JP2018527915A - Dna試料を分析するためのプローブ組及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年9月18日に出願された仮出願第62/220,746号の利益を主張し、その出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
より詳細に例示的な実施形態を説明する前に、本説明に使用される用語の意味及び範囲を図示及び定義するために、以下の定義を明記する。
プローブシステムの一部の実施形態は、(a)配列Bの1組の識別子オリゴヌクレオチドと、(b)式X’−A’−B’−Z’の1組のスプリントオリゴヌクレオチドであって、1組内で、(i)配列A’及びB’は、変化し、(ii)配列X’及びZ’は、互いに異なり、かつ可変性ではなく、各スプリントオリゴヌクレオチド内で、(i)配列A’は、核酸試料のゲノム断片に対して相補的であり、(ii)配列B’は、1組の識別子オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1つのメンバに対して相補的である、1組のスプリントオリゴヌクレオチドと、(c)X及びZを含む1つ以上のプローブ配列であって、配列X及びZは、可変性ではなく、配列X’及びZ’にハイブリダイズし、各スプリントオリゴヌクレオチドは、(i)プローブ配列、(ii)1組の識別子オリゴヌクレオチドのメンバ、及び(iii)ゲノム断片にハイブリダイズすることが可能であり、それによって、式X−A−B−Zのライゲーション可能な複合体を生成する、1つ以上のプローブ配列と、を含み得る。以下により詳細に説明されるように、一部の実施形態において、異なる識別子オリゴヌクレオチド及びそれらの相補的配列B’は、異なる染色体、例えば、染色体21、18、及び13を識別する。
本明細書において、(a)上述されるプローブシステムを、ゲノムの断片を含む試験ゲノム試料とハイブリダイズして、式X−A−B−Zのライゲーション可能な複合体を生成することと、(b)ライゲーション可能な複合体をライゲーションして、式X−A−B−Zの生成物DNA分子を生成することと、(c)配列Bの各遺伝子座識別子に対応する生成物DNA分子を計数することと、を含む方法も提供される。一部の実施形態において、計数は、生成物DNA分子またはその増幅生成物を配列決定して配列リードを生成することと、Bの各配列を含む配列リードの数を計数することと、によって行われ得る。
染色体 異常及び疾患関連性
X: XO(ターナー症候群)
Y: XXY(クラインフェルター症候群)
Y: XYY(YY症候群)
Y: XXX(トリソミーX症候群(Trisomy X Syndrome))
Y: XXXX(4X症候群(Four X Syndrome))
Y: Xp21欠失(デュシェンヌ/ベッカー症候群、先天性副腎低形成症、慢性
肉芽腫症)
Y: Xp22欠失(ステロイドスルファターゼ欠損)
Y: Xq26欠失(X連鎖リンパ球増殖性疾患)
1: 1p体細胞(神経芽細胞腫)
1: モノソミー(神経芽細胞腫)
1: トリソミー(神経芽細胞腫)
2: モノソミー(発達遅滞、発達及び精神遅延、ならびに低度の身体的異常)
2: トリソミー2q(発達遅滞、発達及び精神遅延、ならびに低度の身体的異常
)
3: モノソミー(非ホジキンリンパ腫)
3: トリソミー体細胞(非ホジキンリンパ腫)
4: モノソミー(急性非リンパ球性白血病(ANLL))
4: トリソミー体細胞(急性非リンパ球性白血病(ANLL))
5: 5p(ネコ鳴き症候群、レジューン症候群)
5: 5q体細胞(骨髄異形成症候群)
5: モノソミー(骨髄異形成症候群)
5: トリソミー(骨髄異形成症候群)
6: モノソミー(明細胞肉腫)
6: トリソミー体細胞(明細胞肉腫)
7: 7q11.23欠失(ウィリアムズ症候群)
7: モノソミー(小児期のモノソミー7症候群;体細胞:腎皮質腺腫;骨髄異形
成症候群)
7: トリソミー(小児期のモノソミー7症候群;体細胞:腎皮質腺腫;骨髄異形
成症候群)
8: 8q24.1欠失(ランガー・ギデオン症候群)
8: モノソミー(骨髄異形成症候群;ワルカニー症候群(Warkany sy
ndrome);体細胞:慢性骨髄性白血病)
8: トリソミー(骨髄異形成症候群;ワルカニー症候群;体細胞:慢性骨髄性白
血病)
9: モノソミー9p(アルフィ症候群(Warkany syndrome))
9: モノソミー9p(レトレ症候群(Rethore syndrome))
9: 部分トリソミー(レトレ症候群)
9: トリソミー(完全なトリソミー9症候群;モザイクトリソミー9症候群)
10: モノソミー(ALLまたはANLL)
10: トリソミー体細胞(ALLまたはANLL)
11: 11p−(無虹彩症、ウィルムス腫瘍)
11: 11q−(ヤコブセン症候群)
11: モノソミー(骨髄系統に影響がある(ANLL、MDS))
11: トリソミー(骨髄系統に影響がある(ANLL、MDS))
12: モノソミー(CLL、若年性顆粒膜細胞腫(JGCT))
12: トリソミー(CLL、若年性顆粒膜細胞腫(JGCT))
13: 13q−(13q症候群;オルベリ症候群(Orbeli syndrom
e))
13: 13q14欠失(網膜芽細胞腫)
13: モノソミー(パトー症候群)
13: トリソミー(パトー症候群)
14: モノソミー(骨髄性障害(MDS、ANLL、非定型CML)
14: トリソミー体細胞(骨髄性障害(MDS、ANLL、非定型CML)
15: 15q11−q13欠失(プラダー・ウィリー、アンジェルマン症候群)
15: モノソミー(プラダー・ウィリー、アンジェルマン症候群)
15: トリソミー体細胞(骨髄及びリンパ系糖に影響がある、例えば、MDS、A
NLL、ALL、CLL)
16: 16q13.3欠失(ルビンシュタイン・テイビ)
16: モノソミー(乳頭状腎細胞癌(悪性))
16: トリソミー体細胞(乳頭状腎細胞癌(悪性))
17: 17p−体細胞(骨髄性悪性疾患における17p症候群)
17: 17q11.2欠失(スミス・マゲニス)
17: 17q13.3(ミラー・ディーカー)
17: モノソミー(腎皮質腺腫)
17: トリソミー体細胞(腎皮質腺腫)
17: 17p11.2−12(シャルコー・マリー・トゥース症候群1型;HNP
P)
17: トリソミー(シャルコー・マリー・トゥース症候群1型;HNPP)
18: 18p−(18部分モノソミー症候群またはグロウチイ・ラミー・ティーフ
リィ症候群)
18: 18q−(グロウチイ・ラミー・サルモン・ランドリー症候群)
18: モノソミー(エドワーズ症候群)
18: トリソミー(エドワーズ症候群)
19: モノソミー(エドワーズ症候群)
19: トリソミー(エドワーズ症候群)
20: 20p−(トリソミー20p症候群)
20: 20p11.2−12欠失(アラジール)
20: 20q−(体細胞:MDS、ANLL、真性多血症、慢性好中球性白血病)
20: モノソミー(乳頭状腎細胞癌(悪性))
20: トリソミー体細胞(乳頭状腎細胞癌(悪性))
21: モノソミー(ダウン症候群)
21: トリソミー(ダウン症候群)
22: 22q11.2欠失(ディジョージ症候群、口蓋心臓顔面症候群、円錐動脈
幹異常顔貌症候群、常染色体優性Opitz G/BBB症候群、ケイラー
心臓顔面症候群)
22: モノソミー(完全なトリソミー22症候群)
22: トリソミー(完全なトリソミー22症候群)
上述のように、対象方法を実践するためのキットも本開示によって提供される。ある特定の実施形態において、キットは、(a)式X’−A’−B’−Z’の1組のスプリントオリゴヌクレオチドであって、1組内で、(i)A’及びB’の配列は、変化し、(ii)X’及びZ’の配列は、互いに異なり、かつ可変性ではなく、各分子内で、(i)配列A’は、ゲノムの断片に対して相補的であり、(ii)配列B’は、隣接するA’配列にハイブリダイズするゲノム断片が由来する遺伝子座を識別する、1組のスプリントオリゴヌクレオチドと、(b)配列X及びZを含む1つ以上のプローブであって、i.配列X及びZは、可変性ではなく、配列X’及びZ’にハイブリダイズする、1つ以上のプローブと、(c)配列Bの1組の遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドと、を含み得、(a)の各スプリントオリゴヌクレオチドは、(b)の(i)プローブ配列、(ii)(c)の遺伝子座特異的オリゴヌクレオチド、及び(iii)(a)のゲノム断片にハイブリダイズして、式X−A−B−Zのライゲーション可能な複合体を生成することが可能であり、配列Bは、隣接する配列Aの遺伝子座を識別する。一部の実施形態において、(b)の1つ以上のプローブは、配列Xを含む第1のオリゴヌクレオチドと、配列Yを含む第2のオリゴヌクレオチドと、を含む。一部の実施形態において、キットは、配列X及びYを含む1つ以上のプローブにハイブリダイズする1対のPCRプライマをさらに含み得る。ある特定の実施形態において、(b)の1つ以上のプローブは、式X−Y−Zのバックボーンプローブであり、ライゲーション可能な複合体は、式X−A−B−Z−Yの環状のライゲーション可能な複合体であり、式中、配列Yは配列X及びZに接合し、配列Bは隣接する配列Aの遺伝子座を識別する。これらの実施形態において、キットは、バックボーンプローブの配列にハイブリダイズするローリングサークル増幅プライマをさらに含み得る。これらの実施形態において、キットは、複数の区別可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含み得、区別可能に標識されたオリゴヌクレオチドの各々は、B’配列の補体にハイブリダイズする。キットは、ローリングサークル増幅を行うために、リガーゼ及び/または鎖置換ポリメラーゼをさらに含有し得る。
初期データ検証方法
本実験の目的は、染色体特異的(例えば、WO2015/083001及びWO2015/083002に記載されるように、第1の染色体、例えば染色体21からの断片を捕捉するために使用されたバックボーンオリゴヌクレオチドは、第2の染色体、例えば染色体18からの断片を捕捉するために使用されたバックボーンオリゴヌクレオチドとは異なる)であるバックボーンオリゴヌクレオチドを使用する方法を、同じバックボーンオリゴヌクレオチドが検査される全ての染色体に使用される方法と比較することである。これは図6に図示される。示されるように、「新」設計において、クローニングされた断片源は、標的断片として同じ環状生成物内にクローニングされる染色体特異的配列(例えば、AまたはB)を使用して判定される。新しい方法では、単一のバックボーンオリゴヌクレオチドが使用され(従来の方法における複数のバックボーンオリゴヌクレオチドと比較して)、全ての染色体からのクローニングされた断片は同じRCAプライマまたは1対のPCRプライマを使用して増幅され得る。
臨床試料の分析
26の正常な妊娠した個体及びトリソミー21を有する胎児を妊娠する4つの個体からcfDNA試料を調製した。各親からの血液(10ml)を遠心分離して、赤血球及び軟膜から血漿を分離した。対応する血漿(約3〜5ml/患者)をビーズに基づくDNA抽出プロトコルに曝し、50ulの緩衝液に希釈された抽出されたcfDNAを得た。
Claims (25)
- 核酸試料を分析するためのプローブシステムであって、
(a)配列Bの1組の識別子オリゴヌクレオチドと、
(b)式X’−A’−B’−Z’の1組のスプリントオリゴヌクレオチドであって、
前記1組内で、(i)配列A’及びB’は、変化し、(ii)配列X’及びZ’は、互いに異なり、かつ可変性ではなく、
各スプリントオリゴヌクレオチド内で、(i)配列A’は、前記核酸試料のゲノム断片に対して相補的であり、(ii)配列B’は、前記1組の識別子オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1つのメンバに対して相補的である、1組のスプリントオリゴヌクレオチドと、
(c)X及びZを含む1つ以上のプローブ配列であって、配列X及びZは、可変性ではなく、配列X’及びZ’にハイブリダイズし、
各スプリントオリゴヌクレオチドは、(i)前記プローブ配列、(ii)前記1組の識別子オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1つのメンバ、及び(iii)前記ゲノム断片にハイブリダイズすることが可能であり、それによって、式X−A−B−Zのライゲーション可能な複合体を生成する、1つ以上のプローブ配列と、を含む、プローブシステム。 - 前記1組の識別子オリゴヌクレオチドは、少なくとも2つの異なるB配列識別子オリゴヌクレオチドを含み、前記1組のスプリントオリゴヌクレオチド内に、少なくとも100の異なるA’配列と、少なくとも2つの異なる識別子オリゴヌクレオチドに対して相補的である、少なくとも2つの異なるB’配列と、が存在する、請求項1に記載のプローブシステム。
- スプリントオリゴヌクレオチドにおける各識別子オリゴヌクレオチドまたはその相補的B’配列は、前記ゲノム断片に対応する、請求項1または2のいずれかに記載のプローブシステム。
- スプリントオリゴヌクレオチドにおける各識別子オリゴヌクレオチドまたはその相補的B’配列は、前記ゲノム断片が由来するゲノムにおける遺伝子座を示す、請求項1〜3のいずれかに記載のプローブシステム。
- スプリントオリゴヌクレオチドにおける各識別子オリゴヌクレオチドまたはその相補的B’配列は、前記ゲノム断片が由来する染色体を示す、請求項1〜4のいずれかに記載のプローブシステム。
- 前記ゲノム断片が、哺乳類ゲノムからのものである、請求項1〜5のいずれかに記載のプローブシステム。
- スプリントオリゴヌクレオチドにおける各識別子オリゴヌクレオチドまたはその相補的B’配列は、染色体21、染色体18、及び染色体13のうちの1つ以上を識別する、請求項1〜6のいずれかに記載のプローブシステム。
- 前記ゲノム断片は、制限断片である、請求項1〜7のいずれかに記載のプローブシステム。
- 前記(c)の1つ以上のプローブ配列は、配列Yを含むオリゴヌクレオチドをさらに含み、前記ライゲーション可能な複合体は、直鎖状である、請求項1〜8のいずれかに記載のプローブシステム。
- 前記(c)の1つ以上のプローブにハイブリダイズする、1対のPCRプライマをさらに含む、請求項1〜9のいずれかに記載のプローブシステム。
- 前記(c)の1つ以上のプローブ配列は、式X−Y−Zのバックボーンプローブを含み、式中、Yは、オリゴヌクレオチド配列を含み、そのため、前記ライゲーション可能な複合体は、式X−A−B−Z−Yの環状のライゲーション可能な複合体であり、式中、配列Yは、配列X及びZに接合する、請求項1〜8のいずれかに記載のプローブシステム。
- 前記バックボーンプローブ内の配列にハイブリダイズする、ローリングサークル増幅プライマをさらに含む、請求項11に記載のプローブシステム。
- (A)ある配列を前記バックボーンプローブにハイブリダイズする、ローリングサークル増幅プライマと、
(B)最大4つの区別可能に標識された検出オリゴヌクレオチドであって、各々が、B’配列にハイブリダイズする、区別可能に標識された検出オリゴヌクレオチドと、をさらに含む、請求項11に記載のプローブシステム。 - (a)請求項1〜13に記載のプローブシステムを、ゲノム断片を含む試験ゲノム試料とハイブリダイズして、式X−A−B−Zのライゲーション可能な複合体を生成する生成することと、
(b)前記ライゲーション可能な複合体をライゲーションして、式X−A−B−Zの生成物DNA分子を生成することと、
(c)配列Bの各遺伝子座識別子に対応する前記生成物DNA分子を計数することと、を含む、方法。 - 前記計数が、生成物DNA分子、またはその増幅生成物を配列決定して、配列リードを生成することと、Bの各配列またはその補体を含む配列リードの数を計数することと、によって行われる、請求項14に記載の方法。
- 前記生成物DNA分子が環状であり、前記計数が、ローリングサークル増幅によって前記生成物DNA分子を増幅することと、Bの各配列またはその補体を含む前記数の増幅生成物を計数することと、を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記方法が、配列B’にハイブリダイズする区別可能に標識されたプローブを使用して前記RCA生成物を標識することを含み、前記計数が、各区別可能な標識に関して前記RCA生成物の数を計数することによって行われる、請求項16に記載の方法。
- さらに、前記方法が、i.前記RCA生成物を平面的な支持体上に付着させることと、ii.前記支持体の領域内の前記個々の標識されたRCA生成物の数を計数することと、を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記支持体が、ガラススライドである、請求項18に記載の方法。
- 前記支持体が、多孔質の透明なキャピラリー膜である、請求項18に記載の方法。
- Bの前記異なる配列及びそれらの相補的な配列B’が異なる染色体を識別し、前記方法が、BまたはB’のいずれかの第1の配列を含む生成物DNA分子の数を、BまたはB’のいずれかの第2の配列を含む生成物DNA分子の数と比較して、前記ゲノム試料が異数性を有するかを決定することをさらに含む、請求項14〜20のいずれかに記載の方法。
- 方法が、ステップ(c)の前記計数結果を、1つ以上の参照試料から得た前記計数結果と比較することを含む、請求項14〜21のいずれかに記載の方法。
- 前記試験ゲノム試料が、疾患または状態を有すると思われるか、またはそのリスクにある患者からのものであり、ステップ(c)の前記計数結果が、前記患者またはその胎児が前記疾患または状態を有するかどうかの指標を提供する、請求項14〜22のいずれかに記載の方法。
- 前記疾患または状態が、癌、感染症、炎症性疾患、移植拒絶、またはトリソミーである、請求項23に記載の方法。
- 前記断片が制限断片である、請求項14〜24のいずれかに記載の方法。
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