JP4313767B2 - ヘリコバクター・ピロリ剥離作用を有するポリペプチド - Google Patents
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本発明は、ヘリコバクター・ピロリ剥離作用を有するポリペプチドに関する。より詳細には、バターミルクを加水分解することにより得られる、ヘリコバクター・ピロリ剥離作用を有するポリペプチドに関する。また、本発明は、該ポリペプチドを有効成分とする組成物に関する。
ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori；Ｈｐ）は、WarrenとMarshallにより胃潰瘍患者の胃から発見されて以来（非特許文献１参照）、世界的に最も感染者数の多い病原性菌の1つであることが明らかになった（非特許文献２参照）。現在では、胃炎（非特許文献３参照）、消化性潰瘍（非特許文献１及び非特許文献４参照）、胃癌（非特許文献５、非特許文献６及び非特許文献７参照）及び胃リンパ腫（非特許文献８参照）の発症に関与していることが示唆されている。
Ｈｐを除菌する治療法や医薬品の研究は盛んに行われている。現在は抗生物質投与による治療が主流である。我国でも日本ヘリコバクター学会が「H. pylori感染の診断と治療のガイドライン」を作成し、除菌治療の第一選択薬としてプロトンポンプ阻害薬（lansoprazole）と抗生物質二剤（amoxicillinおよびclarithromycin）を1週間投与する３剤併用療法を推奨している。しかしながら、副作用が１４．８〜４５．１％の患者で報告され、耐性菌も５〜１０％の頻度で発生していることが問題点として論じられている。一方で抗生物質を用いない除菌法も研究されており、その代表としてはプロバイオティクスを用いる方法などが挙げられる（非特許文献９参照）。しかしながら、メカニズムが解明されていないため、医学的治療に応用するには至っていないのが現状である。そこで胃粘膜の構造および性状、さらに粘膜内でのＨｐの細菌学的特徴を考慮した除菌方法（素材）を開発することが望まれている。
胃粘膜は、表層ムチン層と腺ムチン層が交互に重なる多重構造をしている。表層ムチンは胃酸から胃を保護するために粘膜上皮細胞から常に分泌されるが、腺ムチンは食事摂取の際に胃底腺から胃酸やペプシンを包む形で分泌される。また、表層ムチンは、セリン、トレオニン、プロリンおよびシステインに富む１,３００アミノ酸のポリペプチドを基本骨格とするＭＵＣ５ＡＣ糖タンパク質であることが知られている（非特許文献１０参照）。Ｈｐは、胃内の、主として上皮細胞近くの表層ムチン層で生育・増殖しており、新しいムチンが分泌されると押し上げられて胃内腔表面（粘膜層上層）に近づくが、その後上皮細胞側へ移動するといった動態を繰り返していると考えられている（非特許文献１１参照）。Ｈｐと胃上皮細胞やそれを覆う胃ムチンとの接着に関する研究も多く行われており、３’−シアリルラクトース（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ；３’ＳＬ）に代表されるシアル酸を中心に（非特許文献１２及び非特許文献１３参照）、糖タンパク質や糖脂質の硫酸化オリゴ糖（非特許文献１４及び非特許文献１５参照）、さらに、基底膜構成成分であるラミニンやコラーゲン等多数が報告されている（非特許文献１６参照）。
こうした知見を利用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける上皮細胞（モデル）や胃ムチンへのＨｐ接着抑制作用が、上記の物質（非特許文献１７参照）に加えクランベリージュース（非特許文献１８及び非特許文献１９参照）や牛乳由来の糖タンパク質（非特許文献２０参照）などについて報告されている。これらの結果は、Ｈｐと阻害物質を同時に添加して凝集反応を調べるか、プレートに固定化した細胞あるいはムチンに菌体懸濁液と同時に阻害物質を混入して得られたものである（非特許文献２０及び非特許文献１９参照）。しかしながら、Ｈｐ凝集／接着抑制作用があっても、Ｈｐ保菌者に対して投与する場合、実際に除菌効果が得られるか不明である。胃ムチンからのＨｐ剥離作用を調べている報告は殆どなく、クランベリージュースを用いた報告（非特許文献１８参照）では、Ｈｐ接着抑制作用が認められた高分子非透析画分にＨｐ剥離作用が無かったと示されている。
さらに、ピロリに対する感染阻止効果に関し、乳汁由来のムチンに定着阻害効果があることが開示されている（特許文献１参照）。しかしながら、記載されている方法は乳脂肪及びカゼイン、さらにはリポ蛋白を除去した後、セファロースカラムで乳汁由来のムチンを分離するものである。また、乳汁由来のムチンの原料としてチーズ等の製造工程で副産物として大量に出るホエーが利用可能であり、価格的にも実用的にも有利であることが記載されているが、乳汁由来のムチンは乳汁中の含量が極めて少なく（特許文献１において０．０１％の収量）、高価な素材となることが予想され、採算性及び実現性には問題がある。
バターミルク（ＢＭ）は、バター製造時のチャーニングによる副産物である。ＢＭには、通常の脱脂乳にはごくわずかにしか含まれない乳脂肪球膜（ＭＦＧＭ）の大部分が移行しており（非特許文献２１参照）、そのＭＦＧＭは多量のシアル酸、セリン、トレオニンを多く含む糖ペプチドから構成されている（非特許文献２２参照）。これまで、ＢＭをブロメライン消化する事で得られた糖ポリペプチドが、細胞表層シアル酸残基をレセプターとするウシロタウイルスに対する感染抑制作用を有することが報告されている（非特許文献２３参照）。
特許第３２５５１６１号公報
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本発明は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｐ）の胃粘膜に対する接着抑制効果のみならず、Ｈｐ保菌者の胃粘膜からＨｐを剥離する効果も有する安価なポリペプチドを提供することを目的とする。
本発明者らは、バターミルク（ＢＭ）のＨｐに対する効果について検討を行った。その結果、ＢＭをプロテアーゼ処理することにより、Ｈｐへの接着性が向上したＢＭ分解物が得られることを見出した。また、このＢＭ分解物が、Ｈｐ臨床分離株に対し、実際に顕著な胃粘膜からの剥離活性を有することを見出した。本発明はこれらの知見に基づき完成したものである。
すなわち、本発明は、ＢＭまたはその乾燥物の溶液をプロテアーゼ処理することにより得られる分子量５〜９００ｋＤａのポリペプチドを提供するものである。
また、本発明は、上記ポリペプチドを有効成分とする、ヘリコバクター・ピロリ接着抑制作用のみならず剥離作用を有する組成物を提供するものである。
また、本発明は、上記ポリペプチドを有効成分とする、ヘリコバクター・ピロリ接着抑制作用のみならず剥離作用を有する組成物を提供するものである。
また、本発明は、ＢＭまたはその乾燥物の溶液をプロテアーゼ処理することにより得られる分子量５〜９００ｋＤａのポリペプチドを含む組成物を提供するものである。
さらに、本発明は、上記ポリペプチドを有効成分として含む、消化器潰瘍の予防用または改善用食品を提供するものである。
さらに、本発明は、上記ポリペプチドを有効成分として含む、消化器潰瘍の予防用または改善用食品を提供するものである。
また、本発明は、上記ポリペプチドを有効成分として含む、消化器潰瘍の予防剤または治療剤を提供する。
さらに、本発明は、上記ポリペプチドを有効成分として含む、ヘリコバクター・ピロリ感染の予防用または改善用食品を提供する。
さらに、本発明は、上記ポリペプチドを有効成分として含む、ヘリコバクター・ピロリ感染の予防用または改善用食品を提供する。
また、本発明は、上記ポリペプチドを有効成分として含む、ヘリコバクター・ピロリ感染の予防剤または治療剤を提供する。
本発明のポリペプチドは、胃の粘膜層に感染したＨｐを剥離する活性が顕著に高い。この活性は、実施例３に示すように、Ｈｐ定着阻害活性を有する乳汁ムチンと比較しても高いことが明らかである。
本発明のポリペプチドは、安価な原料から５０％以上の高収率で調製することが可能であり、上述の採算性の問題を解決するものである。
したがって、本発明のポリペプチドを用いることにより、Ｈｐ感染に対する予防及び／または治療効果を有する食品や医薬品の開発が可能となる。さらに、これらの食品や医薬品は、Ｈｐ感染に関連する消化器潰瘍などの疾患の予防及び／または治療に有効である。
したがって、本発明のポリペプチドを用いることにより、Ｈｐ感染に対する予防及び／または治療効果を有する食品や医薬品の開発が可能となる。さらに、これらの食品や医薬品は、Ｈｐ感染に関連する消化器潰瘍などの疾患の予防及び／または治療に有効である。
本発明のポリペプチドは、ＢＭまたはＢＭを限外ろ過によるダイアフィルトレーション処理で乳糖や塩類などの低分子成分を除去した乾燥物から得ることができる。ＢＭ中に含まれる乳脂肪球膜（ＭＦＧＭ）を含むタンパク質成分をプロテアーゼで加水分解処理することにより、これらを構成する糖ペプチドである本発明のポリペプチドを調製することができる。加水分解はプロテアーゼ処理だけでなく、各種の酸やアルカリなどの化学的処理でも行うことができるが、食品に含有させることを考慮するとプロテアーゼ処理が好ましい。加水分解に用いるプロテアーゼとしては、トリプシン、パパイン、パンクレアチン、ペプシンなどが挙げられるが、乳酸菌やその他のプロテアーゼ活性を有する微生物、及びこれらの抽出物を用いることも可能であり、プロテアーゼ活性をもつものである限りこれらに限定されるものではない。
本発明のポリペプチドは、分子量が５〜９００ｋＤａであり、例えば低分子成分であれば、５〜４５ｋＤａであり、好ましくは１０〜４０ｋＤａであり、更に好ましくは１０〜３０ｋＤａである。また、例えば高分子成分であれば、４００〜９００ｋＤａであり、好ましくは５００〜８００ｋＤａであり、更に好ましくは５５０〜７５０ｋＤａである。
本発明のポリペプチドは、例えば以下のようにして調製することができる。ＢＭまたはＢＭパウダーを脱イオン水に懸濁し、８５〜９０℃で加熱殺菌する。懸濁液を冷却後、水酸化ナトリウムあるいは塩酸を添加して、用いるプロテアーゼに至適のｐＨに調整する。その後、プロテアーゼ粉末、あるいは懸濁液を添加し、至適温度で緩く撹拌しながら反応させる。反応後、水酸化ナトリウムあるいは塩酸でｐＨを６．８〜７．０に調整し、９０℃、１０分間の加熱でプロテアーゼを失活させる。冷却後、凍結乾燥し、ＢＭ加水分解物を得る。プロテアーゼの使用量、反応温度、反応時間などの具体的な反応条件については、当業者であれば容易に設定が可能であろう。このＢＭ加水分解物中に含まれる本発明のポリペプチドは、精製して用いてもよく、また未精製のまま用いてもよい。
上記のようにして調製した本発明のポリペプチドは、Ｈｐ表層成分との結合能が高く、胃粘膜からＨｐを剥離させる作用を有する。また、Ｈｐ剥離活性は、出発材料であるＢＭやＢＭパウダーには存在せず、プロテアーゼによる分解で初めて活性が発現する。
したがって、本発明は、本発明のポリペプチドを有効成分とするＨｐ剥離作用を有する組成物を提供するものである。
本発明の組成物は、例えば上記方法により、ＢＭ加水分解物から調製することができる。
本発明の組成物は、例えば上記方法により、ＢＭ加水分解物から調製することができる。
さらに、遠心分離などにより沈殿物を除去した液体若しくはその乾燥粉末、またはその沈殿物を用いることもできる。
本発明のポリペプチドは、有効成分として食品中に含有させることにより、Ｈｐ感染や消化器潰瘍の予防・改善用食品として用いることができる。
本発明のポリペプチドは、有効成分として食品中に含有させることにより、Ｈｐ感染や消化器潰瘍の予防・改善用食品として用いることができる。
本発明の消化器潰瘍の予防・改善用食品は、実質的に本発明のポリペプチドのみを含む食品であってもよいし、他の栄養補助食品と組み合わせたサプリメントの形であっても良い。また、当該ポリペプチドを既存の食品や飲料等に直接添加したものであってもよい。例えば、ペプチドをガム、キャンディー、ゼリー、グミ、クッキー、ビスケット、チョコレート等の菓子類、ジュース等の清涼飲料、チーズ、バター、ヨーグルト等の乳製品、アイスクリーム、ハム等の農産加工品、ちくわ、はんぺん等の水産加工品、そば、うどん等の麺類、パン、ケーキ等の小麦粉加工品、缶詰または味噌、醤油、塩、こしょう、さとう、人工甘味料等の調味食品等に直接添加することができる。また、ポリペプチドをこれらの食品の加工段階で混合してもよい。ポリペプチドを食品に加工する際は、通常の食品加工方法に基づき行うことができる。また、ポリペプチドを食品に添加・混合する際は、ポリペプチドを粉末、顆粒、細粒等の固形状で用いてもよく、あるいは液状で用いてもよい。本発明の消化器潰瘍の予防・改善用食品は、消化器潰瘍の予防または改善用の特定保健用食品、機能性食品、健康食品としても応用可能である。なお、「機能性食品」とは、生体調節機能をもつ物質を含む食品を意味し、厚生労働省より特定保健用食品として食品毎に個別の許可を得ることにより、機能性を表示することができる。
本発明の食品においては、一般に食品１００ｇあたり０．１〜５０ｇ程度の範囲でポリペプチドを配合することが好ましい。摂取量は、摂取対象の性別、体重、体質、年齢、他の摂取食品等により異なるが、一般にヒト成人が対象の場合には、ポリペプチド摂取量が１日あたり３〜１５ｇとなる範囲で摂取させることが好ましい。摂取回数は、１週に数回ないし１日１回が適当である。
また、本発明のポリペプチドは、Ｈｐ感染や消化器潰瘍の予防剤又は治療剤などの医薬組成物として用いることもできる。
本発明の消化器潰瘍の予防剤又は治療剤を生体に投与する場合は、経口的に投与する。
本発明の消化器潰瘍の予防剤又は治療剤を生体に投与する場合は、経口的に投与する。
本発明の組成物を適当な剤型に製剤化して用いてもよい。例えば錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤、チュワブル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤等の製剤で用いることができる。これらの剤型に製剤化するには薬学上許容しうる適当な担体、賦形剤、添加剤等を用いて行うことができる。
また錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、トローチ剤、チュワブル剤等の固形製剤を調製するには、例えば重炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、デンプン、ショ糖、マンニトール、カルボキシメチルセルロース等の担体、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、グリセリン等の添加剤を加えて常法により行うことができる。
本発明の組成物を、医薬として使用する場合には、その投与量は、患者の性別、体重、体質、年齢、症状あるいは投与剤型等により異なるが、一般にポリペプチドを有効成分として成人１日当り０．１〜５０ｇ、好ましくは３〜１５ｇの範囲で適宜選択することができる。投与回数は、患者の症状あるいは投与剤型等により異なるが、１週に数回ないし１日１回が適当である。
Ｈｐ接着試験
材料および方法
（１）使用菌株
この試験において使用したHelicobacter pylori ＡＴＣＣ ４３５０４TおよびＡＴＣＣ ４３５７９はAmerican Type Culture Collectionより購入した。
材料および方法
（１）使用菌株
この試験において使用したHelicobacter pylori ＡＴＣＣ ４３５０４TおよびＡＴＣＣ ４３５７９はAmerican Type Culture Collectionより購入した。
（２）ＢＭ加水分解物の調製
ＢＭパウダーを６０ｇ／Ｌとなるように脱イオン水に懸濁し、８５〜９０℃で１５分間殺菌した。冷却後、懸濁液を水酸化ナトリウムあるいは塩酸（１〜６Ｎ、ペプシンの場合は濃塩酸）にて至適ｐＨに調整し、０．３ｇの各種プロテアーゼ粉末（日本バイコン社製）を添加し、至適温度で２４時間緩く撹拌しながら反応させた。反応開始１２時間後にｐＨを再調整し、０．３ｇのプロテアーゼ粉末を再添加した。反応後、水酸化ナトリウムあるいは塩酸にてｐＨを６．８〜７．０に調整し、９０℃、１０分間の加熱で酵素を失活させた。冷却後、凍結乾燥し、ＢＭ加水分解物を得た。使用酵素、その至適温度および至適ｐＨを表１に示す。
ＢＭパウダーを６０ｇ／Ｌとなるように脱イオン水に懸濁し、８５〜９０℃で１５分間殺菌した。冷却後、懸濁液を水酸化ナトリウムあるいは塩酸（１〜６Ｎ、ペプシンの場合は濃塩酸）にて至適ｐＨに調整し、０．３ｇの各種プロテアーゼ粉末（日本バイコン社製）を添加し、至適温度で２４時間緩く撹拌しながら反応させた。反応開始１２時間後にｐＨを再調整し、０．３ｇのプロテアーゼ粉末を再添加した。反応後、水酸化ナトリウムあるいは塩酸にてｐＨを６．８〜７．０に調整し、９０℃、１０分間の加熱で酵素を失活させた。冷却後、凍結乾燥し、ＢＭ加水分解物を得た。使用酵素、その至適温度および至適ｐＨを表１に示す。
（３）試験方法
各種プロテアーゼによるＢＭ加水分解物、未処理ＢＭ、ブタおよびマウス胃粗ムチンを、それぞれ１０ｍｇ／ｍＬとなるように０．１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．６）に懸濁／溶解し、９６ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ Ａ／Ｓ）に７５μＬ／ウェルずつ加え、３７℃で２時間コーティングした。滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．２）２５０μＬにて各ウェルを３回洗浄後、Ｈｐ懸濁液を５０μＬ／ウェルずつ添加し、微好気条件下で緩やかに振とうしながら（３０ｒｐｍ）３７℃で２時間培養した。滅菌ＰＢＳで５回洗浄することにより非接着菌体を除去した。その後、１００μＬのＰＢＳを添加して激しいピペッティングを行い、接着菌体を剥離し、５０μＬを５％緬羊脱繊維血液添加Tryptic soy寒天培地に塗抹した。３７℃で９６時間、微好気培養後、出現コロニー数をカウントし、１ウェル当たりの接着菌数を算出した。
各種プロテアーゼによるＢＭ加水分解物、未処理ＢＭ、ブタおよびマウス胃粗ムチンを、それぞれ１０ｍｇ／ｍＬとなるように０．１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．６）に懸濁／溶解し、９６ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ Ａ／Ｓ）に７５μＬ／ウェルずつ加え、３７℃で２時間コーティングした。滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．２）２５０μＬにて各ウェルを３回洗浄後、Ｈｐ懸濁液を５０μＬ／ウェルずつ添加し、微好気条件下で緩やかに振とうしながら（３０ｒｐｍ）３７℃で２時間培養した。滅菌ＰＢＳで５回洗浄することにより非接着菌体を除去した。その後、１００μＬのＰＢＳを添加して激しいピペッティングを行い、接着菌体を剥離し、５０μＬを５％緬羊脱繊維血液添加Tryptic soy寒天培地に塗抹した。３７℃で９６時間、微好気培養後、出現コロニー数をカウントし、１ウェル当たりの接着菌数を算出した。
なお、ブタ胃ムチンはＳｉｇｍａ社より購入し、マウス胃ムチンはＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、♂）より調製した。すなわち、頸椎脱臼後、胃を摘出、切開した。内容物を除去しＰＢＳにて洗浄後、スパチュラにて内側表層ムチンを掻き取り、１０ｍＭアジ化ナトリウム添加ＰＢＳに懸濁させた。５分間激しく撹拌後、１０,０００ｇで２０分間遠心分離し、得られた上清をＭＷ １０,０００〜１２,０００の透析チューブにて透析した。透析内液を、０．４５μｍフィルターで処理後、凍結乾燥して得られた粉末をマウス胃粗ムチンとして試験に供した。
また、Ｈｐ懸濁液は上記の培地上で９６時間培養したＨｐコロニーを綿棒にて回収し、６６０ｎｍの吸光度が０．４±０．０１となるようにＰＢＳに懸濁したものを１００倍希釈した調製液である。
（４）統計処理
接着性の比較は独立２標本のｔ−検定にて実施し、ｐ＜０．０５を統計学的有意とした。なお、統計解析用ソフトはSTATISTICA（デザインテクノロージーズ）を使用した。
接着性の比較は独立２標本のｔ−検定にて実施し、ｐ＜０．０５を統計学的有意とした。なお、統計解析用ソフトはSTATISTICA（デザインテクノロージーズ）を使用した。
結果
各種プロテアーゼ処理されたＢＭ加水分解物のＡＴＣＣ ４３５０４TとＡＴＣＣ ４３５７９に対する接着性を、平均接着菌体数±標準誤差として図１に示す（４回平均）。
各種プロテアーゼ処理されたＢＭ加水分解物のＡＴＣＣ ４３５０４TとＡＴＣＣ ４３５７９に対する接着性を、平均接着菌体数±標準誤差として図１に示す（４回平均）。
ＡＴＣＣ ４３５０４Tに対する接着性についてみると、トリプシン、パパインおよびパンクレアチン分解ＢＭは未処理ＢＭと比較して６〜１２倍と有意に（ｐ＜０．０５）強い接着性が認められた。
ＡＴＣＣ ４３５７９に対する接着性についてみると、トリプシン（ｐ＜０．０１）、パパイン（ｐ＜０．００１）およびパンクレアチン（ｐ＜０．０５）分解ＢＭは未処理ＢＭと比較して１０〜１５倍と有意に強い接着性が認められた。この結果はＢＭをプロテアーゼ処理することにより、Ｈｐ接着性が増加することを示している。
マウス胃ムチンおよびブタ胃ムチンの接着性と比較した結果、ＡＴＣＣ ４３５０４Tでは、トリプシン分解ＢＭは有意に（ｐ＜０．０５）強い接着性を示した。ＡＴＣＣ ４３５７９に対しても、トリプシン（ｐ＜０．００１）、パパイン（ｐ＜０．００１）およびパンクレアチン（ｐ＜０．０５）分解ＢＭは有意に強い接着性を示した。一方、未処理ＢＭはＡＴＣＣ ４３５７９では有意に（ｐ＜０．０５）両胃ムチンより接着性が弱いことが確認され、またＡＴＣＣ ４３５０４Tに対する接着性も胃ムチンの約５０％と弱い傾向を示した。これらの結果は、ＢＭをプロテアーゼ処理することにより、Ｈｐと胃ムチン間の親和性を上回るＨｐとの親和性を得たことを示唆している。
Ｈｐ剥離試験
実施例１でＢＭをプロテアーゼ処理することによりＨｐに対し強力な接着性を示す分解物が得られることが確認されたことから、このＢＭ分解物を用いてＨｐ剥離活性を確認した。
実施例１でＢＭをプロテアーゼ処理することによりＨｐに対し強力な接着性を示す分解物が得られることが確認されたことから、このＢＭ分解物を用いてＨｐ剥離活性を確認した。
材料および方法
（１）使用菌株
ヘリコバクター・ピロリＡＴＣＣ ４３５０４TおよびＡＴＣＣ ４３５７９はAmerican Type Culture Collectionより購入した。Ｈｐ ＬＫＭ ＨＰ−２、ＬＫＭ ＨＰ−３、ＬＫＭ ＨＰ−４、ＬＫＭ ＨＰ−５およびＬＫＭ ＨＰ−７は大阪医科大学第二内科に通院している胃潰瘍患者の胃体中部大弯より分離したものである。なお、ピロリ菌の分離はヘルシンキ宣言の精神に則り、事前に趣旨及び試験内容を説明し、保菌者の同意に基づいて実施した。これらの菌株は５％緬羊脱繊維血液添加Tryptic soy 寒天培地（ＭＥＲＣＫ）に白金耳にて塗抹し、アネロパック・ヘリコ（三菱ガス）を用いた微好気培養にて９６時間毎に継代培養した。なお、継代毎にグラム染色による形態観察とカタラーゼ、ウレアーゼおよびオキシダーゼ試験にて純粋培養が行われていることを確認した。
（１）使用菌株
ヘリコバクター・ピロリＡＴＣＣ ４３５０４TおよびＡＴＣＣ ４３５７９はAmerican Type Culture Collectionより購入した。Ｈｐ ＬＫＭ ＨＰ−２、ＬＫＭ ＨＰ−３、ＬＫＭ ＨＰ−４、ＬＫＭ ＨＰ−５およびＬＫＭ ＨＰ−７は大阪医科大学第二内科に通院している胃潰瘍患者の胃体中部大弯より分離したものである。なお、ピロリ菌の分離はヘルシンキ宣言の精神に則り、事前に趣旨及び試験内容を説明し、保菌者の同意に基づいて実施した。これらの菌株は５％緬羊脱繊維血液添加Tryptic soy 寒天培地（ＭＥＲＣＫ）に白金耳にて塗抹し、アネロパック・ヘリコ（三菱ガス）を用いた微好気培養にて９６時間毎に継代培養した。なお、継代毎にグラム染色による形態観察とカタラーゼ、ウレアーゼおよびオキシダーゼ試験にて純粋培養が行われていることを確認した。
（２）ＢＭ加水分解物の調製
実施例１と同様の方法でＢＭ分解物を調製した。プロテアーゼは実施例１でＨｐに対し高い接着活性が発現したトリプシンおよびパンクレアチンを用いた。
実施例１と同様の方法でＢＭ分解物を調製した。プロテアーゼは実施例１でＨｐに対し高い接着活性が発現したトリプシンおよびパンクレアチンを用いた。
（３）試験方法
ブタ胃ムチンを、１０ｍｇ／ｍＬとなるように０．１Ｍ炭酸バッファーに懸濁し、９６ウェルマイクロプレートに７５μＬ／ウェルずつ加えて３７℃で２時間コーティングした。滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．２）２５０μＬにて各ウェルを３回洗浄後、Ｈｐ懸濁液を５０μＬ／ウェルずつ添加し、微好気条件下で緩やかに振とうしながら（３０ｒｐｍ）３７℃で２時間培養した。滅菌ＰＢＳにて２回洗浄後、ＰＢＳに種々の濃度で懸濁／溶解したＢＭ加水分解物（０．０６２５、０．１２５、０．２５、０．５、１．０、１０ｍｇ／ｍＬ）を５０μＬ／ウェル添加し、微好気条件下で緩やかに振とうしながら（３０ｒｐｍ）３７℃で１時間培養した。滅菌ＰＢＳにて２回洗浄後、１００μＬのＰＢＳを添加し、激しいピペッティングにて接着菌体を剥離し、５０μＬを上記の培地に塗抹し、微好気条件にて培養後のコロニー数を計測した。コントロールはＢＭ加水分解物の代わりにＰＢＳを用いた。各濃度における剥離率は以下の式で算出した。
ブタ胃ムチンを、１０ｍｇ／ｍＬとなるように０．１Ｍ炭酸バッファーに懸濁し、９６ウェルマイクロプレートに７５μＬ／ウェルずつ加えて３７℃で２時間コーティングした。滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．２）２５０μＬにて各ウェルを３回洗浄後、Ｈｐ懸濁液を５０μＬ／ウェルずつ添加し、微好気条件下で緩やかに振とうしながら（３０ｒｐｍ）３７℃で２時間培養した。滅菌ＰＢＳにて２回洗浄後、ＰＢＳに種々の濃度で懸濁／溶解したＢＭ加水分解物（０．０６２５、０．１２５、０．２５、０．５、１．０、１０ｍｇ／ｍＬ）を５０μＬ／ウェル添加し、微好気条件下で緩やかに振とうしながら（３０ｒｐｍ）３７℃で１時間培養した。滅菌ＰＢＳにて２回洗浄後、１００μＬのＰＢＳを添加し、激しいピペッティングにて接着菌体を剥離し、５０μＬを上記の培地に塗抹し、微好気条件にて培養後のコロニー数を計測した。コントロールはＢＭ加水分解物の代わりにＰＢＳを用いた。各濃度における剥離率は以下の式で算出した。
剥離率（％）＝［（Ａ−Ｂ）／Ａ］×１００
Ａ：コントロールサンプルにおけるマイクロプレート当たりの接着菌体数
Ｂ：ＢＭ分解物添加サンプルにおけるマイクロプレート当たりの接着菌体数
（４）統計処理
接着性の比較は独立２標本のｔ−検定にて実施し、ｐ＜０．０５を統計学的有意とした。なお、統計解析用ソフトはSTATISTICA（デザインテクノロージーズ）を使用した。
Ａ：コントロールサンプルにおけるマイクロプレート当たりの接着菌体数
Ｂ：ＢＭ分解物添加サンプルにおけるマイクロプレート当たりの接着菌体数
（４）統計処理
接着性の比較は独立２標本のｔ−検定にて実施し、ｐ＜０．０５を統計学的有意とした。なお、統計解析用ソフトはSTATISTICA（デザインテクノロージーズ）を使用した。
結果
ＡＴＣＣ ４３５０４TとＡＴＣＣ ４３５７９に対して接着性の強かったトリプシンおよびパンクレアチン処理ＢＭ（１０ｍｇ／ｍｌ）の剥離試験の結果を表２に示す。
ＡＴＣＣ ４３５０４TとＡＴＣＣ ４３５７９に対して接着性の強かったトリプシンおよびパンクレアチン処理ＢＭ（１０ｍｇ／ｍｌ）の剥離試験の結果を表２に示す。
ＡＴＣＣ株に対してだけでなく、臨床分離菌株に対してもその殆どが９５％以上の強い剥離作用を示した。
性状分析
実施例１および２で、ＢＭ分解物にＨｐに対する強力な接着作用ならびに剥離作用が確認されたが、既にピロリに対し定着阻害作用を示す類似物質として、乳汁ムチンが報告されている（特許文献１参照）。本実施例ではＢＭ分解物と乳汁ムチンとの違いを明確にするため、以下の試験検討を行った。
実施例１および２で、ＢＭ分解物にＨｐに対する強力な接着作用ならびに剥離作用が確認されたが、既にピロリに対し定着阻害作用を示す類似物質として、乳汁ムチンが報告されている（特許文献１参照）。本実施例ではＢＭ分解物と乳汁ムチンとの違いを明確にするため、以下の試験検討を行った。
材料および方法
（１）使用菌株
ヘリコバクター・ピロリＡＴＣＣ ４３５０４TをAmerican Type Culture Collectionより購入し、使用した。
（１）使用菌株
ヘリコバクター・ピロリＡＴＣＣ ４３５０４TをAmerican Type Culture Collectionより購入し、使用した。
（２）ＢＭ加水分解物
ＢＭパウダー（ＢＭの噴霧乾燥物）から、実施例１の方法に準じてＢＭをトリプシン消化し、酵素を加熱失活させた後、遠心分離により、上清と沈殿とに分離した。それぞれ凍結乾燥し、ＢＭ分解物上清、ＢＭ分解物沈殿とした。さらに、上清をゲルろ過で分離・精製し、高分子成分と低分子成分を得た。
ＢＭパウダー（ＢＭの噴霧乾燥物）から、実施例１の方法に準じてＢＭをトリプシン消化し、酵素を加熱失活させた後、遠心分離により、上清と沈殿とに分離した。それぞれ凍結乾燥し、ＢＭ分解物上清、ＢＭ分解物沈殿とした。さらに、上清をゲルろ過で分離・精製し、高分子成分と低分子成分を得た。
（３）試験方法
ＢＭ分解物のタンパク質及び糖質の含有量、分子量分布を、ケルダール法、フェノール硫酸法、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ゲルろ過法でそれぞれ測定し、特許文献１に記載の乳汁ムチンの成分組成及び分子量と比較した。
ＢＭ分解物のタンパク質及び糖質の含有量、分子量分布を、ケルダール法、フェノール硫酸法、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ゲルろ過法でそれぞれ測定し、特許文献１に記載の乳汁ムチンの成分組成及び分子量と比較した。
剥離活性は実施例２に記載の方法に準じ、それぞれ１ｍｇ／ｍＬの濃度における剥離活性を調べ、比較した。
結果
表３に示すように、ＢＭ分解物は乳汁ムチンと比較してタンパク質含量が高く、糖質が少ないことが確認された。また、乳汁ムチンとは分子量、成分組成ともに異なる物質であり、乳汁ムチンと比較して高い活性が認められた。
結果
表３に示すように、ＢＭ分解物は乳汁ムチンと比較してタンパク質含量が高く、糖質が少ないことが確認された。また、乳汁ムチンとは分子量、成分組成ともに異なる物質であり、乳汁ムチンと比較して高い活性が認められた。
特に、分子量５５０〜７５０ｋＤａの画分についてみると、固形分当たりの収率は２０．２％、タンパク質含量４０〜５０％、糖質含量１０〜２０％であり、剥離活性は９０．５％であった。
以上より、ＢＭ加水分解物が強いＨｐ接着性ならびに剥離活性を有することは明らかである。このＢＭ分解物中に含まれる本発明のポリペプチドは、乳汁ムチンなどの既存の抗ピロリ食品素材と比較して、剥離活性はもとより、生産性、熱安定性が高いことから、大量生産および長期保存が可能な機能性素材として大いに期待できる。
Claims (8)
- バターミルクまたはその乾燥物の溶液をプロテアーゼ処理することにより得られる加水分解物から沈殿物を除去した液体またはその乾燥粉末、あるいは前記加水分解物から得られる沈殿物を有効成分として含む、ヘリコバクター・ピロリの表層に対する結合剤。
- 食品添加剤として使用する、請求項１記載のヘリコバクター・ピロリの表層に対する結合剤。
- バターミルクまたはその乾燥物の溶液をプロテアーゼ処理することにより得られる加水分解物から沈殿物を除去した液体またはその乾燥粉末、あるいは前記加水分解物から得られる沈殿物を有効成分として含む、ヘリコバクター・ピロリの剥離剤。
- 食品添加剤として使用する、請求項１記載のヘリコバクター・ピロリの剥離剤。
- バターミルクまたはその乾燥物の溶液をプロテアーゼ処理することにより得られる加水分解物から沈殿物を除去した液体またはその乾燥粉末、あるいは前記加水分解物から得られる沈殿物を有効成分として含む、消化器潰瘍の予防剤。
- バターミルクまたはその乾燥物の溶液をプロテアーゼ処理することにより得られる加水分解物から沈殿物を除去した液体またはその乾燥粉末、あるいは前記加水分解物から得られる沈殿物を有効成分として含む、ヘリコバクター・ピロリ感染の予防剤。
- バターミルクまたはその乾燥物の溶液をプロテアーゼ処理することにより得られる加水分解物から沈殿物を除去した液体またはその乾燥粉末、あるいは前記加水分解物から得られる沈殿物を有効成分として含む、消化器潰瘍の治療剤。
- バターミルクまたはその乾燥物の溶液をプロテアーゼ処理することにより得られる加水分解物から沈殿物を除去した液体またはその乾燥粉末、あるいは前記加水分解物から得られる沈殿物を有効成分として含む、ヘリコバクター・ピロリ感染の治療剤。
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