JP2018513682A - ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性遺伝子調節のための化学修飾型ガイドＲＮＡ - Google Patents

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性遺伝子調節のための化学修飾型ガイドＲＮＡ Download PDF

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Abstract

細胞において標的核酸（例えば、標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡ）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに基づいた遺伝子調節（例えば、ゲノム編集または遺伝子発現）を誘導するための方法が本明細書に提供される。方法は、エクスビボ治療用の初代細胞において、またはインビボ治療用の対象内の細胞において、標的核酸の遺伝子調節を増強する、修飾型単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を用いることを含む。加えて、遺伝的疾患に関連した標的遺伝子における変異を正すのに十分な量の修飾型ｓｇＲＮＡを投与することにより、対象において遺伝的疾患を予防または処置するための方法が本明細書に提供される。

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１５年４月６日に出願された米国仮出願第６２／１４３，７２９号、および２０１５年５月１２日に出願された米国仮出願第６２／１６０，５４５号の優先権を主張し、それらの米国仮出願の開示は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
連邦政府支援の研究および開発の下でなされた発明への権利に関する陳述
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与された契約ＥＹ０１８２４４およびＡＩ０９７３２０による政府支援でなされた。政府はこの発明において一定の権利を有する。
人工ヌクレアーゼを用いたゲノム編集は、関心対象となる、本質的にいかなるゲノム配列をも改変するための画期的技術である（Ｐｏｒｔｅｕｓ， Ｍ．Ｈ． ＆ Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｄ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３， ９６７−９７３ （２００５））。この技術は、人工ヌクレアーゼを利用して、部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせ、続いて、内因性細胞修復機構によりＤＳＢを回復させる。その結果は、切断の部位において挿入もしくは欠失（イン／デル）を生じる、変異原性の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による特定部位の変異か、または外因的に導入されたドナー鋳型を用いる相同組換え（ＨＲ）によるゲノム配列の正確な変化かのいずれかであり得る（Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３， １３２−１４０ （２０１５））。このプラットフォームへの最近の主な追加は、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）および短鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）からなるクラスター化された規則的な配置の回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ：ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓシステムである（Ｊｉｎｅｋ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７， ８１６−８２１ （２０１２）、Ｍａｌｉ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９， ８２３−８２６ （２０１３）、Ｃｏｎｇ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９， ８１９−８２３ （２０１３）、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １５７， １２６２−１２７８ （２０１４））。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と名付けられた２つのＲＮＡで構成されており、それらは、典型的には、キメラ単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として融合している。
ゲノム編集のためのｓｇＲＮＡは、１００ヌクレオチド（ｎｔ）からなり得、そのうちの５’末端における２０ｎｔが、ワトソン・クリック塩基対形成によって標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズし、標的ゲノムＤＮＡを切断するようにＣａｓエンドヌクレアーゼを導く。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムはまた、遺伝子発現の配列特異的制御、例えば、遺伝子発現の阻害または活性化に適応している。エンドヌクレアーゼ活性を欠く特定のＣａｓ９ポリペプチドバリアントを用いて、標的遺伝子を抑制または活性化することができる（Ｑｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ２０１３， １５２（５）：１１７３−７７８３、Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２０１３， １０（１０）：９７３−９７６、Ｍａｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２０１３， １０（１０）：９７７−９７９、Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ２０１４， １５９：６４７−６６１、Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２０１４， ５１６：２６３−２６６）。
残念なことに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いるゲノム編集および遺伝子発現のモジュレーションは、特に初代細胞において、非効率のままである。それゆえに、遺伝子調節、例えば、ゲノム編集、遺伝子発現の阻害、および遺伝子発現の活性化のために用いることができる、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づいた、改善された組成物および方法の必要性が当技術分野において依然として存在する。本発明は、この必要性を満たし、さらに追加の利点を提供する。
細胞において標的核酸の遺伝子調節を誘導する（例えば、惹起する、モジュレートする、増強するなど）ための方法を提供する。本発明は、（例えば、エクスビボ治療用にインビトロで培養された）初代細胞において、または（例えば、インビボ治療用の）ヒトなどの対象内の細胞において、標的核酸のゲノム編集および／または遺伝子発現の阻害もしくは活性化を増強する、修飾型単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を用いることを含む。本発明はまた、疾患に関連した標的遺伝子における変異を正す正確なゲノム編集を増強することによる、対象において疾患を予防または処置するための方法を提供する。本発明は、ヌクレアーゼ媒介性ゲノム編集技術を受け入れられる、いかなる細胞型に関しても、かついかなる遺伝子座においても用いることができる。
第１の態様において、本発明は、初代細胞において標的核酸の遺伝子調節を誘導するための方法であって、
（ａ）標的核酸に相補的な第１のヌクレオチド配列、およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列を含む修飾型単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、前記第１のヌクレオチド配列および／または前記第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの１個または複数が修飾型ヌクレオチドである、修飾型単一ガイドＲＮＡ；ならびに
（ｂ）Ｃａｓポリペプチド、ＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、および／またはＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター
を初代細胞へ導入するステップ
を含み、
前記修飾型ｓｇＲＮＡがＣａｓポリペプチドを標的核酸へ導き、
前記修飾型ｓｇＲＮＡが、対応する非修飾型ｓｇＲＮＡと比較して増強した活性で標的核酸の遺伝子調節を誘導する、方法を提供する。
関連態様において、本発明は、初代細胞において標的ＤＮＡのゲノム編集を増強するための方法であって、
（ａ）標的ＤＮＡに相補的な第１のヌクレオチド配列、およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列を含む修飾型単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、前記第１のヌクレオチド配列および／または前記第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの１個または複数が修飾型ヌクレオチドである、修飾型単一ガイドＲＮＡ；ならびに
（ｂ）Ｃａｓポリペプチド、ＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、および／またはＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター
を初代細胞へ導入するステップ
を含み、
前記修飾型ｓｇＲＮＡがＣａｓポリペプチドを標的ＤＮＡへ導き、
前記修飾型ｓｇＲＮＡが、対応する非修飾型ｓｇＲＮＡと比較して、（例えば、修飾型ｓｇＲＮＡの安定性の増加および／または修飾型ｓｇＲＮＡの標的ＤＮＡに対する特異性の増加によって）標的ＤＮＡのゲノム編集を増強する、方法を提供する。
第２の態様において、本発明は、対象において遺伝的疾患を予防または処置するための方法であって、
遺伝的疾患に関連した標的遺伝子における変異を正すのに十分な量で修飾型単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を対象に投与するステップであって、前記修飾型ｓｇＲＮＡが、標的遺伝子に相補的な第１のヌクレオチド配列、およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列を含み、かつ前記第１のヌクレオチド配列および／または前記第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの１個または複数が修飾型ヌクレオチドである、ステップ
を含む、方法を提供する。
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明および図から当業者に明らかであろう。
合成され、かつ化学修飾されたｓｇＲＮＡが、インビトロでの高レベルのＤＮＡ切断、およびヒト細胞株（Ｋ５６２）におけるイン／デルの高頻度を促進することを示す図である。図１Ａは、ＩＬ２ＲＧ ｓｇＲＮＡの配列、およびＣａｓ９へローディングされ、かつそれのゲノム標的部位と結合したＩＬ２ＲＧ ｓｇＲＮＡの二次構造の概略図を示す。化学修飾を有するヌクレオチドは、白色旗でマークされている。図１Ｂは、ｓｇＲＮＡ（配列については表１）の化学合成中に取り込まれた化学修飾の構造を描く。存在する場合、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル、３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、または２’−Ｏ−メチル、３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）を含む化学修飾（灰色で示されている）は、５’末端と３’末端の両方における３個の終端ヌクレオチドに取り込まれた。図１Ｃは、ＰＣＲアンプリコンのディープシーケンシングにより測定された場合の変異原性ＮＨＥＪによる遺伝子破壊を示す。図１Ｄは、合成ｓｇＲＮＡと組み合わされたＣａｓ９により誘導されたＫ５６２細胞の３つの遺伝子座ＩＬ２ＲＧ、ＨＢＢ、およびＣＣＲ５におけるＨＲによる遺伝子付加を示す。合成ｓｇＲＮＡを、１００万個の細胞あたり１μｇ（明るい色調）または２０μｇ（暗い色調）で送達した。Ｃａｓ９はプラスミド（２μｇ）から発現し、ＨＲ実験について、５μｇのＧＦＰコードドナープラスミドが含まれた。陽性対照として、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質の両方をコードする２μｇのｓｇＲＮＡプラスミドを用いた（灰色バー）。バーは、平均値＋ＳＥＭ、ｎ＝３を表す。図１Ｅは、２０μｇのｓｇＲＮＡについて、図１Ｃにおいて実施されたような合成ｓｇＲＮＡにより媒介される標的化切断の特異性を示す。イン／デル頻度を、標的ゲノム遺伝子座、および各遺伝子について３つのバイオインフォマティクス的に予測されたオフターゲット遺伝子座のＰＣＲアンプリコンのディープシーケンシングにより測定した。バーは、平均値＋ＳＥＭ、ｎ＝３を表す。図１Ｆは、エレクトロポレーション法を用いた、１５μｇ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよび１０μｇ ＩＬ２ＲＧ合成ｓｇＲＮＡの１００万個のＫ５６２細胞への時差送達を示す。バーは、参照対照としてｍｏｃｋ処理された試料を用いた、ｓｇＲＮＡ標的部位に及ぶＰＣＲアンプリコンのＴＩＤＥ分析により測定された場合の、平均イン／デル頻度＋ＳＥＭ、ｎ＝３を表す。図１Ｇにおいて、Ｃａｓ９タンパク質を、２．５モル過剰の示された合成ＩＬ２ＲＧ ｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化させ、示された量で１００万個のＫ５６２細胞へヌクレオフェクションした。イン／デル頻度は、上記のようにＴＩＤＥ分析により測定され、バーは平均イン／デル頻度＋ＳＥＭ、ｎ＝３を表す。 化学修飾型ｓｇＲＮＡが、ヒト初代Ｔ細胞およびＣＤ３４＋造血幹細胞・造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）において高率の遺伝子破壊を促進することを示す図である。１００万個のヒト初代Ｔ細胞に、１０μｇの示された合成ｓｇＲＮＡ、および１５μｇ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡかまたは１μｇ Ｃａｓ９コードプラスミドかのいずれかをヌクレオフェクションした（図２Ａ）。ｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質の両方をコードする１μｇのプラスミドを比較のために含めた。バーは、ｓｇＲＮＡ標的部位に及ぶＰＣＲアンプリコンのＴＩＤＥ分析により測定された場合の、３つの異なるドナーについての平均イン／デル頻度＋ＳＥＭ、ｎ＝６を表し、参照対照としてｍｏｃｋ処理の試料を用いた。図２Ｂにおいて、刺激Ｔ細胞に、上記の通りであるが、ただし、２．５モル過剰の示された合成ＣＣＲ５ ｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化した１５μｇ Ｃａｓ９タンパク質をヌクレオフェクションした。イン／デル頻度を、上記のようにＴＩＤＥ分析により測定した。バーは、３つの異なるドナーについての平均イン／デル頻度＋ＳＥＭ、ｎ＝６を表す。図２Ｃにおいて、５００，０００個の動員化ヒト末梢血ＣＤ３４＋ＨＳＰＣに、１０μｇの、示された、ＩＬ２ＲＧまたはＨＢＢを標的にする合成ｓｇＲＮＡ、および１５μｇ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡかまたは１μｇ Ｃａｓ９プラスミドのいずれかをヌクレオフェクションした。ｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質の両方をコードする１μｇのｓｇＲＮＡプラスミドを比較のために含めた。バーは、Ｔ７エンドヌクレアーゼ切断アッセイにより測定される場合の平均イン／デル頻度＋ＳＥＭ、ｎ＝３を表す。図２Ｄにおいて、１００万個の刺激Ｔ細胞または動員化ヒト末梢血ＣＤ３４＋ＨＳＰＣに、１５μｇ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよび１０μｇの示された合成ＣＣＲ５ ｓｇＲＮＡをヌクレオフェクションした。組み合わせて用いられる場合、各ｓｇＲＮＡの量は５μｇであった。単一のｓｇＲＮＡでの試料についてのイン／デル頻度を、上記のようにＴＩＤＥ分析により測定し、２つのｓｇＲＮＡでの試料についてのイン／デル頻度を、クローニングされたＰＣＲ産物のシーケンシングにより測定した（図１８Ａ〜Ｂ参照）。バーは平均イン／デル頻度＋ＳＥＭ、ｎ＝３を表す。 インビトロでの化学修飾型ｓｇＲＮＡにより方向づけられたｄｓＤＮＡ標的のＣａｓ９切断を示す図である。バーは、Ｃａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡで処理された標的ＤＮＡ断片の切断生成物（図４参照）のパーセント収量を示す。各ｓｇＲＮＡの３つの独立した合成についての平均値＋ＳＥＭが示されている。 インビトロで化学修飾型ｓｇＲＮＡにより方向づけられたｄｓＤＮＡ標的のＣａｓ９切断を示す図である。ｄｓＤＮＡ標的の生化学的切断からの切断生成物を、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２２００においてＤＮＡ ７５００ ＬａｂＣｈｉｐｓでアッセイした。各標的について代表的なゲルが示されており、追加の反復実験は、図３においてプロットされた結果に含まれている。試料は以下の通りであった：（Ｌ）：ラダー、（１）：非修飾型ｓｇＲＮＡ＋標的ＤＮＡ（−Ｃａｓ９ ｍｏｃｋ処理）、（２）：標的ＤＮＡ＋Ｃａｓ９タンパク質（−ｓｇＲＮＡ ｍｏｃｋ処理）、（３）：非修飾型ｓｇＲＮＡ＋標的ＤＮＡ＋Ｃａｓ９タンパク質、（４）：Ｍ ｓｇＲＮＡ＋標的ＤＮＡ＋Ｃａｓ９タンパク質、（５）：ＭＳ ｓｇＲＮＡ＋標的ＤＮＡ＋Ｃａｓ９タンパク質、および（６）：ＭＳＰ ｓｇＲＮＡ＋標的ＤＮＡ＋Ｃａｓ９タンパク質。 合成ｓｇＲＮＡにより媒介される標的化切断の特異性を示す図である。標的特異性を図１ＥにおいてのようにＩｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングを用いて評価したが、ただし、図１Ｃからの試料に１μｇ ｓｇＲＮＡをヌクレオフェクションした。イン／デル頻度を、各ｓｇＲＮＡについて３つのバイオインフォマティクス的に予測されたオフターゲット遺伝子座からのＰＣＲアンプリコンのディープシーケンシングにより測定した。バーは、対数目盛で示された、平均値＋ＳＥＭ、ｎ＝３を表す。イン／デルパーセンテージに関して表５を参照。 Ｋ５６２細胞における、ＩＬ２ＲＧを標的にするＭＳＰ ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡの滴定を示す図である。測定されたイン／デル頻度は、３回の反復実験からの平均であり、値は、ヒートマップで示されている。反復実験（ｎ＝３）のＳＥＭは、明快にするために表示されていないが、全て、測定された表示の値の４％未満である。イン／デル頻度を、ｓｇＲＮＡ標的部位に及ぶＰＣＲアンプリコンのＴＩＤＥ分析により測定し、参照対照としてｍｏｃｋ処理された試料を用いた。 ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡの時差送達の実験概略図を提供する。図１Ｇについてのデータをもたらした実験の概略図。Ｋ５６２細胞に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、および／またはＩＬ２ＲＧを標的にするｓｇＲＮＡを、示された時点にヌクレオフェクションした。ゲノムＤＮＡを、最後の成分のヌクレオフェクションから７２時間後、抽出し、イン／デル頻度を、参照対照としてｍｏｃｋ処理された試料を用いるＴＩＤＥにより測定した。 異なる販売会社からのＣａｓ９タンパク質を比較する図である。１００万個のＫ５６２細胞に、２．５モル過剰のＭＳ ｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化した１５μｇ Ｃａｓ９タンパク質をヌクレオフェクションした３日後、ゲノムＤＮＡを抽出し、イン／デル頻度を、参照対照としてｍｏｃｋ処理された試料を用いるＴＩＤＥにより測定した。バーは、平均＋ＳＥＭ、ｎ＝３を表す。 標的化切断の特異性が、合成ＩＬ２ＲＧ ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９プラスミド、ｍＲＮＡ、またはタンパク質により媒介されることを示す図である。標的特異性を、図１Ｅおよび図５においてのようにＩｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングを用いて評価し、均等目盛（図９Ａ）および対数目盛（図９Ｂ）で表示した。１００万個のＫ５６２細胞に、（ｉ）２μｇ Ｃａｓ９プラスミド＋２０μｇ ｓｇＲＮＡ、（ｉｉ）１５μｇ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ＋１０μｇ ｓｇＲＮＡ、または（ｉｉｉ）７．６μｇ ｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化した１５μｇ Ｃａｓ９タンパク質（タンパク質：ｓｇＲＮＡのモル比＝１：２．５）をヌクレオフェクションした。Ｃａｓ９プラスミドの結果は、図１Ｅに示されたのと同じである。バーは、平均イン／デル頻度＋ＳＥＭ、ｎ＝３を表す。 ヒト初代Ｔ細胞における高いＲＮＡヌクレオフェクション効率を示す図である。３つの異なるドナー由来の刺激Ｔ細胞に、刺激から３日後、ＧＦＰ ｍＲＮＡをヌクレオフェクションした。ＧＦＰの発現を、ヌクレオフェクションから３日後、フローサイトメトリにより測定した。ヌクレオフェクションされた細胞（灰色）におけるＧＦＰ発現は、ｍｏｃｋでトランスフェクトされた細胞（黒色）と比較して示されている。 Ｔ細胞ヌクレオフェクションにおいてＣＣＲ５ ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡ量を増加させることが、類似したイン／デル頻度を生じたことを示す図である。刺激Ｔ細胞に、ＭＳＰ ＣＣＲ５ ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡの示された量をヌクレオフェクションした。イン／デル頻度を、ｓｇＲＮＡ標的部位に及ぶＰＣＲアンプリコンのＴＩＤＥ分析により測定し、参照対照としてｍｏｃｋ処理された試料を用いた。平均イン／デル頻度は＋ＳＥＭ、ｎ＝６を示されている。 ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、および全てのＴ細胞集団における類似したイン／デル頻度を示す図である。刺激Ｔ細胞にＣＣＲ５ ＭＳＰ ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡをヌクレオフェクションし、その後、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋亜集団へ分別した。イン／デル頻度をＴＩＤＥにより測定し、全部の集団におけるイン／デル頻度と比較した。バーは、１つのＴ細胞ドナーについての平均イン／デル頻度＋ＳＥＭ、ｎ＝８を表す。 ヒト初代Ｔ細胞におけるイン／デル頻度が、時間が経過しても安定であることを示す図である。刺激Ｔ細胞にＣＣＲ５ ＭＳＰ ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡをヌクレオフェクションした。示された時点において細胞のサブセットからｇＤＮＡを抽出し、イン／デル頻度を、ｓｇＲＮＡ標的部位に及ぶＰＣＲアンプリコンのＴＩＤＥ分析により測定し、参照対照としてｍｏｃｋ処理された試料を用いた。平均イン／デル頻度は３つの異なるＴ細胞ドナーについて、＋／−ＳＥＭ、ｎ＝６を示されている。 Ｃａｓ９プラスミドと比較して、合成ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡをヌクレオフェクションされたＴ細胞における細胞死の、より低い頻度を示す図である。１００万個の刺激Ｔ細胞に、１０μｇの示された合成ｓｇＲＮＡ、および１５μｇ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡかまたは１μｇ Ｃａｓ９コードプラスミドのいずれかをヌクレオフェクションした。ＣＣＲ５ ｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質の両方をコードする１μｇのプラスミドを、比較のために含めた（ｓｇＲＮＡプラスミド）。ヌクレオフェクションから３日後、細胞を、生／死の細胞染色で染色した。バーは、３つの異なるＴ細胞ドナーについての死細胞の平均パーセンテージ＋ＳＥＭ、ｎ＝６を表す。 合成ｓｇＲＮＡのＴ細胞へのヌクレオフェクション後の増殖アッセイからの結果を示す図である。２つの異なるドナー由来の刺激Ｔ細胞を０日目にヌクレオフェクションし、細胞増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイを用いてモニターした。反復実験のＳＥＭは、明快にするために表示されていないが、全て、示された値の１５％未満である。 刺激されていないＴ細胞におけるＣＣＲ５破壊を示す図である。３つの異なるドナー由来の刺激されていないヒトＴ細胞に、単離の日において、ＭＳ ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡをヌクレオフェクションした。ヌクレオフェクションから３日後、ｇＤＮＡを抽出し、イン／デル頻度を、参照対照としてｍｏｃｋ処理された試料を用いるＴＩＤＥにより測定した。バーは平均＋ＳＥＭ、ｎ＝２を表す。 ＩＬ２ＲＧおよびＨＢＢについての動員化ＰＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるイン／デル頻度を示す図である。ＣＤ３４＋ＨＳＰＣのヌクレオフェクションから３日後、ゲノムＤＮＡを抽出し、イン／デル頻度をＴ７アッセイにより測定した。ＩＬ２ＲＧおよびＨＢＢのそれぞれについての３つの生物学的反復実験の１つの代表的なゲルが示されている。＋ＳＥＭ、ｎ＝２。 ２つのｓｇＲＮＡを用いた、ヒト初代Ｔ細胞およびＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおける高いＣＣＲ５遺伝子改変頻度を示す図である。３つの異なるドナー由来の刺激Ｔ細胞およびＰＢ動員化ＣＤ３４＋ＨＳＰＣに、「Ｄ」 ｓｇＲＮＡと「Ｑ」 ｓｇＲＮＡの両方をＣａｓ９ ｍＲＮＡと共に３連でヌクレオフェクションした。ヌクレオフェクションから３日後、ｇＤＮＡを抽出し、ＣＣＲ５の改変された領域を、非改変対立遺伝子についての２．１ｋｂアンプリコンを生じるプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した（図１８Ａ）。ＰＣＲアンプリコンを、形質転換用のプラスミドへサブクローニングし、個々の対立遺伝子を表す個々のコロニーをシーケンシングし、予想されたゲノム配列に対して照合し、対立遺伝子ジェノタイプに従って分類した（図１８Ｂ）。 ＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおいて、ＭＳ修飾型ｓｇＲＮＡが、非修飾型ｓｇＲＮＡより優れた機能を果たすことを示す図である。ＣＤ３４＋ＨＳＰＣに、２．５モル過剰の示された合成ＨＢＢ ｓｇＲＮＡと複合体化した３０μｇ Ｃａｓ９タンパク質をヌクレオフェクションした。インデル頻度を、ヌクレオフェクションから４日後、ＴＩＤＥ分析により測定した。バーは、３つの異なるドナーについての平均インデル頻度＋ＳＥＭ、ｎ＝３を表す。＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。 修飾型ｓｇＲＮＡが、効率的な多重化ゲノム編集に用いられ得ることを示す図である。１００万個のＫ５６２細胞に、１５μｇ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよび５μｇの、ＣＣＲ５か、ＨＢＢか、またはＩＬ２ＲＧのいずれかのＭＳ修飾型ｓｇＲＮＡ、または３つ全てのｓｇＲＮＡ（多重化）（３×５μｇ）をヌクレオフェクションした。インデル頻度を、ヌクレオフェクションから３日後、その３つの遺伝子座のそれぞれにおいてＴＩＤＥ分析により測定した。バーは、平均インデル頻度＋ＳＥＭ、ｎ＝３を表す。＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ．ｓ．＝ｐ≧０．０５、スチューデントｔ検定。 化学修飾型ＣＣＲ５ ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、およびＣＣＲ５ ｓｓＯＤＮを用いた相同組換え後のＣＣＲ５標的部位に及ぶＰＣＲ産物を示す図である。
Ｉ．序論
インビトロ細胞（例えば、エクスビボ治療用の初代細胞）またはインビボ細胞（例えば、ヒトなどの対象の器官または組織における細胞）においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに基づいた、ゲノム編集および／または遺伝子発現のモジュレーションのための方法が本明細書に提供される。特に、本明細書に提供される方法は、対応する非修飾型ｓｇＲＮＡと比較して、遺伝子調節（例えば、ゲノム編集、遺伝子発現の阻害、および遺伝子発現の活性化）中、増強した活性を有する化学修飾型単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を利用する。ある特定の態様において、本発明は、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片か、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするｍＲＮＡか、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターかのいずれかと共に、標的核酸とハイブリダイズする化学修飾型ｓｇＲＮＡを導入することによる、細胞における標的核酸の遺伝子調節のための方法を提供する。ある特定の他の態様において、本発明は、疾患に関連した遺伝子変異を正すのに十分な量の化学修飾型ｓｇＲＮＡを投与することにより、対象において遺伝的疾患を予防または処置するための方法を提供する。
ＩＩ．一般
本発明の実施は、他に指示がない限り、当業者の能力の範囲内にある、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノム科学、および組換えＤＮＡの通常の技術を用いる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．， （１９８７））、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）： ＰＣＲ ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｍ． Ｊ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｂ． Ｄ． Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ． Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ． （１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， ｅｄｓ． （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ （Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ． （１９８７））参照。
市販されていないオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒ ｅｔ． ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：６１５９−６１６８ （１９８４）に記載されているように、自動合成機を用いて、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２２：１８５９−１８６２ （１９８１）により初めて記載された固相ホスホラミダイトトリエステル方法に従って、化学合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、任意の当技術分野において認められた戦略、例えば、非変性アクリルアミドゲル電気泳動、またはＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｒｅａｎｉｅｒ， Ｊ． Ｃｈｒｏｍ． ２５５： １３７−１４９ （１９８３）に記載されているように陰イオン交換高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いて実施される。
ＩＩＩ．定義
具体的に他に指示がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。加えて、本明細書に記載された方法または材料と類似した、または等価の任意の方法または材料を、本発明の実施に用いることができる。本発明のために、以下の用語が定義される。
本明細書で用いられる場合、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、または「その（ｔｈｅ）」は、１つのメンバーに関する態様を含むだけでなく、１つより多いメンバーに関する態様も含む。例えば、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他に規定しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「１つの細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「その作用物質」への言及は、当業者に知られた１つまたは複数の作用物質への言及を含むなどである。
用語「初代細胞」は、多細胞生物体から直接、単離された細胞を指す。初代細胞は、典型的には、集団倍加をほとんど起こしておらず、それゆえに、連続（腫瘍または人工的不死化）細胞株と比較して、それらが由来する組織の主要な機能性成分をより顕著に表している。ある場合には、初代細胞は、単離されている細胞であり、その後、すぐに用いられる。他の場合では、初代細胞は、無制限に***することができず、それゆえに、インビトロで長期間、培養することができない。
用語「ゲノム編集」は、１つまたは複数のヌクレアーゼおよび／またはニッカーゼを用いて、ＤＮＡが、標的ＤＮＡ、例えば、細胞のゲノムから挿入、置換、または除去される一種の遺伝子操作を指す。ヌクレアーゼは、ゲノムにおいて所望の位置に、特異的な二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせ、細胞の内因性機構を利用して、相同組換え修復（ＨＤＲ）（例えば、相同組換え）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により、引き起こされた切断を修復する。ニッカーゼは、ゲノムにおいて所望の位置に特異的な一本鎖切断を生じさせる。１つの非限定的例において、２つのニッカーゼは、標的ＤＮＡの向かい合わせのストランドに２個の一本鎖切断を生じさせるために用いることができ、それにより、平滑または突出末端を生み出す。標的ＤＮＡ配列のゲノム編集を誘導するために任意の適切なヌクレアーゼを導入することができ、それらには、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、他のエンド−またはエキソ−ヌクレアーゼ、それらのバリアント、それらの断片、およびそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。特定の実施形態において、標的ＤＮＡ配列のヌクレアーゼ媒介性ゲノム編集は、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）による正確なゲノム編集の効率を向上させるために、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはＣａｓ９ ｍＲＮＡ）と組み合わせて、本明細書に記載された修飾型単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を用いて、「誘導」または「モジュレート」（例えば、増強）することができる。
用語「相同組換え修復」または「ＨＤＲ」は、修復を導くための相同鋳型を用いて、二本鎖ＤＮＡ切断を精密かつ正確に修復する、細胞における機構を指す。ＨＤＲの最も一般的な形は、相同組換え（ＨＲ）（ヌクレオチド配列が、２つの類似した、または同一のＤＮＡ分子の間で交換される一種の遺伝的組換え）である。
用語「非相同末端結合」または「ＮＨＥＪ」は、相同鋳型の必要性なしに、切断末端が直接的にライゲーションされる、二本鎖ＤＮＡ切断を修復する経路を指す。
用語「核酸」、「ヌクレオチド」、または「ポリヌクレオチド」は、一本鎖、二本鎖、または多重鎖のいずれかの形での、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、およびそれらのポリマーを指す。その用語には、一本鎖、二本鎖、もしくは多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリン塩基および／もしくはピリミジン塩基、もしくは他の天然、化学修飾型、生化学的修飾型、非天然、合成、もしくは誘導体化のヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの類似体の混合物を含み得る。具体的に限定されない限り、その用語は、参照核酸と類似した結合性質を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドと類似した様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。他に指示がない限り、特定の核酸配列はまた、明確に示された配列に加えて、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、一塩基多型（ＳＮＰ）、および相補的配列を暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１個または複数の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基と置換されている配列を生じさせることにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９：５０８１ （１９９１）； Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：２６０５−２６０８ （１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８ （１９９４））。核酸という用語は、遺伝子、遺伝子によってコードされるｃＤＮＡ、およびｍＲＮＡと交換可能に用いられる。
用語「ヌクレオチド類似体」または「修飾型ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの窒素塩基（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ）、アデニン（Ａ）、またはグアニン（Ｇ））の中もしくは上に、ヌクレオシドの糖部分（例えば、リボース、デオキシリボース、修飾型リボース、修飾型デオキシリボース、６員環糖類似体、または鎖式糖類似体）の中もしくは上に、またはホスフェートの中もしくは上に、１つまたは複数の化学修飾（例えば、置換）を含有するヌクレオチドを指す。
用語「遺伝子」または「ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列」は、ポリペプチド鎖を産生するのに関与するＤＮＡのセグメントを意味する。ＤＮＡセグメントは、遺伝子産物の転写／翻訳、および転写／翻訳の調節に関与する、コード領域の前および後の領域（リーダーおよびトレイラー）、加えて、個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含み得る。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すのに、本明細書で交換可能に用いられる。その用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに加えて、１個または複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書で用いられる場合、その用語は、アミノ酸残基が共有結合性ペプチド結合によって連結されている、完全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。
用語「バリアント」は、天然に存在するものから逸脱する、生物体、菌株、遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または特性の一形態を指す。
用語「相補性」は、核酸が、伝統的なワトソン・クリック型かまたは他の非伝統的型のいずれかにより、別の核酸配列と水素結合を形成する能力を指す。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合を形成することができる（例えば、ワトソン・クリック塩基対形成）、核酸分子における残基のパーセンテージを示す（例えば、１０個のうちの５個、６個、７個、８個、９個、１０個は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補性である）。「完全に相補的な」とは、核酸配列の全ての連続した残基が、第２の核酸配列における連続した残基の同じ数と水素結合するだろうことを意味する。本明細書で用いられる場合、「実質的に相補的な」とは、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、もしくはそれ以上のヌクレオチドの領域に関して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％である相補性の程度を指し、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。
ハイブリダイゼーションについての用語「ストリンジェントな条件」とは、標的配列と相補性を有する核酸が、主にその標的配列とハイブリダイズし、かつ非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない、条件を指す。ストリンジェントな条件は、一般的に、配列依存性であり、いくつかの因子によって変わる。一般的に、配列が長ければ長いほど、その配列がそれの標的配列と特異的にハイブリダイズする温度は高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ （１９９３）， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ １， Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．に詳細に記載されている。
用語「ハイブリダイゼーション」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定化している複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対形成、フーグスティーン結合により、または任意の他の配列特異的様式で、生じ得る。その複合体は、二重鎖構造を形成する２本のストランド、多重鎖複合体を形成する３本以上のストランド、単一の自己ハイブリッド形成ストランド、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
「組換え発現ベクター」は、宿主細胞において特定のポリヌクレオチド配列の転写を可能にする一連の特定化された核酸エレメントを含む、組換え的に、または合成的に作製された核酸構築物である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスゲノム、または核酸断片の部分であり得る。典型的には、発現ベクターは、プロモーターへ作動可能に連結された、転写されるべきポリヌクレオチドを含む。この文脈における「作動可能に連結された」とは、プロモーターがコード配列の転写を命令するように、エレメントの適切な生物学的機能を可能にする相対的位置に置かれた、ポリヌクレオチドコード配列およびプロモーターなどの、２つ以上の遺伝的エレメントを意味する。用語「プロモーター」は、核酸の転写を命令する核酸制御配列のアレイを指すように、本明細書で用いられる。本明細書で用いられる場合、プロモーターは、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合のＴＡＴＡエレメントなど、転写開始部位の近くに必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた、任意で、転写開始部位から数千塩基対ほどの所に位置することができる遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含む。発現ベクターに存在し得る他のエレメントには、転写を増強するエレメント（例えば、エンハンサー）、および転写を終結するエレメント（例えば、ターミネーター）、ならびに発現ベクターから産生された組換えタンパク質にある特定の結合親和性または抗原性を与えるエレメントが挙げられる。
「組換え」とは、遺伝子改変されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、細胞、組織、または生物体を指す。例えば、組換えポリヌクレオチド（または組換えポリヌクレオチドのコピーもしくは相補体）は、よく知られた方法を用いて操作されているものである。第２のポリヌクレオチド（例えば、コード配列）へ作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットは、ヒトの操作（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅｓ １−３， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． （１９９４−１９９８）に記載された方法による）の結果として、第２のポリヌクレオチドに対して異種性であるプロモーターを含み得る。組換え発現カセット（または発現ベクター）は、典型的には、天然で見出されない組合せでポリヌクレオチドを含む。例えば、ヒトが操作した制限部位またはプラスミドベクター配列は、他の配列由来のプロモーターに隣接し、または離れることができる。組換えタンパク質は、組換えポリヌクレオチドから発現するものであり、組換え細胞、組織、および生物体は、組換え配列（ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド）を含むものである。
用語「一塩基多型」または「ＳＮＰ」は、対立遺伝子内を含む、ポリヌクレオチドに関して、単一ヌクレオチドの変化を指す。これは、１個のヌクレオチドの別のヌクレオチドによる置換、および単一ヌクレオチドの欠失または挿入を含み得る。最も典型的には、ＳＮＰは、２対立遺伝子のマーカーであるが、３対立遺伝子および４対立遺伝子のマーカーもまた存在し得る。非限定的例として、ＳＮＰ Ａ＼Ｃを含む核酸分子は、多型の位置にＣまたはＡを含み得る。
細胞培養自体または培養の過程に言及する場合の用語「培養する」、「培養すること」、「成長する」、「成長すること」、「維持する」、「維持すること」、「増殖する」、「増殖すること」などは、細胞（例えば、初代細胞）が、制御された条件下、例えば、生存に適した条件下で、それの通常の環境の外側で維持されることを意味するように、交換可能に用いることができる。培養された細胞は、生存することが可能になり、培養の結果として、細胞成長、静止、分化、または***を生じ得る。その用語は、一部の細胞は、自然に、死、または老化し得るため、培養中の全ての細胞が、生存し、成長し、または***することを含意するわけではない。細胞は、典型的には、培地中で培養され、その培地は、培養の経過中に交換することができる。
用語「対象」、「患者」、および「個体」は、ヒトまたは動物を含むように、本明細書で交換可能に用いられる。例えば、動物対象は、哺乳類、霊長類（例えば、サル）、家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、またはヤギ）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、トリ）、獣医学的意義のある動物、または経済的意義のある動物であり得る。
本明細書で用いられる場合、用語「投与すること」には、対象への経口投与、局所的接触、坐剤としての投与、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内、髄腔内、鼻腔内、または皮下の投与が挙げられる。投与は、非経口および経粘膜（例えば、頬側、舌下、口蓋、歯肉、鼻、膣、直腸、または経皮）を含む任意の経路による。非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、および頭蓋内が挙げられる。送達の他の様式には、リポソーム製剤の使用、静脈内注入、経皮パッチなどが挙げられるが、それらに限定されない。
用語「処置すること」は、非限定的に治療的利益および／または予防的利益を含む、有益な、または所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療的利益とは、処置の下での、１つまたは複数の疾患、状態、または症状における任意の治療的に関連した向上または効果を意味する。予防的利益について、疾患、状態、もしくは症状がまだ顕在化されていないかもしれないが、特定の疾患、状態、もしくは症状を発生するリスクがある対象に、または疾患の生理的症状の１つもしくは複数を報告している対象に，組成物が投与され得る。
用語「有効量」または「十分な量」は、有益な、または所望の結果をもたらすのに十分である作用物質（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、修飾型単一ガイドＲＮＡなど）の量を指す。治療的有効量は、処置されている対象および疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与の様式などの１つまたは複数に依存して変わり得、それは、当業者により容易に決定することができる。特定の量は、選択された特定の作用物質、標的細胞型、対象における標的細胞の位置、従われるべき投与計画、それが他の作用物質と併用して投与されるかどうか、投与のタイミング、およびそれが運ばれる物理的送達系の１つまたは複数に依存して変わり得る。
用語「薬学的に許容される担体」は、作用物質（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、修飾型単一ガイドＲＮＡなど）の細胞、生物体、または対象への投与を助ける物質を指す。「薬学的に許容される担体」は、組成物または製剤に含まれ得、かつ患者に有意に有害な毒性学的効果を引き起こさない担体または賦形剤を指す。薬学的に許容される担体の非限定的例には、水、ＮａＣｌ、生理食塩水、乳酸リンゲル液、規定のスクロース、規定のグルコース、結合剤、増量剤、崩壊剤、潤滑剤、コーティング剤、甘味剤、香料および着色剤などが挙げられる。他の薬学的担体が本発明において有用であることを当業者は認識しているだろう。
ＣＲＩＳＰＲシステムの成分に関しての用語「安定性を増加させること」は、ＣＲＩＳＰＲシステムの任意の分子成分の構造を安定化させる修飾を指す。その用語は、ＣＲＩＳＰＲシステムの任意の分子成分の分解を減少、阻害、減弱、または低下させる修飾を含む。
ＣＲＩＳＰＲシステムの成分に関しての用語「特異性を増加させること」は、ＣＲＩＳＰＲシステムの任意の分子成分の特異性活性（例えば、オンターゲット活性）を増加させる修飾を指す。その用語は、ＣＲＩＳＰＲシステムの任意の分子成分の非特異性活性（例えば、オフターゲット活性）を減少、阻害、減弱、または低下させる修飾を含む。
ＣＲＩＳＰＲシステムの成分に関しての用語「毒性を減少させること」は、ＣＲＩＳＰＲシステムの任意の分子成分の細胞、生物体、対象などへの毒性効果を減少、阻害、減弱、または低下させる修飾を指す。
ＣＲＩＳＰＲシステムの成分に関し、遺伝子調節の文脈における用語「増強した活性」は、ゲノム編集および／または遺伝子発現を誘導、モジュレート、調節、または制御する効率および／または頻度の増加または向上を指す。
表示数値に関しての用語「約」は、その値から１０％をプラスまたはマイナスした値の範囲を含み得る。例えば、量「約１０」は、９、１０、および１１の表示数を含む、９から１１までの量を含む。表示数値に関しての用語「約」はまた、その値から１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％をプラスまたはマイナスした値の範囲を含み得る。
ＩＶ．実施形態の説明
本発明は、細胞において標的核酸の遺伝子調節を誘導するための方法を提供する。本発明は、（例えば、エクスビボ治療用にインビトロで培養された）初代細胞において、または（例えば、インビボ治療用の）ヒトなどの対象内の細胞において、標的核酸のゲノム編集および／または遺伝子発現の阻害もしくは活性化を増強する修飾型単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を用いることを含む。本発明はまた、疾患に関連した標的遺伝子における変異を正すための正確なゲノム編集を増強することによる、対象において疾患を予防または処置するための方法を提供する。本発明は、ヌクレアーゼ媒介性ゲノム編集技術を受け入れられる、いかなる細胞型に関しても、かついかなる遺伝子座においても用いることができる。
第１の態様において、本発明は、初代細胞において標的核酸の遺伝子調節を誘導する（例えば、惹起する、モジュレートする、増強するなど）ための方法であって、
（ａ）標的核酸に相補的な第１のヌクレオチド配列、およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列を含む修飾型単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、前記第１のヌクレオチド配列および／または前記第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの１個または複数が修飾型ヌクレオチドである、修飾型単一ガイドＲＮＡ；ならびに
（ｂ）Ｃａｓポリペプチド、ＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、および／またはＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター
を初代細胞へ導入するステップ
を含み、
前記修飾型ｓｇＲＮＡがＣａｓポリペプチドを標的核酸へ導き、
前記修飾型ｓｇＲＮＡが、対応する非修飾型ｓｇＲＮＡと比較して増強した活性で標的核酸の遺伝子調節を誘導する、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、増強した活性は、修飾型ｓｇＲＮＡの増加した安定性および／または修飾型ｓｇＲＮＡの標的核酸に対する増加した特異性を含む。
いくつかの実施形態において、標的核酸は、標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡを含む。標的核酸の遺伝子調節は、標的核酸による特定の遺伝子産物（例えば、タンパク質またはＲＮＡ）の産生を増加または減少させ得る、細胞により用いられる任意の機構を包含し、標的核酸のゲノム編集、または標的核酸の遺伝子発現のモジュレーション（例えば、阻害または活性化）を含む。ある例では、遺伝子調節は、標的ＤＮＡのゲノム編集を含む。ゲノム編集は、標的ＤＮＡの相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）であり得る。他の例では、遺伝子調節は、標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡの遺伝子発現を、エンドヌクレアーゼ欠損Ｃａｓポリペプチドを用いてモジュレートすること（例えば、阻害すること、または活性化すること）を含む。
いくつかの実施形態において、方法は、組換えドナー修復鋳型を初代細胞へ導入することをさらに含む。ある特定の例では、組換えドナー修復鋳型は、標的ＤＮＡの２つの重複しない相同部分を含む２つのヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、ゲノム編集を受ける標的ＤＮＡに対応するヌクレオチド配列の５’末端および３’末端に位置する。他の例では、組換えドナー修復鋳型は、一塩基多型（ＳＮＰ）を正すための変異をコードするヌクレオチド配列を含む合成の一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）鋳型、および標的ＤＮＡの２つの重複しない相同部分を含む２つのヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、変異をコードするヌクレオチド配列の５’末端および３’末端に位置する。
いくつかの実施形態において、初代細胞は、修飾型ｓｇＲＮＡおよびＣａｓポリペプチドを初代細胞へ導入する前に、多細胞生物体から単離される。多細胞生物体は、植物、多細胞原生生物、多細胞真菌、または哺乳類（例えば、ヒト）などの動物であり得る。ある特定の例では、初代細胞は、幹細胞、免疫細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択される。幹細胞の非限定的例には、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣなどの造血幹細胞・造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）、間葉幹細胞、神経幹細胞、臓器幹細胞、およびそれらの組合せが挙げられる。免疫細胞の非限定的例には、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬｓ）、メモリーＴ細胞、メモリーＴ幹細胞、エフェクターＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞、単球、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、およびそれらの組合せが挙げられる。他の実施形態において、修飾型ｓｇＲＮＡおよびＣａｓポリペプチドを初代細胞へ導入した後に、初代細胞またはその子孫（例えば、初代細胞に由来した細胞）が多細胞生物体（例えば、ヒト）へ戻される（例えば、任意の許容される送達系および送達経路によって投与される）。
いくつかの実施形態において、初代細胞は、初代細胞集団を含む。ある例では、修飾型ｓｇＲＮＡが、初代細胞集団の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％において標的核酸の遺伝子調節を誘導する。他の例では、初代細胞集団は、少なくとも約１０個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、または１０９個の初代細胞を含む。ある特定の例では、遺伝子調節は、初代細胞集団における標的ＤＮＡのゲノム編集（例えば、ＨＤＲまたはＮＨＥＪ）を含む。ある特定の他の例では、遺伝子調節は、エンドヌクレアーゼ欠損Ｃａｓポリペプチドを用いた、初代細胞集団において標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡの遺伝子発現をモジュレートすること（例えば、阻害すること、または活性化すること）を含む。非限定的例として、修飾型ｓｇＲＮＡは、（例えば、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体としての）ＣａｓポリペプチドまたはＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡと共に、初代Ｔ細胞へ修飾型ｓｇＲＮＡを導入した後、初代Ｔ細胞集団の少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または６０％においてＨＤＲ（例えば、イン／デル頻度）を誘導することができる。別の非限定的例として、修飾型ｓｇＲＮＡは、（例えば、ＲＮＰ複合体としての）ＣａｓポリペプチドまたはＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡと共に、初代造血幹細胞・造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）へ修飾型ｓｇＲＮＡを導入した後、初代造血幹細胞・造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）集団の少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または６０％においてＨＤＲ（例えば、イン／デル頻度）を誘導することができる。
いくつかの実施形態において、修飾型ｓｇＲＮＡの第１のヌクレオチド配列および／または第２のヌクレオチド配列における１個または複数の修飾型ヌクレオチドは、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはそれらの組合せにおける修飾を含む。リボース基における修飾は、リボース基の２’位における修飾であり得る。ある例では、リボース基の２’位における修飾は、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−デオキシ、および２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）からなる群から選択される。リン酸基における修飾は、ホスホロチオエート修飾であり得る。
特定の実施形態において、修飾型ｓｇＲＮＡの第１のヌクレオチド配列および／または第２のヌクレオチド配列における１個または複数の修飾型ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル３’−ホスホロチオエート（ＭＳ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル３’−チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）ヌクレオチド、またはそれらの組合せを含む。ある場合では、修飾型ｓｇＲＮＡは、第１のヌクレオチド配列および／または第２のヌクレオチド配列において１個または複数のＭＳヌクレオチドを含む。ある場合では、修飾型ｓｇＲＮＡは、第１のヌクレオチド配列および／または第２のヌクレオチド配列において１個または複数のＭＳＰヌクレオチドを含む。ある場合では、修飾型ｓｇＲＮＡは、第１のヌクレオチド配列および／または第２のヌクレオチド配列において、１個または複数のＭＳヌクレオチドおよび１個または複数のＭＳＰヌクレオチドを含む。ある場合では、修飾型ｓｇＲＮＡは、第１のヌクレオチド配列および／または第２のヌクレオチド配列においてＭヌクレオチドを含まない。ある場合では、修飾型ｓｇＲＮＡは、第１のヌクレオチド配列および／または第２のヌクレオチド配列において、修飾型ヌクレオチドとしてＭＳヌクレオチドおよび／またはＭＳＰヌクレオチドだけを含む。他の場合では、修飾型ｓｇＲＮＡは、第１のヌクレオチド配列および／または第２のヌクレオチド配列において、１個もしくは複数のＭＳヌクレオチドおよび／または１個もしくは複数のＭＳＰヌクレオチドを含み、第１のヌクレオチド配列および／または第２のヌクレオチド配列において、１個または複数のＭヌクレオチドをさらに含み得る。
いくつかの実施形態において、修飾型ｓｇＲＮＡの第１のヌクレオチド配列は、約２０ヌクレオチド長である。ある例では、第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上が、修飾型ヌクレオチドである。ある特定の例では、第１のヌクレオチド配列（例えば、約２０ヌクレオチド長の第１のヌクレオチド配列）におけるヌクレオチドの約２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個が修飾型ヌクレオチドである。他の例では、第１のヌクレオチド配列（例えば、約２０ヌクレオチド長の第１のヌクレオチド配列）におけるヌクレオチドの全部が修飾型ヌクレオチドである。ある例では、修飾型ヌクレオチドは、第１のヌクレオチド配列の５’末端（例えば、５’末端の終端ヌクレオチド）に、もしくは５’末端の近く（例えば、５’末端の終端ヌクレオチドから１、２、３、４、または５ヌクレオチド内）に、および／または第１のヌクレオチド配列内の内部の位置に、位置する。他の例では、第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの約１０％から約３０％までが修飾型ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、修飾型ｓｇＲＮＡの第２のヌクレオチド配列は、約８０ヌクレオチド長である。ある例では、第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上が、修飾型ヌクレオチドである。ある特定の例では、第２のヌクレオチド配列（例えば、約８０ヌクレオチド長の第２のヌクレオチド配列）におけるヌクレオチドの約２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、または８０個が修飾型ヌクレオチドである。他の例では、第２のヌクレオチド配列（例えば、約８０ヌクレオチド長の第２のヌクレオチド配列）におけるヌクレオチドの全部が修飾型ヌクレオチドである。ある例では、修飾型ヌクレオチドは、第２のヌクレオチド配列の３’末端（例えば、３’末端の終端ヌクレオチド）に、もしくは３’末端の近く（例えば、３’末端から１、２、３、４、または５ヌクレオチド内）に、および／または第２のヌクレオチド配列内の内部の位置に、位置する。他の例では、第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの約１％から約１０％までが修飾型ヌクレオチドである。
ある特定の実施形態において、修飾型ｓｇＲＮＡは、第１のヌクレオチド配列の５’末端（例えば、５’末端の終端ヌクレオチド）から、または５’末端の近く（例えば、５’末端の終端ヌクレオチドから１、２、３、４、または５ヌクレオチド内）から始まる１個、２個、または３個の連続した、または非連続の修飾型ヌクレオチド、および第２のヌクレオチド配列の３’末端（例えば、３’末端の終端ヌクレオチド）から、または３’末端の近く（例えば、３’末端から１、２、３、４、または５ヌクレオチド内）から始まる１個、２個、または３個の連続した、または非連続の修飾型ヌクレオチドを含む。
ある例では、修飾型ｓｇＲＮＡは、第１のヌクレオチド配列の５’末端（例えば、５’末端の終端ヌクレオチド）に、または５’末端の近く（例えば、５’末端の終端ヌクレオチドから１、２、３、４、または５ヌクレオチド内）に１個の修飾型ヌクレオチド、および第２のヌクレオチド配列の３’末端（例えば、３’末端の終端ヌクレオチド）に、または３’末端の近く（例えば、３’末端から１、２、３、４、または５ヌクレオチド内）に１個の修飾型ヌクレオチドを含む。
他の例では、修飾型ｓｇＲＮＡは、第１のヌクレオチド配列の５’末端（例えば、５’末端の終端ヌクレオチド）から、または５’末端の近く（例えば、５’末端の終端ヌクレオチドから１、２、３、４、または５ヌクレオチド内）から始まる２個の連続した、または非連続の修飾型ヌクレオチド、および第２のヌクレオチド配列の３’末端（例えば、３’末端の終端ヌクレオチド）から、または３’末端の近く（例えば、３’末端から１、２、３、４、または５ヌクレオチド内）から始まる２個の連続した、または非連続の修飾型ヌクレオチドを含む。
さらに他の例では、修飾型ｓｇＲＮＡは、第１のヌクレオチド配列の５’末端（例えば、５’末端の終端ヌクレオチド）から、または５’末端の近く（例えば、５’末端の終端ヌクレオチドから１、２、３、４、または５ヌクレオチド内）から始まる３個の連続した、または非連続の修飾型ヌクレオチド、および第２のヌクレオチド配列の３’末端（例えば、３’末端の終端ヌクレオチド）から、または３’末端の近く（例えば、３’末端から１、２、３、４、または５ヌクレオチド内）から始まる３個の連続した、または非連続の修飾型ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態において、修飾型ｓｇＲＮＡは、第１のヌクレオチド配列の５’末端に３個の連続した修飾型ヌクレオチド、および第２のヌクレオチド配列の３’末端に３個の連続した修飾型ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、修飾型ｓｇＲＮＡは化学合成される。他の実施形態において、遺伝子調節を誘導するための方法は、複数の修飾型ｓｇＲＮＡを用いて、単一の標的核酸配列または異なる標的核酸配列の多重化遺伝子調節（例えば、ゲノム編集または遺伝子発現をモジュレートすること）を含む。特定の実施形態において、多重化遺伝子調節は、対応する非修飾型ｓｇＲＮＡの使用と比較して、より効率性および／または一貫性が高い。ある特定の例では、複数の修飾型ｓｇＲＮＡは、少なくとも２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、またはそれ以上の異なる修飾型ｓｇＲＮＡを含み、各修飾型ｓｇＲＮＡが、異なる標的核酸に方向づけられている。他の例では、複数の修飾型ｓｇＲＮＡは、少なくとも２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、またはそれ以上の異なる修飾型ｓｇＲＮＡを含み、各修飾型ｓｇＲＮＡが、同じ標的核酸に方向づけられている。
ある特定の実施形態において、Ｃａｓポリペプチドは、ＣａｓポリペプチドバリアントまたはＣａｓポリペプチド断片である。特定の実施形態において、ＣａｓポリペプチドはＣａｓ９ポリペプチド、そのバリアント、またはその断片である。他の実施形態において、初代細胞へ導入するステップは、初代細胞を（例えば、ヌクレオフェクションによって）エレクトロポレーションすることを含む。
第２の態様において、本発明は、対象において遺伝的疾患を予防または処置するための方法であって、
遺伝的疾患に関連した標的遺伝子における変異を正すのに十分な量で修飾型単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を対象に投与するステップであって、前記修飾型ｓｇＲＮＡが、標的遺伝子に相補的な第１のヌクレオチド配列、およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列を含み、かつ前記第１のヌクレオチド配列および／または前記第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの１個または複数が修飾型ヌクレオチドである、ステップ
を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、遺伝的疾患は、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症、鎌状赤血球貧血、サラセミア、血友病、腫瘍症、癌、加齢黄斑変性、統合失調症、トリヌクレオチドリピート障害、脆弱Ｘ症候群、プリオン関連障害、筋萎縮性側索硬化症、薬物依存、自閉症、アルツハイマー病、パーキンソン病、嚢胞性線維症、血液凝固性疾患または障害、炎症、免疫関連疾患または障害、代謝性疾患、肝臓疾患および障害、腎臓疾患および障害、筋肉／骨格疾患および障害、神経学的および神経細胞の疾患および障害、心血管疾患および障害、肺疾患および障害、眼疾患および障害、ならびにウイルス感染症（例えば、ＨＩＶ感染症）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、方法は、Ｃａｓポリペプチド、ＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、および／またはＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを対象に投与するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態において、方法は、対象に組換えドナー修復鋳型を投与するステップをさらに含む。ある特定の例では、組換えドナー修復鋳型は、標的遺伝子の２つの重複しない相同部分を含む２つのヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、ゲノム編集を受ける標的遺伝子に対応するヌクレオチド配列の５’末端および３’末端に位置する。他の例では、組換えドナー修復鋳型は、標的遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）を正すための変異をコードするヌクレオチド配列を含む合成の一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）鋳型、および標的遺伝子の２つの重複しない相同部分を含む２つのヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、前記変異をコードするヌクレオチド配列の５’末端および３’末端に位置する。
ある特定の実施形態において、修飾型ｓｇＲＮＡを投与することは、対応する非修飾型ｓｇＲＮＡを投与することと比較して、標的遺伝子における変異を正すＣａｓポリペプチドの効果を増強する。対象において遺伝的疾患を予防または処置するための方法に用いられる修飾型ｓｇＲＮＡに関連した非限定的実施形態は、上に記載されている。
いくつかの実施形態において、修飾型ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓポリペプチド、および／または組換えドナー修復鋳型は、薬学的に許容される担体と共に対象に投与される。
いくつかの実施形態において、修飾型ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓポリペプチド、および／または組換えドナー修復鋳型は、ナノ粒子、リポソーム、ミセル、ビロソーム、核酸複合体、およびそれらの組合せからなる群から選択される送達系によって対象へ投与される。ある特定の例では、核酸複合体は、Ｃａｓポリペプチドと複合体化した修飾型ｓｇＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、修飾型ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓポリペプチド、および／または組換えドナー修復鋳型は、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、皮下、細動脈内、脳室内、頭蓋内、病巣内、髄腔内、局所的、経粘膜、鼻腔内、およびそれらの組合せからなる群から選択される送達経路によって対象へ投与される。
本明細書に記載された化学修飾型ｓｇＲＮＡは、任意のＣＲＩＳＰＲ関連技術に関して用いることができ、そのＣＲＩＳＰＲ関連技術には、遺伝子発現の阻害のためのＣＲＩＳＰＲｉ、遺伝子発現の活性化のためのＣＲＩＳＰＲａ、ゲノム遺伝子座の動的可視化のためのＣＲＩＳＰＲ画像化ツール、ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介性ＲＮＡ認識および切断が挙げられるが、それらに限定されない。ある場合では、ｓｇＲＮＡは、小さい分子またはタンパク質の、画像化、および／またはインビトロ細胞もしくはインビボ細胞への送達のために用いることができる。したがって、ｓｇＲＮＡは、研究および治療的適用に用いられ得る。
Ａ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
ゲノム改変のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）またはそのバリアントもしくは断片、Ｃａｓヌクレアーゼを標的ゲノムＤＮＡへ向けるガイド配列およびＣａｓヌクレアーゼと相互作用するスキャフォールド配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含有するＤＮＡターゲティングＲＮＡ（例えば、修飾型ｓｇＲＮＡ）、ならびに任意で、ドナー修復鋳型を含む。ある例では、変異Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｄ８３９Ａ、およびＨ８６３Ａの１つまたは複数を含有するＣａｓ９変異体などのＣａｓヌクレアーゼのバリアント、またはＣａｓ９ニッカーゼを用いることができる。他の例では、所望の性質（例えば、一本鎖もしくは二本鎖切断を生じ、および／または遺伝子発現をモジュレートする能力がある）をもつＣａｓヌクレアーゼまたはそのバリアントの断片を用いることができる。ドナー修復鋳型は、蛍光タンパク質または抗生物質耐性マーカーなどのレポーターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および標的ＤＮＡと相同であり、かつ遺伝子改変の部位に隣接する相同アームを含み得る。あるいは、ドナー修復鋳型は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であり得る。
１．Ｃａｓヌクレアーゼおよびそのバリアント
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ））／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）ヌクレアーゼシステムは、ゲノム操作のために用いることができる、細菌システムに基づいた人工ヌクレアーゼシステムである。それは、多くの細菌および古細菌の適応免疫応答の部分に基づいている。ウイルスまたはプラスミドが細菌に侵入した時、侵入者のＤＮＡのセグメントが、「免疫」応答によりＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）へ変換される。その後、ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる別の型のＲＮＡと部分的相補性の領域を通して会合して、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼを、「プロトスペーサー」と呼ばれる標的ＤＮＡにおけるｃｒＲＮＡと相同性の領域へ導く。Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡ転写産物内に含有される２０ヌクレオチドガイド配列によって特定化された部位において、前記ＤＮＡを切断して、二本鎖切断点に平滑末端を生じる。Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼは、部位特異的ＤＮＡ認識および切断のためにｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とする。このシステムは、現在、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡが１つの分子（「単一ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」）へ組み合わされ得るように操作されており、単一ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ等価部分は、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼを、任意の所望の配列に向けるように導くために操作することができる（例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３７：８１６−８２１； Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ． （２０１３） ｅＬｉｆｅ， ２：ｅ００４７１； Ｓｅｇａｌ （２０１３） ｅＬｉｆｅ， ２：ｅ００５６３参照）。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、細胞のゲノムにおける所望の標的地点に二本鎖切断を生じ、かつ相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって、誘導された切断を修復する細胞の内因性機構を利用するように操作することができる。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＤＮＡ切断活性を有する。Ｃａｓヌクレアーゼは、標的ＤＮＡ配列における位置において、１つまたは両方の鎖の切断を命令することができる。例えば、Ｃａｓヌクレアーゼは、標的ＤＮＡ配列の一本鎖を切断する、１個または複数の不活性化触媒ドメインを有するニッカーゼであり得る。
Ｃａｓヌクレアーゼの非限定的例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらの相同体、それらのバリアント、それらの断片、それらの変異体、およびそれらの誘導体が挙げられる。Ｃａｓヌクレアーゼの３つの主要な型（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型）、ならびに５個のＩ型、３個のＩＩ型、および２個のＩＩＩ型タンパク質を含む１０個のサブタイプがある（例えば、Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ， ２０１５：４０（１）：５８−６６参照）。ＩＩ型Ｃａｓヌクレアーゼには、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃｓｎ２、およびＣａｓ９が挙げられる。これらのＣａｓヌクレアーゼは当業者に知られている。例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）野生型Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列が、例えば、ＮＢＣＩ参照配列番号ＮＰ＿２６９２１５に示されており、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）野生型Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、ＮＢＣＩ参照配列番号ＷＰ＿０１１６８１４７０に示されている。本発明において有用であるＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、例えば、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号、第２０１４／０３０２５６３号、および第２０１４／０３５６９５９号に開示されている。
Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドは、様々な細菌種に由来し得、その細菌種には、ベイロネラ・アティピカ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ａｔｙｐｉｃａ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、フィリファクター・アロキス（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ）、ソロバクテリウム・ムーレイ（Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｏｒｅｉ）、コプロコッカス・カツス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｔｕｓ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、ペプトニフィラス・デュエルデニ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）、カテニバクテリウム・ミツオカイ（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｔｓｕｏｋａｉ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、スタフィロコッカス・シュードインターメディウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、アシダミノコッカス・インテスティン（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、オルセネラ・ウリ（Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ ｕｌｉ）、オエノコッカス・キタハラエ（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｋｉｔａｈａｒａｅ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、フィネゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）、マイコプラズマ・モービレ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、マイコプラズマ・オビニューモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｏｖｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ・カニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｎｉｓ）、マイコプラズマ・シノビアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ）、ユウバクテリウム・レクターレ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ユウバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種トルクエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｕｂｓｐ． Ｔｏｒｑｕｅｎｓ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、ルミノコッカス・アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ）、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）、アシドサーマス・セルロリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ）、コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、エルシミクロビウム・ミヌタム（Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｍｉｎｕｔｕｍ）、ニトラティフラクター・サルスガイニス（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ）、スファエロカエタ・グロブス（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ）、フィブロバクター・サクシノゲネス亜種サクシノゲネス（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ｓｕｂｓｐ． Ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、カプノサイトファガ・オクラセア（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅａ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、プレボテーラ・ミカンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｉｃａｎｓ）、プレボテーラ・ルミニコーラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ）、フラボバクテリウム・コルムナーレ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、ロドスピリラム・ルブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）、カンジダタス・プニセイスピリルム・マリナム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、ベルミネフロバクター・エイセニアエ（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ）、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ニトロバクター・ハンブルゲンシス（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ）、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ウォリネラ・サクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、キャンピロバクター・ジェジュニ亜種ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ． Ｊｅｊｕｎｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、アシドボラクス・エブレウス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｅｂｒｅｕｓ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、ロゼブリア・インテスティナーリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、パスツレラ・ムルトシダ亜種ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｓｕｂｓｐ． Ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ステレラ・ワズワースエンシス（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）、プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、パラステレラ・エクスクレメンチホミニス（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ）、ウォリネラ・サクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、およびフランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）が挙げられるが、それらに限定されない。
「Ｃａｓ９」は、ＲＮＡガイド型二本鎖ＤＮＡ結合性ヌクレアーゼタンパク質またはニッカーゼタンパク質を指す。野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、異なるＤＮＡ鎖を切断する２つの機能性ドメイン、例えば、ＲｕｖＣおよびＨＮＨを有する。Ｃａｓ９は、両方の機能性ドメインが活性である場合、ゲノムＤＮＡ（標的ＤＮＡ）において二本鎖切断を誘導することができる。Ｃａｓ９酵素は、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユウバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビボーラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スファエロカエタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリルム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パルビバクラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、およびカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群に属する細菌に由来したＣａｓ９タンパク質の１個または複数の触媒ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、２個の触媒ドメインは、異なる細菌種由来である。
有用なＣａｓ９ヌクレアーゼのバリアントは、ＲｕｖＣ−もしくはＨＮＨ−酵素またはニッカーゼなどの単一の不活性触媒ドメインを含み得る。Ｃａｓ９ニッカーゼは、１つだけの活性機能性ドメインを有し、標的ＤＮＡの１つのストランドのみを切断することができ、それにより、一本鎖切断またはニックを生じる。いくつかの実施形態において、少なくともＤ１０Ａ変異を有する変異体Ｃａｓ９ヌクレアーゼはＣａｓ９ニッカーゼである。他の実施形態において、少なくともＨ８４０Ａ変異を有する変異体Ｃａｓ９ヌクレアーゼはＣａｓ９ニッカーゼである。Ｃａｓ９ニッカーゼに存在する変異の他の例には、非限定的に、Ｎ８５４ＡおよびＮ８６３Ａが挙げられる。向かい合わせのＤＮＡストランドを標的にする少なくとも２つのＤＮＡターゲティングＲＮＡが用いられる場合には、二本鎖切断は、Ｃａｓ９ニッカーゼを用いて導入することができる。二重ニックにより引き起こされた二本鎖切断は、ＮＨＥＪまたはＨＤＲにより修復することができる（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｃｅｌｌ， １５４：１３８０−１３８９）。この遺伝子編集戦略は、ＨＤＲを優先し、オフターゲットＤＮＡ部位におけるインデル変異の頻度を減少させる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼの非限定的例は、例えば、米国特許第８，８９５，３０８号；第８，８８９，４１８号；および第８，８６５，４０６号、ならびに米国特許出願公開第２０１４／０３５６９５９号、第２０１４／０２７３２２６号、および第２０１４／０１８６９１９号に記載されている。Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼは、標的細胞または標的生物体ごとにコドン最適化することができる。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ１およびＨＮＨヌクレアーゼドメインの２つのサイレンシング変異（Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）を含有するＣａｓ９ポリペプチドであり得、それはｄＣａｓ９と呼ばれる（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０１２， ３３７：８１６−８２１； Ｑｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １５２（５）：１１７３−１１８３）。一実施形態において、化膿性連鎖球菌由来のｄＣａｓ９ポリペプチドは、位置Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、Ａ９８７、またはそれらの任意の組合せにおける少なくとも１個の変異を含む。そのようなｄＣａｓ９ポリペプチドおよびそれらのバリアントの記載は、例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２号に提供されている。ｄＣａｓ９酵素は、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ９８３、またはＤ９８６における変異、加えてＨ８４０またはＮ８６３における変異を含有することができる。ある例では、ｄＣａｓ９酵素は、Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ変異を含有する。また、ｄＣａｓ９酵素は、Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｙ、またはＨ８４０Ｎを含み得る。いくつかの実施形態において、本発明のｄＣａｓ９酵素は、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ；Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ｙ；Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ｎ；Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ａ；Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ｙ；またはＤ１０ＮおよびＨ８４０Ｎの置換を含む。置換は、Ｃａｓ９ポリペプチドを触媒的不活性にし、かつ標的ＤＮＡと結合することができるようにする、保存的または非保存的置換であり得る。
ある特定の実施形態において、ｄＣａｓ９ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性の欠陥など、触媒的不活性である。ある例では、ｄＣａｓ９酵素またはそのバリアントもしくは断片は、標的配列の転写をブロックすることができ、場合によっては、ＲＮＡポリメラーゼをブロックすることができる。他の例では、ｄＣａｓ９酵素またはそのバリアントもしくは断片は、標的配列の転写を活性化することができる。
ゲノム編集方法について、Ｃａｓヌクレアーゼは、ｄＣａｓ９に連結されたＩＩＳ型制限酵素ＦｏｋＩの触媒ドメインを含むポリペプチドなどのＣａｓ９融合タンパク質であり得る。ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合タンパク質（ｆＣａｓ９）は、標的ＤＮＡの一本鎖と結合し得る２つのガイドＲＮＡを用いて、二本鎖切断を生じさせることができる。
遺伝子調節（例えば、標的ＤＮＡの転写のモジュレーション）について、非限定的にｄＣａｓ９などの、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓタンパク質が、転写活性化または転写抑制のために用いることができる。ヌクレアーゼ無しのＣａｓタンパク質を用いて遺伝子発現を不活性化する方法は、例えば、Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ．， ２０１３， ８（１１）：２１８０−２１９６に記載されている。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、組換え発現ベクターに存在する。ある特定の例では、組換え発現ベクターはウイルス構築物、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス構築物、組換えアデノウイルス構築物、組換えレンチウイルス構築物などである。例えば、ウイルスベクターは、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルスなどに基づき得る。レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルスに基づき得、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、乳癌ウイルスなどのレトロウイルスに由来したベクターであり得る。有用な発現ベクターは当業者に知られており、多くは市販されている。ベクターｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０は、真核生物宿主細胞のための例として提供される。しかしながら、宿主細胞と適合性であるならば、いかなる他のベクターも用いられ得る。例えば、Ｃａｓ９酵素をコードするヌクレオチド配列を含有する有用な発現ベクターは、例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、およびＯｒｉｇｅｎｅから市販されている。
用いられる標的細胞／発現系に依存して、プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含むいくつかの転写および翻訳制御エレメントのいずれかが発現ベクターに用いられ得る。有用なプロモーターは、ウイルス、または任意の生物体、例えば、原核生物もしくは真核生物に由来し得る。適切なプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルスの主要な後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６核内低分子プロモーター（Ｕ６）、増強Ｕ６プロモーター、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）などが挙げられるが、それらに限定されない。
Ｃａｓヌクレアーゼおよびそのバリアントまたは断片は、Ｃａｓポリペプチドまたはそのバリアントもしくは断片、Ｃａｓポリペプチドまたはそのバリアントもしくは断片をコードするｍＲＮＡ、あるいはＣａｓポリペプチドまたはそのバリアントもしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターとして、細胞（例えば、エクスビボ治療用の初代細胞などのインビトロ細胞、または患者内などのインビボ細胞）へ導入することができる。
２．修飾型単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）
ゲノム改変のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに用いられる修飾型ｓｇＲＮＡは、典型的には、標的核酸配列に相補的なガイド配列（例えば、ｃｒＲＮＡ）、およびＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片と相互作用するスキャフォールド配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。本発明者らは、１つまたは複数の化学修飾を含有する修飾型ｓｇＲＮＡが、初代細胞（例えば、Ｔ細胞または造血幹細胞・造血前駆細胞）においてＣＲＩＳＰＲに基づいた遺伝子調節（例えば、ゲノム編集または遺伝子発現をモジュレートすること）のために用いられた場合、対応する非修飾型ｓｇＲＮＡと比較して、修飾型ｓｇＲＮＡの活性、安定性、および特異性を増加させ、ならびに／またはその毒性を減少させ得ることを発見した。先行技術に優る修飾型ｓｇＲＮＡの利点には、初代細胞などの標的細胞への送達がより容易なこと、加えて、安定性の増加、活性の持続時間の増加、および標的細胞における毒性の低下が挙げられるが、それらに限定されない。ある場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの部分としての修飾型ｓｇＲＮＡは、他のシステムと比較してオンターゲット遺伝子調節のより高い頻度を提供する。他の場合では、修飾型ｓｇＲＮＡは、それらの非修飾型配列等価物と比較して向上した活性および／または特異性を提供する。
ある特定の例では、修飾型ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片と複合体化して、細胞（例えば、エクスビボ治療用の初代細胞などのインビトロ細胞、または患者内などのインビボ細胞）への導入のためのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）に基づいた送達系を形成する。他の例では、修飾型ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするｍＲＮＡと共に細胞（例えば、エクスビボ治療用の初代細胞などのインビトロ細胞、または患者内などのインビボ細胞）へ導入される。さらに他の例では、修飾型ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターと共に細胞（例えば、エクスビボ治療用の初代細胞などのインビトロ細胞、または患者内などのインビボ細胞）へ導入される。
ある例では、複数の修飾型ｓｇＲＮＡが、初代細胞などの標的細胞において、効率的な多重化された、ＣＲＩＳＰＲに基づいた遺伝子調節（例えば、ゲノム編集または遺伝子発現をモジュレートすること）に用いることができる。複数の修飾型ｓｇＲＮＡは、同じ標的核酸配列または異なる標的核酸配列とハイブリダイズする、少なくとも約２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはそれ以上の修飾型ｓｇＲＮＡを含み得る。複数の修飾型ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片との複合体で、あるいはＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、ｍＲＮＡまたは組換え発現ベクター）として、細胞（例えば、エクスビボ治療用の初代細胞などのインビトロ細胞、または患者内などのインビボ細胞）へ導入することができる。
修飾型ｓｇＲＮＡの核酸配列は、標的配列とハイブリダイズし、かつＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を導くのに十分な、標的ポリヌクレオチド配列（例えば、標的ＤＮＡ配列）との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列であり得る。いくつかの実施形態において、修飾型ｓｇＲＮＡのガイド配列とそれの対応する標的配列との相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントされた場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、もしくはそれ以上、または約５０％より高く、６０％より高く、７５％より高く、８０％より高く、８５％より高く、９０％より高く、９５％より高く、９７．５％より高く、９９％より高く、もしくはそれ以上より高い。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを用いて決定され得、そのアルゴリズムの非限定的例には、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づいたアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで利用可能）、およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで利用可能）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ガイド配列は、約１ヌクレオチド長、２ヌクレオチド長、３ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長、６ヌクレオチド長、７ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１１ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長、２７ヌクレオチド長、２８ヌクレオチド長、２９ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、３５ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、４５ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、またはそれ以上である。ある例では、ガイド配列は約２０ヌクレオチド長である。他の例では、ガイド配列は約１５ヌクレオチド長である。他の例では、ガイド配列は約２５ヌクレオチド長である。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を導くガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイにより評価され得る。例えば、試験されるべきガイド配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲシステムの成分が、ＣＲＩＳＰＲ配列の成分をコードするベクターでのトランスフェクションによるなど、対応する標的配列を有する宿主細胞へ供給され得、その後、標的配列内の優先的な切断が評価され得る。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験されるべきガイド配列および試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の成分を供給し、試験ガイド配列反応と対照ガイド配列反応の間で、標的配列における結合または切断率を比較することにより試験管内で評価され得る。
修飾型ｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列は、上記のウェブに基づいたソフトウェアのいずれかを用いて選択することができる。ＤＮＡターゲティングＲＮＡを選択するための考慮すべきことには、用いられることになっているＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）についてのＰＡＭ配列、およびオフターゲット改変を最小限にするための戦略が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌなどのツールは、修飾型ｓｇＲＮＡを調製するための配列、標的改変効率を評価すること、および／またはオフターゲット部位における切断を評価することを提供することができる。修飾型ｓｇＲＮＡの配列を選択するための別の考慮すべきことには、ガイド配列内の二次構造の度合を低下させることが挙げられる。二次構造は、任意の適切なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムによって決定され得る。いくつかのプログラムは、最小のギブズ自由エネルギーを計算することに基づいている。適切なアルゴリズムの例には、ｍＦｏｌｄ（Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ９ （１９８１）， １３３−１４８）、ＵＮＡＦｏｌｄパッケージ（Ｍａｒｋｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２００８， ４５３：３−３１）、およびＶｉｅｎｎａＲＮａ ＰａｃｋａｇｅからのＲＮＡｆｏｌｄが挙げられる。
修飾型ｓｇＲＮＡの、ガイド配列の１個もしくは複数のヌクレオチド、および／またはスキャフォールド配列の１個もしくは複数のヌクレオチドは、修飾型ヌクレオチドであり得る。例えば、約２０ヌクレオチド長であるガイド配列は、１個または複数、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれ以上の修飾型ヌクレオチドを有し得る。ある場合では、ガイド配列は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上の修飾型ヌクレオチドを含む。他の場合では、ガイド配列は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１９個、２０個、またはそれ以上の修飾型ヌクレオチドを含む。修飾型ヌクレオチドは、ガイド配列の任意の核酸位置に位置し得る。言い換えれば、修飾型ヌクレオチドは、ガイド配列の最初および／もしくは最後のヌクレオチドの地点、もしくはその近くに、ならびに／またはその間の任意の位置にあり得る。例えば、２０ヌクレオチド長であるガイド配列について、１個または複数の修飾型ヌクレオチドは、ガイド配列の核酸１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、および／または２０位に位置し得る。ある特定の例では、ガイド配列の約１０％から約３０％まで、例えば、約１０％〜約２５％、約１０％〜約２０％、約１０％〜約１５％、約１５％〜約３０％、約２０％〜約３０％、または約２５％〜約３０％が修飾型ヌクレオチドを含み得る。他の例では、ガイド配列の約１０％〜約３０％、例えば、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、または約３０％が修飾型ヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態において、修飾型ｓｇＲＮＡのスキャフォールド配列は、１個または複数の修飾型ヌクレオチドを含有する。例えば、約８０ヌクレオチド長であるスキャフォールド配列は、１個または複数、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、またはそれ以上の修飾型ヌクレオチドを有し得る。ある例では、スキャフォールド配列は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上の修飾型ヌクレオチドを含む。他の例では、スキャフォールド配列は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１９個、２０個、またはそれ以上の修飾型ヌクレオチドを含む。修飾型ヌクレオチドは、スキャフォールド配列の任意の核酸位置に位置し得る。例えば、修飾型ヌクレオチドは、スキャフォールド配列の最初および／もしくは最後のヌクレオチドの地点、もしくはその近くに、ならびに／またはその間の任意の位置にあり得る。例えば、約８０ヌクレオチド長であるスキャフォールド配列について、１個または複数の修飾型ヌクレオチドは、その配列の核酸１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、および／または８０位に位置し得る。ある例では、スキャフォールド配列の約１％から約１０％まで、例えば、約１％〜約８％、約１％〜約５％、約５％〜約１０％、または３％〜約７％が修飾型ヌクレオチドを含み得る。他の例では、スキャフォールド配列の約１％から約１０％まで、例えば、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％が修飾型ヌクレオチドを含み得る。
ｓｇＲＮＡの修飾型ヌクレオチドは、リボース（例えば、糖）基、リン酸基、核酸塩基、またはそれらの任意の組合せにおける修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、リボース基における修飾は、リボースの２’位での修飾を含む。
いくつかの実施形態において、修飾型ヌクレオチドには、２’フルオロ−アラビノ核酸、三環性ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）、ペプチド核酸、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノ、またはそれらの組合せが挙げられる。
修飾型ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、糖修飾型および／またはバックボーン修飾型リボヌクレオチドを含む（すなわち、リン酸−糖バックボーンへの修飾を含む）ことができる。例えば、天然または自然のＲＮＡのホスホジエステル結合が、窒素またはイオウのヘテロ原子の少なくとも１個を含むように修飾され得る。いくつかのバックボーン修飾型リボヌクレオチドにおいて、隣接するリボヌクレオチドへ連結するホスホエステル基が、修飾型基、例えばホスホロチオエート基によって置換され得る。好ましい、糖修飾型リボヌクレオチドにおいて、２’部分は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＯＮから選択される基であり、ＲはＣ１〜Ｃ６アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである。
いくつかの実施形態において、修飾型ヌクレオチドは糖修飾を含有する。糖修飾の非限定的例には、２’−デオキシ−２’−フルオロ−オリゴリボヌクレオチド（２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸）、２’−デオキシ−２’−デアミンオリゴリボヌクレオチド（２’−アミノ−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸）、２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルシチジン−５’−三リン酸、２’−メチルウリジン−５’−三リン酸）、２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、およびそれらの異性体（２’−アラシチジン−５’−三リン酸、２’−アラウリジン−５’−三リン酸）、アジド三リン酸（ａｚｉｄｏｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（２’−アジド−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、２’−アジド−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸）、ならびにそれらの組合せが挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾型ｓｇＲＮＡは、１個または複数の２’−フルオロ、２’−アミノ、および／または２’−チオ修飾を含有する。ある例では、修飾は、２’−フルオロ−シチジン、２’−フルオロ−ウリジン、２’−フルオロ−アデノシン、２’−フルオロ−グアノシン、２’−アミノ−シチジン、２’−アミノ−ウリジン、２’−アミノ−アデノシン、２’−アミノ−グアノシン、２，６−ジアミノプリン、４−チオ−ウリジン、５−アミノ−アリル−ウリジン、５−ブロモ−ウリジン、５−ヨード−ウリジン、５−メチル−シチジン、リボ−チミジン、２−アミノプリン、２’−アミノ−ブチリル−ピレン−ウリジン、５−フルオロ−シチジン、および／または５−フルオロ−ウリジンである。
哺乳類ＲＮＡ上に見出される９６個より多い天然に存在するヌクレオシド修飾がある。例えば、Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２２（１２）：２１８３−２１９６ （１９９４）参照。ヌクレオチドならびに修飾型ヌクレオチドおよびヌクレオシドの調製は、当技術分野においてよく知られており、例えば、米国特許第４，３７３，０７１号、第４，４５８，０６６号、第４，５００，７０７号、第４，６６８，７７７号、第４，９７３，６７９号、第５，０４７，５２４号、第５，１３２，４１８号、第５，１５３，３１９号、第５，２６２，５３０号、および第５，７００，６４２号に記載されている。本明細書に記載されているような使用に適している多数の修飾型ヌクレオシドおよび修飾型ヌクレオチドは市販されている。そのヌクレオシドは、天然に存在するヌクレオシドの類似体であり得る。ある場合では、その類似体は、ジヒドロウリジン、メチルアデノシン、メチルシチジン、メチルウリジン、メチルプソイドウリジン、チオウリジン、デオキシシチジン、およびデオキシウリジンである。
ある場合では、本明細書に記載された修飾型ｓｇＲＮＡは、核酸塩基修飾型リボヌクレオチド、すなわち、天然に存在する核酸塩基の代わりに少なくとも１個の天然に存在しない核酸塩基を含有するリボヌクレオチドを含む。修飾型ヌクレオシドおよび修飾型ヌクレオチドへ組み入れることができる修飾型核酸塩基の非限定的例には、ｍ５Ｃ（５−メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５−メチルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ６−メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２−チオウリジン）、Ｕｍ（２’−Ｏ−メチルウリジン）、ｍ１Ａ（１−メチルアデノシン）、ｍ２Ａ（２−メチルアデノシン）、Ａｍ（２−１−Ｏ−メチルアデノシン）、ｍｓ２ｍ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン）、ｉ６Ａ（Ｎ６−イソペンテニルアデノシン）、ｍｓ２ｉ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン）、ｉｏ６Ａ（Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）、ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）、ｇ６Ａ（Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン）、ｔ６Ａ（Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン）、ｍｓ２ｔ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン）、ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン）、ｈｎ６Ａ（Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）、ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）、Ａｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸））、Ｉ（イノシン）、ｍ１１（１−メチルイノシン）、ｍ’Ｉｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン）、ｍ３Ｃ（３−メチルシチジン）、Ｃｍ（２Ｔ−Ｏ−メチルシチジン）、ｓ２Ｃ（２−チオシチジン）、ａｃ４Ｃ（Ｎ４−アセチルシチジン）、ｆ５Ｃ（５−フォンニル（ｆｏｎｎｙｌ）シチジン）、ｍ５Ｃｍ（５，２−Ｏ−ジメチルシチジン）、ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４アセチル２ＴＯメチルシチジン）、ｋ２Ｃ（リシジン）、ｍ１Ｇ（１−メチルグアノシン）、ｍ２Ｇ（Ｎ２−メチルグアノシン）、ｍ７Ｇ（７−メチルグアノシン）、Ｇｍ（２’−Ｏ−メチルグアノシン）、ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン）、ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）、ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン）、Ｇｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸））、ｙＷ（ワイブトシン）、ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）、ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）、ＯＨｙＷ＊（未修飾（ｕｎｄｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシワイブトシン）、ｉｍＧ（ワイオシン）、ｍｉｍＧ（メチルグアノシン）、Ｑ（クエオシン）、ｏＱ（エポキシクエオシン）、ｇａｌＱ（ガラクトシル−クエオシン）、ｍａｎＱ（マンノシル−クエオシン）、ｐｒｅＱｏ（７−シアノ−７−デアザグアノシン）、ｐｒｅＱｉ（７−アミノメチル−７−デアザグアノシン）、Ｇ（アルカエオシン）、Ｄ（ジヒドロウリジン）、ｍ５Ｕｍ（５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン）、ｓ４Ｕ（４−チオウリジン）、ｍ５ｓ２Ｕ（５−メチル−２−チオウリジン）、ｓ２Ｕｍ（２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン）、ａｃｐ３Ｕ（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン）、ｈｏ５Ｕ（５−ヒドロキシウリジン）、ｍｏ５Ｕ（５−メトキシウリジン）、ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸）、ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル）、ｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））、ｍｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）、ｍｃｍ５Ｕ（５−メトキシカルボニルメチルウリジン）、ｍｃｍ５Ｕｍ（Ｓ−メトキシカルボニルメチル−２−Ｏ−メチルウリジン）、ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン）、ｎｍ５ｓ２Ｕ（５−アミノメチル−２−チオウリジン）、ｍｎｍ５Ｕ（５−メチルアミノメチルウリジン）、ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン）、ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン）、ｎｃｍ５Ｕ（５−カルバモイルメチルウリジン）、ｎｃｍ５Ｕｍ（５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）、ｃｍｎｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン）、ｃｎｍｍ５Ｕｍ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−Ｌ−Ｏメチルウリジン）、ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン）、ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン）、Ｔｍ（２’−Ｏ−メチルイノシン）、ｍ４Ｃ（Ｎ４−メチルシチジン）、ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２−Ｏ−ジメチルシチジン）、ｈｍ５Ｃ（５−ヒドロキシメチルシチジン）、ｍ３Ｕ（３−メチルウリジン）、ｃｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルウリジン）、ｍ６Ａｍ（Ｎ６，Ｔ−Ｏ−ジメチルアデノシン）、ｒｎ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ−２−トリメチルアデノシン）、ｍ２’７Ｇ（Ｎ２，７−ジメチルグアノシン）、ｍ２’２’７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン）、ｍ３Ｕｍ（３，２Ｔ−Ｏ−ジメチルウリジン）、ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）、ｆ５Ｃｍ（５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン）、ｍ１Ｇｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）、ｍ’Ａｍ（１，２−Ｏ−ジメチルアデノシン）イリノメチルウリジン）、ｔｍ５ｓ２Ｕ（Ｓ−タウリノメチル−２−チオウリジン））、ｉｍＧ−１４（４−デメチルグアノシン）、ｉｍＧ２（イソグアノシン）、またはａｃ６Ａ（Ｎ６−アセチルアデノシン）、ヒポキサンチン、イノシン、８−オキソ−アデニン、その７−置換誘導体、ジヒドロウラシル、プソイドウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルウラシル、５−メチルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルシトシン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ２−ジメチルグアニン、７−デアザグアニン、８−アザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン、７−デアザ−７−（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニルグアニン、７−デアザ−８−置換グアニン、８−ヒドロキシグアニン、６−チオグアニン、８−オキソグアニン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，４−ジアミノプリン、２，６−ジアミノプリン、８−アザプリン、置換７−デアザプリン、７−デアザ−７−置換プリン、７−デアザ−８−置換プリン、およびそれらの組合せが挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾型ｓｇＲＮＡのリン酸バックボーンが変化している。その修飾型ｓｇＲＮＡは、１個または複数のホスホロチオエート、ホスホラミデート（例えば、Ｎ３’−Ｐ５’−ホスホラミデート（ＮＰ））、２’−Ｏ−メトキシ−エチル（２’ＭＯＥ）、２’−Ｏ−メチル−エチル（２’ＭＥ）、および／またはメチルホスホネート結合を含み得る。
特定の実施形態において、修飾型ｓｇＲＮＡの、ガイド配列の修飾型ヌクレオチドの１個もしくは複数、および／またはスキャフォールド配列の修飾型ヌクレオチドの１個もしくは複数は、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル３’−ホスホロチオエート（ＭＳ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）ヌクレオチド、またはそれらの組合せを含む。ある例では、修飾型ｓｇＲＮＡは、１個または複数のＭＳヌクレオチドを含む。他の例では、修飾型ｓｇＲＮＡは、１個または複数のＭＳＰヌクレオチドを含む。さらに他の例では、修飾型ｓｇＲＮＡは、１個または複数のＭＳヌクレオチド、および１個または複数のＭＳＰヌクレオチドを含む。さらなる例では、修飾型ｓｇＲＮＡはＭヌクレオチドを含まない。ある特定の例では、修飾型ｓｇＲＮＡは、１個もしくは複数のＭＳヌクレオチド、および／または１個もしくは複数のＭＳＰヌクレオチドを含み、１個または複数のＭヌクレオチドをさらに含む。ある特定の他の例では、ＭＳヌクレオチドおよび／またはＭＳＰヌクレオチドが、修飾型ｓｇＲＮＡに存在する唯一の修飾型ヌクレオチドである。
本明細書に記載された修飾のいずれかが、修飾型ｓｇＲＮＡのガイド配列および／またはスキャフォールド配列において組み合わされて、組み入れられ得ることは留意されるべきである。
ある場合では、修飾型ｓｇＲＮＡはまた、ステムループ、例えば、Ｍ２ステムループまたはテトラループなどの構造的修飾を含む。
修飾型ｓｇＲＮＡは、当業者に知られた任意の方法により合成することができる。いくつかの実施形態において、修飾型ｓｇＲＮＡは化学合成される。修飾型ｓｇＲＮＡは、２’−Ｏ−チオノカルバメート保護ヌクレオシドホスホラミダイトを用いて合成することができる。方法は、例えば、Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １３３， １１５４０−１１５５６ （２０１１）； Ｔｈｒｅｌｆａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０， ７４６−７５４ （２０１２）；およびＤｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２５， ９４０−９５０ （２００３）に記載されている。
化学修飾型ｓｇＲＮＡは、任意のＣＲＩＳＰＲ関連技術、例えば、ＲＮＡガイド型技術と共に用いることができる。本明細書に記載されているように、修飾型ｓｇＲＮＡは、任意の人工、または人造のＣａｓ９ポリペプチドを含む任意のＣａｓヌクレアーゼまたはそのバリアントもしくは断片についてのガイドとしての役割を果たすことができる。修飾型ｓｇＲＮＡは、エクスビボ治療用の単離された初代細胞において、またはインビボで（例えば、動物において）、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子を標的にすることができる。本明細書に開示された方法は、ゲノム編集、遺伝子調節、画像化、および任意の他のＣＲＩＳＰＲに基づいた適用に適用することができる。
３．ドナー修復鋳型
いくつかの実施形態において、本発明は、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）切断部位の両側に、標的ＤＮＡ配列（例えば、標的遺伝子または遺伝子座）の部分に相同である２つの相同アームを含む組換えドナー修復鋳型を提供する。ある特定の例では、組換えドナー修復鋳型は、レポーターポリペプチド（例えば、検出可能なポリペプチド、蛍光ポリペプチド、または選択マーカー）をコードするヌクレオチド配列を含むレポーターカセット、およびＣａｓヌクレアーゼ切断部位の両側における、そのレポーターカセットに隣接し、かつ標的ＤＮＡの部分に相同である２つの相同アームを含む。レポーターカセットは、自己切断ペプチド、１個もしくは複数の核移行シグナル、および／または蛍光ポリペプチド、例えば、スーパーフォルダーＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）をコードする配列をさらに含み得る。
いくつかの実施形態において、相同アームは同じ長さである。他の実施形態において、相同アームは異なる長さである。相同アームは、少なくとも約１０塩基対（ｂｐ）、例えば、少なくとも約１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４５ｂｐ、５５ｂｐ、６５ｂｐ、７５ｂｐ、８５ｂｐ、９５ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐ、５００ｂｐ、５５０ｂｐ、６００ｂｐ、６５０ｂｐ、７００ｂｐ、７５０ｂｐ、８００ｂｐ、８５０ｂｐ、９００ｂｐ、９５０ｂｐ、１０００ｂｐ、１．１キロベース（ｋｂ）、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２．０ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３．０ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．８ｋｂ、３．９ｋｂ、４．０ｋｂ、またはそれ以上であり得る。相同アームは、約１０ｂｐ〜約４ｋｂ、例えば、約１０ｂｐ〜約２０ｂｐ、約１０ｂｐ〜約５０ｂｐ、約１０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約１０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約１０ｂｐ〜約１ｋｂ、約１０ｂｐ〜約２ｋｂ、約１０ｂｐ〜約４ｋｂ、約１００ｂｐ〜約２００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１００ｂｐ〜約２ｋｂ、約１００ｂｐ〜約４ｋｂ、約５００ｂｐ〜約１ｋｂ、約５００ｂｐ〜約２ｋｂ、約５００ｂｐ〜約４ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約１ｋｂ〜約４ｋｂ、または約２ｋｂ〜約４ｋｂであり得る。
ドナー修復鋳型は、発現ベクターへクローニングすることができる。当業者に知られた通常のウイルスおよび非ウイルスに基づいた発現ベクターを用いることができる。
組換えドナー修復鋳型の代わりに、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）ドナー鋳型を、相同組換え媒介性修復に用いることができる。ｓｓＯＤＮは、標的ＤＮＡ内に短い改変を導入するのに有用である。例えば、ｓｓＯＤＮは、ＳＮＰなどの遺伝子変異を正確に正すのに適している。ｓｓＯＤＮは、Ｃａｓヌクレアーゼ切断の標的部位のそれぞれの側における２つの隣接する相同配列を含有し得、標的ＤＮＡに対してセンス方向またはアンチセンス方向に配向することができる。各隣接配列は、少なくとも約１０塩基対（ｂｐ）、例えば、少なくとも約１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ、５０ｂｐ、５５ｂｐ、６０ｂｐ、６５ｂｐ、７０ｂｐ、７５ｂｐ、８０ｂｐ、８５ｂｐ、９０ｂｐ、９５ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐ、５００ｂｐ、５５０ｂｐ、６００ｂｐ、６５０ｂｐ、７００ｂｐ、７５０ｂｐ、８００ｂｐ、８５０ｂｐ、９００ｂｐ、９５０ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、４ｋｂ、またはそれ以上であり得る。いくつかの実施形態において、各相同アームは、約１０ｂｐ〜約４ｋｂ、例えば、約１０ｂｐ〜約２０ｂｐ、約１０ｂｐ〜約５０ｂｐ、約１０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約１０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約１０ｂｐ〜約１ｋｂ、約１０ｂｐ〜約２ｋｂ、約１０ｂｐ〜約４ｋｂ、約１００ｂｐ〜約２００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１ｋｂ、約１００ｂｐ〜約２ｋｂ、約１００ｂｐ〜約４ｋｂ、約５００ｂｐ〜約１ｋｂ、約５００ｂｐ〜約２ｋｂ、約５００ｂｐ〜約４ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約１ｋｂ〜約４ｋｂ、または約２ｋｂ〜約４ｋｂである。ｓｓＯＤＮは、長さが少なくとも約２５ヌクレオチド（ｎｔ）、例えば、少なくとも約２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ、８０ｎｔ、８５ｎｔ、９０ｎｔ、９５ｎｔ、１００ｎｔ、１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔ、またはそれ以上であり得る。いくつかの実施形態において、ｓｓＯＤＮは、約２５〜約５０；約５０〜約１００；約１００〜約１５０；約１５０〜約２００；約２００〜約２５０；約２５０〜約３００；または約２５ｎｔ〜約３００ｎｔ長である。
いくつかの実施形態において、ｓｓＯＤＮ鋳型は、本明細書に記載された、少なくとも１個、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、またはそれ以上の修飾型ヌクレオチドを含む。ある例では、ｓｓＯＤＮの配列の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９９％が、修飾型ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、修飾型ヌクレオチドは、ｓｓＯＤＮの末端の１つまたは両方に位置する。修飾型ヌクレオチドは、終端から１番目、２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、７番目、８番目、９番目、もしくは１０番目のヌクレオチド、またはそれらの任意の組合せであり得る。例えば、修飾型ヌクレオチドは、ｓｓＯＤＮ鋳型の両端における３個の終端ヌクレオチドであり得る。追加として、修飾型ヌクレオチドが、内部から末端まで位置し得る。
４．標的ＤＮＡ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、標的ＤＮＡ配列は、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ（例えば、修飾型ｓｇＲＮＡ）の断片に相補的であり得、その直後に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が続き得る。標的ＤＮＡ部位は、ＰＡＭ配列から５’側すぐにあり得、そのＰＡＭ配列は、用いられるＣａｓ９の細菌種に特異的である。例えば、化膿性連鎖球菌由来のＣａｓ９のＰＡＭ配列はＮＧＧであり、髄膜炎菌由来のＣａｓ９のＰＡＭ配列はＮＮＮＮＧＡＴＴであり、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来のＣａｓ９のＰＡＭ配列はＮＮＡＧＡＡであり、トレポネーマ・デンティコーラ由来のＣａｓ９のＰＡＭ配列はＮＡＡＡＡＣである。いくつかの実施形態において、ＰＡＭ配列は、５’−ＮＧＧ（ただし、Ｎは任意のヌクレオチドである）、５’−ＮＲＧ（ただし、Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｒはプリンである）、または５’−ＮＮＧＲＲ（ただし、Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｒはプリンである）であり得る。化膿性連鎖球菌システムについて、選択される標的ＤＮＡ配列は、５’ＮＧＧ（ただし、Ｎは任意のヌクレオチドである）ＰＡＭの直前にある（例えば、５’側に位置する）べきであり、その結果、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ（例えば、修飾型ｓｇＲＮＡ）のガイド配列が、逆ストランドと塩基対形成して、ＰＡＭ配列から約３塩基対上流での切断を媒介する。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ（例えば、修飾型ｓｇＲＮＡ）のガイド配列とそれの対応する標的ＤＮＡ配列の間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントされた場合、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上、または約５０％より高く、５５％より高く、６０％より高く、６５％より高く、７０％より高く、７５％より高く、８０％より高く、８５％より高く、９０％より高く、９１％より高く、９２％より高く、９３％より高く、９４％より高く、９５％より高く、９６％より高く、９７％より高く、９８％より高く、９９％より高く、もしくはそれ以上である。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを用いて決定され得、そのアルゴリズムの非限定的例には、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅｌａｎｇｏｒ、Ｍａｌａｙｓｉａ）、およびＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に基づいたアルゴリズムが挙げられる。
標的ＤＮＡ部位は、ＺｉＦｉＴ Ｔａｒｇｅｔｅｒソフトウェア（Ｓａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ３５：５９９−６０５； Ｓａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ３８：４６２−４６８）、Ｅ−ＣＲＩＳＰ（Ｈｅｉｇｗｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １１：１２２−１２３）、ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓ（Ｂａｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， ３０（１０）：１４７３−１４７５）、ＣａｓＦｉｎｄｅｒ（Ａａｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， ｂｉｏＲｘｉｖ）、ＤＮＡ２．０ ｇＮＲＡ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌ（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）、およびＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌ（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）などのウェブに基づいたソフトウェアを用いて、所定のゲノム配列（遺伝子）内で選択することができる。そのようなツールは、ゲノム配列（例えば、関心対象となる遺伝子または遺伝子座）を分析し、遺伝子編集のための適切な標的部位を同定する。各ＤＮＡターゲティングＲＮＡ（例えば、修飾型ｓｇＲＮＡ）についてのオフターゲット遺伝子改変を評価するために、オフターゲット部位のコンピュータ的予測を、塩基対形成ミスマッチのアイデンティティ、位置、および分布の定量的特異性分析に基づいて行う。
５．遺伝子発現のモジュレーション
遺伝子発現を阻害すること、または遺伝子発現を活性化することなどの遺伝子発現を調節するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、野生型または天然のＣａｓヌクレアーゼのバリアントまたは断片（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドのバリアントまたは断片）、およびＤＮＡターゲティングｓｇＲＮＡまたはＲＮＡターゲティングｓｇＲＮＡのいずれかを含み得る。非限定的例として、Ｃａｓ９バリアントまたは断片と、ｓｇＲＮＡの一部に相補的な標的ＤＮＡ配列と結合することができるｓｇＲＮＡとを含む複合体は、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始および伸長をブロックまたは邪魔することができる。これは、次に、標的ＤＮＡの遺伝子発現を阻害または抑制することができる。あるいは、異なるＣａｓ９バリアントまたは断片と、ｓｇＲＮＡの一部に相補的な標的ＤＮＡ配列と結合することができるｓｇＲＮＡとを含む複合体は、標的ＤＮＡの遺伝子発現を誘導または活性化することができる。
遺伝子発現を不活性化し、または低下させるＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）を実施するための方法の詳細な説明は、例えば、Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ２０１３， ８（１１）：２１８０−２１９６、およびＱｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １５２， ２０１３， １１７３−１１８３に見出される。ＣＲＩＳＰＲｉにおいて、ｓｇＲＮＡ−Ｃａｓ９バリアント複合体は、タンパク質コード領域の非鋳型ＤＮＡ鎖と結合し、転写伸長をブロックすることができる。ある場合では、ｓｇＲＮＡ−Ｃａｓ９バリアント複合体が遺伝子のプロモーター領域と結合する場合、その複合体は、転写開始を阻止または邪魔する。
遺伝子発現を増加させるＣＲＩＳＰＲ活性化を実施するための方法の詳細な説明は、例えば、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０１３， ２３：１１６３−１１７１、Ｋｏｎｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２０１５， ５１７：５８３−５８８、および米国特許第８，６９７，３５９号に見出される。
遺伝子発現をモジュレートするためのＣＲＩＳＰＲに基づいたＲＮＡ結合および／または切断についての方法の詳細な説明は、例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２０１４， ５１６：２６３−２６６、および米国特許出願公開第２０１４／０３０２５６３号に見出される。
遺伝子発現のＣＲＩＳＰＲに基づいた制御について、ヌクレオチド鎖切断活性を欠くＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）の触媒的不活性のバリアントを用いることができる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ様およびＨＮＨヌクレアーゼドメインにおいて少なくとも２つの点変異を含有するＣａｓ９バリアントである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９バリアントは、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａアミノ酸置換を有し、それはｄＣａｓ９と呼ばれている（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０１２， ３３７：８１６−８２１； Ｑｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １５２（５）：１１７３−１１８３）。ある場合では、化膿性連鎖球菌由来のｄＣａｓ９ポリペプチドは、位置Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、Ａ９８７、またはそれらの任意の組合せにおける少なくとも１個の変異を含む。そのようなｄＣａｓ９ポリペプチドおよびそのバリアントの説明は、例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２号に提供されている。ｄＣａｓ９酵素は、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ９８３、またはＤ９８６における変異、加えて、Ｈ８４０またはＮ８６３における変異を含有することができる。ある場合では、ｄＣａｓ９酵素はＤ１０ＡまたはＤ１０Ｎ変異を含有する。また、ｄＣａｓ９酵素は、Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｙ、またはＨ８４０Ｎを含み得る。ある場合では、ｄＣａｓ９酵素は、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ；Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ｙ；Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ｎ；Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ａ；Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ｙ；またはＤ１０ＮおよびＨ８４０Ｎの置換を含む。置換は、Ｃａｓ９ポリペプチドを触媒的不活性にし、かつ標的ＤＮＡと結合することができるようにする、保存的または非保存的置換であり得る。
ある特定の実施形態において、ｄＣａｓ９ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性の欠陥など触媒的不活性である。ある例では、ｄＣａｓ９酵素またはそのバリアントもしくは断片は、標的配列の転写をブロックすることができ、場合によっては、ＲＮＡポリメラーゼをブロックすることができる。他の例では、ｄＣａｓ９酵素またはそのバリアントもしくは断片は、標的配列の転写を活性化することができる。
ある特定の実施形態において、ヌクレオチド鎖切断活性を欠くＣａｓ９バリアント（例えば、ｄＣａｓ９）は、転写抑制ドメイン、例えば、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、または転写活性化ドメイン、例えば、ＶＰ１６トランス活性化ドメインと融合することができる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９バリアントは、ｄＣａｓ９および転写因子、例えば、ＲＮＡポリメラーゼω因子、熱ショック因子１、またはその断片を含む融合ポリペプチドである。他の実施形態において、Ｃａｓ９バリアントは、ｄＣａｓ９およびＤＮＡメチラーゼ、ヒストンアセチラーゼ、またはその断片を含む融合ポリペプチドである。
ＲＮＡ結合および／またはＲＮＡ切断により媒介される遺伝子発現のＣＲＩＳＰＲに基づく制御について、例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２０１４， ５１６：２６３−２６６に記載されているような、エンドリボヌクレアーゼ活性を有する適切なＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）バリアントを用いることができる。他の有用なＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）バリアントは、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０３０２５６３号に記載されている。ＲＮＡを切断することができる他のＣＲＩＳＰＲ関連酵素には、Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連Ｃａｓ６酵素、Ｃａｓ５ファミリーメンバー酵素、Ｃａｓ６ファミリーメンバー酵素、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステムエンドリボヌクレアーゼ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムエンドリボヌクレアーゼ、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムエンドリボヌクレアーゼ、およびそれらのバリアントが挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲに基づいたＲＮＡ切断のいくつかの実施形態において、ＰＡＭ配列を含有するＤＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＡＭｍｅｒ）が、一本鎖ＲＮＡ転写産物と結合し、それを切断するために、本明細書に記載された修飾型ｓｇＲＮＡおよびＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）バリアントと共に用いることができる。適切なＰＡＭｍｅｒ配列の詳細な説明は、例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２０１４， ５１６：２６３−２６６に見出される。
Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片は、ポリペプチド、そのポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、またはそのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターとして供給することができる。追加の詳細は上記で見出すことができる。
いくつかの実施形態において、複数の修飾型ｓｇＲＮＡが、標的遺伝子の異なる領域を標的にして、その標的遺伝子の遺伝子発現を調節するために用いられる。複数の修飾型ｓｇＲＮＡは、各修飾型ｓｇＲＮＡ単独と比較して、単一の標的遺伝子の遺伝子発現の相乗的モジュレーション（例えば、阻害または活性化）を提供することができる。他の実施形態において、複数の修飾型ｓｇＲＮＡは、少なくとも２つの標的遺伝子の遺伝子発現を調節するために用いられる。
Ｂ．初代細胞
本発明は、関心対象となる任意の初代細胞において標的核酸の遺伝子調節を誘導するために用いることができる。初代細胞は、任意の多細胞生物体から単離された細胞、例えば、植物細胞（例えば、イネ細胞、コムギ細胞、トマト細胞、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）細胞、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）細胞など）、多細胞原生生物由来の細胞、多細胞真菌由来の細胞、無脊椎動物（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線形動物など）由来の細胞または脊椎動物（例えば、魚、両生類、爬虫類、鳥、哺乳類など）由来の細胞などの動物細胞、ヒト由来の細胞、健康なヒト由来の細胞、ヒト患者由来の細胞、癌患者由来の細胞などであり得る。ある場合では、遺伝子調節を誘導された初代細胞は、対象（例えば、患者）へ移植することができる。例えば、初代細胞は、処置されることになっている対象（例えば、患者）に由来し得る。
任意の型の初代細胞が関心対象となり得、例えば、幹細胞、例えば、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、成体幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、臓器幹細胞）、前駆細胞、体細胞（例えば、線維芽細胞、肝実質細胞、心臓細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、筋肉細胞、皮膚細胞、血液細胞、神経細胞、免疫細胞）、および身体、例えば、ヒト身体の任意の他の細胞である。細胞は、対象、例えば、動物対象またはヒト対象に由来した初代細胞または初代細胞培養物であり得、限られた数の継代の間、インビトロで成長することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、疾患細胞であり、または疾患を有する対象に由来する。例えば、細胞は癌または腫瘍細胞であり得る。
初代細胞は、任意の標準方法により対象から採取することができる。例えば、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、腎臓、膵臓、肺、腸、胃などの組織由来の細胞は、組織生検または細針吸引により採取することができる。血液細胞および／または免疫細胞は、全血、血漿、または血清から単離することができる。ある場合では、適切な初代細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、および他の血液細胞サブセット、例えば、限定されるわけではないが、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、ナチュラルキラーＴ細胞、単球前駆細胞、造血幹細胞・造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）、例えばＣＤ３４＋ＨＳＰＣ、または非多能性幹細胞が挙げられる。ある場合では、細胞は、任意の免疫細胞であり得、それには、任意のＴ細胞、例えば、腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、または任意の他の型のＴ細胞が挙げられるが、それらに限定されない。Ｔ細胞にはまた、メモリーＴ細胞、メモリーＴ幹細胞、またはエフェクターＴ細胞が挙げられ得る。Ｔ細胞はまた、特定の集団および表現型に偏ることができる。例えば、Ｔ細胞は、表現型的に、ＣＤ４５ＲＯ（−）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ２８（＋）、および／またはＩＬ−７Ｒα（＋）を含むように偏ることができる。ＣＤ４５ＲＯ（−）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ２８（＋）、および／またはＩＬ−７Ｒα（＋）を含むリストから選択される１個または複数のマーカーを含む適切な細胞を選択することができる。誘導多能性幹細胞は、例えば、米国特許第７，６８２，８２８号、第８，０５８，０６５号、第８，５３０，２３８号、第８，８７１，５０４号、第８，９００，８７１号、および第８，７９１，２４８号に記載された標準プロトコールに従って、分化細胞から作製することができる。
いくつかの実施形態において、初代細胞はインビトロである、他の実施形態において、初代細胞はエクスビボである。
Ｃ．エクスビボ治療
本明細書に記載された方法は、エクスビボ治療に用いることができる。エクスビボ治療は、生物体の外側で作製または改変された組成物（例えば、細胞）を対象（例えば、患者）に投与することを含み得る。いくつかの実施形態において、組成物（例えば、細胞）は、本明細書に開示された方法により作製または改変することができる。例えば、エクスビボ治療は、生物体の外側で作製または改変された初代細胞を対象（例えば、患者）に投与することを含み得、本明細書に記載された１つまたは複数の修飾型ｓｇＲＮＡ、およびＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするｍＲＮＡ、あるいはＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターと初代細胞における標的核酸を接触させることを含む、本発明の方法に従って、前記初代細胞がインビトロで培養されている。
いくつかの実施形態において、組成物（例えば、細胞）は、エクスビボ治療により処置されることになっている対象（例えば、患者）に由来し得る。いくつかの実施形態において、エクスビボ治療は、養子免疫治療などの細胞に基づいた治療を含み得る。
いくつかの実施形態において、エクスビボ治療に用いられる組成物は、細胞であり得る。その細胞は、初代細胞であり得、それには、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、および他の血液細胞サブセットが挙げられるが、それらに限定されない。初代細胞は免疫細胞であり得る。初代細胞は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）、ナチュラルキラー細胞、単球、ナチュラルキラーＴ細胞、単球前駆細胞、造血幹細胞もしくは非多能性幹細胞、幹細胞、または前駆細胞であり得る。初代細胞は、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣなどの造血幹細胞または造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）であり得る。初代細胞はヒト細胞であり得る。初代細胞は、単離、選択、および／または培養することができる。初代細胞は、エクスビボで増殖することができる。初代細胞は、インビボで増殖することができる。初代細胞は、ＣＤ４５ＲＯ（−）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ２８（＋）、および／またはＩＬ−７Ｒα（＋）であり得る。初代細胞は、必要としている対象の自己性であり得る。初代細胞は、必要としている対象の非自己性であり得る。初代細胞は、製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）適合の試薬であり得る。初代細胞は、必要としている対象における、癌、感染症、自己免疫障害、または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含む疾患を処置するための併用療法の一部であり得る。
エクスビボ治療の非限定的例として、初代細胞は、その初代細胞内の標的核酸を、Ｃａｓヌクレアーゼおよび修飾型ｓｇＲＮＡと接触させる前に、多細胞生物体（例えば、植物、多細胞原生生物、多細胞真菌、無脊椎動物、脊椎動物など）から単離することができる。標的核酸をＣａｓヌクレアーゼおよび修飾型ｓｇＲＮＡと接触させた後、初代細胞またはそれの子孫（例えば、初代細胞に由来した細胞）を多細胞生物体へ戻すことができる。
Ｄ．核酸を標的細胞へ導入するための方法
ポリペプチドおよび核酸を標的細胞（宿主細胞）へ導入するための方法は当技術分野において知られており、ヌクレアーゼまたは核酸（例えば、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列、ＤＮＡターゲティングＲＮＡ（例えば、修飾型単一ガイドＲＮＡ）、相同組換え修復（ＨＤＲ）のためのドナー修復鋳型など）を細胞、例えば、幹細胞、前駆細胞、または分化細胞などの初代細胞へ導入するために用いることができる。適切な方法の非限定的例には、エレクトロポレーション、ウイルスまたはバクテリオファージの感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、リン酸カルシム沈殿法、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、パーティクルガン技術、リン酸カルシム沈殿法、直接的マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介性核酸送達などが挙げられる。
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性遺伝子調節の成分は、送達系を用いて細胞へ導入することができる。ある特定の例では、送達系は、（ポリペプチドとして、または発現構築物によりコードされた）ヌクレアーゼ成分、ならびにＤＮＡターゲティングＲＮＡ（例えば、修飾型単一ガイドＲＮＡ）および／またはドナー修復鋳型などの１つもしくは複数の核酸成分を含む、ナノ粒子、微粒子（例えば、ポリマー微粒子）、リポソーム、ミセル、ビロソーム、ウイルス粒子、核酸複合体、トランスフェクション剤、（例えば、ＮＥＯＮトランスフェクションシステムを用いる）エレクトロポレーション剤、ヌクレオフェクション剤、リポフェクション剤、および／またはバッファー系を含む。例えば、成分は、それらが、陽イオンのμｍ未満の水中油エマルジョンへカプセル化またはパッケージング化されるようにリポフェクション剤と混合することができる。あるいは、成分は、送達系なしで、例えば、水溶液として送達することができる。
リポソームを調製し、リポソーム内にポリペプチドおよび核酸をカプセル化する方法は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｖｏｌｕｍｅ １： Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． （ｅｄ． Ｗｅｉｓｓｉｇ）． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ２００９およびＨｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７：２７６−８７に記載されている。微粒子を調製し、ポリペプチドおよび核酸をカプセル化する方法は、例えば、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｖｏｌｕｍｅ ４ （Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ， ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ ＆ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）． （ｅｄｓ． Ａｒｓｈａｄｙ ＆ Ｇｕｙｏｔ）． Ｃｉｔｕｓ Ｂｏｏｋｓ， ２００２およびＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ． （ｅｄｓ． Ｃｏｈｅｎ ＆ Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ）． ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９６に記載されている。
Ｅ．ゲノム編集の効率を評価するための方法
正しいゲノム編集改変の存在を機能的に検査するために、標的ＤＮＡを、当業者に知られた標準方法によって分析することができる。例えば、インデル変異は、ＳＵＲＶＥＹＯＲ（登録商標）変異検出キット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）またはＧｕｉｄｅ−ｉｔ（商標）インデル同定キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いてシーケンシングすることにより同定することができる。相同組換え修復（ＨＤＲ）は、ＰＣＲに基づいた方法により、かつシーケンシングまたはＲＦＬＰ分析と組み合わせて、検出することができる。ＰＣＲに基づいたキットの非限定的例には、Ｇｕｉｄｅ−ｉｔ変異検出キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）ゲノム切断検出キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が挙げられる。ディープシーケンシングもまた、特に多数の試料または候補のターゲット／オフターゲット部位について、用いることができる。
ある特定の実施形態において、ゲノム編集の効率（例えば、特異性）は、オンターゲットおよびオフターゲット事象を含む全てのゲノム切断事象の数またはパーセンテージに対する、オンターゲットゲノム切断事象の数またはパーセンテージに対応する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された修飾型ｓｇＲＮＡは、対応する非修飾型ｓｇＲＮＡと比較して、初代細胞などの細胞において標的ＤＮＡ配列のゲノム編集を増強する能力がある。ゲノム編集は、相同組換え修復（ＨＤＲ）（例えば、挿入、欠失、または点変異）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を含み得る。
ある特定の実施形態において、細胞における標的ＤＮＡ配列のヌクレアーゼ媒介性ゲノム編集効率は、対応する非修飾型ｓｇＲＮＡ配列と比較して、本明細書に記載された修飾型ｓｇＲＮＡの存在下で、少なくとも約０．５倍、０．６倍、０．７倍、０．８倍、０．９倍、１倍、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、またはそれ以上、増強される。
Ｆ．細胞における標的核酸の遺伝子調節のための方法
細胞において標的核酸の遺伝子調節、例えば、ゲノム編集、および／または遺伝子発現をモジュレートすること（例えば、阻害し、または活性化すること）を誘導するための方法が本明細書に提供される。細胞は、インビトロ（例えば、エクスビボ治療用の初代細胞）またはインビボ（例えば、ヒトなどの対象の器官または組織における細胞）であり得る。
ゲノム編集を誘導するための方法は、本明細書に記載された修飾型ｓｇＲＮＡ、およびＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片か、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするｍＲＮＡか、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターかのいずれかを細胞へ導入することを含む。修飾型ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片を標的核酸（例えば、標的ＤＮＡ）へ導く。修飾型ｓｇＲＮＡは、対応する非修飾型ｓｇＲＮＡ配列と比較して、活性、安定性、および／または標的ＤＮＡに対する特異性が増強している。ある場合では、ゲノム編集は標的ＤＮＡの非相同末端結合（ＮＨＥＪ）である。他の場合では、ゲノム編集は、標的ＤＮＡの相同組換え修復（ＨＤＲ）である。ＨＤＲのいくつかの実施形態において、組換えドナー修復鋳型が細胞へ加えられる。組換えドナー修復鋳型は、標的ＤＮＡの２つの重複していない、相同部分を含む２つのヌクレオチド配列を含み得、そのヌクレオチド配列は、標的ＤＮＡに対応するヌクレオチド配列の５’末端および３’末端に位置する。いくつかの実施形態において、組換えドナー修復鋳型は、一塩基多型（ＳＮＰ）を正すための変異をコードするヌクレオチド配列、および標的ＤＮＡの２つの重複していない、相同部分を含む２つのヌクレオチド配列を含む合成一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を含み、前記２つのヌクレオチド配列が、変異をコードするヌクレオチド配列の５’末端および３’末端に位置する。修飾型ｓｇＲＮＡ、および／またはＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）もしくはそのバリアントもしくは断片か、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）もしくはそのバリアントもしくは断片をコードするｍＲＮＡか、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）もしくはそのバリアントもしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターかのいずれかは、エレクトロポレーションによるなどの任意の適切な方法を用いて細胞へ導入される。
細胞において標的核酸、例えば、標的ＤＮＡの遺伝子発現をモジュレートする（例えば、阻害または活性化する）ための方法は、本明細書に記載された修飾型ｓｇＲＮＡ、およびＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片か、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするｍＲＮＡか、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターかのいずれかを細胞へ導入する（例えば、エレクトロポレーションする）ことを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）バリアントはエンドヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ９）ポリペプチドである。ある例では、Ｃａｓ９バリアントは、野生型Ｃａｓ９ポリペプチドと比較して２つ以上のアミノ酸置換を有し得る。他の例では、Ｃａｓ９バリアントは、二本鎖ＤＮＡを切断することができない。Ｃａｓヌクレアーゼバリアントは、Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ９）融合ポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態において、その融合ポリペプチドは、転写抑制ドメイン、転写活性化ドメイン、転写因子、ヒストン修飾酵素（例えば、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ）、ＤＮＡ修飾酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ）などを含む。
細胞において標的核酸、例えば、標的ＲＮＡの遺伝子発現をモジュレートする（例えば、阻害または活性化する）ための方法は、本明細書に記載された修飾型ｓｇＲＮＡ、およびＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片か、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするｍＲＮＡか、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターかのいずれかを細胞へ導入する（例えば、エレクトロポレーションする）ことを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）バリアントは、ヌクレオチド鎖切断活性が低下し、または不足している。Ｃａｓヌクレアーゼバリアントは、そのポリペプチドが二本鎖ＤＮＡを切断することができないように２つ以上のアミノ酸置換を含有することができる。Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）バリアントは、エンドリボヌクレアーゼ活性を有し得、かつ標的ＲＮＡを切断することができる。
Ｇ．対象において遺伝的疾患を予防または処置するための方法
本明細書に記載された修飾型ｓｇＲＮＡは、遺伝子調節の効率をモジュレートするために用いることができる。例えば、修飾型ｓｇＲＮＡは、対応する非修飾型ｓｇＲＮＡと比較して増強した活性で遺伝子調節を誘導することができる。ある場合では、増強した活性は、修飾型ｓｇＲＮＡの安定性の増加、および／または修飾型ｓｇＲＮＡの標的核酸に対する特異性の増加を含む。別の例として、修飾型ｓｇＲＮＡは、対応する非修飾型ｓｇＲＮＡと比較して細胞毒性を減少させて、遺伝子調節を誘導することができる。
修飾型ｓｇＲＮＡは、遺伝的疾患の標的化されたヌクレアーゼに基づいた治療法に適用することができる。患者の初代細胞のゲノムにおいて遺伝子変異を正確に正すための現在のアプローチは、非常に非効率的である（細胞の１パーセント未満が正確に編集され得る）。本明細書に記載された修飾型ｓｇＲＮＡは、ゲノム編集の活性を増強し、ゲノム編集に基づいた治療の効力を増加させることができる。特定の実施形態において、修飾型ｓｇＲＮＡは、遺伝的疾患を有する対象における遺伝子のインビボ遺伝子編集に用いられ得る。修飾型ｓｇＲＮＡは、任意の適切な投与経路を介して、ヌクレアーゼに基づいた治療の効果を増強する（例えば、ゲノム編集効率を向上させる）のに十分な用量または量で対象に投与することができる。
疾患に関連した遺伝子変異を正すことにより、必要としている対象において遺伝的疾患を予防または処置するための方法が本明細書に提供される。方法は、本明細書に記載された修飾型ｓｇＲＮＡを、変異を正すのに十分である量で対象に投与することを含む。疾患に関連した遺伝子変異を正すことにより、必要としている対象において遺伝的疾患を予防または処置するための薬物の製造における、本明細書に記載された修飾型ｓｇＲＮＡの使用もまた本明細書に提供される。修飾型ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするｍＲＮＡ、あるいはＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターも含む組成物中に含有され得る。ある例では、修飾型ｓｇＲＮＡは、上記の送達系内に含まれる。
本方法により正され得る遺伝的疾患には、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症、鎌状赤血球貧血、サラセミア、血友病、腫瘍症、癌、加齢黄斑変性、統合失調症、トリヌクレオチドリピート障害、脆弱Ｘ症候群、プリオン関連障害、筋萎縮性側索硬化症、薬物依存、自閉症、アルツハイマー病、パーキンソン病、嚢胞性線維症、血液凝固性疾患または障害、炎症、免疫関連疾患または障害、代謝性疾患、肝臓疾患および障害、腎臓疾患および障害、筋肉／骨格疾患および障害（例えば、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー）、神経学的および神経細胞の疾患および障害、心血管疾患および障害、肺疾患および障害、眼疾患および障害、ウイルス感染症（例えば、ＨＩＶ感染症）などが挙げられるが、それらに限定されない。
以下の実施例は、主張された発明を例証するために提供されるが、限定するために提供されるのではない。
［実施例１］
化学修飾型ガイドＲＮＡは、ヒト初代細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集を増強する
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性ゲノム編集は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼにより促進される部位特異的ＤＮＡ切断を方向づけるガイドＲＮＡに頼る。ここで、本発明者らは、化学合成された単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の使用に関して報告し、化学的変化によるｓｇＲＮＡの修飾が、ヒト初代Ｔ細胞およびＣＤ３４＋造血幹細胞・造血前駆細胞においてゲノム編集を劇的に増強することを示す。このアプローチは、ゲノム編集の開発を合理化する簡便かつ非常に効果的な方法であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術の多様な生物工学的および治療的適用を加速させる可能性をもつ。
人工ヌクレアーゼを用いたゲノム編集は、関心対象となる、本質的にいかなるゲノム配列をも改変するための画期的技術である（Ｐｏｒｔｅｕｓ， Ｍ．Ｈ． ＆ Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｄ．， Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３， ９６７−９７３ （２００５））。この技術は、人工ヌクレアーゼを利用して、部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせ、続いて、内因性細胞修復機構によりＤＳＢを回復させる。その結果は、切断の部位において挿入もしくは欠失（イン／デル）を生じる、変異原性の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による特定部位の変異か、または外因的に導入されたドナー鋳型を用いる相同組換え（ＨＲ）によるゲノム配列の正確な変化かのいずれかであり得る（Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３， １３２−１４０ （２０１５））。この技術への最近の主な追加は、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）および短鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）からなるクラスター化された規則的な配置の回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓシステムである（Ｊｉｎｅｋ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７， ８１６−８２１ （２０１２）、Ｍａｌｉ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９， ８２３−８２６ （２０１３）、Ｃｏｎｇ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９， ８１９−８２３ （２０１３）、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １５７， １２６２−１２７８ （２０１４））。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と名付けられた２つのＲＮＡで構成されており、それらは、遺伝子編集を目的として、典型的には、キメラ単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として融合している。ｓｇＲＮＡは、１００ヌクレオチド（ｎｔ）からなり、そのうちの５’末端における２０ｎｔが、ワトソン・クリック塩基対形成によって標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズし、標的ゲノムＤＮＡを切断するようにＣａｓエンドヌクレアーゼを導くことができる（図１Ａ）。ｓｇＲＮＡは、例えばインビトロ転写により調製された、ＲＮＡとして、またはｓｇＲＮＡがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターから発現する、ＤＮＡベクターを用いることにより、細胞へ送達することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いるゲノム編集はヒト細胞株において非常に効率的であるが、ヒト初代細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集は、一般的により困難である。この活性の減少についての理由は、捉えにくいままであるが、要因は、トランスフェクション率、プロモーター活性、エキソヌクレアーゼ活性、核酸を送達した時のインターフェロン自然免疫応答、およびＤＮＡ修復忠実度の差に関与し得る。ここで、本発明者らは、化学合成されたｓｇＲＮＡが、高レベルのゲノム編集を誘導し得ることを実証し、かつさらに、ｓｇＲＮＡの化学的変化が、ヒト初代Ｔ細胞とＣＤ３４＋造血幹細胞・造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）の両方においてゲノム編集を劇的に増強し得ることを示す。化学修飾型ｓｇＲＮＡを用いてのこれらの細胞型におけるゲノム編集の増加は、ＤＮＡ発現プラスミドを通してよりもむしろ、ｍＲＮＡまたはタンパク質としてＣａｓ９を送達することにより、したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのための単純かつ完全なＲＮＡまたはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）に基づいた送達系を作製することにより、さらに向上する。
結果
ＲＮＡ合成技術における最近の進歩により、１００ｎｔ長より長いＲＮＡの化学合成が実行可能になった（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ， Ｄ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １３３， １１５４０−１１５５６ （２０１１））。ゲノム編集のための化学合成されたｓｇＲＮＡの有用性を試験するために、本発明者らは、以前に記載された手順（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ， Ｄ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １３３， １１５４０−１１５５６ （２０１１））に従い、ＡＢＩ ３９４合成機および２’−Ｏ−チオカルバメート保護ヌクレオシドホスホラミダイトを用いて、１００ｎｔの完全長ｓｇＲＮＡを合成した。本発明者らはまた、両終端に様々な化学修飾を有するｓｇＲＮＡを合成して、それらの効力への効果を評価した（図１Ａおよび１Ｂ、および表１）。存在する場合、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、または２’−Ｏ−メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）を含む化学修飾を、５’末端と３’末端の両方における３個の終端ヌクレオチドに組み入れた。これらの３つの修飾は、それらの以前に報告された、血清およびヘビ毒ホスホジエステラーゼに対する安定性、および核酸の免疫賦活性へのそれらの広範な、報告された効果により、評価のために選択された（Ｄｅｌｅａｖｅｙ， Ｇ．Ｆ． ＆ Ｄａｍｈａ， Ｍ．Ｊ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２５， ９４０−９５０ （２００３）， Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７， ２９３−３０５ （２０１４））。本発明者らは、以前報告された３つのｓｇＲＮＡを選択して、ヒト遺伝子、（ｉ）ＩＬ２ＲＧ（その中の変異は、先天性原発性免疫不全症ＳＣＩＤ−Ｘ１の原因である）、（ｉｉ）ＨＢＢ（その中の変異は、鎌状赤血球貧血およびサラセミアの原因である）、および（ｉｉｉ）ＣＣＲ５（それは、ＨＩＶの共受容体をコードし、現在、抗ＨＩＶ臨床試験において治療的遺伝子編集のための標的として研究中である）（Ｔｅｂａｓ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３７０， ９０１−９１０ （２０１４））のそれぞれの細胞株において高い遺伝子編集率を得た（Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７， ２９３−３０５ （２０１４）， Ｃｒａｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４１， ９５８４−９５９２ （２０１３））。本発明者らはまず、インビトロで、精製組換えＣａｓ９タンパク質および合成ｓｇＲＮＡのそれぞれの存在下で標的ＤＮＡ切断を試験した。全ての、化学合成され、かつ修飾されたｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質の存在下でそれらのＤＮＡ標的を効率的に切断した（図３および４）。
本発明者らは、次に、合成ｓｇＲＮＡが、ヒト細胞株において、変異原性ＮＨＥＪおよび遺伝子破壊を示している標的化イン／デルを誘導することができるかどうかを調べた。本発明者らは、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡプラスミドと共に各ｓｇＲＮＡをＫ５６２細胞へヌクレオフェクションにより送達し、イン／デル頻度を分析した。ＩＬ２ＲＧ遺伝子座を標的にする１μｇの合成非修飾型ｓｇＲＮＡの送達は、２．４％の標的化イン／デル頻度を生じ、それの機能性を実証した（図１Ｃ、明るい色調のバー）。Ｍ修飾型ｓｇＲＮＡについて、本発明者らは、非修飾型ｓｇＲＮＡと比較して、安定性の中程度の向上を示唆する、１３．５％へのイン／デル頻度の小さい増加を観察した。顕著なことには、同じ量の化学修飾型ｓｇＲＮＡが、ＭＳ修飾型ｓｇＲＮＡおよびＭＳＰ修飾型ｓｇＲＮＡについて、それぞれ、６８．０％および７５．７％へイン／デル頻度を増加させた。修飾型ｓｇＲＮＡの量を２０倍、増加させることは、全ての場合においてイン／デル頻度をさらに増加させ、ＭＳ ｓｇＲＮＡおよびＭＳＰ ｓｇＲＮＡについてそれぞれ、７５．３％および８３．３％に達し（図１Ｃ、暗い色調のバー）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをプラスミドから発現させることにより得られる頻度に匹敵した。ＨＢＢおよびＣＣＲ５標的について非常に類似した結果が得られ（図１Ｃ）、ヒト細胞において高レベルの標的化遺伝子変異を方向づける化学修飾型ｓｇＲＮＡの全般的な能力を実証した。本発明者らは次に、これらの合成ｓｇＲＮＡが、ＨＲによる遺伝子ターゲティングを刺激することができるかどうかを決定した。本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ切断部位の５’側および３’側に相同性の約０．８ｋｂのアームを有する、３つの遺伝子座のそれぞれについてのターゲティングベクターを設計した。相同アーム間に、本発明者らは、ＨＲ成功時に標的遺伝子座に安定的に組み込まれ得るＧＦＰ発現カセットを含めた（Ｌｏｍｂａｒｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ８， ８６１−８６９ （２０１１）； Ｖｏｉｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２， １３６５−１３７８ （２０１４））。全ての３つの標的遺伝子座において、ＭＳ ｓｇＲＮＡおよびＭＳＰ ｓｇＲＮＡは、非修飾型およびＭ修飾型ｓｇＲＮＡより有意に高いレベルのＨＲを刺激した（図１Ｄ）。より高いｓｇＲＮＡレベル（２０μｇ）において、本発明者らは、ＩＬ２ＲＧ、ＨＢＢ、およびＣＣＲ５において、それぞれ、ＭＳＰ ｓｇＲＮＡについて、２０．６％、２５．５％、および５０．０％のＨＲ率を測定した。これらの頻度は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを完全にプラスミドから発現させることにより得られる頻度に匹敵し、またはそれより高い。
化学修飾型ｓｇＲＮＡがオフターゲット活性に影響するかどうかを調べるために、本発明者らは、ディープシーケンシングを用いて、各ｓｇＲＮＡについて３つの異なる遺伝子座におけるオフターゲット変異頻度を測定した。８個のこれらのオフターゲット部位は、インシリコ予測ツールにより予測され（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１， ８２７−８３２ （２０１３）、Ｃｒａｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ， ３， ｅ２１４ （２０１４））、ＨＢＢ ｓｇＲＮＡについて、本発明者らは、ｓｇＲＮＡが高レベルのオフターゲット活性を有することが以前に示されている１個のオフターゲット部位を含めた（Ｃｒａｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ４２， ９５８４−９５９２， （２０１３））。８個の予測部位のうちの４個について、本発明者らは、修飾型ｓｇＲＮＡに関して高レベルのオンターゲット活性を検出したにも関わらず、全ての化学修飾型ｓｇＲＮＡに関してバックグラウンド近くのオフターゲット活性を見出した（図１Ｅおよび５、表５）。ｓｇＲＮＡの化学修飾は、他の４個の予測部位においてより高いオフターゲット活性を生じる傾向にあったが、その活性レベルは変化しやすかった。ある場合では、オフターゲットのイン／デル頻度に対するオンターゲットのイン／デル頻度の比率は、修飾型ｓｇＲＮＡに関して向上し、相対的な特異性の向上が示唆された。これらの結論の詳細は、下記に要約されている。本発明者らは、２個のオフターゲット部位（ＩＬ２ＲＧ「オフターゲット２」およびＨＢＢ「オフターゲット１」（その部位において、ＨＢＢ ｓｇＲＮＡが有意なオフターゲット活性を以前、示した））において、非修飾型ｓｇＲＮＡについて、活性を検出しただけで、それにより、非修飾型ｓｇＲＮＡと修飾型ｓｇＲＮＡの間で、オンターゲット：オフターゲット比率を比較することができた。ＩＬ２ＲＧ部位において、オンターゲット：オフターゲット比率は、ＭＳＰ ｓｇＲＮＡと比較して、非修飾型ｓｇＲＮＡについて５．８倍、良かったが（図１Ｅおよび表５）、ＨＢＢ部位について、この比率は、非修飾型ｓｇＲＮＡと比較してＭＳＰ ｓｇＲＮＡについて、２．６倍および１．５倍（１μｇおよび２０μｇについて）、良かった（図１Ｅおよび５、表５）。修飾型ｓｇＲＮＡのオンターゲット：オフターゲット比率をｓｇＲＮＡプラスミドのオンターゲット：オフターゲット比率と比較すると、ｓｇＲＮＡプラスミドは、ＣＣＲ５「オフターゲット２」およびＩＬ２ＲＧ「オフターゲット２」においてより良い比率を有し、一方、ＨＢＢ「オフターゲット１」について、ＭＳＰ ｓｇＲＮＡは、より良いオンターゲット：オフターゲット比率を有した（図１Ｅおよび表５）。ＨＢＢオフターゲット１部位を除いて、測定された最も高いオフターゲット頻度は、ＩＬ２ＲＧ ｓｇＲＮＡｓに関する「オフターゲット２」においてであり、１μｇおよび２０μｇ ＭＳ ｓｇＲＮＡを用いた場合、それぞれ、１．０％および７．８％のイン／デル頻度を生じた。興味深いことに、同じ部位におけるＩＬ２ＲＧ ＭＳＰ ｓｇＲＮＡのオフターゲット活性は、ＭＳ ｓｇＲＮＡと比較して、より高いオンターゲット活性を有したにも関わらず、それぞれ、２．７分の１および２．８分の１であった。同様に、ＭＳＰ ｓｇＲＮＡのオフターゲット活性は、ＨＢＢオフターゲット１部位（その部位において、ＨＢＢ ｓｇＲＮＡが有意なオフターゲット活性を以前、示した）においてＭＳ ｓｇＲＮＡと比較して良かった。ＣＣＲ５「オフターゲット２」において、その正反対が観察され、ＭＳＰ ｓｇＲＮＡが、ＭＳ ｓｇＲＮＡと比較して、より高いオフターゲット活性を有した。まとめて考えると、これらの結果は、典型的には、化学修飾型ｓｇＲＮＡが高特異性を保持することを示唆している。オンターゲット：オフターゲット比率において観察された差は、ｓｇＲＮＡへの化学的変化が、オンターゲット：オフターゲット活性をモジュレートする潜在能力を有し得るが、所定の化学的変化の影響は、配列依存性であるように思われ、かつ細胞型および送達条件などの他の因子にも依存し得るという可能性を示唆している。これらの観察が、異なる種における異なる遺伝子座を標的にする他のｓｇＲＮＡへ一般化可能であるかどうかは、さらなる研究を必要とするだろう。
ヒト細胞株において化学修飾型ｓｇＲＮＡのパフォーマンスをさらに探求するために、本発明者らは、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡと共にｓｇＲＮＡを同時送達する「全ＲＮＡ」送達プラットフォームに変えた。本発明者らは、様々な量のＭＳＰ ｓｇＲＮＡ（１〜２０μｇ）と共に様々な量のＣａｓ９ ｍＲＮＡ（１〜１５μｇ）を用いて、ＩＬ２ＲＧ遺伝子座におけるイン／デル頻度を測定した（図６）。本発明者らは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびＭＳＰ ｓｇＲＮＡのそれぞれ１μｇを用いた場合の７０％イン／デルへの中程度の減少を除いて、試験された全ての濃度について８１〜９０％の間のイン／デルの高率を同様に観察し、この「全ＲＮＡ」アプローチの高効率が実証された。化学修飾が、ｓｇＲＮＡ活性の半減期へ効果を生じるかどうかを探求するために、本発明者らは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、およびＩＬ２ＲＧを標的にする様々な合成ｓｇＲＮＡをヌクレオフェクションにより同時送達するか、または連続的に送達するかのいずれかである実験を実施した（図７）。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、およびＭＳ ｓｇＲＮＡかまたはＭＳＰ ｓｇＲＮＡのいずれかの同時送達は、それぞれ、８７％および８４％イン／デルの高い編集頻度を生じた（図１Ｆ）。Ｍ ｓｇＲＮＡが６６％イン／デルを生じたが、非修飾型ｓｇＲＮＡは、中程度の７．０％を生じ、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡと同時送達する場合のｓｇＲＮＡ修飾の重要性を明らかに表している。興味深いことに、最初にＣａｓ９ ｍＲＮＡを送達し、４時間または８時間後にｓｇＲＮＡを送達することは、全ての４個のｓｇＲＮＡにわたって、イン／デルの高く、かつ同等のレベル（８３．１％〜９２．４％）を生じ、非修飾型ｓｇＲＮＡと化学修飾型ｓｇＲＮＡの間での効率に差がなかった（図１Ｆ）。対照的に、最初にｓｇＲＮＡを送達し、続いて、４時間後、８時間後、１２時間後、または２４時間後にＣａｓ９ ｍＲＮＡを送達した場合、非修飾型ｓｇＲＮＡを用いて得られたイン／デル頻度は、４時間時点までにすでに、バックグラウンド近くのレベルへ降下した。Ｍ ｓｇＲＮＡについて、本発明者らはまた、イン／デル頻度のバックグラウンド近くのレベルへの減少を観察したが、この降下は、わずかに遅れ、非修飾型ｓｇＲＮＡより優る、安定性の中程度の向上を示唆した。ＭＳ ｓｇＲＮＡについて、本発明者らは、２４時間時点（その時点において、率は５３％へ降下した）までイン／デル頻度の減少を観察しなかった。顕著なことには、ＭＳＰ ｓｇＲＮＡについて、本発明者らは、ｓｇＲＮＡ送達とＣａｓ９送達の間の２４時間遅延後さえも、活性の有意な減退を検出しなかった。これらの結果は、ｓｇＲＮＡ末端修飾が、細胞内安定性を増強し、それにしたがって、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡがヒト細胞へ同時送達された場合、ゲノム編集の効力の増加を可能にするという本発明者らのモデルと一致している。非修飾型ｓｇＲＮＡによって方向づけられたイン／デル頻度は、Ｃａｓ９が最初に送達された場合、低下しなかったという事実は、Ｃａｓ９タンパク質がｓｇＲＮＡを分解から保護することを示唆している。この仮説を調べるために、本発明者らは、非修飾型またはＭＳ ＩＬ２ＲＧ ｓｇＲＮＡを組換えＣａｓ９タンパク質と複合体化し、その後に、この活性ＲＮＰを２つの異なる量でＫ５６２細胞へエレクトロポレーションした（図１Ｇおよび８）。低量のＲＮＰに関して、本発明者らは、非修飾型ｓｇＲＮＡと比較して、ＭＳ ｓｇＲＮＡを用いた場合、３．８倍高いイン／デル頻度を観察し（３５．７％対９．５％）、高量のＲＮＰについて、この増加は、２．３倍であった（８１．０％対３５．９％）。しかしながら、ＭＳ ｓｇＲＮＡと非修飾型ｓｇＲＮＡの間のこの比率は、ｓｇＲＮＡをＣａｓ９ ｍＲＮＡと同時送達した場合に観察されたものより（図１Ｆ「同時送達」と比較して）有意に低く、Ｃａｓ９タンパク質が非修飾型ｓｇＲＮＡを分解から部分的に保護することを示している。それでもなお、ｓｇＲＮＡへの修飾は、Ｃａｓ９タンパク質とあらかじめ複合体化したｓｇＲＮＡを送達する場合、遺伝子編集効率をさらに向上させる。次に、本発明者らは、Ｃａｓ９プラスミドと共に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡと共に、またはｃａｓ９タンパク質とあらかじめ複合体化して送達された場合、３つの以前に調べられたオフターゲット部位において、非修飾型ＩＬ２ＲＧ ｓｇＲＮＡとＭＳ ＩＬ２ＲＧ ｓｇＲＮＡのオフターゲット活性を比較した。非修飾型ｓｇＲＮＡに関して、本発明者らは、全ての３つのＣａｓ９供給源および全ての３つのオフターゲット部位にわたって、低レベル（＜０．３７％）のイン／デルを検出した（図９Ａ〜Ｂ）。ＭＳ ｓｇＲＮＡについて、本発明者らは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡと比較して、Ｃａｓ９プラスミドを送達した場合、全ての３つのオフターゲット部位においてオンターゲット：オフターゲット比率の向上を観察した（２．６〜３．０倍）。とりわけ、ＭＳ ｓｇＲＮＡとのＣａｓ９ ＲＮＰ送達に関して、本発明者らは、Ｃａｓ９プラスミドおよびｍＲＮＡと比較して、全ての３つの部位について、有意により良いオンターゲット：オフターゲット比率を検出し、それらの部位のうちの２つにおいてはバックグラウンド近くのオフターゲット活性であった。要約すれば、化学修飾型ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡと同時送達され、またはＲＮＰとして送達される場合、ヒト細胞株における遺伝子編集について非修飾型ｓｇＲＮＡより有意な優位性を示している。
本発明者らは、次に、初代細胞において化学修飾型ｓｇＲＮＡを試験した。ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いたＣＣＲ５遺伝子破壊は、抗ＨＩＶ処置としての臨床試験において現在、探求中である（Ｔｅｂａｓ ｅｔ ａｌ． Ｎｅｗ Ｅｎｇ Ｊｏｕｒ ｏｆ Ｍｅｄ， ３７０， ９０１−９１０ （２０１４））。しかしながら、最近の研究により、ヒト初代Ｔ細胞が、単一ｓｇＲＮＡを用いるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドシステムで編集することは本質的に困難であること、および細胞株において高い対立遺伝子改変頻度を生じるｓｇＲＮＡが、トランスフェクトされた細胞について濃縮した場合でさえも、Ｔ細胞における効力を実質的に低下させていることが見出された（Ｍａｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， １５， ６４３−６５２ （２０１４））。本発明者らは、刺激ヒト初代Ｔ細胞において、Ｃａｓ９コードｍＲＮＡと同時送達される、化学修飾型ＣＣＲ５ ｓｇＲＮＡを試験した。注目すべきことには、ＧＦＰ ｍＲＮＡを用いて、本発明者らは、フローサイトメトリにより測定された場合、Ｔ細胞において９８％より高いヌクレオフェクション効率を一貫して観察し（図１０）、トランスフェクトされた細胞について濃縮する必要性はなくなった。ｓｇＲＮＡとＣａｓ９の両方をコードするｓｇＲＮＡプラスミドのヌクレオフェクションは、バックグラウンドより上の対立遺伝子改変頻度を生じなかった（図２Ａ）。しかしながら、ＭＳＰ ｓｇＲＮＡの、Ｃａｓ９についてのＤＮＡ発現プラスミドとの同時トランスフェクションは、活性を９．３％イン／デル頻度まで救出することができた。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの非修飾型ｓｇＲＮＡまたはＭ ｓｇＲＮＡとのヌクレオフェクションは、バックグラウンドより上の対立遺伝子改変率を生じなかった。対照的に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡのＭＳ ｓｇＲＮＡかまたはＭＳＰ ｓｇＲＮＡのいずれかとのヌクレオフェクションは、それぞれ、著しい４８．７％および４７．９％イン／デル頻度を生じた。ｓｇＲＮＡまたはＣａｓ９ ｍＲＮＡの量を増加させることは、より高いイン／デル頻度を生じなかった（図１１）。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびＭＳＰ ｓｇＲＮＡでヌクレオフェクションされた細胞について、本発明者らは、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、および総Ｔ細胞集団において、同等の対立遺伝子改変頻度を見出した（図１２）。重要なことには、観察された高い改変頻度は、２１日間の時間経過にわたって、ＭＳＰ ｓｇＲＮＡについて測定された場合、安定であり（図１３）、本発明者らは、有意な細胞死を引き起こし、かつ増殖ポテンシャルを減少させたプラスミドヌクレオフェクションとは対照的に、修飾型ｓｇＲＮＡでのヌクレオフェクション後、細胞生存率および増殖へわずかな影響を観察しただけであった（図１４および１５）。本発明者らはまた、刺激Ｔ細胞より編集することがより困難であることが示されている非刺激Ｔ細胞において（Ｙｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， ３， ｅ１９８ （２０１４））、ＭＳ ｓｇＲＮＡを試験した。刺激Ｔ細胞とは対照的に、非刺激Ｔ細胞におけるイン／デル頻度は、６．６％から２２．２％までの範囲であり、より高いドナー変動性を示した（図１６）。刺激Ｔ細胞においてより低いが、非刺激Ｔ細胞におけるこれらの編集頻度は、特に、活性化および長期培養が細胞のその後の生物学的機能性に影響し得る、Ｔ細胞を操作することにおいて、なお有用性を有し得る。本発明者らは、次に、刺激初代Ｔ細胞において非修飾型ｓｇＲＮＡおよびＭＳ ｓｇＲＮＡを用いるＲＮＰ送達を試験した（図２Ｂ）。Ｋ５６２細胞において得られた結果と同様に、本発明者らは、非修飾型ｓｇＲＮＡよりＭＳ ｓｇＲＮＡのイン／デル頻度の２．４倍の向上を観察し（３０．７％対１２．８％）、Ｃａｓ９タンパク質とあらかじめ複合体化して送達される場合の化学修飾型ｓｇＲＮＡの使用をさらに支持している。
ＨＳＰＣにおける遺伝子治療は、造血系の遺伝的または後天性障害を処置するために広く探求されている。本発明者らは、ＩＬ２ＲＧおよびＨＢＢを標的にする化学修飾型ｓｇＲＮＡが、動員化末梢血から単離されたＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおいて機能するかどうかを試験した。この場合も先と同様に、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９の両方を発現するｓｇＲＮＡプラスミドは、検出可能なイン／デル頻度を生じなかったが、Ｃａｓ９ ＤＮＡ発現プラスミドとのＭＳＰ ｓｇＲＮＡの同時トランスフェクションが、ＩＬ２ＲＧおよびＨＢＢについて、それぞれ、３．２％および５．２％までイン／デル頻度を救出した（図２Ｃおよび１７）。Ｔ細胞における本発明者らの観察と同様に、本発明者らは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡと同時トランスフェクトされた場合、非修飾型ｓｇＲＮＡまたはＭ ｓｇＲＮＡを用いて、いずれの遺伝子座においてもイン／デルを検出しなかったが、ＭＳ ｓｇＲＮＡおよびＭＳＰ ｓｇＲＮＡは、それぞれ、高いイン／デル頻度を生じ、ＩＬ２ＲＧに関して、本発明者らは、ＭＳ ｓｇＲＮＡおよびＭＳＰ ｓｇＲＮＡについて、それぞれ、１７．５％および１７．７％のイン／デル頻度を検出し、ＨＢＢに関して、頻度は、それぞれ、２３．４％および２２．０％で、さらに高かった。さらなる研究により、化学修飾型ｓｇＲＮＡによるＨＳＰＣの遺伝子改変が、それらの多分化能に影響するかどうかを、または編集効率が、長期再増殖幹細胞と系列コミットされた前駆細胞との間で異なるかどうかを解明することができた。
最近の研究により、２つのｓｇＲＮＡの同時使用が、ヒト初代Ｔ細胞およびＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおいて遺伝子破壊を向上させ得ることが示された（Ｍａｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， １５， ６４３−６５２ （２０１４））。本発明者らは、２０５ｂｐを切り離すその研究において報告された配列（「Ｄ」および「Ｑ」と名付けられた）を有するＭＳおよびＭＳＰ ＣＣＲ５ ｓｇＲＮＡを化学合成した。本発明者らは、それらを、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡと同時送達されたＴ細胞およびＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおいて試験した。その２つのｓｇＲＮＡが個々に用いられた場合、本発明者らは、ＴＩＤＥ分析を用いて対立遺伝子改変頻度を定量化した。両方が用いられた場合、本発明者らは、クローニングされたＰＣＲ産物のシーケンシングにより対立遺伝子改変頻度を定量化し、そのシーケンシングはまた、以前報告された、その２つのｓｇＲＮＡ標的部位間の配列の欠失の高い発生率を含む、編集事象の全範囲を定量化することを可能にした。初代Ｔ細胞において個々に用いられた場合、「Ｄ」ｓｇＲＮＡは、ＭＳ ｓｇＲＮＡおよびＭＳＰ ｓｇＲＮＡについて、それぞれ、５６．０％および５６．３％を生じ、「Ｑ」ｓｇＲＮＡは、それぞれ、６２．６％および６９．６％を生じた（図２Ｄおよび１８Ａ）。組み合わせて用いられた場合、対立遺伝子改変の頻度は、本発明者らがＭＳ ｓｇＲＮＡおよびＭＳＰ ｓｇＲＮＡについて、それぞれ、７３．９％および９３．１％を観察したように、増加し、それらのうち、改変事象の大部分は、２つのｓｇＲＮＡ標的部位間の欠失であった（図１８Ｂ）。ＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおいて、本発明者らの観察は類似していたが、全体的な頻度はより低かった。したがって、本発明者らは、ＭＳ ｓｇＲＮＡおよびＭＳＰ ｓｇＲＮＡについて、それぞれ、「Ｄ」ｓｇＲＮＡについては９．８％および１１．２％、および「Ｑ」ｓｇＲＮＡについては１７．８％および１９．２％の対立遺伝子改変頻度を観察した（図２Ｄおよび１８Ｂ）。組み合わせて用いられた場合、その頻度は、ＭＳ ｓｇＲＮＡおよびＭＳＰ ｓｇＲＮＡについて、それぞれ、３７．８％および４３．０％へ増加した。本発明者らは、２つの化学修飾型ｓｇＲＮＡの使用が、ヒト初代Ｔ細胞およびＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおいて遺伝子破壊を促進する非常に効果的な方法であると結論づける。
図１９は、ＭＳ修飾型ｓｇＲＮＡが、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおいて対応する非修飾型ｓｇＲＮＡより良く機能することを示す追加の実験データを提供する。図２０は、修飾型ｓｇＲＮＡが、効率的な多重化ゲノム編集に用いられ得ることを示す。
この研究において、本発明者らは、化学合成されたｓｇＲＮＡが、標的化ゲノム編集へ効果的に用いられ得ることを示し、かつ化学修飾型ｓｇＲＮＡが、ヒト初代Ｔ細胞およびＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおいてゲノム編集効率を有意に増強することを実証している。化学合成され、かつ修飾されたｓｇＲＮＡは、発現した、またはインビトロで転写されたｓｇＲＮＡに優る利点を提供し、その中で、（１）効力の増加、（２）生物工学的および治療的適用のための高度に純粋なｓｇＲＮＡのロバストかつスケーラブルな製造、（３）ｓｇＲＮＡのプラスミド発現またはインビトロ転写、それぞれに典型的に用いられる、Ｕ６またはＴ７プロモーターにより強要される最初の転写されるヌクレオチドにおける制約とは対照的な、ｓｇＲＮＡデザインにおけるより高い柔軟性、および（４）ＤＮＡプラスミドに基づいた系より初代細胞において細胞毒性が低く、高活性の「ＲＮＡのみ」またはＲＮＰ ＣＲＩＳＰＲプラットフォームの使用可能性がある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの純粋なＲＮＡまたはＲＮＰ ＣＲＩＳＰＲシステムへの単純化は、インビボでの送達用の異なるナノ粒子ベクターにおける製剤に役立ち、その結果、ヌクレアーゼは、それがウイルスベクターの一部として送達された時の場合のように連続的に発現することはないだろう。さらに、本発明者らは、化学修飾型ｓｇＲＮＡが、多重化ゲノム編集、およびハイスループットマルチウェル実験を増強するだろうと予測する。本発明者らはまた、修飾型ｓｇＲＮＡが、遺伝子発現の阻害および活性化のためのＣＲＩＳＰＲｉ／ＣＲＩＳＰＲａシステム（Ｇｉｌｂｅｒｔ， Ｌ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １５９， ６４７−６６１ （２０１４））、ゲノム遺伝子座の動的可視化のためのＣＲＩＳＰＲ画像化ツール（Ｃｈｅｎ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １５５， １４７９−１４９１ （２０１３））、ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介性ＲＮＡ認識および切断（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ， Ｍ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ５１６， ２６３−２６６ （２０１４））などの幅広い範囲のＣＲＩＳＰＲ関連技術を精巧にするだろうと予測する。その技術は、標的細胞または組織への細胞内送達を向上させ、かつ画像化および生化学的研究のために様々な分子へのコンジュゲーションを可能にするように、さらに開発され得る。将来の研究は、より多様な化学修飾を調べ、最適化ｓｇＲＮＡの合理的デザインのために修飾の種々の位置、加えて、修飾型ｓｇＲＮＡの活性の増強についての機構を探求することができる。結論として、本発明者らは、本明細書に提示されたもののような化学修飾型ｓｇＲＮＡが、幅広いＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ生物工学的および治療的適用を有意に向上させるだろうと信じている。
材料および方法
１．ｓｇＲＮＡ合成
全てのＲＮＡオリゴマーを、ＡＢＩ ３９４合成機（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）において、２’−Ｏ−チオノカルバメート保護ヌクレオシドホスホラミダイト（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡまたはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて、以前、記載された手順（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １３３， １１５４０−１１５５６ （２０１１））に従って合成した。２’−Ｏ−メチルホスホラミダイトを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹから購入し、２’−Ｏ−チオノカルバメート保護ヌクレオシドホスホラミダイトと同じ条件下でＲＮＡオリゴマーへ組み入れた。チオホスホノアセテート（チオＰＡＣＥ）修飾型ＲＮＡの合成に用いられる２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ酢酸−１，１−ジメチルシアノエチルエステル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチルヌクレオシドを、本質的に、公開された方法（Ｔｈｒｅｌｆａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｇａｎｉｃ ＆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １０， ７４６−７５４ （２０１２）； Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， １２５， ９４０−９５０ （２００３））に従って合成した。ホスホロチオエート含有オリゴマーについて、カップリング反応後のヨウ素酸化ステップを、ピリジン−アセトニトリル（３：２）混合物中、６分間の３−（（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオンの０．０５Ｍ溶液を用いる硫化ステップに置き換えた。特に断りのない限り、固相ＲＮＡ合成のための試薬は、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ、ＵＳＡ）から購入された。
全てのオリゴヌクレオチドを、逆相ＨＰＬＣを用いて精製し、Ａｇｉｌｅｎｔ ６５２０ Ｑ−ＴＯＦ質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）と連結されたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＩｎｆｉｎｉｔｙシリーズＬＣシステムを用いるＬＣ−ＭＳにより分析した。表１は、用いられた全てのｓｇＲＮＡの配列、および見出されたピークの電荷状態シリーズのデコンボリューションから得られた質量を示す。デコンボリューションは、Ｍａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（バージョンＢ．０６．００）ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて行われた。
ｓｇＲＮＡ配列、ならびに、計算された、および観察された分子量が示されている。２’−Ｏ−メチル修飾を有するヌクレオチドは下線が引かれている。リン酸バックボーンにおける修飾は、黒丸（ＭＳ）および菱形（ＭＳＰ）で示されている。
２．インビトロ切断アッセイ
４ｋｂ ＰＡＭアドレス可能な標的を、プラスミド由来のヒト配列の調製用ＰＣＲ増幅により調製した。２０μＬ反応体積において、５０ｎＭ ｓｇＲＮＡ、３９ｎＭ 組換え精製Ｃａｓ９タンパク質（Ａｇｉｌｅｎｔ）、および１０ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下、ｐＨ７．６で５０フェントモルの直線化されたＤＮＡ標的を、３７℃で３０分間、インキュベートした。完了時に、０．５μＬのＲＮａｃｅ Ｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を加え、インキュベーションを３７℃で５分間、その後、７０℃で１５分間、継続した。その後、０．５μＬのプロテイナーゼＫ（分子生物学グレード、ＮＥＢ）を加え、３７℃で１５分間、インキュベートした。アリコートをＤＮＡ ７５００ ＬａｂＣｈｉｐにローディングし、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２２００で分析した。切断頻度を、式：（ａ／ｂ）×１００（式中、「ａ」は、２つの切断生成物のバンド強度の合計であり、ｂは、切断された、および切断されていないＤＮＡのバンド強度の合計である）により計算した。
３．プラスミド
ｓｇＲＮＡ発現ベクターを、ヒトコドン最適化ＳｐＣａｓ９発現カセット、およびキメラｓｇＲＮＡの発現を作動させるヒトＵ６プロモーターを含有するｐｘ３３０（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４２２３０）への２０ｂｐオリゴヌクレオチド標的配列のクローニングにより構築した（ｓｇＲＮＡ配列について表１参照）。
全ての３つのプラスミドターゲティングベクターは、相同性のおよそ２×８００ｂｐアームを有し、それらのアームは、Ｋ５６２細胞から単離されたゲノムＤＮＡを用いた対応する遺伝子座のＰＣＲ増幅により作製された。その後、相同アームを、標準クローニング方法を用いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋に基づいた約２，９００塩基対ベクターへクローニングした。相同アーム間に、ＨＢＢドナーとＣＣＲ５ドナーの両方は、ＧＦＰの発現を作動させるＥＦ１αプロモーターを含有する。ＩＬ２ＲＧドナーは、プロモーターを欠き、ＧＦＰ発現を作動させるためにＩＬ２ＲＧ遺伝子の内因性活性に頼る。ＩＬ２ＲＧターゲティングベクターの核酸配列は配列番号１として示されている。ＨＢＢターゲティングベクターの核酸配列は配列番号２として示されている。ＣＣＲ５ターゲティングベクターの核酸配列は配列番号３として示されている。
４．細胞培養およびヌクレオフェクション
Ｋ５６２細胞およびＴ細胞を、３７℃、５％ＣＯ２、および周囲酸素レベルで培養した。ＣＤ３４＋造血幹細胞／造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）を、３７℃、５％ＣＯ２、および５％Ｏ２で培養した。Ｋ５６２細胞を、１０％ ウシ成長血清、１００ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、１００ユニット／ｍｌ ペニシリン、および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを追加したＲＰＭＩ １６４０（ＨｙＣｌｏｎｅ）中で維持した。Ｋ５６２細胞を、Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ２ｂ（プログラムＴ−０１６）、および１００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１２ｍＭ ＭｇＣｌ２×６Ｈ２０、８ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ グルコースを含有するヌクレオフェクションバッファー（ｐＨ７．４）を用いてヌクレオフェクションした。ヌクレオフェクション条件は、１００μＬ ヌクレオフェクション溶液、１０６個の細胞、１〜２０μｇ 化学修飾型ｓｇＲＮＡ、１〜１５μｇ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、５ｍｅＣ、Ψ、製品コード：Ｌ−６１２５、ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、２μｇ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９コードプラスミド、または５μｇ ＨＲドナープラスミドである。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ヒトＰａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒから入手されたバフィーコートから単離した。ＣＤ３＋細胞を、５％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、１００ＩＵ／ｍＬ ヒト組換えＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ、ＵＳＡ）、および１０ｎｇ／ｍＬ ヒト組換えＩＬ−７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を追加したＸ−ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）中で維持した。ヌクレオフェクション前に、Ｔ細胞を、固定化抗ＣＤ３抗体（クローン：ＯＫＴ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）および可溶性抗ＣＤ２８抗体（クローン：ＣＤ２８．２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で３日間、活性化した。非活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞について、細胞を、単離後すぐにヌクレオフェクションした。Ｔ細胞を、Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ２ｂ（プログラムＵ−０１４）およびヒトＴ細胞Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（ＶＰＡ−１００２、Ｌｏｎｚａ）を用いてヌクレオフェクションした。ヌクレオフェクション条件は、１００μＬ ヌクレオフェクション溶液、１０６個の細胞、１０〜２０μｇ 化学修飾型ｓｇＲＮＡ、１５〜３０μｇ Ｃａｓ９（または１５μｇ ｅＧＦＰ ｍＲＮＡ、ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、１μｇ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９コードプラスミドである。動員化ヒト末梢血ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを、ＡｌｌＣｅｌｌｓから購入し、製造会社の使用説明書に従って解凍した。ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ３−リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ１（０．７５ｍＭ）を追加したＸ−ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ）中で維持した。ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（プログラムＥＯ−１００）およびＰ３初代細胞４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ｖ４ＸＰ−３０２４）を用いて、ヌクレオフェクションした。ヌクレオフェクション条件は、１００μＬ ヌクレオフェクション溶液、５×１０５個の細胞、１０μｇ 化学修飾型ｓｇＲＮＡ、１５μｇ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、１μｇ プラスミドである。Ｃａｓ９ ＲＮＰ実験について、Ｃａｓ９タンパク質をＰＮＡ Ｂｉｏ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）またはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。図８を除く全てのＲＮＰ実験について、ＰＮＡ Ｂｉｏ社製のＣａｓ９タンパク質を用いた。Ｃａｓ９タンパク質を、ｓｇＲＮＡと、１：２．５のＣａｓ９：ｓｇＲＮＡモル比で、２５℃で１０分間、複合体化させた。ＲＮＰを、上記のように、１００μＬのそれぞれのヌクレオフェクション溶液中の１０６個の細胞を用いて、Ｋ５６２細胞またはＴ細胞へヌクレオフェクションした。二重ｓｇＲＮＡ実験について、全ｓｇＲＮＡ量は、１０μｇであった（個々に用いられる場合は１０μｇ、一緒に用いられる場合は２×５μｇ）。Ｔ細胞とＣＤ３４＋ＨＳＰＣの両方について、ｓｇＲＮＡを、１５μｇ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡと共に１０６個の細胞へヌクレオフェクションした。Ｔ細胞ヌクレオフェクションを上記のように実施したが、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣのヌクレオフェクションは、Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ２ｂ（プログラムＵ−０１４）およびヒトＴ細胞Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（ＶＰＡ−１００２、Ｌｏｎｚａ）を用いるＴ細胞ヌクレオフェクションと同様であった。ヌクレオフェクション後すぐに、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを、３０℃で２４時間、インキュベートし、その後、それらを、ゲノムＤＮＡの採取まで、３７℃へ移した。
５．フローサイトメトリおよび蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）
ＨＲ実験について、エピソームプラスミドからのｅＧＦＰ発現が残存していない時点の、細胞型に依存してヌクレオフェクションから２〜３週間後、細胞を分析した。ｅＧＦＰ発現を、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）において測定した。細胞死を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｒｅｄ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、製造会社の使用説明書に従って測定し、細胞をＡｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーターで分析した。ＣＤ３＋Ｔ細胞のＣＤ４＋集団およびＣＤ８＋集団へのソーティングについて、細胞を、ＰＥ−Ｃｙ７抗ヒトＣＤ４（クローン：ＲＰＡ−Ｔ４、Ｔｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＡＰＣ抗ヒトＣＤ８ａ（クローン：ＲＰＡ−Ｔ８、Ｔｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の混合物で染色し、その２つの集団をＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ ＳＯＲＰにおいてソーティングした。
６．ＴＩＤＥおよびＴ７アッセイを用いる対立遺伝子改変頻度の測定
ＴＩＤＥおよびＴ７アッセイについて、（他に指示がない場合には）ヌクレオフェクションから３日後、ｇＤＮＡを細胞から、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて製造会社の使用説明書に従って抽出した。ｓｇＲＮＡゲノム標的部位に及ぶＰＣＲアンプリコンを、ｉＰｒｏｏｆ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、以下のプライマー対で作製した：
ＩＬ２ＲＧ＿ｆｗ（配列番号８４）：５’−ＴＣＡＣＡＣＡＧＣＡＣＡＴＡＴＴＴＧＣＣＡＣＡＣＣＣＴＣＴＧ−３’、
ＩＬ２ＲＧ＿ＲＶ（配列番号８５）：５’−ＴＧＣＣＣＡＣＡＴＧＡＴＴＧＴＡＡＴＧＧＣＣＡＧＴＧＧ−３’、
ＨＢＢ＿ｆｗ（配列番号８６）：５’−ＣＣＡＡＣＴＣＣＴＡＡＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＧＡＡＧＡＧ−３’、
ＨＢＢ＿ｒｖ（配列番号８７）５’−ＡＧＴＣＡＧＴＧＣＣＴＡＴＣＡＧＡＡＡＣＣＣＡＡＧＡＧ−３’、
ＣＣＲ５＿ｆｗ（配列番号８８）：５’−ＧＣＡＣＡＧＧＧＴＧＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧ−３’、
ＣＣＲ５＿ｒｖ（配列番号８９）：５’−ＣＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＴＧＡＣＣＧＴ−３’。
Ｔ７アッセイについて、ＰＣＲアンプリコンを精製し、製造会社のプロトコールに従って、２００ｎｇを、サーモサイクラーにおいて変性および再アニールさせ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で消化した。消化されたＤＮＡを、４〜２０％ ＴＢＥポリアクリルアミドゲル上に流し、Ｄｉａｍｏｎｄ核酸色素（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）で染色し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）において可視化した。バンド強度を、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて分析し、対立遺伝子改変頻度を、式：１００×（１−（１−切断された割合）０．５）で計算した。ＴＩＤＥ（Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｉｎ／ｄｅｌｓ ｂｙ Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（分解によるイン／デルのトラッキング）、Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２， ｅ１６８ （２０１４））を用いる対立遺伝子改変頻度の分析について、精製ＰＣＲ産物を、両方のプライマーを用いてサンガーシーケンシングし、各配列クロマトグラムを、ウェブサイトｔｉｄｅ．ｎｋｉ．ｎｌで入手できるオンラインＴＩＤＥソフトウェアで分析した。ｍｏｃｋでトランスフェクトされた試料からの参照配列を用いて分析を実施した。パラメータを、１０ヌクレオチドの最大イン／デルサイズ、および高品質トレースでできる限り最大のウィンドウを網羅する分解ウィンドウに設定した。３．５％の検出感度未満の全てのＴＩＤＥ分析を０％に設定した。ＴＯＰＯクローニングされたＰＣＲ断片のシーケンシングについて、切断部位に及ぶ２．１ｋｂアンプリコン（ＷＴサイズ）を、ｉＰｒｏｏｆ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘならびにプライマー５’−ＧＧＣＴＧＴＴＧＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＣＣＴＴＣＣＣ−３’（配列番号９０）および５’−ＴＧＴＡＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＧＣＴＣＧ−３’（配列番号９１）を用い、７２℃のアニーリング温度および２分間の伸長時間を含む２５サイクルで作製した。ＰＣＲ反応産物を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニングキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製造会社のプロトコールに従って、プラスミドへ直接、サブクローニングした。ＴＯＰＯ反応を、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅコンピテント細胞へ形質転換し、カナマイシンを含む寒天プレート上に蒔き、単一コロニーは、プレートから直接的に、ＭｃＬａｂ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）により、ローリングサークル増幅、続いて、プライマー５’−ＧＣＡＣＡＧＧＧＴＧＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧ−３’（配列番号９２）を用いるシーケンシングによって、シーケンシングされた。
７．増殖アッセイ
ヌクレオフェクション後のＴ細胞の増殖を測定するために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ ２．０アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いた。ヌクレオフェクション後すぐに、Ｔ細胞を、マルチプル９６ウェルＵ底９６ウェルプレートへ、３×１０４細胞／ウェルで移した。ヌクレオフェクション後すぐに、および２４時間間隔で、細胞を、白色９６ウェルプレート内の１００μＬ培地中へ移し、製造会社のガイドライン通り、１００μＬ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ ２．０を加えた。発光を、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ ＰＲＯ（Ｔｅｃａｎ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）において１秒間積分時間を用いて、読み取った。
８．ゲノム改変の効率および特異性を定量化するためのディープシーケンシング
各遺伝子ターゲティング実験について、ゲノムＤＮＡを、トランスフェクションから４８時間後、様々なＣＲＩＳＰＲ処理されたＫ５６２細胞および対照Ｋ５６２細胞から抽出した。ＣＲＩＳＰＲ標的に隣接するゲノム領域および３つのオフターゲット（表２）を、２ラウンドのＰＣＲにより増幅して、（処理特異的）バーコードおよびＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングアダプターを付着させた（表３）。バーコード付きＰＣＲアンプリコンを等モルでプールし、スピンカラムにより精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ＤＮＡシーケンサープラットフォームにおいてシーケンシングした。さらなる詳細については、下記の「９．ディープシーケンシングのためのＣＲＩＳＰＲオンターゲットおよび予測オフターゲットアンプリコンの作製」セクションを参照。
表２は、ＰＣＲアンプリコンのディープシーケンシングにより問い合わせられたオンターゲットおよびオフターゲット遺伝子座のリストを提供する。ＣＣＲ５、ＨＢＢ、およびＩＬ２ＲＧターゲティングＣＲＩＳＰＲ実験について、意図されたゲノム標的配列（「オン」）および３つのコンピュータ的に予測されたＯＦＦ標的配列（「ＯＦＦ１〜３」）は、それらのゲノム位置（ヒトゲノム構築アセンブリｈｇ３８）と共に提示されている。選択されたオフターゲット配列は、ＨＢＢ−ＯＦＦ３（それは、ＣＯＳＭＩＤによって有意な活性を有すると予測されただけだった）を除いて、ＣＯＳＭＩＤ（Ｃｒａｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ３， ｅ２１４ （２０１４））および最適化ＣＲＩＳＰＲデザイン（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３１， ８２７−８３２ （２０１３））ウェブツール（ＭＩＴデザイン）の両方による予測された上位スコアラーであった。予測標的活性は、ＣＯＳＭＩＤスコア値の増加および「ＭＩＴデザイン」スコア値の減少と共に増加する。ＰＡＭ部位およびオフターゲット配列におけるミスマッチは、それぞれ、赤色テキストおよび太字のテキストにより示されている。
表３は、ディープシーケンシングによりイン／デル頻度を定量化するためのオンターゲットおよびオフターゲットアンプリコンの作製に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーのリストを提供する。遺伝子特異的アンプリコンプライマーの遺伝子特異的ハイブリダイゼーション配列、およびＩｌｌｕｍｉｎａバーコーディングプライマーのバーコードは、それぞれ、下線および太字のテキストで示されている。
遺伝子特異的アンプリコンプライマーの遺伝子特異的ハイブリダイゼーション配列、およびＩｌｌｕｍｉｎａバーコーディングプライマーのバーコードは、それぞれ、下線および太字のテキストで示されている。
シーケンシングデータの分析について、異なる処理からの読み取りを、それらの対応する処理バーコードにより区分けし、デフォルトパラメータでＢＷＡ−ＭＥＭ（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６， ５８９−５９５ （２０１０））（ｂｗａ−０．７．１０）を用いてゲノムへマッピングした。不一致の対形成された末端マッピング（＞１Ｋｂｐ離れた）を、ＢＷＡ−ＭＥＭにおけるデフォルトパラメータにより定義されているような低品質マッピングされ、かつ二次アラインメントされた読み取りと共に、分析から取り除いた。オンターゲットおよびオフターゲット領域のそれぞれについて、本発明者らは、予測切断部位（予測切断部位は、ＰＡＭ部位から上流へ３番目と４番目の間の位置であると推定される）の周囲のイン／デルを有する読み取りの％を計算した。ゲノムにおける各位置についてのイン／デル％を、イン／デル［ｉ］＝（Ｉ［ｉ］＋Ｄ［ｉ］）／Ｃ［ｉ］（式中、Ｄ［ｉ］およびＩ［ｉ］は、それぞれ、位置ｉにおける任意のサイズの欠失または挿入を有する読み取りの数を示し、Ｃ［ｉ］は、位置ｉを含有する任意のゲノム区間にマッピングされた読み取りの数を示す）を用いることにより計算した。その後、各標的についてのイン／デル％を、イン／デル［ｃ］（式中、ｃは、ＰＡＭ部位から上流へ４番目の位置である予想された切断部位である）により計算した。位置４におけるホモヌクレオチド配列、ＩＬ２ＲＧにおける「ＡＡ」およびＣＣＲ５における「ＣＣＣ」、および挿入事象を有する場合、ＢＷＡ＿ＭＥＭアライナーは、その挿入されたヌクレオチドの位置を決定することができない。これは、位置４の代わりにアラインメントレポートにおいて関連位置を選ぶこと、具体的には、ＩＬ２ＲＧおよびＣＣＲ５オフターゲットについて、それぞれ、位置３および６を選ぶことにより是正された。
９．ディープシーケンシングのためのＣＲＩＳＰＲオンターゲットおよび予測オフターゲットアンプリコンの作製
各標的遺伝子座について、１０６個のＫ５６２細胞に、１μｇかもしくは２０μｇのいずれかの合成ガイドＲＮＡ（非修飾型、Ｍ、ＭＳ、またはＭＳＰ）および２μｇのＣａｓ９発現プラスミド（ＰＸ３３０）、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質の両方をコードする２μｇのｓｇＲＮＡプラスミド（陽性対照）、または２μｇのＰＸ３３０のみ（Ｃａｓ９のみ、陰性対照）をトランスフェクトした。追加として、ＩＬ２ＲＧ遺伝子座を標的にする実験について、１０６個のＫ５６２細胞に、１５μｇ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよび１０μｇの合成ガイドＲＮＡ（非修飾型またはＭＳ）、７．６μｇ 合成ガイドＲＮＡ（非修飾型またはＭＳ）とあらかじめ複合体化した１５μｇ Ｃａｓ９タンパク質をトランスフェクトした。これらの試料およびｍｏｃｋトランスフェクション試料（第２の陰性対照）由来のゲノムＤＮＡを、トランスフェクションから７２時間後、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、製造会社の仕様書に従って、抽出した。ＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩ ＨＳ ２ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）、およびＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）プラットフォームによるディープシーケンシングにおいて利用されるシーケンシングプライマーと共にアンプリコン末端をタグ付けする遺伝子特異的プライマー（表３）を用いる、オンターゲットおよび３つのコンピュータ的に予測されたオフターゲット遺伝子座（表２）のＰＣＲ増幅のための鋳型として、４０ｎｇのゲノムＤＮＡを用いた。オンターゲットおよびオフターゲットアンプリコン（表４）に２回目のＰＣＲ反応を行って、追加のＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングアダプター（すなわち、Ｐ５、Ｐ７）、および対応するトランスフェクション処理を一意的に同定するカスタムの二重８ｂｐバーコードを付加した。２回目のＰＣＲ後、バーコード付きアンプリコンを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｄ１０００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎにより定量化し、等モル濃度でプールし、その後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて、製造会社の使用説明書に従って精製した。精製されたライブラリーは、ＮＧＳ ＤＮＡシーケンシングサービス（Ｓｅｑｍａｔｉｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）により、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ＤＮＡシーケンサーにおいて、二重インデキシングで２×２０１サイクルで、シーケンシングされた。
表４は、イン／デル頻度のディープシーケンシング分析のために作製されたＣＣＲ５、ＨＢＢ、およびＩＬ２ＲＧのオンターゲットおよびオフターゲットアンプリコンのリストを提供する。（編集されていないゲノムＤＮＡの）アンプリコンサイズは、１８３〜２２０ｂｐの範囲であり、標的部位から遺伝子特異的プライマーのハイブリダイゼーション配列まで最短５０ｂｐである。ゲノムＤＮＡからのアンプリコン産生に用いられるハイブリダイゼーション配列および推定ＣＲＩＳＰＲ標的部位は、それぞれ、下線および太字のテキストで示されている。
（編集されていないゲノムＤＮＡの）アンプリコンサイズは、１８３〜２２０ｂｐの範囲であり、標的部位から遺伝子特異的プライマーのハイブリダイゼーション配列まで最短５０ｂｐである。ゲノムＤＮＡからのアンプリコン産生に用いられるハイブリダイゼーション配列および推定ＣＲＩＳＰＲ標的部位は、それぞれ、下線および太字のテキストで示されている。
１０．化学修飾型ｓｇＲＮＡのオンターゲットおよびオフターゲット活性
表５は、図１Ｃ、１Ｅ、および５が基づいている数を示す。２μｇ Ｃａｓ９プラスミド、および１μｇ ｓｇＲＮＡ（上部パネル）かまたは２０μｇ ｓｇＲＮＡ（下部パネル）のいずれかに関して、図１Ｃにおいて実施されているような合成ｓｇＲＮＡによって媒介される標的化切断の特異性。イン／デル頻度を、標的ゲノム遺伝子座由来のＰＣＲアンプリコン、および各遺伝子についてバイオインフォマティクス的に予測されたオフターゲット遺伝子座のディープシーケンシングにより測定した。平均値は、＋／−ＳＥＭ、ｎ＝３で示されている。
［実施例２］
化学修飾型ガイドＲＮＡおよび合成一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）鋳型を用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに基づいた相同組換え
３つの異なるドナー由来の刺激ヒト初代Ｔ細胞に、１０μｇ ＣＣＲ５ ｓｇＲＮＡ（非修飾型またはＭＳ）、１５μｇ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、および２．８１μｇの１８３ｎｔ ＣＣＲ５ ｓｓＯＤＮ（両末端における３個の終端ヌクレオチド間のホスホロチオエート（「ＰＳ」）結合の有りまたは無し）をヌクレオフェクションした。ｓｓＯＤＮは、ＷＴ ＣＣＲ５配列には存在しない、中央のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有した。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、ヌクレオフェクションから３日後、抽出し、標的部位から（ｓｓＯＤＮに相同的な配列の外側へ）及ぶＰＣＲ産物を作製し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。制限断片を、２％ＴＢＥアガロースゲル上で分析し、ＨＤＲ頻度を計算した。
図２１は、ＨＤＲ実験からのアガロースゲルを描く。修飾型ｓｇＲＮＡが用いられた場合、ＨＤＲ頻度は増加した。加えて、ｓｓＯＤＮが両末端における３個の終端ヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含有した場合、ＨＤＲ頻度はさらに増加した。
前述の発明は、理解を明りょうにするために、例証および例としてかなり詳細に記載されているが、当業者は、ある特定の変化および改変が、添付の特許請求の範囲内で実施され得ることを認識しているだろう。加えて、本明細書に提供された各参考文献は、各参考文献を個々に引用することにより本明細書の一部をなすものとするのと同じ程度でその全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
非公式の配列表
配列番号１
ＩＬ２ＲＧターゲティングベクター配列
ＩＬ２ＲＧ相同アームは太字でイタリック体である。キメラのイントロンは下線を付している。ＧＦＰ配列は大文字でイタリック体である。ＢＧＨポリ（Ａ）配列は二重線を付している。
配列番号２
ＨＢＢターゲティングベクター配列
ＨＢＢ相同アームは太字でイタリック体である。ＥＦ１αプロモーターは下線を付している。ＧＦＰ配列は大文字でイタリック体である。ＢＧＨポリ（Ａ）配列は二重線を付している。
配列番号３
ＣＣＲ５ターゲティングベクター配列
ＨＢＢ相同アームは太字でイタリック体である。ＥＦ１αプロモーターは下線を付している。ＧＦＰ配列は大文字でイタリック体である。ＷＰＲＥ配列は破線が引かれている。ＢＧＨポリ（Ａ）配列は二重線が引かれている。
配列番号４〜１９
表１参照。
配列番号２０〜３１
表２参照。
配列番号３２〜７１
表３参照。
配列番号７２〜８３
表４参照。
配列番号８４
ＩＬ２ＲＧ＿ｆｗ：５’−ＴＣＡＣＡＣＡＧＣＡＣＡＴＡＴＴＴＧＣＣＡＣＡＣＣＣＴＣＴＧ−３’、
配列番号８５
ＩＬ２ＲＧ＿ＲＶ：５’−ＴＧＣＣＣＡＣＡＴＧＡＴＴＧＴＡＡＴＧＧＣＣＡＧＴＧＧ−３’
配列番号８６
ＨＢＢ＿ｆｗ：５’−ＣＣＡＡＣＴＣＣＴＡＡＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＧＡＡＧＡＧ−３’
配列番号８７
ＨＢＢ＿ｒｖ：５’−ＡＧＴＣＡＧＴＧＣＣＴＡＴＣＡＧＡＡＡＣＣＣＡＡＧＡＧ−３’
配列番号８８
ＣＣＲ５＿ｆｗ：５’−ＧＣＡＣＡＧＧＧＴＧＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧ−３’
配列番号８９
ＣＣＲ５＿ｒｖ：５’−ＣＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＴＧＡＣＣＧＴ−３’
配列番号９０
５’−ＧＧＣＴＧＴＴＧＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＣＣＴＴＣＣＣ−３’
配列番号９１
５’−ＴＧＴＡＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＧＣＴＣＧ−３’
配列番号９２
５’−ＧＣＡＣＡＧＧＧＴＧＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧ−３’

Claims (50)

  1. 初代細胞において標的核酸の遺伝子調節を誘導するための方法であって、
    （ａ）標的核酸に相補的な第１のヌクレオチド配列、およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列を含む修飾型単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、前記第１のヌクレオチド配列および／または前記第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの１個または複数が修飾型ヌクレオチドである、修飾型単一ガイドＲＮＡ；ならびに
    （ｂ）Ｃａｓポリペプチド、ＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、および／またはＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター
    を初代細胞へ導入するステップ
    を含み、
    前記修飾型ｓｇＲＮＡが前記Ｃａｓポリペプチドを標的核酸へ導き、
    前記修飾型ｓｇＲＮＡが、対応する非修飾型ｓｇＲＮＡと比較して増強した活性で標的核酸の遺伝子調節を誘導する、方法。
  2. 前記増強した活性が、前記修飾型ｓｇＲＮＡの増加した安定性および／または前記修飾型ｓｇＲＮＡの標的核酸に対する増加した特異性を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記標的核酸が標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記遺伝子調節が前記標的ＤＮＡのゲノム編集を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ゲノム編集が、標的ＤＮＡの相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 組換えドナー修復鋳型を前記初代細胞へ導入するステップをさらに含む、請求項４または５に記載の方法。
  7. 前記組換えドナー修復鋳型が、前記標的ＤＮＡの２つの重複しない相同部分を含む２つのヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、ゲノム編集を受ける前記標的ＤＮＡに対応するヌクレオチド配列の５’末端および３’末端に位置する、請求項６に記載の方法。
  8. 前記組換えドナー修復鋳型が、一塩基多型（ＳＮＰ）を正すための変異をコードするヌクレオチド配列を含む合成の一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）鋳型、および標的ＤＮＡの２つの重複しない相同部分を含む２つのヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、変異をコードするヌクレオチド配列の５’末端および３’末端に位置する、請求項６に記載の方法。
  9. 前記遺伝子調節が、エンドヌクレアーゼ欠損Ｃａｓポリペプチドを用いた、前記標的ＤＮＡまたは前記標的ＲＮＡの遺伝子発現の阻害または活性化を含む、請求項３に記載の方法。
  10. 前記修飾型ｓｇＲＮＡおよび前記Ｃａｓポリペプチドを前記初代細胞へ導入する前に、前記初代細胞が多細胞生物体から単離される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記多細胞生物体が、植物、多細胞原生生物、多細胞真菌、または動物である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記初代細胞が、幹細胞、免疫細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記幹細胞が、造血幹細胞・造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）、間葉幹細胞、神経幹細胞、臓器幹細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
  15. 前記修飾型ｓｇＲＮＡおよび前記Ｃａｓポリペプチドを前記初代細胞へ導入した後に、前記初代細胞またはその子孫が前記多細胞生物体へ戻される、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記初代細胞が初代細胞集団を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記修飾型ｓｇＲＮＡが、前記初代細胞集団の少なくとも約３０％において前記標的核酸の遺伝子調節を誘導する、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記修飾型ｓｇＲＮＡが、前記初代細胞集団の少なくとも約４０％において前記標的核酸の遺伝子調節を誘導する、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記修飾型ｓｇＲＮＡが、前記初代細胞集団の少なくとも約５０％において前記標的核酸の遺伝子調節を誘導する、請求項１６に記載の方法。
  20. 前記修飾型ｓｇＲＮＡが、前記初代細胞集団の少なくとも約６０％において前記標的核酸の遺伝子調節を誘導する、請求項１６に記載の方法。
  21. 前記修飾型ヌクレオチドが、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはそれらの組合せにおける修飾を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記リボース基における修飾が、前記リボース基の２’位における修飾を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記リボース基の２’位における修飾が、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−デオキシ、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記リン酸基における修飾が、ホスホロチオエート修飾を含む、請求項２１に記載の方法。
  25. 前記修飾型ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル３’−ホスホロチオエート（ＭＳ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル３’−チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）ヌクレオチド、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記第１のヌクレオチド配列が約２０ヌクレオチド長である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上が、修飾型ヌクレオチドである、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記修飾型ヌクレオチドが、前記第１のヌクレオチド配列の５’末端に、もしくは５’末端の近くに、および／または前記第１のヌクレオチド配列内の内部の位置に位置する、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの約１０％から約３０％までが修飾型ヌクレオチドである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記第２のヌクレオチド配列が約８０ヌクレオチド長である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上が、修飾型ヌクレオチドである、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記修飾型ヌクレオチドが、前記第２のヌクレオチド配列の３’末端に、もしくは３’末端の近くに、および／または前記第２のヌクレオチド配列内の内部の位置に位置する、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの約１％から約１０％までが修飾型ヌクレオチドである、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記修飾型ｓｇＲＮＡが、前記第１のヌクレオチド配列の５’末端、または５’末端の近くにおける１個、２個、または３個の連続した、または非連続の修飾型ヌクレオチド、および前記第２のヌクレオチド配列の３’末端、または３’末端の近くにおける１個、２個、または３個の連続した、または非連続の修飾型ヌクレオチドを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記修飾型ｓｇＲＮＡが、前記第１のヌクレオチド配列の５’末端における３個の連続した修飾型ヌクレオチド、および前記第２のヌクレオチド配列の３’末端における３個の連続した修飾型ヌクレオチドを含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記修飾型ｓｇＲＮＡが化学合成される、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記修飾型ｓｇＲＮＡが少なくとも２個の異なる修飾型ｓｇＲＮＡを含み、各修飾型ｓｇＲＮＡが、異なる標的核酸へ方向づけられている、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記Ｃａｓポリペプチドが、前記ＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡである、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記Ｃａｓポリペプチドが、Ｃａｓ９ポリペプチド、そのバリアント、またはその断片である、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記初代細胞へ導入するステップが、前記初代細胞をエレクトロポレーションすることを含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 対象において遺伝的疾患を予防または処置するための方法であって、
    前記遺伝的疾患に関連した標的遺伝子における変異を正すのに十分な量で修飾型単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を前記対象に投与するステップであって、前記修飾型ｓｇＲＮＡが、前記標的遺伝子に相補的な第１のヌクレオチド配列、およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列を含み、かつ前記第１のヌクレオチド配列および／または前記第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの１個または複数が修飾型ヌクレオチドである、ステップ
    を含む、方法。
  42. 前記遺伝的疾患が、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症、鎌状赤血球貧血、サラセミア、血友病、腫瘍症、癌、ＨＩＶ感染症、加齢黄斑変性、統合失調症、トリヌクレオチドリピート障害、脆弱Ｘ症候群、プリオン関連障害、筋萎縮性側索硬化症、薬物依存、自閉症、アルツハイマー病、パーキンソン病、嚢胞性線維症、血液凝固性疾患または障害、炎症、免疫関連疾患または障害、代謝性疾患、肝臓疾患および障害、腎臓疾患および障害、筋肉／骨格疾患および障害、神経学的および神経細胞の疾患および障害、心血管疾患および障害、肺疾患および障害、ならびに眼疾患および障害からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
  43. Ｃａｓポリペプチド、ＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、および／またはＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを対象に投与するステップをさらに含む、請求項４１または４２に記載の方法。
  44. 前記Ｃａｓポリペプチドが、Ｃａｓ９ポリペプチド、そのバリアント、またはその断片である、請求項４３に記載の方法。
  45. 組換えドナー修復鋳型を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項４１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記修飾型ｓｇＲＮＡの投与が、対応する非修飾型ｓｇＲＮＡの投与と比較して、前記標的遺伝子において前記変異を正す前記Ｃａｓポリペプチドの効果を増強する、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記修飾型ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓポリペプチド、および／または組換えドナー修復鋳型が、薬学的に許容される担体と共に前記対象に投与される、請求項４５または４６に記載の方法。
  48. 前記修飾型ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓポリペプチド、および／または組換えドナー修復鋳型が、ナノ粒子、リポソーム、ミセル、ビロソーム、核酸複合体、およびそれらの組合せからなる群から選択される送達系によって前記対象へ投与される、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記核酸複合体が、前記Ｃａｓポリペプチドと複合体化した前記修飾型ｓｇＲＮＡを含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記修飾型ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓポリペプチド、および／または組換えドナー修復鋳型が、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、皮下、細動脈内、脳室内、頭蓋内、病巣内、髄腔内、局所的、経粘膜、鼻腔内、およびそれらの組合せからなる群から選択される送達経路によって対象へ投与される、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載の方法。
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