答を引き出すことになるが、バリアントはまた、必要に応じて、ＩＬ－２変異タンパク質の特徴を改変するようにも選択される。或いは、バリアントは、ＩＬ－２変異タンパク質の生物活性が変化するように設計されてもよい。例えば、本明細書で考察するとおり、グリコシル化部位を変化させるか、又は除去してもよい。

ＴＮＦＲアゴニスト
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーは、細胞膜に三量体複合体を形成して、細胞外システインリッチドメインで腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合するサイトカイン受容体のファミリーである。ＴＮＦＲファミリーの一部のメンバーはデスドメインを含有し、デス受容体と呼ばれている。

本発明のＴＮＦＲアゴニストは、本発明のＩＬ－２分子及び変異タンパク質との組合せで、Ｔ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞を優先的に刺激する。本発明のＴＮＦＲアゴニストには、腫瘍壊死因子受容体１（ＴＮＦＲ１）；腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）；リンホトキシンβ受容体（ＬＴＢＲ）；ＯＸ４０；ＣＤ４０；Ｆａｓ受容体；デコイ受容体３；ＣＤ２７；ＣＤ３０；４－１ＢＢ；デス受容体１、２、３、４、５、及び６；ＲＡＮＫ、オステオプロテゲリン；ＴＷＥＡＫ受容体；ＴＡＣＩ；ＢＡＦＦ受容体；ヘルペスウイルス侵入メディエーター；神経成長因子受容体；Ｂ細胞成熟抗原；グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質；ＴＲＯＹ；及びエクトジスプラシンＡ２受容体、並びにＯＸ４０アゴニスト抗体など、これらの受容体に対するアゴニスト抗体が含まれる。

ベースラインでは、Ｔｒｅｇ細胞は、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＴＮＦＲ２など、幾つかの異なるＴＮＦＲファミリーメンバーを、他の免疫細胞集団と比較するとはるかに高いレベルで発現する。異なるＴ細胞サブセット上でのＴＮＦＲの発現をシングルセルＲＮＡデータから決定した。例えば、様々な免疫細胞サブセット上のＴＮＦＲレベルは、ｈｔｔｐ：／／ｃｒｃ．ｃａｎｃｅｒ－ｐｋｕ．ｃｎ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐにあるようなヒトシングルセルＲＮＡシーケンシングデータから抽出することができる。一部の実施形態において、本発明のＴＮＦＲアゴニストには、抗ＯＸ４０、抗ＤＲ３、及びＴＮＦが含まれる。一部の実施形態において、ＴＮＦＲアゴニストは、ＴＮＦＲメンバーのリガンドであってもよい。それらには、ＴＮＦ－α；リンホトキシン－β（ＴＮＦ－Ｃ）；ＯＸ４０Ｌ；ＣＤ１５４；ＦａｓＬ；ＬＩＧＨＴ；ＴＬ１Ａ；ＣＤ７０；Ｓｉｖａ；ＣＤ１５３；４－１ＢＢリガンド；ＴＲＡＩＬ；ＲＡＮＫＬ；ＴＷＥＡＫ；ＡＰＲＩＬ；ＢＡＦＦ；ＣＡＭＬＧ；ＮＧＦ；ＢＤＮＦ；ＮＴ－３；ＮＴ－４；ＧＩＴＲリガンド；及びＥＤＡ－Ａ２が含まれる。

ＯＸ４０に対する抗体の例としては、国際公開第２００７０６２２４５Ａ２号パンフレット、国際公開第２０１００９６４１８Ａ２号パンフレット、国際公開第２０１３００８１７１Ａ１号パンフレット、国際公開第２０１３０２８２３１Ａ１号パンフレット、国際公開第２０１３０３８１９１Ａ２号パンフレット、国際公開第２０１３０６８５６３Ａ２号パンフレット、国際公開第２０１４１４８８９５Ａ１号パンフレット、国際公開第２０１５１５３５１３Ａ１号パンフレット、国際公開第２０１６０５７６６７Ａ１号パンフレット、国際公開第２０１６１７９５１７Ａ１号パンフレット、国際公開第２０１６１９６２２８Ａ１号パンフレット、及び国際公開第２０１８１１２３４６Ａ１号パンフレットに見られる、アゴニスト抗体として働くものが挙げられる。一部の実施形態において、本発明には、ＯＸ４０受容体のアゴニストとして働くことができるＯＸ４０に対する抗体が有用である。ＯＸ４０受容体に対する抗体の例としては、国際公開第２００３１０６４９８Ａ２号パンフレットに見られるものが挙げられる。ＯＸ４０リガンドの例としては、米国特許第５７８３６６５Ａ号明細書に見られるものが挙げられる（上記は全て、全体として参照により援用される）。

一実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、以下の重鎖配列を有する：

一実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、以下の軽鎖配列を有する：

一実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号９の重鎖と配列番号１０の軽鎖とを有する。

デス受容体３（ＤＲ３）に対する抗体の例としては、国際公開第２０１１１０６７０７Ａ２号パンフレット及び国際公開第２０１５１５２４３０Ａ１号パンフレットに見られるものが挙げられる。一部の実施形態において、本発明には、ＤＲ３受容体のアゴニストとして働くことができるＤＲ３に対する抗体が有用である。ＤＲ３リガンドの例としては、ＴＮＦ様タンパク質１Ａ（ＴＬ１Ａ）が挙げられる。上記の参考文献は全て、全体として参照により援用される。

組合せ分子
本発明にあるとおりのＩＬ－２分子又は変異タンパク質とＴＮＦＲアゴニストとの組合せは、組合せで、又は単一分子として投与することができる。本明細書に提供されるＴＮＦＲアゴニストとの組合せのＩＬ－２分子又は変異タンパク質は、単一の分子構築物として構築されてもよい。一部の例では、本発明のＩＬ－２分子又は変異タンパク質及びＴＮＦＲアゴニストは、Ｆｃ分子などと共に、単一分子として構築することができる。一部の実施形態において、Ｆｃ分子は、ＩＬ－２分子又は変異タンパク質を一方のアームに有し、ＴＮＦＲアゴニストを他方のアームに有するか、又は融合タンパク質として有する。一部の例では、Ｆｃ結合ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子は、Ｆｃ結合ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子の血清半減期を延長する。一部の例では、これは、かかる半減期の延長によって患者の副作用又は有害事象の可能性又は強度が増大し得るリスクが増大しないように行われる。そのように血清半減期が延長された変異タンパク質の皮下投薬により、最大全身曝露（Ｃ_ｍａｘ）がより低い標的範囲の長期化が可能となり得る。血清半減期の延長により、より少ない又はより頻度の低い変異タンパク質の投薬レジメンが可能となり得る。

本明細書中で提供されるＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子の血清半減期は、当該技術において知られている本質的にあらゆる方法によって延長されてよい。そのような方法は、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子の配列を、新生児Ｆｃγ受容体に結合するペプチドを含むように、又は血清半減期が延長されたタンパク質、例えば、ＩｇＧ若しくはヒト血清アルブミンに結合するように変更させることを含む。他の実施形態において、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子は、融合分子に対して半減期の延長を付与するポリペプチドに融合されている。そのようなポリペプチドとして、新生児Ｆｃγ受容体に結合するＩｇＧ Ｆｃ若しくは他のポリペプチド、ヒト血清アルブミン、又は血清半減期が延長されたタンパク質に結合するポリペプチドが挙げられる。いくつかの好ましい実施形態において、Ｆｃ結合ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子は、ＩｇＧ Ｆｃ分子に融合されている。

分子のＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト部分は、ＩｇＧ Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に融合されてもよい。

本発明の一実施形態は、ＩＬ－２分子又は変異タンパク質を抗体の１つのＦｃ領域と融合し、ＴＮＦＲアゴニストを別の領域と融合することによって作り出される２つのＦｃ融合ポリペプチドを含む二量体に関する。この二量体は、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を適切な発現ベクターに挿入し、組換え発現ベクターを形質転換した宿主細胞で遺伝子融合体を発現させて、及び発現した融合タンパク質を抗体分子とほぼ同じようにアセンブルさせておくと、Ｆｃ部分の間に鎖間結合が形成されて二量体が生じることによって作製することができる。

本明細書中で用いられる用語「Ｆｃポリペプチド」又は「Ｆｃ領域」は、抗体のＦｃ領域に由来するポリペプチドの天然形態及び変異タンパク質形態を含み、本発明のＩＬ－２変異タンパク質融合タンパク質又は抗ＩＬ－２抗体のいずれかの一部となり得る。また、二量体化を促進するヒンジ領域を含有するそのようなポリペプチドの切断型も含まれる。特定の実施形態において、Ｆｃ領域は、抗体のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。血清半減期の延長と共に、Ｆｃ部分を含む融合タンパク質（及びそれから形成されるオリゴマー）は、プロテインＡカラム又はプロテインＧカラム上でのアフィニティクロマトグラフィによる精製が容易であるという利点を提供する。好ましいＦｃ領域は、ヒトＩｇＧに由来し、これとして、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４が挙げられる。本明細書中では、Ｆｃ内のある特定の残基は、位置によって同定される。全てのＦｃ位置は、ＥＵナンバリングスキームに基づいている。

抗体のＦｃ部分の機能の１つは、当該抗体がその標的に結合すると、免疫系とコミュニケートすることである。これは、「エフェクタ機能」とみなされる。コミュニケーションは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、及び／又は補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）に至る。ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰは、免疫系の細胞の表面上のＦｃ受容体へのＦｃの結合を介して媒介される。ＣＤＣは、補体系のタンパク質、例えばＣ１ｑとのＦｃの結合により媒介される。

ＩｇＧサブクラスは、エフェクタ機能を媒介する能力が異なる。例えば、ＩｇＧ１は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを媒介することにおいて、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４よりもはるかに優れている。ゆえに、エフェクタ機能が望ましくない実施形態においては、ＩｇＧ２ Ｆｃが好ましいであろう。しかしながら、ＩｇＧ２ Ｆｃ含有分子は、ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子と比較して、製造がより困難であること、及び半減期がより短い等のあまり魅力的ではない生物物理学的特性を有することが知られている。

抗体のエフェクタ機能は、１つ以上の変異をＦｃ中に導入することによって増大又は低下させることができる。本発明の実施形態として、エフェクタ機能を増大させるように操作されたＦｃを有するＩＬ－２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質が挙げられる（米国特許第７，３１７，０９１号明細書及びＳｔｒｏｈｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０：６８５－６９１，２００９；双方共にその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。エフェクタ機能が増大した例示的なＩｇＧ１ Ｆｃ分子として、以下の置換基を有するものが挙げられる。Ｓ２３９Ｄ；Ｓ２３９Ｅ；Ｓ２３９Ｋ，Ｆ２４１Ａ；Ｖ２６２Ａ；Ｖ２６４Ｄ；Ｖ２６４Ｌ；Ｖ２６４Ａ；Ｖ２６４Ｓ；Ｄ２６５Ａ；Ｄ２６５Ｓ；Ｄ２６５Ｖ；Ｆ２９６Ａ；Ｙ２９６Ａ；Ｒ３０１Ａ；Ｉ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｓ／Ｉ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ；Ｓ２９８Ａ／Ｄ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ；Ｐ２４７Ｉ／Ａ３３９Ｄ；Ｐ２４７Ｉ／Ａ３３９Ｑ；Ｄ２８０Ｈ／Ｋ２９０Ｓ；Ｄ２８０Ｈ／Ｋ２９０Ｓ／Ｓ２９８Ｄ；Ｄ２８０Ｈ／Ｋ２９０Ｓ／Ｓ２９８Ｖ；Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ；Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ；Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ；Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ；Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ；Ｋ２９０Ｅ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ；Ｋ２９０Ｎ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ；Ｋ２９０Ｅ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ／Ｋ３２６Ｅ；及び／又はＫ２９０Ｎ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ／Ｋ３２６Ｅ。

ＩｇＧ Ｆｃ含有タンパク質のエフェクタ機能を増大させる別の方法として、Ｆｃのフコシル化を減少させることによるものがある。Ｆｃに結合した二分岐複合型オリゴ糖からコアフコースを除去することにより、抗原結合性又はＣＤＣエフェクタ機能を変化させることなく、ＡＤＣＣエフェクタ機能が著しく増大する。Ｆｃ含有分子、例えば抗体のフコシル化を減少させ、又は無効にするための幾つかの方法が知られている。これらの方法は、ＦＵＴ８ノックアウト細胞株、変異型ＣＨＯ株Ｌｅｃ１３、ラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０、ＦＵＴ８遺伝子に対して特異的な低分子干渉ＲＮＡを含む細胞株、並びにβ－１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ及びゴルジα－マンノシダーゼＩＩを共発現する細胞株が挙げられる特定の哺乳動物細胞株における組換え発現を含む。これ以外にも、Ｆｃ含有分子は、植物細胞、酵母、又は原核細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の非哺乳細胞内で発現されてもよい。

特定の実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質又は抗ＩＬ－２抗体は、エフェクタ機能を低下させるように操作されたＦｃを含む。エフェクタ機能が低下した例示的なＦｃ分子として、以下の置換基を有するものが挙げられる：Ｎ２９７Ａ若しくはＮ２９７Ｑ（ＩｇＧ１）；Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＩｇＧ１）；Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ（ＩｇＧ２）；Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｅ３１８Ａ（ＩｇＧ４）；Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ａ３３１Ｓ（ＩｇＧ２）；Ｃ２２０Ｓ／Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｐ２３８Ｓ（ＩｇＧ１）；Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ（ＩｇＧ１）；Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ（ＩｇＧ１）；又はＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（ＩｇＧ１）。

ヒトＩｇＧ１は、Ｎ２９７（ＥＵナンバリング系）にグリコシル化部位を有し、グリコシル化がＩｇＧ１抗体のエフェクター機能に寄与することが公知である。例示的ＩｇＧ１配列を配列番号３に提供する：

基は、非グリコシル化抗体を形成するように変異したＮ２９７を有する。当該変異は、Ｎ２９７を、生理化学的性質がアスパラギンと類似するアミノ酸、例えばグルタミンにより（Ｎ２９７Ｑ）、又は極性基を有していないアスパラギンを模倣するアラニンにより（Ｎ２９７Ａ）置換することに焦点を当てている。

本明細書中で用いられる「非グリコシル化抗体」又は「非グリコシル化ｆｃ」は、Ｆｃの２９７位にある残基のグリコシル化状態を指す。抗体又は他の分子は、１つ以上の他の位置にてグリコシル化を含有してよいが、依然として非グリコシル化抗体又は非グリコシル化Ｆｃ融合タンパク質であるとみなされ得る。

エフェクタ無機能ＩｇＧ１ Ｆｃを形成しようとして、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸Ｎ２９７の、グリシンへの変異、すなわちＮ２９７Ｇが、当該残基での他のアミノ酸置換よりもはるかに優れた精製効率及び生物物理学的特性を提供することが発見された。実施例８参照。ゆえに、好ましい実施形態において、ＩＬ－２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ２９７Ｇ置換を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃを含む。Ｎ２９７Ｇ置換を含むＦｃは、分子がヒトＩｇＧ１ Ｆｃを含むあらゆるコンテクストにおいて有用であり、ＩＬ－２変異タンパク質Ｆｃ融合体のコンテクストにおける使用に限定されない。特定の実施形態において、抗体は、Ｎ２９７Ｇ置換を有するＦｃを含む。

Ｎ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃを含むＦｃがまた、更なる挿入、欠失、及び置換を含んでもよい。特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ１ ＦｃはＮ２９７Ｇ置換を含み、配列番号３に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、又は少なくとも９９％同一である。特に好ましい実施形態では、Ｃ末端リジン残基が置換されているか、又は欠失している。Ｎ２９７Ｇ置換とＣ末端リジンの欠失とを含むヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列を有する配列番号４に記載される：

グリコシル化ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、グリコシル化ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子よりも安定ではないことが示された。Ｆｃ領域はさらに、非グリコシル化分子の安定性を増大させるように操作されていてよい。一部の実施形態において、１つ以上のアミノ酸がシステインに置換されて、ジスルフィド結合を二量体状態で形成している。配列番号３に記載されるアミノ酸配列の残基Ｖ２５９、Ａ２８７、Ｒ２９２、Ｖ３０２、Ｌ３０６、Ｖ３２３、又はＩ３３２が、システインにより置換されていてよい。好ましい実施形態において、特定の残基対は、互いにジスルフィド結合を優先的に形成することでジスルフィド結合のスクランブリングを制限又は防止するような置換である。好ましい対として、以下に限定されないが、Ａ２８７Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ、並びにＶ３２３Ｃ及びＩ３３２Ｃが挙げられる。

本明細書中で提供されるのは、残基Ｖ２５９、Ａ２８７、Ｒ２９２、Ｖ３０２、Ｌ３０６、Ｖ３２３、又はＩ３３２の１つ以上がシステインで置換されているＦｃ含有分子であり、その例として、Ａ２８７Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ、又はＶ３２３Ｃ及びＩ３３２Ｃの置換を含むものが挙げられる。

ＩｇＧ１ Ｆｃに対して形成されてよい追加的な変異として、Ｆｃ含有ポリペプチドの中でヘテロ二量体形成を促進するものが挙げられる。一部の実施形態において、Ｆｃ領域は、細胞中で共発現される場合に２つの異なるＦｃ含有ポリペプチド鎖のヘテロ二量体形成を促進する「ノブ」及び「ホール」を作出するように操作されている。米国特許第７，６９５，９６３号明細書。他の実施形態において、Ｆｃ領域は、静電的ステアリングを用いて、細胞中で共発現される場合に２つの異なるＦｃ含有ポリペプチドのホモ二量体形成を阻止しながら、ヘテロ二量体形成を促進するように変更されている。国際公開第０９／０８９，００４号パンフレット（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。好ましいヘテロ二量体Ｆｃとして、Ｆｃの一方の鎖がＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋの置換を含み、Ｆｃの他方の鎖がＫ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄの置換を含むものが挙げられる。他の実施形態において、Ｆｃの一方の鎖が、Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、及びＥ３５７Ｋの置換を含み、Ｆｃの他方の鎖が、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｄ、及びＫ３７０Ｄの置換を含む。

特定の実施形態において、Ｆｃ結合ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子は、ＦｃとＩＬ－２分子又は変異タンパク質との間のリンカー及び／又はＦｃとＴＮＦＲアゴニストとの間のリンカーを含む。多くの異なるリンカーポリペプチドが当該技術分野において公知であり、Ｆｃ結合ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子のコンテクストで使用され得る。好ましい実施形態において、Ｆｃ結合ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子は、ＦｃとＩＬ－２変異タンパク質との間にＧＧＧＧＳ（配列番号５）、ＧＧＮＧＴ（配列番号６）、又はＹＧＮＧＴ（配列番号７）からなるペプチドの１つ以上のコピーを含む。一部の実施形態において、ＦｃとＩＬ－２分子又は変異タンパク質との間及び／又はＦｃとＴＮＦＲアゴニスト領域との間のポリペプチド領域は、ＧＧＧＧＳ（配列番号５）、ＧＧＮＧＴ（配列番号６）、又はＹＧＮＧＴ（配列番号７）の単一コピーを含む。本明細書に示されるとおり、リンカーＧＧＮＧＴ（配列番号６）又はＹＧＮＧＴ（配列番号７）は、適切な細胞で発現させるとグリコシル化され、かかるグリコシル化は、溶液中での、及び／又はインビボ投与したときのタンパク質を安定化させる助けとなり得る。したがって、特定の実施形態において、ＩＬ－２変異タンパク質融合タンパク質は、Ｆｃ領域とＩＬ－２変異タンパク質領域との間にグリコシル化されたリンカーを含む。

ＦｃのＣ末端部分及び／又はＩＬ－２分子又は変異タンパク質のアミノ末端部分は、哺乳類細胞で発現したときにＦｃ結合ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子のグリコシル化プロファイルを変化させる１つ以上の変異を含有し得る。特定の実施形態において、Ｆｃ結合ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子は、Ｔ３置換、例えば、Ｔ３Ｎ又はＴ３Ａをさらに含む。Ｆｃ結合ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子は、Ｓ５Ｔなど、Ｓ５置換をさらに含み得る。

本発明の範囲内には、Ｆｃ結合ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子の共有結合修飾が含まれ、これは、常にというわけではないが、概して翻訳後に行われる。例えば、選択の側鎖又はＮ末端若しくはＣ末端残基と反応する能力のある有機誘導体化剤をそのアミノ酸残基の特定のものと反応させることにより、分子に幾つかのタイプの共有結合修飾が導入される。

システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸又はクロロアセトアミドなどのα－ハロ酢酸塩（及び対応するアミン類）と反応して、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α－ブロモ－β－（５－イミダゾリル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸塩、Ｎ－アルキルマレイミド類、３－ニトロ－２－ピリジルジスルフィド、メチル２－ピリジルジスルフィド、ｐ－クロロメルクリ安息香酸塩、２－クロロメルクリ－４－ニトロフェノール、又はクロロ－７－ニトロベンゾ－２－オキサ－１，３－ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。

ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５～７．０でのジエチルピロカーボナートとの反応によって誘導体化される。なぜなら、当該剤は、ヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるからである。また、パラ－ブロモフェナシルブロミドが有用である；反応は、好ましくは、ｐＨ６．０の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で実行される。

リシニル及びアミノ末端残基は、コハク酸無水物又は他のカルボン酸無水物と反応する。これらの剤による誘導体化は、リシニル残基の電荷を反転させる効果を有する。アルファ－アミノ含有残基を誘導体化するのに適した他の試薬として、イミドエステル、例えばピコリンイミド酸メチル；リン酸ピリドキサール；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ－メチルイソ尿素；２，４－ペンタンジオン；及びグリオキシラートとのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。

アルギニル残基は、１つ又は幾つかの従来型の試薬、とりわけフェニルグリオキサール、２，３－ブタンジオン、１，２－シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンとの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、反応がアルカリ条件下で実行される必要がある。なぜなら、グアニジン官能基のｐＫ_ａが高いためである。さらに、当該試薬は、リジンの基及びアルギニンイプシロン－アミノ基と反応し得る。

チロシル残基の特異的修飾は、特に、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基中へのスペクトル標識の導入を目的として、行われてよい。最も一般的には、Ｎ－アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンを用いて、それぞれＯ－アセチルチロシル種及び３－ニトロ誘導体を形成する。チロシル残基を、^１２５Ｉ又は^１３１Ｉを用いてヨウ素化して、ラジオイムノアッセイに用いられる標識タンパク質を調製する、先に記載されるクロラミンＴ法が適している。

カルボキシル側基（アスパルチル又はグルタミル）が、カルボジイミド（Ｒ’－Ｎ＝Ｃ＝Ｎ－－Ｒ’）との反応によって選択的に修飾され、ここで、Ｒ及びＲ’は、場合によっては、異なるアルキル基、例えば１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリニル－４－エチル）カルボジイミド又は１－エチル－３－（４－アゾニア－４，４－ジメチルペンチル）カルボジイミドである。さらに、アスパルチル残基及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換される。

二官能性剤による誘導体化は、種々の方法に用いられる水不溶性支持マトリックス又は表面に抗原結合タンパク質を架橋するのに有用である。一般的に用いられる架橋剤として、例えば、１，１－ビス（ジアゾアセチル）－２－フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４－アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミドエステル（３，３’－ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）等のジスクシンイミジルエステルが挙げられる）、及びビス－Ｎ－マレイミド－１，８－オクタン等の二官能性マレイミドが挙げられる。メチル－３－［（ｐ－アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミダート等の誘導体化剤により、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体が得られる。これ以外にも、反応性非水溶性マトリックス、例えば、米国特許第３，９６９，２８７号明細書；米国特許第３，６９１，０１６号明細書；米国特許第４，１９５，１２８号明細書；米国特許第４，２４７，６４２号明細書；米国特許第４，２２９，５３７号明細書；及び米国特許第４，３３０，４４０号明細書に記載されている臭化シアン活性化炭水化物及び反応基質が、タンパク質固定化に使用される。

グルタミニル残基及びアスパラギニル残基は、頻繁に脱アミド化されて、それぞれ、対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基になる。これ以外にも、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も、本発明の範囲内に含まれる。

他の修飾として、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル残基又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα－アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３，ｐｐ．７９－８６）、Ｎ末端アミンのアセチル化、並びに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。

本発明の範囲内に含まれるＩＬ－２変異タンパク質、ＩＬ－２変異タンパク質Ｆｃ融合体、又は抗ＩＬ－２抗体の別のタイプの共有結合修飾は、タンパク質のグリコシル化パターンを変更することを含む。当該技術において知られているように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、以下で考察される特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在又は不在）、又はタンパク質が産生される宿主細胞若しくは生物体の双方によって決まり得る。特定の発現系を以下で考察する。

ポリペプチドのグリコシル化は、典型的に、Ｎ結合型又はＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－トレオニン（Ｘは、プロリン以外のあらゆるアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。ゆえに、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ結合型グリコシル化は、糖であるＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はトレオニンへの結合を指すが、５－ヒドロキシプロリン又は５－ヒドロキシリシンが用いられてもよい。

ＩＬ－２変異タンパク質、ＩＬ－２変異タンパク質Ｆｃ融合体、又は抗ＩＬ－２抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列が、（Ｎ結合型グリコシル化部位の）上記トリペプチド配列の１つ以上を含有するように、当該アミノ酸配列を変更することによって首尾良く達成され得る。また、変更は、（Ｏ結合型グリコシル化部位について）１つ以上のセリン残基若しくはトレオニン残基の、開始配列への付加、又はそれらによる置換によってなされてもよい。容易にするために、ＩＬ－２変異タンパク質、ＩＬ－２変異タンパク質Ｆｃ融合体、又は抗ＩＬ－２抗体のアミノ酸配列は好ましくは、ＤＮＡレベルでの変化を介して、特に、所望のアミノ酸に翻訳されることとなるコドンを生成するように、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを、予め選択された塩基にて変異させることによって変更される。

ＩＬ－２変異タンパク質、ＩＬ－２変異タンパク質Ｆｃ融合体、又は抗ＩＬ－２抗体上の炭水化物部分の数を増やす別の手段として、グリコシドの、タンパク質との化学的カップリング又は酵素的カップリングによるものがある。この手順は、Ｎ結合型グリコシル化及びＯ結合型グリコシル化について、グリコシル化能を有する宿主細胞におけるタンパク質の産生を必要としない点で、有利である。用いられるカップリング様式に応じて、糖は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えばシステインの基、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えば、セリン、スレオニン、若しくはヒドロキシプロリンの基、（ｅ）芳香族残基、例えば、フェニルアラニン、チロシン、若しくはトリプトファンの残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に結合されてよい。これらの方法は、１９８７年９月１１日公開の国際公開第８７／０５３３０号パンフレット及びＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９－３０６に記載されている。

開始ＩＬ－２変異タンパク質、ＩＬ－２変異タンパク質Ｆｃ融合体、又は抗ＩＬ－２抗体上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的に達成されても酵素的に達成されてもよい。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸又は等価の化合物へのタンパク質の曝露が必要となる。この処理により、ポリペプチドは無傷な状態のままで、結合している糖（Ｎ－アセチルグルコサミン又はＮ－アセチルガラクトサミン）を除くほとんど又は全ての糖が切断される。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２及びＥｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１によって記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０によって記載されるように、種々のエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用によって達成することができる。潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化は、Ｄｕｓｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５によって記載される化合物ツニカマイシンの使用によって妨げられ得る。ツニカマイシンは、タンパク質－Ｎ－グリコシド結合の形成を阻止する。

ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子の別のタイプの共有結合修飾は、米国特許第４，６４０，８３５号明細書；同第４，４９６，６８９号明細書；同第４，３０１，１４４号明細書；同第４，６７０，４１７号明細書；同第４，７９１，１９２号明細書又は同第４，１７９，３３７号明細書に記載される方法で、限定はされないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレン類などの様々なポリオール類を含めた様々な非タンパク質性ポリマーをタンパク質と連結することを含む。加えて、ＰＥＧなどのポリマーを付加し易くなるように、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子内の様々な位置にアミノ酸置換が作られてもよい。したがって、本発明の実施形態は、ＰＥＧ化されたＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子を含む。かかるＰＥＧ化されたタンパク質は、そのＰＥＧ化されていない形態と比べて半減期の増加及び／又は免疫原性の低下を呈し得る。

ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子をコードするポリヌクレオチド
本発明内に包含されるのは、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子をコードする核酸である。本発明の態様は、本明細書中に記載されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドバリアント（例えば、縮重に起因する）を含む。

核酸の単離用のプローブ若しくはプライマーとして、又はデータベース検索用のクエリー配列として用いられることとなる、本明細書中に記載されるアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列を、アミノ酸配列からの「逆翻訳」によって得ることができる。周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順を使用して、ＩＬ－２変異タンパク質及びＩＬ－２変異タンパク質Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離且つ増幅することができる。ＤＮＡ断片の組合せの所望の末端を定義するオリゴヌクレオチドが、５’プライマー及び３’プライマーとして使用される。オリゴヌクレオチドは追加的に、制限エンドヌクレアーゼ用の認識部位を含有して、ＤＮＡ断片の増幅した組合せの、発現ベクター中への挿入を促進することができる。ＰＣＲ技術は、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７（１９８８）；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９８９），ｐｐ．１８９－１９６；及びＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）に記載されている。

本発明の核酸分子には、一本鎖及び二本鎖の双方の形態のＤＮＡ及びＲＮＡ、並びに対応する相補的配列が含まれる。「単離核酸」は、天然に存在する源から単離された核酸の場合、核酸が単離された生物のゲノム中に存在する、隣接する遺伝子配列から分離された核酸である。鋳型から酵素的に、又は化学的に合成された核酸、例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、又はオリゴヌクレオチドの場合、そのようなプロセスに由来する核酸は、単離核酸であると理解される。単離核酸分子は、別個の断片の形態の核酸分子、又はより大きな核酸コンストラクトの構成要素としての核酸分子を指す。好ましい一実施形態において、核酸は、夾雑する内因性物質を実質的に含まない。核酸分子は、好ましくは、実質的に純粋な形態で、且つ標準的な生化学的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に概説されているもの）によって、その構成要素ヌクレオチド配列の識別、操作、及び回収を可能にする量又は濃度で、少なくとも１回単離されたＤＮＡ又はＲＮＡから由来した。そのような配列は、好ましくは、典型的には真核生物遺伝子内に存在する内部非翻訳配列又はイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供且つ／又は構築される。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’側又は３’側に存在することができ、この場合、これは、コード領域の操作又は発現を妨害しない。

本発明に従うＩＬ－２変異タンパク質は、通常、カセット若しくはＰＣＲ変異誘発、又は当該技術において周知の他の技術を用いた、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的変異誘発によって、バリアントをコードするＤＮＡを生成し、その後、本明細書中で概説されているような細胞培養において組換えＤＮＡを発現させることによって、調製される。しかしながら、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子は、確立された技術を用いるインビトロ合成によって調製されてもよい。バリアントは典型的に、天然に存在する類似体と同じ定性的生物活性、例えば、Ｔｒｅｇ増殖を示すが、以下でより詳細に概説されるように、改変された特徴を有するバリアントを選択することもできる。

当業者によって理解されるように、遺伝子コードの縮重に起因して、本発明の各ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子は、極めて多数の核酸によってコードされており、当該核酸の各々が、本発明の範囲内であり、標準的な技術を用いて形成することができる。ゆえに、特定のアミノ酸配列を識別すると、当業者であれば、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変化させない方法で、１つ以上のコドンの配列を単に修飾することによって、任意の数の異なる核酸を形成することができる。

本発明はまた、先の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、発現ベクター、転写又は発現カセットの形態で、発現系及び構築物を提供する。加えて、本発明は、そのような発現系又は構築物を含む宿主細胞を提供する。

典型的には、いずれの宿主細胞においても用いられる発現ベクターは、プラスミドを維持するための配列、並びに外因性ヌクレオチド配列のクローニング及び発現のための配列を含有することとなる。まとめて「フランキング配列」と称されるそのような配列は、特定の実施形態において、典型的には、以下のヌクレオチド配列：プロモータ、１つ以上のエンハンサ配列、複製起点、転写終結配列、ドナー及びアクセプタスプライス部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されることとなるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、並びに選択マーカーエレメントの１つ以上を含むこととなる。これらの配列の各々を、以下で考察する。

場合によっては、ベクターは、「タグ」コード配列、すなわち、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子コード配列の５’末端又は３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含有してよく；オリゴヌクレオチド配列は、市販の抗体が存在するポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓ：ＨＨＨＨＨＨ（配列番号８）等）、又は別の「タグ」、例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス）、若しくはｍｙｃをコードする。このタグは典型的に、ポリペプチドの発現直後にポリペプチドに融合されて、宿主細胞からのポリペプチドのアフィニティ精製又は検出のための手段として機能し得る。アフィニティ精製は、例えば、タグに対する抗体を親和性マトリックスとして用いるカラムクロマトグラフィによって達成することができる。場合によっては、タグはその後、種々の手段によって、例えば、切断用の特定のペプチダーゼを用いて除去され得る。

フランキング配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種及び／又は株に由来）、異種（すなわち、宿主細胞種又は株以外の種に由来）、ハイブリッド（すなわち、２つ以上の源由来のフランキング配列の組合せ）、合成、又は天然であってよい。したがって、フランキング配列の源は、あらゆる原核生物若しくは真核生物、あらゆる脊椎生物若しくは無脊椎生物、又はあらゆる植物であってよいが、フランキング配列は、宿主細胞機構において機能的であり、且つ当該機構によって活性化され得ることを条件とする。

本発明のベクターにおいて有用なフランキング配列は、当該技術において周知の幾つかの方法のいずれかによって得ることができる。典型的には、本明細書において有用なフランキング配列は、マッピング及び／又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されていることになるため、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切な組織源から単離することができる。場合により、フランキング配列の全ヌクレオチド配列が知られている場合がある。この場合、核酸合成又はクローニングのための本明細書中に記載される方法を用いてフランキング配列を合成することができる。

フランキング配列の全てが知られているか、又はその一部のみが知られているかに拘わらず、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、且つ／又は同じ若しくは別の種に由来するオリゴヌクレオチド及び／若しくはフランキング配列断片等の適したプローブによりゲノムライブラリをスクリーニングすることによって、フランキング配列を得ることができる。フランキング配列が不明である場合、フランキング配列を含有するＤＮＡの断片は、例えば、コード配列又は１つ又は複数の別の遺伝子すら含有し得るより大きなＤＮＡ片から単離することができる。制限エンドヌクレアーゼで消化することで適切なＤＮＡ断片を生成した後に、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）、又は当業者に知られている他の方法を用いて単離することによって、単離を達成してよい。この目的を達成するのに適した酵素の選択は、当業者であれば容易に明らかとなろう。

複製起点は典型的に、市販の原核生物発現ベクターの一部であり、当該起点は、宿主細胞内でのベクターの増幅を補助する。選択したベクターが複製起点部位を含有していなければ、知られている配列に基づいて当該部位を化学的に合成して、ベクター中にライゲートしてもよい。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に由来する複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適しており、種々のウイルス起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、又はパピローマウイルス、例えば、ＨＰＶ又はＢＰＶ）が、哺乳動物細胞におけるベクターのクローニングに有用である。一般に、複製起点構成要素は、哺乳動物発現ベクターには必要でない（例えば、ＳＶ４０起点は、多くの場合、ウイルス初期プロモータも含有するという理由でのみ、用いられている）。

転写終結配列は典型的に、ポリペプチドコード領域の末端に対して３’側に位置しており、転写を終結させるように機能する。通常、原核細胞における転写終結配列は、Ｇ－Ｃリッチ断片と、それに続くポリＴ配列である。当該配列は、ライブラリから容易にクローニングされるか、又はベクターの一部として商業的に購入すらされる一方、本明細書中に記載される方法等の核酸合成方法を用いて容易に合成することもできる。

選択マーカー遺伝子は、選択培地中で増殖させた宿主細胞の生存及び増殖に必須のタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞に、抗生物質若しくは他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、若しくはカナマイシンに対する耐性を付与し；（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補完し；又は（ｃ）複合培地若しくは規定培地からは利用不能の重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。特異的選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。有利には、ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物宿主細胞及び真核生物宿主細胞の双方における選択に用いることができる。

他の選択遺伝子を用いて、発現されることとなる遺伝子を増幅してもよい。
増幅は、増殖又は細胞生存にとって重要なタンパク質の産生に必要とされる遺伝子が、連続する世代の組換え細胞の染色体内でタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に適した選択マーカーの例として、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子及びプロモーターレスチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体を、当該形質転換体のみが唯一、ベクター中に存在する選択遺伝子によって生存するように一意的に適合される選択圧の下に置く。選択圧は、培地中の選択剤濃度が連続的に増大する条件下で形質転換細胞を培養することによって付与され、それによって、選択可能な遺伝子、及び結果的に、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子など、所望のポリペプチドをコードする遺伝子の両方の増幅につながる。結果として、増幅したＤＮＡから、増大した分量のポリペプチドが合成される。

リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必須であり、シャイン・ダルガーノ配列（原核生物）又はコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。当該エレメントは典型的に、プロモータの３’側に、且つ発現されることになるポリペプチドのコード配列の５’側に位置決めされる。特定の実施形態において、１つ以上のコード領域は、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結されていてよく、単一のＲＮＡ転写産物から２つのオープンリーディングフレームの翻訳が可能となる。

真核生物宿主細胞発現系においてグリコシル化が所望される等の場合には、グリコシル化又は収率を向上させるために、種々のプレ配列又はプロ配列を操作してよい。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更するか、又はプロ配列を付加してよく、これもグリコシル化に影響し得る。最終タンパク質産物は、－１位（成熟タンパク質の第１のアミノ酸に対して）において、発現に付随する１つ以上の追加的なアミノ酸を有する場合があり、これは、完全には除去されていない場合がある。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合した、ペプチダーゼ切断部位内に見出される１つ又は２つのアミノ酸残基を有し得る。これ以外にも、幾つかの酵素切断部位の使用により、酵素が成熟ポリペプチド内のそのような領域にて切れているならば、所望のポリペプチドが僅かに切断された形態が生じる場合がある。

本発明の発現ベクター及びクローニングベクターは典型的に、宿主生物によって認識され、且つＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子をコードする分子に作動可能に連結されているプロモータを含有することとなる。プロモータは、構造遺伝子（一般に、約１００～１０００ｂｐ以内）の開始コドンの上流（即ち５’側）に位置決めされた、構造遺伝子の転写を制御する非転写配列である。従来、プロモータは、２つのクラス：誘導性プロモータ及び構成的プロモータの１つにグループ化される。誘導性プロモータは、その制御下で、栄養素の有無又は温度の変化等の培養条件の何らかの変化に応じて、ＤＮＡからの転写レベルの増大を開始する。一方、構成的プロモータは、これが作動可能に連結されている遺伝子を一様に、即ち、遺伝子発現に対する制御をほとんど又は全く行わずに、転写する。種々の潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモータが周知である。

酵母宿主に用いるのに適したプロモータもまた、当該技術において周知である。有利には、酵母エンハンサが、酵母プロモータと共に用いられる。哺乳動物宿主細胞に用いるのに適したプロモータは周知であり、以下に限定されないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２型等）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから得られるものが挙げられる。他の適した哺乳動物プロモータとして、異種哺乳動物プロモータ、例えば、熱ショックプロモータ及びアクチンプロモータが挙げられる。

対象となり得る追加的なプロモータとして、以下に限定されないが：ＳＶ４０初期プロモータ（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４－３１０）；ＣＭＶプロモータ（Ｔｈｏｒｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６５９－６６３）；ラウス肉腫ウイルスの３’側の長い末端リピートに含有されるプロモータ（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７－７９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４－１４４５）；メタロチオネイン遺伝子由来のプロモータ及び調節配列（Ｐｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９－４２）；及びベータ－ラクタマーゼプロモータ等の原核生物プロモータ（Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７－３７３１）；又はｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１－２５）が挙げられる。また、対象となるのは、組織特異性を示し、且つトランスジェニック動物において利用されている以下の動物転写制御領域である：膵腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９－６４６；Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９－４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５－５１５）；膵ベータ細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５－１２２）；リンパ球系細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７－６５８；Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３－５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６－１４４４）；精巣細胞、***細胞、リンパ球系細胞及びマスト細胞において活性であるマウス***腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５－４９５）；肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８－２７６）；肝臓において活性であるアルファ－フェト－タンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９－１６４８；Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：５３－５８）；肝臓において活性であるアルファ１－アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１－１７１）；骨髄細胞において活性であるベータグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８－３４０；Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９－９４）；脳内のオリゴデンドロサイト細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３－７１２）；骨格筋において活性であるミオシン軽鎖２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３－２８６）；並びに視床下部において活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２－１３７８）。

エンハンサ配列をベクター中に挿入して、高等真核生物による転写を増大させてもよい。エンハンサは、ＤＮＡのシス作用性エレメントであり、通常、約１０～３００ｂｐ長であり、プロモータに作用して転写を増大させる。エンハンサは、方向及び位置に比較的依存せず、転写単位に対して５’側及び３’側の双方の位置にて見出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能な幾つかのエンハンサ配列が知られている（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ－フェト－タンパク質、及びインスリン）。しかしながら、典型的には、ウイルス由来のエンハンサが用いられる。当該技術において知られているＳＶ４０エンハンサ、サイトメガロウイルス初期プロモータエンハンサ、ポリオーマエンハンサ、及びアデノウイルスエンハンサは、真核生物プロモータの活性化のための例示的な増強エレメントである。エンハンサは、ベクターにおいて、コード配列の５’側又は３’側のいずれに位置してもよいが、典型的には、プロモータから５’側の部位に位置決めされる。適切な天然又は異種のシグナル配列（リーダー配列又はシグナルペプチド）をコードする配列を発現ベクター中に組み込んで、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子の細胞外分泌を促進することができる。シグナルペプチド又はリーダーの選択は、タンパク質が産生されることになる宿主細胞のタイプに依存し、異種性のシグナル配列が、天然のシグナル配列に取って代わり得る。哺乳類宿主細胞において機能性のシグナルペプチドの例としては、以下が挙げられる：米国特許第４，９６５，１９５号明細書に記載されるインターロイキン－７（ＩＬ－７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８に記載されるインターロイキン－２受容体のシグナル配列；欧州特許第０３６７ ５６６号明細書に記載されるインターロイキン－４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号明細書に記載されるＩ型インターロイキン－１受容体シグナルペプチド；欧州特許第０ ４６０ ８４６号明細書に記載されるＩＩ型インターロイキン－１受容体シグナルペプチド。

ベクターは、ベクターが宿主細胞ゲノム中に組み込まれた場合に発現を促進する１つ以上のエレメントを含有してよい。例として、ＥＡＳＥエレメント（Ａｌｄｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ． ２００３ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ． １９：１４３３－３８）及びマトリックス結合領域（ＭＡＲ）が挙げられる。ＭＡＲは、クロマチンの構造的組織化を媒介して、統合されたベクターを「位置」効果から保護し得る。ゆえに、ＭＡＲは、安定したトランスフェクタントを作出するのにベクターが用いられる場合に、特に有用である。幾つかの天然及び合成ＭＡＲ含有核酸が、当該技術、例えば、米国特許第６，２３９，３２８号明細書；米国特許第７，３２６，５６７号明細書；米国特許第６，１７７，６１２号明細書；米国特許第６，３８８，０６６号明細書；米国特許第６，２４５，９７４号明細書；米国特許第７，２５９，０１０号明細書；米国特許第６，０３７，５２５号明細書；米国特許第７，４２２，８７４号明細書；米国特許第７，１２９，０６２号明細書において知られている。

本発明の発現ベクターは、市販のベクター等の開始ベクターから構築されてよい。そのようなベクターは、所望のフランキング配列の全てを含有していてもよいし、含有していなくてもよい。本明細書中に記載されるフランキング配列の１つ以上がベクター内に最初から存在していない場合、それらを個々に得てベクター中にライゲートしてもよい。フランキング配列の各々を得るために用いられる方法は、当業者に周知である。

ベクターが構築されて、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子をコードする核酸分子が、ベクターの適切な部位中に挿入された後に、完全なベクターが、増幅及び／又はポリペプチド発現に適した宿主細胞中に挿入されてよい。選択された宿主細胞中への発現ベクターの形質転換は、周知の方法、例えば、形質移入、感染、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介形質移入、又は他の知られている技術によって達成されてよい。選択される方法は、部分的に、用いられることになる宿主細胞のタイプに応じることとなる。これらの方法及び他の適した方法は、当業者に周知であり、例えば、前掲のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１に示されている。

宿主細胞は、適切な条件下で培養される場合、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子を合成し、これらはその後、（宿主細胞が培地中に分泌するならば）培地から収集され得、又は（分泌されなければ）産生宿主細胞から直接収集され得る。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に望ましいか又は必須であるポリペプチド修飾（グリコシル化又はリン酸化等）、及び生物学的に活性な分子へのフォールディングの容易さ等の種々の要因によって決まることとなる。宿主細胞は、真核生物であっても原核生物であってもよい。

発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術において周知であり、以下に限定されないが、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株が挙げられ、当該技術において知られている発現系に用いられるあらゆる細胞株を用いて、本発明の組換えポリペプチドを形成することができる。一般に、宿主細胞は、所望のＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子をコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターにより形質転換される。使用されてよい宿主細胞には、原核生物、酵母、又は高等真核細胞がある。原核生物として、グラム陰性生物又はグラム陽性生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はバシラス綱（Ｂａｃｉｌｌｉ）が挙げられる。高等真核細胞として、昆虫細胞、及び哺乳動物起源の確立された細胞株が挙げられる。適した哺乳動物宿主細胞株の例として、サル腎細胞のＣＯＳ－７系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ ２３：１７５）、Ｌ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、若しくはそれらの誘導体、例えば、無血清培地中で増殖するＶｅｇｇｉｅ ＣＨＯ及び関連細胞株（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８：３１）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０）細胞株、及びＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１に記載されているようなアフリカミドリザル腎細胞株ＣＶＩ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）に由来するＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞株、ヒト胎児腎細胞、例えば、２９３、２９３ＥＢＮＡ若しくはＭＳＲ２９３、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換霊長類細胞株、正常な二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養物に由来する細胞株、一次外植片、ＨＬ－６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞、又はＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。場合によっては、種々のシグナル伝達アッセイ又はレポータアッセイにおいてポリペプチドを用いることが望ましい場合に、哺乳動物細胞株、例えば、ＨｅｐＧ２／３Ｂ、ＫＢ、ＮＩＨ３Ｔ３、又はＳ４９が、ポリペプチドの発現に用いられ得る。

これ以外にも、酵母等の下等真核生物において、又は細菌等の原核生物において、ポリペプチドを生成することが可能である。適した酵母として、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、***酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属株、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、又は異種ポリペプチドを発現することができるあらゆる酵母株が挙げられる。適した細菌株として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、又は異種ポリペプチドを発現することができるあらゆる細菌株が挙げられる。ポリペプチドが、酵母又は細菌内で形成されるならば、酵母又は細菌内で産生されるポリペプチドを、例えば、適切な部位のリン酸化又はグリコシル化によって修飾して、機能的ポリペプチドを得ることが望ましい場合がある。そのような共有結合は、知られている化学的方法又は酵素的方法を用いて達成することができる。

また、ポリペプチドは、本発明の単離核酸を、１種以上の昆虫発現ベクター内の適した制御配列に作動可能に連結させて、昆虫発現系を使用することによって生成することができる。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系用の材料及び方法は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．由来のキット形態で市販されており （ＭａｘＢａｃ（登録商標）キット）、そのような方法は、Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）、及びＬｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）に記載されているように、当該技術において周知である。無細胞翻訳系もまた、本明細書中で開示される核酸構築物に由来するＲＮＡを用いてポリペプチドを生成するのに使用することができる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主に用いるのに適切なクローニングベクター及び発現ベクターが、Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５）によって記載されている。好ましくは少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、本発明の単離核酸を含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」である。

また、含まれるのは、本明細書中に記載される例示的なＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子のいずれかをコードする単離核酸である。好ましい実施形態において、Ｆｃ部分、及びＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子は、場合によってはリンカーがＦｃ領域とＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子との間にコードされて、単一のオープンリーディングフレーム内にコードされている。

別の態様において、本明細書中で提供されるのは、プロモータに作動可能に連結された、上記ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子コード核酸を含む発現ベクターである。

別の態様において、本明細書中で提供されるのは、上記ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子をコードする単離核酸を含む宿主細胞である。宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の原核細胞であってもよいし、哺乳動物細胞等の真核細胞であってもよい。特定の実施形態において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。

別の態様において、本明細書中で提供されるのは、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子を形成する方法である。当該方法は、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子Ｆｃ融合タンパク質に作動可能に連結されたプロモータが発現される条件の下で、宿主細胞を培養することを含む。その後、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子Ｆｃ融合タンパク質は、前記培養から収穫される。ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子Ｆｃ融合タンパク質は、培地及び／又は宿主細胞溶解物から収穫され得る。

医薬組成物
一部の実施形態において、本発明は、治療有効量のＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子を、薬学的に有効な希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、及び／又はアジュバントと一緒に含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、ＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子Ｆｃ融合タンパク質のコンテクスト内である。本発明の医薬組成物として、液体組成物、凍結組成物、及び凍結乾燥組成物が挙げられるが、これらに限定されない。

好ましくは、製剤材料は、使用される投与量及び濃度にて、レシピエントにとって非毒性である。特定の実施形態において、治療有効量のＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子含有治療分子、例えば、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子Ｆｃ融合体を含む医薬組成物が提供される。

特定の実施形態において、医薬組成物は、組成物の、例えば、ｐＨ、オスモル濃度、粘性、透明性、色調、等張性、臭気、滅菌状態、安定性、溶解速度若しくは放出速度、吸収性、又は透過性を改変、維持、又は保存するための製剤材料を含有してよい。そのような実施形態において、適した製剤材料として、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、プロリン、又はリシン等）；抗微生物剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、又は亜硫酸水素ナトリウム等）；緩衝液（ホウ酸、重炭酸、トリス－ＨＣｌ、クエン酸、リン酸、又は他の有機酸等）；増量剤（マンニトール又はグリシン等）；キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリン、又はヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリン等）；充填剤；単糖、二糖、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、又はデキストリン等）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等）；着色剤、香味剤、及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドン等）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウム等）；防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、又は過酸化水素等）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、又はポリエチレングリコール等）；糖アルコール（マンニトール又はソルビトール等）；懸濁化剤；界面活性剤若しくは湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０等のポリソルベート、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール等）；安定性増強剤（スクロース又はソルビトール等）；張度増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトールソルビトール等）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤、並びに／又は医薬アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８”Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ参照。

特定の実施形態において、最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式、及び所望の投与量に応じて、当業者によって決定されることとなる。例えば、前掲のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ参照。特定の実施形態において、そのような組成物は、本発明の抗原結合タンパク質の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、及びインビボでのクリアランス速度に影響し得る。特定の実施形態において、医薬組成物中の主なビヒクル又は担体は、実際は、水性又は非水性のいずれかであり得る。例えば、適したビヒクル又は担体は、注射用水、生理食塩水、又は人工脳脊髄液であり得るが、非経口投与用の組成物において一般的な他の材料が補充される可能性がある。中性緩衝生理食塩水、又は血清アルブミンを混合した生理食塩水が、更なる例示的なビヒクルである。特定の実施形態において、医薬組成物は、約ｐＨ７．０～８．５のトリス緩衝液、又は約ｐＨ４．０～５．５の酢酸塩緩衝液を含み、ソルビトール又はその適した代替物をさらに含んでよい。本発明の特定の実施形態において、Ｉｌ－２変異タンパク質組成物又は抗ＩＬ－２抗体組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を、任意選択の製剤用剤（前掲のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ）と混合することによって、凍結乾燥ケーキ又は水溶液の形態での保存のために調製されてよい。さらに、特定の実施形態において、ＩＬ－２変異タンパク質又は抗ＩＬ－２抗体生成物は、スクロース等の適切な賦形剤を用いて、凍結乾燥物として製剤化されてよい。

本発明の医薬組成物は、非経口送達用に選択することができる。これ以外にも、組成物は、吸入用に、又は経口等、消化管を介した送達用に選択されてよい。そのような医薬的に許容可能な組成物の調製は、当該技術の範囲内である。製剤構成要素は、好ましくは、投与部位に許容可能な濃度で存在する。特定の実施形態において、緩衝液は、組成物を、生理学的ｐＨ又は僅かに低いｐＨ、典型的には約５～約８のｐＨ範囲内に維持するのに用いられる。

非経口投与が意図される場合、本発明に用いられる治療用組成物は、所望のＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子組成物を、薬学的に許容されるビヒクル中に含む、発熱物質非含有の非経口的に許容される水溶液の形態で提供されてよい。非経口注射に特に適したビヒクルは、滅菌蒸留水であり、この中でＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子組成物が、滅菌等張液として製剤化されて、適切に保持される。特定の実施形態において、調製は、デポ注射を介して送達することができる産物の制御放出又は持続放出を実現し得る剤、例えば注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー性化合物（ポリ乳酸又はポリグリコール酸等）、ビーズ、又はリポソームとの所望の分子の製剤化を含み得る。特定の実施形態において、循環系における持続期間を増進する効果を有するヒアルロン酸が用いられてもよい。特定の実施形態において、移植可能な薬物送達デバイスが、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子を導入するのに用いられてよい。

持続送達製剤又は制御送達製剤中にＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子組成物を含む製剤を含む、追加的な医薬組成物が当業者に明らかとなろう。また、種々の他の持続性又は制御性の送達手段、例えば、リポソーム担体、生体内分解性マイクロ粒子、又は多孔ビーズ、及びデポ注射を製剤化する技術が当業者に知られている。例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号明細書（参照によって組み込まれる）参照。この文献では、医薬組成物を送達するための多孔性ポリマー微粒子の制御放出について記載されている。持続放出調製物は、成形物品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスを含み得る。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書及び欧州特許出願公開第０５８４８１号明細書に開示されており、これらの文献はそれぞれ、参照によって組み込まれる）、Ｌ－グルタミン酸及びガンマ－エチル－Ｌ－グルタマートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２：５４７－５５６）、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリラート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７－２７７及びＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８－１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１、前掲）又はポリ－Ｄ（－）－３－ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第１３３，９８８号明細書）を含み得る。また、持続放出組成物は、当該技術において知られている幾つかの方法のいずれかによって調製可能なリポソームを含み得る。例えば、参照によって組み込まれる、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８－３６９２；欧州特許出願公開第０３６，６７６号明細書；欧州特許出願公開第０８８，０４６号明細書、及び欧州特許出願公開第１４３，９４９号明細書参照。

インビボ投与に用いられる医薬組成物は典型的に、滅菌調製物として提供される。滅菌化は、滅菌濾過膜による濾過によって達成することができる。組成物を凍結乾燥する場合、この方法を用いる滅菌化は、凍結乾燥及び再構成の前後のいずれに実施されてもよい。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態で、又は溶液中に保存することができる。非経口組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有するコンテナ、例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する、静脈注射用溶液バッグ又はバイアル中に配置される。

本発明の態様は、自己緩衝ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子製剤を含み、これらは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第０６１３８１８１（Ａ２）号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２５９９）に記載されているような医薬組成物として用いることができる。

先で考察されるように、特定の実施形態は、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子組成物、特に、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子組成物に加えて、本節及び本明細書内の他の箇所に例示的に記載されているもの等の１つ以上の賦形剤を含む医薬ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子Ｆｃ融合タンパク質を提供する。賦形剤は、粘度の調整等の製剤の物理的、化学的、若しくは生物学的特性の調整、及び／又は有効性を向上させ、且つ／若しくはそのような製剤を安定化させるための本発明のプロセス、並びに、例えば製造、輸送、保管、使用前の調製、投与の間に、そしてこれらの後に生じるストレスに起因する劣化及び腐敗に対するプロセス等、広範囲の目的について、本発明に用いることができる。

タンパク質の安定化、並びにこれに関して有用な製剤材料及び方法に対して種々の説明が可能であり、例えば、Ａｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｏｌｖｅｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．８（３）：２８５－９１（１９９１）；Ｋｅｎｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．“Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ” ｉｎ：ＲＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥＳＩＧＮ ＯＦ ＳＴＡＢＬＥ ＰＲＯＴＥＩＮ ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ：ＴＨＥＯＲＹ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｎｎｉｎｇ，ｅｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１３：６１－８４（２００２）、及びＲａｎｄｏｌｐｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”，Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１５９－７５（２００２）（それらの各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる）があり、特に、本発明に従う自己緩衝タンパク質製剤のための賦形剤及びそのプロセスに関する部分において、とりわけ、獣医学的用途及び／又はヒト医学的用途のタンパク質医薬製品及びプロセスに関して、種々の説明が可能である。

本発明の特定の実施形態に従って塩を用いて、例えば、製剤のイオン強度及び／若しくは等張性を調整し、且つ／又は本発明に従う組成物のタンパク質若しくは他の成分の溶解度及び／若しくは物理的安定性を向上させることができる。

周知の通り、イオンは、タンパク質の表面上の荷電残基に結合することによって、且つタンパク質中の荷電基及び極性基を遮蔽して、その静電気相互作用、引力、及び反発相互作用の強度を低減することによって、天然状態のタンパク質を安定化させることができる。また、イオンは、特に、タンパク質の変性ペプチド結合（－－ＣＯＮＨ）に結合することによって、変性状態のタンパク質を安定化させることができる。さらに、タンパク質中の荷電基及び極性基とのイオン相互作用は、分子間静電相互作用を低減し、それによってタンパク質の凝集及び不溶化を防止又は低減することもできる。

イオン種は、タンパク質に及ぼすその効果が著しく異なる。イオン及びタンパク質に及ぼすその効果をカテゴリーで順位付けする方法が幾つも開発されており、本発明にかかる医薬組成物の製剤化に用いることができる。１つの例は、ホフマイスター系列であり、これは、イオン性溶質及び極性非イオン性溶質を、溶液中のタンパク質の立体構造安定性に及ぼすその効果によって順位付けするものである。安定化させる溶質は、「コスモトロピック」と称される。不安定化させる溶質は、「カオトロピック」と称される。コスモトロープは、一般には、タンパク質を溶液から沈殿させるため（「塩析」）、高濃度で使用される（例えば、１モルより高い硫酸アンモニウム）。カオトロープは、一般には、タンパク質を変性させる及び／又は可溶化させるために使用される（「塩溶」）。「塩溶」及び「塩析」に対するイオンの相対的な有効性が、ホフマイスター系列におけるその位置を定義する。

遊離アミノ酸は、増量剤、安定化剤、及び抗酸化剤として、そして他の標準的用途として、本発明の種々の実施形態に従うＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子製剤に用いることができる。リシン、プロリン、セリン、及びアラニンは、製剤中でタンパク質を安定化させるのに用いることができる。グリシンは、正確なケーキ構造及び特性を確保するのに、凍結乾燥において有用である。アルギニンは、液体及び凍結乾燥の双方の製剤において、タンパク質の凝集を阻害するのに有用であり得る。メチオニンは、抗酸化剤として有用である。

ポリオールは、糖、例えば、マンニトール、スクロース、及びソルビトール、並びに多価アルコール、例えば、グリセロール及びプロピレングリコール、並びに、本明細書中での考察を目的として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び関連物質を含む。ポリオールはコスモトロピックである。ポリオールは、液体及び凍結乾燥の双方の製剤において、タンパク質を、物理的劣化プロセス及び化学的劣化プロセスから保護するのに有用な安定化剤である。また、ポリオールは、製剤の張度を調整するのに有用である。

ポリオールの中でも、本発明の選択実施形態において有用なものはマンニトールであり、これは一般に、凍結乾燥製剤においてケーキの構造安定性を確保するのに用いられる。マンニトールは、ケーキの構造安定性を確保する。マンニトールは一般に、凍結乾燥保護剤、例えばスクロースと共に用いられる。ソルビトール及びスクロースは、好ましい薬剤の中でも、張度を調節するための、そして輸送中の凍結融解ストレス、又は製造プロセス中のバルクの調製から保護するための安定化剤として、好ましい剤である。還元糖（遊離アルデヒド基又はケトン基を含有する）、例えばグルコース及びラクトースは、表面のリジン及びアルギニン残基を糖化し得る。したがって、還元糖は、一般に、本発明に従う使用にとって好ましいポリオールには入らない。加えて、そのような反応種を形成する糖、例えばスクロースも、酸性条件下でフルクトース及びグルコースに加水分解されて、結果として糖化を生じさせる点で、本発明の好ましいポリオールには入らない。ＰＥＧは、タンパク質を安定化させるのに、且つ凍結保護物質として有用であり、この点に関して本発明に用いることができる。

ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子製剤の実施形態はさらに、界面活性剤を含む。タンパク質分子は、表面への吸着、並びに気体－液体界面、固体－液体界面、及び液体－液体界面での変性及びその結果としての凝集の影響を受け易い場合がある。これらの効果は一般に、タンパク質濃度に反比例する。これらの有害な相互作用は、一般に、タンパク質濃度と反比例し、典型的には、例えば製品の輸送及び取扱い中に生じる物理的撹拌によって悪化する。

界面活性剤は、日常的に、表面吸着を防止する、最小限に抑える、又は低減するのに用いられる。この点に関して、本発明において有用な界面活性剤として、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンポリエトキシラートの他の脂肪酸エステル、及びポロキサマー１８８が挙げられる。

また、界面活性剤は一般に、タンパク質の立体構造安定性を制御するのに用いられる。この点に関して、界面活性剤の使用は、所与のあらゆる界面活性剤が典型的に、一部のタンパク質を安定化させ、且つその他を不安定化させることとなるため、タンパク質特異的である。

ポリソルベートは、酸化劣化の影響を受け易く、多くの場合、供給されるならば、タンパク質残基の側鎖、とりわけメチオニンの酸化を引き起こすほど十分な過酸化物量を含有している。結果として、ポリソルベートは、慎重に用いられるべきであり、用いられる場合には最低有効濃度にて使用されるべきである。この点に関して、ポリソルベートは、賦形剤が最低有効濃度で用いられるべきとする原則を例示している。

ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子製剤の実施形態はさらに、１つ以上の抗酸化剤を含む。医薬製剤中のタンパク質の有害な酸化は、適切なレベルの周囲酸素及び周囲温度を維持することによって、且つ光への曝露を回避することによって、ある程度まで防止することができる。抗酸化賦形剤も同様に、タンパク質の酸化劣化を防止するのに用いることができる。この点に関して有用な抗酸化剤には、還元剤、酸素／フリーラジカルスカベンジャ、及びキレート化剤がある。本発明に従う治療用タンパク質製剤に用いられる抗酸化剤は、好ましくは、水溶性であり、製品の有効期間全体を通して活性を維持する。この点に関して、ＥＤＴＡが、本発明に従う好ましい抗酸化剤である。

抗酸化剤は、タンパク質を損傷する虞がある。例えば、還元剤、例えばグルタチオンは特に、分子内ジスルフィド結合を破壊する虞がある。ゆえに、本発明に用いられる抗酸化剤は、とりわけ、それ自体が製剤中のタンパク質に損傷を与える可能性を排除するか、又はその可能性を十分に低減するように選択される。

本発明に従う製剤は、タンパク質補因子であり、且つタンパク質配位錯体を形成するのに必須である金属イオン、例えば特定のインスリン懸濁液を形成するのに必須の亜鉛を含んでもよい。また、金属イオンは、タンパク質を分解する幾つかのプロセスを阻害することができる。しかしながら、金属イオンはまた、タンパク質を分解する物理的プロセス及び化学的プロセスを触媒する。

マグネシウムイオン（１０～１２０ｍＭ）を用いて、アスパラギン酸の、イソアスパラギン酸への異性化を阻害することができる。Ｃａ^＋２イオン（最大１００ｍＭ）は、ヒトデオキシリボヌクレアーゼの安定性を増大させ得る。しかしながら、Ｍｇ^＋２、Ｍｎ^＋２、及びＺｎ^＋２は、ｒｈＤＮａｓｅを不安定化させ得る。同様に、Ｃａ^＋２及びＳｒ^＋２は、第ＶＩＩＩ因子を安定化させ得、これは、Ｍｇ^＋２、Ｍｎ^＋２及びＺｎ^＋２、Ｃｕ^＋２及びＦｅ^＋２によって不安定化し得、その凝集は、Ａｌ^＋３イオンによって増大し得る。

ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子製剤の実施形態はさらに、１つ以上の防腐剤を含む。防腐剤は、同じコンテナからの２回以上の抽出を伴う複数回用量の非経口製剤を開発する場合に、必須である。その主な機能は、薬物製品の有効期間又は使用期間の全体にわたって微生物の増殖を阻害し、且つ製品の滅菌状態を確保することである。一般に用いられる防腐剤として、ベンジルアルコール、フェノール、及びｍ－クレゾールが挙げられる。防腐剤は、低分子の非経口薬での使用の歴史が長いが、防腐剤を含むタンパク質製剤の開発は、困難となり得る。防腐剤はほぼ常に、タンパク質に及ぼす不安定化効果（凝集）を有しており、これが複数回用量のタンパク質製剤における使用を制限する主要な要因となっている。現在に至るまで、ほとんどのタンパク質薬物は、単回使用用でしか製剤化されていない。しかしながら、複数回用量製剤が可能である場合、患者の利便性及び市場性の増大を可能にするという利点が加わる。良い例が、保存処理された製剤の開発により、より便利な複数回使用の注射ペンの提案が製品化に至ったヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の例である。ｈＧＨの保存処理された製剤を含有するそのような少なくとも４つのペンデバイスが、現在市場で入手可能である。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（液体、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ ＡＱ（液体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、及びＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥－デュアルチャンバーカートリッジ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ）が、フェノールを含有する一方で、Ｓｏｍａｔｒｏｐｅ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）が、ｍ－クレゾールにより製剤化されている。

幾つかの態様が、保存剤型の製剤化且つ開発中に考慮される必要がある。薬物製品中の有効防腐剤濃度は最適化されなければならない。これには、タンパク質安定性を損なうことなく抗微生物有効性を付与する濃度範囲の、剤型中の所与の防腐剤を試験する必要がある。

別の態様において、本発明は、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子、又はＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子のＦｃ融合体を、凍結乾燥製剤で提供する。凍結乾燥製品は、防腐剤なしで凍結乾燥されて、使用時に、防腐剤を含有する希釈剤により再構成することができる。これにより、防腐剤がタンパク質と接触する時間が短縮されて、付随する安定性のリスクが大幅に最小化される。液体製剤の場合、防腐剤の有効性及び安定性は、製品有効期間全体（約１８～２４ヶ月）にわたって維持されるべきである。注意すべき重要な点は、防腐剤の有効性が、活性薬物及び全ての賦形剤構成要素を含有する最終製剤において実証されるべきであることである。

ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子製剤は一般に、特定の投与経路及び投与方法のために、特定の投与量及び投与頻度のために、特定の疾患の特定の処置のために、とりわけバイオアベイラビリティ及び持続性の範囲で、設計されることとなる。ゆえに、製剤は、経口経路、経耳経路、経眼経路、経直腸経路、及び経膣経路が挙げられるがこれらに限定されない適切なあらゆる経路による、そして静脈内注射及び動脈内注射、筋肉内注射、及び皮下注射が挙げられる非経口経路による送達のために、本発明に従って設計され得る。

医薬組成物が製剤化されると、これは、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、結晶として、又は脱水粉末若しくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアル中に保存され得る。そのような製剤は、即時使用形態で、又は投与前に再構成される形態（例えば凍結乾燥形態）で保存され得る。本発明はまた、単回用量投与単位を生成するためのキットを提供する。本発明のキットは各々、乾燥タンパク質を有する第１のコンテナ、及び水性製剤を有する第２のコンテナの双方を含有してよい。本発明の特定の実施形態において、シングルチャンバー及びマルチチャンバー式充填済みシリンジ（例えば、液体シリンジ及びリオシリンジ）を含有するキットが提供される。

使用されることになるＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子含有医薬組成物の治療有効量は、例えば、治療のコンテクスト及び目的によって決まることとなる。当業者であれば、処置に適切な投与量レベルが、送達される分子、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子が用いられている適応症、投与経路、並びに患者のサイズ（体重、体表面、又は器官サイズ）及び／又は状態（年齢及び健康状態）に部分的に応じて変動することとなることを理解するであろう。特定の実施形態において、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投与量を力価測定し、且つ投与経路を改変してよい。典型的な投与量は、上記の要因に応じて、約０．１μｇ／ｋｇ～最大約１ｍｇ／ｋｇ以上に及び得る。特定の実施形態において、投与量は、０．５μｇ／ｋｇ～最大約１００μｇ／ｋｇ、場合によっては２．５μｇ／ｋｇ～最大約５０μｇ／ｋｇに及び得る。

治療有効量のＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子は好ましくは、疾患病徴の重症度の低下、疾患無病徴期間の頻度若しくは期間の増大、又は疾患の苦痛に起因する障害若しくは不自由の予防をもたらす。

医薬組成物は、医療デバイスを用いて投与されてよい。医薬組成物を投与するための医療デバイスの例が、米国特許第４，４７５，１９６号明細書；米国特許第４，４３９，１９６号明細書；米国特許第４，４４７，２２４号明細書；米国特許第４，４４７，２３３号明細書；米国特許第４，４８６，１９４号明細書；米国特許第４，４８７，６０３号明細書；米国特許第４，５９６，５５６号明細書；米国特許第４，７９０，８２４号明細書；米国特許第４，９４１，８８０号明細書；米国特許第５，０６４，４１３号明細書；米国特許第５，３１２，３３５号明細書；米国特許第５，３１２，３３５号明細書；米国特許第５，３８３，８５１号明細書；及び米国特許第５，３９９，１６３号明細書（全てが参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている。

一実施形態において、を含む医薬組成物が提供される。

自己免疫障害又は炎症性障害を処置する方法
特定の実施形態において、本発明のＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子は、自己免疫障害又は炎症性障害を処置するために用いられる。好ましい実施形態において、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子Ｆｃ融合タンパク質が用いられる。

本明細書中で開示されるＩＬ－２変異タンパク質又は抗ＩＬ－２抗体による処置に特に適している障害として、炎症、自己免疫疾患、アトピー性疾患、腫瘍随伴性自己免疫疾患、軟骨炎症、関節炎、関節リウマチ、若年性関節炎、若年性関節リウマチ、小関節型若年性関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、全身性発症若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、若年性腸疾患性関節炎、若年性反応性関節炎、若年性ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清反応陰性、腱付着部症、関節症症候群）、若年性皮膚筋炎、若年性乾癬性関節炎、若年性強皮症、若年性全身性エリテマトーデス、若年性血管炎、小関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身性発症関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸疾患性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、強皮症、血管炎、脊髄炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、サルコイドーシス、硬化症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、シェーグレン症候群、乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アテローム性動脈硬化症、ループス、スティル病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、多発性硬化症（ＭＳ）、喘息、ＣＯＰＤ、鼻副鼻腔炎、ポリープを伴う鼻副鼻腔炎、好酸球性食道炎、好酸球性気管支炎、ギラン・バレー病、Ｉ型糖尿病、甲状腺炎（例えば、グレーブス病）、アジソン病、レイノー現象、自己免疫性肝炎、ＧＶＨＤ、移植拒絶、腎障害、Ｃ型肝炎誘発性血管炎、及び自然流産が挙げられるが、これらに限定されない。

好ましい実施形態において、自己免疫障害又は炎症性障害は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、移植片対宿主病、Ｃ型肝炎誘発性血管炎、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、多発性硬化症、自然流産、アトピー性疾患、及び潰瘍性大腸炎やセリアック病を含めた炎症性腸疾患である。

別の実施形態において、自己免疫障害又は炎症性障害を患う、又は発症するリスクのある患者は、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子（例えば、本明細書中で開示されるＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子、例えば、本明細書中で開示されるようなＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子Ｆｃ融合体）により処置されて、当該処置に対する患者の応答がモニターされる。モニターされる患者の応答は、処置に対する患者の検出可能又は測定可能ないかなる応答であっても、そのような応答のいかなる組合せであってもよい。例えば、応答は、患者の生理学的状態、例えば、体温若しくは発熱、欲望、発汗、頭痛、嘔気、疲労、空腹、口渇、知力等の変化であり得る。これ以外にも、応答は、例えば、患者から採取した末梢血の試料中の細胞型又は遺伝子産物（例えば、タンパク質、ペプチド、又は核酸）の量の変化であり得る。一実施形態において、患者の処置レジメンは、患者が処置に対する検出可能若しくは測定可能な応答を有するならば、又はそのような応答が特定の閾値を超えるならば、変更される。この変更は、投薬頻度の減少若しくは増大、又は１回用量あたりに投与されるＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子の量の減少若しくは増大、又は投薬の「休止」（すなわち、特定の期間、又は処置を行う医師が処置を継続すべきであると決定するまで、又はモニターされる患者の応答が処置を再開すべき、若しくは再開できると示すまでのいずれかの、一時的な処置の中断）、又は処置の終了であり得る。一実施形態において、応答は、患者の体温又はＣＲＰレベルの変化である。例えば、応答は、患者の体温上昇、若しくは末梢血の試料中のＣＲＰレベルの増大、又はそれらの双方であり得る。特定の一実施形態において、患者の処置は、処置過程中に患者の体温が少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７、１、１．５、２、又は２．５℃上昇するならば、引き下げられる、一時中断される、又は終了する。別の特定の実施形態において、患者の処置は、処置過程中に患者の末梢血の試料中のＣＲＰの濃度が少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７、１、１．５、又は２ｍｇ／ｍＬ増大するならば、引き下げられる、一時中断される、又は終了する。処置を改変する、引き下げる、一時中断する、又は終了するかを決定する際にモニターされ、且つ用いられ得る他の患者反応として、毛細管漏出症候群（低血圧及び心血管不安定）の発症若しくは悪化、好中球機能障害（例えば、感染症の発症又は悪化が生じる、又は検出される）、血小板減少症、血栓性血管症、注射部位反応、血管炎（Ｃ型肝炎ウイルス血管炎等）、又は炎症病徴若しくは疾患が挙げられる。処置を改変する、引き下げる、増大させる、一時中断する、又は終了するかを決定する際にモニターされ、且つ用いられ得る更なる患者反応として、ＮＫ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＦＯＸＰ３^－ＣＤ４Ｔ細胞、ＦＯＸＰ３^＋ＣＤ４Ｔ細胞、ＦＯＸＰ３－ＣＤ８Ｔ細胞、又は好酸球の数の増大が挙げられる。これらの細胞型の増大は、例えば、末梢血の単位あたりのそのような細胞の数の増大として（例えば、血液１ミリリットルあたりの細胞の増大として表される）、又はそのような細胞型の、血液試料中の別の細胞型と比較したパーセンテージの増大として検出することができる。モニターされ得る別の患者反応は、患者の末梢血の試料中のＣＤ２５^＋細胞上の細胞表面結合したＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子の量の増大である。

Ｔｒｅｇ細胞を増殖させる方法
ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子、又はＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子Ｆｃ融合タンパク質は、対象又は試料内のＴｒｅｇ細胞を増殖させるのに用いられてよい。本明細書中で提供されるのは、Ｔｒｅｇの、非制御性Ｔ細胞に対する比率を増大させる方法である。本方法は、Ｔ細胞の集団を、有効量のヒトＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子、又はＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子Ｆｃ融合体と接触させることを含む。当該比率は、Ｔ細胞の集団内のＣＤ３＋ＦＯＸＰ３＋細胞の、ＣＤ３＋ＦＯＸＰ３－細胞に対する比率を求めることによって測定され得る。ヒト血液中の典型的なＴｒｅｇ頻度は、総ＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の５～１０％である。しかしながら、先で列挙される疾患において、このパーセンテージは、より低い場合もより高い場合もある。好ましい実施形態において、Ｔｒｅｇのパーセンテージは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％、又は少なくとも１０００％増大する。Ｔｒｅｇの最大増大倍率は、詳細な疾患毎に異なり得る；しかしながら、ＩＬ－２変異タンパク質処置によって達成される可能性のある最大Ｔｒｅｇ頻度は、全ＣＤ４＋ＣＤ３＋ Ｔ細胞の５０％又は６０％である。特定の実施形態において、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子、又はＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子Ｆｃ融合タンパク質が対象に投与され、対象の末梢血中における非制御性Ｔ細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率が増大する。

ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子、及びＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子Ｆｃ融合タンパク質及びＩＬ－２とＴＮＦＲとの他の組合せは、他の細胞型よりもＴｒｅｇを優先的に増殖させるため、これらはまた、対象の末梢血中にあるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃｏｎ）に対するＴｒｅｇの比率を増大させるためにも有用である。この比率は、ＣＤ１９－及びＣＤ３－であるＣＤ１６＋及び／又はＣＤ５６＋リンパ球に対するＣＤ３＋ＦＯＸＰ３＋細胞の比率を決定することにより測定し得る。加えて、意外にも、ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子、及びＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子Ｆｃ融合タンパク質及びＩＬ－２とＴＮＦＲとの組合せは、他の細胞型と比べてＴｒｅｇを優先的に増殖させるのみならず、Ｔｃｏｎ、例えば、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋ Ｔｃｏｎ及び／又はＮＫ細胞を含めた他の細胞型のレベルも低下させることが発見された。一部の実施形態において、Ｔｃｏｎ、例えば、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋ Ｔｃｏｎ及び／又はＮＫ細胞のレベルは、ＩＬ－２を単独で投与した後のそれらの細胞のレベルよりも低い。一部の実施形態において、この低下レベルは、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％又はそれ以上である。一部の実施形態において、Ｔｃｏｎ、例えば、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋ Ｔｃｏｎ及び／又はＮＫ細胞のレベルは、ベースライン時（例えば、実施例２及び図６の対照）のレベルよりも低い。一部の実施形態において、この低下レベルは、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％又はそれ以上である。

ＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子、又はＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子Ｆｃ融合タンパク質は、患者の末梢血中の非制御性Ｔ細胞又はＮＫ細胞に対するＴｒｅｇの比率が著しく大きくなることなく、患者体内で疾患又は障害に治療効果を及ぼし得ることが企図される。この治療効果は、炎症部位又は自己免疫部位におけるＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子、又はＩＬ－２／ＴＮＦＲアゴニスト分子Ｆｃ融合タンパク質の局所的な活性によるものであり得る。

以下の例は、実際の例及び仮想例の両方とも、本発明の具体的な実施形態又は特徴を例示する目的で提供され、その範囲を限定することは意図されない。

実施例１ － ＴＮＦＲとＩＬ－２Ｒとのアゴニスト性を組み合わせると、Ｔｒｅｇ細胞増殖が促進される
ＴＮＦＲ及びＩＬ－２Ｒ刺激の効果を決定するため、ヒト末梢血単核球をｃｅｌｌ ｔｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔで標識し、ＩＬ－２と併せて様々なＴＮＦＲアゴニスト（抗ＯＸ４０、抗ＤＲ３、ＴＮＦ）で処理し、４日後に分析した。抗ＣＤ３で刺激した細胞はロバストな増殖を示し、このアッセイの陽性対照として供する。ＩＬ２又は対照ＩｇＧによる刺激では、いかなるＣＴＶ希釈も生じなかった。指示されるＴＮＦＲアゴニスト単独では、いずれによっても増殖は観察されなかった。抗ＯＸ４０及びＩＬ２を使用して刺激を組み合わせると、ＣＴＶ希釈によって見られるとおりのＴｒｅｇ細胞増殖につながる。

健常ヒトドナーのＰＢＭＣをｃｅｌｌ ｔｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で製造者の指示に従い標識し、ｘ－ｖｉｖｏ １５培地（Ｌｏｎｚａ）で培養した。試薬は以下の供給業者から入手した：ＴＮＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ＤＲ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及び抗ＯＸ４０（配列番号９の重鎖配列と配列番号１０の軽鎖配列とを有する）。試料はＳｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメーター（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析し、データはＦｌｏｊｏソフトウェアを用いて分析した。

図１は、ＴＮＦＲアゴニスト（抗ＯＸ４０、組換えＴＮＦ、又は抗ＤＲ３）と組み合わせてＩＬ－２で刺激したときのＴｒｅｇの増殖を示す。（Ａ）Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で標識したヒトＰＢＭＣを指示される試薬で４日間刺激した後、フローサイトメトリー分析を行った。ヒストグラムは以下の順番に並べている（下から上に）：刺激なし、１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３、２０Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２、ＩｇＧ、ＴＮＦＲアゴニスト（抗ＯＸ４０、組換えＴＮＦ、抗ＤＲ３）、ＴＮＦＲアゴニスト＋ＩＬ－２で刺激。ヒストグラムはＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋）でゲーティングした。陽性対照抗ＣＤ３プロット及びＴＮＦＲアゴニストの組合せ（抗ＯＸ４０、組換えＴＮＦ、及び抗ＤＲ３）のみが、Ｔｒｅｇの増殖を示した。図２は、ＰＢＭＣに対する抗ＯＸ４０及びＩＬ－２のヒストグラムプロットを示す。図３は、ＰＢＭＣに対するＴＮＦ及びＩＬ－２のヒストグラムプロットを示す。図４は、ＰＢＭＣに対する抗ＤＲ３及びＩＬ－２のヒストグラムプロットを示す。図５は、ＰＢＭＣに対する抗ＧＩＴＲ及びＩＬ－２のヒストグラムプロットを示す。

実施例２ － ＴＮＦＲとＩＬ－２Ｒとのアゴニスト性を組み合わせるとＴｒｅｇ細胞増殖が促進されることについてのインビボ研究
Ｃ５７／Ｂｌ６マウス（ｎ＝６）に１ｍｇ／ｋｇのマウスＩＬ－２変異タンパク質、抗ＯＸ４０又は抗ＯＸ４０－ＩＬ２のいずれかを与え、４日目（ｎ＝３）又は１５日目（ｎ＝３）に脾臓、リンパ節及び肺を摘出した。この研究のために作成した分子の例を図６に示す。ここでの具体的な研究には、分子＃３を使用した。ＰＢＳ処置したマウスを対照として使用した。これらの処置が、指示される細胞集団の頻度に及ぼす効果を調べた。ＴｒｅｇはＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋として同定し、活性化Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３－ＣＤ２５＋として同定し、活性化ＣＤ８はＣＤ８＋ＣＤ４４＋として同定し、及びＮＫ／ＩＬＣはＣＤ４－ＣＤ８－ＮＫ１．１＋として同定した。結果は、２つの独立した実験の代表である。データは、対照（値を１に設定）に対する増殖倍率として示される。

結果は図７に示す。ＩＬ２単独による処置では、幾つかの組織にＴｒｅｇ細胞の増殖が生じた；しかしながら、活性化ＣＤ４及びＣＤ８細胞並びにＮＫ細胞の頻度の増大もまた観察された。抗ＯＸ４０処置もまた、他の免疫細胞タイプに大きい効果を及ぼすことなく、ＩＬ２と比較したとき同程度の規模でＴｒｅｇ増殖を生じた。抗ＯＸ４０－ＩＬ２融合投与は、他の細胞への効果は最小限でありながら、ＩＬ２又は抗ＯＸ４０単独と比較したときＴｒｅｇ細胞のはるかに高い増殖倍率につながる。さらに、抗ＯＸ４０－ＩＬ２融合の媒介によるＴｒｅｇ細胞増殖は、他の処置と比較したときより長い時間にわたって持続したことから、脾臓及び肺組織の両方でＩＬ２又はＯＸ４０単独に対する相加を超える効果が実証された。

Claims (35)

1. 配列番号１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むヒトＩＬ－２ポリペプチドと、抗ＯＸ４０、抗ＤＲ３、及びＴＮＦからなる群から選択される腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）アゴニストとを含むヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）キメラ分子。
2. 前記ヒトＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項１に記載のヒトＩＬ－２キメラ分子。
3. 前記ヒトＩＬ－２ポリペプチドがヒトＩＬ－２ポリペプチド変異タンパク質であり、前記ＩＬ－２変異タンパク質が、Ｖ９１Ｋ、Ｎ３０Ｓ、Ｎ３０Ｄ、Ｙ３１Ｈ、Ｙ３１Ｓ、Ｋ３５Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ｌ、Ｄ８４Ｒ／Ｅ６１Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ａ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｎ８８Ｋ／Ｍ１０４Ｌ、Ｖ９１Ｈ／Ｍ１０４Ｌ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｖ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｒ／Ｍ１０４Ｖ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｒ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｅ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｒ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｅ、Ｖ９１Ｈ／Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｔ、Ｈ１６Ｅ／Ｖ９１Ｈ／Ｍ１０４Ｖ、Ｖ９１Ｈ／Ｄ２０Ａ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｈ／Ｈ１６Ｒ／Ｅ１６Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｖ、Ｈ１６Ｅ／Ｖ９１Ｈ、Ｖ９１Ｈ／Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｖ、Ｈ１６Ｅ／Ｖ９１Ｈ／Ｍ１０４Ｔ、Ｈ１６Ｅ／Ｖ９１Ｈ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ／Ｈ１６Ｅ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｒ／Ｍ１０４Ｌ、Ｈ１６Ｅ／Ｖ９１Ｈ／Ｅ１６Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ／Ｈ１６Ｒ、Ｄ２０Ｗ／Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ、Ｖ９１Ｈ／Ｈ１６Ｒ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｒ、Ｄ２０Ｗ／Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ａ、Ｖ９１Ｈ／Ｄ２０Ａ／Ｅ１６Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｌ、Ｖ９１Ｈ／Ｄ２０Ａ、Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ／Ｄ２０Ａ、Ｖ９１Ｈ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｈ／Ｍ１０４Ｖ、Ｖ９１Ｋ／Ｅ６１Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｎ８８Ｋ／Ｅ６１Ｑ／Ｍ１０４Ｔ、Ｖ９１Ｋ／Ｎ８８Ｋ／Ｅ６１Ｑ、Ｖ９１Ｈ／Ｅ６１Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｎ８８Ｋ、Ｄ２０Ａ／Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｔ、Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｔ、Ｈ１６Ｅ／Ｎ８８Ｋ、Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｖ、Ｄ２０Ａ／Ｍ１０４Ｌ、Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｔ、Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｖ、Ｎ８８Ｋ／Ｍ１０４Ｖ、Ｎ８８Ｋ／Ｅ６１Ｑ、Ｄ２０Ａ／Ｅ６１Ｑ、Ｈ１６Ｒ／Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｗ／Ｅ６１Ｑ、Ｈ１６Ｅ／Ｅ６１Ｑ、Ｈ１６Ｅ／Ｍ１０４Ｌ、Ｎ８８Ｋ／Ｍ１０４Ｔ、Ｄ２０Ａ／Ｈ１６Ｅ、Ｄ２０Ａ／Ｈ１６Ｅ／Ｅ１６Ｑ、Ｄ２０Ａ／Ｈ１６Ｒ／Ｅ１６Ｑ、Ｖ９１Ｋ／Ｄ２０Ｗ、Ｖ９１Ａ／Ｈ１６Ａ、Ｖ９１Ａ／Ｈ１６Ｄ、Ｖ９１Ａ／Ｈ１６Ｅ、Ｖ９１Ａ／Ｈ１６Ｓ、Ｖ９１Ｅ／Ｈ１６Ａ、Ｖ９１Ｅ／Ｈ１６Ｄ、Ｖ９１Ｅ／Ｈ１６Ｅ、Ｖ９１Ｅ／Ｈ１６Ｓ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ａ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｄ、Ｖ９１Ｋ／Ｈ１６Ｓ、Ｖ９１Ｓ／Ｈ１６Ｅ、Ｌ１２Ｇ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１２Ｑ、Ｌ１２Ｓ、Ｑ１３Ｇ、Ｅ１５Ａ、Ｅ１５Ｇ、Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ａ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｍ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｓ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｈ１６Ｙ、Ｌ１９Ａ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｅ、Ｌ１９Ｇ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｒ、Ｌ１９Ｓ、Ｌ１９Ｔ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｆ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｔ、Ｄ２０Ｗ、Ｍ２３Ｒ、Ｎ３０Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｒ８１Ａ、Ｒ８１Ｇ、Ｒ８１Ｓ、Ｒ８１Ｔ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ｉ、Ｄ８４Ｍ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｒ、Ｄ８４Ｓ、Ｄ８４Ｔ、Ｓ８７Ｒ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｆ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｍ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｖ、Ｎ８８Ｗ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｅ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｓ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ、及び／又はＥ９５Ｇから選択される少なくとも１つの変異を有し、且つ制御性Ｔ細胞を優先的に刺激する、請求項１又は２に記載のヒトＩＬ－２キメラ分子。
4. Ｃ１２５Ａに置換をさらに含む、請求項３に記載のヒトＩＬ－２キメラ分子。
5. Ｆｃと、配列番号１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むヒトＩＬ－２ポリペプチドと、抗ＯＸ４０、抗ＤＲ３、及びＴＮＦからなる群から選択される腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）アゴニストとを含む、Ｆｃ融合タンパク質。
6. 前記抗ＯＸ４０が抗ＯＸ４０抗体であり、前記抗ＯＸ４０抗体が、配列番号９の重鎖アミノ酸配列、配列番号１０の軽鎖アミノ酸配列、又は配列番号９の重鎖抗体配列と配列番号１０の軽鎖アミノ酸配列との両方を有する、請求項５に記載のＦｃ融合タンパク質。
7. 前記ＦｃがヒトＩｇＧ１ Ｆｃである、請求項５又は６に記載のＦｃ融合タンパク質。
8. 前記ヒトＩｇＧ１ Ｆｃが、前記Ｆｃのエフェクター機能を変化させる１つ以上の変異を含み、前記ヒトＩｇＧ１がＮ２９７Ｇ置換を含む、請求項７に記載のＦｃ融合タンパク質。
9. 前記ヒトＩｇＧ ＦｃのＣ末端リジンの置換又は欠失を含む、請求項５～８のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
10. 前記ヒトＩｇＧ ＦｃのＣ末端リジンが欠失している、請求項９に記載のＦｃ融合タンパク質。
11. 前記タンパク質の前記ＦｃとヒトＩＬ－２ポリペプチド部分とをリンカーがつなぐ、請求項５～１０のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
12. 前記タンパク質の前記Ｆｃと腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）アゴニスト部分とをリンカーがつなぐ、請求項５～１０のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
13. 前記リンカーが、ＧＧＧＧＳ（配列番号５）、ＧＧＮＧＴ（配列番号６）、又はＹＧＮＧＴ（配列番号７）である、請求項１１又は１２に記載のＦｃ融合タンパク質。
14. 第１のリンカーが前記タンパク質部分の前記ＦｃとヒトＩＬ－２ポリペプチド部分とをつなぎ、第２のリンカーが前記タンパク質の前記Ｆｃと腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）アゴニスト部分とをつなぐ、請求項５～１３のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
15. 前記第１のリンカーが、ＧＧＧＧＳ（配列番号５）、ＧＧＮＧＴ（配列番号６）、又はＹＧＮＧＴ（配列番号７）であり、前記第２のリンカーが、ＧＧＧＧＳ（配列番号５）、ＧＧＮＧＴ（配列番号６）、又はＹＧＮＧＴ（配列番号７）である、請求項１４に記載のＦｃ融合タンパク質。
16. 前記ＩＬ－２キメラ分子が、哺乳類細胞で発現したとき前記Ｆｃ融合タンパク質のグリコシル化を変化させるアミノ酸付加、置換、又は欠失をさらに含み、グリコシル化を変化させる前記付加、置換、又は欠失が、Ｔ３Ｎ、Ｔ３Ａ、又はＳ５Ｔ置換である、請求項５～１５のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
17. 請求項１～４のいずれか一項に記載のヒトＩＬ－２キメラ分子をコードする単離核酸。
18. 請求項５～１６のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質をコードする単離核酸。
19. プロモータに作動可能に連結された請求項１７又は１８に記載の単離核酸を含む発現ベクター。
20. 請求項１７～１９のいずれか一項に記載の単離核酸を含む宿主細胞。
21. ヒトＩＬ－２キメラ分子を作製する方法であって、前記プロモータが発現する条件下で請求項２０に記載の宿主細胞を培養すること、及び前記培養物から前記ヒトＩＬ－２キメラ分子を回収することを含む方法。
22. Ｆｃ融合タンパク質を作製する方法であって、前記プロモータが発現する条件下で請求項２０に記載の宿主細胞を培養すること、及び前記培養物から前記Ｆｃ融合タンパク質を回収することを含む方法。
23. 対象のＴ細胞集団内又は末梢血中における非制御性Ｔ細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率を増大させる方法であって、前記Ｔ細胞集団を有効量の請求項１～４のいずれか一項に記載のヒトＩＬ－２キメラ分子又は請求項５～１５のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質と接触させることを含む方法。
24. ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３－に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が増大する、請求項２３に記載の方法。
25. ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３－に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が少なくとも５０％増大する、請求項２４に記載の方法。
26. 対象の末梢血中におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率を増大させる方法であって、前記Ｔ細胞集団を有効量の請求項１～４のいずれか一項に記載のヒトＩＬ－２キメラ分子又は請求項５～１５のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質と接触させることを含む方法。
27. ＣＤ５６及び／又はＣＤ１６を発現するＣＤ３－ＣＤ１９－リンパ球に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が増大する、請求項２６に記載の方法。
28. ＣＤ５６及び／又はＣＤ１６を発現するＣＤ３－ＣＤ１９－リンパ球に対するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の比率が少なくとも５０％増大する、請求項２７に記載の方法。
29. 炎症性疾患又は自己免疫疾患を患う対象を処置する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～４のいずれか一項に記載のヒトＩＬ－２キメラ分子又は請求項５～１５のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質を投与することを含む方法。
30. 投与により、前記疾患の少なくとも１つの症状の軽減が引き起こされる、請求項２９に記載の炎症性疾患又は自己免疫疾患を患う対象を処置する方法。
31. 前記投与後に、対象の末梢血中における非制御性Ｔ細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率が増大する、請求項３０に記載の方法。
32. 対象の末梢血中における非制御性Ｔ細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率が、前記投与後も本質的に同じままである、請求項３０に記載の方法。
33. 前記炎症性疾患又は自己免疫疾患が、炎症、自己免疫疾患、アトピー性疾患、腫瘍随伴性自己免疫疾患、軟骨炎症、関節炎、関節リウマチ、若年性関節炎、若年性関節リウマチ、少関節型若年性関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、若年性腸疾患性関節炎、若年性反応性関節炎、若年性ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清反応陰性、腱付着部症、関節症症候群）、若年性皮膚筋炎、若年性乾癬性関節炎、若年性強皮症、若年性全身性エリテマトーデス、若年性血管炎、少関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身型関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸疾患性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、強皮症、血管炎、脊髄炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、サルコイドーシス、硬化症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、シェーグレン症候群、乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アテローム性動脈硬化症、ループス、スチル病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、多発性硬化症（ＭＳ）、喘息、ＣＯＰＤ、鼻副鼻腔炎、ポリープを伴う鼻副鼻腔炎、好酸球性食道炎、好酸球性気管支炎、ギラン・バレー病、Ｉ型糖尿病、甲状腺炎（例えば、グレーブス病）、アジソン病、レイノー現象、自己免疫性肝炎、ＧＶＨＤ、移植拒絶反応、腎臓損傷、Ｃ型肝炎誘発性血管炎、又は自然流産である、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記炎症性疾患又は自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、移植片対宿主病、Ｃ型肝炎誘発性血管炎、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、多発性硬化症、自然流産、アトピー性疾患、及び潰瘍性大腸炎やセリアック病を含めた炎症性腸疾患である、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記炎症性疾患又は自己免疫疾患が、ループス、移植片対宿主病、Ｃ型肝炎誘発性血管炎、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、円形脱毛症、アテローム性動脈硬化症、乾癬、移植臓器拒絶反応、シェーグレン症候群、ベーチェット病、自然流産、アトピー性疾患、喘息、又は炎症性腸疾患である、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の方法。

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