JP2008214241A - 免疫調節剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ガングリオシドGD3を有効成分とする免疫機能調節剤。ガングリオシドGD3は乳由来であることが好ましい。前記免疫機能調節剤を飲食品または飼料に配合する。
【選択図】なし
Description
本発明において有効成分として使用されるガングリオシドGD3は、いかなる方法により得られるものであってもよい。すなわち、従来法により畜獣の脳等から分離精製されたものを用いてもよく、また、牛乳から効率よく回収する方法(特開昭63−269992号公報)を利用して得られたものを用いてもよい。同公報に記載の方法によれば、工業規模で大量に生産することも可能である。なお、同公報に記載の乳からガングリオシドを分離抽出する方法を、参考までに示すと下記の通りである。すなわち、牛乳、バターミルク、ホエー、脱脂乳等の乳原料に、塩酸や乳酸等の酸、またはトリプシン、ペプシン等のタンパク質分解酵素を作用させてタンパク質を分解し、得られたタンパク質分解溶液を限外濾過法、ゲル濾過法または透析法により処理し、ガングリオシドを濃縮して調製する。このようにして調製されたガングリオシドは、GM3とGD3から構成されるが、本発明においては、ガングリオシドGD3を有効成分とする。
チーズを製造する際に排出されるホエー 1.5kLに対し、1%の蛋白質分解酵素を添加して、pH8.0、55℃で2時間の酵素反応を行うことによりホエー中の蛋白質を加水分解した。この反応液を限外濾過膜(Cefilt 10kDaNG:フィルテック社製)で処理することにより蛋白質加水分解物及び乳糖を除去し、エバポレーターで30%濃度となるまで濃縮した後、凍結乾燥して、ガングリオシド含有粉末1.5kgを得た。なお、このガングリオシド含有粉末中のガングリオシド量は、約1%であった。次に、アニオン交換樹脂 Dowex-1 (酢酸型:ダウケミカル社製)をカラム(直径10cm×高さ100cm)に充填し、クロロホルム:メタノール:水(60:30:8)からなる溶液で平衡化した後、上記のガングリオシド含有粉末をクロロホルム:メタノール:水(60:30:8)からなる溶液 30Lに懸濁した懸濁液を通液して、ガングリオシド等の酸性物質をカラムに吸着させた後、クロロホルム:メタノール:水(60:30:8)からなる溶液20Lでカラムを洗浄し、2M酢酸ナトリウムを含むクロロホルム:メタノール:水(60:30:8)からなる溶液20Lで溶出してガングリオシドを含有する溶出液を回収した。このガングリオシドを含有する溶出液を減圧乾固して溶媒を除去した後、1N水酸化ナトリウム溶液を加え、40℃で2時間の反応を行うことによりリン脂質を分解した。その後、この反応液を限外濾過膜(Cefilt 10kDaNG:フィルテック社製) で処理して脱塩濃縮し、凍結乾燥した後、クロロホルム:メタノール (85:15) からなる溶液200mLで溶解し、シリカゲルカラム (直径5cm×高さ40cm)に通液してガングリオシドをシリカゲルに吸着させた。そして、ガングリオシドをクロロホルム:メタノール溶液で勾配溶出し、濃縮及び凍結乾燥して、ガングリオシドGD3粉末15.2gを得た。なお、このガングリオシドGD3の純度は、高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、97%以上であった。
[試験例1]
(ガングリオシドGD3の脾臓マクロファージのTNF−α産生能への影響)
10週齢のBalb/C雄マウスを屠殺し脾臓を採取した。脾臓を培養皿内で細切し、注射筒で細かく押しつぶし、メッシュを通すことにより、脾細胞を分離した。分離した脾細胞をRPMI1640培地に10%となるよう牛胎児血清を添加した培地(10%FCS/RPMI1640)で2時間培養した後、同培地で2回洗うことにより、接着したマクロファージを単離した。単離した脾臓マクロファージに実施例1のガングリオシドGD3を10μg/mlとなるように添加した10%FCS/RPMI1640培地、または何も添加していないRPMI1640培地(対照)を加え、2時間培養した。その後LPSを1μg/mlとなるように添加し、さらに3時間培養した。培養終了後、培地を採取するとともに、細胞を0.1%SDS溶液で可溶化した。採取した培地中のTNF−α濃度は、L929マウス線維芽細胞を用いたバイオアッセイ法により測定した。可溶化した細胞内のDNA量をDAPIによる蛍光光度法で測定し、DNA量当たりのTNF−α分泌を求めた。結果を図1に示す。
(ガングリオシドGD3の脾細胞によるIL−4及びIFN−γ産生能への影響)
細胞の分離は試験例1と同様に行った。すなわち採取した脾臓は、試験例1と同様に細切後、強く押しつぶしてバラバラにした後、メッシュを通すことで細胞を分離した。細胞は、10%FCS/RPMI1640培地もしくは実施例1のガングリオシドGD3を10μg/mlとなるように添加した10%FCS/RPMI1640培地に播種した。培養開始2日目にマイトジェンであるConcanavallinAを5μg/mlの濃度となるように添加し、さらに3日間培養した。培養終了後、培地を回収するとともに、細胞を溶解した。培地中のIL−4、IFN−γ濃度は、それぞれサンドイッチELISA法により測定した。細胞中のDNA濃度を測定し、DNA量当たりのサイトカイン分泌量を求めた。結果を図2、3に示す。
バターミルク粉20kgを水180Lに溶解した溶液に、0.5kgの枯草菌プロテアーゼを添加し、pH7.6、温度40℃で15時間反応させ、タンパク質を分解した後、90℃で10分間加熱殺菌し、酵素を失活させた。次いで、この溶液を膜面積0.36平方mの濾過膜を装着した限外濾過膜装置(LAB-20型モジュール:DDS社製)を用いて、温度40℃、流量15L/分、平方圧力0.6MPaで濾過し、ガングリオシドを濃縮した。この溶液を凍結乾燥してガングリオシドGD3を約7.5g含有するガングリオシドGD3含有粉末1kgを得た。このようにして得られたガングリオシドGD3含有粉末は、そのまま本発明の免疫調節剤として利用可能である。
実施例2で調製したガングリオシドGD3含有粉末200gを、カゼイン6.8kg、ホエー粉70.0kg、ビタミン及びミネラル成分1kgと共に、水700kgに溶解した。さらに、植物油脂23.0kgを混合して、均質化した後、殺菌・濃縮・乾燥工程を経て、本発明の免疫機能調節剤を配合した粉乳100kgを得た。得られた粉乳100g中のガングリオシドGD3含量は約1.0mgであった。
実施例2で調製したガングリオシドGD3含有粉末を用い、表1の配合により本発明の免疫機能調節剤であるドリンク剤を調製した。表1の成分を、水に溶解して5Lとした。この溶液を、圧力160kg/cm2で均質化した後、プレート式殺菌機により、120℃で3秒間保持して殺菌し、次いで5℃に冷却した。得られたドリンク剤を200ml入り紙容器に充填した。このドリンク剤は、100ml当り約2.4mgのGD3を含有していた。
実施例1で調製したガングリオシド粉末を、常法により、ゼラチンよりなるソフトカプセル中に一錠当り100mgとなるように充填して、本発明の免疫機能調節剤(錠剤)を得た。
Claims (4)
- ガングリオシドGD3を有効成分とする免疫機能調節剤。
- ガングリオシドGD3が乳由来であることを特徴とする請求項1の免疫機能調節剤。
- 請求項1または2記載の免疫機能調節剤を配合した飲食品。
- 請求項1または2記載の免疫機能調節剤を配合した飼料。
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