JP2021019513A

JP2021019513A - 標的粒子の解析方法

Info

Publication number: JP2021019513A
Application number: JP2019136690A
Authority: JP
Inventors: 惇野口; Atsushi Noguchi; 瑠依畑下; Rui Hatashita; 篤史森本; Atsushi Morimoto
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2019-07-25
Filing date: 2019-07-25
Publication date: 2021-02-18

Abstract

【課題】特別の熟練を要することなく、試料中に含まれる標的細胞を簡便、迅速かつ高効率に回収し、当該回収した標的細胞の情報を正確に取得する方法を提供すること。【解決手段】標的粒子を含む試料を保持部に導入し、当該標的粒子を前記保持部に保持させた後、前記保持部に保持された標的粒子を、試料中に含まれる夾雑粒子と同時に回収し、回収した夾雑粒子の存在下で前記標的粒子の性状を解析することで、前記課題を解決する。【選択図】なし

Description

本発明は、試料中に含まれる標的粒子の解析方法に関する。特に本発明は、試料中に含まれる標的粒子を保持部に保持させた後、保持された前記粒子を回収し、解析する方法に関する。

近年、血液などの体液および、臓器などの組織を構成する細胞を対象とした基礎研究、ならびに前記細胞を解析することで臨床診断、治療へ応用する研究が進められている。例えば、がん患者より採取した血液から腫瘍細胞（ＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＴｕｍｏｒＣｅｌｌ、以下ＣＴＣ）を対象に当該細胞について形態学的分析、組織型分析や遺伝子解析を行ない、前記解析により得られた知見に基づき、治療方針の決定や治療中における病態変化を判断する研究が進められている。特にＣＴＣに代表されるような血液中に含まれる希少細胞の解析は、夾雑となる血液細胞が含まれている中で、前記希少細胞の情報や機能を個々に明らかにできる技術が求められている。

標的細胞を個々に解析するための当該細胞の回収手段として、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ＡｃｔｉｖａｔｅｄＣｅｌｌＳｏｒｔｉｎｇ）、光ピンセット、誘電泳動、マイクロマニピュレーションを用いた方法などが知られている（特許文献１から２、非特許文献１から３）。しかしながらＦＡＣＳは、標的細胞の確実な選別が困難であり、またソーティング／単離操作により細胞が損傷するため、解析結果に影響を及ぼす可能性がある。光ピンセット、誘電泳動、マイクロマニピュレーションを利用した回収では、細胞を平板基板やマイクロサイズのウェルに捕捉し、当該捕捉した細胞について形状、光学的情報の解析が行なえる。また前記捕捉した標的細胞を回収することで、遺伝子解析などの性状解析が行なえる。しかしながらこれらの方法においても、例えばマイクロピペットなどの回収手段を操作する、精密な位置制御機構が必要であったり、回収操作が煩雑で技術的な熟練が必要であったり、回収に時間を要するなどといった課題が依然として存在している。

特開２００９−００２６９６号公報特表２０１２−５０７７３３号公報

Ｆｕ，ＡＹ．ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，１１０９−１１１１（１９９９）Ｈｅｌｌｍｉｃｈ，Ｗ．ｅｔａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２６，３６８９−３６９６（２００５）Ｖｏｌｄｍａｎ，Ｊ．，ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８，４２５−４５４（２００６）

本発明の課題は、特別の熟練を要することなく、試料中に含まれる標的細胞を簡便、迅速かつ高効率に回収し、当該回収した標的細胞の情報を正確に取得する方法を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。

すなわち本発明は以下［１］から［７］に記載の態様を包含する：
［１］（１）標的粒子を含む試料を保持部に導入し、当該標的粒子を前記保持部に保持させる工程と、（２）保持された標的粒子を回収手段で回収する工程と、（３）回収した標的粒子の性状を解析する工程と、を含む試料中に含まれる標的粒子の解析方法において、（２）の工程が前記標的粒子と前記保持部に保持された試料中に含まれる夾雑粒子とを同時に回収する工程であって、（３）の工程が回収した夾雑粒子の存在下での標的粒子の性状解析を含む工程である、前記解析方法。

［２］（２）の工程が、標的粒子の純度が２０％から８０％となるように回収する工程である、前記［１］に記載の方法。

［３］保持部が、試料中に含まれる標的粒子および夾雑粒子を保持可能な凹部である、前記［１］または［２］に記載の方法。

［４］（１）の工程が、標的粒子を含む試料を当該試料中に含まれる標的粒子および夾雑粒子を保持可能な凹部を複数設けた粒子保持装置に導入し、前記保持装置に設けた凹部のうち少なくとも５％の凹部に複数の粒子を保持させる工程であり、（２）の工程が前記複数の粒子を保持した凹部のうち、標的粒子および夾雑粒子をそれぞれ一つ以上保持した凹部から回収手段で回収する工程である、前記［３］に記載の方法。

［５］（３）の工程が夾雑粒子存在下での標的粒子の性状解析結果から夾雑粒子単独での性状解析結果を差し引く工程である、前記［１］から［４］に記載の方法。

［６］標的粒子が生体材料からなる粒子である、前記［１］から［５］に記載の方法。

［７］（３）の工程における性状解析が、生体材料からなる粒子が有する核酸の塩基配列解析である、前記［６］に記載の方法。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明において粒子とは、溶液中に単独または凝集状態で分散する不溶性物質のことをいう。具体例としては、ビーズ、粉砕用ボール、クロマトグラフィー用分離剤、吸着剤といった工業材料からなる粒子や、細胞、ウイルス、オルガネラ、小胞といった生体材料からなる粒子があげられる。特に本発明は、前記生体材料からなる粒子の解析に好ましい方法である。

標的粒子が前述した生体材料からなる粒子である場合の、本発明における標的粒子を含む試料の一例としては、全血、希釈血液、血清、血漿、髄液、臍帯血、成分採血液、尿、唾液、***、糞便、痰、羊水、腹水、腹腔洗浄液などの生体試料や、肝臓、肺、脾臓、腎臓、皮膚、腫瘍、リンパ節などの組織の一片を懸濁させた組織懸濁液や、前記生体試料または前記組織懸濁液より分離して得られる前記生体試料または前記組織由来の細胞を含む画分や、あらかじめ単離した細胞の培養液、があげられる。このうち生体試料または組織由来の細胞を含む画分の一例として、生体試料や組織懸濁液を密度勾配形成用媒体の上に重層後、密度勾配遠心して得られる画分があげられる。

標的粒子を含む試料が血液試料である場合の、標的粒子の一例としては、血液循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの腫瘍細胞、循環血液内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血管内皮細胞（ＣＥＰ）、循環胎児細胞（ＣＦＣ）、抗原特異的Ｔ細胞、各種幹細胞があげられる。一方、夾雑粒子は前述した標的粒子以外の粒子であり、具体的には、血液試料中に含まれる細胞である白血球、赤血球、血小板および小胞、ならびにこれら細胞または前述した標的粒子由来のデブリがあげられる。なお本明細書における血液試料は、全血、血清、血漿、臍帯血、成分採血液といった血液検体に限らず、当該血液検体を生理食塩水などで希釈した試料や、当該血液検体より分離して得られる、前記血液検体由来の細胞を含む画分も、血液試料に含まれる。

本発明における保持部は、試料中に含まれる標的粒子および夾雑粒子を保持可能な形状であればよく、単に平面であってもよいし、凹凸があってもよい。前記保持部を凹凸とする場合の形状（平面図における形状）は、標的粒子および夾雑粒子を保持できれば特に限定はなく、円形であってもよく、楕円形であってもよく、正方形、ひし形、平行四辺形、六角形、八角形といった多角形であってもよい。また、凹多角形や、凸多角形も前記多角形に含まれる。

保持部が標的粒子および夾雑粒子を保持可能な凹部である場合、当該凹部の大きさは、回収対象である標的粒子および夾雑粒子の大きさや形状に応じ適宜選択すればよいが、前記凹部の大きさを、前記標的粒子および前記夾雑粒子がそれぞれ少なくとも一つ以上保持可能な大きさとすると、標的粒子を含む粒子集団が容易に回収できる点で好ましい。例えば標的粒子がＣＴＣ（直径：１０から２５μｍ程度）であり、夾雑粒子が白血球（直径：５から２０μｍ程度）である場合は、前記凹部を直径３０μｍから１００μｍの大きさとすると好ましい。深さは、保持された細胞が観察できる程度が好ましく、例えば５〜１００μｍが好ましく、５〜３０μｍがより好ましい。

本発明において、標的粒子を含む試料を保持部へ導入する方法には特に限定はなく、単に保持部に標的粒子を含む試料を導入するだけでもよいし、試料を導入した後に遠心力を利用して保持部へ強制的に粒子を保持させてもよい。中でも試料を導入した後に、誘電泳動力を利用して保持部へ粒子を保持させる方法は、効率的に粒子を保持できる点で好ましい。

本発明において、標的粒子を含む試料を、複数の凹部（保持部）を設けた粒子保持装置に導入する場合、当該凹部に保持される粒子の数には特に制限はない。すなわち、試料を導入した後の粒子保持装置に設けた凹部の中に、粒子が一つも保持されてない凹部が含まれていてもよく、粒子を複数保持した凹部が含まれていてもよい。ただし、粒子の検出や回収を効率的および／または迅速的に行なう観点からは、粒子の密度が高い方が、すなわち粒子を保持する凹部の数や複数粒子を保持する凹部の数が多い方が好ましい。特に粒子保持装置に設けた凹部の総数の５％以上に複数粒子が保持されているとよく、４０％以上に保持されていると好ましく、６０％以上に保持されていると特に好ましい。

保持部に保持された標的粒子および夾雑粒子は、光ピンセット、誘電泳動力を発生させる手段、マイクロマニピュレーションなどの回収手段を用いて回収すればよい。前記回収は、標的細胞と夾雑細胞とを同時に回収する方法である限り、特に限定はない。一例として、マイクロマニピュレーターを用いる場合には、マイクロマニピュレーターを固定して粒子を回収してもよいし、マイクロマニピュレーターを移動させながら連続的に回収してもよい。また、保持部が標的粒子および夾雑粒子を保持可能な凹部である場合、標的粒子および夾雑粒子をそれぞれ一つ以上保持した単一の凹部から回収してもよく、標的粒子のみを保持した一つ以上の凹部および夾雑粒子のみを保持した一つ以上の凹部から連続的に回収してもよく、これら回収を組み合わせてもよい。ただし、操作の簡便性の観点からは、単一の凹部から回収する方が好ましく、また、操作の簡便性と性状解析の精度を両立する観点から、回収した粒子に含まれる標的粒子の割合（標的粒子の純度）が２０％から８０％となるよう、回収するのが好ましい。

本発明における、標的粒子の性状解析方法には特に限定はなく、一例としてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計）などを用いた質量分析法、マイクロアレイなどを用いたハイブリダイゼーション法があげられる。標的粒子が細胞などの生体材料からなる粒子である場合、標的粒子の性状解析方法としては、次世代シーケンサーなどを用いた塩基配列解析や、質量分析装置を用いたプロテオーム解析・メタボロミクス解析が例示できる。なお本発明では、標的粒子とともに夾雑粒子も回収するため、当該標的粒子の性状を解析する際、解析方法によっては、同時に回収した夾雑粒子の性状解析結果と重なった結果を得る可能性がある。したがって、前記夾雑粒子の性状解析結果を差し引ける解析方法とすると、標的粒子の性状を明確に解析できる点で好ましい。

本発明は、標的粒子を含む試料を保持部に導入し当該標的粒子を前記保持部に保持させる工程と保持された標的粒子を回収手段で回収する工程と回収した標的粒子の性状を解析する工程と、を含む試料中に含まれる標的粒子の解析方法において、前記回収工程が前記標的粒子と前記保持部に保持された試料中に含まれる夾雑粒子とを同時に回収する工程であり、前記性状解析工程が回収した夾雑粒子の存在下での標的粒子の性状解析を含む工程であることを特徴としている。本発明により、性状解析対象の標的粒子を回収する際、従来のような煩雑で時間のかかる一粒子単位での標的粒子の回収が不要となるため、回収のための特別の熟練を要することなく、標的粒子の性状を解析できる。

本発明で利用可能な、保持部を複数設けた粒子保持装置の一態様を示す分解図である。図１に示した装置の正面図である。回収手段による、図１および図２に示した装置で保持した粒子の回収を示す図である。実施例４の結果を示す図である。

以下、図面を用いて本発明をさらに詳細に説明する。

本発明で利用可能な、保持部を複数設けた粒子保持装置を図１に示す。また図１に示した装置の正面図を図２に示す。

図１および図２に示す粒子保持装置１００は、貫通孔１１ａを有した平板状の遮光部材１１と、貫通孔１２ａを有した平板状の絶縁体１２と、導入口２１、排出口２２および貫通部２３を有した平板状のスペーサー２０とからなる粒子導入保持手段と、前記粒子導入保持手段を上下方向に密着して挟むよう設けた電極基板３１・３２と、電極基板３１・３２同士を接続する導線４０と、電極基板３１・３２に信号を印加する信号発生器５０と、を備えている。遮光部材１１が有する貫通孔１１ａと絶縁体１２が有する貫通孔１２ａとは互いに同一の寸法および形状であり、かつそれぞれの貫通孔の位置が一致するよう遮光部材１１および絶縁体１２を設けている。貫通孔１１ａ、貫通孔１２ａおよび遮光部材１１の下部に密着して設けた電極基板３１により保持部６０が構成され、導入口２１から標的粒子を含む試料を導入すると、貫通部２３を通じて保持部６０へ粒子が導入される。電極基板３２はスペーサー２０上部に密着して設けており、導入口２１から導入した標的粒子を含む試料の飛散や蒸発を防止している。なお保持部６０に保持した粒子の回収を容易にするため、電極基板３２はスペーサー２０から取り外し可能な構造となっている。

次に、図１および図２に示した粒子保持装置１００を用いた、本発明の解析方法の一例を説明する。

（１）標的粒子保持工程
導入口２１から標的粒子７０を含む試料を粒子保持装置１００に導入し、標的粒子７０および前記試料に含まれる夾雑粒子８０を、保持部６０へ保持させる。なお図１および図２に示す粒子保持装置１００では、標的粒子７０および夾雑粒子８０を保持部６０へ保持させる際、誘電泳動力３００を利用して導入できる。具体的には、信号発生器５０から電極基板３１・３２へ交流電圧を印加することで誘電泳動力３００を発生させ、保持部６０に標的粒子７０および夾雑粒子８０を保持させる。標的粒子が生体材料からなる粒子である細胞の場合、信号発生器５０から電極基板３１・３２へ印加する交流電圧は、保持部６０に保持された標的粒子（細胞）７０の充放電が周期的に繰り返される波形を有した交流電圧とすると好ましく、周波数を１００ｋＨｚから３ＭＨｚまでの間とし、電界強度を１×１０^５から５×１０^５Ｖ／ｍまでの間とすると特に好ましい（ＷＯ２０１１／１４９０３２号および特開２０１２−０１３５４９号公報参照）。

誘電泳動力３００を利用して粒子を保持部６０へ保持させる場合、粒子保持装置１００に導入する、標的粒子７０を含む試料は、誘電泳動力３００で粒子を移動可能な分散媒に標的粒子７０を分散させた試料とする必要がある。前記分散媒の例として、マンニトール、キシリトール、グルコース、スクロース等の糖類を含んだ水溶液や、当該水溶液に塩化カルシウムや塩化マグネシウム等の電解質、および／またはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等のタンパク質をさらに含んだ水溶液があげられる。特に、標的粒子が細胞などの生体材料からなる粒子の場合、等張液となる濃度に調製した糖溶液を用いると、当該粒子へのダメージが少なくなる点で好ましい。

試料中に含まれる標的粒子の濃度に特に制限はないが、粒子保持装置１００に設けた保持部６０のうち、少なくとも一部の保持部６０に、標的粒子７０および夾雑粒子８０をそれぞれ一つ以上保持される濃度とすると、効率的に粒子を検出および回収できる点で好ましい。図１および図２に示す粒子保持装置１００の場合、粒子保持装置１００に導入する粒子数を、粒子保持装置１００に設けた保持部６０の数の５０％以上とするとよく、保持部６０の数の２倍以上とすると好ましく、保持部６０の数の３倍以上とするとより好ましい。例えば、標的粒子を血液試料１ｍＬ中に数個から数十個程度しか存在しない希少細胞（ＣＴＣなど）とする場合、粒子保持装置１００に設けた保持部６０の数の５０％以上の粒子を導入することで、標的粒子である希少細胞および夾雑粒子である白血球をそれぞれ一つ以上保持した凹部を存在せしめることができる。

保持部６０へ保持された標的粒子７０や夾雑粒子８０の再流出を防止するため、当該粒子を接着可能な試薬を用いて保持部６０に固定させてもよい。粒子が細胞である場合の接着試薬の一例として、ポリ−Ｌ−リジン、コラーゲン、ＢＡＭ（細胞膜修飾剤、油化産業社製）があげられる。なお保持部６０への粒子固定は、予め保持部６０を前記接着試薬で被覆してから標的粒子を含む試料を導入し、保持部６０への当該粒子の保持とともに保持部６０に固定させてもよく、保持部６０へ粒子を保持させてから前記接着試薬を導入し、保持された粒子を保持部６０に固定させてもよい。

（２）保持された粒子の回収工程
保持部６０に保持された標的粒子７０および夾雑粒子８０を、回収手段４００を用いて同時に回収する（図３）。図３では、粒子保持装置１００に設けた電極基板３２を取り外したのち、回収手段であるマイクロマニピュレーター４００を利用して保持部６０に保持された粒子を吸引後、あらかじめ用意した回収チューブなどに吐出して前記粒子を回収する。

なお粒子回収にあたり、保持部６０に保持された標的粒子７０および／または夾雑粒子８０を、これら粒子が有する特徴に基づき識別してもよい。例えば、
明視野像、蛍光画像、化学発光画像といった標的粒子の光学的特徴に基づき識別する場合は、光学検出器や光学顕微鏡などの光学測定器を用いて検出すればよく、
標的粒子の弾性や粘性といった特徴に基づき識別する場合は、超音波顕微鏡などの超音波測定器を用いて検出すればよく、
放射性同位元素を標識した標的粒子など標的粒子の放射化学的特徴に基づき識別する場合は、シンチレーション検出器などの放射線検出器を用いて検出すればよく、
標的粒子の熱応答性や熱物性に基づき識別する場合は、当該熱応答性や熱物性を検出可能な装置を用いて検出すればよい。

また前記標的粒子および／または前記夾雑粒子の識別を行なう際に、これら粒子が有する特徴に基づいて粒子を標識する操作を行なってから検出しても良い。一例として、粒子が生体材料からなる粒子の場合には、抗原−抗体、レセプター−ホルモン、レセプター−リガンド、レクチン−糖鎖（炭水化物）、ＦｃレセプターまたはマウスＩｇＧ−ＰｒｏｔｅｉｎＡ、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチンおよびウイルス−レセプターなどの相互作用を利用して標的粒子および／または夾雑粒子を識別できる。具体例として、標的粒子が細胞の場合には、当該細胞をＤＡＰＩ（４’，６−ＤｉＡｍｉｄｉｎｏ−２−ＰｈｅｎｙｌＩｎｄｏｌｅ）などの核酸標識試薬や、ＰＥ（フィコエリスリン）などの蛍光物質を結合した抗体を用いて標識し、蛍光顕微鏡２００を用いて検出すればよい（図２）。

本発明では、保持部６０に保持された標的粒子７０と夾雑粒子８０とを同時に回収することで、特別な熟練や煩雑な操作を必要とせずに、簡便かつ迅速に標的粒子を回収できる。本工程は、標的細胞７０と夾雑細胞８０を同時に回収できる方法であれば、特に限定はない。一例として、
（Ｉ）図３に示すように、マイクロマニピュレーター４００を用いて一つの保持部に保持された一つ以上の標的粒子７０および一つ以上の夾雑粒子８０を同時に回収してもよいし、
（ＩＩ）複数の保持部６０に保持された標的粒子７０および夾雑粒子８０を、マイクロマニピュレーター４００を移動させながら連続的に回収してもよい。
なお操作の簡便性の観点からは、前記（Ｉ）の回収方法が好ましい。また後述する標的粒子の性状解析の観点から、本工程で回収する標的粒子７０と夾雑粒子８０との比率は、回収する総粒子数に対する標的粒子７０の割合（標的粒子７０の純度）が２０％から８０％となるように回収すると好ましい。

（３）標的粒子の性状解析工程
保持部６０から回収した標的粒子７０の性状解析を、同時に回収した夾雑粒子８０の存在下で行なう。なお前記解析結果を、夾雑粒子８０単独での性状解析結果で差し引くと、標的粒子７０の性状を明確に解析できるため、好ましい。

標的粒子を含む試料が血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を含む血液試料である場合の好ましい解析方法の一例を以下に説明する。
（ｉ）保持部６０から回収したＣＴＣ（標的粒子）および白血球（夾雑粒子）を含む試料に対して、全ゲノム増幅やライブラリー調製を行ない、次世代シーケンサーを用いて遺伝子変異を検出する。
（ｉｉ）別途（ｉ）と同様な方法で、白血球単独の遺伝子変異を検出する。
（ｉｉｉ）（ｉ）で検出した遺伝子変異から（ｉｉ）で検出した遺伝子変異を差し引くことで、ＣＴＣ単独の遺伝子変異を検出する。

以下、本発明を実施例に基づき、さらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１白血球とがん細胞株との遺伝子変異の比較
以下に示す方法で、健常者白血球の集団およびがん細胞株の集団から、それぞれ遺伝子変異を検出した。

（１）インフォームドコンセントを得て取得した健常者血液０．５ｍＬに、塩化アンモニウムを主成分とする赤血球破砕液を７．５ｍＬ添加し、室温で５分間静置することで赤血球を破砕した。その後、９００×ｇで５分間遠心分離して上清を除去後、細胞ペレットをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に再懸濁することで洗浄した。

（２）（１）で取得した細胞懸濁液を、９００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。残った細胞ペレットを、１％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（以下、「細胞固定試薬」とも表記）１ｍＬに懸濁し、１０分間静置することで細胞を固定した。その後、６００×ｇで５分間遠心分離して上清を除去後、細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁することで洗浄した。

（３）２４穴マイクロプレートで培養した肺がん細胞株（Ｈ１９７５株）をトリプシンで剥離し、マイクロチューブに回収した。６００×ｇで５分間遠心分離して上清を除去後、細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁することで洗浄した。

（４）（２）で取得した白血球懸濁液、および（３）で取得したがん細胞株懸濁液から、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＴｉｓｓｕｅ（タカラバイオ社製）を用いて、それぞれゲノムＤＮＡを抽出した。

（５）（４）で取得した各ゲノムＤＮＡに対して、ＩｏｎＡｍｐｌｉＳｅｑＣａｎｃｅｒＨｏｔｓｐｏｔＰａｎｅｌｖ２（以下、ＣＨＰｖ２）およびＩｏｎＡｍｐｌｉＳｅｑＬｉｂｒａｒｙＫｉｔＰｌｕｓ（いずれもＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いたライブラリー調製を行ない、ＩｏｎＳ５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて遺伝子変異解析を実施した。

表１に、健常者白血球の集団およびがん細胞株の集団からそれぞれ検出した、Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ１０％以上の変異を示す。４番染色体（ｃｈｒ４）５５，１４１，０５５位（ＰＤＧＦＲＡ遺伝子）のＡ／Ｇ変異や、５番染色体（ｃｈｒ５）１１２，１７５，７７０位（ＡＰＣ遺伝子）のＧ／Ａ変異などは、白血球とがん細胞株の両者から共通して検出された。一方、４番染色体（ｃｈｒ４）５５，１５２，０４０位（ＰＤＧＦＲＡ遺伝子）のＣ／Ｔ変異や、７番染色体（ｃｈｒ７）５５，２４９，０６３位（ＥＧＦＲ遺伝子）のＧ／Ａ変異などは、がん細胞株からのみ検出されており、当該がん細胞株（Ｈ１９７５株）に特有の遺伝子変異であることが分かる。

実施例２異種細胞混合試料からの遺伝子解析（その１）
以下に示す方法で、健常者白血球とがん細胞株との混合試料から、がん細胞株の遺伝子変異を検出した。

（１）インフォームドコンセントを得て取得した健常者血液３ｍＬを、塩化アンモニウムを主成分とする赤血球破砕液で９０ｍＬまでメスアップし、室温で５分間静置することで赤血球を破砕した。その後、９００×ｇで５分間遠心分離して上清を除去後、細胞ペレットをＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））および２８０ｍＭキシリトールを含む溶液（以下、「ＰＥＧ−ＢＳＡキシリトール溶液」とも表記）で懸濁することで洗浄した。当該洗浄操作を３回繰り返した。

（２）２４穴マイクロプレートで培養した肺がん細胞株（Ｈ１９７５株）をトリプシンで剥離し、マイクロチューブに回収した。６００×ｇで５分間遠心分離を行なって上清を除去し、細胞ペレットを細胞培養培地１ｍＬに再懸濁することで洗浄した。

（３）（２）で取得したがん細胞株懸濁液を６００×ｇで５分間遠心分離して上清を除去後、細胞ペレットを塩化アンモニウムを主成分とする赤血球破砕液１ｍＬで懸濁し、室温で５分間静置することで赤血球を破砕した。その後、９００×ｇで５分間遠心分離して上清を除去後、細胞ペレットをＰＥＧ−ＢＳＡキシリトール溶液で懸濁することで洗浄した。当該洗浄操作を３回繰り返した。

（４）（１）で取得した白血球懸濁液、および（３）で取得したがん細胞株懸濁液を、それぞれ図１および図２に示す粒子保持装置１００に導入した。信号発生器５０から電極基板３１・３２に交流電圧（１ＭＨｚ、２０Ｖｐ−ｐ）を１０分間印加することで、誘電泳動力３００により前記装置が有する保持部６０に白血球またはがん細胞株を保持させ、白血球を保持した保持装置、およびがん細胞を保持した保持装置を調製した。本実施例で用いた粒子保持装置１００は、直径３０μｍの貫通孔１２ａを複数有した絶縁体１２と直径３０μｍの貫通孔１１ａを複数有した遮光性のクロム膜（遮光部材１１）と電極基板３１とを上から絶縁体１２−遮光部材１１−電極基板３１の順に密着して設け、さらに絶縁体１２の上面に試料の導入口２１、排出口２２および貫通部２３を有する厚さ１ｍｍのスペーサー２０を、スペーサー２０の上面に電極基板３２を、それぞれ密着して設けてなる装置である。なお貫通孔１１ａ／１２ａおよび電極基板３１により、直径３０μｍ、深さ４０μｍからなる標的粒子７０および夾雑粒子８０を保持可能な保持部６０が約３０万個形成されている。

（５）導入口２１から、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリ−Ｌ−リジンを含む２８０ｍＭキシリトール水溶液を、前記交流電圧を印加しながら導入し、３分間静置後、前記交流電圧の印加を停止し、排出口２２から前記水溶液を吸引除去した。

（６）導入口２１から細胞固定試薬を導入し、１０分間静置することで細胞を固定した。その後、排出口２２から細胞固定試薬を吸引除去し、導入口２１からＰＢＳ−Ｔ（ＰｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅｗｉｔｈＴｗｅｅｎ２０）を導入することで、残留した細胞固定試薬を洗浄した。

（７）導入口２１から９５％（ｗ／ｖ）エタノールを含む水溶液（以下、膜透過試薬）を導入し、１０分間静置することで細胞の膜透過処理を行なった。その後、排出口２２から細胞固定試薬を吸引除去し、導入口２１からＰＢＳ−Ｔを導入することで、残留した膜透過試薬を洗浄した。

（８）導入口２１からＤＡＰＩ（４’，６−ＤｉＡｍｉｄｉｎｏ−２−ＰｈｅｎｙｌＩｎｄｏｌｅ）（同仁化学研究所社製）を混合した細胞染色試薬８５０μＬを導入し、２０分静置することで細胞を標識した。その後、排出口２２から細胞染色試薬を吸引除去し、導入口２１からＰＢＳ−Ｔを導入することで、残留した細胞染色試薬を洗浄した。

（９）蛍光顕微鏡２００（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製ＩＸ７１）を用いて、保持部６０に保持されたＤＡＰＩ陽性細胞（白血球またはがん細胞株）を検出後、図３に示すように、吸引手段であるマイクロマニピュレーター４００を用いて、上面の電極基板３２を取り外した粒子保持装置１００の保持部６０に保持された白血球またはがん細胞株を吸引した。吸引した白血球またはがん細胞株を、がん細胞数：白血球数の比が１：１または１：２となるよう０．２ｍＬマイクロチューブヘ吐出して混合することで、異種細胞混合試料を調製した。

（１０）Ａｍｐｌｉ１ＷＧＡキット（シリコンバイオシステムズ社製）を用いて、混合試料中の細胞の全ゲノム増幅を実施した。その後、取得した全ゲノム増幅産物に対して、ＣＨＰｖ２およびＩｏｎＡｍｐｌｉＳｅｑＬｉｂｒａｒｙＫｉｔＰｌｕｓ（いずれもＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）によるライブラリー調製を行ない、ＩｏｎＳ５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて遺伝子変異を解析した。

（１１）（１０）で検出された混合試料の遺伝子変異から、実施例１で健常者白血球集団からの遺伝子変異解析により検出した遺伝子変異（すなわち表１中、「変異の有無（白血球）」欄に丸がついている変異）を差し引くことで、がん細胞株（Ｈ１９７５株）特有の変異を検出した。

表２に、実施例１で見出したがん細胞株（Ｈ１９７５株）特有の遺伝子変異（Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ１０％以上）の検出結果を示す。なお本実施例では、異種細胞混合試料の調製をそれぞれ６回実施しており、各調製ごとの結果をａからｆ欄で示している。がん細胞株と白血球とを１：１で回収した試料（がん細胞の純度５０％）では、６回調製したうちの３回で、実施例１で見出したがん細胞株（Ｈ１９７５株）特有の遺伝子変異を検出できた。また、がん細胞株と白血球とを１：２で回収した試料（がん細胞の純度３３％）であっても、６回調製したうちの１回で、実施例１で見出したがん細胞株（Ｈ１９７５株）特有の遺伝子変異を検出できた。

以上の結果から、試料中に含まれる標的粒子（がん細胞）を解析する際、当該標的粒子を前記試料中に含まれる夾雑粒子（白血球）と混合した状態で回収しても、当該混合状態での性状解析結果から、夾雑粒子（白血球）単独での性状解析結果を差し引くことで、標的粒子（がん細胞）を解析できることがわかる。

実施例３異種細胞混合試料からの遺伝子解析（その２）
実施例２より、標的粒子と夾雑粒子との混合試料の性状解析結果から、標的粒子を解析できることがわかったことから、標的粒子の純度が実施例２より低い試料であっても、標的粒子を解析できるか、検証した。

（１）インフォームドコンセントを得て取得した健常者血液０．５ｍＬに、塩化アンモニウムを主成分とする赤血球破砕液を７．５ｍＬ添加し、室温で５分間静置することで赤血球を破砕した。その後、９００×ｇで５分間遠心分離して上清を除去し、細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁することで洗浄した。

（２）２４穴マイクロプレートで培養した肺がん細胞株（Ｈ１９７５株）をトリプシンで剥離し、マイクロチューブに回収した。６００×ｇで５分間遠心分離して上清を除去し、細胞ペレットを細胞培養用培地１ｍＬに再懸濁することで洗浄した。

（３）（１）で取得した白血球懸濁液および（２）で取得したがん細胞株懸濁液を、それぞれ９００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。残った各細胞ペレットを、細胞固定試薬１ｍＬに懸濁し、５分間静置することで細胞を固定した。その後、６００×ｇで５分間遠心分離して上清を除去し、細胞ペレットをＰＢＳに懸濁することで洗浄した。

（４）（３）の各細胞懸濁液を６００×ｇで５分間遠心分離した後、上清を除去し、膜透過試薬１ｍＬに懸濁して、５分間静置することで細胞の膜透過処理を行なった。その後、６００×ｇで５分間、室温で遠心分離して上清を除去し、細胞ペレットをＰＢＳに懸濁することで洗浄した。

（５）（４）の各細胞懸濁液を６００×ｇで５分間遠心分離した後、上清を除去し、ＤＡＰＩを混合した細胞染色液１ｍＬに懸濁して、２０分静置することで細胞を標識した。その後、６００×ｇで５分間、室温で遠心分離して上清を除去し、細胞ペレットをＰＢＳに懸濁することで洗浄した。

（６）（５）の各細胞懸濁液を６００×ｇで５分間遠心分離した後、上清を除去し、３００ｍＭマンニトール溶液へ懸濁した。得られた白血球懸濁液およびがん細胞株懸濁液の一部を回収して、蛍光顕微鏡を用いたセルカウントに基づき細胞数を算出した。当該算出結果に基づき、がん細胞数：白血球数が１：１または１：５となるよう、各懸濁液中の白血球とがん細胞株とを混合することで、異種細胞混合試料を調製した。

（７）実施例２の（１０）および（１１）に記載の方法に従い、（６）の異種細胞混合試料から標的細胞（がん細胞株（Ｈ１９７５株））特有の変異を検出した。

表３に、実施例１で見出したがん細胞株（Ｈ１９７５株）特有の遺伝子変異（Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ１０％以上）の検出結果を示す。なお本実施例では、異種細胞混合試料の調製を２回実施しており、各調製ごとの結果をａおよびｂ欄で示している。がん細胞数：白血球数が１：１となるよう混合した試料（がん細胞株の純度５０％）では、２回調製したうちの１回で、実施例１で見出したがん細胞株（Ｈ１９７５株）特有の遺伝子変異を検出できた。一方、がん細胞数：白血球数が１：５となるよう混合した試料（がん細胞株の純度１７％）では、実施例１で見出したがん細胞株（Ｈ１９７５株）特有の遺伝子変異は検出できなかった。

以上の結果から、標的粒子（がん細胞）の解析を夾雑粒子（白血球）と混合した状態で行なう場合、前記混合試料中の標的粒子の純度が２０％未満であると、標的粒子の解析が困難となるおそれがあることがわかる。

実施例４粒子導入数と保持部への粒子保持数との関係
粒子を含む試料を図１および図２に示す粒子保持装置１００に導入する際の、導入する前記粒子数と保持部６０への前記粒子の保持数との関係を確認した。

（１）インフォームドコンセントを得て取得した健常者血液３ｍＬを、塩化アンモニウムを主成分とする赤血球破砕液で９０ｍＬまでメスアップし、室温で５分間静置することで赤血球を破砕した。その後、９００×ｇで５分間遠心分離して上清を除去し、細胞ペレットをＰＥＧ−ＢＳＡ洗浄液３０ｍＬで再懸濁した。

（２）再懸濁液を６００×ｇで５分間遠心分離して上清を除去し、細胞ペレットをＰＥＧ−ＢＳＡキシリトール溶液３０ｍＬで再懸濁することで洗浄した。当該洗浄操作を３回繰り返した。

（３）（２）で取得した細胞懸濁液を、導入細胞数が１０万個から２００万個となるよう、それぞれ調製し、当該調製した細胞懸濁液を、図１および図２に示す粒子保持装置１００に導入した。導入後、信号発生器５０から電極基板３１・３２に交流電圧（１ＭＨｚ、２０Ｖｐ−ｐ）を１０分間印加することで、誘電泳動力３００により前記装置が有する保持部６０に細胞を保持させた。本実施例で用いた粒子保持装置１００は、実施例２（４）に記載の装置と同じである。

（４）実施例２の（５）から（８）に記載の方法に従い、細胞の固定、膜透過および標識を行なった。

（５）蛍光顕微鏡２００（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製ＩＸ７１）を用いて、各保持部６０に保持された細胞を全て検出し、各保持部６０に保持されている細胞の数を計測した。

図４に、粒子保持装置１００に導入した細胞数と、各保持部６０に保持された細胞数との関係を示す。粒子保持装置１００に２０万個以上の細胞（すなわち、保持部６０の数（３０万個）の５０％以上）を導入すれば、保持部６０の５％以上に複数の細胞を保持できることが分かる。また、粒子保持装置１００に６８万個以上の細胞（すなわち、保持部６０の数の２倍以上）を導入すると保持部６０の４０％以上に、１００万個以上の細胞（すなわち、保持部６０の数の３倍以上）を導入すると保持部６０の６０％以上に、それぞれ複数の細胞を保持できることが分かる。

粒子保持装置１００に２０万個以上の細胞（すなわち、保持部６０の数（３０万個）の５０％以上）を導入する場合、一つ以上の細胞を保持する凹部の割合は約５０％であることから、細胞が保持されている凹部のうち、その１０％以上に複数の細胞が保持されていることが分かる。例えば、血液試料中に含まれるＣＴＣを標的粒子とする場合、ＣＴＣの数は一般的に１ｍＬあたり数個から数十個の範囲となるため、細胞が保持されている凹部のうち、その１０％以上に複数の細胞が保持されていれば、標的粒子であるＣＴＣと夾雑粒子である白血球をそれぞれ一つ以上保持した凹部が存在し得る。

実施例５標的細胞の検出率
以下に示す方法で、健常者白血球（夾雑細胞）とがん細胞株（標的細胞）との混合試料からの標的細胞検出を試みた。

（１）インフォームドコンセントを得て取得した健常者血液３ｍＬに、肺がん細胞株（ＰＣ９株）約２００個を添加してスパイク検体を調製した。前記スパイク検体を、塩化アンモニウムを主成分とする赤血球破砕液で９０ｍＬまでメスアップし、室温で５分間静置することで赤血球を破砕した。その後、９００×ｇで５分間遠心分離して上清を除去し、細胞ペレットをＰＥＧ−ＢＳＡ洗浄液３０ｍＬで再懸濁した。

（２）再懸濁液を６００×ｇで５分間遠心分離した後、上清を除去し、細胞ペレットをＰＥＧ−ＢＳＡキシリトール溶液３０ｍＬで再懸濁することで洗浄した。当該洗浄操作を３回繰り返した。

（３）（２）で取得した細胞懸濁液を、導入細胞数が２万５千個または１００万個となるよう、それぞれ調製し、当該調製した細胞懸濁液を、実施例４（３）に記載の方法に従い、保持部６０へ保持させた。

（４）実施例２の（５）から（７）に示した方法に従い、細胞の固定および膜透過を行なった。

（５）導入口２１から、抗サイトケラチンマウス抗体（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社製）を混合した細胞標識試薬８５０μＬを導入し、３０分静置することでがん細胞を標識した。その後、排出口２２から細胞標識試薬を吸引除去し、導入口２１からＰＢＳ−Ｔを導入することで、残留した細胞標識試薬を洗浄した。

（６）導入口２１から、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗マウスＩｇＧ１抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｃｅ社製）、ＰＥ（フィコエリスリン）標識抗ＣＤ４５抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ製）およびＤＡＰＩ（同仁化学研究所社製）を混合した細胞染色試薬８５０μＬを導入し、２０分静置することで細胞を染色した。その後、排出口２２から細胞染色試薬を吸引除去し、導入口２１からＰＢＳ−Ｔを導入することで、残留した細胞染色試薬を洗浄した。

（７）蛍光顕微鏡２００（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製ＩＸ７１）を用いて、保持部６０に保持された標的粒子７０および夾雑粒子８０全てを検出し、以下の基準で、保持部６０に保持されている標的粒子および夾雑粒子の数を計測した。
標的粒子（がん細胞株）：ＤＡＰＩで染色され（細胞核を有し）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で染色され（サイトケラチンを発現し）、かつＰＥでは染色されない（ＣＤ４５を発現しない）細胞
夾雑粒子（白血球）：ＤＡＰＩで染色され（細胞核を有し）、ＰＥで染色され（ＣＤ４５を発現する）、かつＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８では染色されない（サイトケラチンを発現しない）細胞
表４に、粒子保持装置１００に導入した細胞数と、標的粒子（がん細胞株）の検出率の関係を示す。ここで検出率とは、（１）で健常者血液に添加したがん細胞株の数（（３）の懸濁液調製時の希釈を加味した数）に対する、（７）で検出されたがん細胞数の割合を表す。粒子保持装置への導入細胞数に関わらず、希少な標的細胞を高い検出率で検出できることが分かる。

１００：粒子保持装置
１１：遮光部材
１２：絶縁体
１１ａ・１２ａ：貫通孔
２０：スペーサー
２１：導入口
２２：排出口
２３：貫通部
３１・３２：電極基板
４０：導線
５０：信号発生器
６０：保持部
７０：標的粒子
８０：夾雑粒子
２００：蛍光顕微鏡
３００：誘電泳動力
４００：吸引手段（マイクロマニピュレーター）

Claims

（１）標的粒子を含む試料を保持部に導入し、当該標的粒子を前記保持部に保持させる工程と、
（２）保持された標的粒子を回収手段で回収する工程と、
（３）回収した標的粒子の性状を解析する工程と、
を含む試料中に含まれる標的粒子の解析方法において、
（２）の工程が、前記標的粒子と前記保持部に保持された試料中に含まれる夾雑粒子とを同時に回収する工程であって、
（３）の工程が、回収した夾雑粒子の存在下での標的粒子の性状解析を含む工程である、
前記解析方法。
（２）の工程が、標的粒子の純度が２０％から８０％となるように回収する工程である、請求項１に記載の方法。
保持部が、試料中に含まれる標的粒子および夾雑粒子を保持可能な凹部である、請求項１または２に記載の方法。
（１）の工程が、標的粒子を含む試料を、当該試料中に含まれる標的粒子および夾雑粒子を保持可能な凹部を複数設けた粒子保持装置に導入し、前記保持装置に設けた凹部のうち少なくとも５％の凹部に複数の粒子を保持させる工程であり、
（２）の工程が前記複数の粒子を保持した凹部のうち、標的粒子および夾雑粒子をそれぞれ一つ以上保持した凹部から回収手段で回収する工程である、請求項３に記載の方法。
（３）の工程が、夾雑粒子存在下での標的粒子の性状解析結果から、夾雑粒子単独での性状解析結果を差し引く工程である、請求項１から４に記載の方法。
標的粒子が生体材料からなる粒子である、請求項１から５に記載の方法。
（３）の工程における性状解析が、生体材料からなる粒子が有する核酸の塩基配列解析である、請求項６に記載の方法。