JP2019100940A

JP2019100940A - 未分化細胞を高感度に検出および回収する方法

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Publication number: JP2019100940A
Application number: JP2017234141A
Authority: JP
Inventors: 太一松永; Taichi Matsunaga; 和樹飯嶋; Kazuki Iijima; 片山　晃治; Koji Katayama; 晃治片山
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2017-12-06
Filing date: 2017-12-06
Publication date: 2019-06-24

Abstract

【課題】試料中に含まれる未分化細胞を、単一状態かつ形状情報を含めた形で高感度に検出および回収する方法を提供すること。【解決手段】細胞を保持可能な１０６以上の保持部を有する基板に未分化細胞を含む試料及び前記未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質を導入し、当該標識タンパク質と試料中に含まれる未分化細胞との複合体を形成させた後、前記複合体中の標識に基づき、未分化細胞を検出することを特徴とする検出方法を提供する。【選択図】図５

Description

本発明は、試料中に含まれる未分化細胞を高感度に検出し、回収する方法に関する。

再生医療分野において、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの幹細胞から分化させることで組織を得ようとする場合、未分化の幹細胞はガン化のおそれがあるため、組織の基となる分化細胞を当該未分化の幹細胞を極力含まない状態で得る必要がある。

未分化細胞と分化細胞とを区別する方法として、蛍光顕微鏡を用いた方法（例えば、特許文献１参照）やフローサイトメーターを用いた方法（例えば、特許文献２参照）が従来より知られている。しかしながら、蛍光顕微鏡を用いた方法は凝集した細胞に対する検出感度が悪く、フローサイトメーターを用いた方法は単一に細胞を検出できるが、検出感度が１／１０^３であり、感度が低いという問題があった（例えば、非特許文献１参照）。

また、誘電泳動を用いて細胞を基板の微細孔部に落とし、整列させた場合、単一細胞として検出することができる（例えば、非特許文献２参照）。しかし、基板が有する微細孔数が約３０万個であり、検出細胞数に制限があり、高感度に検出することが困難であった。

国際公開２０１０／１０１２２５号国際公開２００６／１２６５７４号

Ｋｕｒｏｄａｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＯＮＥ．２０１２Ｍｏｒｉｍｏｔｏｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＯＮＥ．２０１５

本発明の課題は、試料中に含まれる未分化細胞を、単一状態かつ形状情報を含めた形で高感度に検出および回収する方法を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。

すなわち、本発明の第一の態様は、細胞を保持可能な１０^６以上の保持部を有する基板に未分化細胞を含む試料及び前記未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質を導入し、当該標識タンパク質と試料中に含まれる未分化細胞との複合体を形成させた後、前記複合体中の標識に基づき、未分化細胞を検出することを特徴とする検出方法である。
次に、本発明の第二の態様は、前記基板にある微細孔が三角格子状に配置されていることを特徴とする。
さらに、本発明の第三の態様は、未分化細胞を含む試料と前記未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質とを混合させ、前記複合体を形成させてから前記基板に導入することを特徴とする。
さらに、本発明の第四の態様は、前記基板への保持の際に誘電泳動力を利用することを特徴とする。
さらに、本発明の第五の態様は、前記標識タンパク質が、前記未分化細胞が有するタンパク質に対する標識抗体または標識レクチンであることを特徴とする。
さらに、本発明の第六の態様は、上述のいずれかの方法で検出された未分化細胞をノズルによる吸引吐出により回収することを特徴とする。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明において未分化細胞とは、分化細胞の一段階前の細胞のことをいい、一例として、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞などの幹細胞があげられる。ｉＰＳ細胞などの幹細胞のサイズは約１０μｍから２０μｍである。

本発明において未分化細胞が有するタンパク質は、未分化細胞の表面もしくは細胞内で発現し、かつ分化細胞では発現しないタンパク質または糖タンパク質のことをいい、対象となる未分化細胞／分化細胞に応じ適宜選択すればよい。例として、未分化細胞がヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞などの幹細胞である場合の、未分化細胞が有するタンパク質の好ましい一態様として、抗ＳＳＥＡ４抗体が認識する糖タンパクがあげられる。

本発明の方法で用いる、未分化細胞が有するタンパク質を認識するタンパク質は未分化細胞が有するタンパク質を認識する機能を有している限り、その態様に限定はなく、一例として未分化細胞が有するタンパク質に対する抗体や未分化細胞が有するタンパク質を認識するレクチンがあげられる。具体的には、未分化細胞が有するタンパク質に対する抗体である、抗Ｎａｎｏｇ抗体、抗Ｏｃｔ４抗体、抗ＴＲＡ−１６０抗体、抗ＴＲＡ−１８０抗体、抗ＳＳＥＡ３抗体、抗ＳＳＥＡ４抗体や、未分化細胞が有するタンパク質を認識するレクチンである、ＢＣ２ＬＣＮなどがあげられる。

本発明の一態様は、細胞を保持可能な保持部である微細孔が三角格子状に１０^６以上配置された基板と前記保持部に保持された細胞の中から目的とする細胞を検出する手段とを備えた装置を用いる。

本発明の検出方法としては、汎用性の点からタンパク質を認識する標識タンパク質（例えば、未分化細胞が有するタンパク質に対する標識抗体や標識レクチン）を用いる方法が一般的である。前記標識タンパク質中の標識物質は、抗原抗体反応を利用した測定の分野で通常用いられる物質の中から適宜選択すればよく、一例として、フルオレセイン等の蛍光物質や、アルカリホスファターゼ等の酵素、放射性物質があげられる。前記標識タンパク質におけるタンパク質と標識物質との結合態様に限定はなく、前記タンパク質が標識物質と化学結合などにより直接結合された態様であってもよく、前記タンパク質が、標識物質が結合された前記タンパク質に対する抗体（前記タンパク質が抗体の場合は標識二次抗体に相当）によって間接的に結合された態様であってもよい。なお、前記標識タンパク質を添加するタイミングも特に限定はなく、未分化細胞を含む試料を基板に導入する前に添加してもよいし、未分化細胞を基板に設けた保持部に保持させた後に添加してもよい。

本発明で用いる、基板に設けた保持部の形状に特に限定はなく、界面張力などで細胞を含む液体を維持できれば平面の保持部であってもよいが、側壁を設けた保持部とすると細胞を含む液体を基板内に安定に保持できる点で好ましい。

本発明で用いる、細胞を保持可能な保持部である微細孔の配置は、三角格子状とすることが好ましい。三角格子状に変更することによって、単位面積当たりの微細孔数を増やせ、より多くの細胞を解析することが可能となり、１／１０^６オーダーまで検出感度を高めることができる。

本発明において、保持部の開口部のサイズは１０μｍから３０μｍが好ましく、保持部の深さは１０μｍから４０μｍが好ましい。

また、未分化細胞を含む液体を基板に導入し、当該細胞を保持部に保持させる方法にも特に限定はなく、単に保持部に細胞を含む液体を導入するだけでもよいし、未分化細胞を含む液体を導入した後、遠心力を利用して保持部へ強制的に当該細胞を導入させてもよい。中でも未分化細胞を含む液体を導入した後、誘電泳動力を利用して保持部へ細胞を導入させると、未分化細胞を保持部へ効率的に保持できる点で好ましい。

前述した未分化細胞を検出するための装置にノズルによる吸引吐出により当該未分化細胞を回収する回収手段をさらに備えることで、試料中に含まれる未分化細胞を回収することができる。

本発明は、試料中に含まれる未分化細胞を、単一状態かつ形状情報を含めた形で検出することができる。また、ノズルによる吸引吐出により保持部に保持された未分化細胞を回収することができる。

本発明の方法を実施可能な装置を構成し、従来使用していた基板の一例を示した図（分解図）である。図１に示す基板の正面図である。図１に示す基板を備えた装置を用いた、未分化細胞の検出および回収方法の一例を示した図である。図１に示す基板を備えた装置を用いた、未分化細胞の検出および回収方法の別の例を示した図である。従来使用していた微細孔が格子状に配置された基板と本発明で使用した微細孔が三角格子状に配置された基板の図である。

以下、図面を用いて本発明をさらに詳細に説明する。

本発明の方法を実施可能な装置を構成する基板の一例を図１、その正面図を図２に示す。
図１に示す基板１００は、
貫通孔１１ａを有した平板状の遮光部材１１と、貫通孔１２ａを有した平板状の絶縁体１２と、導入口１３ａ、排出口１３ｂおよび貫通部１３ｃを有した平板状のスペーサ１３とからなる細胞導入保持手段１０と、
細胞導入保持手段１０を上下方向に密着して挟むよう設けた電極２１・２２と、
電極２１・２２同士を接続する導線３０と、
電極２１・２２に信号を印加する信号発生器４０と、
を備えている。遮光部材１１が有する貫通孔１１ａと絶縁体１２が有する貫通孔１２ａとは互いに同一の寸法および形状であり、かつそれぞれの貫通孔の位置が一致するよう遮光部材１１および絶縁体１２を設けている。貫通孔１１ａ、貫通孔１２ａおよび遮光部材１１の下部に密着して設けた電極基板２１により保持部５０が構成され、導入口１３ａから細胞を含む液体を導入すると、貫通部１３ｃを通じて保持部５０へ細胞２００が導入される。電極２２はスペーサ１３上部に密着して設けており、導入口１３ａから導入した、細胞２００を含む液体の飛散や蒸発を防止している。なお、保持部５０に保持した細胞２００の回収を容易にするため、電極２２はスペーサ１３から取り外し可能な構造となっている。

次に、図１に示す基板を備えた装置を用いた、未分化細胞の検出および回収方法の一例について図３を用いて説明する。なお、本発明では、図５で示す通り、微細孔が三角格子状に配置された基板を使用した。

（１−１）未分化細胞を標識する工程（図示せず）
未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質を含む溶液を試料に添加することで、試料中に含まれる未分化細胞と前記標識タンパク質との複合体を形成させる。

（１−２）保持部へ細胞を導入する工程
図１に示す基板１００に設けた導入口１３ａから、分化細胞２２０（試料中に含まれている場合）および標識タンパク質３００と結合した未分化細胞２１０を含む試料を導入し、誘電泳動力６０を利用してこれら細胞を保持部５０へ導入させる。具体的には、信号発生器４０から電極２１・２２へ交流電圧を印加することで誘電泳動力６０を発生させ、保持部５０へ未分化細胞２１０および分化細胞２２０を導入する。図１に示す基板１００に導入する細胞を含む液体は、誘電泳動力で細胞が移動できるよう懸濁された液であればよく、例えば、マンニトール、グルコース、スクロース等の糖類を含んだ水溶液や、当該水溶液に塩化カルシウム、塩化マグネシウム等の電解質、および／またはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等のタンパク質をさらに含んだ水溶液に、細胞を含んだ試料を懸濁させた液体があげられる。特に細胞を含む液体として、マンニトールを含む水溶液に細胞を含んだ試料を懸濁させた液体を用いると、細胞へのダメージが少なくなる点で好ましい。添加するマンニトールの濃度は等張液となる濃度とすればよく、具体的には２５０ｍＭから３５０ｍＭの間とするとよい。

信号発生器４０から電極２１・２２へ印加する交流電圧は、保持部５０に保持された細胞の充放電が周期的に繰り返される波形を有した交流電圧とすると好ましく、周波数を１００ｋＨｚから３ＭＨｚまでの間とし、電界強度を１×１０^５から５×１０^５Ｖ／ｍまでの間とすると特に好ましい。

（１−３）未分化細胞２１０を検出する工程
導入口１３ａから洗浄液を導入して残存試料を排出した後、基板を移動させる手段（図示せず）で基板をＸＹ軸方向に移動させながら、検出部４００および計測部により、未分化細胞２１０に結合した標識タンパク質由来の蛍光または発光および位置情報を取得し、未分化細胞２１０の位置を検出する。

（１−４）未分化細胞２１０を回収する工程
検出部４００および計測部により検出した未分化細胞２１０を回収するために、電極２２をスペーサ１３から取り外した後、ノズル５００で吸引することで、基板１００から未分化細胞２１０を回収する。電極２２を取り外す際は、スペーサ１３を剥がさないよう取り外す必要がある。もしスペーサ１３が絶縁体１２から剥がれると、装置内に保持されている溶液が系外に流れてしまい、未分化細胞２１０が破壊されるからである。

未分化細胞２１０の吸引は、基板を移動させる手段およびノズルを移動させる手段（ともに図示せず）を用いて前記（１−３）の工程で検出した未分化細胞２１０が保持されている保持部へノズル５００の中心を移動させ、ノズル５００により液を吸引することで未分化細胞２１０を回収する。なお、ノズル５００による未分化細胞２１０の吸引位置を、未分化細胞２１０を保持した保持部５０の中心から水平方向に一定距離ずらした位置とすると、未分化細胞２１０の吸引を容易に行なえるため好ましい。具体的には未分化細胞２１０の吸引位置を、保持部５０の中心から水平方向に保持部５０の直径の０．１倍から２倍の長さ分（ただし隣接する保持部５０間の距離の２分の１以下）ずらし、かつ保持部５０の高さから垂直方向に保持部５０の高さの０．０１倍から２倍の高さ分高い位置とすると好ましい。

図１に示す基板を備えた装置を用いた、未分化細胞の検出および回収方法の別の例を図４を用いて説明する。

（２−１）保持部へ細胞を導入する工程
図１に示す基板１００に設けた導入口１３ａから未分化細胞２１０および分化細胞２２０（試料中に含まれている場合）を含む試料を導入し、誘電泳動力６０を利用してこれら細胞を保持部５０へ導入させる。導入方法および条件は前記（１−２）と同様な方法および条件で行なえばよい。

（２−２）標識タンパク質３００を導入する工程
導入口１３ａから洗浄液を導入して残存試料を排出した後、導入口１３ａから標識タンパク質３００を含む試薬を導入して、未分化細胞２１０と標識タンパク質３００との複合体を形成させる。標識タンパク質は前記（１−１）と同様のタンパク質を用いればよい。

（２−３）未分化細胞２１０を検出する工程
前記（１−３）と同様の方法で行う。

（２−４）未分化細胞２１０を回収する工程
前記（１−４）と同様の方法で行う。

以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本例に限定されるものではない。

（実施例１）
以下に示す方法により、モデル細胞として２種の蛍光微粒子を用いて検出感度を検討した。
（１）緑色蛍光微粒子１億７，０００万個と赤色蛍光微粒子１，００５個を超純水で懸濁混合した。
（２）細胞保持部を有する前記基板１００に前記微粒子１，７００万個相当を含んだ懸濁液を導入した。前記基板は、微細孔が直径１５μｍ、微細孔中心間距離が２５μｍであり、三角格子状に配置されている基板である。
（３）周波数１ＫＨｚの交流電圧を電極２１・２２に１０分間印加することで誘電泳動力を用いて微粒子を基板１００が有する保持部５０に保持させた。
（４）保持部５０に保持された蛍光微粒子の有する蛍光を、蛍光顕微鏡（ＩＸ８３、オリンパス社製）を用いてＣＭＯＳカメラで撮影することで観察し、赤色蛍光粒子の検出感度を算出した。
（５）緑色蛍光粒子と赤色蛍光粒子の検出粒子数および、検出粒子数から下記式で算出した検出率［×１０^-６］を表１に示す。

検出率［×１０^-６］＝赤色蛍光粒子数÷（赤色蛍光粒子数＋緑色蛍光粒子数）
導入粒子数から計算された検出率の理論値５．９１［×１０^-６］に対し、実際の検出率の平均が６．９８［×１０^-６］と遜色のない結果となったことから、本装置を用いて１／１０^６オーダーの感度で検出できた。

（実施例２）
蛍光粒子を用いて１／１０^６オーダーの検出感度を確認したことから、ヒトｉＰＳ細胞を用いて、１／１０^５および１／１０^６オーダーの検出感度を以下の方法を用いて検討した。

（１）以下に、示す方法でヒトｉＰＳ細胞を調製した。
（１−１）ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株（ｉＰＳアカデミアジャパンより購入）をｉＭａｔｒｉｘ（タカラバイオ社製）でコートしたシャーレに播種し、ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ培地（タカラバイオ社製）を用いて５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃で培養した。
（１−２）７日間培養したｉＰＳ細胞をＰＢＳ（りん酸緩衝生理食塩水）で洗浄後、終濃度１０μＭＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＯｒａｎｇｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を含むＲＰＭＩ培地で５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃で３０分間培養した。
（１−３）３０分後、培地をＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ培地に変更後、ＰＢＳで洗浄した。次に、ＴｒｙｐＬＥｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）とＶｅｒｓｅｎｅＳｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）との混合液で前記細胞を剥離した。
（１−４）剥離した細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄した後、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド溶液に室温で４０分間浸することで、前記細胞を固定した。固定後、ＰＢＳで洗浄し、保存した。

（２）以下に示す方法により、ＭＲＣ−５細胞を調製した。
（２−１）ヒト胎児肺由来繊維芽細胞ＭＲＣ−５株（医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンクより購入）を１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を用いて５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃で培養した。
（２−２）７日間培養したＭＲＣ−５細胞をＰＢＳで洗浄後、０．０５％ＴｒｙｐｓｉｎＥＤＴＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を用いて前記細胞を剥離した。
（２−３）剥離した細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄した後、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド溶液に室温で４０分間浸することで、前記細胞を固定した。固定後、ＰＢＳで洗浄し、保存した。

（３）以下に示す方法を用いて、誘電泳動用溶液を作製した。
（３−１）一方の末端がメトキシ基であり、もう一方の末端がＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、分子量５０００のポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）と、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（３００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）とを、炭酸水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、１５ｍＬ）に溶解後、当該溶液を室温で３時間撹拌することでポリエチレングリコールを結合したＢＳＡ（ＰＥＧ−ＢＳＡ）を調製した。なお、調製する際、ｍＰＥＧ−ＮＨＳとＢＳＡとのモル比（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡ）を２となるようにした。調製後、分画分子量１００００の透析膜を用いて、純水への溶液置換を３日間行なった。（３−１）で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭマンニトールを含む溶液を作製し、これを誘電泳動用溶液とした。

（４）下記に示す方法を用いて、細胞サンプルを調整した。
（４−１）保存したｉＰＳ細胞およびＭＲＣ−５細胞を終濃度２μｇ／ｍＬＤＡＰＩ（同仁化学研究所製）を含む誘電泳動用溶液で懸濁し、３０分間室温で反応させ、細胞核を染色した。
（４−２）３０分後、誘電泳動用溶液で２回洗浄した。
（４−３）ＤＡＰＩ染色を行ったｉＰＳ細胞数、ＭＲＣ−５細胞数をカウントし、ＭＲＣ−５細胞１００万個に対し、１または１０個のｉＰＳ細胞をスパイクし、全量を８５０μＬに調製し、これをサンプルとした。

（５）前記サンプルを実施例１で用いた基板に導入し、周波数１ＭＨｚの交流電圧を電極２１・２２に１０分間印加することで誘電泳動力を用いて細胞を基板１００が有する保持部５０に保持させた。

（６）保持部５０に保持された細胞が有する蛍光を、蛍光顕微鏡（ＩＸ８３、オリンパス社製）を用いてＣＭＯＳカメラで撮影することで観察し、ＤＡＰＩ陽性で認識される細胞数を全細胞数、ＤＡＰＩ陽性かつＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＯｒａｎｇｅ陽性の細胞数をｉＰＳ細胞数と判断し、検出感度を算出した。

（７）全細胞数とｉＰＳ細胞数および、検出数から下記式で算出した検出率［×１０^-６］を表２、３に示す。

検出率［×１０^-６］＝ｉＰＳ細胞数÷全細胞数
導入細胞数から計算された検出率の理論値１［×１０^-６］、１０［×１０^-６］に対し、実際の検出率の平均が１．５８［×１０^-６］、１１．１［×１０^-６］と遜色のない結果となったことから、本装置を用いて１／１０^６オーダーの感度で試料中に含まれるｉＰＳ細胞を検出できた。

１００：基板
１０：細胞導入保持手段
１１：遮光部材
１２：絶縁体
１１ａ、１２ａ：貫通孔
１３：スペーサ
１３ａ：導入口
１３ｂ：排出口
１３ｃ：貫通部
２１・２２：電極基板
３０：導線
４０：信号発生器
５０：保持部
６０：誘電泳動力
２００：細胞
２１０：未分化細胞
２２０：分化細胞
３００：標識タンパク質
４００：検出部
５００：ノズル

Claims

細胞を保持可能な１０^６以上の保持部を有する基板に未分化細胞を含む試料及び前記未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質を導入し、当該標識タンパク質と試料中に含まれる未分化細胞との複合体を形成させた後、前記複合体中の標識に基づき、未分化細胞を検出することを特徴とする検出方法。
前記基板の保持部が三角格子状に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
未分化細胞を含む試料と前記未分化細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質とを混合させ、前記複合体を形成させてから前記基板に導入することを特徴とする請求項１又は２に記載の検出方法。
前記基板への保持の際に誘電泳動力を利用することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の検出方法。
前記標識タンパク質が、前記未分化細胞が有するタンパク質に対する標識抗体または標識レクチンであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の検出方法。
請求項１〜５のいずれかに記載の方法で検出された未分化細胞をノズルによる吸引吐出により回収することを特徴とする回収方法。