JP2019189574A - Lipid nanoparticles - Google Patents

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Abstract

To provide lipid nanoparticles useful as carriers of medicinal ingredients for cells expressing hyaluronic acid receptors.SOLUTION: Provided are a lipid nanoparticle containing a hyaluronic acid derivative to which a neutral lipid having a linear hydrophobic group is directly or indirectly linked in a hydroxyl group of N-acetylglucosamine which is a reducing sugar at the terminal of hyaluronic acid; the lipid nanoparticle as described above, in which the neutral lipid is glycerophospholipid; and further any of the lipid nanoparticle as described above which contains cationic lipid.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、ヒアルロン酸受容体を発現している細胞への薬効成分のキャリアとして有用な脂質ナノ粒子に関する。   The present invention relates to a lipid nanoparticle useful as a carrier for a medicinal component to cells expressing a hyaluronic acid receptor.

がん細胞へと効率的な薬剤送達を可能とするために、がん細胞に積極的に取り込まれる機能を持ったドラッグデリバリーシステムの開発が盛んに行われている。がん細胞が選択的に発現する受容体として、ヒアルロン酸受容体であるＣＤ４４が報告されている（非特許文献１及び２参照。）。このがん細胞におけるＣＤ４４の選択的発現を利用して、薬剤を含有するナノ粒子にヒアルロン酸を結合させることにより、ＣＤ４４を持つがん細胞に選択的に薬剤送達を行う手法が試みられてきた。   In order to enable efficient drug delivery to cancer cells, drug delivery systems having a function of being actively taken up by cancer cells are being actively developed. CD44, which is a hyaluronic acid receptor, has been reported as a receptor that is selectively expressed by cancer cells (see Non-Patent Documents 1 and 2). A technique for selectively delivering a drug to a cancer cell having CD44 has been attempted by using this selective expression of CD44 in cancer cells to bind hyaluronic acid to nanoparticles containing the drug. .

ヒアルロン酸はＮ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸の二糖が連結した構造を有する多糖である。従来は、この構造のうち、グルクロン酸のカルボン酸がナノ粒子へヒアルロン酸を相互作用させるための特徴的構造として用いられてきた。例えば、メソポーラスシリカからなるナノ粒子表面上にアミノ基を付与し、ヒアルロン酸のカルボン酸との脱水縮合によりアミド結合を形成させて、ナノ粒子表面にヒアルロン酸を結合させる方法が開示されている（非特許文献３参照。）。また、リポソームを用いた例としては、リポソームを構成する脂質に極性部にアミノ基を含むホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を混合してリポソームを形成させたのちに、リポソーム表面上のアミノ基とヒアルロン酸を脱水縮合により結合させる手法が用いられている（非特許文献４参照。）。また、Suraceらはヒアルロン酸のカルボン酸に対してＰＥを結合させた誘導体を予め合成し、これをもってリポソームの構成脂質として加える方法を提唱している（非特許文献５参照。）。   Hyaluronic acid is a polysaccharide having a structure in which N-acetylglucosamine and glucuronic acid disaccharide are linked. Conventionally, of this structure, carboxylic acid of glucuronic acid has been used as a characteristic structure for allowing hyaluronic acid to interact with nanoparticles. For example, a method is disclosed in which an amino group is imparted on the surface of a nanoparticle made of mesoporous silica, an amide bond is formed by dehydration condensation with carboxylic acid of hyaluronic acid, and hyaluronic acid is bonded to the nanoparticle surface ( (Refer nonpatent literature 3.). In addition, as an example using liposomes, phosphatidylethanolamine (PE) containing an amino group in the polar part is mixed with the lipid constituting the liposome to form a liposome, and then the amino group and hyaluronic acid on the liposome surface are formed. Is used to bind them by dehydration condensation (see Non-Patent Document 4). Surace et al. Have proposed a method in which a derivative in which PE is bound to a carboxylic acid of hyaluronic acid is synthesized in advance and added as a constituent lipid of the liposome (see Non-Patent Document 5).

一方で、ヒアルロン酸中のグルクロン酸が持つ負電荷に着目する研究もある。El Kechaiらはリポソームを構成する脂質として正電荷を有する脂質ステアリルアミンを添加しておき、リポソーム形成後に負電荷を有するヒアルロン酸を単純混合することによって複合体形成させている（非特許文献６参照。）。Jiangらはリポソームを構成する脂質に正電荷を有するアルギニンのオリゴ体と脂質の結合体を予め脂質に加えてリポソームを形成することで、上記と同様に単純混合によるヒアルロン酸とナノ粒子表面を相互作用させている（非特許文献７参照。）。   On the other hand, there is also research that focuses on the negative charge of glucuronic acid in hyaluronic acid. El Kechai et al. Added a lipid stearylamine having a positive charge as a lipid constituting the liposome, and formed a complex by simply mixing hyaluronic acid having a negative charge after the formation of the liposome (see Non-Patent Document 6). .) Jiang et al. Added liposomes with arginine oligos and lipids, which have positive charges to the lipids that make up the liposomes, to form liposomes in advance, thereby forming hyaluronic acid and nanoparticle surfaces by simple mixing as described above. (See Non-Patent Document 7).

Ponta et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology，2003，vol.4, p.33-45.Ponta et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2003, vol.4, p.33-45. Pozza et al., Biochimica et Biophysica Acta, 2013, vol.1828, p.1396-1404.Pozza et al., Biochimica et Biophysica Acta, 2013, vol.1828, p.1396-1404. He et al., Biomaterials，2012，vol.33, p.4392-4402.He et al., Biomaterials, 2012, vol.33, p.4392-4402. Peer et al., Neoplasia，2004，vol.6, p.343-353.Peer et al., Neoplasia, 2004, vol.6, p.343-353. Surace et al., Molecular Pharmaceutics，2009，vol.6, p.1062-1073.Surace et al., Molecular Pharmaceutics, 2009, vol.6, p.1062-1073. El Kechai et al., International Journal of Pharmaceutics，2015，vol.487, p.187-196.El Kechai et al., International Journal of Pharmaceutics, 2015, vol.487, p.187-196. Jiang et al., Biomaterials，2012，vol.33, p.9246-9258.Jiang et al., Biomaterials, 2012, vol.33, p.9246-9258. Banerji et al., Nature Structural & Molecular Biology，2007，vol.14, p.234-239.Banerji et al., Nature Structural & Molecular Biology, 2007, vol.14, p.234-239. Li et al., Biochimica et Biophysica Acta, 2001, vol.1513, p.193-206.Li et al., Biochimica et Biophysica Acta, 2001, vol.1513, p.193-206. Arpicco et al., European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2013，vol.85，p.373-380.Arpicco et al., European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2013, vol.85, p.373-380.

ヒアルロン酸は生体内に天然に存在する物質であり安全性は高いことから、生体内で適合性の高い標的化リガンドとして非常に有用である。そのため、多くのグループが上記のような構造を有するナノ粒子を作成しているが、未だ高効率で薬剤をがん細胞に送達可能なドラッグデリバリーシステムは存在しない。この理由として、上記の修飾方法ではヒアルロン酸とＣＤ４４の相互作用が不十分である可能性が挙げられる。実際、ヒアルロン酸とＣＤ４４の相互作用には、グルクロン酸中のカルボン酸とＣＤ４４のＡｌａ１０２、Ａｌａ１０３との水素結合が重要であることが報告されている（非特許文献８参照。）。上記のようにグルクロン酸中のカルボン酸をナノ粒子との修飾に使用してしまうことで、ヒアルロン酸とＣＤ４４の結合活性が失われていることが予想される。また、一般的に負電荷を帯びたナノ粒子の取り込みは著しく悪いことが報告されており、ヒアルロン酸を修飾したナノ粒子は強い負電荷を帯び効率的な細胞内取り込み機構が作用しない。このように、ヒアルロン酸の構造上受容体との相互作用に重要な部位を維持したままナノ粒子表面に提示し、かつ負電荷による取り込みの阻害を克服するヒアルロン酸のナノ粒子の修飾方法の開発は必要不可欠である。   Hyaluronic acid is a substance that exists naturally in the living body and has high safety. Therefore, it is very useful as a targeting ligand with high compatibility in the living body. For this reason, many groups have created nanoparticles having the structure described above, but there is still no drug delivery system capable of delivering drugs to cancer cells with high efficiency. This is because the above-described modification method may have insufficient interaction between hyaluronic acid and CD44. In fact, it has been reported that a hydrogen bond between carboxylic acid in glucuronic acid and Ala102 and Ala103 of CD44 is important for the interaction between hyaluronic acid and CD44 (see Non-Patent Document 8). As described above, it is expected that the binding activity between hyaluronic acid and CD44 is lost by using carboxylic acid in glucuronic acid for modification with nanoparticles. In general, it has been reported that the uptake of negatively charged nanoparticles is extremely poor, and nanoparticles modified with hyaluronic acid have a strong negative charge and an efficient intracellular uptake mechanism does not act. In this way, the development of a method for modifying nanoparticles of hyaluronic acid that presents on the surface of the nanoparticle while maintaining a site important for the interaction of hyaluronic acid with the receptor and overcomes the inhibition of uptake by negative charges Is essential.

本発明は、ヒアルロン酸受容体を発現している細胞への薬効成分のキャリアとして有用な脂質ナノ粒子を提供することを目的とする。   An object of this invention is to provide the lipid nanoparticle useful as a carrier of an active ingredient to the cell which is expressing the hyaluronic acid receptor.

本発明者らは、ヒアルロン酸の末端の還元糖であるＮ−アセチルグルコサミンの水酸基に、直鎖状の疎水性基を備える中性脂質を直接又は間接的に連結させたヒアルロン酸誘導体が、ヒアルロン酸とＣＤ４４との結合活性を保持した脂質誘導体であること、このヒアルロン酸誘導体を脂質ナノ粒子を構成する脂質分子として用いることにより、ヒアルロン酸受容体との相互作用に重要な構造が粒子表面に提示されており、ＣＤ４４を持つ細胞への取り込み効率に優れた脂質ナノ粒子が得られることを見出し、本発明を完成させた。   The present inventors have developed a hyaluronic acid derivative in which a neutral lipid having a linear hydrophobic group is directly or indirectly linked to a hydroxyl group of N-acetylglucosamine, which is a reducing sugar at the terminal of hyaluronic acid. By using this hyaluronic acid derivative as a lipid molecule constituting lipid nanoparticles, the structure important for the interaction with the hyaluronic acid receptor is formed on the particle surface. The present invention has been completed by finding that lipid nanoparticles can be obtained that have been presented and have excellent uptake efficiency into cells having CD44.

すなわち、本発明は、以下の脂質ナノ粒子を提供するものである。
［１］ ヒアルロン酸の末端の還元糖であるＮ−アセチルグルコサミンの水酸基に、直鎖状の疎水性基を備える中性脂質が直接又は間接的に連結されたヒアルロン酸誘導体を含有する、脂質ナノ粒子。
［２］ 前記中性脂質が、グリセロリン脂質である、前記［１］の脂質ナノ粒子。
［３］ 前記グリセロリン脂質がジアシルグリセロリン脂質である、前記［２］の脂質ナノ粒子。
［４］ さらに、カチオン性脂質を含む、前記［１］〜［３］のいずれかの脂質ナノ粒子。
［５］ 脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する前記ヒアルロン酸誘導体の割合が０．５モル％以上である、前記［１］〜［４］のいずれかの脂質ナノ粒子。
［６］ 前記ヒアルロン酸誘導体が、１０〜１０００ｋＤａのヒアルロン酸と前記中性脂質が直接又は間接的に連結された物質である、前記［１］〜［５］のいずれかの脂質ナノ粒子。
［７］ さらに、グリセロリン脂質及びスフィンゴリン脂質を含む、前記［１］〜［６］のいずれかの脂質ナノ粒子。
［８］ 低分子化合物、低分子核酸、及びペプチドからなる群より選択される１種以上を含有する、前記［１］〜［７］のいずれかの脂質ナノ粒子。
［９］ 薬効成分を含有しており、標的細胞へ前記薬効成分を送達するキャリアである、前記［１］〜［８］のいずれかの脂質ナノ粒子。
［１０］ 前記標的細胞が、ヒアルロン酸受容体を発現している細胞である、前記［９］の脂質ナノ粒子。
［１１］ 抗がん剤を含有しており、悪性胸膜中皮腫／胸膜播種した肺がんの治療に用いられる、前記［１］〜［１０］のいずれかの脂質ナノ粒子。 That is, the present invention provides the following lipid nanoparticles.
[1] A lipid nano containing a hyaluronic acid derivative in which a neutral lipid having a linear hydrophobic group is directly or indirectly linked to a hydroxyl group of N-acetylglucosamine which is a reducing sugar at the terminal of hyaluronic acid. particle.
[2] The lipid nanoparticle of [1], wherein the neutral lipid is glycerophospholipid.
[3] The lipid nanoparticle of [2], wherein the glycerophospholipid is a diacylglycerophospholipid.
[4] The lipid nanoparticle according to any one of [1] to [3], further comprising a cationic lipid.
[5] The lipid nanoparticle according to any one of the above [1] to [4], wherein the ratio of the hyaluronic acid derivative to the total amount of lipid constituting the lipid nanoparticle is 0.5 mol% or more.
[6] The lipid nanoparticle according to any one of [1] to [5], wherein the hyaluronic acid derivative is a substance in which 10 to 1000 kDa hyaluronic acid and the neutral lipid are directly or indirectly linked.
[7] The lipid nanoparticle according to any one of [1] to [6], further comprising glycerophospholipid and sphingophospholipid.
[8] The lipid nanoparticle according to any one of [1] to [7], containing one or more selected from the group consisting of a low molecular compound, a low molecular nucleic acid, and a peptide.
[9] The lipid nanoparticle according to any one of [1] to [8], which contains a medicinal ingredient and is a carrier that delivers the medicinal ingredient to a target cell.
[10] The lipid nanoparticle of [9], wherein the target cell is a cell expressing a hyaluronic acid receptor.
[11] The lipid nanoparticles according to any one of [1] to [10], which contain an anticancer agent and are used for the treatment of malignant pleural mesothelioma / pleurally seeded lung cancer.

本発明に係る脂質ナノ粒子は、粒子表面にヒアルロン酸受容体との相互作用に重要なグルクロン酸に由来するカルボン酸が、遊離のヒアルロン酸と同様に高い自由度で提示されており、ＣＤ４４を持つ細胞への取り込み効率に優れている。このため、当該脂質ナノ粒子に薬効成分を内包させることにより、がん細胞などのＣＤ４４を持つ細胞への選択的送達能に優れた薬剤キャリアナノ粒子が得られる。   In the lipid nanoparticles according to the present invention, the carboxylic acid derived from glucuronic acid, which is important for the interaction with the hyaluronic acid receptor, is presented on the particle surface with a high degree of freedom like free hyaluronic acid. Excellent uptake efficiency into cells. For this reason, drug carrier nanoparticles excellent in ability to selectively deliver to cells having CD44, such as cancer cells, can be obtained by encapsulating medicinal components in the lipid nanoparticles.

実施例１において、ＨＭＭ３細胞における、非修飾蛍光標識リポソーム、ＨＡ混合蛍光標識リポソーム、及びＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソームの取り込み量（蛍光強度、Ａ．Ｕ．）の測定結果を、リポソームのＤＯＴＡＰの含有量ごとに示した図である。In Example 1, the measurement results of the amount of uptake (fluorescence intensity, AU) of unmodified fluorescently labeled liposomes, HA mixed fluorescently labeled liposomes, and HA-PE modified fluorescently labeled liposomes in HMM3 cells are shown as liposome DOTAP. It is the figure shown for every content. 実施例１において、Ｈ２２６細胞における、非修飾蛍光標識リポソーム、ＨＡ混合蛍光標識リポソーム、及びＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソームの取り込み量（蛍光強度、Ａ．Ｕ．）の測定結果を、リポソームのＤＯＴＡＰの含有量ごとに示した図である。In Example 1, the measurement results of the amount of uptake (fluorescence intensity, AU) of unmodified fluorescently labeled liposomes, HA mixed fluorescently labeled liposomes, and HA-PE modified fluorescently labeled liposomes in H226 cells were compared with the DOTAP of liposomes. It is the figure shown for every content. 実施例１において、ＨＭＭ３細胞における、非修飾蛍光標識リポソーム及びＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソームの取り込み量（蛍光強度、Ａ．Ｕ．）の測定結果を、リポソームが含有するカチオン性脂質ごとに示した図である。In Example 1, the measurement results of the uptake amount (fluorescence intensity, AU) of unmodified fluorescently labeled liposomes and HA-PE modified fluorescently labeled liposomes in HMM3 cells are shown for each cationic lipid contained in the liposomes. FIG. 実施例１において、Ｈ２２６細胞における、非修飾蛍光標識リポソーム及びＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソームの取り込み量（蛍光強度、Ａ．Ｕ．）の測定結果を、リポソームが含有するカチオン性脂質ごとに示した図である。In Example 1, the measurement results of the uptake amount (fluorescence intensity, AU) of unmodified fluorescently labeled liposomes and HA-PE modified fluorescently labeled liposomes in H226 cells are shown for each cationic lipid contained in the liposomes. FIG. 実施例１において、Ｈ２２６細胞における、ＨＡ−ＰＥ体（ＳＯＰＥ）による修飾量（モル％）を変化させた際のＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソームの取り込み量（蛍光強度、Ａ．Ｕ．）の変化を示した図である。In Example 1, change in the amount of uptake of HA-PE modified fluorescently labeled liposomes (fluorescence intensity, AU) when the amount of modification (mol%) by HA-PE body (SOPE) in H226 cells was changed. FIG. 実施例１において、ＨＭＭ１細胞、ＨＭＭ３細胞、及びＨ２２６細胞における、非修飾蛍光標識リポソーム及びＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソームの取り込み量（蛍光強度、Ａ．Ｕ．）の測定結果を示した図である。In Example 1, it is the figure which showed the measurement result of the uptake | capture amount (fluorescence intensity, AU) of a non-modified fluorescence labeled liposome and a HA-PE modified fluorescence labeled liposome in HMM1 cell, HMM3 cell, and H226 cell. . 実施例１において、Ｈ２２６細胞における、ＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソームの相対取り込み量の測定結果を、リポソームが含有するＨＡ−ＰＥ体の含有量（モル％）及びヒアルロン酸の大きさ（ｋＤａ）ごとに示した図である。In Example 1, the measurement results of the relative uptake of HA-PE-modified fluorescently labeled liposomes in H226 cells are shown for each HA-PE body content (mol%) and hyaluronic acid size (kDa) contained in the liposomes. It is the figure shown in. 実施例１において、非修飾蛍光標識リポソーム（左）又はＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソーム（右）を取り込ませたＨ２２６細胞の蛍光画像である。In Example 1, it is the fluorescence image of the H226 cell which took in the unmodified fluorescence labeled liposome (left) or the HA-PE modified fluorescence labeled liposome (right). 実施例２において、ＣＤＤＰ内封非修飾リポソーム、ＣＤＤＰ内封ＨＡ−ＰＥ修飾リポソーム、及びフリーのＣＤＤＰを取り込ませたＨＭＭ３細胞の細胞生存率（％）の測定結果を示した図である。In Example 2, it is the figure which showed the measurement result of the cell viability (%) of the HMM3 cell which took in CDDP inclusion non-modified liposome, CDDP inclusion HA-PE modification liposome, and free CDDP. 実施例２において、ＣＤＤＰ内封非修飾リポソーム、ＣＤＤＰ内封ＨＡ−ＰＥ修飾リポソーム、及びフリーのＣＤＤＰを取り込ませたＨ２２６細胞の細胞生存率（％）の測定結果を示した図である。In Example 2, it is the figure which showed the measurement result of the cell viability (%) of the H226 cell which took in CDDP inclusion non-modified liposome, CDDP inclusion HA-PE modification liposome, and free CDDP. 実施例２において、ＣＤＤＰを内封していないＨＡ−ＰＥ修飾リポソームを取り込ませたＨＭＭ３細胞の細胞生存率（％）の測定結果を示した図である。In Example 2, it is the figure which showed the measurement result of the cell survival rate (%) of the HMM3 cell which took in the HA-PE modified liposome which does not encapsulate CDDP. 実施例２において、ＣＤＤＰを内封していないＨＡ−ＰＥ修飾リポソームを取り込ませたＨ２２６細胞の細胞生存率（％）の測定結果を示した図である。In Example 2, it is the figure which showed the measurement result of the cell survival rate (%) of the H226 cell which took in the HA-PE modified liposome which does not encapsulate CDDP. 実施例３において、ＰＢＳ、ＣＤＤＰ単剤、又はＣＤＤＰ内封ＨＡ−ＰＥ修飾リポソームを投与した悪性胸膜中皮腫胸腔内播種マウスの生存率（％）の経時的変化を示した図である。In Example 3, it is the figure which showed the time-dependent change of the survival rate (%) of the malignant pleural mesothelioma intrathoracic seed | inoculation mouse | mouth which administered PBS, CDDP single agent, or the CDDP encapsulated HA-PE modified liposome.

本発明に係る脂質ナノ粒子は、表面が脂質膜によって被覆されているナノ粒子であり、この表面の脂質膜を構成する脂質分子の一部に、ヒアルロン酸に中性脂質が連結されたヒアルロン酸誘導体を含む。ヒアルロン酸誘導体に由来するヒアルロン酸が、ヒアルロン酸受容体と相互作用することにより、このヒアルロン酸誘導体を含む脂質ナノ粒子は、ヒアルロン酸誘導体を発現している細胞内に取り込まれる。   The lipid nanoparticle according to the present invention is a nanoparticle whose surface is covered with a lipid membrane, and hyaluronic acid in which a neutral lipid is linked to hyaluronic acid on a part of the lipid molecules constituting the lipid membrane on the surface. Including derivatives. When hyaluronic acid derived from a hyaluronic acid derivative interacts with a hyaluronic acid receptor, lipid nanoparticles containing the hyaluronic acid derivative are taken up into cells expressing the hyaluronic acid derivative.

［ヒアルロン酸誘導体］
本発明に係る脂質ナノ粒子は、ヒアルロン酸の末端の還元糖であるＮ−アセチルグルコサミンの水酸基に、直鎖状の疎水性基を備える中性脂質が直接又は間接的に連結されたヒアルロン酸誘導体を含有する。このヒアルロン酸誘導体（以下、「本発明に係るヒアルロン酸誘導体」ということがある。）は、中性脂質に由来する直鎖状の疎水性基部分が脂質ナノ粒子の粒子表面を構成する脂質膜に埋まっており、ヒアルロン酸部分が粒子表面に構造上十分な自由度で露出している。このため、本発明に係る脂質ナノ粒子は、従来の、粒子表面にヒアルロン酸を単に静電的に付着させた脂質ナノ粒子や、ヒアルロン酸がグルクロン酸由来のカルボキシル基で脂質ナノ粒子の粒子表面を構成する脂質分子に結合している脂質ナノ粒子よりも、ヒアルロン酸受容体との結合活性が高く、ヒアルロン酸受容体を細胞表面に備える細胞へ選択的にかつ効率よく取り込まれる。 [Hyaluronic acid derivative]
The lipid nanoparticle according to the present invention is a hyaluronic acid derivative in which a neutral lipid having a linear hydrophobic group is directly or indirectly linked to the hydroxyl group of N-acetylglucosamine, which is a reducing sugar at the terminal of hyaluronic acid. Containing. This hyaluronic acid derivative (hereinafter sometimes referred to as “the hyaluronic acid derivative according to the present invention”) is a lipid membrane in which a linear hydrophobic group portion derived from a neutral lipid constitutes the particle surface of a lipid nanoparticle. The hyaluronic acid portion is exposed on the particle surface with a sufficient degree of structural freedom. For this reason, the lipid nanoparticle according to the present invention is a conventional lipid nanoparticle in which hyaluronic acid is simply electrostatically attached to the particle surface, or a particle surface of a lipid nanoparticle having a carboxyl group derived from glucuronic acid. Compared with lipid nanoparticles bound to the lipid molecules constituting, the binding activity to the hyaluronic acid receptor is higher, and the hyaluronic acid receptor is selectively and efficiently taken up into the cell having the cell surface.

本発明に係るヒアルロン酸誘導体は、ヒアルロン酸の末端の還元糖であるＮ−アセチルグルコサミンの水酸基に、直鎖状の疎水性基を備える中性脂質を連結させることにより得られる。ヒアルロン酸と中性脂質は、直接連結させてもよく、間接的に連結させてもよい。ヒアルロン酸の末端のＮ−アセチルグルコサミンの水酸基と中性脂質とが連結基により間接的に連結されている場合、当該連結基としては、本発明の効果を損なわないものであれば特に限定されるものではなく、例えば、ペプチド鎖、糖鎖、ポリエチレングリコール（ＰＯＥ）鎖、炭化水素鎖、核酸鎖等を用いることができ、これらの２種以上を、直接、又はエーテル結合、チオエーテル結合、エステル結合、シリルエーテル結合、アミド結合、カルボニル基、シロキサン結合等の基を介して連結させた基であってもよい。   The hyaluronic acid derivative according to the present invention can be obtained by linking a neutral lipid having a linear hydrophobic group to the hydroxyl group of N-acetylglucosamine, which is a reducing sugar at the end of hyaluronic acid. Hyaluronic acid and neutral lipids may be linked directly or indirectly. When the hydroxyl group of N-acetylglucosamine at the terminal of hyaluronic acid and the neutral lipid are indirectly linked by a linking group, the linking group is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired. For example, a peptide chain, a sugar chain, a polyethylene glycol (POE) chain, a hydrocarbon chain, a nucleic acid chain, etc. can be used, and two or more of these can be used directly or as an ether bond, a thioether bond, or an ester bond. Or a group linked via a group such as a silyl ether bond, an amide bond, a carbonyl group, or a siloxane bond.

ヒアルロン酸の末端のＮ−アセチルグルコサミンの水酸基に連結させる中性脂質としては、本発明のヒアルロン酸誘導体が脂質ナノ粒子の粒子表面の脂質膜に固定されるための足場となり得る直鎖状の疎水性基を備える中性脂質であれば、特に限定されるものではない。直鎖状の疎水性基が脂質膜を構成する他の脂質分子の疎水性部位と相互作用することにより、本発明に係るヒアルロン酸誘導体は、脂質膜中に安定して存在することができる。脂質ナノ粒子を構成する他の脂質分子との相互作用の点から、当該直鎖状の疎水性基としては、直鎖状の炭化水素基を含む基であることが好ましく、脂肪酸残基であることがより好ましい。   The neutral lipid linked to the hydroxyl group of N-acetylglucosamine at the terminal of hyaluronic acid is a linear hydrophobic that can serve as a scaffold for fixing the hyaluronic acid derivative of the present invention to the lipid membrane on the particle surface of the lipid nanoparticle. It is not particularly limited as long as it is a neutral lipid having a sex group. The hyaluronic acid derivative according to the present invention can be stably present in the lipid membrane by the interaction of the linear hydrophobic group with the hydrophobic sites of other lipid molecules constituting the lipid membrane. From the viewpoint of interaction with other lipid molecules constituting the lipid nanoparticle, the linear hydrophobic group is preferably a group containing a linear hydrocarbon group, and is a fatty acid residue. It is more preferable.

本発明に係るヒアルロン酸誘導体を構成する中性脂質としては、脂質膜の構成成分として汎用されていることから、グリセロ脂質又はスフィンゴ脂質が好ましい。グリセロ脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファリジルコリン、カルジオリピン、プラスマロゲン等の中性のグリセロリン脂質；スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド等のグリセロ糖質が挙げられる。スフィンゴ脂質としては、スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルエタノールアミン等の中性のスフィンゴリン脂質；ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等のスフィンゴ糖質が挙げられる。これらのグリセロ脂質又はスフィンゴ脂質が２以上の直鎖状の脂肪酸残基を有する場合、全ての脂肪酸残基が同一の基であってもよく、互いに異なる基であってもよい。   As the neutral lipid constituting the hyaluronic acid derivative according to the present invention, glycerolipid or sphingolipid is preferable because it is widely used as a component of the lipid membrane. Examples of glycerolipids include neutral glycerophospholipids such as phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, cardiolipin, and plasmalogen; glycerosaccharides such as sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride, galactosyl diglyceride, and glycosyl diglyceride It is done. Examples of sphingolipids include neutral sphingophospholipids such as sphingomyelin, ceramide phosphorylglycerol, and ceramide phosphorylethanolamine; and sphingosaccharides such as galactosyl cerebroside, lactosyl cerebroside, and ganglioside. When these glycerolipids or sphingolipids have two or more linear fatty acid residues, all the fatty acid residues may be the same group or different from each other.

これらのグリセロ脂質又はスフィンゴ脂質における脂肪酸残基は特に限定されないが、例えば、炭素数１２〜２４の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を挙げることができ、炭素数１４〜２０の飽和又は不飽和の脂肪酸残基が好ましい。具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸などの脂肪酸由来のアシル基を挙げることができる。なお、当該脂肪酸残基は、１個以上の炭素−炭素単結合間に、エステル結合（-COO-）、アミド結合（-CONH-）、エーテル結合（-O-）、カルボニル結合（-CO-）、及びカーボネート結合（-OCOO-）からなる群より選択される１以上の結合が挿入されていてもよい。   Fatty acid residues in these glycerolipids or sphingolipids are not particularly limited, and examples thereof include saturated or unsaturated fatty acid residues having 12 to 24 carbon atoms, and saturated or unsaturated fatty acids having 14 to 20 carbon atoms. Fatty acid residues are preferred. Specific examples include acyl groups derived from fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidic acid, arachidonic acid, behenic acid, and lignoceric acid. Can do. The fatty acid residue includes an ester bond (—COO—), an amide bond (—CONH—), an ether bond (—O—), a carbonyl bond (—CO—) between one or more carbon-carbon single bonds. And one or more bonds selected from the group consisting of carbonate bonds (—OCOO—) may be inserted.

本発明のヒアルロン酸誘導体としては、ヒアルロン酸が、グリセロ脂質又はスフィンゴ脂質の親水性基部分と、直接又は間接的に連結された誘導体が好ましく、ヒアルロン酸が、グリセロリン脂質と、直接又は間接的に連結された誘導体がより好ましく、ヒアルロン酸が、２本の脂肪酸残基を備えるグリセロリン脂質（ジアシルグリセロリン脂質）と、直接又は間接的に連結された誘導体がさらに好ましい。中でも、ヒアルロン酸が、２本の飽和脂肪酸残基を備えるジアシルグリセロリン脂質又は１本の飽和脂肪酸残基と１本の不飽和脂肪酸残基を備えるジアシルグリセロリン脂質と、直接又は間接的に連結された誘導体が特に好ましい。ジアシルグリセロリン脂質の２本の脂肪酸残基のうち、少なくとも一方が自由度の高い飽和脂肪酸残基であることにより、脂質膜により安定して保持される（例えば、非特許文献９参照。）。具体的には、ラウリン酸残基、ミリスチン酸残基、パルミチン酸残基、パルミトレイン酸残基、ステアリン酸残基、オレイン酸残基、リノール酸残基、リノレン酸残基、アラキジン酸残基、アラキドン酸残基、ベヘン酸残基、及びリグノセリン酸残基からなる群より選択される１種又は２種の脂肪酸残基を備えるジアシルグリセロリン脂質が挙げられる。   The hyaluronic acid derivative of the present invention is preferably a derivative in which hyaluronic acid is directly or indirectly linked to the hydrophilic group portion of glycerolipid or sphingolipid, and hyaluronic acid is directly or indirectly linked to glycerophospholipid. A linked derivative is more preferred, and a derivative in which hyaluronic acid is linked directly or indirectly to glycerophospholipid (diacylglycerophospholipid) having two fatty acid residues is more preferred. Among them, hyaluronic acid was directly or indirectly linked to a diacylglycerophospholipid having two saturated fatty acid residues or a diacylglycerophospholipid having one saturated fatty acid residue and one unsaturated fatty acid residue. Derivatives are particularly preferred. Since at least one of the two fatty acid residues of diacylglycerophospholipid is a saturated fatty acid residue having a high degree of freedom, it is stably held by the lipid membrane (see, for example, Non-Patent Document 9). Specifically, lauric acid residue, myristic acid residue, palmitic acid residue, palmitoleic acid residue, stearic acid residue, oleic acid residue, linoleic acid residue, linolenic acid residue, arachidic acid residue, Examples thereof include diacylglycerophospholipids having one or two fatty acid residues selected from the group consisting of arachidonic acid residues, behenic acid residues, and lignoceric acid residues.

脂質ナノ粒子を構成する脂質分子に占める本発明のヒアルロン酸誘導体の割合が少なすぎると、ヒアルロン酸受容体を発現している細胞（標的細胞）への送達効率（脂質ナノ粒子が、ヒアルロン酸誘導体を発現している細胞内に取り込まれる効率）が不十分となるおそれがある。一方で、脂質ナノ粒子を構成する脂質分子に占める本発明のヒアルロン酸誘導体の割合が多すぎると、脂質ナノ粒子の膜安定性が低下するおそれがある。本発明に係る脂質ナノ粒子としては、標的細胞への送達効率と粒子の安定性の両方を向上させられることから、脂質ナノ粒子を構成する脂質分子に占める本発明のヒアルロン酸誘導体の割合（［本発明のヒアルロン酸誘導体の量（ｍｏｌ）］／（［脂質ナノ粒子を構成する全脂質の量（ｍｏｌ）］）×１００％）は、０．５モル％以上が好ましく、０．５〜１５モル％であることがより好ましく、０．５〜１０モル％であることがさらに好ましく、１〜６モル％であることがよりさらに好ましく、１〜４モル％であることが特に好ましい。   If the proportion of the hyaluronic acid derivative of the present invention in the lipid molecules constituting the lipid nanoparticle is too small, the delivery efficiency to the cell expressing the hyaluronic acid receptor (target cell) (the lipid nanoparticle is a hyaluronic acid derivative) There is a risk that the efficiency of incorporation into the cells expressing the On the other hand, if the proportion of the hyaluronic acid derivative of the present invention in the lipid molecules constituting the lipid nanoparticles is too large, the membrane stability of the lipid nanoparticles may be reduced. Since the lipid nanoparticles according to the present invention can improve both the delivery efficiency to target cells and the stability of the particles, the proportion of the hyaluronic acid derivative of the present invention in the lipid molecules constituting the lipid nanoparticles ([[ The amount of the hyaluronic acid derivative of the present invention (mol)] / ([the amount of total lipid constituting the lipid nanoparticles (mol)]) × 100%) is preferably 0.5 mol% or more, 0.5 to 15 It is more preferably mol%, more preferably 0.5 to 10 mol%, still more preferably 1 to 6 mol%, and particularly preferably 1 to 4 mol%.

本発明に係る脂質ナノ粒子を構成する本発明のヒアルロン酸誘導体は、１種類のみであってもよく、２種類以上であってもよい。本発明に係る脂質ナノ粒子を構成する本発明のヒアルロン酸誘導体が２種類以上である場合、本発明のヒアルロン酸誘導体の量は、脂質ナノ粒子を構成する脂質分子のうち、本発明のヒアルロン酸誘導体に相当する脂質分子の合計量を意味する。   The hyaluronic acid derivative of the present invention constituting the lipid nanoparticle according to the present invention may be only one type or two or more types. When there are two or more kinds of the hyaluronic acid derivative of the present invention constituting the lipid nanoparticle according to the present invention, the amount of the hyaluronic acid derivative of the present invention is the amount of the hyaluronic acid of the present invention among the lipid molecules constituting the lipid nanoparticle. It means the total amount of lipid molecules corresponding to the derivative.

本発明に係るヒアルロン酸誘導体を構成するヒアルロン酸としては、特に限定されるものではなく、天然に存在する様々なヒアルロン酸をそのまま用いることができる。使用するヒアルロン酸の大きさも特に限定されるものではなく、例えば、１０ｋＤａ以上の大きさのものを用いることができ、脂質ナノ粒子が充分な効率で細胞へ取り込まれることが期待できることから、１０〜１０００ｋＤａの大きさであることが好ましく、２０〜８００ｋＤａの大きさであることがより好ましく、２０〜６００ｋＤａの大きさであることがさらに好ましく、４０〜１００ｋＤａの大きさであることがよりさらに好ましい。また、ヒアルロン酸受容体との相互作用を損なわない限りにおいて、各種修飾を施したヒアルロン酸であってもよい。   The hyaluronic acid constituting the hyaluronic acid derivative according to the present invention is not particularly limited, and various naturally occurring hyaluronic acids can be used as they are. The size of hyaluronic acid to be used is not particularly limited. For example, a hyaluronic acid having a size of 10 kDa or more can be used, and lipid nanoparticles can be expected to be taken into cells with sufficient efficiency. The size is preferably 1000 kDa, more preferably 20 to 800 kDa, still more preferably 20 to 600 kDa, and still more preferably 40 to 100 kDa. Moreover, as long as the interaction with the hyaluronic acid receptor is not impaired, hyaluronic acid subjected to various modifications may be used.

［中性脂質］
本発明に係る脂質ナノ粒子を構成する脂質のうち、本発明のヒアルロン酸誘導体以外の脂質分子としては、特に限定されるものではないが、より粒子の安定性が向上することから、粒子表面の脂質膜の構成脂質に中性脂質が含まれていることが好ましい。中性脂質としては、前記で列挙されたものを用いることができ、中性のグリセロ脂質又はスフィンゴ脂質が好ましく、中性のグリセロリン脂質又はスフィンゴリン脂質がより好ましい。 [Neutral lipids]
Among the lipids constituting the lipid nanoparticle according to the present invention, the lipid molecules other than the hyaluronic acid derivative of the present invention are not particularly limited. However, since the stability of the particles is further improved, It is preferable that a neutral lipid is contained in the constituent lipid of the lipid membrane. As the neutral lipid, those listed above can be used, and neutral glycerolipid or sphingolipid is preferable, and neutral glycerophospholipid or sphingophospholipid is more preferable.

脂質ナノ粒子を構成する脂質分子に占める中性脂質の割合が多いほど、粒子表面の脂質膜の安定性が高くなり、粒子径を小さくした場合でも十分な送達効率が達成できる。このため、本発明に係る脂質ナノ粒子においては、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する中性脂質の量の割合（［中性脂質の量（ｍｏｌ）］／（［脂質ナノ粒子を構成する全脂質の量（ｍｏｌ）］）×１００％）は、１モル％以上が好ましく、３モル％以上がより好ましく、２５モル％以上がさらに好ましく、３０〜７０モル％がよりさらに好ましく、５０〜７０モル％が特に好ましい。   The greater the proportion of neutral lipid in the lipid molecules constituting the lipid nanoparticle, the higher the stability of the lipid membrane on the particle surface, and sufficient delivery efficiency can be achieved even when the particle size is reduced. Therefore, in the lipid nanoparticle according to the present invention, the ratio of the amount of neutral lipid to the total amount of lipid constituting the lipid nanoparticle ([the amount of neutral lipid (mol)] / ([the lipid nanoparticle is composed The total amount of lipids (mol)]) × 100%) is preferably 1 mol% or more, more preferably 3 mol% or more, further preferably 25 mol% or more, more preferably 30 to 70 mol%, 50 to 70 mol% is particularly preferred.

本発明に係る脂質ナノ粒子を構成する中性脂質は、１種類のみであってもよく、２種類以上であってもよい。本発明に係る脂質ナノ粒子を構成する中性脂質が２種類以上である場合、中性脂質の量は、脂質ナノ粒子を構成する脂質分子のうち、中性脂質に相当する脂質分子の合計量を意味する。   The neutral lipid constituting the lipid nanoparticle according to the present invention may be only one type or two or more types. When there are two or more types of neutral lipids constituting the lipid nanoparticles according to the present invention, the amount of neutral lipids is the total amount of lipid molecules corresponding to neutral lipids among the lipid molecules constituting the lipid nanoparticles. Means.

［カチオン性脂質］
本発明に係る脂質ナノ粒子は、表面の脂質膜を構成する脂質分子の一部に、カチオン性脂質を含むことが好ましい。カチオン性脂質を構成脂質に含むことにより、本発明に係る脂質ナノ粒子の標的細胞への取り込み効率がより改善される。 [Cationic lipids]
The lipid nanoparticles according to the present invention preferably contain a cationic lipid in a part of the lipid molecules constituting the surface lipid membrane. By including the cationic lipid in the constituent lipid, the efficiency of incorporation of the lipid nanoparticles according to the present invention into the target cells is further improved.

カチオン性脂質としては、例えば、ＤＯＤＡＣ（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）、ＤＤＡＢ（ｄｉｄｏｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｒｏｐａｎｅ）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）−ｃａｒｂａｍｏｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、ＤＭＲＩＥ（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ）、ＤＯＳＰＡ（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ−Ｎ−［２（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｕｍ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）、ＤＳＴＡＰ（１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｒｏｐａｎｅ）、ＤＯＤＡＰ（ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ）等が挙げられる。好ましいカチオン性脂質はＤＯＴＭＡ、ＤＳＴＡＰ又はＤＯＤＡＰであり、特に好ましくはＤＯＴＭＡが挙げられる。カチオン性脂質は単独で又は２種以上を混合して使用することができる。カチオン性脂質において、ＤＯＴＭＡ及びＤＳＴＡＰは４級アミンを有しており，常に正電荷を帯びているが，ＤＯＤＡＰは３級アミンを有しており，生理的ｐＨにおいて電荷を持たないものである。このようにカチオン性脂質の種類、配合量を変更することで、カチオン性脂質の構造、特徴に幅を持たせることができる。   Examples of the cationic lipid include DODAC (dioctadecyldimethylammonium chloride), DOTMA (N- (2,3-dioleoyloxy) propyl-N, N, N-trimethylaluminumium), DDAB (didodecylamyloidium, dododecylamyloidium). 3-trimethylammonium propylene), DC-Chol (3β-N- (N ′, N ′,-dimethylethylamine) -carbamoylcholesterol), DMRIE (1,2-dimethyloxypropylene-3-dimethylpropylene-3-dimethylpropylene) 3-dioleoyloxy-N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propanamine trifluoroacetate), DSTAP (1,2-distearoyl-3-triammonium-tri-Ammoleprone-ammonium Etc. A preferred cationic lipid is DOTMA, DSTAP or DODAP, and particularly preferably DOTMA. Cationic lipids can be used alone or in admixture of two or more. In cationic lipids, DOTMA and DSTAP have quaternary amines and are always positively charged, while DODAP has tertiary amines and has no charge at physiological pH. Thus, the structure and characteristics of the cationic lipid can be widened by changing the type and the blending amount of the cationic lipid.

脂質ナノ粒子を構成する脂質分子に占めるカチオン性脂質の割合が多いほど、標的細胞への脂質ナノ粒子の取り込み効率が高くなる。このため、本発明に係る脂質ナノ粒子においては、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対するカチオン性脂質の量の割合（［カチオン性脂質の量（ｍｏｌ）］／（［脂質ナノ粒子を構成する全脂質の量（ｍｏｌ）］）×１００％）は、２０モル％以上であることが好ましい。一方で、脂質ナノ粒子を構成する脂質分子に占めるカチオン性脂質の割合が多すぎると、粒子径を十分に小さくすることが困難な場合がある。標的細胞への脂質ナノ粒子の取り込み効率が十分であり、かつ粒子径が十分に小さい脂質ナノ粒子が得られることから、本発明に係る脂質ナノ粒子における脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対するカチオン性脂質の量の割合は、３０モル％以上であることがより好ましく、３０〜７０モル％がさらに好ましく、３０〜５０モル％がよりさらに好ましい。   The greater the proportion of the cationic lipid in the lipid molecules constituting the lipid nanoparticle, the higher the efficiency of taking up the lipid nanoparticle into the target cell. Therefore, in the lipid nanoparticle according to the present invention, the ratio of the amount of cationic lipid to the total amount of lipid constituting the lipid nanoparticle ([amount of cationic lipid (mol)] / ([constituting lipid nanoparticle The total lipid amount (mol)]) × 100%) is preferably 20 mol% or more. On the other hand, if the proportion of the cationic lipid in the lipid molecules constituting the lipid nanoparticles is too large, it may be difficult to sufficiently reduce the particle diameter. Since the lipid nanoparticle having a sufficiently small uptake efficiency of the lipid nanoparticle to the target cell and a sufficiently small particle diameter can be obtained, the cation with respect to the total lipid amount constituting the lipid nanoparticle in the lipid nanoparticle according to the present invention As for the ratio of the quantity of sex lipid, it is more preferred that it is 30 mol% or more, 30-70 mol% is still more preferred, and 30-50 mol% is still more preferred.

本発明に係る脂質ナノ粒子がカチオン性脂質を含む場合、粒子を構成するカチオン性脂質は、１種類のみであってもよく、２種類以上であってもよい。本発明に係る脂質ナノ粒子を構成するカチオン性脂質が２種類以上である場合、カチオン性脂質の量は、脂質ナノ粒子を構成する脂質分子のうち、カチオン性脂質に相当する脂質分子の合計量を意味する。   When the lipid nanoparticles according to the present invention include a cationic lipid, the cationic lipid constituting the particle may be only one type or two or more types. When the number of cationic lipids constituting the lipid nanoparticle according to the present invention is two or more, the amount of the cationic lipid is the total amount of lipid molecules corresponding to the cationic lipid among the lipid molecules constituting the lipid nanoparticle. Means.

［その他の脂質］
本発明に係る脂質ナノ粒子は、その構成脂質が、本発明のヒアルロン酸誘導体と中性脂質とのみからなる粒子であってもよく、本発明のヒアルロン酸誘導体と中性脂質とカチオン性脂質とのみからなる粒子であってもよく、さらにその他の脂質を含む粒子であってもよい。その他の脂質としては、一般的にリポソームを形成する際に使用される脂質を用いることができる。このような脂質としては、例えば、正又は負に帯電したリン脂質、ステロール、又は飽和若しくは不飽和の脂肪酸等が挙げられる。これらは１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。 [Other lipids]
The lipid nanoparticle according to the present invention may be a particle whose constituent lipid is composed only of the hyaluronic acid derivative of the present invention and a neutral lipid. The hyaluronic acid derivative of the present invention, a neutral lipid, and a cationic lipid The particle | grains which consist only of, and the particle | grains which contain another lipid may be sufficient. As other lipids, lipids generally used for forming liposomes can be used. Examples of such lipids include positively or negatively charged phospholipids, sterols, saturated or unsaturated fatty acids, and the like. These can be used alone or in combination of two or more.

正又は負に帯電したリン脂質としては、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、ホスファチジン酸などを挙げることができる。ステロールとしては、例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール等の動物由来のステロール；スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等の植物由来のステロール（フィトステロール）；チモステロール、エルゴステロール等の微生物由来のステロールなどが挙げられる。   Examples of positively or negatively charged phospholipids include phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, ceramide phosphorylglycerol phosphate, and phosphatidic acid. Examples of sterols include sterols derived from animals such as cholesterol, cholesterol succinic acid, lanosterol, dihydrolanosterol, desmosterol, dihydrocholesterol; sterols derived from plants (phytosterols) such as stigmasterol, sitosterol, campesterol, and brassicasterol; Examples include sterols derived from microorganisms such as timosterol and ergosterol.

本発明に係る脂質ナノ粒子が、本発明のヒアルロン酸誘導体と中性脂質とその他の脂質分子とを含む場合には、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する本発明のヒアルロン酸誘導体と中性脂質との合計量の割合は、５０モル％以上であればよく、６０モル％以上が好ましく、７０モル％以上がより好ましく、８０モル％以上がさらに好ましく、９０モル％以上がよりさらに好ましい。本発明に係る脂質ナノ粒子が、本発明のヒアルロン酸誘導体と中性脂質とカチオン性脂質とその他の脂質分子とを含む場合には、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する本発明のヒアルロン酸誘導体と中性脂質とカチオン性脂質との合計量の割合は、５０モル％以上であればよく、６０モル％以上が好ましく、７０モル％以上がより好ましく、８０モル％以上がさらに好ましく、９０モル％以上がよりさらに好ましい。   When the lipid nanoparticle according to the present invention contains the hyaluronic acid derivative of the present invention, a neutral lipid, and other lipid molecules, the hyaluronic acid derivative of the present invention and the neutrality with respect to the total lipid amount constituting the lipid nanoparticle. The ratio of the total amount with lipid should just be 50 mol% or more, 60 mol% or more is preferable, 70 mol% or more is more preferable, 80 mol% or more is more preferable, 90 mol% or more is more preferable. When the lipid nanoparticle according to the present invention contains the hyaluronic acid derivative of the present invention, a neutral lipid, a cationic lipid, and other lipid molecules, the hyaluronic acid of the present invention relative to the total amount of lipid constituting the lipid nanoparticle The ratio of the total amount of the derivative, neutral lipid and cationic lipid may be 50 mol% or more, preferably 60 mol% or more, more preferably 70 mol% or more, further preferably 80 mol% or more, 90 Mole% or more is more preferable.

［脂質ナノ粒子］
本発明に係る脂質ナノ粒子の形態は特に限定されないが、例えば、水系溶媒に分散した形態として一枚膜リポソーム、多重層リポソーム、球状ミセル、又は不定型の層状構造物などを挙げることができる。本発明に係る脂質ナノ粒子としては、一枚膜リポソーム、多重層リポソームであることが好ましい。 [Lipid nanoparticles]
The form of the lipid nanoparticle according to the present invention is not particularly limited. Examples of the form dispersed in an aqueous solvent include monolayer liposomes, multilamellar liposomes, spherical micelles, and amorphous layered structures. The lipid nanoparticles according to the present invention are preferably monolayer liposomes and multilamellar liposomes.

本発明に係る脂質ナノ粒子の大きさは、標的細胞が生体内の比較的深奥部に存在する場合でも高い送達効率が得られやすいことから、平均粒子径が５００ｎｍ以下であることが好ましく、平均粒子径が４００ｎｍ以下であることがより好ましく、平均粒子径が３００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。なお、脂質ナノ粒子の平均粒子径とは、動的光散乱法（Dynamic light scattering：ＤＬＳ）により測定された個数平均粒子径を意味する。動的光散乱法による測定は、市販のＤＬＳ装置等を用いて常法により行うことができる。   The size of the lipid nanoparticle according to the present invention is preferably such that the average particle diameter is 500 nm or less because high delivery efficiency is easily obtained even when the target cells are present in a relatively deep part in the living body. The particle diameter is more preferably 400 nm or less, and the average particle diameter is further preferably 300 nm or less. The average particle diameter of lipid nanoparticles means the number average particle diameter measured by dynamic light scattering (DLS). Measurement by the dynamic light scattering method can be performed by a conventional method using a commercially available DLS apparatus or the like.

本発明に係る脂質ナノ粒子には、必要に応じて適宜の表面修飾などを行うことができる。
例えば、本発明に係る脂質ナノ粒子の核内移行を促進するために、例えば、脂質ナノ粒子を３糖以上のオリゴ糖化合物で表面修飾することもできる。３糖以上のオリゴ糖化合物の種類は特に限定されないが、例えば、３〜１０個程度の糖ユニットが結合したオリゴ糖化合物を用いることができ、好ましくは３〜６個程度の糖ユニットが結合したオリゴ糖化合物を用いることができる。 The lipid nanoparticles according to the present invention can be subjected to appropriate surface modification as required.
For example, in order to promote the intranuclear transfer of lipid nanoparticles according to the present invention, for example, the lipid nanoparticles can be surface-modified with an oligosaccharide compound having 3 or more sugars. The type of oligosaccharide compound having 3 or more sugars is not particularly limited. For example, an oligosaccharide compound to which about 3 to 10 sugar units are bound can be used, and preferably about 3 to 6 sugar units are bound. Oligosaccharide compounds can be used.

オリゴ糖化合物としてより具体的には、例えば、セロトリオース（Cellotriose：β-D-グルコピラノシル-(1→4)-β-D-グルコピラノシル-(1→4)-D-グルコース）、カコトリオース（Chacotriose：α-L-ラムノピラノシル-(1→2)-[α-L-ラムノピラノシル-(1→4)]-D-グルコース）、ゲンチアノース（Gentianose：β-D-フルクトフラノシル β-D-グルコピラノシル-(1→6)-α-D-グルコピラノシド）、イソマルトトリオース（Isomaltotriose：α-D-グルコピラノシル-(1→6)-α-D-グルコピラノシル-(1→6)-D-グルコース）、イソパノース（Isopanose：α-D-グルコピラノシル-(1→4)-[α-D-グルコピラノシル-(1→6)]-D-グルコース）、マルトトリオース（Maltotriose：α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-D-グルコース）、マンニノトリオース（Manninotriose：α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-D-グルコース）、メレジトース（Melezitose：α-D-グルコピラノシル-(1→3)-β-D-フルクトフラノシル=α-D-グルコピラノシド）、パノース （Panose：α-D-グルコピラノシル-(1→6)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-D-グルコース）、プランテオース（Planteose: α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-β-D-フルクトフラノシル=α-D-グルコピラノシド）、ラフィノース（Raffinose：β-D-フルクトフラノシル=α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-α-D-グルコピラノシド）、ソラトリオース（Solatriose：α-L-ラムノピラノシル-(1→2)-[β-D-グルコピラノシル-(1→3)]-D-ガラクトース）、ウンベリフェロース（Umbelliferose：β-D-フルクトフラノシル=α-D-ガラクトピラノシル-(1→2)-α-D-ガラクトピラノシド）などの３糖化合物；リコテトラオース（Lycoテトラose：β-D-グルコピラノシル-(1→2)-[β-D-キシロピラノシル-(1→3)]-β-D-グルコピラノシル-(1→4)-β-D-ガラクトース）、マルトテトラオース（Maltoテトラose：α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-D-グルコース）、スタキオース（Stachyose：β-D-フルクトフラノシル=α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-α-D-ガラクトピラノシル-(1→6) -α-D-グルコピラノシド）などの４糖化合物；マルトペンタオース（Maltopentaose：α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-D-グルコース）、ベルバスコース（Verbascose：β-D-フルクトフラノシル=α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-α-D-グルコピラノシド）などの５糖化合物；マルトヘキサオース（Maltohexaose: α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-D-グルコース）などの６糖化合物を挙げることができるが、これらに限定されることはない。   More specific examples of oligosaccharide compounds include, for example, cellotriose (Cellotriose: β-D-glucopyranosyl- (1 → 4) -β-D-glucopyranosyl- (1 → 4) -D-glucose), chacotriose: α -L-rhamnopyranosyl- (1 → 2)-[α-L-rhamnopyranosyl- (1 → 4)]-D-glucose), gentianose (β-D-fructofuranosyl β-D-glucopyranosyl- (1 → 6) -α-D-glucopyranoside), isomaltotriose (α-D-glucopyranosyl- (1 → 6) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 6) -D-glucose), isopanose : Α-D-glucopyranosyl- (1 → 4)-[α-D-glucopyranosyl- (1 → 6)]-D-glucose), maltotriose (α-D-glucopyranosyl- (1 → 4)- α-D-Glucopyranosyl- (1 → 4) -D-glucose), Manninotriose (α-D-galactopyranosyl- (1 → 6) -α-D- Galactopyranosyl- (1 → 6) -D-glucose), Melezitose (α-D-glucopyranosyl- (1 → 3) -β-D-fructofuranosyl = α-D-glucopyranoside), Panose ( Panose: α-D-glucopyranosyl- (1 → 6) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 4) -D-glucose), planteose (Planteose: α-D-galactopyranosyl- (1 → 6) -β-D-fructofuranosyl = α-D-glucopyranoside), raffinose (β-D-fructofuranosyl = α-D-galactopyranosyl- (1 → 6) -α-D-glucopyranoside ), Solatriose (α-L-rhamnopyranosyl- (1 → 2)-[β-D-glucopyranosyl- (1 → 3)]-D-galactose), Umbelliferose (β-D-fructofurano) Trisaccharide compounds such as syl = α-D-galactopyranosyl- (1 → 2) -α-D-galactopyranoside); Lycotetraose (β-D-glucopyra) Syl- (1 → 2)-[β-D-xylopyranosyl- (1 → 3)]-β-D-glucopyranosyl- (1 → 4) -β-D-galactose), maltotetraose (α) -D-Glucopyranosyl- (1 → 4) -α-D-Glucopyranosyl- (1 → 4) -α-D-Glucopyranosyl- (1 → 4) -D-glucose), Stachyose: β-D-fructo 4 sugar compounds such as furanosyl = α-D-galactopyranosyl- (1 → 6) -α-D-galactopyranosyl- (1 → 6) -α-D-glucopyranoside); maltopentaose : Α-D-glucopyranosyl- (1 → 4) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 4) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 4) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 4) -D -Glucose), Verbascose: β-D-fructofuranosyl = α-D-galactopyranosyl- (1 → 6) -α-D-galactopyranosyl- (1 → 6) -α Pentasaccharide compounds such as -D-galactopyranosyl- (1 → 6) -α-D-glucopyranoside); malto Hexaose (Maltohexaose: α-D-glucopyranosyl- (1 → 4) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 4) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 4) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 4 ) -α-D-glucopyranosyl- (1 → 4) -D-glucose), but not limited thereto.

好ましくはグルコースの３量体ないし６量体であるオリゴ糖化合物を用いることができ、さらに好ましくはグルコースの３量体又は４量体であるオリゴ糖化合物を用いることができる。より具体的には、イソマルトトリオース、イソパノース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、又はマルトヘキサオースなどを好適に用いることができ、これらのうち、グルコースがα1-4結合したマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、又はマルトヘキサオースがさらに好ましい。特に好ましいのはマルトトリオース又はマルトテトラオースであり、最も好ましいのはマルトトリオースである。オリゴ糖化合物による脂質ナノ粒子の表面修飾量は特に限定されないが、例えば、総脂質量に対して１〜３０モル％程度、好ましくは２〜２０モル％程度、より好ましくは５〜１０モル％程度である。   Preferably, an oligosaccharide compound that is a trimer to hexamer of glucose can be used, and more preferably, an oligosaccharide compound that is a trimer or tetramer of glucose can be used. More specifically, isomaltotriose, isopanose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, etc. can be preferably used. More preferred is triose, maltotetraose, maltopentaose, or maltohexaose. Particularly preferred is maltotriose or maltotetraose, and most preferred is maltotriose. The surface modification amount of the lipid nanoparticles by the oligosaccharide compound is not particularly limited, but for example, about 1 to 30 mol%, preferably about 2 to 20 mol%, more preferably about 5 to 10 mol%, based on the total lipid amount. It is.

オリゴ糖化合物で脂質ナノ粒子を表面修飾する方法は特に限定されないが、例えば、脂質ナノ粒子をガラクトースやマンノースなどの単糖で表面を修飾したリポソーム（国際公開第２００７／１０２４８１号）が知られているので、この刊行物に記載された表面修飾方法を採用することができる。上記刊行物の開示の全てを参照により本明細書の開示として含める。この手段はポリアルキレングリコール化脂質に単糖化合物を結合して脂質ナノ粒子の表面修飾を行なう方法であり、この手段により脂質ナノ粒子の表面をポリアルキレングリコールにより同時に修飾することができるので好ましい。   The method for modifying the surface of lipid nanoparticles with an oligosaccharide compound is not particularly limited. For example, liposomes whose surface is modified with monosaccharides such as galactose and mannose are known (International Publication No. 2007/102481). Therefore, the surface modification method described in this publication can be adopted. The entire disclosures of the above publications are incorporated herein by reference. This means is a method in which a monosaccharide compound is bonded to a polyalkylene glycolated lipid to modify the surface of the lipid nanoparticles, and this means is preferable because the surface of the lipid nanoparticles can be simultaneously modified with polyalkylene glycol.

脂質ナノ粒子の表面をポリアルキレングリコールなどの親水性ポリマーで修飾することによりリポソームの血中滞留性などの安定性を高めることができる場合がある。この手段については、例えば、特開平１−２４９７１７号公報、特開平２−１４９５１２号公報、特開平４−３４６９１８号公報、特開２００４−１０４８１号公報などに記載されている。親水性ポリマーとしてはポリアルキレングリコールが好ましい。ポリアルキレングリコールとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレングリコール、ポリヘキサメチレングリコールなどを用いることができる。ポリアルキレングリコールの分子量は、例えば３００〜１０，０００程度、好ましくは５００〜１０，０００程度、さらに好ましくは１，０００〜５，０００程度である。   In some cases, the surface of the lipid nanoparticles may be modified with a hydrophilic polymer such as polyalkylene glycol to improve the stability of liposomes such as blood retention. This means is described, for example, in JP-A-1-249717, JP-A-2-149512, JP-A-4-346918, and JP-A-2004-10482. As the hydrophilic polymer, polyalkylene glycol is preferable. As polyalkylene glycol, for example, polyethylene glycol, polypropylene glycol, polytetramethylene glycol, polyhexamethylene glycol and the like can be used. The molecular weight of the polyalkylene glycol is, for example, about 300 to 10,000, preferably about 500 to 10,000, and more preferably about 1,000 to 5,000.

ポリアルキレングリコールによる脂質ナノ粒子の表面修飾は、例えばポリアルキレングリコール修飾脂質を脂質膜構成脂質として用いて脂質ナノ粒子を構築することにより容易に行なうことができる。例えば、ポリエチレングリコールによる修飾を行う場合には、ステアリル化ポリエチレングリコール（例えばステアリン酸PEG45(STR-PEG45)など）を用いることができる。その他、N-[カルボニル−メトキシポリエチレングリコール-2000]-1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、n-[カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-5000]-1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、N-[カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-750]-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、N-[カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-2000]-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、N-[カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-5000]-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミンなどのポリエチレングリコール誘導体などを用いることもできるが、ポリアルキレングリコール化脂質はこれらに限定されることはない。   Surface modification of lipid nanoparticles with polyalkylene glycol can be easily performed by constructing lipid nanoparticles using, for example, polyalkylene glycol-modified lipid as a lipid membrane constituent lipid. For example, when the modification with polyethylene glycol is performed, stearyl-ized polyethylene glycol (for example, PEG45 stearate (STR-PEG45) or the like) can be used. Others, N- [carbonyl-methoxypolyethyleneglycol-2000] -1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, n- [carbonyl-methoxypolyethyleneglycol-5000] -1,2-dipalmitoyl -sn-glycero-3-phosphoethanolamine, N- [carbonyl-methoxypolyethyleneglycol-750] -1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, N- [carbonyl-methoxypolyethyleneglycol -2000] -1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, N- [carbonyl-methoxypolyethyleneglycol-5000] -1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol Polyethylene glycol derivatives such as amines can also be used, but polyalkylene glycolated lipids are not limited to these.

また、ポリアルキレングリコールにオリゴ糖化合物を結合させることにより、ポリアルキレングリコール及びオリゴ糖化合物による表面修飾を同時に達成することができる。もっとも、脂質ナノ粒子をポリアルキレングリコールやオリゴ糖化合物で表面修飾する方法は上記の方法に限定されることはなく、例えば、ステアリル化されたポリアルキレングリコールやオリゴ糖化合物など脂質化された化合物を脂質ナノ粒子の構成脂質として使用することにより、表面修飾を行なうことができる場合もある。   In addition, surface modification with the polyalkylene glycol and the oligosaccharide compound can be simultaneously achieved by bonding the oligosaccharide compound to the polyalkylene glycol. However, the method for surface modification of lipid nanoparticles with polyalkylene glycol or oligosaccharide compound is not limited to the above-mentioned method. For example, lipidated compounds such as stearyl polyalkylene glycol and oligosaccharide compounds may be used. In some cases, the surface modification can be performed by using the lipid nanoparticle as a constituent lipid.

本発明に係る脂質ナノ粒子の製造にあたり、血中滞留性を高めるための脂質誘導体として、例えば、グリコフォリン、ガングリオシドＧＭ１、ホスファチジルイノシトール、ガングリオシドＧＭ３、グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体などを利用することもできる。また、血中滞留性を高めるための親水性ポリマーとして、ポリアルキレングリコールのほかにデキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンなどを表面修飾に用いることもできる。   In the production of lipid nanoparticles according to the present invention, examples of lipid derivatives for enhancing retention in blood include glycophorin, ganglioside GM1, phosphatidylinositol, ganglioside GM3, glucuronic acid derivatives, glutamic acid derivatives, polyglycerin phospholipid derivatives, and the like. Can also be used. In addition to polyalkylene glycols, dextran, pullulan, ficoll, polyvinyl alcohol, styrene-maleic anhydride alternating copolymer, divinyl ether-maleic anhydride alternating copolymer as well as polyalkylene glycol Amylose, amylopectin, chitosan, mannan, cyclodextrin, pectin, carrageenan and the like can also be used for surface modification.

本発明に係る脂質ナノ粒子は、ステロール、又はグリセリン若しくはその脂肪酸エステルなどの膜安定化剤、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、又はブチル化ヒドロキシトルエンなどの抗酸化剤、荷電物質、及び膜ポリペプチドなどからなる群から選ばれる１種又は２種以上の物質を含んでいてもよい。正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルアミン、オレイルアミンなどの飽和若しくは不飽和脂肪族アミン；ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンなどの飽和若しくは不飽和カチオン性合成脂質；又は、カチオン性ポリマーなどを挙げることができ、負電荷を付与する荷電物質としては、例えば、ジセチルホスフェート、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸などを挙げることができる。膜ポリペプチドとしては、例えば、膜表在性ポリペプチド、又は膜内在性ポリペプチドなどが挙げられる。これらの物質の配合量は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。   Lipid nanoparticles according to the present invention include a sterol or a membrane stabilizer such as glycerin or a fatty acid ester thereof, an antioxidant such as tocopherol, propyl gallate, ascorbyl palmitate, or butylated hydroxytoluene, a charged substance, and a membrane. One or two or more substances selected from the group consisting of polypeptides and the like may be included. Examples of the charged substance that imparts a positive charge include saturated or unsaturated aliphatic amines such as stearylamine and oleylamine; saturated or unsaturated cationic synthetic lipids such as dioleoyltrimethylammoniumpropane; or cationic polymers. Examples of the charged substance that imparts a negative charge include dicetyl phosphate, cholesteryl hemisuccinate, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, and phosphatidic acid. Examples of the membrane polypeptide include a membrane superficial polypeptide or an integral membrane polypeptide. The compounding amount of these substances is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose.

また、本発明に係る脂質ナノ粒子には、例えば、温度変化感受性機能、膜透過機能、遺伝子発現機能、及びｐＨ感受性機能などのいずれか１つ又は２つ以上の機能を付与することができる。これらの機能を適宜付加することにより、例えば遺伝子を含む核酸などを内包する脂質ナノ粒子の血液中での滞留性を向上させ、肝臓や脾臓などの細網内皮系組織による捕捉率を低下させるとともに、標的細胞におけるエンドサイトーシスの後にエンドソームから効率的に脂質ナノ粒子を脱出させて核内に移行させることができ、核内において高い遺伝子発現活性を達成することが可能になる。   Moreover, any one or two or more functions such as a temperature change sensitivity function, a membrane permeation function, a gene expression function, and a pH sensitivity function can be imparted to the lipid nanoparticles according to the present invention. By appropriately adding these functions, for example, the retention of lipid nanoparticles encapsulating nucleic acids containing genes in blood is improved, and the capture rate by reticuloendothelial tissues such as the liver and spleen is reduced. Thus, after endocytosis in the target cell, lipid nanoparticles can be efficiently escaped from the endosome and transferred into the nucleus, and high gene expression activity can be achieved in the nucleus.

本発明に係る脂質ナノ粒子の製造方法は特に限定されず、当業者に利用可能な任意の方法を採用することができる。一例を挙げれば、全ての脂質成分をクロロホルムなどの有機溶媒に溶解し、エバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことによって脂質膜を形成した後、水系溶媒を乾燥した上記の混合物に添加し、さらにホモジナイザーなどの乳化機、超音波乳化機、又は高圧噴射乳化機などにより乳化することで製造することができる。また、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することができる。脂質ナノ粒子の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルターなどを用いて、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。   The method for producing lipid nanoparticles according to the present invention is not particularly limited, and any method available to those skilled in the art can be adopted. For example, all the lipid components are dissolved in an organic solvent such as chloroform, and after forming a lipid film by drying under reduced pressure with an evaporator or spray drying with a spray dryer, the above mixture is dried with an aqueous solvent. And further emulsifying with an emulsifier such as a homogenizer, an ultrasonic emulsifier, or a high-pressure jet emulsifier. Moreover, it can manufacture also by the method well-known as a method of manufacturing a liposome, for example, a reverse phase evaporation method etc. When it is desired to control the size of the lipid nanoparticles, the extrusion (extrusion filtration) may be performed under high pressure using a membrane filter having a uniform pore size.

水系溶媒（分散媒）の組成は特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩液などの緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。これら水系溶媒（分散媒）は脂質ナノ粒子を安定に分散させることができるが、さらに、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトースなどの二糖類、ラフィノース、メレジノースなどの三糖類、シクロデキストリンなどの多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトールなどの糖アルコールなどの糖（水溶液）や、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、1,3-ブチレングリコールなどの多価アルコール（水溶液）などを加えてもよい。この水系溶媒に分散した脂質ナノ粒子を安定に長期間保存するには、凝集抑制などの物理的安定性の面から水系溶媒中の電解質を極力排除することが望ましい。また、脂質の化学的安定性の面からは水系溶媒のｐＨを弱酸性から中性付近（ｐＨ３．０〜８．０程度）に設定し、及び／又は窒素バブリングなどにより溶存酸素を除去することが望ましい。   The composition of the aqueous solvent (dispersion medium) is not particularly limited, and examples thereof include a buffer solution such as a phosphate buffer solution, a citrate buffer solution, and a phosphate buffered saline solution, a physiological saline solution, a medium for cell culture, and the like. Can do. These aqueous solvents (dispersion media) can stably disperse lipid nanoparticles, but also glucose, galactose, mannose, fructose, inositol, ribose, xylose sugar monosaccharides, lactose, sucrose, cellobiose, trehalose, Disaccharides such as maltose, trisaccharides such as raffinose and merezinose, polysaccharides such as cyclodextrin, sugars (aqueous solutions) such as sugar alcohols such as erythritol, xylitol, sorbitol, mannitol, maltitol, glycerin, diglycerin, polyglycerin , Propylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, polyethylene glycol, ethylene glycol monoalkyl ether, diethylene glycol -Alkyl ether, 1,3-polyhydric alcohol (aqueous solution), such as butylene glycol and the like may be added. In order to stably store the lipid nanoparticles dispersed in the aqueous solvent for a long period of time, it is desirable to eliminate the electrolyte in the aqueous solvent as much as possible from the viewpoint of physical stability such as aggregation suppression. In terms of chemical stability of the lipid, the pH of the aqueous solvent should be set from weakly acidic to near neutral (about pH 3.0 to 8.0) and / or dissolved oxygen can be removed by nitrogen bubbling or the like. Is desirable.

得られた脂質ナノ粒子の水性分散物を凍結乾燥又は噴霧乾燥する場合には、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトースなどの二糖類、ラフィノース、メレジノースなどの三糖類、シクロデキストリンなどの多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトールなどの糖アルコールなどの糖（水溶液）を用いると安定性を改善できる場合がある。また、上記水性分散物を凍結する場合には、例えば、前記の糖類やグリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、1,3-ブチレングリコールなどの多価アルコール（水溶液）を用いると安定性を改善できる場合がある。   When the resulting aqueous dispersion of lipid nanoparticles is freeze-dried or spray-dried, for example, glucose, galactose, mannose, fructose, inositol, ribose, xylose sugar monosaccharide, lactose, sucrose, cellobiose, trehalose, When stability can be improved by using sugars (aqueous solutions) such as disaccharides such as maltose, trisaccharides such as raffinose and merezinose, polysaccharides such as cyclodextrin, erythritol, xylitol, sorbitol, mannitol, maltitol, etc. There is. When the aqueous dispersion is frozen, for example, the saccharides, glycerin, diglycerin, polyglycerin, propylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, polyethylene glycol, ethylene glycol monoalkyl ether If a polyhydric alcohol (aqueous solution) such as diethylene glycol monoalkyl ether or 1,3-butylene glycol is used, stability may be improved.

本発明に係る脂質ナノ粒子は、脂質膜で覆われた粒子内部に、標的の細胞内に送達する目的の成分を内包していることが好ましい。本発明に係る脂質ナノ粒子は、ヒアルロン酸受容体との相互作用部位が粒子表面に露出しているため、ヒアルロン酸受容体を発現している細胞へ選択的に取り込まれる。すなわち、本発明に係る脂質ナノ粒子は、脂質膜の内部に内包した成分を、ヒアルロン酸受容体を発現している細胞の細胞内へ効率よく送達させることができる。このため、本発明に係る脂質ナノ粒子は、目的の成分をヒアルロン酸受容体を発現している細胞へ送達させるキャリアとして有用である。   The lipid nanoparticle according to the present invention preferably contains a target component to be delivered into a target cell inside a particle covered with a lipid membrane. The lipid nanoparticle according to the present invention is selectively incorporated into cells expressing the hyaluronic acid receptor because the interaction site with the hyaluronic acid receptor is exposed on the particle surface. That is, the lipid nanoparticles according to the present invention can efficiently deliver the components encapsulated in the lipid membrane into the cells of the cells expressing the hyaluronic acid receptor. Therefore, the lipid nanoparticles according to the present invention are useful as a carrier for delivering a target component to cells expressing a hyaluronic acid receptor.

本発明に係る脂質ナノ粒子が粒子内部に内包する成分としては、内包可能な大きさであれば特に限定されるものではなく、本発明に係る脂質ナノ粒子には、核酸、糖類、ペプチド類、低分子化合物、金属化合物など任意の物質を封入することができる。本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させる成分としては、低分子化合物、低分子核酸、及びペプチドからなる群より選択される１種以上であることが好ましい。低分子核酸としては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、核酸アプタマー、デコイ核酸、リボザイム、ＣｐＧオリゴ核酸等が挙げられる。   The component that the lipid nanoparticle according to the present invention encapsulates inside the particle is not particularly limited as long as it has a size capable of being encapsulated, and the lipid nanoparticle according to the present invention includes nucleic acids, saccharides, peptides, Any substance such as a low molecular compound or a metal compound can be encapsulated. The component to be encapsulated in the lipid nanoparticle according to the present invention is preferably at least one selected from the group consisting of a low molecular compound, a low molecular nucleic acid, and a peptide. Examples of the low molecular nucleic acid include siRNA, microRNA, nucleic acid aptamer, decoy nucleic acid, ribozyme, CpG oligonucleic acid and the like.

ｓｉＲＮＡは２１〜２３塩基対からなる低分子二本鎖ＲＮＡであり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に関与し、ｍＲＮＡの破壊によって配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。合成のｓｉＲＮＡがヒトの細胞においてＲＮＡ干渉を引き起こすことが報告されており、ｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉により遺伝子をノックダウンすることができることから、医薬としての利用やがんなどの治療分野において応用が期待されている。本発明に係る脂質ナノ粒子に内包されるｓｉＲＮＡの種類は特に限定されず、ＲＮＡ干渉を引き起こすことができるものであればいかなるものを使用してもよいが、一般的には、２１〜２３塩基対の二本鎖ＲＮＡであって、ＲＮＡ鎖の３’部分が２塩基分突出した構造をとり、それぞれの鎖は５’末端にリン酸基と３’末端にヒドロキシル基を有する構造のＲＮＡを本発明におけるｓｉＲＮＡとして使用することができる。また、リボース骨格の２’位のヒドロキシル基がメトキシ基、フルオロ基、又はメトキシエチル基に、ホスホジエステル結合がホスホロチオエート結合に一部置換されたｓｉＲＮＡも含まれる。   siRNA is a small double-stranded RNA consisting of 21 to 23 base pairs, is involved in RNA interference (RNAi), and suppresses gene expression in a sequence-specific manner by destroying mRNA. Synthetic siRNA has been reported to cause RNA interference in human cells, and it can be knocked down by RNA interference using siRNA, so that it can be used in medicine and in therapeutic fields such as cancer. Expected. The type of siRNA included in the lipid nanoparticle according to the present invention is not particularly limited, and any siRNA can be used as long as it can cause RNA interference. It is a pair of double-stranded RNAs, each of which has a structure in which the 3 ′ portion of the RNA strand protrudes by 2 bases, and each strand has a structure having a phosphate group at the 5 ′ end and a hydroxyl group at the 3 ′ end. It can be used as siRNA in the present invention. Also included are siRNAs in which the hydroxyl group at the 2 'position of the ribose backbone is partially substituted with a methoxy group, a fluoro group, or a methoxyethyl group, and a phosphodiester bond is partially substituted with a phosphorothioate bond.

本発明に係る脂質ナノ粒子は、脂質膜で覆われた粒子内部に薬効成分を内包する薬剤キャリアであることが好ましい。当該薬効成分としては、特に限定されるものではなく、抗がん剤、抗炎症剤、抗菌剤、抗ウイルス剤などの任意の医薬の有効成分を使用できる。抗がん剤としては、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シスプラチン、オキザリプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、イリノテカン、ＳＮ−３８、アクチノマイシンＤ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキサート、アザチオプリン、フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、ドセタキセル、シクロホスファミド、カペシタビン、エピルビシン、ゲムシタビン、ミトキサントロン、ロイコボリン、ビノレルビン、トラスツズマブ、エトポシド、エストラムスチン、プレドニゾン、インターフェロンα、インターロイキン−２、ブレオマイシン、イホスファミド、メスナ、アルトレタミン、トポテカン、シタラビン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルダラビン、ゲムツズマブ、イダルビシン、ミトキサントロン、トレチノイン、アレムツズマブ、クロランブシル、クラドリビン、イマチニブ、エピルビシン、ダカルバジン、プロカルバジン、メクロレタミン、リツキシマブ、デニロイキンジフチトクス、トリメトプリム／スルファメトキサゾール、アロプリノール、カルムスチン、タモキシフェン、フィルグラスチム、テモゾロマイド、メルファラン、ビノレルビン、アザシチジン、サリドマイド、およびマイトマイシン等が挙げられる。抗炎症剤としては、例えば、フェニルブタゾン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、インドメタシン、スリンダク、ピロキシカム、ジクロフェナック、プレドニゾン、ベクロメタゾン、デキサメタゾン等が挙げられる。抗菌剤としては、例えば、アムホテリシンＢ等が挙げられる。抗ウイルス剤として、ビダラビン、アシクロビル、トリフルオロチミジン等が挙げられる。   The lipid nanoparticle according to the present invention is preferably a drug carrier in which a medicinal component is encapsulated inside a particle covered with a lipid film. The medicinal component is not particularly limited, and any medicinal active component such as an anticancer agent, an anti-inflammatory agent, an antibacterial agent and an antiviral agent can be used. Examples of anticancer agents include doxorubicin, daunorubicin, cisplatin, oxaliplatin, carboplatin, paclitaxel, irinotecan, SN-38, actinomycin D, vincristine, vinblastine, methotrexate, azathioprine, fluorouracil, mitomycin C, docetaxel, Capecitabine, epirubicin, gemcitabine, mitoxantrone, leucovorin, vinorelbine, trastuzumab, etoposide, estramustine, prednisone, interferon alpha, interleukin-2, bleomycin, ifosfamide, mesna, altretamine, topotecan, cytarabone, methylpredazozone, Mercaptopurine, thioguanine, fludarabine, gemts Budar, idarubicin, mitoxantrone, tretinoin, alemtuzumab, chlorambucil, cladribine, imatinib, epirubicin, dacarbazine, procarbazine, mechloretamine, rituximab, denileukin diftitox, trimethoprim / sulfamethoxazole, allopurinol, carximustine Examples include thym, temozolomide, melphalan, vinorelbine, azacitidine, thalidomide, and mitomycin. Examples of the anti-inflammatory agent include phenylbutazone, acetaminophen, ibuprofen, indomethacin, sulindac, piroxicam, diclofenac, prednisone, beclomethasone, dexamethasone and the like. Examples of the antibacterial agent include amphotericin B. Antiviral agents include vidarabine, acyclovir, trifluorothymidine and the like.

本発明に係る脂質ナノ粒子は、ヒアルロン酸受容体の発現量が少ない細胞よりも、ヒアルロン酸受容体の発現量が多い細胞に対して、より多く取り込まれる。送達効率がヒアルロン酸受容体の発現量に依存しているため、ヒアルロン酸受容体の発現量の多い細胞に対して選択的に取り込ませることができる。この選択性の高さから、本発明に係る脂質ナノ粒子は、抗がん剤を内包する薬剤キャリアであって、ヒアルロン酸受容体を高発現しているがんに対するがん治療に使用される医薬品として特に有用である。がん細胞がヒアルロン酸受容体を高発現しているがんとしては、例えば、悪性胸膜中皮腫、胸膜播種性肺がん等が挙げられる。   The lipid nanoparticles according to the present invention are more taken up by cells having a high expression level of hyaluronic acid receptor than cells having a low expression level of hyaluronic acid receptor. Since the delivery efficiency depends on the expression level of the hyaluronic acid receptor, it can be selectively incorporated into cells having a high expression level of the hyaluronic acid receptor. Because of this high selectivity, the lipid nanoparticles according to the present invention are drug carriers encapsulating anticancer agents and are used for cancer treatment for cancers that highly express hyaluronic acid receptors. It is particularly useful as a medicine. Examples of cancers whose cancer cells highly express hyaluronic acid receptors include malignant pleural mesothelioma, pleural disseminated lung cancer and the like.

本発明に係る脂質ナノ粒子を薬剤キャリアとして使用する場合、本発明に係る脂質ナノ粒子が投与される動物は、特に限定されるものではなく、ヒトであってもよく、ヒト以外の動物であってもよい。非ヒト動物としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳動物や、ニワトリ、ウズラ、カモ等の鳥類等が挙げられる。   When the lipid nanoparticles according to the present invention are used as a drug carrier, the animal to which the lipid nanoparticles according to the present invention are administered is not particularly limited and may be a human or an animal other than a human. May be. Examples of non-human animals include mammals such as cows, pigs, horses, sheep, goats, monkeys, dogs, cats, rabbits, mice, rats, hamsters, and guinea pigs, and birds such as chickens, quails, and ducks.

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。   EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to a following example.

［実施例１］
ヒアルロン酸誘導体を含むリポソームの、ヒアルロン酸受容体を発現している細胞への取り込みを調べた。 [Example 1]
The uptake of liposomes containing hyaluronic acid derivatives into cells expressing hyaluronic acid receptors was examined.

＜ヒアルロン酸誘導体の製造＞
Arpiccoらの方法（非特許文献１０参照。）の改変法により、ヒアルロン酸とホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）とを結合させたヒアルロン酸脂質誘導体（ＨＡ−ＰＥ体）を製造した。 <Production of hyaluronic acid derivative>
A hyaluronic acid lipid derivative (HA-PE body) in which hyaluronic acid and phosphatidylethanolamine (PE) were combined was produced by a modification of the method of Arpicco et al. (See Non-Patent Document 10).

具体的には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１００ｍＬに分子量が５０ｋＤａのヒアルロン酸２．５ｇ（５０μｍｏｌ）を懸濁し、６０℃に加熱した。３０分間攪拌した後、ＤＳＰＥ（distearoyl-sn-glycerophosphoethanolamine）３７．４ｍｇ（５０μｍｏｌ）を添加し、１０ｍＬ酢酸を滴下した。さらに２時間攪拌した後、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド２６．４ｍｇ（１２５μｍｏｌ）を加え、その後９６時間攪拌を続けた。常温まで冷却した後、反応溶液を逆相クロマトグラフィー｛有利溶媒；水：メタノール（連続勾配）｝に供することにより、合成されたＨＡ−ＰＥ体（ＤＳＰＥ）を精製した。   Specifically, 2.5 g (50 μmol) of hyaluronic acid having a molecular weight of 50 kDa was suspended in 100 mL of dimethyl sulfoxide (DMSO) and heated to 60 ° C. After stirring for 30 minutes, 37.4 mg (50 μmol) of DSPE (distearoyl-sn-glycerophosphoethanolamine) was added, and 10 mL of acetic acid was added dropwise. After further stirring for 2 hours, 26.4 mg (125 μmol) of sodium triacetoxyborohydride was added, and stirring was continued for 96 hours. After cooling to room temperature, the synthesized HA-PE body (DSPE) was purified by subjecting the reaction solution to reverse phase chromatography {advantageous solvent; water: methanol (continuous gradient)}.

ＤＳＰＥに代えて、ＳＯＰＥ（stearoyl-oleoyl-glycerophosphoethanolamine）を用いて同様に反応を行い、ＨＡ−ＰＥ体（ＳＯＰＥ）を単離した。   Instead of DSPE, the reaction was similarly carried out using SOPE (stearoyl-oleoyl-glycerophosphoethanolamine), and the HA-PE body (SOPE) was isolated.

＜ＨＡ−ＰＥ修飾リポソームの製造＞
ＨＡ−ＰＥ修飾リポソームを、エクストゥルーダー法を用いて製造した。カチオン性脂質としてＤＯＴＡＰ（1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane）を用いた。まず、ＤＳＰＣ（distearoyl-sn- gylcerolphosphocholine）とコレステロール（chol）とカチオン性脂質を５０−ｘ：５０：ｘ（ｘ＝０、５、又は１０）の割合（モル比）で総量４０００ｎｍｏｌを、ガラス試験管に添加した後、溶媒を留去することで当該ガラス試験管内に脂質薄膜を作製した。次いで、このガラス試験管内にＰＢＳ（phosphate-buffered saline）添加して脂質薄膜を水和させた後に、超音波処理を行うことでリポソームを得た。 <Production of HA-PE modified liposome>
HA-PE modified liposomes were produced using the extruder method. DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane) was used as the cationic lipid. First, a total amount of 4000 nmol with a ratio (molar ratio) of DSPC (distearoyl-sn-gylcerolphosphocholine), cholesterol (chol), and cationic lipid in a ratio of 50-x: 50: x (x = 0, 5, or 10) is glass test. After adding to the tube, the solvent was distilled off to prepare a lipid thin film in the glass test tube. Next, PBS (phosphate-buffered saline) was added to the glass test tube to hydrate the lipid thin film, and then sonication was performed to obtain liposomes.

粒子径を一定のサイズにするために、得られたリポソームに対して、４００、２００、又は１００ｎｍの細孔を有するポリカーボネート膜を用いて整粒処理を行った。整粒したリポソームをＨＡ−ＰＥ体と混合し、加熱下でインキュベートすることにより、ＨＡ−ＰＥ体を脂質膜へ挿入して、ＨＡ−ＰＥ修飾リポソームを得た。動的光散乱法により算出されたこのＨＡ−ＰＥ修飾リポソームの平均粒子径は１００〜２００ｎｍであった。   In order to make the particle diameter constant, the obtained liposomes were subjected to granulation treatment using a polycarbonate membrane having 400, 200, or 100 nm pores. The sized liposomes were mixed with the HA-PE body and incubated under heating to insert the HA-PE body into the lipid membrane to obtain HA-PE modified liposomes. The average particle diameter of the HA-PE modified liposomes calculated by the dynamic light scattering method was 100 to 200 nm.

＜非修飾リポソームの製造＞
非修飾リポソームは、ガラス試験管に添加する脂質（総量４０００ｎｍｏｌ）を、ＤＳＰＣとコレステロールを５０：５０の割合（モル比）とした以外は＜ＨＡ−ＰＥ修飾リポソームの製造＞と同様して、超音波処理後整粒することによって製造した。 <Production of unmodified liposome>
Unmodified liposomes were prepared in the same manner as in <Production of HA-PE modified liposomes> except that the lipid added to the glass test tube (total amount 4000 nmol) was DSPC and cholesterol in a 50:50 ratio (molar ratio). It was manufactured by sizing after sonication.

＜ＨＡ混合リポソームの製造＞
非修飾リポソームに、ヒアルロン酸を混合して、ヒアルロン酸を粒子表面に付着させたリポソーム（ＨＡ混合リポソーム）を得た。 <Production of HA-mixed liposome>
Hyaluronic acid was mixed with unmodified liposomes to obtain liposomes (HA mixed liposomes) in which hyaluronic acid was adhered to the particle surface.

＜ＨＡ−ＰＥ修飾リポソームの細胞への取り込み量の測定＞
ＨＡ−ＰＥ修飾リポソームをさらに3,3'-dioctadecyloxacarbo-cyanine perchlorateにより蛍光標識したリポソーム（ＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソーム）を細胞の培地に添加して、当該細胞への取り込み量を調べた。ＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソームを取り込ませる細胞は、ヒアルロン酸受容体を発現している細胞のうち、悪性胸膜中皮腫由来ＨＭＭ３細胞と胸膜播種肺がん由来Ｈ２２６細胞を用いた。 <Measurement of uptake of HA-PE modified liposome into cells>
Liposomes obtained by further fluorescently labeling HA-PE modified liposomes with 3,3′-dioctadecyloxacarbo-cyanine perchlorate (HA-PE modified fluorescently labeled liposomes) were added to the cell culture medium, and the amount taken up into the cells was examined. Among cells expressing hyaluronan receptors, HAM-PE-modified fluorescently labeled liposomes used were malignant pleural mesothelioma-derived HMM3 cells and pleural disseminated lung cancer-derived H226 cells.

具体的には、各細胞を培養容器に播種して２４時間培養した後、培養培地にＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソームを添加して２時間インキュベートした。その後、細胞を剥離して、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）により細胞内に取り込まれた蛍光量を測定した。また、比較対象として、ＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソームに代えて、赤色蛍光物質3,3'-dioctadecyloxacarbo-cyanine perchlorateにより蛍光標識した非修飾リポソーム（非修飾蛍光標識リポソーム）及びＨＡ混合リポソーム（ＨＡ混合蛍光標識リポソーム）を用いて同様にして細胞内に取り込まれた蛍光量を測定した。   Specifically, each cell was seeded in a culture vessel and cultured for 24 hours, and then HA-PE modified fluorescently labeled liposomes were added to the culture medium and incubated for 2 hours. Thereafter, the cells were detached and the amount of fluorescence taken into the cells was measured with a flow cytometer (FACS). In addition, as a comparison object, instead of HA-PE modified fluorescently labeled liposomes, unmodified liposomes (unmodified fluorescently labeled liposomes) fluorescently labeled with a red fluorescent substance 3,3′-dioctadecyloxacarbo-cyanine perchlorate and HA mixed liposomes (HA mixed) The amount of fluorescence taken into the cells was measured in the same manner using fluorescently labeled liposomes).

ＨＡ−ＰＥ体（ＤＳＰＥ）を２モル％含有させて製造された各蛍光標識リポソームの取り込み量（蛍光強度、Ａ．Ｕ．）を測定した結果を図１に示す。ＨＭＭ３細胞における結果を図１Ａに、Ｈ２２６細胞における結果を図１Ｂに、それぞれ示す。非修飾蛍光標識リポソームとＨＡ−ＰＥ修飾リポソームとＨＡ混合蛍光標識リポソームの細胞への取り込み量は、いずれも、ＤＯＴＡＰの含有量依存的に増大していた。より詳細には、ＤＯＴＡＰの含有量が１０モル％の非修飾蛍光標識リポソームでは、ＤＯＴＡＰなしの非修飾蛍光標識リポソームよりも細胞への取り込み量が約１０〜２０倍程度増大していた。ＨＡ混合蛍光標識リポソームにおいても、非修飾蛍光標識リポソームよりもやや少ないものの、ＤＯＴＡＰの含有量が１０モル％のリポソームではＤＯＴＡＰなしのリポソームよりも細胞への取り込み量が約８〜１５倍程度増大していた。一方で、ＤＯＴＡＰの含有量が１０モル％のＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソームでは、ＤＯＴＡＰなしのＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソームよりも細胞への取り込み量が約２００倍以上増大していた。つまり、リポソームに対してカチオン性脂質を添加することによる取り込み効率改善効果と、ＨＡ−ＰＥ体により粒子表面をヒアルロン酸で修飾することによる取り込み効率改善効果は、統計学的に有意な交互作用を有していた。リポソームに対してカチオン性脂質を添加することによる取り込み効率改善効果と、粒子表面にヒアルロン酸を付着させることによる取り込み効率改善効果とは、交互作用はなかった。   FIG. 1 shows the results of measurement of the amount of uptake (fluorescence intensity, AU) of each fluorescently labeled liposome produced by containing 2 mol% of HA-PE body (DSPE). The results for HMM3 cells are shown in FIG. 1A, and the results for H226 cells are shown in FIG. 1B. The amounts of unmodified fluorescently labeled liposomes, HA-PE modified liposomes, and HA mixed fluorescently labeled liposomes taken into the cells all increased depending on the DOTAP content. More specifically, in the unmodified fluorescently labeled liposome having a DOTAP content of 10 mol%, the amount of uptake into cells was increased by about 10 to 20 times compared to the unmodified fluorescently labeled liposome without DOTAP. Although the HA mixed fluorescently labeled liposome is slightly less than the unmodified fluorescently labeled liposome, the amount of DOTAP contained in the 10 mol% liposome is about 8 to 15 times higher than the liposome without DOTAP. It was. On the other hand, in the HA-PE modified fluorescently labeled liposome having a DOTAP content of 10 mol%, the amount of uptake into cells was increased by about 200 times or more than the HA-PE modified fluorescently labeled liposome without DOTAP. In other words, the uptake efficiency improvement effect by adding cationic lipid to the liposome and the uptake efficiency improvement effect by modifying the particle surface with hyaluronic acid by the HA-PE body have a statistically significant interaction. Had. There was no interaction between the effect of improving the uptake efficiency by adding cationic lipid to the liposome and the effect of improving the uptake efficiency by attaching hyaluronic acid to the particle surface.

続いて、ヒアルロン酸に結合させる足場の脂質の取り込み効率に対する影響を調べた。具体的には、ＨＡ−ＰＥ体（ＤＳＰＥ）に代えてＨＡ−ＰＥ体（ＳＯＰＥ）を用いて同様にして製造された各蛍光標識リポソームの取り込み量（蛍光強度、Ａ．Ｕ．）を測定した。次いで、各細胞の取り込み量の測定結果に基づき、ＤＯＴＡＰの含有量が１０モル％のリポソームについて、非修飾蛍光標識リポソームの取り込み量を１とした相対取り込み量を求めた。ＨＡ−ＰＥ体（ＤＳＰＥ）を含有するリポソームの結果とＨＡ−ＰＥ体（ＳＯＰＥ）を含有するリポソームの結果を表１に示す。   Subsequently, the effect of the scaffold bound to hyaluronic acid on the lipid uptake efficiency was examined. Specifically, the uptake amount (fluorescence intensity, AU) of each fluorescently labeled liposome produced in the same manner was measured using an HA-PE body (SOPE) instead of the HA-PE body (DSPE). . Next, based on the measurement results of the amount of each cell, the relative uptake amount of the liposome having a DOTAP content of 10 mol% was determined by setting the uptake amount of the unmodified fluorescently labeled liposome to 1. Table 1 shows the results of liposomes containing HA-PE body (DSPE) and liposomes containing HA-PE body (SOPE).

この結果、ＨＡ−ＰＥ体（ＤＳＰＥ）で修飾したＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソームとＨＡ−ＰＥ体（ＳＯＰＥ）で修飾したＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソームのいずれであっても、非修飾蛍光標識リポソームよりも細胞内への取り込み量を４〜７倍程度上昇させた。特に、２本の脂肪酸残基のうち、両方が飽和脂肪酸残基であるＨＡ−ＰＥ体（ＤＳＰＥ）で修飾したリポソームよりも、１本が飽和脂肪酸残基、残る１本が不飽和脂肪酸残基であるＨＡ−ＰＥ体（ＳＯＰＥ）で修飾したリポソームのほうが、やや細胞内への取り込み量が高い傾向が観察された。   As a result, unmodified fluorescently labeled liposomes, both HA-PE modified fluorescently labeled liposomes modified with HA-PE body (DSPE) and HA-PE modified fluorescently labeled liposomes modified with HA-PE body (SOPE) The amount of cellular uptake was increased about 4 to 7 times. In particular, one of the two fatty acid residues is a saturated fatty acid residue and the remaining one is an unsaturated fatty acid residue, compared to a liposome modified with a HA-PE body (DSPE) in which both are saturated fatty acid residues. It was observed that the liposomes modified with the HA-PE body (SOPE) as described above had a slightly higher uptake into the cells.

次いで、リポソームに含有させるカチオン性脂質の取り込み効率に対する影響を調べた。リポソームを構成する脂質に対し、カチオン性脂質の含有量は１０モル％とし、ＨＡ−ＰＥ体（ＳＯＰＥ）の含有量は２モル％とした。具体的には、ＤＯＴＡＰに代えて、ＤＳＴＡＰ、ＤＤＡＢ、又はＤＣ−Ｃｈｏｌを用いて同様にして製造された各ＨＡ−ＰＥ（ＳＯＰＥ）蛍光標識リポソームの取り込み量（蛍光強度、Ａ．Ｕ．）を測定した。対照として、非修飾蛍光標識リポソームも同様にして製造し、細胞への取り込み量（蛍光強度、Ａ．Ｕ．）を測定した。測定結果を図２に示す。ＨＭＭ３細胞における結果を図２Ａに、Ｈ２２６細胞における結果を図２Ｂに、それぞれ示す。図に示すように、いずれのカチオン性脂質を用いた場合でも、カチオン性脂質を含まないリポソームよりも、取り込み量を顕著に増大していた。中でも、ＤＯＴＡＰを含有させたリポソームが、他のカチオン性脂質を含有させたリポソームよりも取り込み効率が最も向上していた。   Subsequently, the influence on the uptake efficiency of the cationic lipid contained in the liposome was examined. The content of the cationic lipid was 10 mol% and the content of the HA-PE body (SOPE) was 2 mol% with respect to the lipid constituting the liposome. Specifically, instead of DOTAP, the uptake amount (fluorescence intensity, AU) of each HA-PE (SOPE) fluorescently labeled liposome produced in the same manner using DSTAP, DDAB, or DC-Chol. It was measured. As a control, unmodified fluorescently labeled liposomes were produced in the same manner, and the amount taken up into cells (fluorescence intensity, AU) was measured. The measurement results are shown in FIG. The results for HMM3 cells are shown in FIG. 2A, and the results for H226 cells are shown in FIG. 2B. As shown in the figure, even when any cationic lipid was used, the amount of uptake was remarkably increased as compared with the liposome containing no cationic lipid. Among them, the liposomes containing DOTAP had the most improved uptake efficiency than the liposomes containing other cationic lipids.

さらに、リポソームに含有させるＨＡ−ＰＥ体の量の取り込み効率に対する影響を調べた。まず、ＨＡ−ＰＥ体（ＳＯＰＥ）の含有量をリポソームの脂質総量に対して０．５〜６モル％に変化させてＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソームを調製した。カチオン性脂質（ＤＯＴＡＰ）の含有量は１０モル％とした。次いで、製造された各ＨＡ−ＰＥ（ＳＯＰＥ）蛍光標識リポソームのＨ２２６細胞への取り込み量（蛍光強度、Ａ．Ｕ．）を測定した。測定結果を図３に示す（ｎ＝３）。この結果、ＨＡ−ＰＥ体（ＳＯＰＥ）の含有量（修飾量）が２モル％の場合に最も取り込み量が多く、取り込み効率の向上効果が高いことがわかった。   Furthermore, the influence on the uptake efficiency of the amount of HA-PE contained in the liposome was examined. First, HA-PE modified fluorescently labeled liposomes were prepared by changing the content of HA-PE body (SOPE) to 0.5 to 6 mol% with respect to the total lipid amount of the liposomes. The content of the cationic lipid (DOTAP) was 10 mol%. Next, the amount of each HA-PE (SOPE) fluorescently labeled liposome incorporated into H226 cells (fluorescence intensity, AU) was measured. The measurement results are shown in FIG. 3 (n = 3). As a result, it was found that when the content (modification amount) of the HA-PE body (SOPE) was 2 mol%, the incorporation amount was the largest and the effect of improving the incorporation efficiency was high.

また、細胞のヒアルロン酸受容体の発現量のＨＡ−ＰＥ修飾リポソームの取り込み効率に対する影響も調べた。具体的には、ＨＭＭ３細胞とＨ２２６細胞に加えて、ＣＤ４４の発現が少ないＨＭＭ１細胞に対して、非修飾蛍光標識リポソーム（ＤＯＴＡＰ含有量：１０モル％）とＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソーム（ＤＯＴＡＰ含有量：１０モル％、ＨＡ−ＰＥ体（ＳＯＰＥ）の含有量：２モル％）の取り込み量を測定した。測定結果を図４に示す。図に示すように、ＨＭＭ１細胞では、ＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソームでは、非修飾蛍光標識リポソームと同様ほとんど取り込みは観察されなかった。これらの結果から、ＨＡ−ＰＥ体で修飾したリポソームは、細胞表面のヒアルロン酸受容体に特異的に結合して細胞内へ取り込まれることが確認された。   In addition, the influence of the expression level of the hyaluronic acid receptor in the cells on the uptake efficiency of the HA-PE modified liposome was also examined. Specifically, in addition to HMM3 cells and H226 cells, non-modified fluorescently labeled liposomes (DOTAP content: 10 mol%) and HA-PE modified fluorescently labeled liposomes (DOTAP-containing) Amount: 10 mol%, HA-PE body (SOPE) content: 2 mol%) was taken up. The measurement results are shown in FIG. As shown in the figure, in the HMM1 cells, almost no uptake was observed in the HA-PE modified fluorescently labeled liposomes as in the unmodified fluorescently labeled liposomes. From these results, it was confirmed that the liposome modified with the HA-PE body specifically binds to the hyaluronic acid receptor on the cell surface and is taken into the cell.

また、リポソームを修飾するＨＡ−ＰＥ体のヒアルロン酸の大きさのＨＡ−ＰＥ修飾リポソームの取り込み効率に対する影響も調べた。具体的には、ＨＡ−ＰＥ体を製造する際に用いるヒアルロン酸を、５０ｋＤａに代えて８ｋＤａ又は５００ｋＤａにした以外は同様にしてＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソーム（ＤＯＴＡＰ含有量：１０モル％、ＨＡ−ＰＥ体（ＳＯＰＥ）の含有量：０．５〜１０モル％）を調製した。次いで、製造された各ＨＡ−ＰＥ（ＳＯＰＥ）蛍光標識リポソームと非修飾蛍光標識リポソームのＨ２２６細胞への取り込み量（蛍光強度、Ａ．Ｕ．）を測定し、非修飾蛍光標識リポソームの取り込み量を１とした相対取り込み量を求めた。各ＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソームの相対取り込み量の結果を図５に示す（ｎ＝３）。この結果、５００ｋＤａのヒアルロン酸から得られたＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソームでもＨＡ−ＰＥ体で修飾することによる細胞への取り込み効率向上の効果は得られた。一方で、８ｋＤａのヒアルロン酸から得られたＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソームは、相対取り込み量が１未満であり、ＨＡ−ＰＥ体で修飾することによる細胞への取り込み効率向上の効果は観察されなかった。これは、リポソーム表面のヒアルロン酸が小さく、ヒアルロン酸受容体との相互作用が弱いためと推察された。   In addition, the influence of the hyaluronic acid size of the HA-PE body modifying the liposome on the uptake efficiency of the HA-PE modified liposome was also examined. Specifically, HA-PE modified fluorescently labeled liposomes (DOTAP content: 10 mol%, HA) except that the hyaluronic acid used for producing the HA-PE body was changed to 8 kDa or 500 kDa instead of 50 kDa. -Content of PE body (SOPE): 0.5 to 10 mol%) was prepared. Next, the amount of each of the produced HA-PE (SOPE) fluorescently labeled liposomes and unmodified fluorescently labeled liposomes incorporated into H226 cells (fluorescence intensity, AU) was measured, and the amount of unmodified fluorescently labeled liposomes incorporated was determined. A relative uptake amount of 1 was determined. The result of the relative uptake of each HA-PE modified fluorescently labeled liposome is shown in FIG. 5 (n = 3). As a result, HA-PE-modified fluorescently labeled liposomes obtained from 500 kDa hyaluronic acid also had the effect of improving cellular uptake efficiency by modification with HA-PE bodies. On the other hand, the HA-PE modified fluorescently labeled liposome obtained from 8 kDa hyaluronic acid has a relative uptake amount of less than 1, and the effect of improving the uptake efficiency into cells by modification with the HA-PE body is not observed. It was. This was presumed to be because the hyaluronic acid on the liposome surface was small and the interaction with the hyaluronic acid receptor was weak.

また、非修飾蛍光標識リポソーム（ＤＯＴＡＰ含有量：１０モル％）又はＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソーム（ＤＯＴＡＰ含有量：１０モル％、ＨＡ−ＰＥ体（ＳＯＰＥ）の含有量：２モル％）を取り込ませたＨ２２６細胞における各リポソームの細胞内局在を調べた。具体的には、各リポソームを取り込ませた細胞を蛍光核酸染色剤で核染色し、蛍光顕微鏡を用いて、リポソームの細胞内局在を観察した。各細胞の核染色画像（上段）とリポソーム蛍光画像（3,3'-dioctadecyloxacarbo-cyanine perchlorateの蛍光画像、下段）を図６に示す。ＨＡ−ＰＥ修飾蛍光標識リポソームを取り込ませた細胞では、非修飾蛍光標識リポソームを取り込ませた細胞よりも、細胞内に多くの赤色蛍光が観察されており、より多くのリポソームが細胞内に取り込まれていた。また、細胞内のリポソームには、エンドソームと共局在しているものも多く認められた。これは、ＨＡ−ＰＥ修飾リポソームが、細胞膜のヒアルロン酸受容体と結合するだけではなく、その後エンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれていることを示唆している。   Further, unmodified fluorescently labeled liposomes (DOTAP content: 10 mol%) or HA-PE modified fluorescently labeled liposomes (DOTAP content: 10 mol%, HA-PE body (SOPE) content: 2 mol%) are incorporated. The intracellular localization of each liposome in the H226 cells was examined. Specifically, the cells into which each liposome was incorporated were nuclear-stained with a fluorescent nucleic acid stain, and the intracellular localization of the liposome was observed using a fluorescence microscope. FIG. 6 shows a nuclear staining image (upper) of each cell and a liposome fluorescence image (fluorescence image of 3,3′-dioctadecyloxacarbo-cyanine perchlorate, lower). In cells into which HA-PE modified fluorescently labeled liposomes were incorporated, more red fluorescence was observed in the cells than in cells into which unmodified fluorescently labeled liposomes were incorporated, and more liposomes were incorporated into the cells. It was. Many intracellular liposomes were co-localized with endosomes. This suggests that the HA-PE modified liposome not only binds to the hyaluronan receptor of the cell membrane, but is subsequently taken up into the cell by endocytosis.

［実施例２］
ヒアルロン酸誘導体を含むリポソームの薬剤キャリアとして効果を調べるために、当該リポソームに抗がん剤を内包させて、ヒアルロン酸受容体を発現している細胞に対するＣＤＤＰの殺細胞効果を調べた。抗がん剤としては、シスプラチン（ＣＤＤＰ）を用いた。 [Example 2]
In order to examine the effect as a drug carrier of a liposome containing a hyaluronic acid derivative, an anticancer agent was included in the liposome, and the cell killing effect of CDDP on cells expressing the hyaluronic acid receptor was examined. Cisplatin (CDDP) was used as an anticancer agent.

＜ＣＤＤＰ内封リポソームの製造＞
脂質膜を水和する際の溶媒として、ＣＤＤＰを溶解させた溶媒を用いた以外は実施例１と同様にして、ＣＤＤＰを内封したＨＡ−ＰＥ修飾リポソーム（ＤＯＴＡＰ含有量：１０モル％、ＨＡ−ＰＥ体（ＳＯＰＥ）の含有量：２モル％）を製造した。対照として、同様にしてＣＤＤＰを内包する非修飾リポソーム（ＤＯＴＡＰ含有量：１０モル％）も製造した。内封されなかったＣＤＤＰは限外濾過によって除去した。得られたリポソームのＣＤＤＰ内封率を、高周波誘導結合プラズマ発光分光分析法で測定したところ、およそ１０％であった。 <Production of CDDP-encapsulated liposome>
HA-PE-modified liposomes encapsulating CDDP (DOTAP content: 10 mol%, HA), except that a solvent in which CDDP was dissolved was used as a solvent for hydrating the lipid membrane. -Content of PE body (SOPE): 2 mol%). As a control, unmodified liposomes (DOTAP content: 10 mol%) encapsulating CDDP were also produced in the same manner. Unencapsulated CDDP was removed by ultrafiltration. When the CDDP encapsulation rate of the obtained liposome was measured by high frequency inductively coupled plasma optical emission spectrometry, it was about 10%.

＜ＣＤＤＰ内封リポソームの細胞への取り込み＞
ＨＭＭ３細胞及びＨ２２６細胞の培養培地に、各ＣＤＤＰ内封リポソームをＣＤＤＰ量として０．１〜２０μｇ／ｍＬとなる量（脂質量として１０〜２０００μＭ）添加して、４８時間培養した。培養後にＷＳＴアッセイを行い、細胞生存率（％）を測定した。対照として、リポソームに内封していないＣＤＤＰを等量培養培地に添加して４８時間培養した細胞に対してもＷＳＴアッセイを行い、細胞生存率（％）を測定した。測定結果を図７に示す。ＨＭＭ３細胞における結果を図７Ａに、Ｈ２２６細胞における結果を図７Ｂに、それぞれ示す。この結果、ＣＤＤＰ内封ＨＡ−ＰＥ修飾リポソームを取り込ませた細胞では、ＣＤＤＰ内封非修飾リポソームを取り込ませた細胞と比較して、５０％の殺細胞活性（ＥＣ５０）としておよそ１／１０の値を示した。また、このＥＣ５０は、リポソームに内封していないＣＤＤＰ（フリーＣＤＤＰ）とほぼ同様の値であった。リポソームに内封しているにもかかわらず、フリーのＣＤＤＰとほぼ同程度に高い殺細胞活性を示したことから、ＣＤＤＰ内封ＨＡ−ＰＥ修飾リポソームは薬剤キャリアとして非常に優れていることが明らかである。 <Incorporation of CDDP-encapsulated liposomes into cells>
Each CDDP-encapsulated liposome was added to the culture medium of HMM3 cells and H226 cells in an amount of 0.1 to 20 μg / mL as a CDDP amount (10 to 2000 μM as a lipid amount), and cultured for 48 hours. After culture, WST assay was performed to measure the cell viability (%). As a control, WST assay was also performed on cells cultured for 48 hours after adding CDDP not encapsulated in liposomes to an equivalent culture medium, and the cell viability (%) was measured. The measurement results are shown in FIG. The results for HMM3 cells are shown in FIG. 7A, and the results for H226 cells are shown in FIG. 7B. As a result, in the cells into which the CDDP-encapsulated HA-PE modified liposomes were incorporated, the cell killing activity (EC 50 ) of about 1/10 of the cells in which the CDDP-encapsulated unmodified liposomes were incorporated. The value is shown. Further, this EC 50 was almost the same value as CDDP (free CDDP) not encapsulated in liposomes. Despite being encapsulated in liposomes, it showed almost as high cytocidal activity as free CDDP, indicating that CDDP-encapsulated HA-PE modified liposomes are very good as drug carriers It is.

また、ＣＤ４４の活性化はがん細胞の増悪を招くことが知られている。そこで、ＣＤＤＰを内封していないＨＡ−ＰＥ修飾リポソームの細胞増殖への影響を調べた。具体的には、ＨＭＭ３細胞及びＨ２２６細胞の培養培地に、ＣＤＤＰを内封していないＨＡ−ＰＥ修飾リポソームを添加して４８時間培養し、ＷＳＴアッセイを行い、細胞生存率（％）を測定した。測定結果を図８に示す。ＨＭＭ３細胞における結果を図８Ａに、Ｈ２２６細胞における結果を図８Ｂに、それぞれ示す。この結果、ＣＤＤＰを内封していないＨＡ−ＰＥ修飾リポソームを取り込ませた細胞では、細胞生存率への影響はほとんど見られず、ＨＡ−ＰＥ修飾リポソームはＣＤ４４を介在するがん細胞の増悪を誘導しなかった。   In addition, it is known that activation of CD44 leads to deterioration of cancer cells. Therefore, the effect of HA-PE modified liposomes not encapsulating CDDP on cell proliferation was examined. Specifically, HA-PE-modified liposomes without encapsulating CDDP were added to the culture medium of HMM3 cells and H226 cells, cultured for 48 hours, WST assay was performed, and cell viability (%) was measured. . The measurement results are shown in FIG. The results for HMM3 cells are shown in FIG. 8A, and the results for H226 cells are shown in FIG. 8B. As a result, in cells incorporating HA-PE modified liposomes without encapsulating CDDP, there was almost no effect on cell viability, and HA-PE modified liposomes caused the deterioration of cancer cells mediated by CD44. Did not induce.

［実施例３］
悪性胸膜中皮腫胸腔内播種マウスを用いて、ＣＤＤＰ内封ＨＡ−ＰＥ修飾リポソームの抗腫瘍効果を評価した。 [Example 3]
Mice pleural mesothelioma intrathoracic seeded mice were used to evaluate the antitumor effect of CDDP-encapsulated HA-PE modified liposomes.

＜悪性胸膜中皮腫胸腔内播種マウスの作製＞
５×１０６個のＨ２２６細胞を、４週齢の雄の免疫不全マウス（BALB/cAJcl nu/nu）の右肺側胸腔内へ移植して、悪性胸膜中皮腫胸腔内播種マウスを作製した。 <Production of Malignant Pleural Mesothelioma Intrathoracic Disseminated Mouse>
5 × 10 6 H226 cells were transplanted into the right pulmonary thoracic cavity of 4-week-old male immunodeficient mice (BALB / cAJcl nu / nu) to produce malignant pleural mesothelioma intrathoracic seeded mice .

＜ＣＤＤＰ内封ＨＡ−ＰＥ修飾リポソーム＞
実施例２と同様にして、ＣＤＤＰを内封したＨＡ−ＰＥ修飾リポソーム（ＤＯＴＡＰ含有量：１０モル％、ＨＡ−ＰＥ体（ＳＯＰＥ）の含有量：２モル％）を製造した。得られたＣＤＤＰ内封ＨＡ−ＰＥ修飾リポソームは、平均粒子径が２６２．１±２９．１ｎｍ、多分散度指数（ＰＤＩ）が０．３４６±０．０６、ゼータ電位が−３６．４±２．７９ｍＶであった。 <CDDP-encapsulated HA-PE modified liposome>
In the same manner as in Example 2, HA-PE-modified liposomes encapsulating CDDP (DOTAP content: 10 mol%, HA-PE body (SOPE) content: 2 mol%) were produced. The obtained CDDP-encapsulated HA-PE-modified liposome has an average particle size of 262.1 ± 29.1 nm, a polydispersity index (PDI) of 0.346 ± 0.06, and a zeta potential of −36.4 ± 2. .79 mV.

＜悪性胸膜中皮腫胸腔内播種マウスへのＣＤＤＰ内封ＨＡ−ＰＥ修飾リポソーム投与＞
Ｈ２２６細胞を移植してから７、１４、２１、２８日後に、ＰＢＳ、ＣＤＤＰ単剤（１．５ｍｇ／ｋｇ）、又はＣＤＤＰ内封ＨＡ−ＰＥ修飾リポソーム（ＣＤＤＰ量として１．５ｍｇ／ｋｇ）を、右肺側胸腔内へと投与し、体重変化と生存率を経時的に測定した。生存率の経時的変化を図９に示す。エンドポイントは、日本学術会議が提唱するガイドラインを参考にし、７日間で２５％の体重減少が確認された時点とした。その結果、生存平均日数は、ＰＢＳ投与群が３６．５日、ＣＤＤＰ単剤（フリーＣＤＤＰ）投与群が２６．０日であった。フリーＣＤＤＰ投与群には、ＰＢＳ投与群よりも早期に死亡する個体が認められた。これらの個体の死因は、フリーＣＤＤＰの毒性に由来するものと推察された。一方で、ＣＤＤＰ内封ＨＡ−ＰＥ修飾リポソーム投与群では、Ｈ２２６細胞移植後４６日後まで死亡個体は見られなかった。また、Ｈ２２６細胞移植後４６日後のＣＤＤＰ内封ＨＡ−ＰＥ修飾リポソーム投与群について、Ｈ２２６細胞の拡散状況を確認したところ、背側の壁側胸膜にもＨ２２６細胞が拡散している個体もあったが、多くは背側の壁側胸膜にわずかに拡散していることが観察されたのみであり、ＨＡ−ＰＥ修飾リポソームに内封したＣＤＤＰは、強く腫瘍の成長を抑制し得ることが確認された。 <Administration of CDDP-encapsulated HA-PE modified liposomes to malignant pleural mesothelioma intrathoracic seeded mice>
7, 14, 21, and 28 days after transplantation of H226 cells, PBS, CDDP single agent (1.5 mg / kg), or CDDP-encapsulated HA-PE modified liposome (CDDP amount as 1.5 mg / kg) Then, it was administered into the right pulmonary thoracic cavity, and body weight change and survival rate were measured over time. FIG. 9 shows the change in survival rate over time. The end point was the point when 25% weight loss was confirmed in 7 days with reference to the guidelines proposed by the Science Council of Japan. As a result, the average survival days were 36.5 days for the PBS administration group and 26.0 days for the CDDP single agent (free CDDP) administration group. In the free CDDP administration group, individuals who died earlier than the PBS administration group were observed. It was speculated that the cause of death of these individuals was derived from the toxicity of free CDDP. On the other hand, in the CDDP-encapsulated HA-PE modified liposome administration group, no dead individuals were seen until 46 days after H226 cell transplantation. In addition, when the diffusion state of H226 cells was confirmed in the group administered with CDDP-encapsulated HA-PE modified liposomes 46 days after transplantation of H226 cells, there were individuals in which H226 cells were also diffused in the dorsal wall side pleura. However, many were only observed to diffuse slightly in the dorsal parietal pleura, confirming that CDDP encapsulated in HA-PE modified liposomes can strongly inhibit tumor growth. It was.

また、犠牲個体の腎臓を摘出し、ヘマトキシリンエオシン染色によりＣＤＤＰの副作用が報告されている腎臓の組織切片を観察した。この結果、フリーＣＤＤＰ投与群で認められた尿細管の壊死が、ＣＤＤＰ内封ＨＡ−ＰＥ修飾リポソーム投与群では見られなかった。つまり、ＣＤＤＰのような毒性の高い薬効成分をＨＡ−ＰＥ修飾リポソームに内封することにより、それ自身の毒性を抑えつつ目的の薬効を得られることがわかった。   In addition, the kidneys of the victims were removed, and tissue sections of the kidneys where CDDP side effects were reported by hematoxylin eosin staining were observed. As a result, tubular necrosis observed in the free CDDP administration group was not observed in the CDDP-encapsulated HA-PE modified liposome administration group. That is, it was found that by encapsulating a highly toxic medicinal component such as CDDP in HA-PE modified liposome, the desired medicinal effect can be obtained while suppressing its own toxicity.

静脈内投与したヒアルロン酸は受容体を介して大部分が肝臓、一部が腎臓に移行する。そこで、ＨＡ−ＰＥ修飾リポソームの肝臓及び腎臓への分布を調べた。この結果、ＨＡ−ＰＥ修飾リポソームは、非修飾リポソームと比較して、これらの臓器への分布の増加は確認されなかった。   Most of the intravenously administered hyaluronic acid is transferred to the liver and partly to the kidney via the receptor. Therefore, the distribution of HA-PE modified liposomes in the liver and kidney was examined. As a result, the HA-PE modified liposomes were not confirmed to have increased distribution in these organs compared to the unmodified liposomes.

Claims (11)

ヒアルロン酸の末端の還元糖であるＮ−アセチルグルコサミンの水酸基に、直鎖状の疎水性基を備える中性脂質が直接又は間接的に連結されたヒアルロン酸誘導体を含有する、脂質ナノ粒子。   A lipid nanoparticle comprising a hyaluronic acid derivative in which a neutral lipid having a linear hydrophobic group is directly or indirectly linked to a hydroxyl group of N-acetylglucosamine, which is a reducing sugar at the terminal of hyaluronic acid. 前記中性脂質が、グリセロリン脂質である、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。   The lipid nano particles according to claim 1, wherein the neutral lipid is glycerophospholipid. 前記グリセロリン脂質がジアシルグリセロリン脂質である、請求項２に記載の脂質ナノ粒子。   The lipid nano particles according to claim 2, wherein the glycerophospholipid is a diacylglycerophospholipid. さらに、カチオン性脂質を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。   Furthermore, the lipid nanoparticle as described in any one of Claims 1-3 containing a cationic lipid. 脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する前記ヒアルロン酸誘導体の割合が０．５モル％以上である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。   The lipid nanoparticle according to any one of claims 1 to 4, wherein a ratio of the hyaluronic acid derivative to the total amount of lipid constituting the lipid nanoparticle is 0.5 mol% or more. 前記ヒアルロン酸誘導体が、１０〜１０００ｋＤａのヒアルロン酸と前記中性脂質が直接又は間接的に連結された物質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。   The lipid nanoparticle according to any one of claims 1 to 5, wherein the hyaluronic acid derivative is a substance in which a hyaluronic acid of 10 to 1000 kDa and the neutral lipid are directly or indirectly linked. さらに、グリセロリン脂質及びスフィンゴリン脂質を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。   Furthermore, the lipid nanoparticle as described in any one of Claims 1-6 containing a glycerophospholipid and a sphingophospholipid. 低分子化合物、低分子核酸、及びペプチドからなる群より選択される１種以上を含有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。   The lipid nanoparticle according to any one of claims 1 to 7, comprising one or more selected from the group consisting of a low molecular compound, a low molecular nucleic acid, and a peptide. 薬効成分を含有しており、標的細胞へ前記薬効成分を送達するキャリアである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。   The lipid nanoparticle according to any one of claims 1 to 8, which contains a medicinal component and is a carrier that delivers the medicinal component to a target cell. 前記標的細胞が、ヒアルロン酸受容体を発現している細胞である、請求項９に記載の脂質ナノ粒子。   The lipid nanoparticle according to claim 9, wherein the target cell is a cell expressing a hyaluronic acid receptor. 抗がん剤を含有しており、悪性胸膜中皮腫／胸膜播種した肺がんの治療に用いられる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。   The lipid nanoparticle according to any one of claims 1 to 10, which contains an anticancer agent and is used for the treatment of malignant pleural mesothelioma / pleurally seeded lung cancer.
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