JP2019043867A - アッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
GMPはこれまでに、胃から出るホルモン(CCK:満腹ホルモン)の分泌促進を介した食欲抑制作用(非特許文献3)、脂肪細胞への直接的な作用による脂肪蓄積抑制作用(非特許文献4)、ビフィズス菌の増殖促進作用(非特許文献5)、感染防御作用(特許文献1)、カルシウム吸収促進剤(特許文献2)などが報告されているが、アッカーマンシア・ムシニフィラに対する作用について記載や示唆のある文献等は知られていない。同様にGMP等を加水分解して得られるシアリル糖ペプチド(以下、SGPと略記する)も、アッカーマンシア・ムシニフィラに対する作用はなんら検討されていない。
〔1〕スレオニン及び/又はセリン残基を有するペプチドに糖鎖が結合したシアリル糖ペプチドを含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物であって、
前記糖ペプチドの分子量が500以上3,000以下であり、
前記糖鎖が前記ペプチドのスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、
前記糖鎖の構成糖がシアル酸、N−アセチルガラクトサミン及びガラクトースからなる群から選択される1つ以上であることを特徴とするアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
〔2〕前記シアリル糖ペプチドの糖鎖がシアル酸及びガラクト−N−ビオースからなるものである〔1〕に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
〔3〕前記シアル酸と前記ガラクト−N−ビオースのモル比が1:1〜2:1である〔2〕に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
〔4〕前記シアリル糖ペプチドのペプチド鎖のアミノ酸残基数が1以上13以下である〔1〕〜〔3〕のいずれか1つに記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
〔5〕スレオニン及び/又はセリン残基を有し当該残基の水酸基に糖鎖が結合したシアリル糖ペプチド、を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物であって、
前記糖鎖が、以下の(1)〜(5)からなる群から選ばれる1つ以上であることを特徴とするアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
(1)Neu5Acα2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
(2)Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
(3)Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα1
(4)Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-Ac-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
(5)Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-diAc-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
〔6〕前記糖鎖が、前記(1)及び前記(2)〜(5)からなる群から選ばれる1つ以上である〔5〕に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
〔7〕シアリル糖ペプチドが乳由来であることを特徴とする〔1〕〜〔6〕のいずれか1つに記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
〔8〕〔1〕〜〔7〕のいずれか1つに記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用飲食品。
〔9〕〔1〕〜〔7〕のいずれか1つに記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用医薬品。
〔10〕〔1〕〜〔7〕のいずれか1つに記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用飼料。
本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用組成物、及び該組成物を含む飲食品、医薬品、飼料について以下に詳細に説明する。
本発明のSGPは、スレオニン及び/又はセリン残基を有するペプチドに糖鎖が結合した糖ペプチドであって、分子量が500以上であり、糖鎖がスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、糖鎖の構成糖がシアル酸、N−アセチルガラクトサミン、ガラクトースから選択される1つ以上であるものを用いることができる。
本発明のSGPは、糖鎖がシアル酸、およびガラクト−N−ビオース(Galβ1-3GalNAc)から成るものが好ましく、シアル酸とガラクト−N−ビオースのモル比が1:1〜2:1であるものが更に好ましい。また、本発明のSPGはペプチド鎖が1アミノ酸残基以上13アミノ酸残基以下程度のものを用いることができる。さらに、本発明のSPGはアセチル化したシアル酸を含むものも用いることができる。
(1)Neu5Acα2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
(2)Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
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GMPはκ−カゼインの糖鎖を含むC末端ペプチドであり、牛乳の場合κ−カゼインの106−169残基に相当し、分子量は、約7,000である。本発明のSGPの原料となるGMPは、牛乳以外にもヤギやヒツジなどの獣乳由来のホエイ中から得られるものであればどのようなものでも用いることができる。
また、本発明のSGPは、微生物、植物、動物の臓器の抽出物を酵素などで加水分解することにより調製することもできる。さらに、化学的に合成されたもの、もしくは遺伝子組換え体で調製したものでもよい。
本発明のSGPの製造方法についてその一態様を示し説明する。
本発明のSGPは、例えばGMPを加水分解することにより得られるため、まず、GMPの製造方法の一態様について説明する。
GMPを含む組成物は、特許第2673828号、または特開平6−25297号公報に記載の方法により調製することができる。すなわち、GMPを含有する乳質原料物質、例えばチーズホエー、ホエー蛋白質濃縮物、除蛋白質チーズホエー等を、まずpH4未満に調整した後、分画分子量10,000〜50,000の膜を用い、限外濾過処理をして透過液を得、好ましくは再度、該透過膜をpH4以上に調整した後、分画分子量50,000以下の膜を用いて脱塩し濃縮することによりGMPを調整する方法が挙げられる。また、乳質ホエーをpH6.0以上に調整し40〜79℃で加熱処理したものを膜処理に付して乳清たんぱく質を除去し、GMPを濃縮液側に回収し、得られた濃縮液をpH5.5以下にした後、再び膜処理に供してGMPを透過液側に回収することによりGMP含有量の高い組成物を調製する方法を挙げることができる。
得られた組成物中のGMP量は、例えば、特許文献2の実施例に示されるようなウレア−SDS電気泳動法により分析することができる。
次に、このようにして得られるGMPをエンド型プロテアーゼまたはエキソ型プロテアーゼで処理する工程と、前記工程で得られた処理物を分画分子量500以上3,000以下の限外ろ過に供する処理工程を経ることにより本発明のSGPを製造することができる。
糖ペプチド製造に用いるプロテアーゼの種類は、ペプチド結合を加水分解し、上記(シアリル糖ペプチド:SGP)で記載したような分子量と糖鎖を有する糖ペプチドを得ることができるものであれば特に限定されるものではなく、1種類、又は複数のエンド型プロテアーゼ、エキソ型プロテアーゼを用いることができる。好ましくは、食品や医薬品の製造に使用可能な酵素がよく、アクチナーゼE(科研ファルマ)、アクチナーゼAS(科研ファルマ)、ヌクレイシン(HBI)、オリエンターゼAY(HBI)、スミチームFP(新日本化学工業)、スミチームSPP−G(新日本化学工業)、プロテアーゼA(天野エンザイム)、ペプチダーゼR(天野エンザイム)などを単独、あるいは組み合わせて使用することができる。
本発明のSGPによるアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進作用は、SGPを投与した場合と非投与の場合における腸内または糞便中のアッカーマンシア・ムシニフィラの増加を比較し、非投与よりも投与の方が増加した場合に本発明の増加促進作用があると評価することができる。増加は増殖と同義で用いられる。アッカーマンシア・ムシニフィラの増加・増殖は菌の増加・増殖の評価に通常用いられる方法であればいずれでもよく、例えば、以下の実施例に記載した方法を挙げることができる。
本発明の上記製造方法により得られたSGP(あるいはSGPを含む組成物)は、そのまま飲食品の原材料として用いることができ、SGPを含む組成物を添加すること以外は、各食品の定法により製造すれば良い。
したがって、本発明の有効量のSGPはどのような飲食品に配合しても良く、飲食品の製造工程中に原料に添加しても良い。飲食品の例としては、チーズ、発酵乳、乳製品乳酸菌飲料、乳酸菌飲料、バター、マーガリンなどの乳製品、乳飲料、果汁飲料、清涼飲料などの飲料、ゼリー、キャンディー、プリン、マヨネーズなどの卵加工品、バターケーキなどの菓子・パン類、さらには、各種粉乳の他、乳幼児食品、栄養組成物などを挙げることができるが特に限定されるものではない。
このようにして製造された有効量のSGPを含む飲食品は、アッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用飲食品として提供される。
したがって、本発明のSGPを有効成分として含む医薬品の製剤化に際しては、製剤上許可されている賦型剤、安定剤、矯味剤などを適宜混合して製剤化するほか、SGPをそのまま乾燥して粉末剤、散剤として用いることもできる。また、アッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進作用を妨げない範囲で、賦型剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、懸濁剤、コーティング剤、その他の任意の薬剤を混合して製剤化することもできる。剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤などが可能である。
このようにして製造された有効量のSGPを含む医薬品は、アッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用医薬品として提供される。
したがって、本発明の有効量のSGPは前記飲食品と同様にどのような飼料に配合しても良く、飼料の製造工程中に原料に添加しても良い。
このようにして製造された有効量のSGPを含む飼料は、アッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用飼料として提供される。
本発明のSGPを飲食品、医薬品、飼料などの素材又はそれら素材の加工品に配合させてアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用組成物を製造する場合、配合割合は特に限定されず、製造の容易性や好ましい一日投与量にあわせて適宜調節すればよい。
一日投与量は、投与対象の症状、年齢などを考慮してそれぞれ個別に決定されるが、成人ヒトの場合、SGPを1日当り0.1g以上を摂取すればよく、1g以上が好ましく、10g以上がさらに好ましい。
1.GMPの製造方法
ホエイタンパク質濃縮物(サンラクトN−2、太陽化学製)1kgを50℃の水50Lに溶解し、濃塩酸によりpH3.5に調整した。これを、分画分子量20,000の限外ろ過膜(GR61PP、DDS製)を用い、50℃、圧力0.4MPa、平均透過液流速52.4L/m2・hにて限外ろ過を行なった。透過液量が40Lに達した時点で濃縮液に50℃の水40Lを加え、連続して限外ろ過を行なった。以上の様にして連続運転を行い、透過液を160L得た。
得られた透過液に25%苛性ソーダを加え、pH7.0とし、再度同じ条件、同じ限外ろ過膜で濃縮液が5Lになるまで限外ろ過を行い、脱塩濃縮した。続いて50℃の水を加え、濃縮液量を常に10Lに保ちながら、これまでと同じ条件、同じ限外ろ過膜でダイアフィルトレーションを行い、さらに脱塩した。このダイアフィルトレーションにより透過液量が80Lに達した時点で濃縮液に水を加えるのをやめ、濃縮液量が2Lになるまで限外ろ過にて濃縮し、この濃縮液を乾燥し、GMP54gを得た。
上記1.で得られたGMPを用い、30Kgの5%GMP溶液を調製した。これをエンド型プロテアーゼ(アクチナーゼAS、科研ファルマ製)を添加して50℃で6時間反応させた。これを、分画分子量1,000の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行なった。濃縮液に水を加えて連続して限外ろ過を行なうことでダイアフィルトレーションを行ない、5倍の加水濃縮を行なった後に濃縮液画分を得た。この濃縮液を乾燥し、SGP(1)271.7gを得た。
3.2種類の酵素を組合わせたSGPの製造方法
上記1.で得られたGMPを用い、30Kgの5%GMP溶液を調製した。これをエンド型プロテアーゼ(オリエンターゼAY、HBI製)を添加して50℃で4時間反応させた後、エキソ型プロテアーゼ(ペプチダーゼR、天野エンザイム製)を添加して37℃で2時間反応した。これを、分画分子量1,000の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行なった。濃縮液に水を加えて連続して限外ろ過を行なうことでダイアフィルトレーションを行ない、5倍の加水濃縮を行なった後に濃縮液画分を得た。この濃縮液を乾燥し、SGP(2)を312.6g得た。
実施例1で調製したSGP(1)を2mM塩化カルシウムを含む100mM酢酸緩衝液(pH5.0)で20mg/mLに調製し、それにシアリダーゼ(Clostridium perfringens由来:Sigma,N2876−25UN)を10U/mLとなるように加え、37℃で20時間反応させた。酵素添加なしのブランクは、酵素を添加せずに同条件で反応させた。反応後は5分間ボイルすることで、反応を停止させた。得られた反応液は、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)に供した。SEC分析には、2本のTSKgel G3000PW(東ソー)を装着したL−2000(HITACHI)システムを用い、UV214nmの吸収を検出した。移動相として0.1%トリフルオロ酢酸を含む40%アセトニトリル溶液を用い、流速0.3ml/minで120分間室温でアイソクラチック(isocratic)に溶出した。
SEC分析の結果を図1に示す。70分付近に大きなピークが認められたが、このピークは、酵素反応に用いた酢酸緩衝液である。
SGPの主要なピークは50分から60分の間に認められたが、これらはシアリダーゼ処理することで全体的に低分子側にシフトした。このことから、調製したSGP(1)の主体は、シアル酸を含有する化合物であることが明らかとなった。
LC/MS分析には、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)ParadigmMS2(Michrom Bioresources)に接続したイオントラップ型質量分析計LTQ Velos(Thermofisher scientific)を用い(LC−ESI−IT MS)、分離カラムとしてInertSustain C18(φ0.2mm×150mm,ジーエルサイエンス)を装着した。移動相には、0.1%のギ酸を含んだ2%アセトニトリル溶液(A液)、および0.1%ギ酸を含んだ90%アセトニトリル溶液(B液)を用いた。各SGPを50%アセトニトリル−0.1%ギ酸溶液で100μg/mLに調製し、25μLをHPLCに導入した。移動相は2μL/minで通液し、試料導入後0分から90分の間にB液の割合を0%から45%まで直線的に増加させた。質量分析計は、MS測定(m/z400−2000,ポジティブモード)とMS/MS測定を行った。
MS/MS測定は、MSのうち強度の高い順に5つのイオンを自動的にプレカーサーイオンとして選択し、コリジョンエネルギー35Vで破壊して生じたプロダクトイオンのm/zを観測した。プレカーサーイオンとプロダクトイオンのm/zの差が292であるものをNeu5Ac、334をN,O−ジアセチルノイラミン酸(O-Ac-Neu5Ac)、376をN,O,O−トリアセチルノイラミン酸(O,O-diAc-Neu5Ac)、203をGalNAc、162をGalと帰属し、プロダクトイオンのパターンから糖鎖構造を決定した。糖鎖が完全に解離したと思われるイオンのm/zをペプチドにプロトンが付加したイオンに由来すると推定し、そのm/zに相当するペプチド配列をGMPの配列中から探索することで、糖ペプチドの構造を推定した。
実施例1で調製したSGP(1)について、LC/MS分析で得られたMSスペクトルおよびMS/MSスペクトルから、SGPに含まれる糖ペプチドの糖鎖構造を推定した。
表1に、LC/MS分析で検出した糖ペプチドの糖鎖構造を示す。その結果、検出したいずれの糖ペプチドもシアル酸を含む糖鎖が結合したペプチドであった。検出した多くの糖ペプチドがシアル酸を2分子結合したNeu5Acα1-3Galβ1-3(Neu5Acα1-6)GalNAcの糖鎖構造(Glycan type 3, 4, 5, 6, 7)を有していたが、シアル酸が1分子であるNeu5Acα1-3Galβ1-3GalNAc(Glycan type 1)やGalβ1-3(Neu5Acα1-6)GalNAc(Glycan type 2)も検出された。さらに、シアル酸のO−アセチル体であるN,O−ジアセチルノイラミン酸(O-Ac-Neu5Ac、Glycantype 4)、およびN,O,O−トリアセチルノイラミン酸(O- diAc-Neu5Ac、Glycan type 5)も検出された。、また、一つのペプチド鎖に2本の糖鎖が結合した糖ペプチド(Glycan type 6, 7)も検出された。
MS/MSスペクトル解析から検出したペプチド鎖は、いずれもウシのグリコマクロペプチドに含まれるペプチド鎖であった。検出した全ての糖ペプチドにはセリンまたはスレオニン残基が1分子以上存在し、ペプチド鎖長は最も短いもので1残基、最も長いもので13残基であった。また、検出したペプチド鎖の分子量は、745から2928の範囲であった。
SGPは糖鎖とペプチド鎖から成るが、アッカーマンシア・ムシニフィラの増加作用にはSGP中の糖鎖の構成糖とその存在比率が重要と考えられる。
実施例3で示したように、SGPの糖鎖は、シアル酸、およびガラクト−N−ビオース(Galb1-3GalNAc)から成ることが明らかとなった。よって、次にSGP中のシアル酸とガラクト-N-ビオースのそれぞれの量を測定し、これらの存在比を調べた。
実施例1で調製したSGP中のシアル酸量は、以下に記載した方法で測定した。すなわち、シアル酸(N−アセチルノイラミン酸)量を測定するために、ねじ口試験管に100μLのサンプル溶液、800μLの水、および100μLの1N硫酸溶液を添加し、ブロックヒーターを用いて80℃で45分間、加熱した。冷却後、等量の100mMの水酸化ナトリウムで中和した後、0.45μmのフィルターで不溶物を除去した。得られた反応液中の糖含量は、Carbopak PA1カラムを装着したDIONEX ICS-5000DPシステムを用いて測定した。
実施例1で調製したSGPからガラクト−N−ビオースを遊離させるために、まず実施例2に記載した方法でSGPをシアリダーゼ処理した。シアリダーゼ処理後のSGPは、引き続きO−グルカナーゼ(エンド−a−N−アセチルガラクトサミニダーゼ)処理することで、SGPからガラクト−N−ビオースを遊離させた。遊離したガラクト−N−ビオースは、Carbopak PA1カラムを装着したDIONEX ICS-5000DPシステムを用いて測定した。
シアル酸(N−アセチルノイラミン酸)とガラクト−N−ビオースのモル比は、実施例1で調製したSGP(1)が1.86:1、SGP(2)が1.67:1であった
マウスに通常餌(コントロール)、実施例1で調製したSGP(1)を10%添加した餌を3週間摂取させた。摂取期間終了後に盲腸内容物を採取し、DNAを抽出した。得られたDNAから総菌量とアッカーマンシア・ムシニフィラ量を測定するために、リボゾームRNA遺伝子をターゲットとした定量的PCRを行なった。ヒトにおける難消化性成分の主な発酵部位は大腸でありアッカーマンシア・ムシニフィラも大腸に存在するが、マウスでの主な発酵部位は盲腸であるため、この試験では盲腸内容物について測定した。したがって、実験結果は盲腸内容物中の総菌量、及びアッカーマンシア・ムシニフィラ量を示すが、これらの結果が盲腸での作用に限定するわけではなく、ヒトでの主な発酵部位である大腸における大腸内容物または糞便中の総菌量、及びアッカーマンシア・ムシニフィラ量に置き換えることができる。
総菌量はControl群に比べてSGPを10%添加した餌を摂取したSGP群で有意に増加した(図2)。
また、アッカーマンシア・ムシニフィラ量は、Control群に比べて、SGP群で顕著に増加した(図3)。SGP群は、Control群よりも約1,000倍多いアッカーマンシア・ムシニフィラが検出された。
これらの結果から、SGPは腸内のアッカーマンシア・ムシニフィラが増加させる作用を有していることが明らかとなった。
実施例1で得られたSGP粉末30gに、ビタミンCとクエン酸の等量混合物40g、グラニュー糖100g、コーンスターチと乳糖の等量混合物60gを加えて混合した。混合物をスティック状袋に詰め、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用サプリメントを製造した。
表2に示した配合により原料を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用飲料を製造した。
表3に示した配合により原料を混合し、造粒により顆粒状とした後、空カプセルに10mgずつ充填して、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用医薬品を含むカプセル剤を製造した。
Claims (10)
- スレオニン及び/又はセリン残基を有するペプチドに糖鎖が結合したシアリル糖ペプチドを含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物であって、
前記糖ペプチドの分子量が500以上3,000以下であり、
前記糖鎖が前記ペプチドのスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、
前記糖鎖の構成糖がシアル酸、N−アセチルガラクトサミン及びガラクトースからなる群から選択される1つ以上であることを特徴とするアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。 - 前記シアリル糖ペプチドの糖鎖がシアル酸及びガラクト−N−ビオースからなるものである請求項1に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
- 前記シアル酸と前記ガラクト−N−ビオースのモル比が1:1〜2:1である請求項2に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
- 前記シアリル糖ペプチドのペプチド鎖のアミノ酸残基数が1以上13以下である請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
- スレオニン及び/又はセリン残基を有し当該残基の水酸基に糖鎖が結合したシアリル糖ペプチド、を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物であって、
前記糖鎖が、以下の(1)〜(5)からなる群から選ばれる1つ以上であることを特徴とするアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
(1)Neu5Acα2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
(2)Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
(3)Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα1
(4)Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-Ac-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
(5)Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-diAc-Neu5Acα2-6)GalNAcα1 - 前記糖鎖が、前記(1)及び前記(2)〜(5)からなる群から選ばれる1つ以上である請求項5に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
- シアリル糖ペプチドが乳由来であることを特徴とする請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
- 請求項1〜請求項7のいずれか1項に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用飲食品。
- 請求項1〜請求項7のいずれか1項に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用医薬品。
- 請求項1〜請求項7のいずれか1項に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用飼料。
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