CN109234388B

CN109234388B - 用于dna高甲基化区域富集的试剂、富集方法及应用

Info

Publication number: CN109234388B
Application number: CN201710538910.9A
Authority: CN
Inventors: 易吉; 罗慧娟; 朱师达
Original assignee: Bgi Guangzhou Medical Laboratory Co ltd; BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: Bgi Guangzhou Medical Laboratory Co ltd; BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2017-07-04
Filing date: 2017-07-04
Publication date: 2021-09-14
Anticipated expiration: 2037-07-04
Also published as: CN109234388A

Abstract

本申请公开了一种用于DNA高甲基化区域富集的试剂、富集方法及应用。本申请用于DNA高甲基化区域富集的试剂，包括单链环形结构的探针，探针的序列包括内切酶酶切区、引物结合区、DNA 3’端高C片段结合区、DNA中间高C片段结合区、DNA 5’端高C片段结合区。本申请的试剂，通过将高甲基化的DNA片段环化后，进行滚环扩增，有效的富集高甲基化的DNA片段，满足测序需求，最大程度的保证了DNA的甲基化信息，避免了常规PCR扩增富集造成的非特异扩增和扩增错误。本申请的试剂和富集方法，操作简便、价格低廉。

Description

用于DNA高甲基化区域富集的试剂、富集方法及应用

技术领域

本申请涉及核酸体外富集领域，特别是涉及一种用于DNA高甲基化区域富集的试剂、富集方法及应用。

背景技术

表观遗传是在不改变基因组DNA序列的前提下，通过DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑以及非编码RNA调控等途径来影响和调节基因的表达和功能的发挥，并且这种改变可以在细胞增殖和个体发育过程中发生稳定传递。近几年随着生命科学研究的不断深入，表观遗传学的研究手段也得到了日新月异的发展，与之相关的研究领域日益拓宽，其在肿瘤发生与发展中的研究更是取得突破性的进展。DNA甲基化是发生在CG位点的化学修饰，s-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMTs)的催化下，胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化是基因组DNA的一种主要表观遗传修饰方式，也是调节基因功能的重要手段。体内DNA甲基化状态有三种：第一种是持续的低甲基化状态，如管家基因；第二种是诱导的去甲基化状态，如发育阶段的一些基因；第三种是高度甲基化状态，如女性的一条缢缩的X染色体。在基因组内，CG位点存在形式一般有两种，一种分散于基因组中，平时多以甲基化形式存在；另一种成簇存在，长度通常在1-2kb，称为CpG岛(CpGisland)。CpG岛通常位于转录调控区附近，在正常细胞中常处于非甲基化形式，但是当肿瘤发生时，在某些因子的作用下，CpG岛的DNA可能由非甲基化转变为高甲基化(hypermethylation)，而启动子区域的DNA高甲基化则会通过进一步影响转录因子结合、募集DNA甲基化结合蛋白以及改变组蛋白乙酰化的状态等因素造成其调控基因的表达沉默。目前已经发现许多重要的抑癌基因由于这种调控机制而表达丧失，其中包括为我们大家所熟悉的P16、RASSF1A(RAS association domain family protein 1A)以及MGMT(methylguanine-DNA methyltransferase)等基因。除此之外，越来越多肿瘤相关基因被发现受表观遗传学调控而在肿瘤发生与发展中下调或沉默。例如，EFEMP1、Fibulin5等基因被发现在肿瘤的发生发展中由于DNA高甲基化而沉默，并且进一步的研究表明这些基因分别在肿瘤的发生与转移中发挥极其重要的作用。

异常DNA甲基化变化，包括CpG岛的高甲基化(CGIs)伴随全基因组低甲基化，是几乎所有人类癌症类型的标志。检测循环的游离DNA(简称，游离DNA)高甲基化CGIs已经作为一种有希望的非侵入性方法来用于诊断，预后和监测癌症。但是，由于游离DNA是高度碎片且与癌症相关的游离DNA只占少数的总游离DNA，在技术上存在很大挑战。尽管下一代测序(NGS)技术的快速发展可促进DNA甲基化的分析，但是基因组范围内检测游离DNA高甲基化的方法仍有所欠缺。许多基因组范围内的方法，比如Infinium甲基化阵列和简化版亚硫酸氢盐测序(RRBS)已成功应于细胞和组织样品。但是，这两个方法都需要相对大量的DNA，或者对DNA片段大小有一定的要求；因此，不适用于严重片段化的游离DNA。

因此，总的来说，目前对于游离DNA的甲基化高通量的测序技术局限性有：

1)全基因组甲基化测序方法，由于游离DNA的总量极少，8mL全血只含有大约30-50ng的游离DNA，而目前的高通量测序方法需要的DNA起始量为100ng，并且在测序过程前进行重亚硫酸盐处理、文库构建，这些过程中都会造成DNA的损失，最终导致测序数据中所包含的甲基化信息稀少；无法满足使用需求。

2)基于PCR方法的高甲基化扩增方法，通过PCR扩增对游离DNA进行扩增富集，虽然能够解决游离DNA总量过少的问题，并且能够有效对高甲基化区域进行富集和检测，但是由于采用常规PCR引物扩增会造成测序数据的偏向性，有可能会损失部分位点的信息；不能准确、全面的反应游离DNA的甲基化信息。

因此亟需一种特别针对游离DNA，特别是高甲基化的游离DNA的检测方案。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的用于DNA高甲基化区域富集的试剂，基于该试剂的富集方法，及其应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种用于DNA高甲基化区域富集的试剂，该试剂包括单链环形结构的探针，探针的序列包括内切酶酶切区、引物结合区、DNA 3’端高C片段结合区、DNA中间高C片段结合区、DNA 5’端高C片段结合区。

需要说明的是，本申请的关键在于，利用探针对DNA高甲基化区域进行环化，然后采用滚环扩增对环化的DNA高甲基化区域进行富集。其中，内切酶酶切区的设计是为了对滚环扩增得到的长链进行酶切，得到富集的片段化的DNA高甲基化区域；可以理解，具体的酶切位点序列，可以参考现有的内切酶酶切位点，在此不作具体限定。

本申请中，引物结合区是为了后续进行滚环扩增和测序使用，采用通用引物进行扩增而设计的；也就是说，针对不同的具体探针序列或者最后环化的DNA高甲基化区域，所有的引物结合区都是一样的，因此，可以采用一条引物对所有不同的环化DNA高甲基化区域进行滚环扩增。引物结合区为一段与待测样品和DNA都没有同源性，也不会发生非特异性杂交的序列。需要说明的是，本申请与一般的滚环扩增不同的是，通常滚环扩增都是对连接成环的探针进行扩增，实现信号放大；而本申请则是对于滚环扩增杂交的DNA高甲基化区域进行扩增，相当于是对与探针杂交的模板进行扩增，并且，本申请的探针一开始就是环化的。可以理解，本申请的富集是利用了滚环扩增的扩增原理，但是，具体设计方案是完全不同于现有的滚环扩增的。

本申请的探针中，DNA 3’端高C片段结合区、DNA中间高C片段结合区、DNA 5’端高C片段结合区，这三个区域是根据DNA高甲基化区域而设计的。通常，DNA高甲基化区域是以“CpNCpNCp”的形式存在，其中，p为甲基化修饰，N表示A、G、C、T中的任意碱基，比较典型的就是游离DNA高甲基化区域，例如CpG岛；因此，本申请的一种实现方式中，DNA 3’端高C片段结合区为“NNNNNGNGNGNG”，DNA中间高C片段结合区为“NGNGNGNG”，DNA 5’端高C片段结合区为“NGNGNGNNNNN”，这三个区域的长度分别为20-50bp。

还需要说明的是，本申请的探针，在使用时，DNA高甲基化区域的3’端杂交结合在探针的DNA 3’端高C片段结合区，5’端杂交结合在探针的DNA 5’端高C片段结合区，然后采用酶使DNA高甲基化区域，以探针为模板，从DNA高甲基化区域的3’末端开始添加碱基，按照序列由5’端向3’端延伸的扩增原理，直至序列延伸至环状探针上DNA高甲基化区域5’端杂交结合的位置；因此，“内切酶酶切区、引物结合区”，都是通过序列延伸的方式，连接到DNA高甲基化区域上的，而这为后续的滚环扩增奠定了基础。可以理解，基于以上原理，内切酶酶切区、引物结合区的位置是可以调整的，只要能够确保DNA高甲基化区域延伸后，具有这些区域即可，在此不做具体限定。当然，内切酶酶切区和引物结合区的位置调整后，滚环扩增的产物和酶切位点的具***置也会相应的改变，但是，这不影响DNA高甲基化区域本身。本申请的优选方案中，探针的长度为140-170bp。

优选的，引物结合区包含正向引物结合区和/或反向引物结合区。

更优选的，反向引物结合区中包含有测序接头序列、索引序列。

需要说明的是，测序接头序列、索引序列是为了方便后续对富集产物直接进行测序而设计的，可以理解，如果不需要测序，则可以不用测序接头序列和索引序列；至于测序接头序列和索引序列具体设置在正向引物结合区或反向引物结合区，还是分别设置在这两个区，可以根据具体试验需求而定，在此不作具体限定。另外，测序接头序列和索引序列的具体序列根据不同的测序平台而定，在此不作具体限定。

还需要说明的是，引物结合区包含正向引物结合区和/或反向引物结合区，也就是说，引物结合区可以单独的包含正向引物结合区，或者反向引物结合区，又或者同时包含正向引物结合区和反向引物结合区，对于DNA高甲基化区域富集来说，只要存在一个引物结合区即可实现滚环扩增富集。但是，在本申请的一种实现方式中，同时包含正向引物结合区和反向引物结合区，并且，内切酶酶切区位于正向引物结合区和反向引物结合区之间，这样设计可以使得酶切后，正向引物结合区和反向引物结合区分别位于酶切DNA片段的5’端和3’端，以方便测序时候的正反向引物分别与正向引物结合区和反向引物结合区结合，这是针对一般的DNA片段测序的情况。在本申请的另一种实现方式中，通过DNB纳米球技术进行建库和测序，其扩增也是基于滚环扩增进行的，则可以不特别要求同时包含正向引物结合区和反向引物结合区，也不必特别限定内切酶酶切区位于正向引物结合区和反向引物结合区之间。具体的引物结合区设置和内切酶酶切区的位置，可以根据不同的测序方案而定，在此不做限定。

优选的，正向引物结合区、DNA 3’端高C片段结合区、DNA中间高C片段结合区、DNA5’端高C片段结合区和反向引物结合区，两个区域之间选择性的设置有间隔区。

需要说明的是，间隔区的作用仅仅是将各区域分开，尽量保障探针自身不会产生稳定的二级结构，避免探针自身杂交形成二聚体，影响与DNA高甲基化区域杂交结合的效率。并且，间隔区可以调节探针的长度，使其与DNA片段的长度相当，提高结合效率。可以理解，DNA高甲基化区域只是其5’端、3’端和中间部分区域与探针的“DNA3’端高C片段结合区、DNA中间高C片段结合区、DNA5’端高C片段结合区”三个区域结合的，形成“双链-泡-双链-泡-双链”的结构形式，因此，杂交结合区域大小不变的情况下，如果探针与DNA片段的长度相当，则可以尽可能的减小没有结合的“泡”结构，从而提高杂交结合的稳定性和效率。另外，间隔区也尽量避免与DNA互补。可以理解，间隔区也可以是一段与待测样品和DNA没有同源性的，也不会发生非特异性杂交的序列，也可以采用电脑生成的随机序列。但是，本申请的优选方案中，间隔区采用多T区域，即由多个T构成的区域，通常在15-20bp。

需要补充说明的是，为了保障DNA片段与探针的杂交稳定性和效率，通常DNA片段与探针之间的序列长短差异不大于200bp，即DNA片段-探针≤200bp。因此，如果是基因组DNA片段，则需要预先将其打断至适当的长度；如果是游离DNA片段，由于其长度本身在130bp左右，不超过190bp，因此提取的游离DNA片段可以直接与探针杂交。

优选的，本申请的试剂还包括与探针的正向引物结合区和/或反向引物结合区匹配的滚环扩增引物。

需要说明的是，本申请的富集是采用探针，使DNA高甲基化区域片段化，然后再采用引物进行滚环扩增实现的。其中，引物就是与探针的正向引物结合区和/或反向引物结合区匹配的一段序列。本申请的一种实现方式中，滚环扩增的第一引物与探针的正向引物结合区序列相同。

优选的，滚环扩增引物包括第一引物，第一引物为Seq ID No.1所示序列；

Seq ID No.1：5’-GAACGACATGGCTACGA-3’。

因此，本申请的一种实现方式中探针的结构和序列如下：

5’-GATATC-GAACGACATGGCTACGATCCGACTT-NNNNNGNGNGNG-(T)_15-20-NGNGNGN-(T)_15-20-NGNGNGNNNNN-AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAATAAACTCGAACAACTCCTTGGCTCACA-3’

其中，“GATATC”为内切酶酶切区、“GAACGACATGGCTACGATCCGACTT”为正向引物结合区、“NNNNNGNGNGNG”为DNA3’端高C片段结合区、“(T)_15-20”为15-20bp的间隔区、“NGNGNGN”为DNA中间高C片段结合区、“NGNGNGNNNNN”为DNA5’端高C片段结合区、“AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAATAAACTCGAACAACTCCTTGGCTCACA”为反向引物结合区，其中反向引物结合区中包含测序接头序列和索引序列。探针序列中N表示A、G、C、T中的任意碱基，在探针合成时，N是随机选择的，这样能够保障对DNA高甲基化区域进行有效捕获。

本申请的另一面公开了本申请的试剂在DNA高甲基化区域富集或DNA高甲基化区域测序中的应用。

需要说明的是，本申请的试剂能够有效的对DNA高甲基化区域进行富集，解决测序数据中甲基化信息稀少的问题，典型的，例如游离DNA，因为游离DNA总量特别少，采用本申请的试剂和方法进行富集后，可以大大增加其测序数据中甲基化的信息。

因此，本申请的另一面公开了本申请的试剂在游离DNA高甲基化区域富集或游离DNA高甲基化区域测序中的应用。解决了游离DNA总量少导致的测序数据中甲基化信息稀少的问题。

本申请的再一面公开了一种用于DNA高甲基化区域富集或测序的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的试剂。

可以理解，为了使用方便，完全可以将本申请的试剂，例如探针和/或滚环扩增引物，制成试剂盒，用于DNA高甲基化区域富集或测序。

本申请的再一面公开了一种DNA高甲基化区域富集的方法，包括以下步骤，

(1)对DNA进行重亚硫酸盐处理，使DNA中的非甲基化C转化为U；

(2)将步骤(1)处理后的DNA，与本申请试剂中的探针杂交；

(3)将步骤(2)的杂交产物与核酸外切酶反应，使DNA与环状探针结合后呈单链存在的5’端和3’端的末端降解；

(4)向步骤(3)的降解产物中加入Klenow fragment、连接酶Ligase、ATP、dNTPs，以及反应缓冲液，将DNA连接成环；

(5)以步骤(4)连接环化的产物为模板，采用与引物结合区匹配的滚环扩增引物，进行滚环扩增，实现DNA高甲基化区域的富集。

需要说明的是，步骤(1)中，其DNA可以采用现有的提取方法提取，在本申请的一种实现方式中，以游离DNA为例，采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit试剂盒自血浆中提取获得。步骤(2)中，DNA与探针杂交具体包括，将本申请的探针与DNA混合，然后再高温下变性，低温退火，即完成杂交，通常高温变性的温度在90度以上，低温退火在55度以下，本申请的一种实现方式中是98度5min后，迅速置于4度。本申请的一种实现方式中，游离DNA平均长度通常为130bp左右，不超过190bp，因此，可以直接与探针杂交，如果是基因组DNA，则需要预先对其进行打断处理，例如超声波打断等。步骤(3)中，核酸外切酶优选的采用Exonuclease VII，优选的，在核酸外切酶反应完成后，于95℃灭活核酸外切酶后，再进行下一步操作。本申请中，核酸外切酶降解DNA与环状探针结合后呈单链存在的5’端和3’端的末端，其目的是，使末端为与探针杂交的双链结构，以方便末端补齐和连接成环。步骤(4)中，Klenow fragment的作用是将DNA的3’端和5’端之间的空隙补齐，连接酶Ligase的作用则是将补齐的末端连接成环。

还需要说明的是，本申请采用一条引物进行滚环扩增，该引物可以任意根据引物结合区设计，例如本申请的一种实现方式中滚环扩增的引物是根据引物结合区的正向引物结合区设计的，引物的序列截取自正向引物结合区序列的一部分。此外，本申请的富集方法，在通过滚环扩增后即得到了富集产物；但是，此时的富集产物实际上是滚环扩增获得的长单链，该长单链是由靶标区域重复延伸而得，因此，在进一步的改进方案中，如果需要片段化的富集产物，还需要对滚环扩增产物进行酶切处理，即富集方法中还可以进一步包括酶切处理步骤，酶切处理的具体方法可以参考本申请后续的DNA高甲基化区域的测序方法。

本申请的再一面公开了一种DNA高甲基化区域的测序方法，包括以下步骤，

(1)采用本申请的方法对DNA高甲基化区域进行富集；

(2)采用核酸内切酶将步骤(1)富集得到的滚环扩增产物酶切为DNA片段，其中，核酸内切酶为本申请探针设计的内切酶酶切区对应的内切酶；

(3)将酶切后的DNA片段连接成环；

(4)对环化的DNA片段进行滚环扩增，获得DNA纳米球；

(5)对DNA纳米球进行高通量测序。

需要说明的是，本申请的探针序列中设计内切酶酶切区，其目的就是为了使最终的产物能够通过内切酶酶切进行片段化，使得其长度符合测序的使用需求。至于将片段化的DNA再次环化，可以参考现有的DNA片段环化方式。

此外，DNA纳米球的高通量测序，或DNA纳米球技术，即DNB，是将DNA首先经过片段化处理，再环化形成单链环状DNA，随后采用滚环扩增技术(Rolling circleamplification,RCA)将单链环状DNA扩增，所产生的扩增产物称为DNA纳米球(DNA nanoball,缩写DNB)，最终纳米球经过DNB装载技术固定在阵列化的硅芯片上，进行测序。本申请的环状的DNA高甲基化区域，在优选的方案中，探针的正向引物结合区和/或反向引物结合区中已经包含有测序接头序列、索引序列，因此，环状的DNA高甲基化区域中也是包含有测序接头序列、索引序列的；可以直接进行滚环扩增建库，然后进行BGISEQ500高通量测序。

优选的，步骤(2)中，核酸内切酶将步骤(1)富集得到的滚环扩增产物酶切为DNA片段具体包括，向步骤(1)的滚环扩增产物中添加第一序列核酸，第一序列核酸与内切酶酶切区互补杂交，使之形成双链DNA，以便于核酸内切酶进行酶切。

更优选的，第一序列核酸为Seq ID No.2所示序列；

Seq ID No.2：5’-CACAGATATCGAAC-3’。

需要说明的是，核酸内切酶通常是对双链结构的DNA进行酶切的，而本申请的富集方法最终获得的是单链的产物，不能直接进行酶切，因此，本申请提出在产物中加入第一序列核酸，第一序列核酸刚好能够杂交到内切酶酶切区，形成双链，因此，可以被核酸内切酶识别和切割。至于第一序列核酸的具体序列可以参考内切酶酶切区的序列，并且，在其两端各延伸2-5bp的保护序列，以提高核酸内切酶的酶切质量。本申请的一种具体实施方式中，第一序列核酸为Seq ID No.2所示序列。

优选的，步骤(3)中，将酶切后的DNA片段连接成环具体包括，向步骤(2)酶切获得的DNA片段中加入第二序列核酸，第二序列核酸与DNA片段的5’端和3’端互补杂交，并且使DNA片段的5’端和3’端杂交后末端相对，以第二序列核酸为模板，使DNA片段连接成环。

需要说明的是，DNA片段连接成环的方式，与本申请中高甲基化区域富集方法中的连接成环方式类似，即提供一个模板，使DNA片段的5’端和3’端末端同时杂交到该模板上，然后再通过连接酶等试剂，使5’端和3’端连接成环，该模板即第二序列核酸。

更优选的，第二序列核酸为Seq ID No.3所示序列；

Seq ID No.3：5’-GCCATGTCGTTCGATATCTGTGAGCCAAGG-3’。

需要说明的是，本申请的优选方案中特别设计了Seq ID No.3所示序列的第二序列核酸，这段序列不仅可以作为模板，将DNA片段环化，在本申请的一种实现方式中，还可以作为引物，对环化的DNA进行滚环扩增。

本申请的有益效果在于：

本申请用于DNA高甲基化区域富集的试剂，通过将高甲基化的DNA片段环化后，进行滚环扩增，增加其拷贝数，能够有效的富集高甲基化的DNA片段，满足测序需求，最大程度的保证了DNA的甲基化信息，并且避免了常规PCR扩增富集造成的非特异扩增和扩增错误。本申请的试剂和富集方法，操作简便、价格低廉，富集扩增过程在一个反应管中完成，避免了反复的纯化分离，最大程度的降低了多步纯化对DNA造成损失，特别适用于游离DNA的检测。

附图说明

图1是本申请实施例用于DNA高甲基化区域富集的试剂中，其探针的结构示意图；

图2是本申请实施例中探针和高甲基化游离DNA片段杂交的结构示意图；

图3是本申请实施例中本申请的富集方法所富集到的CpG岛数量统计结果。

具体实施方式

现有获取高甲基化游离DNA片段信息的方法包括，1)通过全基因组测序获得高甲基化游离DNA片段信息，但是这种方法，由于游离DNA的总量极少，所获得的甲基化信息稀少。2)基于常规PCR对高甲基化游离DNA片段进行扩增，实现游离DNA富集，解决游离DNA总量少的问题，但是，常规PCR容易造成非特异扩增和扩增错误，造成测序数据的偏向性，最终造成部分甲基化信息损失。

本申请的试剂和方法，首先利用探针对高甲基化的DNA片段进行杂交捕获；然后通过酶将杂交的DNA片段两端的空隙补齐，补齐的过程中，将探针设计的内切酶酶切区、引物结合区的反向互补序列连接到高甲基化DNA片段上，使得高甲基化DNA片段具有引物结合区，以方便后续建库和测序；补齐后再利用连接酶将DNA片段环化；最后根据添加在环化DNA片段上的引物结合区的反向互补序列，设计滚环扩增引物，以环化DNA片段为模板，进行滚环扩增，实现高甲基化的DNA片段的富集。

滚环扩增富集后，为了进行后续的高通量测序，本申请进一步的，还包括，对滚环扩增产物进行酶切，酶切所采用的内切酶，即探针设计的内切酶酶切区对应的酶；酶切后获得140bp-350bp左右的DNA片段，然后再对其进行环化，利用DNB技术，进行建库和高通量测序，或者直接对酶切后的DNA片段进行测序。DNB技术建库和高通量测序，实际上就是，对再次环化的DNA片段进行滚环扩增，然后直接采用滚环扩增产物上机测序。专利申请201510130536.X中关于DNB测序的内容援引于本申请。

可以理解，本申请的DNA高甲基化区域富集的试剂和方法，是特别针对高甲基化的游离DNA而设计的；但是，本申请的试剂和方法并不只限于游离DNA的富集和测序，其它高甲基化区域的DNA片段，包括基因组DNA，也同样可以采用本申请的试剂和方法进行富集。当然，如前面提到的，如果是基因组DNA片段，则需要对基因组DNA进行打断处理，使其达到适合的长度，具体打断处理的方法可以参考现有的基因组DNA打断工艺。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

本例首先根据游离DNA高甲基化区域的序列特征设计了一种探针，如图1所示，探针为单链环形结构，探针序列包括内切酶酶切区、正向引物结合区、游离DNA的3’端高C片段结合区、游离DNA的中间高C片段结合区、游离DNA的5’端高C片段结合区和反向引物结合区，正向引物结合区、游离DNA的3’端高C片段结合区、游离DNA的中间高C片段结合区、游离DNA的5’端高C片段结合区和反向引物结合区，两个区域之间选择性的设置有间隔区。

本例的探针中，引物结合区同时包含正向引物结合区和反向引物结合区，并且，内切酶酶切区位于正向引物结合区和反向引物结合区之间。

本例的探针如下所示：

其中，“GATATC”为内切酶酶切区，本例采用的是EcoRV内切酶。“GAACGACATGGCTACGATCCGACTT”为正向引物结合区，用于滚环扩增引物设计。“NNNNNGNGNGNG”为游离DNA的3’端高C片段结合区，用于杂交结合高甲基化游离DNA的3’端。“NGNGNGN”为游离DNA的中间高C片段结合区，用于杂交结合游离DNA的中间区域。“NGNGNGNNNNN”为游离DNA的5’端高C片段结合区，用于杂交结合游离DNA的5’端。“(T)_15-20”为15-20bp的间隔区，本例具体的，在游离DNA的3’端高C片段结合区和游离DNA的中间高C片段结合区之间，游离DNA的中间高C片段结合区和游离DNA的5’端高C片段结合区之间设计了多T间隔区。

“AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAATAAACTCGAACAACTCCTTGGCTCACA”为反向引物结合区。反向引物结合区中包含测序接头序列和索引序列。

本例的探针，是针对高甲基化的游离DNA而设计的，典型的高甲基化的游离DNA如CpG岛区域，其甲基化修饰的碱基经常以CpNCpNCp形式存在，因此通过探针的游离DNA的3’端高C片段结合区、游离DNA的中间高C片段结合区、游离DNA的5’端高C片段结合区可以对甲基化修饰的游离DNA杂交结合。由于游离DNA的3’端高C片段结合区到游离DNA的5’端高C片段结合区，仅有约60-70bp，并且，三个结合区域被15-20bp长度的T碱基间隔区隔离；由于游离DNA的长度约为69-180bp左右，因此，在退火时，游离DNA高甲基化区域的3’端、中间和5’端的CpNCpNCp能够分别与探针的游离DNA的3’端高C片段结合区、游离DNA的中间高C片段结合区、游离DNA的5’端高C片段结合区杂交结合，形成“双链-泡-双链-泡-双链”的结构。

其中探针起作用的区域为：

1)探针的游离DNA的3’端高C片段结合区和游离DNA的5’端高C片段结合区中包含的GNGNGNG区域，能够有选择性的捕获游离DNA的甲基化高C区域，而非高甲基化的游离DNA则不能与之结合；并且，游离DNA两端的序列具有的动力学更高，会优先结合在游离DNA的3’端高C片段结合区和游离DNA的5’端高C片段结合区。

2)游离DNA的3’端高C片段结合区和游离DNA的5’端高C片段结合区附近的NNNNNN的序列的作用为：a.提高游离DNA的结合能力；b.能够提供游离DNA滚环扩增前的唯一标签标记，该标签在后期扩增过程中，可以保证所有同一游离DNA来源的扩增子都标记上相同的序列，从而保证了后期高通量测序过程中对于游离DNA定量和去测序错误的作用；c.允许GNGNGNG区域外0-5个bp的残余碱基的非高C存在，提高了捕获的效率、减少非必要的游离DNA的损失。

3)游离DNA的中间高C片段结合区的作用是，供正确的游离DNA的杂交结合方向，如图2的B图所示，确保游离DNA能够依靠寡核苷酸探针的结构序列，在连接酶的作用成功环化；避免出现如图2的A图所示的环化方向错误的情况。

4)探针中5-20bp的多T间隔区的作用是，使游离DNA在于探针杂交后形成空泡结构，同时也能防止探针形成自连接的二级结构。

采用探针对游离DNA进行捕获、环化后，采用引物对环化的游离DNA进行滚环扩增，本例滚环扩增采用的第一引物为Seq ID No.1所示序列。

Seq ID No.1：5’-GAACGACATGGCTACGA-3’

本例的引物和探针都有上海生工合成。

下面对本例的游离DNA高甲基化区域的富集和测序方法进行试验说明：

一、重亚硫酸盐处理

本例的亚硫酸氢钠处理采用EZ DNA Methylation^TM-GOLD Kit(Zymo Research)试剂盒。重亚硫酸盐处理使所有未被甲基化修饰的C转化为U，而被甲基化修饰的C保持不变；由于在CpG岛区域，甲基化修饰的碱基经常以CpNCpNCp形式存在，因此，其C是保持不变的，可以被本例的环状探针所捕获。亚硫酸氢钠处理具体方法如下：

1.试剂准备

(1)CT Conversion Reagent的制备

试剂盒中所提供的CT Conversion Reagent是固体混合物，需要在首次使用前制备成溶液。具体的，添加900μL水、50μL的M-Dissolving Buffer和300μL的M-DilutionBuffer到一管的CT Conversion Reagent中，在室温下溶解并且震荡10分钟或在摇床上摇动10分钟，得到CT Conversion Reagent溶液，CT Conversion Reagent溶液在20℃-30℃的室温下避光保存。本例采用的试剂盒中，每管CT Conversion Reagent是10次DNA处理的设计量。为了得到较好的结果，CT Conversion Reagent溶液应当在制备后立即使用。如果不立刻使用可在-20℃存储1星期。CT Conversion Reagent对光很敏感，尽量减少在光下暴露。

(2)M-WASH BUFFER的制备

添加24mL的100％的乙醇到M-WASH BUFFER中，制备试验使用的M-Wash Buffer。对于200次量的D5006试剂盒，乙醇添加量为96mL。

2.试验步骤

(1)取10ng的游离DNA稀释至20μL水中，作为DNA样品。本例的游离DNA使用QIAampCirculating Nucleic Acid Kit(QIAgen,Valencia,CA,USA)自血浆中提取得来。

(2)在PCR管中添加130μL的CT Conversion Reagent溶液和20μL的DNA样品，轻弹试管或用移液器混合样品。

(3)将步骤(2)的混合样品管放到循环变温器并按以下条件处理，98℃放置10分钟、64℃放置2.5小时，然后立刻进行后续操作，或者在4℃下待机存储。

(4)添加600μL的M-Binding Buffer到Zymo-Spin IC Column中，并将柱放入试剂盒所提供的Collection Tube中。

(5)将步骤(3)的产物加入Zymo-Spin IC Column中，盖上盖将柱颠倒数次，混合样品。

(6)采用大于10,000g的离心速度，离心30秒，弃滤液。

(7)添加200μL的M-Wash Buffer到Zymo-Spin IC Column柱中，大于10,000g的离心速度，离心30秒，弃滤液。

(8)添加200μL的M-Desulphonation Buffer到Zymo-Spin IC Column柱中，并且在20℃-30℃的室温下放置15-20分钟，然后大于10,000g的离心速度，离心30秒，弃滤液。

(9)添加200μL的M-Wash Buffer到Zymo-Spin IC Column柱中，大于10,000g的离心速度，离心30秒，弃滤液；再重复添加200μL的M-Wash Buffer，离心30秒，弃滤液。

(10)添加15μL的M-Elution Buffer到Zymo-Spin IC Column柱的基质中，并将Zymo-Spin IC Column柱放置在一个新的1.5mL管中，大于10,000g的离心速度，离心1min，洗脱DNA，滤液即经过重亚硫酸盐处理的DNA。DNA可立刻使用或储存在低于-20℃的环境，以备以后使用。

二、游离DNA的杂交捕获

在15μL重亚硫酸盐处理的DNA中，加入1μL浓度为10μM的本例的环状探针，混匀后，迅速置于98℃，反应5min，然后立即置于4℃放置至少5min。完成游离DNA的杂交捕获。

三、游离DNA单链核苷酸切除

在捕获后的游离DNA中加入1μL的Exonuclease VII(NEB)，以及2μL的10×PNKbuffer，混匀后，置于37℃反应30min后，置于95℃反应15min。将游离DNA以及游离DNA与环状探针结合后呈单链存在的5’以及3’的末端进行降解。外切酶酶切的反应体系如表1所示。

表1游离DNA外切酶反应体系

试剂	用量(μL)
		10×PNK buffer	2
Exonuclease VII(10U/μL)	1
		杂交捕获产物	16
H<sub>2</sub>0	1
		总计	20

四、游离DNA环化

在游离DNA与探针杂交结合，形成“双链-泡-双链-泡-双链”的结构后，向其中在加入Klenow fragment(ENZYMATICS)、连接酶Ligase(ENZYMATICS)以及缓冲液PNK buffer(ENZYMATICS)，将游离DNA环化。Klenow fragment将游离DNA的3’端和5’端之间的空隙补齐，将内切酶酶切区、正向引物结合区和反向引物结合区的反向互补序列连接到游离DNA上；最后，连接酶Ligase将游离DNA连接成环。具体反应体系如表2所示。

表2游离DNA环化反应体系

反应体系配制好后，置于37℃反应30分钟、95℃反应15分钟。

五、滚环扩增

首先将已经环化的游离DNA 30μL中加入浓度为10μM的Seq ID No.1所示序列引物2.5μL，在95℃反应1min，65℃反应1min，40℃反应1min，4℃反应5min后，加入Phi29DNAPolymerase(NEB)、dNTPs(NEB)和滚环扩增反应buffer(NEB)，将已经环化的游离DNA，在常温下滚环扩增、富集。

滚环扩增的反应体系如表3所示。

表3滚环扩增反应体系

试剂	用量(μL)
		10×Phi29buffer	5
dNTP(2.5mM)	5
		Phi29DNA Polymerase(10U/μL)	2
引物(10μM)	2.5
		游离DNA环化产物	30
H<sub>2</sub>0	5.5
		总计	50

反应体系配制好后，置于30℃反应2小时、65℃反应10min。滚环扩增2小时即完成高甲基化游离DNA片段的富集。

本例为了进一步对其进行高通量测序，还对滚环扩增产物进行了酶切、纯化、再环化，以及基于DNB技术的建库和高通量测序，具体如下。

五、酶切纯化

加入与探针设计的内切酶酶切区相匹配的内切酶，对滚环扩增产物进行酶切处理，将滚环扩增获得的长的单链DNA切割成140-350bp左右的片段，本例具体采用的是EcoRV内切酶；然后采用磁珠纯化，去除酶切的酶和缓冲液等。

酶切前，事先将浓度为10μM的Seq ID No.2所示序列的第一序列核酸10μL加入到50μL滚环扩增产物中，于98℃变性10分钟，然后快速置于4℃，冷却后，加入EcoRV酶(NEB)和酶切缓冲液(NEB)，37℃反应30分钟，进行酶切。酶切反应体系参考EcoRV酶说明书(NEB)。

酶切产物使用XP磁珠(AGENCOURT)进行纯化，具体包括：1)在酶切产物中加入75μL的XP磁珠，混匀，室温静置5分钟；2)置于磁力架中，待澄清后，吸去上清；3)加入80％乙醇，吹打10次后，待澄清，吸取上清，重复一次；4)加入100μL去离水，震荡混合均匀，室温放置3min后，置于磁力架上，吸取上清，弃掉磁珠，该上清即纯化的DNA。

六、DNB文库构建和高通量测序

将酶切得到的富集后的游离DNA片段再次环化，然后采用DNB技术建库、测序。具体如下：

1.再次环化处理

(1)热变性单链分离

向酶切纯化的30μL片段化DNA样品中加入浓度为10μM的Seq ID No.3所示序列的第二序列核酸10μL，放置于PCR仪上进行变性，反应条件94℃3min。反应结束后，迅速将样品转移至冰上冷却2min。

(2)环化

向上步变性的样品中加入20μL反应mix，混匀后，置于恒温混匀仪中37℃孵育1h。20μL反应mix的组份如表4所示。

表4游离DNA片段环化的反应mix

试剂	用量(μL)
		10×TA buffer	6
ATP(100mM)	0.6
		T4DNA ligase(600U/μL)	0.2
H<sub>2</sub>0	13.2
		总计	20

2.基于DNB技术的建库和高通量测序

上一步环化后的总量约40ng的单链环状DNA 10μL加入浓度为10μM的Seq ID No.3所示序列的第二序列核酸，以此作为滚环扩增引物，置于95℃反应1min，65℃反应1min，40℃反应1min，4℃反应5min。加入以下包含有Phi29buffer(NEB)，dNTP(NEB)，Phi29DNAPolymerase(NEB)的混合液10μL，混合均匀后，置于30℃反应30min。

表5环化游离DNA片段滚环扩增混合液

最后在其中加入Stop DNB Rxn Buffer 5μL，混合均匀后，即完成再次环化的酶切游离DNA环的滚环扩增，形成DNA纳米球，即DNB；然后对DNB，进行BGISEQ500高通量双向测序，每个样本测序量为8GB。测序方法参考专利申请201510130536.X。

七、测序数据分析

首先对数据进行过滤，去掉adapter序列、引物序列以及筛除掉低质量的reads。然后使用Bismark和Bowtie程序对将C转换为T后的reads比对到人基因组hg19参考序列中，并使用Methylkit R包从Bismark比对结果SAM文件中读取每个碱基的甲基化比例，要求每个碱基至少需要有4-10乘以上的覆盖度，并且每个碱基覆盖的reads至少具有20的质量值，并对应UCSC Genome Browser中下载的hg19的人类CpG岛序列进行注释。

人的参考序列hg19中含有28691个CpG岛，最终通过比对分析本例的测序结果显示，测序深度4乘以上的有25162个CpG岛，人CpG岛覆盖度87.7％，而测序深度10乘以上的有21374个CpG岛，覆盖深度达74.5％，如图3所示。而现有的测序方法，对人CpG岛覆盖度仅为34.2％，详细信息参考Wen L,Li J,Guo H,et al.Genome-scale detection ofhypermethylated CpG islands in circulating cell-free DNA of hepatocellularcarcinoma patients[J].Cell research,2015,25(11):1250-1264。可见，本例的游离DNA高甲基化区域的富集和测序方法与同类技术相比，对于CpG岛的富集效果更高。

本例的富集和测序方法，覆盖度高达87.7％，能够覆盖到大部分的CpG岛，为DNA甲基化研究提供了新的方法。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大基因研究院

广州华大基因医学检验所有限公司

<120> 用于DNA高甲基化区域富集的试剂、富集方法及应用

<130> 17I24510

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaacgacatg gctacga 17

<210> 2

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cacagatatc gaac 14

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gccatgtcgt tcgatatctg tgagccaagg 30

Claims

1.一种用于DNA高甲基化区域富集的试剂，其特征在于：所述试剂包括单链环形结构的探针，所述探针的序列依序为内切酶酶切区、正向引物结合区、DNA 3’端高C片段结合区“NNNNNGNGNGNG”、间隔区“(T)_15-20”、DNA中间高C片段结合区“NGNGNGN”、间隔区“(T)_15-20”、DNA 5’端高C片段结合区“NGNGNGNNNNN”、反向引物结合区；探针序列中，N表示A、G、C、T中的任意碱基。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述反向引物结合区中包含有测序接头序列、索引序列。

3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：还包括与所述探针的正向引物结合区和/或反向引物结合区匹配的滚环扩增引物。

4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述滚环扩增引物包括第一引物，所述第一引物为Seq ID No.1所示序列；

Seq ID No.1：5’- GAACGACATGGCTACGA -3’。

5.据权利要求1-4任一项所述的试剂在DNA高甲基化区域富集或DNA高甲基化区域测序中的应用。

6.一种用于DNA高甲基化区域富集或测序的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1-4任一项所述的试剂。

7.一种DNA高甲基化区域富集的方法，其特征在于：包括以下步骤，

（1）对DNA进行重亚硫酸盐处理，使DNA中的非甲基化C转化为U；

（2）将步骤（1）处理后的DNA，与权利要求1-4任一项所述的试剂中的所述探针杂交；

（3）将步骤（2）的杂交产物与核酸外切酶反应，使DNA与所述探针结合后呈单链存在的5’端和3’端的末端降解；

（4）向步骤（3）的降解产物中加入Klenow fragment、连接酶Ligase、ATP，dNTP以及反应缓冲液，将DNA连接成环；

（5）以步骤（4）连接环化的产物为模板，采用与所述引物结合区匹配的滚环扩增引物，进行滚环扩增，实现DNA高甲基化区域的富集。

8.一种DNA高甲基化区域的测序方法，其特征在于：包括以下步骤，

（1）采用权利要求7所述的方法对DNA高甲基化区域进行富集；

（2）采用核酸内切酶将步骤（1）富集得到的滚环扩增产物酶切为DNA片段，所述核酸内切酶为所述探针设计的内切酶酶切区对应的内切酶；

（3）将酶切后的DNA片段连接成环；

（4）对环化的DNA片段进行滚环扩增，获得DNA纳米球；

（5）对DNA纳米球进行高通量测序。

9.根据权利要求8所述的测序方法，其特征在于：所述步骤（2）中，核酸内切酶将步骤（1）富集得到的滚环扩增产物酶切为DNA片段具体包括，向步骤（1）的滚环扩增产物中添加第一序列核酸，所述第一序列核酸与所述内切酶酶切区互补杂交，使之形成双链DNA，以便于所述核酸内切酶进行酶切。

10.根据权利要求9所述的测序方法，其特征在于：所述第一序列核酸为Seq ID No.2所示序列；

Seq ID No.2：5’-CACAGATATCGAAC-3’。

11.根据权利要求8所述的测序方法，其特征在于：所述步骤（3）中，将酶切后的DNA片段连接成环具体包括，向步骤（2）酶切获得的DNA片段中加入第二序列核酸，所述第二序列核酸与所述DNA片段的5’端和3’端互补杂交，并且使DNA片段的5’端和3’端杂交后末端相对，以所述第二序列核酸为模板，使所述DNA片段连接成环。

12.根据权利要求11所述的测序方法，其特征在于：所述第二序列核酸为Seq ID No.3所示序列；

Seq ID No.3：5’-GCCATGTCGTTCGATATCTGTGAGCCAAGG-3’。

13.根据权利要求12所述的测序方法，其特征在于：所述步骤（4）中，对环化的DNA片段进行滚环扩增，其采用的引物为Seq ID No.3所示序列。