CN105934523B

CN105934523B - 核酸的多重检测

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Publication number: CN105934523B
Application number: CN201480070068.5A
Authority: CN
Inventors: C·O·F·达尔; J·O·埃瑞克森
Original assignee: Suzhou Xinbo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Sym Bio Lifescience Co Ltd
Priority date: 2013-12-02
Filing date: 2014-11-26
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2034-11-26
Also published as: JP2021006028A; RU2733887C2; GB2520765A; KR20210121291A; EP3757228B1; US20160281130A1; JP2016537989A; WO2015083002A2; CA2931015C; EP3757228A1; EP3757228C0; BR112016012319A2; WO2015083002A3; KR102307230B1; US10526643B2; AU2014358862B2; KR20160096632A; GB201321196D0; BR112016012319B1; KR102451174B1

Abstract

本文描述新的方法，其中使用多个特异性探针来检测含有多个独特靶标序列的所关注核酸物质(例如染色体)，所述探针通过滚环扩增来扩增并加以检测。多个探针用于提供可检测信号，其中信号的幅度与识别其靶标序列的探针的数目成比例。通过经由多重探测来扩增个别信号，来自多个探针的个别信号被转化成单一累积可检测信号。十个或更多个探针产生十倍或更大的信号扩增。所产生的信号取决于在靶标识别后正确反应的探针，其使用序列特异性杂交和酶催化来产生特异性产物，从所述产物获得信号。

Description

核酸的多重检测

交叉引用

本申请要求2013年12月2日提交的英国申请号：1321196.6的权益，所述申请通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及使用结合特定序列的探针来并行检测多个核酸序列的多重方法。本发明还涉及量化核酸物质，例如确定样品中的两种不同染色体的相对数量，包括这类方法在胎儿异倍体性的非侵入性出生前诊断中的使用。

背景

许多疾病的病因或特征是与物种的染色体或染色体节段的正常数目比较，个体的细胞中的染色体数目的不平衡(异倍体性)或染色体节段数目的不平衡(部分异倍体性)。人二倍体基因组具有23对染色体；成对染色体1至22和性染色体XX或XY。术语单体性和三体性是指缺失或额外染色体，而部分单体性和部分三体性是指由染色体一部分的相应损失或增加所导致的遗传物质的不平衡。个体基因组中的异倍体性和部分异倍体性与先天性病症诸如唐氏综合征(人染色体21的三体性)和特纳氏综合征(性染色体的单体性或部分单体性)相关联。异倍体性和部分异倍体性还可经由成人组织中的体细胞突变而出现。举例来说，许多癌细胞展现染色体脆性，导致染色体片段易位和肿瘤细胞的异倍体性。

已开发诊断与染色体缺陷相关联的疾病的方法。传统的核型分析方法包含获得组织样品，将染色体染色并且在光学显微镜下对其检查。

等人(Science 273(5274):494–497 1996)描述多色光谱核型分析，其使用荧光原位杂交(FISH)来同时以不同颜色显现所有人染色体。通过用不同荧光团来标记染色体特定DNA来制成针对每个染色体的荧光标记探针。因为光谱不同荧光团的数目有限，所以组合标记方法用于产生所需数目的不同发射光谱。将由组合标记产生的光谱差异捕获并且使用连接至荧光显微镜的干涉仪来分析。然后，图像处理软件为每个光谱不同组合指派颜色，从而允许显现个别着色的染色体。

比较基因组杂交(CGH)涉及从待比较的两个来源，最通常测试和参考来源分离DNA，将每个DNA样品用不同颜色(通常红色和绿色)的荧光团单独地标记，将DNA变性以使得它是单链的，并且两个所得样品以1:1比率杂交至正常中期染色体涂片，经标记DNA样品在其起点基因座处结合至所述涂片。然后使用荧光显微镜和计算机软件，将差异着色的荧光信号沿着每个染色体的长度比较以识别两个来源之间的染色体差异。染色体的特定区域中的测试样品颜色的较高强度指示相应来源样品中的此区域的材料增加，而参考样品颜色的较高强度指示此特定区域中的测试样品的材料损失。中性颜色(在荧光团标记为红色和绿色时，中性颜色是黄色)指示在此位置的两个样品之间没有差异。CGH由Kallioniemi等人,Science 258(5083):818-21 1992和Pinkel等人,Nat Genet.20(2):207-11 1998描述。

最近，已开发数字或假核型分析方法来在基因组规模上量化拷贝数(Wang等人,PNAS 99(25):16156-16161 2002)。与常规核型分析或基于染色体的CGH相比，数字核型分析允许在较高分辨率下检测拷贝数的差异。分离并计数来自整个基因组上的特定基因座的短DNA序列。各自21bp的标签可从基因组中的特定位置获得并且总体上含有唯一地识别产生所述标签的基因组基因座的足够信息。因此，标签可与精确染色***置匹配并且标签密度可在移动窗口上评估以检测DNA序列内含物的异常。将序列标签与其染色***置匹配的方法包括高通量测序、使用阵列比较基因组杂交和SNP阵列。

阵列由与基因组中的所关注区域互补的数百至数百万个探针组成。将来自测试样品的DNA片段化、标记并且杂交至阵列。对于阵列上的每个位置，将每个探针的杂交信号强度量化。知道阵列上的每个探针的地址和基因组中的每个探针的地址，使用算法来将探针以染色体顺序排齐并且在计算机中重建基因组。数字核型分析的分辨率取决于阵列上的探针密度。

需要高精度分析的一个领域是非侵入性出生前核型分析。怀孕母亲在其血液中带有无细胞循环DNA，其中4-30％来自胎儿。可通过确定来源于每个染色体的无细胞DNA的丰度来确定胎儿的核型。举例来说，如果无细胞DNA由95％母体和5％胎儿DNA组成，并且如果胎儿患有染色体21的三体性(唐氏综合征)，那么来自染色体21的无细胞DNA的总量应超过相同大小的任何其他基因组区域的无细胞DNA的总量2.5％。观察胎儿DNA中的染色体异倍体性需要非常精确的测量来检测不同染色体的相对数量的这些轻微不平衡。由于需要用相对较小样品来研究以便为患者和临床医生提供便利并且可接受的方法，因此上述困难加重。

来自单一或少许DNA分子的特定靶标的分析在传统上一直是技术难题。通常需要拷贝DNA的方法以便获得用于下游分析程序的足够信号。分析方法诸如DNA测序、凝胶电泳和DNA微阵列通常需要所提供的样品中的DNA的信号扩增。扩增特定DNA靶标的最常见扩增方法是PCR，其可提供来自DNA样品的特定靶标的数百万(或数十亿)个拷贝。然而，当需要扩增基因组样品的许多区域以便分析时，可由于在同一反应混合物中一起执行多个不同扩增而出现扩增假象。另外，扩增步骤可导致损失关于样品中的序列的相对数量的信息，因为与扩增核酸产物的绝对量相比，相对数量的初始差异可能很小，并且因为不同序列可以不同效率来扩增。

发明概述

本文所述方法的一些实施方案引入新方法，其中含有多个独特靶标序列的所关注核酸物质(例如染色体)使用多个特定探针来检测。多个探针用于提供可检测信号，其中信号的幅度与识别其靶标序列的探针的数目成比例。来自多个探针的个别信号转化成单一累积可检测信号，从而经由多重探测来扩增个别信号。十个或更多个探针产生十倍或更大的信号扩增。所产生的信号取决于在靶标识别后正确反应的探针，其使用序列特异性杂交和酶催化来产生特异性产物，从所述产物获得信号。

一些实施方案使用检测所关注靶标分子的核酸物质上的多个基因座作为信号扩增步骤，并且由此能够在不需要扩增反应探针的产物的情况下实现信号产生和检测。然而，来自多重产物的信号可任选地通过传统信号扩增步骤来扩增。可执行信号的克隆扩增。合适扩增技术包括滚环扩增、桥式PCR、emPCR和数字PCR。

识别其靶标序列的每个探针产生连接产物，并且通过每个探针杂交产生的连接产物可个别地检测，以使得个别信号可从每个连接产物获得。然而，本发明方法的一些实行方案的极好特征是这些个别信号不一定个别地检测，而是替代地合并成累积信号并且检测累积信号。累积信号是个别信号的组合并且由此可用于检测和/或量化连接产物，所述连接产物代表所研究的核酸物质的存在或数量。与涉及测序和微阵列的方法相比，这允许更早合并探针信号，在所述方法中对于在区域上的多个探针，产生个别信号，然后信号在分析中合并以代表区域。信号可在检测之前合并，以使得个别信号无需单独定位或查询。这能够实现更简单读出格式。

通过多重处理的信号扩增方法可用于检测样品中的所关注核酸物质，例如其中核酸物质是复杂核酸样品中的次要或微量组分。通过多重处理的扩增能够实现可靠检测。这可用于例如出于诊断目的来检测样品，诸如患者样品中的微生物核酸。样品可用对于多种微生物核酸物质具有特异性的探针来探测，以检测并识别所存在的核酸。这适用于检测传染病媒介物，诸如细菌、病毒和真菌。可检测具体核酸转录物。通过多重处理的扩增还可用于量化核酸物质。通过探测两种或更多种核酸物质，一或多种所关注物质和一或多种参考核酸物质，本发明方法能够量化样品中的两种物质的相对量。在应用于检测或量化染色体或染色体基因座，例如用于染色体拷贝数检测时，所述方法尤其有用。特别有价值的应用是使用这类方法来识别染色体缺陷，包括诊断癌症和先天性异倍体性。尤其描述用于非侵入性出生前诊断(NIPT)的用途。在查询/检测包括许多靶标序列的较大核酸时，本发明方法特别有用，尤其如果这些核酸以低摩尔量存在，并且在其必须以很高精确度来测量或量化时更是如此，如在NIPT中的情况下。

样品中的核酸物质可通过使样品与一组探针接触来检测，其中每个探针特异性识别待检测的核酸物质中的不同靶标序列，并且其中由每个探针来识别每个靶标序列产生产物，并且检测作为来自产物的信号的组合的累积信号，其中检测到信号指示样品中的核酸物质的存在。核酸物质可通过量化累积信号以确定信号水平来量化，其中信号水平与样品中的核酸物质的数量成比例，并且由此确定样品中的核酸物质的数量。第一核酸物质可通过使样品与第一组探针和第二组探针接触来相对于第二或参考核酸物质量化，其中第一组探针各自特异性识别第一核酸物质内的不同靶标序列并且其中第二组探针各自特异性识别第二或参考核酸物质内的不同靶标序列。检测第一和第二累积信号，第一累积信号是来自由识别其靶标序列的第一组探针所产生的产物的个别信号的组合，并且第二累积信号是来自由识别其靶标序列的第二组探针所产生的产物的个别信号的组合。将第一和第二信号量化以分别确定第一和第二信号水平，这些水平与样品中的第一和第二核酸物质的数量成比例。因此，样品中的第一和第二核酸物质的相对数量可通过比较第一和第二信号水平来确定。

举例来说，累积信号可为识别其靶标序列的探针的克隆扩增和/或标记产物的汇总计数，例如滚环扩增的产物，或从所有产物发射的荧光信号，其中每个产物发射荧光信号。为了量化多种核酸物质的相对量，对于每一种物质使用不同信号，例如与另一组探针的产物相比，一组探针的产物可发射不同波长或光谱的荧光。

在探针靶标识别依赖于杂交和酶辨别时获得优势，以使得信号输出取决于正确的酶促探针反应。优选地，通过探针来识别靶标序列包括探针杂交至靶标序列和产生连接产物，其中连接产物的产生取决于探针特异性杂交至其靶标序列。本文描述被设计成尤其适合于用于本发明方法的探针。然而，探针不限于探针的任何一种设计，并且可便利地使用各种已知核酸探针，包括例如挂锁探针、选择子探针、寡核苷酸连接探针、分子倒转探针和串联探针。

本公开的第一方面提供检测样品中的核酸物质的方法，其包括

使样品与一组探针接触，其中每个探针特异性识别待检测的核酸物质内的不同靶标序列，

提供使得核酸物质中的靶标序列变成至少部分单链的条件，

提供用于退火和连接的条件，在所述条件下探针杂交至其靶标序列并且产生连接产物，每个连接产物包括连接接合处，以及

检测作为来自所有连接产物的个别信号的组合的累积信号，

其中检测到信号指示样品中的核酸物质的存在。

本公开的第二方面提供量化样品中的核酸物质的方法，其包括

使样品与一组探针接触，其中每个探针特异性识别待量化的核酸物质内的不同靶标序列，

提供使得核酸物质中的靶标序列变成至少部分单链的条件，

检测作为来自所有连接产物的个别信号的组合的累积信号，

量化累积信号以确定信号水平，其中信号水平与样品中的核酸物质的数量成比例，并且

由此确定样品中的核酸物质的数量。

所述方法可用于相对于样品中的第二核酸物质来量化第一核酸物质。因此，所述方法可包括

使样品与第一组探针和第二组探针接触，其中第一组探针各自特异性识别第一核酸物质内的不同靶标序列并且其中第二组探针各自特异性识别第二核酸物质内的不同靶标序列，

提供使得第一和第二核酸物质中的靶标序列变成至少部分单链的条件，

提供用于退火和连接的条件，在所述条件下探针杂交至其靶标序列并且产生连接产物，每个连接产物包括连接接合处，

检测作为来自由第一组探针所产生的连接产物的个别信号的组合的第一累积信号，并且将其量化以确定第一信号水平，其中第一信号水平与样品中的第一核酸物质的数量成比例，

检测作为来自由第二组探针所产生的连接产物的个别信号的组合的第二累积信号，并且将其量化以确定第二信号水平，其中第二信号水平与样品中的第二核酸物质的数量成比例，以及

比较第一和第二信号水平，从而确定样品中的第一和第二核酸物质的相对数量。

另一个方面提供相对于样品中的第二染色体或染色体基因座来量化第一染色体或染色体基因座的方法，其包括

使样品与第一组探针和第二组探针接触，其中第一组探针各自特异性识别第一染色体或染色体基因座内的不同靶标序列并且其中第二组探针各自特异性识别第二染色体或染色体基因座内的不同靶标序列，

提供使得第一和第二染色体或染色体基因座中的靶标序列变成至少部分单链的条件，

提供用于退火和连接的条件，在所述条件下探针杂交至其靶标序列并且产生连接产物，每个连接产物是包括连接接合处的核酸环，

提供用于核酸环的滚环复制的条件，

计数第一滚环复制产物的数目，其中滚环复制产物从由第一组探针产生的连接产物扩增以提供第一计数，

计数第二滚环复制产物的数目，其中第二滚环复制产物从由第二组探针产生的连接产物扩增以提供第二计数，以及

比较第一和第二计数，从而确定样品中的第一和第二核酸物质的相对数量。

在这些实施方案中，滚环扩增产物可个别地通过以下步骤来计数：(a)获得底物，所述底物包括分布在底物表面上的多个复合物，其中每个复合物包括单一RCA产物和杂交至RCA产物的多个标记寡核苷酸探针，其中对应于第一滚环扩增产物的复合物和对应于第二滚环扩增产物的复合物可区分地标记；并且(b)计数存在于底物区域中的第一RCA产物的数目并且独立地计数第二RCA产物的数目。在此实施方案中，寡核苷酸可荧光标记。

总体上，对于待检测或量化的每一种核酸物质，探针的数目至少为十种。数目当然是指不同探针的数目，而非探针分子的绝对数。因此，核酸含有至少十种不同特定靶标序列，并且累积信号是至少十种独特探针的个别信号的组合，此累积信号代表一种核酸物质。高水平的多重处理可用于获得相应地高水平信号扩增。举例来说，至少100种、至少1,000种、至少10,000种或甚至更大数目的探针可用于待检测或量化的每一种核酸物质。

如提及，各种探针设计适合于用于本发明方法。在正确杂交至其靶标序列之后产生连接产物的探针包括：

a)挂锁探针，其中探针通过杂交至靶标序列来环化，并且探针核酸的环通过连接来产生。挂锁探针描述于US5,854,033(Lizardi)、WO99/49079(Landegren)和US 5,871,921(Landegren&Kwiatkowski)中。被称为倒转探针的挂锁探针形式描述于US 6,858,412(Willis等人)中。倒转探针是含有探针骨架中的裂解位点的挂锁探针，从而允许环化探针裂解以形成线性产物，然后其可扩增并检测。

b)串联探针，其在结合至靶标序列时与桥连寡核苷酸一起环化。靶标序列充当两个探针序列的连接的模板，其中在所述探针序列之间具有桥连寡核苷酸。然后，两个探针序列连接以形成环。此类型的探针描述于US2013/0172212(Ariosa)中。串联探针类似于挂锁探针，但是在连接之后的单独步骤中而非在连接期间使探针环化。

c)靶标环化探针。在此类型的探针中，靶标序列片段通过模板寡核苷酸来环化。靶标序列的末端可连接在一起，任选地在所述末端之间具有***序列。靶标环化探针描述于WO2008/033442(Stanford)中。EP1997909(源自WO99/49079)描述一种探针，所述探针具有与界定5’靶标序列和界定3’靶标序列互补的两个相邻序列，以使得靶标片段与探针的杂交使靶标末端放在一起以充当靶标末端连接的模板，从而使靶标核酸环化。

d)选择子探针，其为具有与靶标序列的末端互补的一个或两个突出末端的双链选择子构建体，所述探针杂交至靶标序列并且连接至靶标序列的每个末端，形成含有探针核酸和靶标序列的环形或线性连接产物。各种选择子探针是已知的。选择子描述于例如WO2005/111236(Dahl)；WO2011/009941(Olink Genomics)；WO2011/067378(OlinkGenomics)和WO2008/153492(Agilent)中。

e)OLA(寡核苷酸连接测定)探针。这些探针已经描述用于SNP基因分型。每个探针包括一对寡核苷酸，其杂交至靶标序列的相邻区域以使得一个寡核苷酸的5’末端相邻于另一个核苷酸的3’末端退火并且然后末端得以连接。OLA探针方法形式包括上游间隙填充聚合(golden gate测定)或通过将额外寡核苷酸连接于两个侧接探针之间来进行间隙填充(DANSR测定)。golden gate测定描述于Fan,J.B.等人Highly parallel SNPgenotyping.Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.68,69–78(2003)中。DANSR测定描述于A.B.Sparks,E.T.Wang,C.A.Struble等人,Selective analysis of cell-free DNA inmaternal blood for evaluation of fetal trisomy,Prenat Diagn(2012)中。

通常，用于本发明方法的所需探针是杂交至靶标序列并且产生连接产物的探针，其中连接产物的产生取决于探针与其靶标序列的特异性杂交。这包括以上列出的所有示例性探针。优选地，连接产物是双重连接产物(例如选择子探针和串联探针)。优选地，连接产物包括靶标序列本身，例如当靶标序列是核酸物质片段时，片段本身连接至探针并且因此并入连接产物中。这允许通过将产物测序来验证靶标序列。连接产物可为环形或线性核酸，但是对于环形产物(例如使用挂锁探针、选择子探针或靶标环化探针)存在某些优势，诸如克隆扩增并检测滚环复制的产物的能力。

因此，在一些情况下，用于本发明方法的探针具有一个或多个上述特征。

本文描述可理想地用于本发明方法的探针的新设计。探针具有尤其合乎需要的特征组合，包括(在各种实施方案中)所有上述属性。这些新探针包括

靶向寡核苷酸，其比所述靶标片段更长并且含有内部靶标互补序列，以使得所述靶向寡核苷酸与所述靶标片段之间的杂交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游和下游侧接序列之间的双链序列，和

分别具有自由5’和3’末端的头部和尾部序列，其中头部和尾部序列分别与上游和下游侧接序列互补。

在用于退火和连接的条件下，头部和尾部序列杂交至侧接序列，并且靶标片段，如果存在，杂交至靶标互补序列，从而将靶标片段的末端与头部序列的5’末端和尾部序列的3’末端并置定位。头部序列的5’末端和靶标片段的3’末端杂交至靶向寡核苷酸的相邻核苷酸，并且尾部序列的3’末端和靶标片段的5’末端杂交至靶向寡核苷酸的相邻核苷酸。如果靶标片段存在，靶标片段的3’末端连接至头部序列的5’末端以形成第一连接接合处，并且靶标片段的5’末端连接至尾部序列的3’末端以形成第二连接接合处，从而产生双重连接产物，所述产物包括包含头部和尾部序列和靶标片段的连续核酸链。

根据在本文中别处阐述的特定探针设计，双重连接产物可为环形或线性。

本文提供样品分析方法。在某些实施方案中，所述方法包括：a)使包括片段化DNA的样品(例如，已经通过限制酶来消化的样品)与包括第一组探针的探针混合物杂交，其中第一组探针的探针杂交至第一染色体中的不同位点(即，不同序列)并且在杂交至来自第一染色体的DNA片段时，形成含有可连接相邻接合处的非共价环形产物。在这种情况下，术语“可连接相邻”意指在两个寡核苷酸之间没有***核苷酸并且其可使用连接酶来彼此连接。这类探针的实例在以上和以下更详细地描述。这类探针的实例在图3和4中示例性说明。接下来，如图2中示出，所述方法包括：b)将可连接相邻接合处连接在一起以产生多个共价环形连接产物。因此，所述方法的下一个步骤包括：c)通过滚环扩增(RCA)来扩增共价环形连接产物以产生多个RCA产物分子。然后，RCA产物可标记并量化，从而提供对应于样品中的第一染色体的DNA的量的估计值。环化产物提供用于检测的显著优势，因为其可通过滚环扩增(RCA)来扩增。RCA产生单一分子中的环化产物的数百或数千个拷贝，从而有效地扩增环化产物并且使得通过使用例如杂交至产物中的基元的标记寡核苷酸来对所述产物个别地检测变得相对容易。量化来自个别RCA产物的信号是重要的，因为在许多应用(例如，通过分析无细胞DNA的非侵入性出生前诊断)中，对应于具体染色体(例如，染色体21)的片段的数目需要相当精确地并且没有偏差地确定。典型分析方法使用PCR，如熟知，所述PCR是非常容易出现偏差的程序，因为一些序列以比其他序列高得多的效率扩增。这使得基于PCR的策略对于许多诊断工作来说是不切实际的。

图8示出可如何量化滚环扩增产物。在此方法中，量化步骤可通过以下步骤来进行：将在步骤c)中产生的个别滚环扩增产物分子彼此分离，并且计数界定区域或体积中的个别滚环扩增产物分子的数目。如图8中示出，包括靶标序列X和侧接序列A和B的环化产物22(由环化产物22a、22b、22c和22d组成)通过引物52扩增以产生一组RCA产物。然后，RCA产物分布于表面上，并且RCA产物的数目可通过显微术来直接计数，其中术语“分布”意指RCA产物沉积于平面底物的表面上，并且允许扩散开。RCA产物不需要结合至底物，但是在某些情况下其可(例如，经由生物素等)来结合。

在这些实施方案中，量化步骤可通过以下来进行：i.使标记寡核苷酸杂交至RCA产物分子，其中标记寡核苷酸杂交至在RCA产物中重复的序列，从而产生多个复合物，所述复合物各自包括单一RCA产物和杂交至RCA产物的多个标记寡核苷酸；和ii.计数在底物表面上的界定区域中的标记复合物的数目。如图2中示出，在检测时点，RCA产物是复合物的一部分，所述复合物含有RCA产物本身、单一环化产物，和杂交至在RCA产物中重复的序列的多个标记寡核苷酸。

如将认识到，RCA产物可在其分布于底物上之前或之后标记。因此，在这些实施方案中，量化步骤可通过以下来进行：(a)获得包括分布在底物表面上的标记复合物的底物；和(b)计数存在于底物的第一区域中的RCA产物的数目。所述方法可多重执行以使得其他环状产物可同时量化。举例来说，用于方法的探针组可含有可区分序列(例如，染色体21探针可含有第一序列并且染色体18探针可含有第二序列)，并且由于那些探针的环化而制成的不同组RCA产物可使用杂交至第一和第二序列的可区分标记寡核苷酸来区分。

在这些实施方案中，所述方法可包括：(a)获得底物，所述底物包括分布在底物表面上的第一和第二多个复合物，其中每个复合物包括单一RCA产物和杂交至RCA产物的多个标记寡核苷酸探针，第一和第二多个复合物可区分地标记，并且第一和第二多个复合物对应于不同染色体；并且(b)计数存在于底物的第一区域中的第一多个RCA产物的数目并且独立地计数第二多个RCA产物的数目。在此实施方案中，寡核苷酸可荧光标记。适用于本发明方法的合适可区分荧光标记对包括Cy-3和Cy-5(Amersham Inc.,Piscataway,NJ)、Quasar570和Quasar 670(Biosearch Technology,Novato CA)、Alexafluor555和Alexafluor647(Molecular Probes,Eugene,OR)、BODIPY V-1002和BODIPY V1005(Molecular Probes,Eugene,OR)、POPO-3和TOTO-3(Molecular Probes,Eugene,OR)和POPRO3TOPRO3(MolecularProbes,Eugene,OR)。其他合适可区分可检测标记可见于Kricka等人(Ann ClinBiochem.39:114-29,2002)。

在一些实施方案中，样品可含有基因组DNA的片段，例如，实际上任何生物体的基因组DNA，包括但不限于植物、动物(例如爬行动物、哺乳动物、昆虫、蠕虫、鱼等)、组织样品、细菌、真菌(例如酵母)、噬菌体、病毒、尸体组织、考古学/古代样品等。在某些实施方案中，用于所述方法的基因组DNA可来自哺乳动物，其中在某些实施方案中哺乳动物是人。在示例性实施方案中，基因组样品可含有来自哺乳动物细胞，诸如，人、小鼠、大鼠或猴细胞的基因组DNA。样品可从培养细胞或临床样品的细胞，例如，组织活检、铲刮物或灌洗物或法医学样品的细胞(即，在犯罪现场收集的样品的细胞)制成。在具体实施方案中，核酸样品可从生物样品例如细胞、组织、体液和粪便中获得。所关注的体液包括但不限于血液、血清、血浆、唾液、粘液、粘痰、脑脊髓液、胸膜液、眼泪、乳腺管流体、淋巴、痰、脑脊液、滑液、尿液、羊水和***。在具体实施方案中，样品可从受试者，例如，人获得。在一些实施方案中，所分析的样品可为从血液，例如，怀孕雌性的血液获得的无细胞DNA的样品。在某些实施方案中，基因组DNA可在片段化之前例如使用全基因组扩增方法来扩增。样品可含有微生物DNA，例如，来自病毒或细菌的基因组的DNA。

在任何实施方案中，探针混合物可包括第二组探针，其中第二组探针的探针杂交至第二染色体中的不同位点并且在杂交至来自第二染色体的DNA片段时，形成含有可连接相邻接合处的非共价环形产物。在此方法中，量化步骤可包括个别地量化对应于第一和第二染色体的滚环扩增产物分子的数目，从而提供对应于样品中的第一和第二染色体的DNA的相对量的估计值。如以上提及，对应于第一和第二染色体的RCA产物可通过将可区分标记寡核苷酸与其杂交并且将其分布在载体例如显微镜用载玻片的表面上来个别地量化。

所述方法也可用于检查亚染色体区域。在这些实施方案中，第一组探针可杂交至染色体的第一区域中的不同位点。在这些实施方案中，探针混合物可包括第二组探针，其中第二组探针的探针杂交至第一染色体中的第二区域中的不同位点并且在杂交至来自第二染色体的DNA片段时，形成含有可连接相邻接合处的非共价环形产物。在此方法中，量化步骤可包括个别地量化对应于第一染色体的第一和第二区域的滚环扩增产物分子的数目，从而提供对应于样品中的染色体的第一和第二区域的DNA的相对量的估计值。如以上提及，对应于第一和第二染色体的RCA产物可通过将可区分标记寡核苷酸与其杂交并且将其分布在载体例如显微镜用载玻片的表面上来个别地量化。

对于非侵入性出生前测试实施方案，靶标片段可来自例如人染色体21、13或18，但是可检查其他染色体异常(例如，其他三体性，或具体区域的缺失或***)。拷贝数变化是对应于在某些染色体上缺失或扩增的相对较大基因组区域的基因组DNA的改变。CNV可由基因组重排诸如缺失、复制、倒转和易位导致。拷贝数变化已经与各种形式的癌症(Cappuzzo F,Hirsch,等人(2005)97(9):643-655)神经病症(Sebat,J.,等人(2007)Science 316(5823):445-9，包括自闭症(Sebat,J.,等人(2007)Science 316(5823):445-9)，和精神***症StClair D(2008).Schizophr Bull 35(1):9-12相关联。检测特定细胞群体中的所关注染色体或其一部分的拷贝数变体可为识别疾病或病症的遗传诊断或预后指标的强有力工具。在一些实施方案中，第一染色体是染色体21并且第二染色体选自染色体13和染色体18。

在任何实施方案中，每个非共价环形产物包括来自样品的DNA片段。在图3和4示出的实行方案中，用于所述方法的探针可包括：i.头部序列和尾部序列，其中头部和尾部序列在第一寡核苷酸分子的末端；和ii.夹持序列，其依序包括：与头部序列互补的上游侧接序列；与靶标片段互补的靶标互补序列；和与尾部序列互补的下游侧接序列。在这些实施方案中，在非共价环形产物中，靶标片段的末端可连接地相邻于第一寡核苷酸分子中的头部和尾部序列的末端。在这些实施方案中，夹持序列可在第一寡核苷酸分子中。或者，夹持序列可在第二寡核苷酸分子中。

在一些实施方案中，所述方法包括使样品与一组至少50种(例如，至少100种、至少200种、至少500种、至少1,000种、至少2,000种或至少5,000种)所述探针杂交，其中所述探针靶向相同染色体(例如，人染色体21、13或18)上的不同片段，并且其中所述方法产生包括靶标片段的多个环状产物。所产生的环状产物的数目可例如通过使用RCA将其扩增并且计数RCA产物的数目来量化，如上所述。

附图说明

熟练技术人员将理解，以下所述附图仅出于说明目的。这些附图并非想要以任何方式来限制本教导的范围。

图1示意性地示出本发明方法的一个实施方案，其中所关注的DNA靶标物质与多个标记线性探针接触并且检测来自结合标记的累积信号。

图2示意性地示出本发明方法的一个实施方案，其中所关注的DNA靶标物质与通过滚环扩增来克隆扩增的多个环化探针接触并且检测扩增产物的累积信号。

图3示出包括结合至其靶标片段的环化骨架寡核苷酸的探针。探针以两种形式A和B示出。

图4示出具有结合靶标片段的环化单一寡核苷酸探针。

图5示出具有结合靶标片段的由靶向寡核苷酸和环状骨架寡核苷酸组成的环化双环探针。

图6示出具有结合靶标片段的由靶向寡核苷酸和线性骨架寡核苷酸组成的线性环状探针。

图7示出具有结合靶标片段的包括两个骨架寡核苷酸的线性探针。

图8示出可藉以计数RCA产物的方法。

图9是展示本文所述方法的特异性的凝胶图像。

图10是展示本文所述方法的精确度的图表。

图11图A示出载玻片表面上的标记RCA产物的图像；图B示出可如何通过计数个别RCA产物来精确地确定来自不同染色体的片段的比率。

详述

靶标序列的多重识别

待检测或量化的核酸物质包括多个靶标序列。这些靶标序列彼此不同。因此，其代表核酸上的空间不同位置，但是其可重叠。给定核酸物质内的靶标序列可重叠、不重叠，或可为重叠和不重叠靶标序列的混合物。优选地靶标序列不重叠。事实上，核酸物质的一组靶标序列代表用于检测同一核酸物质的不同表位。

通常在核酸中存在至少10种、至少100种、至少1,000种或至少10,000种不同靶标序列，并且这些序列中的每一种可探测。

探针的合适浓度可基于样品中的核酸物质的浓度(或预期浓度)来确定。如在实施例中示出，探针可以每个探针10pM的浓度添加至样品。当样品与多个探针(例如一组探针)接触时，个别探针的浓度可为10pM。优选地，探针在超过待检测或量化的所关注核酸物质的预期浓度的浓度下使用。使用过量探针确保存在于样品中的靶标序列的所有拷贝得以识别。这最大程度地增强检测的灵敏度。另外，当方法涉及量化时，确保检测来自一组探针的连接产物或累积信号与样品中的靶标序列的数量成比例。

当一种核酸物质相对于另一种核酸物质量化时，靶标序列是对所述核酸物质有特异性的，即，未发现于另一种核酸物质中，并且优选地未发现于可存在于样品中的任何其他核酸物质中。

在许多诊断和其他应用中，核酸物质是染色体或染色体基因座，例如，人染色体或染色体基因座。因此，每个靶标序列片段可为对生物体的基因组的这一种染色体有特异性的。换句话说，它只可发现于基因组的一种染色体中并且未发现于此基因组的其他染色体中。通常，本发明方法用于分析人基因组，在此情况下靶标序列可为对一种人染色体有特异性的片段，即，发现于这种染色体中并且未发现于其他人染色体中。举例来说，靶标序列可为对染色体21有特异性的。靶标序列可为对染色体的一个基因座有特异性的。因此，其可在这个染色体基因座中发现并且未发现于同一染色体的其他基因座中或同一基因组的其他染色体中。举例来说，靶标序列可为对人染色体的一个基因座有特异性的。

样品中的给定核酸物质可包括一些变化性，例如样品可包括不同个体的染色体，诸如从含有母体DNA和胎儿DNA的母体血液获得的核酸。在此处，所关注物质可为具体染色体，但是不论来自胎儿或母体，检测这种染色体的所有拷贝是便利的。因此，所关注物质可为一种染色体或染色体基因座，并且靶标序列在染色体或染色体基因座的母体和胎儿拷贝中发现于这种染色体或基因座中。

核酸物质可为片段化的。靶标序列可为核酸物质的片段的序列，即，靶标片段。

优选地，靶标序列是其序列预先界定的片段。包括末端的整个片段的序列可为已知的。预先界定序列的已知片段可通过核酸物质的特定，而非随机，片段化来产生。具体片段化方法包括用限制酶消化、PCR(例如，多重PCR)，和序列引导片段末端界定的其他方法，包括其他酶、核酶或这些技术的组合。

优选片段化方法是用限制性核酸内切酶或两种或更多种限制性核酸内切酶的组合来消化。因此，样品可为核酸的限制酶消化物并且靶标序列可为限制片段。

各种特定核酸裂解酶是已知的并且任何合适酶可用于本发明方法中，包括在特定核酸序列内的预先界定位置处裂解的酶，或在特定核酸识别序列之后或之前裂解的核酸内切酶和切口酶(侧切酶)。催化核酸，诸如核酶，也可用于DNA片段化。酶可裂解双链核酸以产生钝圆末端或粘性末端，或可裂解单一核酸链。各种类型限制酶是已知的，包括I型、II型、III型、IV型和V型。合适酶或酶的组合可根据需要选择用于本发明方法。举例来说，样品中的核酸(例如10ng的DNA)可用相应相容限制酶缓冲液中的限制酶(例如1U)来消化。反应可在合适条件下孵育(例如37℃历时1小时)，随后酶去活(例如在80℃下20分钟)。

另一种提供片段化核酸的便利方法是使用引物来从核酸物质扩增特定线性序列。可使用多重PCR，用多个特定引物对处理核酸以扩增多个特定片段。在此情况下，靶标序列的末端对应于引物对的序列。

核酸样品可以任何合适方式提供，例如以来自患者的生物组织或流体的样品形式。样品可为血液样品、全血、血浆或血清、组织样品，例如***固定石蜡包埋组织样品，或可为从血液或组织提取的核酸样品。

样品可为含有核酸的任何样品。包含于样品中的核酸可为DNA和/或RNA。样品可为复合物，例如来自完整生物体、组织或细胞群体的全基因组DNA或cDNA，或其部分。在这方面，它可为例如核酸分离程序或细胞溶解程序的直接产物，或它可以某种方式来进一步分级或纯化，例如它可含有核酸，所述核酸已经以某种方式部分或完全分离，或以任何方式处理，例如经由RNA来产生cDNA。样品可来自任何真核或原核或病毒来源，例如可为微生物(例如细菌或真菌)、植物或动物。因此，例如，待检测或量化的核酸物质可为微生物DNA。优选地样品来自人，例如，人基因组DNA。样品可为来自动物的组织或血液样品，其中待检测的核酸是微生物，例如，细菌、病毒或真菌的核酸。对于许多诊断和其他应用，样品是片段化染色体(例如，人染色体或微生物染色体)的样品。对于关于非侵入性出生前诊断的方法，样品来源于孕妇的血液并且包括胎儿DNA。在其他实例中，待检测或量化的核酸是肿瘤相关DNA。

样品中的给定核酸物质可包括一些变化性，例如样品可包括不同个体的染色体，诸如从含有母体DNA和胎儿DNA的母体血液获得的核酸。在此处，所关注物质可为具体染色体，但是不论来自胎儿或母体，检测这种染色体的所有拷贝是便利的。因此，所关注物质可为一种染色体或染色体基因座，并且靶标序列在染色体或染色体基因座的母体和胎儿拷贝中从这种染色体或基因座获得。

本发明方法可在体外对于样品执行。因此，方法总体上不包括在体内对于人类或动物身体执行的诊断或通过手术或疗法来治疗人类或动物身体的方法。然而，体外诊断方法的结果可用于为随后治疗患者提供信息。

使靶标核酸变性

探针经由杂交以至少部分单链形式来识别并结合至靶标序列。对于探针的一些设计，靶标序列应为完全单链，尤其杂交至全长靶标序列的那些探针。对于其他探针，例如，杂交至靶标序列的唯一区域的探针，只需要部分单链靶标核酸。因此，应提供合适条件来使靶标序列的结合位点暴露于探针，取决于所使用的探针的类型。

如果样品中的靶标序列还不是单链或至少部分单链，应提供条件以使单链靶标序列与其互补核酸链分离。这类条件可为变性条件或在一些情况下用外切核酸酶处理。

变性条件可为将靶标序列与其互补序列分离的足够高温度。变性条件可为在95℃下孵育历时合适时间，例如10分钟。或者可执行化学变性。

互补性和杂交

探针与其靶标序列之间的特异性结合是本发明方法的重要特征。探针优选地包括识别靶标序列的单一靶标互补序列。然而，如例如挂锁探针和选择子探针例示，探针可包括与靶标序列的不同区域互补的多个序列。

如果探针包括作为靶标序列或靶标序列区域的精确互补序列的靶标互补序列，以使得在探针与靶标序列之间存在完全杂交，那么获得对于靶标序列的最大特异性。然而，此并非在所有情况下是必需的，并且例如当不论存在于样品中的确切等位基因为何，需要检测靶标序列时，可接受较小程度的错配，以允许检测展现等位基因变化的序列。或者，可对于变体序列来设计多个探针。这可实现不同等位基因或突变的检测和辨别。设想大部分探针具有对于其靶标序列的完全互补性，但是一些探针可结合具有轻微错配的靶标。

在一些实施方案中，用于本发明方法的探针各自包括靶标互补序列，所述序列具有与靶标序列或靶标序列区域少于5个碱基对错配。靶标序列或区域与靶标互补序列之间可任选地存在一个、两个、三个或四个碱基对错配。错配可为从一个序列中缺失相应碱基的点，以使得互补序列在错配点处形成环，或可在非互补核苷酸存在于一个序列中并且因此未与另一个序列的相应位置处的碱基配对时发生。当存在不正确的碱基配对，即，A或T与C或G配对时，氢键合不出现于两个链的碱基之间，但是由于在错配附近的核苷酸之间的碱基配对，因此杂交仍然在靶标序列与靶向寡核苷酸的靶标互补序列之间发生。错配可为摆动碱基。摆动碱基通常对应于与靶标片段中的已知遗传性变异位置配对的靶标互补序列位置。探针可通过在摆动碱基位置的特定合成周期期间添加一个或多个双脱氧核苷酸来合成。对于传统寡核苷酸合成来说，通常是这种情况。或者可产生多个单独探针，一个探针针对每个遗传性变型。如果探针使用基于微阵列的合成来合成，通常是这种情况。摆动碱基可对应于密码子之间的单一核苷酸差异，其中不同密码子编码相同氨基酸。

通常，与较短靶标互补序列相比，用于杂交较长靶标序列或其区域的较长靶标互补序列可耐受较高数目的错配。靶标互补序列可例如具有与靶标序列或其区域至多8个中1个、9个中1个或10个中1个碱基对错配。任何这些错配应限于靶标互补序列和靶标序列或区域的内部区域，以使得其不抑制连接或例如通过限制酶消化的序列特异性靶标片段化。因此，优选地在终端6至8个核苷酸中，优选地在靶标序列的每个末端的终端10个核苷酸中，存在靶标序列与靶标互补序列之间的完全互补。

优选地，探针包括与靶标序列相同长度的单一靶标互补序列。因此，全长靶标序列由靶标互补序列结合。靶标序列杂交至靶向寡核苷酸代表两个核酸分子之间的单一结合事件，与结合至靶标分子的两个末端或靶标的两个非相邻区域的探针形成对比。

靶标互补序列可具有至少10个核苷酸的长度，例如至少15个核苷酸。它可多达20、25、30、35或40个核苷酸长。优选范围包括10–20个核苷酸、10–30个核苷酸，和10–40个核苷酸。这些相对短靶标互补序列适合于结合相应地短靶标序列。短序列有助于双重连接反应的特异性，因为DNA连接酶对于碱基对错配敏感并且优先连接完全匹配的序列。当错配存在于结合至双链序列的DNA连接酶的足迹中时，序列可能无法连接，从而提供额外校对步骤，确保优先于不同但是类似序列的序列来检测靶标序列的较高特异性。DNA连接酶通常在切口的每一侧具有6至8个碱基的足迹。因此，如果靶标序列是20个碱基，那么12至16个碱基由连接酶特异性涵盖。

探针杂交排斥尤其在杂交序列的中心部分的错配，而连接排斥靶标末端的错配。这种情况共同产生高度特异性检测。

如在本文中别处更详细地描述，探针优选地包括：

靶向寡核苷酸，其比靶标序列更长并且含有内部靶标互补序列，以使得靶向寡核苷酸与靶标序列之间的杂交形成位于靶向寡核苷酸的上游和下游侧接序列之间的双链序列，和

当将核酸物质片段化并且靶标序列是界定序列的片段时，这些探针尤其适合于使用。靶向寡核苷酸比靶标序列更长，因为它包括侧接序列以及靶标互补序列。上游侧接区域是靶向寡核苷酸中的靶标互补序列的上游或5’。下游侧接区域是靶向寡核苷酸中的靶标互补序列的下游或3’。因此，靶标互补序列在靶向寡核苷酸内部并且不包括靶向寡核苷酸的末端，因为它由上游和下游侧接序列来侧接。

通过靶标序列与靶标互补序列的杂交所产生的双链序列可被认为是混合双链序列，因为它是靶标与探针的混合物。典型地双链序列采用双螺旋构象，其中靶标序列是一个链并且靶向寡核苷酸是双螺旋的另一个链。混合双链序列由靶向寡核苷酸的上游和下游侧接序列侧接，所述侧接序列进而杂交至头部和尾部序列以产生双链序列。另外，这些序列通常采取双链核酸的正常双螺旋构象。

上游和下游侧接序列优选地彼此不同，即，优选地具有不同序列。优选地，头部序列与上游侧接序列但是不与下游侧接序列互补，并且尾部序列与下游侧接序列但是不与上游侧接序列互补。这确保头部和尾部序列只分别杂交至上游和下游侧接序列。

头部序列通常与上游侧接序列相同长度。尾部序列通常与下游侧接序列相同长度。

侧接序列的正常长度在10与40个核苷酸之间，例如10–20个或10–30个核苷酸。侧接序列可为彼此相同长度。一个或两个侧接序列可与靶标互补序列相同长度。因此，上游和/或下游侧接序列可具有至少10个核苷酸，例如至少15个核苷酸的长度。它可多达20、25、30、35或40个核苷酸长。

优选地，头部序列是上游序列的互补序列。优选地，尾部序列是下游序列的互补序列。序列的完全匹配对于探针的最优结合是合乎需要的以使得头部和尾部序列正确定位以便连接至靶标序列。然而，任选地，可在头部序列与上游侧接序列之间，和/或在尾部序列与下游侧接序列之间存在一个、两个三个或四个碱基对错配。优选地，存在少于5个碱基对错配。

除了靶标互补序列以外，探针通常应不与靶标序列或可存在于样品中的其他核酸互补。这避免探针不必要地杂交至除了靶标以外的核酸。因此，如果探针用于结合人基因组DNA的序列，那么探针可被设计成使得除了靶标互补序列以外的序列不与人基因组DNA互补，以使得探针只杂交至靶标序列并且不杂交至样品中的其他核酸。

探针可包括一或多个定制序列。定制序列不与探针的其他区域或靶标序列互补，换句话说它在退火条件下不杂交至探针的其他区域(在定制序列外部)或靶标序列。定制序列可用于检测，例如作为条形码或标记来识别属于一组的探针，如本文中别处描述。

产生连接产物

在用于退火和连接的条件下，探针杂交至其靶标序列并且连接以产生连接产物。每个探针的杂交导致产生连接产物。因此，连接产物的产生取决于探针与其靶标序列的特异性杂交。

连接产物可包括或由探针核酸或靶标核酸组成，或可包括探针和靶标核酸。连接产物包括通过核酸的5’末端连接至核酸的3’末端所形成的连接接合处。当多个核酸连接在一起时，可存在两个连接接合处。

所形成的连接产物的类型取决于所使用的探针的类型。连接产物可为核酸环或可为线性核酸分子。

形成环形连接产物的探针的实例是挂锁探针。各种类型的挂锁探针是已知的，例如标准、间隙填充、分子倒转探针(MIP)。挂锁探针是在末端具有靶标互补序列并且在其之间具有非靶标互补序列的线性寡核苷酸。在用于退火和连接的条件下，靶标互补序列头部对尾部地放在一起以便杂交至靶标序列的相邻区域并且连接形成核酸环。因此，探针通过杂交至靶标序列来环化，并且连接产物是探针核酸环。环形连接产物通常含有其中线性探针的5’和3’末端连接在一起的一个连接接合处。包含变化的桥连寡核苷酸和间隙填充探针是已知的。探针可含有探针骨架中的裂解位点，从而允许环化连接产物裂解以形成线性产物，然后其可扩增并检测(MIP)。

优选地，探针杂交至靶标序列将探针的寡核苷酸定位以便连接至靶标序列。相应地，靶标序列可并入连接产物中。这是超过探针诸如挂锁探针的优势，因为它允许通过将连接产物测序来验证靶标序列。优选地，探针连接至其靶标序列的每个末端，从而在靶标序列的每个末端形成连接接合处。在这些方法中，待检测或量化的核酸物质优选地片段化以产生对应于靶标序列的靶标片段。然后，靶标片段的末端可连接至探针的末端，从而将靶标序列捕获于连接产物内。在这些情况下，靶标片段在高度特异性反应中在两个末端处连接。由于靶标片段通常是核酸的特异性片段化的产物，因此这些末端通常具有特异性、预先确定的序列。在连接步骤中，这些末端通过与序列相关地分别连接至头部和尾部序列来特异性检测。优选地，靶标片段结合至探针产生两个完全匹配的可连接接合处，一个在靶标片段的3’末端与头部序列的5’末端之间并且一个在靶标片段的5’末端与尾部序列的3’末端之间。

核酸的5’末端连接至核酸的3’末端可在两个末端与互补序列的相邻核苷酸碱基配对时发生。相应末端核苷酸与相邻核苷酸的碱基配对形成在两个末端之间含有切口的核酸链。两个末端的连接可通过DNA连接酶来催化。因此，提供用于连接的条件通常包括提供DNA连接酶和反应条件，在所述反应条件下DNA连接酶将两个末端连接以形成连续核酸链，从而封闭切口。许多连接酶可购得，诸如Ampligase(Epicentre)，其合适条件是添加1U酶并且在55℃下在连接酶缓冲液中孵育1小时。

产生并入靶标序列的连接产物的探针的实例是选择子探针。这些探针是具有与靶标序列的末端互补的一个或两个突出末端的双链选择子构建体，所述探针杂交至靶标序列并且连接至靶标序列的每个末端，形成含有探针核酸和靶标序列的环形或线性连接产物。在用于退火和连接的条件下，选择子的末端序列杂交至片段的末端序列并且连接至选择子。当探针包括各自具有突出末端的一对选择子构建体时，每个突出末端可连接至靶标片段的一个末端以使得连接产物是在两个探针序列之间包括靶标序列的线性核酸。当探针包括具有两个突出末端的单一选择子构建体时，它可连接至靶标片段的每个末端以使得连接产物是包括靶标序列和探针核酸的环形核酸。在两种情况下，连接产物包括两个连接接合处。

合适探针的许多其他实例在本文中别处描述。

在一些实施方案中，本发明方法可使用包括以下的探针：

分别具有自由5’和3’末端的头部和尾部序列，其中头部和尾部序列分别与上游和下游侧接序列互补，其中

在用于退火和连接的条件下，头部和尾部序列杂交至侧接序列，并且靶标片段，如果存在，杂交至靶标互补序列，从而将靶标片段的末端与头部序列的5’末端和尾部序列的3’末端并置定位，其中靶标片段的3’末端连接至头部序列的5’末端以形成第一连接接合处，并且靶标片段的5’末端连接至尾部序列的3’末端以形成第二连接接合处，从而产生双重连接产物，所述产物包括包含头部和尾部序列和靶标片段的连续核酸链。

在这些探针中，由于靶标互补序列定位于侧接序列之间，因此靶向寡核苷酸充当靶标片段连接至头部和尾部序列的模板。在靶标片段存在下的退火条件下，头部和尾部序列杂交至侧接序列，从而界定头部序列的5’末端与尾部序列的3’末端之间的间隙。靶标片段杂交至间隙中的靶标互补序列。因此，头部和尾部序列和靶标片段杂交至靶向寡核苷酸将靶标片段的3’末端与头部序列的5’末端并置定位，并且将靶标片段的5’末端与尾部序列的3’末端并置定位。

将两个末端并置定位提供DNA连接酶将末端连接在一起的底物。优选地，头部序列的5’末端和靶标片段的3’末端杂交至靶向寡核苷酸的相邻核苷酸，并且尾部序列的3’末端和靶标片段的5’末端杂交至靶向寡核苷酸的相邻核苷酸。因此，上游侧接序列可直接相邻于靶标互补序列，而没有***核苷酸。类似地，下游侧接序列可直接相邻于靶标互补序列，而没有***核苷酸。相邻3’和5’末端可通过DNA连接酶来直接连接，所述连接酶密封其之间的切口以形成连续核酸链。

双重连接产物，即，将头部序列和尾部序列连接至靶标片段的产物是连续核酸链。它在它不含有切口或间隙的意义上是连续的，因此链中的所有核苷酸共价接合。

探针可被设计成使得包含头部和尾部序列和靶标片段的连续核酸链是核酸环。术语环在此是指作为封闭环，而没有自由末端的链的拓扑学。

在靶标片段存在下的退火条件下，头部和尾部序列杂交至侧接序列，从而界定头部序列的5’末端与尾部序列的3’末端之间的间隙。靶标片段杂交至间隙中的靶标互补序列，从而将靶标片段的末端与头部序列的5’末端和尾部序列的3’末端并置定位，并且完成包括靶标片段和头部和尾部序列的核酸环。

形成环的核酸分子使其末端并置。末端的连接产生包括至少头部和尾部序列和靶标片段的连续环形核酸链。

形成核酸环的探针包括其中头部和尾部序列提供于单一核酸分子上的探针。举例来说，除了靶向寡核苷酸以外，探针可包括在其5’末端3’末端分别具有头部和尾部序列的骨架寡核苷酸，其中在退火条件下，骨架寡核苷酸的头部和尾部序列反式结合至靶向寡核苷酸的侧接序列。骨架寡核苷酸可包括头部与尾部序列之间的定制序列。图3示出这类探针的实施方案。或者，骨架寡核苷酸的头部和尾部序列可相邻，在其之间没有定制序列。

在另一个实例中，头部和尾部序列可在靶向寡核苷酸的末端并且在退火条件下顺式结合至侧接序列。靶向寡核苷酸可在靶向寡核苷酸与头部和/或尾部序列之间包括定制序列。图4示出这类探针的实施方案。

形成核酸环的探针也包括其中头部和尾部序列提供于不同核酸分子上的探针。在这些情况下，在退火条件下形成的核酸环包括至少三个核酸分子–靶标片段、头部序列和尾部序列。核酸分子的末端全部是并置的，如以前提及。在这些情况下，需要超过两个连接反应来形成连续环形核酸链。实例是当尾部序列是靶向寡核苷酸的3’末端时，并且探针包括在其5’末端具有头部序列的骨架寡核苷酸。在退火条件下，尾部序列顺式结合至靶向寡核苷酸的下游侧接序列，并且骨架寡核苷酸的头部序列反式结合至靶向寡核苷酸的上游侧接序列。顺式结合是指结合在同一核酸分子上发生，即，单一核酸链形成三维结构，其中不同区域放在一起并且杂交。反式结合是指结合在不同核酸分子之间发生。任选地，骨架寡核苷酸包括一对倒转重复序列，其在退火条件下形成发夹结构，从而将骨架寡核苷酸的3’末端与靶向寡核苷酸的5’末端并置定位。在两个末端之间存在切口。此类型的探针在图5中示出。当提供用于连接的条件时，靶向寡核苷酸的5’末端连接至骨架寡核苷酸的3’末端。双重连接产物是包括靶向寡核苷酸、靶标片段和骨架寡核苷酸的核酸环。或者，当在靶向寡核苷酸的5’末端与骨架寡核苷酸的3’末端之间存在间隙，图5所示探针未通过连接来环化–替代地包含头部和尾部序列和靶标片段的连续核酸链是线性核酸链。

探针可替代地以相反定向来布置以使得头部序列在靶向寡核苷酸的5’末端并且探针包括在其3’末端具有尾部序列的骨架寡核苷酸。在此情况下，在退火条件下头部序列顺式结合至靶向寡核苷酸的上游侧接序列，并且骨架寡核苷酸的尾部序列反式结合至靶向寡核苷酸的下游侧接序列。另外，骨架寡核苷酸可包括一对倒转重复序列，其在退火条件下形成发夹结构，以将骨架寡核苷酸的5’末端与靶向寡核苷酸的3’末端并置定位。然后，靶向寡核苷酸的3’末端连接至骨架寡核苷酸的5’末端以使得双重连接产物是包括靶向寡核苷酸、靶标片段和骨架寡核苷酸的核酸环。或者，如以上提及，退火可将骨架寡核苷酸的5’末端定位于靶向寡核苷酸的3’末端附近但是通过一或多个核苷酸的间隙分隔开。这时，连接产物是包括头部和尾部序列和靶标片段的连续线性核酸链。

骨架寡核苷酸可包括倒转重复序列之间的定制序列，以使得在退火条件下骨架寡核苷酸形成发夹环，如图5示出。

如提及，探针可被设计成使得包含头部和尾部序列和靶标片段的连续核酸链是线性核酸链。在靶标片段存在下的退火条件下，头部和尾部序列杂交至侧接序列，从而界定头部序列的5’末端与尾部序列的3’末端之间的间隙。靶标片段杂交至间隙中的靶标互补序列，从而将靶标片段的末端与头部序列的5’末端和尾部序列的3’末端并置定位，并且完成包括靶标片段和头部和尾部序列的核酸链。形成链的核酸分子使其末端并置。术语并置已经在别处论述。在待连接的末端之间存在切口。末端的连接产生包括至少头部和尾部序列和靶标片段的连续核酸链。

探针可包括在其3’末端具有尾部序列的靶向寡核苷酸和在其5’末端具有头部序列的线性骨架寡核苷酸。在退火条件下，尾部序列顺式结合至靶向寡核苷酸的下游侧接序列，并且骨架寡核苷酸的头部序列反式结合至靶向寡核苷酸的上游侧接序列。靶向寡核苷酸可包括下游侧接序列与尾部序列之间的，定制序列以使得在退火条件下靶向寡核苷酸形成发夹环。在退火条件下形成的线性核酸链包括骨架寡核苷酸、靶标片段和靶向寡核苷酸。图6示出此布置。

探针可同样地以相反定向来布置，其中头部序列在靶向寡核苷酸的5’末端并且探针包括在其3’末端具有尾部序列的骨架寡核苷酸。在此情况下，头部序列顺式结合至靶向寡核苷酸的上游侧接序列，并且骨架寡核苷酸的尾部序列反式结合至靶向寡核苷酸的下游侧接序列。

形成作为连接产物的线性核酸链的另一种形式的探针是包括在分开骨架寡核苷酸上的头部和尾部序列的探针。这类探针可包括包含具有自由5’末端的头部序列的骨架寡核苷酸，和包含具有自由3’末端的尾部序列的骨架寡核苷酸，其中在退火条件下头部和尾部序列反式结合至靶向寡核苷酸的侧接序列。一个或两个骨架寡核苷酸可进一步包括定制序列。图7示出此类型的探针。

优选地，呈其未连接形式的探针的寡核苷酸是线性的。因此，优选地靶向寡核苷酸是线性核酸分子。对于包括一或多个骨架寡核苷酸的探针，这些骨架寡核苷酸也优选地是线性的。这允许便利地在连接与未连接探针之间区分，其中DNA环只由于探针的环化实施方案的成功连接而形成。线性核酸分子未通过滚环复制来扩增。

产物的扩增

本发明方法中的信号检测取决于在靶标识别之后通过正确反应的探针或从正确反应的探针来产生的信号，其使用序列特异性杂交和酶催化来产生特异性产物，从所述产物获得信号。本发明方法使用检测所关注核酸物质靶标分子上的多个基因座作为信号扩增步骤，并且因此使得能够在不需要扩增反应探针产物的情况下产生并检测信号。可获得信号并且可在不扩增连接产物的情况下检测累积信号。然而，任选地，来自多重产物的信号可通过传统信号扩增步骤来扩增。

方法可包括在检测之前富集连接产物。产物可通过扩增和/或固相化学来富集。环形核酸产物可通过用外切核酸酶(例如，λ外切核酸酶)处理样品以消化线性核酸产物来选择性富集。通常，在保护连接产物以避免外切核酸酶降级时，外切核酸酶降级可用于富集连接产物。然后，在涉及聚合的任何后续步骤之前，例如在滚环扩增之前，应将核酸外切酶灭活(例如通过加热)。如实施例2示出，可添加1U核酸外切酶以移除未反应探针和片段。合适条件是在37℃下在相应外切核酸酶缓冲液中孵育1小时，随后在80℃下酶灭活20分钟。当使用捕获/检测方法时，连接产物可通过经由捕获部分将产物捕获于固相上来富集。如实施例1示出，含有线性连接产物的溶液可与200ml最终体积的Tris-HCl(pH 7.5)、3.5mM EDTA和0.07％Tween-20中的10ml M-280链霉抗生物素蛋白涂布磁性珠粒(Invitrogen)混合，并且在室温下孵育15分钟。孵育之后，珠粒使用环形磁铁来收集并且将上清液移除。富集连接产物的其他方法包括对连接产物的特定大小进行选择。

连接产物可通过克隆扩增来扩增。合适扩增技术包括滚环扩增(参见下文)、桥式PCR(Adessi C,等人,Nucleic Acids Res.2000Oct 15；28(20):E87)、乳液PCR(乳液中的数字PCR由Dressman等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2003Jul 22；100(15):8817-22.Epub2003Jul 11描述)和数字PCR(Vogelstein&Kinzler,Proc Natl Acad Sci U S A.1999Aug3；96(16):9236-41)。凝胶中的克隆局部扩增由Mitra&Church,Nucleic AcidsRes.1999December 15；27(24):e34描述。本发明方法的实施方案可包括扩增连接产物并且获得作为来自扩增产物的个别信号的组合的累积信号。优选地，连接产物跨越连接接合处扩增或对于双重连接产物来说，跨越两个连接接合处扩增。

当连接产物是核酸环时，扩增可包括提供用于核酸环的滚环复制的条件，并且检测滚环复制的产物。滚环复制描述于US 5,854,033(Lizardi)和Fire&Xu,Proc Natl AcadSci U S A.1995年5月9日；92(10):4641-5中。滚环复制是使用链移位DNA聚合酶来扩增环形核酸分子，由此产生含有扩增序列的串联重复序列的较大DNA分子。DNA聚合酶在进行所需长时间的进行性滚环聚合反应中催化引物延伸和链位移。它导致与单循环PCR复制和其中每个循环限于靶标序列拷贝数目加倍的其他扩增技术相比，环化探针序列的扩增高几个数量级。额外扩增可使用链位移反应的级联来获得。滚环复制可为超支化滚环复制。超支化RCA由Lizardi等人,Nat Genet.1998Jul；19(3):225-32描述。滚环复制的条件在实施例中示出，例如与1U的phi29聚合酶(New England Biolabs)一起孵育可在37℃下添加于相应phi29缓冲液和核苷酸(dNTP)中历时1小时。

检测

连接产物可个别地可检测，以使得个别信号可从由于每个靶标序列由其相应探针识别所产生的连接产物获得。然而，在本发明方法中，连接产物不必个别地检测。来自连接产物的个别信号合并成累积信号并且检测累积信号。

信号的类型和检测方法可适当地基于探针的类型来选择，或探针可被设计成实现所需信号类型和检测方法。所述方法不限于具体信号类型或信号检测手段–实际上，方法可通过将来自多个探针的个别信号转化成单一累积可检测信号的任何方法来执行，从而经由探测步骤的多重处理性质来扩增个别信号。

通常，检测来自连接产物的信号取决于探针结合至其靶标序列之后的每一种产物的形成，由此指示是否靶标序列存在于样品中。因此，信号可特别地从包括连接接合处的产物获得或对于双重连接产物来说，从包括两个连接接合处的产物获得。个别信号可从每个连接接合处获得，所述连接接合处由于探针杂交至每个靶标序列而导致形成。因此，例如，当一组探针包括识别所关注物质的10种靶标序列的10种不同探针时，存在包括连接接合处的10种连接产物，并且可检测累积信号，所述信号是来自10种连接产物的个别信号的组合。当然，在此实施例中分子探针、靶标序列和连接产物的实际数可高于10，因为在样品中通常存在每一种靶标序列的多个拷贝并且样品与每一种探针的多个拷贝接触。

由一组探针产生的连接产物可产生这一组特有的个别信号，并且不同于从由不同组的探针产生的连接产物所获得的信号，从而允许区分并个别地量化来自每一组探针的累积信号。举例来说，一组内的探针可共有这一组共同的定制序列并且不同于其他组中的探针的定制序列，从而允许方便地识别来自每一组的探针。每一组探针可含有用于结合对核酸物质有特异性的多个靶标序列的至少500、600、700、800、900或至少1,000种不同探针。举例来说，方法可使用分别针对染色体21、13和18中的每一种的1,000种不同靶向寡核苷酸，和三组不同探针，每一组用唯一的定制序列来标记，一个定制序列针对每一种染色体。如果需要，编码特定等位基因和或基因座的基元可在高多重处理中并入定制序列中。

可确定样品中的两种或更多种染色体的相对数量，方法是检测来自两组或更多组探针中的每一组的双重连接产物的累积信号，每一组识别对一种染色体有特异性的靶标序列，并且量化不同累积信号。

获得来自连接产物的信号的便利方法是提供扩增条件并且测试扩增产物的存在。一些扩增方法是可能的，诸如NASPA、LAMP、T7扩增、PCR或当连接产物是环时，滚环复制。获得信号可涉及跨越连接接合处来扩增并且检测来自扩增产物的信号(例如，通过PCR或，对于探针的环化实施方案，滚环复制)，或将连续核酸链在一个末端捕获并且检测其另一个末端。信号可使用核酸的任何常规检测***从扩增或非扩增连接产物获得，诸如检测荧光标记、酶联检测***、抗体介导标记检测和检测放射性标记。优选地，滚环扩增产物通过将经过标记的检测寡核苷酸杂交至RCA产物中的基元，例如探针的定制序列中的基元来检测。因为连接产物的量与存在于样品中的靶标序列的量成正比，所以定量测量可靠地代表样品中的靶标序列的量。此方法的主要优势是可操纵连接步骤以获得等位基因辨别，DNA复制步骤是等温的，并且信号是严格定量的，因为扩增反应是线性的并且由高度进行性酶来催化。用于DNA聚合酶反应的引物寡核苷酸可对于所有一组探针或对于反应混合物中的多组探针来说是相同的。

信号检测的一个实例使用捕获/标记技术。在这里，所述连接产物包括连接接合处的一侧上的捕获部分和连接接合处的另一侧上的标记，并且所述方法包括通过经由捕获部分将连接产物捕获于底物上，洗涤底物并且保持包括底物和所捕获连接产物的所捕获部分，并且检测所捕获部分中的连接产物上的标记而获得来自连接产物的信号。当连接产物是线性时，这类方法尤其合适，以使得捕获产物的一个末端并且检测另一个末端。然而，当连接产物是环形时，通过包括裂解环以将它转化成线性产物的步骤，也可使用所述方法。信号可从异质标记或探针的序列，例如，定制序列来得到。

可使用荧光信号，例如通过用不同荧光标记来标记第一和第二组的探针。因此，方法可包括将样品中的核酸与第一组探针和第二组探针接触并且检测第一和第二累积信号，其中

第一累积信号是由第一组探针产生的连接产物发射的第一波长下的荧光，并且其中

第二累积信号是由第二组探针产生的连接产物发射的第二波长下的荧光。

在一些这些实施方案中，将由第一和第二组探针产生的连接产物的滚环复制的产物可区分标记。

捕获/检测方法尤其便利地用于包括分开核酸分子(例如分开核酸分子上的头部和尾部序列)的探针。然后，连接产物含有单一核酸分子(连接产物)中的两种分子的序列(例如头部和尾部序列)，而未连接探针不含有所述序列。因此，可从连接产物获得信号，方法是通过捕获含有一种序列(例如头部序列)的核酸分子，洗涤以移除未连接探针核酸，然后检测捕获部分中的另一种序列(例如尾部序列)的存在。检测对于连接探针具有特异性，因为在未连接探针中，两个序列只通过核酸之间的杂交来连接并且通过洗涤来分离，而连接探针含有连续核酸链中的连接接合处的每一侧上的两个序列，即，共价接合。

如提及，探针可修饰以带有捕获部分。捕获部分可允许连接至固体底物诸如珠粒。合适捕获部分是生物素，其与链霉抗生物素蛋白配对，从而允许修饰探针核酸在用链霉抗生物素蛋白涂布的固体底物上分离。可便利地在探针与样品组合之前，为探针提供捕获部分。或者，捕获部分可在连接步骤之后引入。

当探针包括含有头部或尾部序列的骨架寡核苷酸，和分别含有尾部或头部的分开核酸(靶向寡核苷酸或第二骨架寡核苷酸)时，这些核酸分子中的任何一个可带有捕获部分，例如可生物素化。

当探针的一个核酸分子带有捕获部分时，其他核酸分子可带有标记。可通过检测定制序列来将核酸序列本身作为标记来使用，所述定制序列识别待检测的核酸分子，例如存在于所有一组探针中但是不存在于另一组探针中。互补寡核苷酸可用于检测。或者核酸可带有异质标记诸如荧光团。异质标记并非核酸本身的一部分。可使用的其他标记包括量子点、生物发光、信号产生酶级联如酪胺信号扩增和放射性部分。然后，所述方法可包括相应地检测标记的存在，例如，检测荧光、检测量子点、检测生物发光、检测信号产生酶或检测放射性。

举例来说，获得来自连接产物的信号可包括经由捕获部分将探针的骨架寡核苷酸捕获于底物上，洗涤底物以移除未连接探针并且保持包括底物和所捕获骨架寡核苷酸的所捕获部分，并且从所捕获部分中的双重连接产物获得信号。当双重连接产物带有标记时，此可包括检测所捕获部分中的标记。

捕获部分可为具有与链亲和素底物的亲和力的生物素分子。其他合适亲和力标签包括具有与固定金属离子诸如钴、镍、铜的亲和力的多组氨酸标签，其可用于纯化含有组氨酸的序列，例如，骨架寡核苷酸。因此，捕获部分可为待捕获的序列，例如His-标签序列的一部分，或它可为并非核酸本身的一部分的异种部分。

合适固体底物是珠粒，例如磁性珠粒以促进使用磁铁来富集所捕获产物。底物可用捕获部分的结合成员来涂布，例如链霉抗生物素蛋白涂布磁性珠粒可与生物素化探针一起使用。

量化

量化确定样品中的核酸物质的量。在一些情况下，此量可确定并且与已知对照比较，从而能够确定样品中的核酸的绝对或相对量。在其他情况下，可例如同时探测样品内的多种核酸物质。这使得一种核酸物质能够用作参考，将不同核酸物质相对于彼此来量化，例如确定与染色体1相比，样品含有更多染色体21。

数量可表达为浓度或量(例如，摩尔或质量)，两种单位是可互换的，其中浓度是核酸的量除以样品的体积。

探针

探针的实例和其特征已经在上文所述。一些进一步特征和实例在本文中描述。

探针核酸优选地是DNA。然而，它可为另一种天然发生或非天然发生的核酸。DNA的标准碱基是A、T、C和G，但是所述方法的探针核酸可任选地包括非标准核苷酸。

通常，用于本发明方法的探针可包括靶向寡核苷酸和头部和尾部序列。头部和尾部序列可为靶向寡核苷酸的一部分，或其中一种或两种可在不同核酸分子上。任选地，探针包括靶向寡核苷酸、包括头部序列的骨架寡核苷酸和包括尾部序列的骨架寡核苷酸。因此，探针可在其未连接形式下包括一个、两个或三个核酸分子。

优选地，探针用于杂交至靶标序列，所述靶标序列是从待量化或识别的核酸物质所产生的界定序列的片段。这些靶标序列可被称为靶标片段。

靶向寡核苷酸比靶标片段更长并且含有内部靶标互补序列，以使得靶向寡核苷酸与靶标片段之间的杂交形成位于靶向寡核苷酸的上游和下游侧接序列之间的双链序列。头部和尾部序列分别具有自由5’和3’末端，并且分别与上游和下游侧接序列互补。在靶标片段存在下的退火条件下，头部和尾部序列杂交至侧接序列，从而界定头部序列的5’末端与尾部序列的3’末端之间的间隙，其中靶标片段杂交至间隙中的靶标互补序列，从而将靶标片段的末端与头部序列的5’末端和尾部序列的3’末端并置定位。

此类型的探针可用于在包括以下步骤的方法中检测核酸物质：

(i)提供其中核酸物质被片段化成靶标片段的样品，

(ii)提供靶标片段成为单链的变性条件

(iii)使样品与一组探针接触，其中每个探针特异性识别待检测的核酸物质内的不同靶标序列，其中靶标序列是靶标片段的序列，并且其中每个探针包括

分别具有自由5’和3’末端的头部和尾部序列，其中头部和尾部序列分别与上游和下游侧接序列互补，

(iv)提供头部和尾部序列杂交至侧接序列的退火条件，并且靶标片段，如果存在，杂交至探针的靶标互补序列，从而将靶标片段的末端与头部序列的5’末端和尾部序列的3’末端并置定位

(v)提供用于连接的条件以使得如果靶标片段存在，靶标片段的3’末端连接至头部序列的5’末端以形成第一连接接合处，并且靶标片段的5’末端连接至尾部序列的3’末端以形成第二连接接合处，从而产生双重连接产物，所述产物包括包含头部和尾部序列和靶标片段的连续核酸链，并且

(vi)检测作为来自所有产物的个别信号的组合的累积信号，

其中检测到信号指示样品中的核酸物质的存在。

核酸物质可通过包括以下步骤的方法来量化

(i)提供其中核酸物质被片段化成靶标片段的样品

(ii)提供靶标片段成为单链的变性条件

(iii)使样品与一组探针接触，其中每个探针特异性识别待量化的核酸物质的不同靶标序列，其中每个探针包括

(v)提供用于连接的条件以使得如果靶标片段存在，靶标片段的3’末端连接至头部序列的5’末端以形成第一连接接合处，并且靶标片段的5’末端连接至尾部序列的3’末端以形成第二连接接合处，从而产生双重连接产物，所述产物包括包含头部和尾部序列和靶标片段的连续核酸链，

(vi)检测作为来自所有连接产物的个别信号的组合的累积信号，以及

(vii)量化累积信号以确定信号水平，其中信号水平与样品中的核酸物质的数量成比例，以及

由此确定样品中的核酸物质的数量。

(i)提供其中第一和第二核酸物质被片段化成靶标片段的样品

(ii)提供靶标片段成为单链的变性条件

(iii)使样品与第一组探针和第二组探针接触，其中第一组探针特异性识别第一核酸物质的不同靶标序列并且其中第二组探针特异性识别第二核酸物质的不同靶标序列，其中每个探针包括

(vi)检测作为来自由第一组探针所产生的连接产物的个别信号的组合的第一累积信号，并且将其量化以确定第一信号水平，其中第一信号水平与样品中的第一核酸物质的数量成比例，

(vii)检测作为来自由第二组探针所产生的连接产物的个别信号的组合的第二累积信号，并且将其量化以确定第二信号水平，其中第二信号水平与样品中的第二核酸物质的数量成比例，以及

(viii)比较第一和第二信号水平，从而确定样品中的第一和第二核酸物质的相对数量。

探针可被设计成使得间隙中的靶标片段的杂交完成核酸环，所述环包括靶标片段和头部和尾部序列。

探针的头部和/或尾部序列优选地接合至定制序列，所述定制序列不与探针的其他区域或靶标片段互补。

在一些实施方案中探针，单一核酸分子包括头部和尾部序列。

头部和尾部序列可与靶向寡核苷酸分开以使得其反式结合至侧接序列。举例来说，头部和尾部序列可分别在骨架寡核苷酸的5’和3’末端。定制序列可包含于骨架寡核苷酸的头部与尾部序列之间。这类探针的实例在图3中示出。或者，骨架寡核苷酸的头部和尾部序列可相邻，没有***核苷酸序列。在这类情况下，靶向寡核苷酸的侧接序列沿着全长骨架寡核苷酸杂交并且可将其环化。

探针可被设计成使得头部序列是靶向寡核苷酸的5’末端和/或尾部序列是靶向寡核苷酸的3’末端，以使得间隙中的靶标片段的杂交完成包括靶标片段、头部和尾部序列、靶标互补序列和侧接序列的核酸链。头部和尾部序列可在靶向寡核苷酸的末端并且顺式结合至侧接序列。这类探针的实例在图4中示出。在此形式的探针中，头部和尾部序列和靶标互补序列全部变得与靶标片段一起环化。定制序列可定位于寡核苷酸的环中。探针核酸相对较长但是具有将寡核苷酸结构连结至一个分子的优势，所述分子预先组装并且不需要杂交不同探针核酸分子。

探针也可被设计成具有骨架寡核苷酸，所述寡核苷酸是与靶向寡核苷酸分开的分子核酸。尾部序列可为靶向寡核苷酸的3’末端并且头部序列是骨架寡核苷酸的5’末端。或者头部序列可为靶向寡核苷酸的5’末端并且尾部序列是骨架寡核苷酸的3’末端。定制序列可引入靶向寡核苷酸中以例如提环头部或尾部序列与侧接序列之间的供。使用此探针方法的优势是检测序列可引入环中并且与靶标互补序列相关联，从而可有利于多重处理方法，尤其使用较高重数检测方案的较高多重处理。骨架寡核苷酸可进一步包括定制序列。通过在两个寡核苷酸中提供探针，探针核酸分子比单一寡核苷酸形式短但是保持相同功能。

探针的另一种设计将头部和尾部序列提供于两个骨架寡核苷酸上。因此，探针包括

靶向寡核苷酸，其比靶标片段更长并且含有内部靶标互补序列，以使得靶向寡核苷酸与靶标片段之间的杂交形成位于靶向寡核苷酸的上游和下游侧接序列之间的双链序列，

包含具有自由5’末端的头部序列的骨架寡核苷酸，和

包含具有自由3’末端的尾部序列的骨架寡核苷酸，

其中头部和尾部寡核苷酸序列分别与上游和下游侧接序列互补。

一个骨架寡核苷酸可带有捕获部分，在此情况下另一个骨架寡核苷酸用于检测并且可带有异质标记。一个或两个骨架寡核苷酸可进一步包括定制序列。替代地或另外，靶向寡核苷酸可包括定制序列。

在靶标片段存在下的退火条件下，头部和尾部序列杂交至侧接序列，从而界定头部序列的5’末端与尾部序列的3’末端之间的间隙，其中靶标片段杂交至间隙中的靶标互补序列，从而将靶标片段的末端与头部序列的5’末端和尾部序列的3’末端并置定位。间隙中的靶标片段的杂交完成包括靶标片段和头部和尾部序列的核酸链。所述链带有捕获部分和标记，允许使用本文中别处描述的捕获/检测方法来检测。

数字核型分析和非侵入性出生前诊断

本发明方法的一些实行方案在试图精确量化靶标DNA的领域中提供特别优势。这包括许多基于核酸的诊断技术。一种这类领域是分析来自患者的生物样品(例如，血液)中的癌症DNA。另一种这类领域是通过分析无细胞DNA的非侵入性出生前诊断(NIPT)。

使用NIPT的难题是必须计数大量特定基因组片段以便获得诊断染色体异倍体性所需要的统计置信度。由于胎儿DNA与母体DNA混合，构成孕妇的血液中的遗传物质的4-30％，因此观察胎儿DNA中的染色体异倍体性需要非常精确的测量。

本发明方法可用于分析母体血液样品中的自由环化胎儿DNA。通过使用针对一个染色体的不同片段的多个探针和针对第二染色体的不同片段的多个探针，所述方法使得样品中的两个染色体的相对数量的不平衡能够以较高置信度来确定。这允许诊断胎儿DNA的染色体异倍体性诸如三体性，甚至相对于母体DNA的较高背景。

本发明方法可用于例如测试来自怀孕女性的母体血液样品以针对诊断染色体异常诸如三体性来检测胎儿核酸，针对肿瘤DNA来测试患者样品以诊断或监测患者的肿瘤的存在。其他用途包括针对微生物核酸的存在来测试材料样品，其中检测到微生物核酸指示材料被微生物感染，所述微生物可为感染媒介物诸如细菌、病毒或真菌。样品可为来自患者的组织或血液样品。

一般来说，通过使用数百或数千个不同探针，本发明方法的一些实行方案可通过检测数百或数千个特定核酸片段来获得高精度，从而在一系列诊断应用中提供优势。检测来自与具体疾病相关联的染色体或染色体基因座的许多DNA片段使得这种染色体或基因座的量能够相对于对照染色体或基因座来测量，以使得可靠地检测样品中的甚至轻微差异。

通过分析短靶标片段，母体血液中的较大比例的高度片段化无细胞DNA可以高效率来分析。这是至关重要的，因为可在母体血液中获得非常少量的无细胞DNA。

在从个体获得的核酸样品中相对于第二染色体或染色体基因座来量化第一染色体或染色体基因座的方法可包括

提供用于退火和连接的条件，在所述条件下探针杂交至其靶标序列并且产生连接产物，

检测作为来自由第一组探针所产生的连接产物的个别信号的组合的第一累积信号，并且将其量化以确定第一信号水平，其中第一信号水平与样品中的第一染色体或染色体基因座的数量成比例，

检测作为来自由第二组探针所产生的连接产物的个别信号的组合的第二累积信号，并且将其量化以确定第二信号水平，其中第二信号水平与样品中的第二染色体或染色体基因座的数量成比例，以及

比较第一和第二信号水平，从而确定样品中的第一和第二染色体或第一和第二染色体基因座的相对数量。

所述方法可用于诊断胎儿中的异倍体性(例如三体性)，其中核酸样品是从母体血液获得的样品并且含有与母体DNA混合的无细胞胎儿DNA，并且其中第一和第二信号水平的不等比率指示异倍体性(例如三体性)。

实施例

提供以下实施例以展现并且进一步阐明本发明的某些优选实施方案和方面，并且不应理解为限制其范围。

实施例1

此实例示出使用本发明方法来检测并量化母体血液中的自由环化胎儿DNA。

血液样品从怀孕母亲收集并且自由环化DNA从血浆提取。然后，DNA与靶向特异性DNA探针反应，所述探针特异性地与来源于经受分析和量化的染色体的DNA片段反应。在此实施例中，我们示出使用所谓“Lotus探针”来靶向并且与来自染色体21和参考染色体的特定片段反应。然而，可替代地使用靶向特定DNA片段的其他基于探针的技术，诸如挂锁探针/分子倒转探针(MIP)、选择子探针、寡核苷酸连接探针。

提供靶向两个染色体中的每一个的多个片段的Lotus探针。在靶标识别后，探针与其相应片段一起产生连接产物，所述产物使一个末端用荧光标记并且另一个末端用生物素标记。连接产物用两个不同荧光团标记，每个荧光团代表所靶向的个别染色体。方案可示出为：

1)将10ng的DNA用相应相容限制酶缓冲液中的1单位限制酶消化。反应在37C下孵育1h，随后在80℃下酶去活20min。

2)在95℃下将DNA片段变性至单链片段历时10min并且与探针和连接酶混合以形成线性连接产物。探针池以10pM个别浓度与1U的Ampligase(Epicentre)一起添加并且在55℃下在连接酶缓冲液中孵育1h。

3)将连接产物捕获于磁性链霉抗生物素蛋白珠粒上。为了移除未反应探针和片段，溶液与200ml最终体积的Tris-HCl(pH 7.5)、3.5mM EDTA和0.07％Tween-20中的10mlM-280链霉抗生物素蛋白涂布磁性珠粒(Invitrogen)混合，并且在室温下孵育15分钟。孵育之后，珠粒使用环形磁铁来收集并且将上清液移除。

4)将其余珠粒结合探针检测并量化。测量两个标记中的每一个的总荧光强度并且测量两个颜色之间的相对强度。

5)在出生前诊断的情况下，最终结果基于荧光的相对数量。简化实施例；如果1000个基因组等效物和母体血液中的10％所有自由环化DNA来自于胎儿，并且1000个染色体21靶向探针用于产生总荧光，那么正常样品将产生1,000,000个荧光团的信号，而三体性21胎儿的样品将产生对应于1,050,000个荧光团的信号。另外，为了获得较高统计精度，如果1000个探针靶向未经受异倍体性的“正常”区域，并且用第二荧光团标记，可测量相对数量。

实施例2

在以下实施例中，Lotus探针靶向两个染色体中的每一个的多个片段。在靶标识别后，探针与其相应片段一起产生环化连接产物。环化连接产物含有可用于随后标记的两个序列基元中的任何一个，每个序列基元对应于所靶向的两个染色体中的任何一个。方案可示出为：

2)在95℃下将DNA片段变性至单链片段历时10min并且与探针和连接酶混合以形成环。探针池以10pM个别浓度与1U的Ampligase(Epicentre)一起添加并且在55℃下在连接酶缓冲液中孵育1h。

3)添加1U核酸外切酶以移除未反应探针和片段。1U的λ外切核酸酶(Epicentre)在37℃下在相应外切核酸酶缓冲液中添加1h，随后在80℃下酶灭活20min。

4)其余环通过滚环扩增RCA来复制。1U的phi29聚合酶(New England Biolabs)在37℃下添加于相应phi29缓冲液和核苷酸(dNTP)中历时1h。将各自用两个不同荧光团标记的与RCA产物互补的探针添加至RCA混合物。所得标记RCA产物个别地计数并且在两种颜色之间测量RCA产物的相对数量。

实施例3

材料和方法

样品制备：将10ml血液从每个受试者收集至无细胞DNA试管(Streck，Omaha，NE)中。通过双重离心方案从血液中分离血浆(1600g历时10min，随后在首次旋出之后进行试管转移之后16 000g历时10min)。根据制造商方案，cfDNA通过Qiagen ccf核酸试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)来分离。所得DNA在50ul缓冲液(Qiagen试剂盒的一部分)中洗脱。

探索和骨架设计：本文描述的多重探针技术使得能够特异性和同时扩增数千个染色体片段。探针被设计成捕获染色体21、18和13中的每一种的2500-5000个片段(靶标)。靶标被选择为具有基因组中的唯一序列，均一AT/GC组成，不包括已知多态性也不包括靶标序列中的CNV，并且大小在18-35bp之间。靶向来自每个染色体13和18的2500个片段的探针与靶向来自染色体21的片段的5000个探针合并以产生单一寡核苷酸探针池。

示例性探针序列，“N”代表靶标互补序列：ATGTGACCCTTCCGTCTGTTGAGTTAGGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCGTGCCTTGTCATTCGGGAGCACTAACTGCTG(SEQ ID NO:1)

具有与探针末端互补的头部和尾部序列的骨架被设计成包括用于测序和数字计数的序列基元。两种骨架用于结果部分概述的实验中；一种骨架与靶向染色体13和18的探针互补：(/5Phos/CGCACACGATTAAGGTCCAGTCACAGGCAGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTNNNNNNNNNNGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATTTCATGCTGCTAACGGTCGAGTCGGACAGGTGGCTCCACTAAATAGACGCA)；SEQ ID NO:2，并且一种骨架靶向染色体21：(/5Phos/GGCCTAACTCAACAGACGGAAGGGTCACATAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTNNNNNNNNNNGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATTTCATGCTGCTAACGGTCGAGCAGTTAGTGCTCCCGAATGACAAGGCACGA；SEQ ID NO:3)。

生物化学探针方案：50ul的纯化cfDNA在37C下用55ul总体积的1x NEB4缓冲液(New England Biolabs)和1x BSA中的5U MseI(New England Biolabs)消化30min，随后在65C下热灭活20min。然后，消化DNA与探针和骨架的连接混合物混合。55ul的消化DNA与探针(1pM/探针)、骨架(各自60nM)、1x连接缓冲液(Epicentre)、100U的Ampligase(Epicentre)、1mM NAD和5mM Mg²⁺混合至70ul的总体积。首先在95C下将消化片段变性为单链DNA历时5min，随后在55C下进行杂交并且连接16h。连接混合物然后用核酸外切酶处理以移除任何其余线性DNA分子。连接反应物在37C下与75ul合计总体积的20U的ExoI(NEB)和5U的ExoIII(NEB)和1xBSA混合60min，随后在65C下热灭活10min。

分析：对于测序分析，核酸外切酶处理的环根据制造商方案用与Illumina测序仪器互补的测序引物来扩增并且随后装载于Illumina Miseq仪器上。

对于数字分析，核酸外切酶处理的反应物经受滚环扩增反应(RCA)以产生所述环的多联体拷贝的离散DNA靶标。37,5ul核酸外切酶处理环与50ul总体积的4mM DTT、3U的phi29聚合酶(NEB)、0,1uM引物、1mM dNTP混合物(NEB)和1x BSA混合，并且在37C下孵育1h，随后在65C下热灭活10min。然后，RCA反应物用与骨架序列互补的荧光标记寡核苷酸标记。50ul的RCA产物与100ul总体积的0,1％Tween 20(Sigma)、5nM标记寡核苷酸和2x SSC(Sigma)混合。标记RCA产物最后沉积于以聚赖氨酸(Sigma)涂布的显微镜用载玻片上并且在荧光显微镜中计数。

结果

本文描述的探针法在Illumina测序和数字计数***中展示。为了证明探针法的性能，具有三体性21的DNA样品在不同浓度下与来自正常血浆样品(3-5ml血浆)提取的DNA混合。然后，将样品经受探针法并且通过测序来评估。

结果在图8中示出，100ng细胞系DNA经受如上所述的方案。10,000探针在池中混合以特异性环化来自染色体13、18和21的10,000个相应染色体片段。然后，10,000个所得环用Illumina相应PCR引物来扩增并且在测序之前在凝胶上分析。泳道1对应于DNA梯带，泳道2是消化之后的DNA样品，并且泳道3是具有10,000个扩增片段的PCR产物。

对于图9示出的结果，12个正常血浆样品在不同浓度下与带有具有三体性21的DNA的样品并行地分析。将DNA提取并且经由10K多重处理探针方案来处理并且最后在Illumina测序器上测序。使用提供99％特异性的置信区间，阳性样品基于估计正态分布以90％灵敏度来检测。

进一步陈述

以下条款代表本发明的方面并且是说明书的一部分。

1.一种检测样品中的核酸物质的方法，其包括

使所述样品与一组探针接触，其中每个探针特异性识别待检测的所述核酸物质内的不同靶标序列，

提供使得所述核酸物质中的所述靶标序列变成至少部分单链的条件，

提供用于退火和连接的条件，在所述条件下所述探针杂交至其靶标序列并且产生连接产物，每个连接产物包括连接接合处，以及

检测作为来自所有连接产物的个别信号的组合的累积信号，

其中检测到所述信号指示所述样品中的所述核酸物质的存在。

2.一种量化样品中的核酸物质的方法，其包括

使所述样品与一组探针接触，其中每个探针特异性识别待量化的所述核酸物质内的不同靶标序列，

检测作为来自所有连接产物的个别信号的组合的累积信号，

量化所述累积信号以确定信号水平，其中所述信号水平与所述样品中的所述核酸物质的数量成比例，以及

由此确定所述样品中的所述核酸物质的数量。

3.一种相对于样品中的第二核酸物质来量化第一核酸物质的方法，其包括

使所述样品与第一组探针和第二组探针接触，其中所述第一组的所述探针各自特异性识别所述第一核酸物质内的不同靶标序列并且其中所述第二组的所述探针各自特异性识别所述第二核酸物质内的不同靶标序列，

提供使得所述第一和第二核酸物质中的所述靶标序列变成至少部分单链的条件，

提供用于退火和连接的条件，在所述条件下所述探针杂交至其靶标序列并且产生连接产物，每个连接产物包括连接接合处，

检测作为来自由所述第一组探针所产生的所述连接产物的个别信号的组合的第一累积信号，并且将其量化以确定第一信号水平，其中所述第一信号水平与所述样品中的所述第一核酸物质的数量成比例，

检测作为来自由所述第二组探针所产生的所述连接产物的个别信号的组合的第二累积信号，并且将其量化以确定第二信号水平，其中所述第二信号水平与所述样品中的所述第二核酸物质的数量成比例，以及

比较所述第一和第二信号水平，从而确定所述样品中的所述第一和第二核酸物质的相对数量。

4.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述靶标序列是不重叠的。

5.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述探针组包括各自特异性识别不同靶标序列的至少10个探针。

6.如条款5所述的方法，其中所述探针组包括各自特异性识别不同靶标序列的至少100个探针。

7.如条款6所述的方法，其中所述探针组包括各自特异性识别不同靶标序列的至少1,000个探针。

8.如条款7所述的方法，其中所述探针组包括各自特异性识别不同靶标序列的至少10,000个探针。

9.如前述条款中任一项所述的方法，其包括扩增所述连接产物并且获得作为来自所述扩增产物的个别信号的组合的累积信号。

10.如条款9所述的方法，其中所述扩增是克隆扩增。

11.如条款9或条款10所述的方法，其包括跨越所述连接接合处来扩增所述连接产物。

12.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述连接产物是双重连接产物，所述产物各自包括第一和第二连接接合处。

13.如条款12所述的方法，其中所述方法包括跨越所述第一和第二连接接合处来扩增所述连接产物。

14.如条款1至8中任一项所述的方法，其包括在不扩增所述连接产物的情况下获得作为来自所述连接产物的个别信号的组合的累积信号。

15.如条款1至13中任一项所述的方法，其中所述连接产物是核酸环。

16.如条款15所述的方法，其包括提供用于所述核酸环的滚环复制的条件，并且检测滚环复制的所述产物。

17.如条款16所述的方法，其中所述滚环复制是超支化滚环复制。

18.如条款1至14中任一项所述的方法，其中所述连接产物是线性核酸。

19.如条款18所述的方法，其中所述连接产物包括连接接合处的一侧上的捕获部分和所述连接接合处的另一侧上的标记，并且所述方法包括通过经由所述捕获部分将所述连接产物捕获于底物上，洗涤所述底物并且保持包括所述底物和所捕获连接产物的所捕获部分，并且检测所捕获部分中的所述连接产物上的所述标记而获得来自所述连接产物的信号。

20.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述信号是荧光。

21.如条款20所述的方法，其包括将所述样品中的所述核酸与第一组探针和第二组探针接触并且检测第一和第二累积信号，其中

所述第一累积信号是由所述第一组探针产生的连接产物发射的第一波长下的荧光，并且其中

所述第二累积信号是由所述第二组探针产生的连接产物发射的第二波长下的荧光。

22.如前述条款中任一项所述的方法，其中将所述探针连接以产生所述连接产物。

23.如条款22所述的方法，其中将所述探针与所述靶标序列连接以产生所述连接产物。

24.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述连接产物是包含所述靶标序列的核酸环。

25.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述核酸物质是片段化的。

26.如条款25所述的方法，其中所述靶标序列是所述核酸物质的片段的序列。

27.如条款25或条款26所述的方法，其中所述样品是核酸的限制酶消化物并且所述靶标序列是限制片段。

28.如条款25至27中任一项所述的方法，其中所述探针连接至所述靶标序列的每个末端。

29.如条款28所述的方法，其中所述探针各自包括

分别具有自由5’和3’末端的头部和尾部序列，其中所述头部和尾部序列分别与所述上游和下游侧接序列互补，其中

在用于退火和连接的条件下，所述头部和尾部序列杂交至所述侧接序列，并且所述靶标片段，如果存在，杂交至所述靶标互补序列，从而将所述靶标片段的所述末端与所述头部序列的所述5’末端和所述尾部序列的所述3’末端并置定位，其中所述靶标片段的所述3’末端连接至所述头部序列的所述5’末端以形成第一连接接合处，并且所述靶标片段的所述5’末端连接至所述尾部序列的所述3’末端以形成第二连接接合处，从而产生双重连接产物，所述产物包括包含所述头部和尾部序列和所述靶标片段的连续核酸链。

30.如条款29所述的方法，其中所述片段化核酸样品是限制酶消化物并且所述靶标片段是限制片段。

31.如条款28或条款29所述的方法，其中检测所述双重连接产物的步骤包括提供跨越所述连续核酸链的所述第一和第二连接接合处来扩增的条件，并且检测是否存在扩增产物。

32.如条款29至31中任一项所述的方法，其中包含所述头部和尾部序列和所述靶标片段的所述连续核酸链是核酸环。

33.如条款32所述的方法，其中检测所述双重连接产物的步骤包括提供用于滚环复制的条件并且检测是否存在滚环复制的产物。

34.如条款33所述的方法，其中所述滚环复制是超支化滚环复制。

35.如条款32至34中任一项所述的方法，其中所述探针在一个核酸分子上包括所述头部和尾部序列。

36.如条款35所述的方法，其中所述探针包括在其5’末端3’末端分别具有所述头部和尾部序列的骨架寡核苷酸，其中在所述退火条件下，所述骨架寡核苷酸的所述头部和尾部序列反式结合至所述靶向寡核苷酸的所述侧接序列。

37.如条款36所述的方法，其中所述骨架寡核苷酸包括所述头部与尾部序列之间的定制序列，其中所述定制序列不与所述探针的其他区域或所述靶标片段互补。

38.如条款36所述的方法，其中所述骨架寡核苷酸的所述头部和尾部序列是相邻的。

39.如条款32至35中任一项所述的方法，其中所述头部和尾部序列在所述靶向寡核苷酸的末端处并且在所述退火条件下顺式结合至所述侧接序列。

40.如条款39所述的方法，其中所述靶向寡核苷酸包括所述靶向寡核苷酸与所述头部和/或尾部序列之间的定制序列，其中所述定制序列不与所述探针的其他区域或所述靶标片段互补。

41.如条款29至34中任一项所述的方法，其中所述尾部序列在所述靶向寡核苷酸的所述3’末端，并且所述探针包括在其5’末端具有所述头部序列的骨架寡核苷酸，

其中在所述退火条件下，所述尾部序列顺式结合至所述靶向寡核苷酸的所述下游侧接序列，并且所述骨架寡核苷酸的所述头部序列反式结合至所述靶向寡核苷酸的所述上游侧接序列。

42.如条款41所述的方法，其中所述骨架寡核苷酸包括一对倒转重复序列，其中

在所述退火条件下所述倒转重复序列形成发夹结构，从而将所述骨架寡核苷酸的所述3’末端与所述靶向寡核苷酸的所述5’末端并置定位，并且其中

在用于连接的所述条件下，所述靶向寡核苷酸的所述5’末端连接至所述骨架寡核苷酸的所述3’末端以使得所述双重连接产物是包括所述靶向寡核苷酸、所述靶标片段和所述骨架寡核苷酸的核酸环。

43.如条款29至34中任一项所述的方法，其中所述头部序列在所述靶向寡核苷酸的所述5’末端，并且所述探针包括在其3’末端具有所述尾部序列的骨架寡核苷酸，

其中在所述退火条件下所述头部序列顺式结合至所述靶向寡核苷酸的所述上游侧接序列，并且所述骨架寡核苷酸的所述尾部序列反式结合至所述靶向寡核苷酸的所述下游侧接序列。

44.如条款43所述的方法，其中所述骨架寡核苷酸包括一对倒转重复序列，其中

在所述退火条件下所述倒转重复序列形成发夹结构，从而将所述骨架寡核苷酸的所述5’末端与所述靶向寡核苷酸的所述3’末端并置定位，并且其中

在用于连接的所述条件下，所述靶向寡核苷酸的所述3’末端连接至所述骨架寡核苷酸的所述5’末端以使得所述双重连接产物是包括所述靶向寡核苷酸、所述靶标片段和所述骨架寡核苷酸的核酸环。

45.如条款41至44中任一项所述的方法，其中所述骨架寡核苷酸包括所述倒转重复序列之间的定制序列，以使得在所述退火条件下所述骨架寡核苷酸形成发夹环。

46.如条款29至33中任一项所述的方法，其中包含所述头部和尾部序列和所述靶标片段的所述连续核酸链是线性核酸链。

47.如条款46所述的方法，其中所述尾部序列在所述靶向寡核苷酸的所述3’末端，并且所述探针包括在其5’末端具有所述头部序列的骨架寡核苷酸，

48.如条款41、42或47中任一项所述的方法，其中所述靶向寡核苷酸包括所述下游侧接序列与所述尾部序列之间的定制序列，以使得在所述退火条件下所述靶向寡核苷酸形成发夹环。

49.如条款46所述的方法，其中所述头部序列在所述靶向寡核苷酸的所述5’末端，并且所述探针包括在其3’末端具有所述尾部序列的骨架寡核苷酸，

50.如条款43、44或49中任一项所述的方法，其中所述靶向寡核苷酸包括所述头部序列与所述上游侧接序列之间的定制序列，以使得在所述退火条件下所述靶向寡核苷酸形成发夹环。

51.如条款41至45或47至50中任一项所述的方法，其中所述骨架寡核苷酸带有捕获部分。

52.如条款46所述的方法，其中所述探针包括包含具有自由5’末端的头部序列的骨架寡核苷酸，和包含具有自由3’末端的尾部序列的骨架寡核苷酸，其中在所述退火条件下所述头部和尾部序列反式结合至所述靶向寡核苷酸的所述侧接序列。

53.如条款52所述的方法，其中一个或两个骨架寡核苷酸进一步包括定制序列，其中所述定制序列不与所述探针的其他区域或所述靶标片段互补。

54.如条款52或条款53所述的方法，其中所述骨架寡核苷酸中的一个带有捕获部分。

55.如条款54所述的方法，其中另一个骨架寡核苷酸带有异质标记。

56.如条款55所述的方法，其中所述标记是荧光团。

57.如条款51或条款54至56中任一项所述的方法，其中检测是否存在所述双重连接产物的步骤包括经由所述捕获部分将所述骨架寡核苷酸捕获于底物上，洗涤所述底物以移除未连接探针并且保持包括所述底物和所捕获骨架寡核苷酸的所捕获部分，并且测试所捕获部分中的所述双重连接产物的存在。

58.如条款55或条款56所述的方法，其中检测是否存在所述双重连接产物的步骤包括经由所述捕获部分将所述骨架寡核苷酸捕获于底物上，洗涤所述底物以移除未连接探针并且保持包括所述底物和所捕获骨架寡核苷酸的所捕获部分，并且测试所捕获部分中的所述标记的存在。

59.如条款51或条款54至58中任一项所述的方法，其中所述捕获部分是生物素。

60.如条款29至59中任一项所述的方法，其中所述靶标互补序列具有10至30个核苷酸的长度。

61.如条款29至60中任一项所述的方法，其中所述靶标互补序列具有与所述靶标片段少于5个碱基对错配。

62.如条款61所述的方法，其中所述靶标互补序列是所述靶标片段的精确互补序列。

63.如条款29至条款62中任一项所述的方法，其中所述侧接序列各自具有10至30个核苷酸的长度。

64.如条款29至63中任一项所述的方法，其中所述上游和下游侧接序列彼此不同。

65.如条款29至条款64中任一项所述的方法，其中所述头部序列具有与所述上游侧接序列少于5个碱基对错配并且所述尾部序列具有与所述下游侧接序列少于5个碱基对错配。

66.如条款65所述的方法，其中所述头部序列是所述上游侧接序列的精确互补序列并且所述尾部序列是所述下游侧接序列的精确互补序列。

67.如条款29至66中任一项所述的方法，其中所述靶向寡核苷酸是线性的。

68.如条款29至条款67中任一项所述的方法，其中所述样品是片段化人染色体样品。

69.如条款68所述的方法，其中所述核酸物质是染色体并且所述靶标序列是对这个染色体有特异性的人基因组片段。

70.如条款68所述的方法，其中所述核酸物质是染色体基因座并且所述靶标片段是对所述人基因组的这个基因座有特异性的。

71.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述探针核酸是DNA。

72.如条款68或条款69所述的方法，其中所述方法包括使片段化染色体样品与用于结合染色体的多个片段的一组探针接触，其中所述组中的每个探针用于结合对这个染色体有特异性的不同靶标片段。

73.如条款72所述的方法，其中所述探针共有共同定制序列。

74.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述方法包括使片段化染色体样品与用于结合两个或更多个染色体的多个片段的两组或更多组探针接触，所述探针组包括：

用于结合对第一染色体有特异性的多个靶标片段的第一组探针，和

用于结合对第二染色体有特异性的多个靶标片段的第二组探针，和任选地

用于结合对一或多个其他染色体有特异性的多个靶标片段的一或多个其他探针组。

75.如条款74所述的方法，其中每个探针组包括用于结合对所述染色体有特异性的多个靶标片段的至少500个不同探针。

76.如条款74或条款75所述的方法，其中一组内的所述探针共有定制序列，所述定制序列是这个组共同的并且不同于其他组中的探针的定制序列。

77.如条款76所述的方法，其包括通过检测并量化来自每一组探针的所述双重连接产物中的所述定制序列的累积信号来确定所述样品中的所述两个或更多个染色体的相对数量。

78.如条款72至77中任一项所述的方法，其中所述一个或多个染色体是人染色体。

79.如条款28所述的方法，其中所述探针包括双链选择子构建体，每个个别选择子包括与所述靶标片段的所述末端互补的一个或两个突出末端序列，其中

在用于退火和连接的所述条件下，所述选择子的所述末端序列杂交至所述片段的所述末端序列并且连接至所述选择子。

80.如条款22所述的方法，其中所述探针是挂锁探针，每个探针包括线性寡核苷酸，所述线性寡核苷酸在末端具有靶标互补序列并且在所述靶标互补序列之间具有非靶标互补序列，其中

在用于退火和连接的所述条件下，所述靶标互补序列头部对尾部地放在一起以便杂交至所述靶标序列的相邻区域并且连接形成核酸环。

81.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述核酸物质是染色体或染色体基因座。

82.如前述条款中任一项所述的方法，其中所述样品是血液或组织样品。

83.如条款82所述的方法，其中所述样品含有来自孕妇的血液的胎儿和母体DNA的混合物。

84.如条款81或条款82所述的方法，其中待检测或量化的所述核酸物质是肿瘤相关DNA。

85.如条款81或条款82所述的方法，其中待检测或量化的所述核酸物质是微生物DNA。

86.一种在从个体获得的核酸样品中相对于第二染色体或染色体基因座来量化第一染色体或染色体基因座的方法，其包括

使所述样品与第一组探针和第二组探针接触，其中所述第一组的所述探针各自特异性识别所述第一染色体或染色体基因座内的不同靶标序列并且其中所述第二组的所述探针各自特异性识别所述第二染色体或染色体基因座内的不同靶标序列，

提供使得所述第一和第二染色体或染色体基因座中的所述靶标序列变成至少部分单链的条件，

提供用于退火和连接的条件，在所述条件下所述探针杂交至其靶标序列并且产生连接产物，

检测作为来自由所述第一组探针所产生的所述连接产物的个别信号的组合的第一累积信号，并且将其量化以确定第一信号水平，其中所述第一信号水平与所述样品中的所述第一染色体或染色体基因座的数量成比例，

检测作为来自由所述第二组探针所产生的所述连接产物的个别信号的组合的第二累积信号，并且将其量化以确定第二信号水平，其中所述第二信号水平与所述样品中的所述第二染色体或染色体基因座的数量成比例，以及

比较所述第一和第二信号水平，从而确定所述样品中的所述第一和第二染色体或第一和第二染色体基因座的相对数量。

87.如条款83或条款86所述的方法，其用于诊断胎儿的三体性，其中所述核酸样品是从所述母亲的血液获得的无细胞胎儿DNA样品，并且其中所述第一和第二信号水平的不等比率指示三体性。

88.一种用于结合单链靶标核酸片段的核酸探针，其中所述探针包括

分别具有自由5’和3’末端的头部和尾部序列，其中所述头部和尾部序列分别与所述上游和下游侧接序列互补

以使得在所述靶标片段存在下的退火条件下，所述头部和尾部序列杂交至所述侧接序列，从而界定所述头部序列的所述5’末端与所述尾部序列的所述3’末端之间的间隙，其中所述靶标片段杂交至所述间隙中的所述靶标互补序列，从而将所述靶标片段的所述末端与所述头部序列的所述5’末端和所述尾部序列的所述3’末端并置定位，并且其中

所述间隙中的所述靶标片段的杂交完成核酸环，所述环包括所述靶标片段和所述头部和尾部序列。

89.如条款88所述的核酸探针，其中所述头部和/或尾部序列接合至定制序列，其中所述定制序列不与所述探针的其他区域或所述靶标片段互补。

90.如条款88或条款89所述的核酸探针，其中单一核酸分子包括所述头部和尾部序列。

91.如条款88或条款89所述的探针，其中所述头部和尾部序列与所述靶向寡核苷酸分开并且反式结合至所述侧接序列。

92.如条款91所述的探针，其中所述头部和尾部序列分别在骨架寡核苷酸的5’和3’末端。

93.如条款92所述的探针，其中所述骨架寡核苷酸包括所述头部与尾部序列之间的定制序列，其中所述定制序列不与所述探针的其他区域或所述靶标片段互补。

94.如条款92所述的探针，其中所述骨架寡核苷酸的所述头部和尾部序列是相邻的。95.一种用于结合单链靶标核酸片段的核酸探针，其中所述探针包括

所述头部序列是所述靶向寡核苷酸的5’末端和/或所述尾部序列是所述靶向寡核苷酸的3’末端，以使得所述间隙中的所述靶标片段的杂交完成包括所述靶标片段、所述头部和尾部序列、所述靶标互补序列和所述侧接序列的核酸链。

96.如条款88或条款95所述的探针，其中所述头部和尾部序列在所述靶向寡核苷酸的末端并且顺式结合至所述侧接序列。

97.如条款88或条款95所述的探针，其中所述尾部序列是所述靶向寡核苷酸的3’末端并且所述头部序列是与所述靶向寡核苷酸分开的骨架寡核苷酸的5’末端。

98.如条款88或条款95所述的探针，其中所述头部序列是所述靶向寡核苷酸的5’末端并且所述尾部序列是与所述靶向寡核苷酸分开的骨架寡核苷酸的3’末端。

99.如条款97或条款98所述的探针，其中所述骨架寡核苷酸进一步包括定制序列，其中所述定制序列不与所述探针的其他区域或所述靶标片段互补。

100.一种用于结合单链靶标核酸片段的核酸探针，其中所述探针包括

靶向寡核苷酸，其比所述靶标片段更长并且含有内部靶标互补序列，以使得所述靶向寡核苷酸与所述靶标片段之间的杂交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游和下游侧接序列之间的双链序列，

包含具有自由5’末端的头部序列的骨架寡核苷酸，和

包含具有自由3’末端的尾部序列的骨架寡核苷酸，

其中所述头部和尾部寡核苷酸序列分别与所述上游和下游侧接序列互补，并且其中

一个骨架寡核苷酸带有捕获部分并且另一个骨架寡核苷酸带有异质标记，

所述间隙中的所述靶标片段的杂交完成包括所述靶标片段和所述头部和尾部序列的核酸链，其中所述链带有所述捕获部分和所述标记。

101.如条款100所述的探针，其中所述捕获部分是生物素。

102.如条款100或条款101所述的探针，其中所述标记是荧光团。

103.如条款100至102中任一项所述的探针，其中一个或两个骨架寡核苷酸进一步包括定制序列，其中所述定制序列不与所述探针的其他区域或所述靶标片段互补。

104.如条款88至103中任一项所述的探针，其中所述靶向寡核苷酸进一步包括不与所述探针的其他区域或所述靶标片段互补的定制序列。

105.如条款88至条款104中任一项所述的探针，其中所述靶标互补序列具有10至30个核苷酸的长度。

106.如条款88至105中任一项所述的探针，其中所述靶标互补序列具有与所述靶标片段少于5个碱基对错配。

107.如条款106所述的探针，其中所述靶标互补序列是所述靶标片段的精确互补序列。

108.如条款88至107中任一项所述的探针，其中所述侧接序列各自具有10至30个核苷酸的长度。

109.如条款88至108中任一项所述的探针，其中所述靶向寡核苷酸的所述上游和下游侧接序列彼此不同。

110.如条款88至109中任一项所述的探针，其中所述头部序列具有与所述上游侧接序列少于5个碱基对错配并且所述尾部序列具有与所述下游侧接序列少于5个碱基对错配。

111.如条款110所述的探针，其中所述头部和尾部序列是所述侧接序列的精确互补序列。

112.如条款88至111中任一项所述的探针，其中所述靶向寡核苷酸是线性的。

113.如条款88至112中任一项所述的探针，其中所述靶标片段是限制性核酸内切酶片段。

114.如条款88至113中任一项所述的探针，其中所述靶标片段是人基因组片段。

115.如条款114所述的探针，其中所述靶标片段是对染色体有特异性的人基因组片段。

116.如条款115所述的探针，其中所述靶标片段是对所述人基因组的一个基因座所有特异性的。

117.如条款88至116中任一项所述的探针，其中所述探针核酸是DNA。

118.用于结合单链靶标核酸片段的一组探针，其包括如条款88至117中任一项所述的多个探针，所述探针具有用于结合多个不同靶标片段的多个不同靶标互补序列。

119.如条款118所述的一组探针，其用于结合人染色体的多个片段，其中所述组中的每个探针用于结合对这个染色体有特异性的不同靶标片段。

120.如条款119所述的一组探针，其中所述探针共有共同定制序列。

121.用于结合两个或更多个人染色体的不同片段的探针组，其包括：

122.如条款121所述的探针组，其中一组内的所述探针共有定制序列，所述定制序列是这个组共同的并且不同于其他组中的探针的定制序列。

123.一种试剂盒，其包括一或多个容器中的溶液中的如条款118至122中任一项所述的一组或多组探针。

124.如条款88至117中任一项所述的探针、如条款118至122中任一项所述的一组或多组探针，或如条款123所述的试剂盒的用途，其用于针对核酸物质的存在来测试样品。

125.一组探针用于针对从核酸物质获得的靶标片段的存在来测试样品的用途，

其中所述组的每个探针包括靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸含有作为靶标片段的精确互补序列的序列，和头部和尾部寡核苷酸序列，所述头部和尾部寡核苷酸序列相邻于所述靶向寡核苷酸上的所述靶标片段来杂交，

其中所述靶标片段与所述探针之间的杂交充当所述靶标片段连接至所述头部和尾部序列的模板。

实施方案提供样品分析方法，其包括：

a)将包括片段化DNA的样品与包括第一组探针的探针混合物杂交，其中所述第一组探针的探针：

i.杂交至第一染色体中的不同位点；并且

ii.在杂交至来自所述第一染色体的DNA片段时，形成含有可连接相邻接合处的非共价环形产物；

b)将所述可连接相邻接合处连接在一起以产生多个共价环形连接产物；

c)通过滚环扩增(RCA)来扩增所述共价环形连接产物以产生多个RCA产物分子；

d)标记所述RCA产物分子；以及

e)量化在步骤d)中产生的标记RCA产物分子的数目，从而提供对应于所述样品中的第一染色体的DNA的量的估计值。

在任何实施方案中，所述第一染色体可为染色体21、13或18。

在任何实施方案中，探针混合物可包括第二组探针，其中第二组探针的探针杂交至第二染色体中的不同位点并且在杂交至来自第二染色体的DNA片段时，形成含有可连接相邻接合处的非共价环形产物；并且步骤e)包括个别地量化对应于所述第一和第二染色体的滚环扩增产物分子的数目，从而提供对应于所述样品中的第一和第二染色体的DNA的相对量的估计值。

在一些实施方案中，第一组探针杂交至第一染色体的第一区域中的不同位点。在这些实施方案中，探针混合物可包括第二组探针，其中第二组探针的探针杂交至第一染色体中的第二区域中的不同位点并且在杂交至来自第二染色体的DNA片段时，形成含有可连接相邻接合处的非共价环形产物；并且步骤e)包括个别地量化对应于第一染色体的第一和第二区域的滚环扩增产物分子的数目，从而提供对应于所述样品中的第一染色体的第一和第二区域的DNA的相对量的估计值。

在任何实施方案中，第一染色体是染色体21并且第二染色体选自染色体13和染色体18。

在任何实施方案中，每个非共价环形产物包括来自样品的DNA片段。在这些实施方案中，步骤a)的探针可包括：

i.头部序列和尾部序列，其中头部和尾部序列在第一寡核苷酸分子的末端；和

ii.夹持序列，其依序包括：

与头部序列互补的上游侧接序列；

与靶标片段互补的靶标互补序列；和

与尾部序列互补的下游侧接序列；

并且在非共价环形产物中，靶标片段的末端可连接地相邻于第一寡核苷酸分子中的头部和尾部序列的末端。

在这些实施方案中，夹持序列可在第一寡核苷酸分子中。或者，夹持序列可在第二寡核苷酸分子中。

在任何实施方案中，所述样品可用限制酶来消化。

在任何实施方案中，所述样品包括基因组DNA，例如，从血液分离的无细胞DNA。

在任何实施方案中，样品可包括从怀孕人的血液分离的无细胞DNA。

在任何实施方案中，染色体可从组织活检分离。

在任何实施方案中，染色体可为微生物染色体。

在任何实施方案中，量化步骤可通过以下步骤来进行：将在步骤c)中产生的个别滚环扩增产物分子彼此分离，并且计数界定区域或体积中的个别滚环扩增产物分子的数目。

在这些实施方案中，量化步骤可通过以下来进行：

i.将经标记寡核苷酸杂交至RCA产物分子，其中经标记寡核苷酸杂交至在RCA产物中重复的序列，从而产生多个复合物，其各自包括单一RCA产物和杂交至RCA产物的多个经标记寡核苷酸；并且

ii.计数经标记复合物的数目。

在这些实施方案中，量化步骤可通过以下来进行：

(a)获得底物，其包括分布在底物表面上的经标记复合物；以及

(b)计数存在于底物的第一区域中的RCA产物的数目。

在这些实施方案中，所述方法可包括：

(a)获得底物，所述底物包括分布在底物表面上的第一和第二多个复合物，其中每个复合物包括单一RCA产物和杂交至RCA产物的多个标记寡核苷酸探针，第一和第二多个复合物可区分地标记，并且第一和第二多个复合物对应于不同染色体；以及

(b)计数存在于底物的第一区域中的第一多个RCA产物的数目并且独立地计数第二多个RCA产物的数目。在此实施方案中，寡核苷酸可荧光标记。

在这些实施方案中，第一组探针可包括至少50个探针。

Claims

1.一种相对于样品中的第二染色体或染色体基因座来量化第一染色体或染色体基因座的方法，其包括

提供用于退火和连接的条件，在所述条件下所述探针杂交至其靶标序列并且产生连接产物，每个连接产物是包括连接接合处的核酸环，

提供用于所述核酸环的滚环复制的条件，

通过使滚环复制产物杂交至荧光标记寡核苷酸来标记滚环复制产物以产生经荧光标记的滚环复制产物，

使经荧光标记的滚环复制产物沉积于载体的表面上，

计数载体上的第一滚环复制产物的数目，其中第一滚环复制产物被第一荧光团标记并且从由第一组探针产生的连接产物扩增以提供第一计数，

计数载体上的第二滚环复制产物的数目，其中第二滚环复制产物被第二荧光团标记并且从由第二组探针产生的连接产物扩增以提供第二计数，以及

比较第一和第二计数，从而确定所述样品中的所述第一和第二核酸物质的相对数量，

其中所述方法不用于诊断目的。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述探针组包括各自特异性识别不同靶标序列的至少1,000个探针。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述探针组包括各自特异性识别不同靶标序列的至少10,000个探针。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述连接产物是双重连接产物，其各自包括第一和第二连接接合处。

5.如权利要求1或2所述的方法，其中滚环扩增产物分别通过以下方式进行计数：

(a)获得底物，所述底物包括分布在底物表面上的多个复合物，其中每个复合物包括单一RCA产物和杂交至RCA产物的多个标记寡核苷酸探针，并且其中对应于第一滚环扩增产物的复合物和对应于第二滚环扩增产物的复合物被可区分地标记；以及

(b)计数存在于底物的区域中的第一RCA产物的数目并且独立地计数第二RCA产物的数目。

6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述连接产物是包括所述靶标序列的核酸环。

7.如权利要求1或2所述的方法，其中所述染色体或染色体基因座是片段化染色体或染色体基因座。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述靶标序列是所述染色体或染色体基因座的片段的序列。

9.如权利要求7所述的方法，其中所述样品是核酸的限制酶消化物并且所述靶标序列是限制片段。

10.如权利要求1或2所述的方法，其中所述探针各自包括

在用于退火和连接的所述条件下，所述头部和尾部序列杂交至所述侧接序列，并且所述靶标片段，如果存在，杂交至所述靶标互补序列，从而将所述靶标片段的所述末端与所述头部序列的所述5’末端和所述尾部序列的所述3’末端并置定位，其中所述靶标片段的所述3’末端连接至所述头部序列的所述5’末端以形成第一连接接合处，并且所述靶标片段的所述5’末端连接至所述尾部序列的所述3’末端以形成第二连接接合处，从而产生双重连接产物，所述产物包括包含所述头部和尾部序列和所述靶标片段的连续核酸链，其中所述连续链是环。

11.如权利要求1或2所述的方法，其中所述样品是血液或组织样品。

12.第一组探针和第二组探针在制备诊断剂中的用途，所述诊断剂用于相对于样品中的第二染色体或染色体基因座来量化第一染色体或染色体基因座的方法，所述方法包括：

提供用于所述核酸环的滚环复制的条件，

使经荧光标记的滚环复制产物沉积于载体的表面上，

比较第一和第二计数，从而确定所述样品中的所述第一和第二核酸物质的相对数量。

13.如权利要求12所述的用途，其中第一染色体是染色体21并且第二染色体选自染色体13和染色体18。

14.如权利要求12或13所述的用途，其中所述探针组包括各自特异性识别不同靶标序列的至少1,000个探针。

15.如权利要求14所述的用途，其中所述探针组包括各自特异性识别不同靶标序列的至少10,000个探针。

16.如权利要求12或13所述的用途，其中所述连接产物是双重连接产物，其各自包括第一和第二连接接合处。

17.如权利要求12或13所述的用途，其中滚环扩增产物分别通过以下方式进行计数：

18.如权利要求12或13所述的用途，其中所述连接产物是包括所述靶标序列的核酸环。

19.如权利要求12或13所述的用途，其中所述染色体或染色体基因座是片段化染色体或染色体基因座。

20.如权利要求19所述的用途，其中所述靶标序列是所述染色体或染色体基因座的片段的序列。

21.如权利要求19所述的用途，其中所述样品是核酸的限制酶消化物并且所述靶标序列是限制片段。

22.如权利要求12或13所述的用途，其中所述探针各自包括

23.如权利要求12或13所述的用途，其中所述样品是血液或组织样品。

24.如权利要求23所述的用途，其中所述样品含有来自孕妇血液的胎儿和母体DNA的混合物。