JPWO2005021012A1 - Gemcitabine encapsulated drug carrier - Google Patents

Abstract

ゲムシタビンの放出速度を抑制することができ、長期にわたってゲムシタビンの局所濃度を維持することができるゲムシタビン封入薬剤担体の提供。膜で形成される担体であって、前記膜を構成する脂質成分として、リン脂質類とともに、コレステロール類を０〜３５ｍｏｌ％未満の比率で含む担体に、ゲムシタビンおよび／またはその塩を封入してなる薬剤担体。Provided is a gemcitabine-encapsulated drug carrier capable of suppressing the release rate of gemcitabine and maintaining the local concentration of gemcitabine for a long period of time. A carrier formed of a membrane, wherein gemcitabine and / or a salt thereof is encapsulated in a carrier containing cholesterol in a ratio of less than 0 to 35 mol% together with phospholipids as a lipid component constituting the membrane. Drug carrier.

Description

本発明は、ゲムシタビンおよび／またはその塩を封入した薬剤担体に関する。  The present invention relates to a drug carrier encapsulating gemcitabine and / or a salt thereof.

近年、薬剤、ＤＮＡ、ペプチドおよびタンパク質を、目的の部位たとえば癌、肺炎、肝炎、腎炎、リンパ腫、血管内皮損傷部位などの病巣部位に、確実に、効率良くかつ安全に薬剤をターゲッティングするためのドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の研究が盛んになってきている。
たとえばＤＤＳの薬剤運搬体として、リポソーム、エマルジョン、リピッドマイクロスフェア、ナノパーテイクルなどの閉鎖小胞を利用し、閉鎖小胞内に薬剤を内包させる方法、また高分子合成ポリマーミセルや多糖体等の高分子運搬体を利用し、薬剤を包含または結合させる方法、さらにはこれら閉鎖小胞や高分子運搬体の標的指向性を高めるために、抗体、蛋白質等の高分子機能性分子あるいは特定の糖鎖、ペプチド等の低分子機能性分子で表面修飾する方法などが研究されている。
しかしながら、これら薬剤運搬体の実用化に際しては、克服すべき様々な問題点があり、中でも生体側の異物認識機構からの回避、体内動態の制御の困難さが問題となり、実用性を向上させるための様々な検討がなされている。たとえばリン脂質からなるリポソーム膜にコレステロールを取り込ませると、リン脂質の平均分子専有面積は低下し、脂質分子のパッキングが密になることにより、膜安定化効果を示す。リン脂質とコレステロールとのモル比１：１のものが血清中でも酵素に対しても安定である（寺田弘ら、「ライフサイエンスにおけるリポソーム」シュプリンガー・フェアラーク東京（１９９２））。
またたとえば薬剤の標的とする組織や細胞への選択性の高い送達性の問題は、薬剤運搬体の親水性高分子による修飾により解決することが可能になっている。具体的には、特に閉鎖小胞は、血液中のオプソニン蛋白質や血漿蛋白質との相互作用による凝集、あるいは肝臓、脾臓等の細網内皮系組織（ＲＥＳ）での捕捉のため、標的とする組織や細胞への選択性の高い送達が困難であるという問題に対し、これら閉鎖小胞および高分子運搬体の表面をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の親水性高分子で被覆することにより、血漿蛋白やオプソニン蛋白質などの吸着を防止して血中安定性を高め、ＲＥＳでの捕捉を回避することが可能となってきていた（“ＬＩＰＯＳＯＭＥＳ ｆｒｏｍ Ｐｈｙｓｉｃｓ ｔｏ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｄ．Ｄ．Ｌａｓｉｃ著（１９９３））。このように親水性高分子で被覆されることにより、リポソームなどの閉鎖小胞は、高い血中滞留性が得られるため、腫瘍組織や炎症部位などの血管透過性が亢進した組織に受動的に集積させられるようになっている。
ところで、細胞周期特異的代謝拮抗物質を用いて最適の抗癌治療を行うには、長期間にわたって薬剤の局所濃度を維持することが必要とされるが、このような薬剤は静脈内または皮下投与後の半減期が数時間と短いという事実がある。これらの薬剤は、治療的濃度の医薬を送達するのに使用できる制御放出製剤が有用であり、このアプローチの１つとしてリポソームへの封入が研究されている。
たとえば、代謝拮抗物質であるシトシンアラビノシド（別称シタラビンまたはＡｒａ−Ｃ）などのいくつかの低分子量の薬剤を封入したリポソームの報告がある（Ｋｉｍら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２８：３３９−３４８（１９８３））。ここでは、脂質膜中にコレステロールを含有するリポソームを調製しているが、ここで報告される封入効率は比較的低く、生物学的流体中への封入分子の放出速度は速い。ゲムシタビンなどの代謝拮抗剤をリポソームに封入した場合、代謝拮抗剤がリポソームの脂質成分を加水分解することにより、封入した薬剤の外部への放出を促進する（Ｒ．Ｍｏｏｇら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０６：４３−５３（２０００））。
また、抗ＨＩＶ薬剤として知られるジデオキシシチジン（別称ザルシタビン）をリポソーム化した場合、コレステロール非存在下では放出速度が抑えられると報告しているが、Ｋｉｍらの報告と同様に放出速度は速い（Ｂｏｄｙ Ｍａｋａｂｉ−Ｐａｎｚｕら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４４（２），２７７−２８４（１９９８））。
以上のように、低分子量の薬剤を封入したリポソームは薬剤の放出速度が速いことが知られており、これを改善する方法として、リポソーム脂質濃度の高いリポソーム製剤を高圧均質化によりゲル化し、リポソームに内封されていない遊離薬剤たとえばゲムシタビンと、リポソームに内封された薬剤とが混在するリポソームゲル（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｇｅｌ、ＶＰＧ）の調製方法の開示がある（Ｒ．Ｍｏｏｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ，４９：３５６−３６６（２００２）および特表２００２−５０９８６６号公報）。この方法では、リポソームの内部と外部の薬剤の濃度を同じにすることで拡散による薬剤のリポソーム内部から外部への放出速度を抑えることはできるが、投与後リポソーム外部の薬剤が急速に血中に拡散する。放出速度を抑えていた薬剤濃度を維持することができず、リポソーム内部からの薬剤の急速な拡散が生じ、血中での放出速度を押えるという根本的解決には至っていない。In recent years, drugs for reliably, efficiently and safely targeting drugs, DNA, peptides and proteins to target sites such as cancer, pneumonia, hepatitis, nephritis, lymphoma, vascular endothelial injury sites, etc. Research on delivery systems (DDS) has become active.
For example, as a drug carrier for DDS, closed vesicles such as liposomes, emulsions, lipid microspheres, and nanoparticles are used, and a drug is encapsulated in the closed vesicles, and polymer synthetic polymer micelles, polysaccharides, etc. In order to enhance the targeting of these closed vesicles and polymer carriers using a polymer carrier, and to include or bind drugs, polymer functional molecules such as antibodies and proteins, or specific sugars A method of surface modification with low-molecular functional molecules such as chains and peptides has been studied.
However, there are various problems to be overcome when these drug carriers are put into practical use, and in particular, avoidance from the foreign body recognition mechanism on the living body side and difficulty in controlling the pharmacokinetics are problems, so as to improve practicality. Various studies have been made. For example, when cholesterol is incorporated into a liposome membrane made of phospholipid, the average molecular occupation area of the phospholipid is reduced, and the packing of lipid molecules becomes dense, thereby showing a membrane stabilizing effect. A phospholipid to cholesterol molar ratio of 1: 1 is stable to both serum and enzymes (Hiroshi Terada et al., “Liposome in Life Science” Springer Fairlark Tokyo (1992)).
Further, for example, the problem of delivery with high selectivity to a tissue or cell targeted by a drug can be solved by modifying the drug carrier with a hydrophilic polymer. Specifically, closed vesicles are particularly targeted for aggregation due to interaction with opsonin proteins and plasma proteins in blood, or for capture by reticuloendothelial tissue (RES) such as liver and spleen. By coating the surfaces of these closed vesicles and polymer carriers with hydrophilic polymers such as polyethylene glycol (PEG), the problem of difficult delivery with high selectivity to cells and cells, It has become possible to prevent the adsorption of opsonin protein and the like to increase the stability in the blood and avoid the capture by RES (“LIPOSOMES from Physics to Applications” by Elsevier, DD Lasic (1993)). ). By being coated with a hydrophilic polymer in this way, closed vesicles such as liposomes have high retention in the blood, so passively applied to tissues with enhanced vascular permeability such as tumor tissues and inflammatory sites. It can be integrated.
By the way, it is necessary to maintain a local concentration of a drug over a long period of time in order to perform an optimal anticancer treatment using a cell cycle-specific antimetabolite, and such a drug is administered intravenously or subcutaneously. There is a fact that the later half-life is as short as several hours. These agents are useful in controlled release formulations that can be used to deliver therapeutic concentrations of the drug, and encapsulation in liposomes has been studied as one of this approach.
For example, there are reports of liposomes encapsulating several low molecular weight drugs such as the antimetabolite cytosine arabinoside (also known as cytarabine or Ara-C) (Kim et al., Biochim. Biophys. Acta, 728: 339-). 348 (1983)). Here, liposomes containing cholesterol in a lipid membrane are prepared, but the encapsulation efficiency reported here is relatively low and the release rate of the encapsulated molecules into the biological fluid is fast. When an antimetabolite such as gemcitabine is encapsulated in the liposome, the antimetabolite promotes the release of the encapsulated drug by hydrolyzing the lipid component of the liposome (R. Moog et al., International Journal of Pharmaceuticals, 206: 43-53 (2000)).
In addition, when dideoxycytidine (also known as zarcitabine), which is known as an anti-HIV drug, is liposomal, it has been reported that the release rate can be suppressed in the absence of cholesterol, but the release rate is fast as in the report of Kim et al. (Body) Makabi-Panzu et al., Cellular and Molecular Biology 44 (2), 277-284 (1998)).
As described above, liposomes encapsulating a low molecular weight drug are known to have a high drug release rate. As a method for improving this, a liposome preparation with a high liposomal lipid concentration is gelled by high-pressure homogenization. Discloses a method for preparing a liposomal gel (VPG) in which a free drug that is not encapsulated, such as gemcitabine, and a drug encapsulated in a liposome are mixed (R. Moog et al., Cancer Chem. Pharm, 49: 356-366 (2002) and Japanese translations of PCT publication No. 2002-509866 gazette). In this method, the concentration of the drug inside and outside the liposome can be made the same, so that the rate of drug release from the inside of the liposome by diffusion can be suppressed, but the drug outside the liposome rapidly enters the blood after administration. Spread. The concentration of the drug that has suppressed the release rate cannot be maintained, and the drug diffuses rapidly from the inside of the liposome, which has not led to a fundamental solution that suppresses the release rate in the blood.

本発明者は、薬剤として、長期間にわたって局所濃度の維持が必要とされる代謝拮抗物質のうちでも、特にゲムシタビンを封入する薬剤担体のゲムシタビン放出速度について検討し、それを抑制するという課題を、担体の膜構成成分によって克服し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明では、ゲムシタビンの放出速度を抑制することができ、長期にわたってゲムシタビンの局所濃度を維持することができるゲムシタビン封入薬剤担体を提供することを目的としている。
上記課題は以下の本発明により解決される。
（１）膜で形成される担体であって、前記膜を構成する脂質成分として、リン脂質類とともに、コレステロール類を０〜３５ｍｏｌ％未満の比率で含む担体に、ゲムシタビンおよび／またはその塩を封入してなる薬剤担体。
（２）前記コレステロール類の比率が１３〜３５ｍｏｌ％未満である上記（１）の薬剤担体。
（３）前記コレステロール類がコレステロールおよび／またはコレスタノールである上記（１）または（２）の薬剤担体。
（４）前記担体がリポソームである上記（１）ないし（３）のいずれかの薬剤担体。
すなわちリポソーム膜構成成分中にコレステロール類を含まないか、または３５ｍｏｌ％未満、好ましくは１３ｍｏｌ％以上ないし３５ｍｏｌ％未満の量でコレステロール類を含むゲムシタビンおよび／またはその塩のリポソーム製剤が提供される。
（５）前記膜が、前記リン脂質類およびコレステロール類以外の脂質類、および表面修飾剤からなる群から選ばれる少なくとも一つの構成成分をさらに含有する上記（１）ないし（４）のいずれかの薬剤担体。
（６）前記表面修飾剤が、ポリエチレングリコール誘導体および／または荷電物質である上記（５）の薬剤担体。
ポリエチレングリコール誘導体は、ポリエチレングリコールの脂質誘導体が好ましく挙げられる。このポリエチレングリコール部分の分子量は、通常、５００〜１０，０００程度である。
荷電物質としては、カチオン化脂質が好ましく挙げられる。
（７）前記薬剤担体が、安定化剤および酸化防止剤からなる群から選ばれる少なくとも一つをさらに含有する上記（１）ないし（６）のいずれかの薬剤担体。
（８）上記（１）ないし（７）のいずれかの薬剤担体を含有する医薬組成物。
（９）予防および／または治療有効量の（１）ないし（７）のいずれかの薬剤担体を宿主に投与することからなる、疾患の予防および／または治療方法。
（１０）（１）ないし（７）のいずれかの薬剤担体を宿主に投与することからなる、有効量のゲムシタビンおよび／またはその塩を宿主内で放出する方法。
（１１）（１）ないし（７）のいずれかの薬剤担体を宿主に投与することからなる、有効量のゲムシタビンおよび／またはその塩を標的部位に暴露する方法。The present inventor examines the gemcitabine release rate of a drug carrier encapsulating gemcitabine, among the antimetabolites that require the maintenance of a local concentration over a long period of time as a drug, and suppresses it. The present invention has been completed by overcoming the membrane component of the carrier. That is, an object of the present invention is to provide a gemcitabine-encapsulated drug carrier that can suppress the release rate of gemcitabine and can maintain the local concentration of gemcitabine for a long period of time.
The above problems are solved by the present invention described below.
(1) A carrier formed of a membrane, in which gemcitabine and / or a salt thereof is encapsulated in a carrier containing cholesterol in a ratio of less than 0 to 35 mol% together with phospholipids as a lipid component constituting the membrane A pharmaceutical carrier.
(2) The drug carrier according to the above (1), wherein the ratio of the cholesterols is less than 13 to 35 mol%.
(3) The drug carrier according to (1) or (2) above, wherein the cholesterol is cholesterol and / or cholestanol.
(4) The drug carrier according to any one of (1) to (3) above, wherein the carrier is a liposome.
That is, a liposome preparation of gemcitabine and / or a salt thereof containing no cholesterol in the liposome membrane component or containing cholesterol in an amount of less than 35 mol%, preferably 13 mol% or more to less than 35 mol% is provided.
(5) Any of the above (1) to (4), wherein the membrane further contains at least one component selected from the group consisting of lipids other than the phospholipids and cholesterols, and a surface modifier Drug carrier.
(6) The drug carrier according to (5), wherein the surface modifier is a polyethylene glycol derivative and / or a charged substance.
The polyethylene glycol derivative is preferably a lipid derivative of polyethylene glycol. The molecular weight of the polyethylene glycol moiety is usually about 500 to 10,000.
Preferred examples of the charged substance include cationized lipids.
(7) The drug carrier according to any one of (1) to (6), wherein the drug carrier further contains at least one selected from the group consisting of a stabilizer and an antioxidant.
(8) A pharmaceutical composition comprising the pharmaceutical carrier of any one of (1) to (7) above.
(9) A method for preventing and / or treating a disease, comprising administering an effective amount of a pharmaceutical carrier of any one of (1) to (7) to a host.
(10) A method for releasing an effective amount of gemcitabine and / or a salt thereof in a host, comprising administering the pharmaceutical carrier of any one of (1) to (7) to the host.
(11) A method of exposing an effective amount of gemcitabine and / or a salt thereof to a target site, comprising administering a pharmaceutical carrier of any one of (1) to (7) to a host.

図１は、実施例１および比較例１で得られた塩酸ゲムシタビン封入リポソームの３７℃緩衝液中における安定性を塩酸ゲムシタビン放出率で示す図である。
図２は、実施例１および比較例１で得られた塩酸ゲムシタビン封入リポソームの１０％ウシ胎児血清存在下での３７℃緩衝液中における安定性を塩酸ゲムシタビン放出率で示す図である。
図３は、実施例２〜３および比較例２〜３で得られた塩酸ゲムシタビン封入リポソームの３７℃緩衝液中における安定性を塩酸ゲムシタビン放出率で示す図である。
図４は、実施例４および比較例４で得られた塩酸ゲムシタビン封入リポソームの３７℃緩衝液中における安定性を塩酸ゲムシタビン放出率で示す図である。
図５は、実施例４および比較例４で得られた塩酸ゲムシタビン封入リポソームの１０％ウシ胎児血清存在下での３７℃緩衝液中における安定性を塩酸ゲムシタビン放出率で示す図である。
図６は、実施例５および比較例５で得られた塩酸ゲムシタビン封入リポソームをマウスに静脈注射した後の採血時間における血漿中の塩酸ゲムシタビン濃度を示す図である。
図７は、実施例６で得られた塩酸ゲムシタビン封入リポソームをマウスに静脈注射した後の採血時間における血漿中の塩酸ゲムシタビン濃度を示す図である。FIG. 1 is a graph showing the stability of gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposomes obtained in Example 1 and Comparative Example 1 in a 37 ° C. buffer solution as a release rate of gemcitabine hydrochloride.
FIG. 2 is a graph showing the stability of gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposomes obtained in Example 1 and Comparative Example 1 in a 37 ° C. buffer solution in the presence of 10% fetal calf serum as a release rate of gemcitabine hydrochloride.
FIG. 3 is a graph showing the stability of gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposomes obtained in Examples 2-3 and Comparative Examples 2-3 in a 37 ° C. buffer solution as a release rate of gemcitabine hydrochloride.
FIG. 4 is a graph showing the stability of gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposomes obtained in Example 4 and Comparative Example 4 in a 37 ° C. buffer solution as a release rate of gemcitabine hydrochloride.
FIG. 5 is a graph showing the stability of gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposomes obtained in Example 4 and Comparative Example 4 in the presence of 10% fetal bovine serum in a 37 ° C. buffer solution as a release rate of gemcitabine hydrochloride.
FIG. 6 is a graph showing the concentration of gemcitabine hydrochloride in plasma during blood sampling after intravenous injection of gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposomes obtained in Example 5 and Comparative Example 5 into mice.
FIG. 7 is a graph showing the concentration of gemcitabine hydrochloride in plasma at the time of blood collection after intravenous injection of gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposomes obtained in Example 6 into mice.

以下に、より詳細に本発明を説明する。
本発明は、基本的にリン脂質類からなる膜に、コレステロール類を所定の範囲の特定比率で含ませた担体に、薬剤として特にゲムシタビンおよび／またはその塩を封入させた薬剤担体を提供する。
ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）は、特異性の高い代謝拮抗作用を有するデオキシシチジン誘導体である。既存物質として、ＣＡＳＮｏ．９５０５８−８１−４のゲムシタビン（化学名（±）−２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジン（分子式Ｃ_９Ｈ_１１Ｆ_２Ｎ_３Ｏ_４、分子量２６３．２０）、およびＣＡＳＮｏ．１２２１１１−０３−９のゲムシタビン塩酸塩（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ・ＨＣｌ）（分子量２９９．６６）がある。本発明では、ゲムシタビンとして、通常、ゲムシタビン塩酸塩（以下、塩酸ゲムシタビンと称することがある。）を担体に封入させる。
本明細書において、「ゲムシタビンおよび／またはその塩」を、単に「ゲムシタビン」または「薬剤」と称することがある。
ゲムシタビンの合成方法は、たとえば米国特許４，５２６，９８８号明細書、同４，８０８，６１４号明細書、同５，２２３，６０８号明細書に記載されており、これら記載の引用により本明細書にも記載されているものとする。
本発明において、ゲムシタビンを封入する担体の主膜材は、閉鎖小胞体形成能を有するものが望ましく、リン脂質類が選択される。主膜材とは、脂質膜の構成成分中最も高い含率を示す成分である。
リン脂質類は、生体膜の主要構成成分であり、分子内に長鎖アルキル基より構成される疎水性基とリン酸基より構成される親水性基のグループを持つ両親媒性物質である。
リン脂質類としては、リン脂質またはその誘導体が挙げられ、特に限定されないが、たとえばフォスファチジルコリン（レシチン）、フォスファジルグリセロール、フォスファチジン酸、ジステアロイルフォスファチジルコリン（_Ｌ−α−Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルフォスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、卵黄フォスファチジルコリン（ＥＰＣ）、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルジオリピン等の天然あるいは合成のリン脂質、またはこれらを常法にしたがって水素添加したもの、たとえば水素添加大豆レシチン（Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＨＳＰＣ）、水素添加卵黄レシチン（ＨＥＰＣ）等を挙げることができる。
本発明において、担体の膜を形成する脂質成分は、上記リン脂質類とともに特定比率のコレステロール類を含有している。
本発明において、「コレステロール類」とは、コレステロールまたはその誘導体であり、シクロペンタノヒドロフェナントレン環を有するステロール類である。
コレステロール類の具体例としては特に限定されないが、コレステロールまたはコレスタノールが挙げられる。これらは、以下に示すコレステロール類の量範囲であれば、脂質膜中に、コレステロール類として異なるコレステロール類が複数混在していてもよいし、単一のコレステロール類が含有されていてもよい。
リン脂質類とコレステロール類とは、薬剤担体を閉鎖小胞として形成する脂質二重層（膜）の構成成分である。
本発明において、担体の膜を構成する脂質成分中、コレステロール類の占める比率（含有比率；Ｃｈｏｌ比率）は、所定の範囲の「特定比率」であり、０〜３５ｍｏｌ％未満（具体的にはコレステロール類／脂質成分＝３２／９２ｍｏｌ％（＝３４．７８ｍｏｌ％）程度以下）である。３５ｍｏｌ％より高いと、薬剤担体に封入される薬剤（ゲムシタビンおよび／またはその塩）の放出性が望まれる範囲より高くなり、好ましくない。上記コレステロール類の含有比率（Ｃｈｏｌ比率）は、好ましくは１〜３５ｍｏｌ％未満（＝３４．７８ｍｏｌ％以下）であり、より好ましくは１３〜３５ｍｏｌ％未満であり、さらに好ましくは２４〜３５ｍｏｌ％未満である。
なお上記「担体の膜を構成する脂質成分」量は、脂質の合計量であり、このうちに脂質の表面修飾剤などは含まれない。
また本発明において、膜構成成分に、後述するカチオン化剤を含む場合（すなわちカチオン化脂質膜の場合）には、上記「脂質成分」の語に対し、リン脂質類、コレステロール類およびカチオン化脂質を含む「総脂質」の語が使用される。ただし、表面修飾剤のうち、後述のＰＥＧ誘導体（たとえばＰＥＧ−ＰＥ）は、この総脂質には含まれない。
上記脂質二重層（膜）は、リン脂質類およびコレステロール類以外の物質を一または二以上含有していてもよい。膜に含ませる他の物質としては、本発明の効果を発揮し得るものであればよく、特に限定されないが、その安全性、生体内における安定性などを考慮すると、リン脂質類以外の脂質類、表面修飾剤などが挙げられる。
リン脂質類以外の脂質類とは、分子内に長鎖アルキル基等より構成される疎水性基を有し、リン酸基を分子内に含有しない脂質およびその誘導体であり、特に限定されないが、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質等を挙げることができる。
表面修飾剤としては、特に限定されないが、荷電物質、親水性高分子、グルクロン酸、シアル酸、デキストランなどの水溶性多糖類の誘導体が挙げられる。
荷電物質の中でも正に荷電する物質（脂質のカチオン化剤）としては、ステアリルアミンおよびＷＯ９７／４２１６６（この記載の引用により本明細書に記載されているものとする）に開示されるアミジン類たとえば３，５−ジペンタデシロキシベンズアミジン塩酸塩などの塩基性物質、Ｎ−アシル−_Ｌ−アルギニン等の塩基性アミノ酸系界面活性剤などが挙げられる。
負に荷電する物質としては、オレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸、ガングリオシドＧＭ１、ガングリオシドＧＭ３等のシアル酸を有するガングリオシド類、Ｎ−アシル−_Ｌ−グルタミン等の酸性アミノ酸系界面活性剤などが挙げられる。
親水性高分子としては、特に限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、合成ポリアミノ酸、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンなどが挙げられる。これらの中でも、ポリエチレングリコールは血中滞留性を向上させる効果があり、好ましい。
薬剤担体の表面に親水性高分子を存在させるために、前記の親水性高分子を疎水性化合物と結合させた誘導体を用いることができる。このような誘導体とすることにより、疎水性化合物部位が疎水性の脂質膜に挿入された状態で安定に存在する。それに伴い、親水性高分子部位が担体の膜表面（外側）に安定化される。疎水性化合物としては、特に限定されないが長鎖脂肪族アルコール、ステロール、ポリオキシプロピレンアルキル、またはグリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる。親水性高分子と疎水性化合物とを結合させた誘導体としては、ＰＥＧ誘導体が挙げられ、特に限定されないが、ポリエチレングリコール−フォスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）等が例示される。
ＰＥＧ誘導体を構成するＰＥＧの分子量としては、特に限定されないが、通常５００〜１０，０００程度であり、好ましくは１，０００〜７，０００、より好ましくは１，０００〜５，０００である。
担体中のＰＥＧ誘導体は、上記総脂質量に対する比率で、通常０〜２０ｍｏｌ％で存在することができ、好ましくは０．１〜１０ｍｏｌ％、より好ましくは０．１〜５ｍｏｌ％、さらに好ましくは０．５〜５ｍｏｌ％である。
本発明において、担体は、ゲムシタビンを封入することができれば、様々な形態をとることができる。
ここで、「封入」とは、薬剤（ゲムシタビン）が、脂質膜で形成される担体の閉鎖空間に内封された状態、膜を構成する脂質層内に一部または全ての部分が含まれて担持されている状態、または担体の外表面に薬剤が付着して担持された状態であることを意味する。
本発明では、特に限定されないが、薬剤を内封する構造を有することが望ましい。特に好ましい担体は、膜構成成分の疎水性基と親水性基の極性に基づいて生ずる膜により外界から隔てられた空間を形成する構造を有する閉鎖小胞であり、特に限定されないがたとえばリポソームである。リポソームとはリン脂質類を基本とする脂質二重層からなる閉鎖小胞である。
また担体の形状は、球状またはそれに近い形態をとることができ、その粒径の大きさ（粒子外径の直径）は、特に限定されないが、０．０２〜２５０μｍ、好ましくは０．０３〜０．４μｍの大きさであり、より好ましくは０．０５〜０．２μｍ（５０〜２００ｎｍ）である。
本発明の薬物担体は、投与経路次第で医薬的に許容される安定化剤および／または酸化防止剤をさらに含むものであってもよい。安定化剤としては、特に限定されないが、グリセロール、シュクロースなどの糖類が挙げられる。酸化防止剤としては、特に限定されないがアスコルビン酸、尿酸あるいはトコフェロール同族体たとえばビタミンＥなどが挙げられる。トコフェロールには、α、β、γ、δの４個の異性体が存在するが本発明においてはいずれも使用できる。
本発明の薬剤担体は、投与経路次第で医薬的に許容される添加物をさらに含むものであってもよい。このような添加物の例として、水、生理食塩水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ＰＢＳ、生体内分解性ポリマー、無血清培地、医薬添加物として許容される界面活性剤あるいは生体内で許容し得る生理的ｐＨの緩衝液などが挙げられる。
添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜選択され、あるいはそれらを組合せて使用されるが、これらに限定されるものではない。
本発明では、これら添加物を含む態様の薬物担体を、医薬組成物として供することができる。本発明の医薬組成物は、通常の方法、たとえば０〜８℃での冷蔵保存することができる。
本発明の薬剤担体は、常法によって得ることができる。薬剤担体の一例として、リポソームである場合の製造方法を以下に示すが、これに限定されない。
フラスコ内で、リン脂質類およびコレステロール類、さらに必要に応じて他の担体の膜構成成分を、クロロホルム等の有機溶媒により混合し、有機溶媒を留去後に真空乾燥することによりフラスコ内壁に薄膜を形成させる。次に、このフラスコ内に薬剤を加え、激しく撹拌することにより、リポソーム分散液を得る。得られたリポソーム分散液を遠心分離し、上清をデカンテーションし封入されなかった薬剤を除去することにより、薬剤担体を分散液として得ることができる。
またリポソームは、上記方法以外にも、上記の各構成成分を混合し、高圧吐出型乳化機により高圧吐出させることにより得ることもできる（寺田、吉村ら、「ライフサイエンスにおけるリポソーム」シュプリンガー・フェアラーク東京（１９９２））。
薬剤を担体に封入するためにｐＨ勾配法を用いることができる（Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編「Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．Ｉ−ＩＩＩ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）。
なお上記各文献の記載は、これを引用することにより本明細書に記載されているものとする。
また、ＰＥＧ−ＰＥを脂質膜に結合した物質を脂質二重層に含む薬剤担体としては以下の方法によって得ることができるが、これに限定されるものではない。リポソーム形成脂質とＰＥＧ−ＰＥを予め均一に混合してリポソームを形成させてもよく、ＰＥＧ−ＰＥを含まないリポソーム形成脂質を混合して得られた混合脂質を用いて常法によりリポソームを形成させた後にＰＥＧ−ＰＥを添加してもよい。
本発明の薬剤担体は、ゲルろ過、透析、膜分離および遠心分離等の通常用いられる方法で精製することにより、薬剤担体に封入されなかった薬剤を除去することができる。薬剤担体は封入されなかった薬剤を除去するための段階を経て供される。したがって、薬剤担体の内部と薬剤担体の外部とでは、脂質二重層（膜）を介して薬剤の濃度勾配が生じ得る。好ましくは、本発明の薬剤担体は、調製後に脂質二重層の外部に、脂質二重層に封入されなかった薬剤を有さない。そして、薬剤担体に封入された薬剤を内部から外部環境へ放出する。
なお「封入率」とは、担体の構成成分とゲムシタビンおよび／またはその塩とを混入して、それを封入した薬剤担体を形成する際に、混入した薬剤（仕込み量）に対する担体に封入された薬剤の比率（重量比またはｍｏｌ比）をいう。
本発明の薬剤担体は、薬剤を封入した状態で標的部位まで到達し、その結果封入する薬剤を標的部位まで送達する。薬剤の標的部位への送達は、担体に封入された薬剤を標的部位へ取りこませることであってもよいし、標的部位に取りこまれずとも薬剤の影響を標的部位またはその近傍へ及ぼすことであってもよい。
本発明において、「放出」とは、薬剤担体に封入された薬剤が薬剤担体を構成する脂質膜を通過することにより、または脂質膜の一部の構造が変わることにより閉鎖小胞の外部へ出てくることを意味する。
「放出率」とは、担体の構成成分とゲムシタビンおよび／またはその塩を封入した薬剤担体から閉鎖小胞の外部へ出てくる薬剤と、担体に封入された薬剤との比率（重量比またはｍｏｌ比）をいう。
「放出率が低い」とは単位時間あたりに閉鎖小胞の外部へ出てくる薬剤量が少ないことを意味する。本発明の薬剤担体は、膜構成成分としてコレステロール類を特定比率で含有することにより、好適な放出率を示す。薬剤担体を宿主に投与する場合、特に標的部位に局所的に投与される場合、コレステロール類を上記の範囲とすることにより、好ましい効果が期待される。
実施例に示すように、本発明の薬剤担体について封入された薬剤の放出率を測定したところ、低い放出率が認められた。放出率は、本発明の薬剤担体を遠心にて沈降させ、上清に存在する薬剤の量と薬剤担体を測定することにより計算することができる。
本発明において、「血中滞留性」とは、薬剤担体を投与した宿主において、担体に封入された状態の薬剤が血液中に存在する性質を意味する。薬剤が担体から放出されると速やかに血中から消失し、薬剤が暴露した部位へ作用する。血中滞留性が良いとより少ない量の薬剤を投与することが可能である。本発明の薬剤担体は、膜構成成分としてコレステロール類を特定比率で含有することにより、好適な血中滞留性を示す。
本発明において、「標的部位」とは薬剤担体が封入する薬剤（ゲムシタビン）が放出されて作用する特定の部位であり、部位ごとに特定された細胞、組織、器官または臓器およびそれらの内部を意味する。細胞、組織、器官または臓器およびそれらの内部などの標的部位は薬剤による治療の対象となる部位であることができ、放出された薬剤が暴露することにより、その効果を発揮する。
本発明における標的部位としては、特に限定されないが腫瘍が挙げられる。治療の対象となる腫瘍としては、特に限定されないが固形腫瘍であり、具体的には食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、喉頭癌、肺癌、前立腺癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌または卵巣癌が挙げられる。標的部位は、腫瘍の細胞、組織、器官または臓器およびそれらの内部などである。したがって、本発明において、疾患とは前記の腫瘍を意味し、薬剤はそれらに対し抗腫瘍効果を示すことが期待される。
本発明において、「暴露」とは、薬剤担体の外部へ放出された薬剤が外部環境へ作用を及ぼすことを意味する。具体的には、放出された薬剤（ゲムシタビン）は、標的部位に近接し、接触することによりその作用である抗腫瘍効果を発揮する。薬剤が標的部位に作用することにより、標的部位のＤＮＡ合成が行われている細胞周期にある細胞に局所的に作用し、期待された効果を示す。このような効果を示すために、薬剤担体からの薬剤の放出率と薬剤担体の血中滞留性との均衡を保つ必要がある。
本発明の薬剤担体は、ゲムシタビンおよび／またはその塩を好ましい放出速度にて放出し、所望の標的部位を暴露するために使用される。したがって、本発明において、有効量のゲムシタビンおよび／またはその塩を封入する薬剤担体を宿主に投与することにより、宿主の疾患の予防および／または治療のため、宿主内で有効量のゲムシタビンおよび／またはその塩を放出するため、または有効量のゲムシタビンおよび／またはその塩を標的部位に暴露するために、宿主（患者）に非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。投与対象の宿主としては、哺乳動物、好ましくはヒト、サル、ネズミ、家畜等が挙げられる。
非経口的投与の経路としては、たとえば点滴などの静脈内注射（静注）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射を選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。本発明の薬剤担体は、病気に既に悩まされる患者に、疾患の症状を治癒するか、あるいは少なくとも部分的に阻止するために十分な量で投与される。たとえば、薬剤担体に封入される薬剤の有効投与量は、一日につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇから１００ｍｇの範囲で選ばれる。しかしながら、本発明の薬剤担体はこれらの投与量に制限されるものではない。投与時期は、疾患が生じてから投与してもよいし、あるいは疾患の発症が予測される時に発症時の症状緩和のために予防的に投与してもよい。また、投与期間は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。
具体的な投与方法としては、医薬組成物をシリンジや点滴によって投与することができる。また、カテーテルを患者または宿主の体内、たとえば管腔内、たとえば血管内に挿入して、その先端を標的部位付近に導き、当該カテーテルを通して、所望の標的部位またはその近傍あるいは標的部位への血流が期待される部位から投与することも可能である。Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
The present invention provides a drug carrier in which gemcitabine and / or a salt thereof is encapsulated as a drug in a carrier in which cholesterol is contained at a specific ratio within a predetermined range in a membrane basically composed of phospholipids.
Gemcitabine is a deoxycytidine derivative having a highly specific antimetabolite action. As an existing substance, CAS No. 95058-81-4 gemcitabine (chemical name (±) -2′-deoxy-2 ′, 2′-difluorocytidine (molecular formula C ₉ H ₁₁ F ₂ N ₃ O ₄ , molecular weight 263.20)), and CAS No. 122111 -03-9 gemcitabine hydrochloride (molecular weight 299.66) In the present invention, gemcitabine hydrochloride (hereinafter sometimes referred to as gemcitabine hydrochloride) is usually encapsulated in a carrier as gemcitabine. Let
In the present specification, “gemcitabine and / or a salt thereof” may be simply referred to as “gemcitabine” or “drug”.
Methods for synthesizing gemcitabine are described in, for example, US Pat. Nos. 4,526,988, 4,808,614, and 5,223,608, and the present specification is incorporated herein by reference. It is assumed that it is described in the book.
In the present invention, it is desirable that the main membrane material of the carrier enclosing gemcitabine has the ability to form a closed endoplasmic reticulum, and phospholipids are selected. The main membrane material is a component having the highest content in the constituent components of the lipid membrane.
Phospholipids are main components of biological membranes and are amphipathic substances having a group of a hydrophobic group composed of a long-chain alkyl group and a hydrophilic group composed of a phosphate group in the molecule.
Phospholipids include phospholipids or derivatives thereof, and are not particularly limited. For example, phosphatidylcholine (lecithin), phosphatylglycerol, phosphatidic acid, distearoylphosphatidylcholine ( _L- α-Distearoyl) Phosphatidylcholine, DSPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC), egg yolk phosphatidylcholine (EPC), phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, Natural or synthetic phospholipids such as sphingomyelin and cardiolipin, or those obtained by hydrogenating them according to a conventional method, such as hydrogenated soybean lecithin (Hydr) genated soybean phosphatidylcholine, HSPC), mention may be made of hydrogenated egg yolk lecithin (HEPC) and the like.
In the present invention, the lipid component forming the carrier film contains a specific proportion of cholesterol together with the phospholipids.
In the present invention, “cholesterols” are cholesterol or derivatives thereof and are sterols having a cyclopentanohydrophenanthrene ring.
Although it does not specifically limit as a specific example of cholesterol, Cholesterol or cholestanol is mentioned. As long as these are in the amount range of cholesterols shown below, a plurality of different cholesterols may be mixed in the lipid membrane, or a single cholesterol may be contained.
Phospholipids and cholesterols are constituents of a lipid bilayer (membrane) that forms drug carriers as closed vesicles.
In the present invention, the proportion of cholesterol in the lipid component constituting the carrier membrane (content ratio; chol ratio) is a “specific ratio” within a predetermined range, and is less than 0 to 35 mol% (specifically, cholesterol). Class / lipid component = 32/92 mol% (= about 34.78 mol%) or less). When it is higher than 35 mol%, the release of the drug (gemcitabine and / or its salt) encapsulated in the drug carrier becomes higher than desired, which is not preferable. The cholesterol content (Chol ratio) is preferably less than 1 to 35 mol% (= 34.78 mol% or less), more preferably less than 13 to 35 mol%, and even more preferably less than 24 to 35 mol%. is there.
The amount of the “lipid component constituting the carrier membrane” is the total amount of lipid, and does not include lipid surface modifiers.
In the present invention, when the membrane constituent contains a cationizing agent described later (that is, in the case of a cationized lipid membrane), phospholipids, cholesterols and cationized lipids are used in addition to the term “lipid component”. The term “total lipid” is used. However, among the surface modifiers, a PEG derivative (for example, PEG-PE) described later is not included in the total lipid.
The lipid bilayer (membrane) may contain one or more substances other than phospholipids and cholesterols. Other substances to be included in the membrane are not particularly limited as long as they can exert the effects of the present invention, but lipids other than phospholipids are considered in view of safety, in vivo stability, and the like. And surface modifiers.
Lipids other than phospholipids are lipids and derivatives thereof that have a hydrophobic group composed of a long-chain alkyl group in the molecule and do not contain a phosphate group in the molecule, and are not particularly limited, Examples thereof include glyceroglycolipid and sphingoglycolipid.
The surface modifier is not particularly limited, and examples thereof include charged substances, hydrophilic polymers, derivatives of water-soluble polysaccharides such as glucuronic acid, sialic acid, and dextran.
Among the charged substances, positively charged substances (lipid cationizing agents) include stearylamine and amidines disclosed in WO 97/42166 (which are described herein by reference). Examples include basic substances such as 3,5-dipentadecyloxybenzamidine hydrochloride, and basic amino acid surfactants such as N-acyl- _L -arginine.
Examples of the negatively charged substance include fatty acids such as oleic acid and stearic acid, gangliosides having sialic acid such as ganglioside GM1 and ganglioside GM3, and acidic amino acid surfactants such as N-acyl- _L -glutamine. .
The hydrophilic polymer is not particularly limited, but polyethylene glycol (PEG), dextran, pullulan, ficoll, polyvinyl alcohol, styrene-maleic anhydride alternating copolymer, divinyl ether-maleic anhydride alternating copolymer, synthetic poly Examples include amino acids, amylose, amylopectin, chitosan, mannan, cyclodextrin, pectin, and carrageenan. Among these, polyethylene glycol is preferable because it has an effect of improving retention in blood.
In order for the hydrophilic polymer to be present on the surface of the drug carrier, a derivative obtained by binding the hydrophilic polymer to a hydrophobic compound can be used. By using such a derivative, the hydrophobic compound site is stably present in a state of being inserted into the hydrophobic lipid membrane. Accordingly, the hydrophilic polymer portion is stabilized on the film surface (outside) of the carrier. Examples of the hydrophobic compound include, but are not limited to, long-chain aliphatic alcohols, sterols, polyoxypropylene alkyls, or glycerin fatty acid esters. Examples of the derivative in which a hydrophilic polymer and a hydrophobic compound are bonded include a PEG derivative, and are not particularly limited, and examples thereof include polyethylene glycol-phosphatidylethanolamine (PEG-PE).
Although it does not specifically limit as molecular weight of PEG which comprises a PEG derivative, Usually, it is about 500-10,000, Preferably it is 1,000-7,000, More preferably, it is 1,000-5,000.
The PEG derivative in the carrier can be usually present at 0 to 20 mol%, preferably 0.1 to 10 mol%, more preferably 0.1 to 5 mol%, and still more preferably 0, in a ratio to the total lipid amount. 0.5 to 5 mol%.
In the present invention, the carrier can take various forms as long as gemcitabine can be encapsulated.
Here, “encapsulation” means a state in which a drug (gemcitabine) is enclosed in a closed space of a carrier formed of a lipid membrane, and a part or all of the portion is included in the lipid layer constituting the membrane. It means that it is in a supported state or a state in which a drug adheres to the outer surface of the carrier.
Although it does not specifically limit in this invention, It is desirable to have a structure which encloses a chemical | medical agent. A particularly preferable carrier is a closed vesicle having a structure that forms a space separated from the outside by a membrane formed based on the polarity of the hydrophobic group and the hydrophilic group of the membrane component, and is not particularly limited, but is a liposome, for example. . Liposomes are closed vesicles composed of lipid bilayers based on phospholipids.
The shape of the carrier can be spherical or close to that, and the size of the particle size (diameter of particle outer diameter) is not particularly limited, but is 0.02 to 250 μm, preferably 0.03 to 0. .4 μm, and more preferably 0.05 to 0.2 μm (50 to 200 nm).
The drug carrier of the present invention may further contain a pharmaceutically acceptable stabilizer and / or antioxidant depending on the route of administration. The stabilizer is not particularly limited, and examples thereof include saccharides such as glycerol and sucrose. Antioxidants include, but are not limited to, ascorbic acid, uric acid or tocopherol analogues such as vitamin E. Tocopherol has four isomers, α, β, γ, and δ, and any of them can be used in the present invention.
The pharmaceutical carrier of the present invention may further contain a pharmaceutically acceptable additive depending on the administration route. Examples of such additives include water, saline, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, sodium alginate, water soluble Dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, gelatin, agar, diglycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin (HSA), Mannitol, sorbitol, lactose, PBS, biodegradable polymer, serum-free medium, surfactants acceptable as pharmaceutical additives There is like a buffer at physiological pH acceptable in vivo.
The additive is appropriately selected from the above depending on the dosage form, or a combination thereof is used, but is not limited thereto.
In the present invention, the drug carrier of an embodiment containing these additives can be provided as a pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition of the present invention can be stored in a conventional manner, for example, refrigerated at 0-8 ° C.
The drug carrier of the present invention can be obtained by a conventional method. As an example of the drug carrier, a production method in the case of liposome is shown below, but is not limited thereto.
In the flask, phospholipids and cholesterols, and if necessary, other carrier membrane components are mixed with an organic solvent such as chloroform, and the organic solvent is distilled off, followed by vacuum drying to form a thin film on the inner wall of the flask. Let it form. Next, a drug is added to the flask and vigorously stirred to obtain a liposome dispersion. The obtained liposome dispersion is centrifuged, and the supernatant is decanted to remove the unencapsulated drug, whereby a drug carrier can be obtained as a dispersion.
In addition to the above methods, liposomes can also be obtained by mixing the above-described components and discharging them at high pressure with a high-pressure discharge type emulsifier (Terada, Yoshimura et al., “Liposomes in Life Science” Springer Fairlark. Tokyo (1992)).
A pH gradient method can be used to encapsulate the drug in a carrier (Edited by G. Gregoriadis, “Liposome Technology Liposome Preparation and Related Technologies”, 2nd edition, Vol. I-III, CRC Press).
In addition, description of each said literature shall be described in this specification by quoting this.
In addition, a drug carrier containing a substance in which PEG-PE is bound to a lipid membrane in a lipid bilayer can be obtained by the following method, but is not limited thereto. Liposome-forming lipids and PEG-PE may be mixed uniformly in advance to form liposomes, or liposomes may be formed by conventional methods using mixed lipids obtained by mixing liposome-forming lipids that do not contain PEG-PE. After that, PEG-PE may be added.
By purifying the drug carrier of the present invention by a commonly used method such as gel filtration, dialysis, membrane separation, and centrifugation, the drug that is not encapsulated in the drug carrier can be removed. The drug carrier is provided through a step for removing the drug that has not been encapsulated. Therefore, a concentration gradient of the drug can occur between the inside of the drug carrier and the outside of the drug carrier via the lipid bilayer (membrane). Preferably, the drug carrier of the present invention does not have the drug not encapsulated in the lipid bilayer outside the lipid bilayer after preparation. Then, the drug enclosed in the drug carrier is released from the inside to the outside environment.
The “encapsulation rate” means that a carrier component and gemcitabine and / or a salt thereof are mixed to form a drug carrier in which the carrier is encapsulated, and the encapsulated drug (preparation amount) is encapsulated in the carrier. The ratio of drug (weight ratio or mol ratio).
The drug carrier of the present invention reaches the target site in a state where the drug is encapsulated, and as a result, delivers the encapsulated drug to the target site. Delivery of the drug to the target site may be by incorporating the drug encapsulated in the carrier into the target site, or by affecting the drug at or near the target site without being incorporated into the target site. There may be.
In the present invention, “release” means that the drug encapsulated in the drug carrier passes outside the closed vesicle by passing through the lipid membrane constituting the drug carrier or by changing the structure of a part of the lipid membrane. It means to come.
“Release rate” refers to the ratio (weight ratio or mol) of a drug that comes out of a closed vesicle from a drug carrier encapsulating a carrier component and gemcitabine and / or a salt thereof and the drug encapsulated in the carrier. Ratio).
“Low release rate” means that a small amount of drug comes out of the closed vesicle per unit time. The drug carrier of the present invention exhibits a suitable release rate by containing cholesterol as a membrane constituent in a specific ratio. When a drug carrier is administered to a host, particularly when it is locally administered to a target site, a favorable effect is expected by making cholesterols in the above range.
As shown in the Examples, when the release rate of the encapsulated drug was measured for the drug carrier of the present invention, a low release rate was observed. The release rate can be calculated by precipitating the drug carrier of the present invention by centrifugation and measuring the amount of drug present in the supernatant and the drug carrier.
In the present invention, “retention in blood” means the property that a drug encapsulated in a carrier is present in the blood in a host administered with the drug carrier. When the drug is released from the carrier, it quickly disappears from the blood and acts on the exposed site of the drug. When the retention in blood is good, a smaller amount of drug can be administered. The drug carrier of the present invention exhibits suitable retention in blood by containing cholesterol as a membrane constituent in a specific ratio.
In the present invention, the “target site” is a specific site where the drug (gemcitabine) encapsulated by the drug carrier acts and means a cell, tissue, organ or organ specified for each site and the inside thereof. To do. Target sites such as cells, tissues, organs or organs and their interior can be sites to be treated with drugs, and the effect is exerted upon exposure of the released drug.
Although it does not specifically limit as a target site | part in this invention, A tumor is mentioned. The tumor to be treated is not particularly limited but is a solid tumor, specifically, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, laryngeal cancer, lung cancer, prostate cancer, bladder cancer, breast cancer, uterus Cancer or ovarian cancer. Target sites include tumor cells, tissues, organs or organs and their interiors. Therefore, in the present invention, the disease means the above-mentioned tumor, and the drug is expected to show an antitumor effect against them.
In the present invention, “exposure” means that the drug released to the outside of the drug carrier has an effect on the external environment. Specifically, the released drug (gemcitabine) exhibits an antitumor effect, which is its action, by approaching and contacting the target site. When the drug acts on the target site, it acts locally on the cells in the cell cycle where DNA synthesis of the target site is performed, and shows the expected effect. In order to exhibit such an effect, it is necessary to maintain a balance between the drug release rate from the drug carrier and the blood retention of the drug carrier.
The drug carrier of the present invention is used to release gemcitabine and / or its salt at a preferred release rate to expose the desired target site. Therefore, in the present invention, an effective amount of gemcitabine and / or in the host for the prevention and / or treatment of host diseases by administering to the host a pharmaceutical carrier encapsulating an effective amount of gemcitabine and / or a salt thereof. The host (patient) can be parenterally administered systemically or locally to release the salt or to expose an effective amount of gemcitabine and / or the salt to the target site. Examples of the host to be administered include mammals, preferably humans, monkeys, mice, livestock and the like.
As the parenteral route of administration, for example, intravenous injection (intravenous injection) such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, or subcutaneous injection can be selected, and an appropriate administration method is selected depending on the age and symptoms of the patient. be able to. The pharmaceutical carrier of the present invention is administered to a patient already suffering from a disease in an amount sufficient to cure or at least partially block the symptoms of the disease. For example, the effective dose of the drug enclosed in the drug carrier is selected in the range of 0.01 mg to 100 mg per kg body weight per day. However, the pharmaceutical carrier of the present invention is not limited to these dosages. The administration time may be administered after the disease has occurred, or may be administered prophylactically to relieve symptoms at the time of onset when the onset of the disease is predicted. The administration period can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
As a specific administration method, the pharmaceutical composition can be administered by syringe or infusion. Further, the catheter is inserted into the body of the patient or host, for example, into a lumen, for example, into a blood vessel, and the tip thereof is guided to the vicinity of the target site. It is also possible to administer from the site where is expected.

次に実施例および試験例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例および試験例に限定されるものではない。
以下の各実施例では、薬剤として塩酸ゲムシタビンを封入したいくつかの種類のリポソームを調製した。
［実施例１および比較例１］
＜混合脂質の調製＞
水素添加大豆レシチン（ＨＳＰＣ、分子量：７９０）（Ｌｉｐｏｉｄ社）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ、分子量３８６．６５）（Ｓｏｌｖａｙ社）を、表１に示す所定量秤量し、６０℃で加温したｔ−ブタノール（関東化学）２５ｍｌに溶解させた後氷冷し、凍結乾燥することで、表１に示す組成の混合脂質を調製した。
＜塩酸ゲムシタビン内封リポソームの調製＞
得られた混合脂質に、６７℃に加温した塩酸ゲムシタビン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ社）／リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（２０ｍｇ／ｍｌ）を１０ｍｌ加え、充分膨潤させた。ボルテックスミキサーにて攪拌し、６７℃で、押出機（Ｔｈｅ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ Ｔ．１０、Ｌｉｐｅｘ ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ Ｉｎｃ．）に取り付けたフィルター（孔径０．４μｍ×３回、０．２μｍ×５回、０．１μｍ×１０回）（Ｗｈａｔｍａｎ社）を順次通過させ、リポソームを調製した。
このリポソームに、総脂質量の０．７５ｍｏｌ％に相当する表面修飾剤としてポリエチレングリコール（分子量５０００）−フォスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ、分子量５９３８）（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）（生食溶液：３６．７４ｍｇ／ｍｌ）を１．２１ｍｌ加え、６０℃で３０分加温することによりＰＥＧ−ＰＥを導入した。ゲル濾過で未封入の塩酸ゲムシタビンを除去した。
上記で調製した塩酸ゲムシタビン内封リポソームについて求めた総脂質組成、脂質成分比、薬剤濃度、総脂質、薬剤／脂質比および秤量値、さらに以下のように測定した粒子径を一覧にして表１に示す。
なお以下の表１〜６中、
「脂質成分比」は、脂質（以下の実施例では、リン脂質類およびコレステロール類）のモル比で示す。
「総脂質組成」は、下記の「総脂質」の組成をモル比で示す。
「総脂質」は、脂質またはカチオン化脂質膜の場合には表面修飾剤のカチオン化剤を含む脂質の総量をモル濃度（ｍＭ）で示す。ただし、表面修飾剤のうち、ＰＥＧ誘導体（たとえばＰＥＧ−ＰＥ）は、この総脂質には含まれない。
「薬剤濃度」は、薬剤担体分散液中の塩酸ゲムシタビン濃度である。
「薬剤／脂質比」は、上記総脂質濃度と、リポソームに内封された塩酸ゲムシタビンの濃度とのモル比である。
「粒子径」とは、薬剤担体を粒度分布計（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ３０００ＨＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）にて測定して得られた平均粒子径を意味する。

（試験例１）
＜３７℃緩衝液中での安定性＞
実施例１および比較例１で調製した塩酸ゲムシタビン内封リポソームを、当量のリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に希釈し、３７℃で、１、２および７日間加温した。加温終了後のリン酸緩衝液中のリポソームに、生理食塩水を加えて４倍希釈した後、超遠心（１×１０^５ｇ、２時間、１０℃）をかけ、塩酸ゲムシタビンを内封するリポソームを沈降させた。上清中に存在する塩酸ゲムシタビン量を定量することでリポソームからの薬剤放出率（％）を算出した。結果を図１に示す。
（試験例２）
＜３７℃緩衝液中、１０％ウシ胎児血清存在下での安定性＞
上記塩酸ゲムシタビン内封リポソームを希釈するリン酸緩衝液を、１０％ウシ胎児血清（Ｔｒａｃｅ社）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に代えた以外は、試験例１と同様にして安定性試験を行い、上清中に存在する塩酸ゲムシタビン量を定量し、薬剤放出率（％）を算出した。結果を図２に示す。
上記各試験の結果、薬剤（塩酸ゲムシタビン）の放出率は、リン酸緩衝液中および１０％ウシ胎児血清を含むリン酸緩衝液中のいずれの場合においても、Ｃｈｏｌ比率の低い実施例１のリポソーム（ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ＝７４：２６）の方が、Ｃｈｏｌ比率の高い比較例１のリポソーム（ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ＝５４：４６）よりも、薬剤放出率が低かった。
［実施例２および比較例２］
＜カチオン化脂質を含む混合脂質の調製＞
３，５−ジペンタデシロキシベンズアミジン塩酸塩（カチオン化脂質）（ＴＲＸ−２０、分子量６０９．４１）（合成方法はＷＯ９７／４２１６６の記載に準拠）、水素添加大豆レシチン（ＨＳＰＣ、分子量：７９０）（Ｌｉｐｏｉｄ社）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）（Ｓｏｌｖａｙ社）を表２に示す所定量秤量し、６０℃で加温したｔ−ブタノール（関東化学）２５ｍｌに溶解させた後氷冷し、凍結乾燥することで、表２に示す組成の混合脂質（カチオン化脂質を含む）を調製した。
＜塩酸ゲムシタビン内封リポソームの調製＞
上記で得られた混合脂質（カチオン化脂質を含む）を用いた以外は、実施例１と同様にして塩酸ゲムシタビン内封リポソームを調製した。
上記で調製した塩酸ゲムシタビン内封リポソームについて求めた総脂質組成、脂質成分比、薬剤濃度、総脂質、薬剤／脂質比および秤量値、さらに以下のように測定した粒子径を一覧にして表２に示す。

［実施例３および比較例３］
＜カチオン化脂質を含む混合脂質の調製＞
３，５−ジペンタデシロキシベンズアミジン塩酸塩（ＴＲＸ−２０、分子量６０９．４１）、ジステアロイルフォスファチジルコリン（ＤＳＰＣ、分子量７９０．２）（日本油脂）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）（Ｓｏｌｖａｙ社）を表３に示す所定量秤量し、６０℃で加温したｔ−ブタノール（関東化学）２５ｍｌに溶解させた後氷冷し、凍結乾燥することで、表３に示す組成の混合脂質（カチオン化脂質を含む）を調製した。
＜塩酸ゲムシタビン内封リポソームの調製＞
上記で得られた混合脂質（カチオン化脂質を含む）を用いた以外は、実施例１と同様にして塩酸ゲムシタビン内封リポソームを調製した。
上記で調製した塩酸ゲムシタビン内封リポソームについて求めた総脂質組成、脂質成分比、薬剤濃度、総脂質、薬剤／脂質比および秤量値、さらに以下のように測定した粒子径を一覧にして表３に示す。

（試験例３）
＜３７℃緩衝液中での安定性＞
実施例２〜３および比較例２〜３で調製した塩酸ゲムシタビン内封リポソームを、前記試験例２＜３７℃緩衝液中での安定性＞と同様にして安定性試験を行い、上清中に存在する塩酸ゲムシタビン量を定量し、薬剤放出率（％）を算出した。結果を図３に示す。
その結果、３，５−ジペンタデシロキシベンズアミジン塩酸塩（ＴＲＸ−２０）を８ｍｏｌ％の量で含有させ、カチオン化脂質を含むリポソームにおいても、Ｃｈｏｌ比率の低下により、内封させた塩酸ゲムシタビン薬剤の放出率が低下することが確認された。
このことはリン脂質の種類にかかわらず、ＨＳＰＣ、ＤＳＰＣいずれにおいても同様の結果が得られた。
［実施例４および比較例４］
＜カチオン化脂質を含む混合脂質の調製＞
３，５−ジペンタデシロキシベンズアミジン塩酸塩（ＴＲＸ−２０）、水素添加大豆レシチン（ＨＳＰＣ）、およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）を、表４に示す所定量秤量した以外は、実施例２と同様にして、表４に示す組成の混合脂質（カチオン化脂質を含む）を調製した。
＜塩酸ゲムシタビン内封リポソームの調製＞
上記で得られた混合脂質（カチオン化脂質を含む）を用い、表４に示す塩酸ゲムシタビンの薬剤濃度とした以外は、実施例１と同様にして塩酸ゲムシタビン内封リポソームを調製した。
上記で調製した塩酸ゲムシタビン内封リポソームについて求めた総脂質組成、脂質成分比、薬剤濃度、総脂質、薬剤／脂質比および秤量値、さらに以下のように測定した粒子径を一覧にして表４に示す。

（試験例４）
＜３７℃緩衝液中での安定性＞
実施例４および比較例４で調製した塩酸ゲムシタビン内封リポソームを、前記試験例１と同様にして３７℃緩衝液中での安定性試験を行い、上清中に存在する塩酸ゲムシタビン量を定量し、薬剤放出率（％）を算出した。結果を図４に示す。
（試験例５）
＜３７℃緩衝液中、１０％ウシ胎児血清存在下での安定性＞
実施例４および比較例４で調製した塩酸ゲムシタビン内封リポソームを、前記試験例２と同様にして３７℃緩衝液中、１０％ウシ胎児血清存在下での安定性試験を行い、上清中に存在する塩酸ゲムシタビン量を定量し、薬剤放出率（％）を算出した。結果を図５に示す。
脂質組成のリポソームからの薬剤放出率は、緩衝液中においてＣｈｏｌ比率が低下するに従って低下することが確認された。
１０％ウシ胎児血清を含むリン酸緩衝液中の薬剤放出率も、Ｃｈｏｌ比率の低下に伴い低下した。この試験では、Ｃｈｏｌ比率０ｍｏｌ％（含まない）リポソームは増加の傾向が認められたため、塩酸ゲムシタビンを内封するリポソーム脂質膜構成成分中のコレステロールの含有比率を０〜３５ｍｏｌ％未満（＝３４．７８ｍｏｌ％以下）としたことにより、薬剤担体からの塩酸ゲムシタビンの放出率を抑えられることが明らかになった。
［実施例５および比較例５］
＜ローダミンＤＨＰＥを含む混合脂質（カチオン化脂質を含む）の調製＞
３，５−ジペンタデシロキシベンズアミジン塩酸塩（ＴＲＸ−２０）、水素添加大豆レシチン（ＨＳＰＣ）、およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）を、表５に示す所定量秤量し、さらにローダミンジヘキサデカノイルフォスファチジルエタノールアミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＤＨＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）２．５ｍｇを加えた。６０℃で加温したｔ−ブタノール（関東化学）２５ｍｌに溶解させた後氷冷し、凍結乾燥することで、表５に示す組成の混合脂質（カチオン化脂質を含む）を調製した。
＜塩酸ゲムシタビン内封リポソームの調製＞
上記で得られた混合脂質（カチオン化脂質を含む）を用い、表５に示す塩酸ゲムシタビンの薬剤濃度とした以外は、実施例１と同様にして塩酸ゲムシタビン内封リポソームを調製した。
上記で調製した塩酸ゲムシタビン内封リポソームについて求めた総脂質組成、脂質成分比、薬剤濃度、総脂質、薬剤／脂質比および秤量値、さらに以下のように測定した粒子径を一覧にして表５に示す。

（試験例６）
＜薬剤担体の血中滞留性＞
実施例５および比較例５で調製した塩酸ゲムシタビン内封リポソームをマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌，５週齢、日本クレア社）に、塩酸ゲムシタビン量として３ｍｇ／ｋｇ（ゲムシタビン量として２．６３ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈注射した。注射後、１、６、２４時間後に採血し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ，１５分、１０℃）し、血漿を採取した。
各血漿中の薬剤担体に含まれるゲムシタビン濃度を、高速液体クロマトグラフィー法（Ｋ．Ｂ．Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ６６５（１９９５）１７１−１８１に準拠。なおここにある記載の引用により本明細書に記載されているものとする）にて測定した（以下、ゲムシタビン濃度は、血漿中の薬剤担体に含まれるゲムシタビン濃度である）。
結果を図６に示す。
表５に示す脂質組成のリポソームを尾静脈注射した際の血漿中のゲムシタビン濃度は投与後１、６時間においては、Ｃｈｏｌ比率が低下するに従って低下することが確認された。
Ｃｈｏｌ比率が０ｍｏｌ％、１２ｍｏｌ％のリポソームは、注射後１時間において、血漿中のゲムシタビン濃度が低く、速やかに血中より消失していることがわかった。
Ｃｈｏｌ比率が２２ｍｏｌ％〜４２ｍｏｌ％のリポソームは、投与後２４時間の血漿中の塩酸ゲムシタビン濃度に顕著な差は認められなかった。
［実施例６］
＜ローダミンＤＨＰＥを含むカチオン化脂質を含む混合脂質の調製＞
３，５−ジペンタデシロキシベンズアミジン塩酸塩（ＴＲＸ−２０）０．０５ｇ、水素添加大豆レシチン（ＨＳＰＣ）０．５５ｇ、およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）０．０８ｇ、ローダミンジヘキサデカノイルフォスファチジルエタノールアミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＤＨＰＥ）２．５ｍｇを、６０℃で加温したｔ−ブタノール（関東化学）２５ｍｌに溶解させた後氷冷し、凍結乾燥することで、表６に示す組成の混合脂質（カチオン化脂質を含む）を調製した。
＜ＰＥＧ−ＰＥ量の異なる塩酸ゲムシタビン内封リポソームの調製＞
上記で得られた混合脂質（カチオン化脂質を含む）を用い、リポソームに加えるＰＥＧ−ＰＥ（表面修飾剤）の生食溶液（３６．７４ｍｇ／ｍｌ）量を、総脂質量の０．７５ｍｏｌ％、１．０ｍｏｌ％、１．５ｍｏｌ％に相当する０．６０、０．８１、１．２２ｍｌとした以外は、実施例１と同様にして、塩酸ゲムシタビン内封リポソームを調製した。
上記で調製した塩酸ゲムシタビン内封リポソームについて求めた総脂質組成、脂質成分比、薬剤濃度、総脂質、薬剤／脂質比および秤量値、さらに以下のように測定した粒子径を一覧にして表６に示す。

（試験例７）
＜ＰＥＧ導入率と血中滞留性＞
実施例６で調製したリポソームをマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌，５週齢、日本チャールス）に塩酸ゲムシタビン量として３ｍｇ／ｋｇを尾静脈注射した。注射後、１、６、２４時間後に採血し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ，１５分、１０℃）し、血漿を採取した。各血漿中のゲムシタビン濃度を、高速液体クロマトグラフィー法（試験例６と同様）にて測定した。結果を図７に示す。
その結果、表６に示すようなＣｈｏｌ比率２４ｍｏｌ％の脂質組成で、ＰＥＧ−ＰＥ導入比率の異なるリポソームを尾静脈注射した際の血漿中のゲムシタビン濃度は、投与後２４時間では、ＰＥＧ−ＰＥ導入比率の違いにより血漿中のゲムシタビン濃度に顕著な差は認められなかったが、投与後１、６時間において、ＰＥＧ−ＰＥ導入比率が高いほど高値であった。
すなわちＣｈｏｌ比率２４ｍｏｌ％の薬剤担体であっても、ＰＥＧ−ＰＥ導入比率が高いと、血中の薬剤担体に含まれる塩酸ゲムシタビン濃度が高値を示し、血中滞留性が向上したことを示す。このことから、Ｃｈｏｌ比率が本発明範囲であっても、ＰＥＧ−ＰＥ導入比率を上げることが望ましい。
以上のことから、上記の実施例の範囲において、放出率と血中滞留性について下記表に示すように次のことが明らかとなった。コレステロール類の含有比率が低くなるに従い、塩酸ゲムシタビンの薬剤担体からの放出を抑えることができるが、一方で、血中滞留性が低下する。また、コレステロール類の含有比率が高くなるに従い、塩酸ゲムシタビンの薬剤担体の血中滞留性は向上するが、一方で、塩酸ゲムシタビンの薬剤担体からの放出を抑えることが困難となる。コレステロール類の含有比率が低い場合でもＰＥＧ−ＰＥ導入比率を上げることで血中滞留性は向上する。

EXAMPLES Next, although an Example and a test example are given and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to these Examples and a test example.
In each of the following examples, several types of liposomes encapsulating gemcitabine hydrochloride as a drug were prepared.
[Example 1 and Comparative Example 1]
<Preparation of mixed lipid>
Hydrogenated soybean lecithin (HSPC, molecular weight: 790) (Lipoid) and cholesterol (Chol, molecular weight 386.65) (Solvay) were weighed in predetermined amounts shown in Table 1 and heated at 60 ° C. (t-butanol) Kanto Chemical Co., Ltd.) After dissolving in 25 ml, the mixture was ice-cooled and freeze-dried to prepare mixed lipids having the composition shown in Table 1.
<Preparation of gemcitabine hydrochloride encapsulated liposome>
To the obtained mixed lipid, 10 ml of gemcitabine hydrochloride (Eli Lilly) / phosphate buffer (pH 7.4) (20 mg / ml) heated to 67 ° C. was added and allowed to swell sufficiently. Stir in a vortex mixer, and at 67 ° C., filter (pore size 0.4 μm × 3 times, 0.2 μm × 5 times, 0.1 μm × 10 times) attached to an extruder (The Extruder T.10, Lipex biomembranes Inc.). Times) (Whatman) was passed sequentially to prepare liposomes.
Polyethylene glycol (molecular weight 5000) -phosphatidylethanolamine (PEG-PE, molecular weight 5938) (Genzyme) (saline solution: 36.74 mg) as a surface modifier corresponding to 0.75 mol% of the total lipid amount. / Ml) was added and PEG-PE was introduced by heating at 60 ° C. for 30 minutes. Unencapsulated gemcitabine hydrochloride was removed by gel filtration.
Table 1 lists the total lipid composition, lipid component ratio, drug concentration, total lipid, drug / lipid ratio and weighed value obtained for the gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposome prepared above, and the particle diameter measured as follows. Show.
In Tables 1 to 6 below,
The “lipid component ratio” is represented by a molar ratio of lipids (phospholipids and cholesterols in the following examples).
“Total lipid composition” indicates the composition of the following “total lipid” in molar ratio.
“Total lipid” indicates the total amount of lipid including the cationizing agent of the surface modifying agent in the case of lipid or a cationized lipid membrane in molar concentration (mM). However, among the surface modifiers, PEG derivatives (for example, PEG-PE) are not included in this total lipid.
“Drug concentration” is the concentration of gemcitabine hydrochloride in the drug carrier dispersion.
The “drug / lipid ratio” is the molar ratio between the total lipid concentration and the concentration of gemcitabine hydrochloride encapsulated in liposomes.
“Particle size” means an average particle size obtained by measuring a drug carrier with a particle size distribution meter (Zetasizer 3000HS, Malvern Instruments).

(Test Example 1)
<Stability in 37 ° C buffer>
Gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposomes prepared in Example 1 and Comparative Example 1 were diluted in an equivalent amount of phosphate buffer (pH 7.4) and heated at 37 ° C. for 1, 2 and 7 days. After completion of heating, the physiological saline is added to the liposomes in the phosphate buffer solution to dilute 4 times, and then ultracentrifugation (1 × 10 ⁵ g, 2 hours, 10 ° C.) is applied to enclose gemcitabine hydrochloride. Liposomes were allowed to settle. The drug release rate (%) from the liposomes was calculated by quantifying the amount of gemcitabine hydrochloride present in the supernatant. The results are shown in FIG.
(Test Example 2)
<Stability in 37 ° C. buffer in the presence of 10% fetal bovine serum>
Stability is the same as in Test Example 1 except that the phosphate buffer for diluting the gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposome is replaced with a phosphate buffer (pH 7.4) containing 10% fetal calf serum (Trace). Tests were conducted, the amount of gemcitabine hydrochloride present in the supernatant was quantified, and the drug release rate (%) was calculated. The results are shown in FIG.
As a result of each of the above tests, the release rate of the drug (gemcitabine hydrochloride) was the liposome of Example 1 having a low chol ratio in both the phosphate buffer and the phosphate buffer containing 10% fetal calf serum. The drug release rate was lower in (HSPC: Chol = 74: 26) than in the liposome of Comparative Example 1 having a higher Chol ratio (HSPC: Chol = 54: 46).
[Example 2 and Comparative Example 2]
<Preparation of mixed lipid containing cationized lipid>
3,5-dipentadecyloxybenzamidine hydrochloride (cationized lipid) (TRX-20, molecular weight 609.41) (the synthesis method is based on the description of WO97 / 42166), hydrogenated soybean lecithin (HSPC, molecular weight: 790) ) (Lipoid) and cholesterol (Chol) (Solvay) were weighed in the prescribed amounts shown in Table 2, dissolved in 25 ml of t-butanol (Kanto Chemical) heated at 60 ° C., then ice-cooled and freeze-dried. Thus, mixed lipids (including cationized lipids) having the composition shown in Table 2 were prepared.
<Preparation of gemcitabine hydrochloride encapsulated liposome>
Gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposomes were prepared in the same manner as in Example 1 except that the mixed lipid (including cationized lipid) obtained above was used.
Table 2 lists the total lipid composition, lipid component ratio, drug concentration, total lipid, drug / lipid ratio and weighed value obtained for gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposomes prepared above, and the particle diameter measured as follows. Show.

[Example 3 and Comparative Example 3]
<Preparation of mixed lipid containing cationized lipid>
3,5-dipentadecyloxybenzamidine hydrochloride (TRX-20, molecular weight 609.41), distearoylphosphatidylcholine (DSPC, molecular weight 790.2) (Japanese oil) and cholesterol (Chol) (Solvay) Were weighed in a predetermined amount as shown in Table 3 and dissolved in 25 ml of t-butanol (Kanto Chemical) heated at 60 ° C., then ice-cooled and freeze-dried to obtain a mixed lipid (cationized) having the composition shown in Table 3 Containing lipids).
<Preparation of gemcitabine hydrochloride encapsulated liposome>
Gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposomes were prepared in the same manner as in Example 1 except that the mixed lipid (including cationized lipid) obtained above was used.
Table 3 lists the total lipid composition, lipid component ratio, drug concentration, total lipid, drug / lipid ratio and weighed value obtained for gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposomes prepared above, and the particle diameter measured as follows. Show.

(Test Example 3)
<Stability in 37 ° C buffer>
The gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposomes prepared in Examples 2-3 and Comparative Examples 2-3 were subjected to a stability test in the same manner as in Test Example 2 <Stability in 37 ° C. Buffer>, The amount of gemcitabine hydrochloride present was quantified, and the drug release rate (%) was calculated. The results are shown in FIG.
As a result, 3,5-dipentadecyloxybenzamidine hydrochloride (TRX-20) was contained in an amount of 8 mol%, and in the liposome containing the cationized lipid, the encapsulated gemcitabine hydrochloride was reduced due to a decrease in the chol ratio. It was confirmed that the drug release rate decreased.
The same result was obtained for both HSPC and DSPC regardless of the type of phospholipid.
[Example 4 and Comparative Example 4]
<Preparation of mixed lipid containing cationized lipid>
3,5-dipentadecyloxybenzamidine hydrochloride (TRX-20), hydrogenated soybean lecithin (HSPC), and cholesterol (Chol) were measured in the same manner as in Example 2 except that predetermined amounts shown in Table 4 were weighed. Thus, mixed lipids (including cationized lipids) having the compositions shown in Table 4 were prepared.
<Preparation of gemcitabine hydrochloride encapsulated liposome>
Gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposomes were prepared in the same manner as in Example 1 except that the mixed lipid (including cationized lipid) obtained above was used and the drug concentration of gemcitabine hydrochloride shown in Table 4 was used.
Table 4 lists the total lipid composition, lipid component ratio, drug concentration, total lipid, drug / lipid ratio and weighed value obtained for gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposomes prepared above, and the particle diameters measured as follows. Show.

(Test Example 4)
<Stability in 37 ° C buffer>
The gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposomes prepared in Example 4 and Comparative Example 4 were subjected to a stability test in a 37 ° C. buffer solution in the same manner as in Test Example 1 to determine the amount of gemcitabine hydrochloride present in the supernatant. The drug release rate (%) was calculated. The results are shown in FIG.
(Test Example 5)
<Stability in 37 ° C. buffer in the presence of 10% fetal bovine serum>
The gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposomes prepared in Example 4 and Comparative Example 4 were subjected to a stability test in the presence of 10% fetal calf serum in a 37 ° C. buffer solution in the same manner as in Test Example 2, and the supernatant was added to the supernatant. The amount of gemcitabine hydrochloride present was quantified, and the drug release rate (%) was calculated. The results are shown in FIG.
It was confirmed that the drug release rate from the liposome having a lipid composition decreases as the chol ratio decreases in the buffer solution.
The drug release rate in phosphate buffer containing 10% fetal bovine serum also decreased with a decrease in the chol ratio. In this test, since the chol ratio 0 mol% (not including) liposomes tended to increase, the content ratio of cholesterol in the liposomal lipid membrane constituent encapsulating gemcitabine hydrochloride was less than 0 to 35 mol% (= 34.78 mol). % Or less), it became clear that the release rate of gemcitabine hydrochloride from the drug carrier can be suppressed.
[Example 5 and Comparative Example 5]
<Preparation of mixed lipid containing rhodamine DHPE (including cationized lipid)>
3,5-dipentadecyloxybenzamidine hydrochloride (TRX-20), hydrogenated soybean lecithin (HSPC), and cholesterol (Chol) were weighed in predetermined amounts as shown in Table 5, and rhodamine dihexadecanoyl phosphati. 2.5 mg of diethanolamine (Rhodamine DHPE) (Molecular Probes) was added. After dissolving in 25 ml of t-butanol (Kanto Chemical) heated at 60 ° C., the mixture was ice-cooled and freeze-dried to prepare mixed lipids (including cationized lipids) having the composition shown in Table 5.
<Preparation of gemcitabine hydrochloride encapsulated liposome>
Gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposomes were prepared in the same manner as in Example 1 except that the mixed lipid (including cationized lipid) obtained above was used and the drug concentration of gemcitabine hydrochloride shown in Table 5 was used.
Table 5 lists the total lipid composition, lipid component ratio, drug concentration, total lipid, drug / lipid ratio and weighed value obtained for the gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposome prepared above, and the particle diameter measured as follows. Show.

(Test Example 6)
<Retention of drug carrier in blood>
Gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposomes prepared in Example 5 and Comparative Example 5 were given to mice (BALB / c, female, 5 weeks old, CLEA Japan) as a gemcitabine hydrochloride amount of 3 mg / kg (gecitabine amount of 2.63 mg / kg). ) Was injected into the tail vein. 1, 6, and 24 hours after injection, blood was collected, centrifuged (3,000 rpm, 15 minutes, 10 ° C.), and plasma was collected.
The concentration of gemcitabine contained in the drug carrier in each plasma is based on the high performance liquid chromatography method (KB Freeman et. Al. J. Chromatogr. B 665 (1995) 171-181. (Hereinafter, gemcitabine concentration is the concentration of gemcitabine contained in a drug carrier in plasma).
The results are shown in FIG.
It was confirmed that the gemcitabine concentration in plasma when liposomes having the lipid composition shown in Table 5 were injected into the tail vein decreased as the Chol ratio decreased in 1 and 6 hours after administration.
It was found that liposomes having a chol ratio of 0 mol% and 12 mol% had a low plasma gemcitabine concentration and disappeared rapidly from the blood 1 hour after injection.
Liposomes with a chol ratio of 22 mol% to 42 mol% showed no significant difference in the concentration of gemcitabine hydrochloride in plasma 24 hours after administration.
[Example 6]
<Preparation of mixed lipid containing cationized lipid containing rhodamine DHPE>
3,5-dipentadecyloxybenzamidine hydrochloride (TRX-20) 0.05 g, hydrogenated soybean lecithin (HSPC) 0.55 g, and cholesterol (Chol) 0.08 g, rhodamine dihexadecanoylphosphatidylethanol 2.5 mg of amine (Rhodamine DHPE) was dissolved in 25 ml of t-butanol (Kanto Chemical) heated at 60 ° C., then ice-cooled and freeze-dried to obtain a mixed lipid (cationization) having the composition shown in Table 6 Containing lipids).
<Preparation of Gemcitabine Hydrochloride-Encapsulated Liposomes with Different PEG-PE Amounts>
Using the mixed lipid (including cationized lipid) obtained above, the amount of PEG-PE (surface modifier) saline solution (36.74 mg / ml) added to the liposomes was adjusted to 0.75 mol% of the total lipid amount, Gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposomes were prepared in the same manner as in Example 1 except that 0.60, 0.81, and 1.22 ml corresponding to 1.0 mol% and 1.5 mol% were used.
Table 6 lists the total lipid composition, lipid component ratio, drug concentration, total lipid, drug / lipid ratio and weighed value obtained for the gemcitabine hydrochloride-encapsulated liposome prepared above, and the particle diameter measured as follows. Show.

(Test Example 7)
<PEG introduction rate and blood retention>
The liposome prepared in Example 6 was injected into mice (BALB / c, female, 5 weeks old, Charles, Japan) via the tail vein at 3 mg / kg as gemcitabine hydrochloride. 1, 6, and 24 hours after injection, blood was collected, centrifuged (3,000 rpm, 15 minutes, 10 ° C.), and plasma was collected. The concentration of gemcitabine in each plasma was measured by a high performance liquid chromatography method (same as in Test Example 6). The results are shown in FIG.
As a result, the concentration of gemcitabine in the plasma when a liposome having a chol ratio of 24 mol% as shown in Table 6 and a PEG-PE introduction ratio with different PEG-PE introduction ratios was injected into the tail vein was 24 hours after administration. Although no significant difference was observed in the plasma gemcitabine concentration due to the difference in the ratio, the higher the PEG-PE introduction ratio, the higher the value at 1 and 6 hours after administration.
That is, even with a drug carrier having a chol ratio of 24 mol%, a high PEG-PE introduction ratio indicates that the concentration of gemcitabine hydrochloride contained in the drug carrier in the blood is high and the retention in blood is improved. Therefore, it is desirable to increase the PEG-PE introduction ratio even if the chol ratio is within the range of the present invention.
From the above, within the range of the above-mentioned examples, the followings were clarified with respect to the release rate and blood retention as shown in the following table. As the cholesterol content decreases, the release of gemcitabine hydrochloride from the drug carrier can be suppressed, but the retention in the blood decreases. Further, as the cholesterol content increases, the retention of gemcitabine hydrochloride in the drug carrier improves in the blood, but on the other hand, it becomes difficult to suppress the release of gemcitabine hydrochloride from the drug carrier. Even when the content ratio of cholesterols is low, the retention in blood is improved by increasing the PEG-PE introduction ratio.

本発明の薬剤担体は、本発明の範囲内の特定量でコレステロール類を含むリン脂質類からなる膜で形成される担体に、塩酸ゲムシタビンを封入することにより、塩酸ゲムシタビンの薬剤担体からの放出率を抑えることができる安定なゲムシタビン製剤を提供することが可能となった。すなわちゲムシタビンの放出速度を抑制することができ、長期にわたってゲムシタビンの局所濃度を維持し、その薬効を発揮することができる。  The drug carrier of the present invention has a release rate of gemcitabine hydrochloride from the drug carrier by encapsulating gemcitabine hydrochloride in a carrier formed of a membrane composed of phospholipids containing cholesterol in a specific amount within the scope of the present invention. It has become possible to provide a stable gemcitabine preparation capable of suppressing the above. That is, the release rate of gemcitabine can be suppressed, the local concentration of gemcitabine can be maintained over a long period of time, and its medicinal effect can be exhibited.

Claims (8)

膜で形成される担体であって、前記膜を構成する脂質成分として、リン脂質類とともに、コレステロール類を０〜３５ｍｏｌ％未満の比率で含む担体に、ゲムシタビンおよび／またはその塩を封入してなる薬剤担体。A carrier formed of a membrane, wherein gemcitabine and / or a salt thereof is encapsulated in a carrier containing cholesterol in a ratio of less than 0 to 35 mol% together with phospholipids as a lipid component constituting the membrane. Drug carrier. 前記コレステロール類の比率が１３〜３５ｍｏｌ％未満である請求項１に記載の薬剤担体。The drug carrier according to claim 1, wherein the ratio of the cholesterols is less than 13 to 35 mol%. 前記コレステロール類がコレステロールおよび／またはコレスタノールである請求項１または２に記載の薬剤担体。The drug carrier according to claim 1 or 2, wherein the cholesterol is cholesterol and / or cholestanol. 前記担体がリポソームである請求項１ないし３のいずれかに記載の薬剤担体。The drug carrier according to any one of claims 1 to 3, wherein the carrier is a liposome. 前記膜が、前記リン脂質類およびコレステロール類以外の脂質類、および表面修飾剤からなる群から選ばれる少なくとも一つの構成成分をさらに含有する請求項１ないし４のいずれかに記載の薬剤担体。The drug carrier according to any one of claims 1 to 4, wherein the membrane further contains at least one component selected from the group consisting of lipids other than the phospholipids and cholesterols, and a surface modifier. 前記表面修飾剤が、ポリエチレングリコール誘導体および／または荷電物質である請求項５に記載の薬剤担体。The drug carrier according to claim 5, wherein the surface modifier is a polyethylene glycol derivative and / or a charged substance. 前記薬剤担体が、安定化剤および酸化防止剤からなる群から選ばれる少なくとも一つをさらに含有する請求項１ないし６のいずれかに記載の薬剤担体。The drug carrier according to any one of claims 1 to 6, wherein the drug carrier further contains at least one selected from the group consisting of a stabilizer and an antioxidant. 請求項１ないし７のいずれかに記載の薬剤担体を含有する医薬組成物。A pharmaceutical composition comprising the drug carrier according to any one of claims 1 to 7.

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