CN110616233B - CRISPR-Cas9高效敲除原代T细胞基因的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及CRISPR‑Cas9高效敲除原代T细胞基因的方法及其应用。本发明具体涉及一种提高CRISPR‑Cas9敲除原代T细胞基因的效率的方法,所述方法包括向T细胞递送Cas9mRNA和化学修饰的sgRNA。该方法可应用于各种CAR‑T细胞、TCR‑T细胞、TIL细胞的制备。
Description
技术领域
本发明涉及细胞治疗领域,特别涉及CRISPR-Cas9高效敲除原代T细胞基因的方法及其应用。
背景技术
基因编辑T细胞的应用
(1)通用型CAR-T细胞治疗
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)治疗技术是通过体外转导一个识别癌细胞的人工基因于人体T细胞上,使人T细胞具有特异杀伤肿瘤细胞的能力。CAR-T细胞治疗属于过继性免疫疗法(adoptive cell transfer,ACT),它利用人体免疫细胞来对抗肿瘤,被称为“活体药物”。基因编辑在CAR-T细胞治疗中是一个非常热门的领域,究其原因在于CAR-T细胞治疗是一个非常具有潜力的抗癌疗法,已经在多种白血病治疗中取得了巨大成功。另外一点是基因编辑技术使得CAR-T细胞治疗具有更多的可变性。基因编辑CAR-T细胞本质上是一种在体外操作的基因疗法,不需要面对复杂困难的递送方式,更有可行性。目前基因编辑CAR-T细胞主要应用于通用型CAR-T细胞治疗上,具体应用有以下几点:
a.TCR基因敲除,避免GvHD,从而可用于异体移植。移植物抗宿主反应(graftversus host disease,GVHD)是由移植物中的特异性淋巴细胞识别宿主抗原而发生的一种反应。其产生的条件是移植物中包含T淋巴细胞及移植物与宿主的主要组织相容性抗原不一致。在骨髓移植中,GvHD是主要的障碍,其会杀伤宿主体内的细胞而导致多器官功能衰竭,进而引起其它并发症。在通用型CAR-T细胞治疗中,GvHD是最需要避免的一个问题,否则宿主有严重的副作用。TCR是T淋巴细胞识别靶细胞主要基因,敲除TCR基因可以避免异体T细胞对宿主细胞的攻击,所以异体移植的通用型CAR-T细胞必须将TCR基因敲除才能避免GvHD。通常只需要将TCR-α或TCR-β其中之一敲除就可以使TCR蛋白不展示在T细胞表面。
b.B2M、CIITA基因敲除,避免受体T细胞攻击,降低排异反应。不同的个体,其组织相容性抗原存在差异,从而导致了受体T细胞对移植物的攻击和排异。为解决这个问题,通常利用基因编辑的方法(如ZFN、TALEN或CRISPR-Cas9)将CAR-T细胞中的B2M基因敲除,从而使HLA-ABC蛋白无法在细胞表面展示,进而可以避免被受体T细胞攻击。也有一些研究者将CIITA基因一并敲除,来降低二类组织相容性抗原的表达。
c.PD-1、CTLA-4、LAG-3等免疫检查点基因敲除,提高通用型CAR-T疗效。PD-1、CTLA-4等免疫检查点是近年已经被证明非常有效的肿瘤免疫靶点,通过这些免疫检查点抗体来封闭肿瘤浸润T细胞(TIL细胞)从而激活已经“疲惫不堪”的TIL细胞。已经有临床研究证明直接体外敲除TIL细胞的PD-1基因可以激活TIL细胞并有效缓解肿瘤进展,也有研究证明敲除PD-1可以增强CAR-T细胞的体内和体外抗肿瘤疗效。
(2)艾滋病领域
基因编辑T细胞在艾滋病治疗领域研究较早,从ZFN基因编辑工具开始就已经开始尝试编辑T细胞基因组DNA。艾滋病病毒非常特异的侵染CD4T细胞,理论上通过编辑CD4T细胞有治疗艾滋病的潜力。其具体应用是:
a.CCR-5基因敲除,防止HIV病毒侵染CD4T细胞。CCR-5是表达于T细胞表面的一个受体蛋白,著名的“柏林病人”布朗正是移植CCR-5基因缺陷的骨髓才彻底治愈艾滋病。CCR-5在T细胞或者干细胞中敲除是艾滋病治疗非常前沿的一个方向。
(3)TCR-T领域
TCR是T细胞受体(T cell receptor)的缩写。在普通的T细胞上,这些受体能特异性地识别癌细胞表面或内部的靶点。在TCR-T疗法中,研发人员分离出内源性TCR,并加以工程化改造,将其引入全新的T细胞,并输注回人体。TCR-T疗法在一些实体瘤中表现出了治疗的潜力,基因编辑应用于TCR-T细胞疗法主要有:
a.TCR双链同时敲除,避免外源性TCR与内源性TCR错配。TCR-T细胞制作过程中外源性TCR容易与内源性TCR蛋白形成异二聚体,这种二聚体并不能识别目的肿瘤抗原,甚至会识别正常的细胞抗原而引起严重的副作用。不同于通用CAR-T中只需要敲除一个TCR链(TCR-α或TCR-β),TCR-T细胞需要将TCR双链同时敲除才能起到好的治疗效果,因为内源性TCR-α或TCR-β都可能与外源性TCR-β或TCR-α结合。
b.PD-1、CTLA-4、LAG-3等免疫检查点基因敲除,提高TCR-T细胞治疗疗效。原理和基因编辑通用型CAR-T一样。
细胞基因敲除方法
(a)ZFN
锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease,ZFN)又名锌指蛋白核酸酶(ZFPN),它是一类人工合成的限制性内切酶,由锌指DNA结合域(zinc finger DNA-binding domain)与限制性内切酶的DNA切割域(DNA cleavage domain)融合而成。研究者可以通过加工改造ZFN的锌指DNA结合域,靶向定位于不同的DNA序列,从而使得ZFN可以结合复杂基因组中的目的序列,并由DNA切割域进行特异性切割。此外,通过将锌指核酸酶技术和胞内DNA修复机制结合起来,研究者还可以自如地在生物体内对基因组进行编辑。目前,在大量植物、果蝇、斑马鱼、蛙、大/小鼠及牛等物种中,ZFN技术已被广泛应用于靶向基因的突变,通过人工修改基因组信息可以产生遗传背景被修改的新物种。该技术在医学领域也具有非常重大的价值,对于疾病的基因治疗有潜在意义,具有非常广泛的应用前景。
(2)TALEN
近年又发现了另外一种简单的DNA识别模块,那就是TALE核酸酶中的DNA识别模块。TALE蛋白是一种源自植物致病菌—黄单包杆菌(Xanthomonas)的天然蛋白,其中也含有DNA结合结构域。TALE蛋白中的DNA结合结构域是由一连串33~35个氨基酸组成的重复结构域组成的,其中每一个结构域都能够识别一个碱基。TALE核酸酶的DNA结合特异性主要由两个高度可变的氨基酸决定,科学家们将这两个关键的氨基酸称作重复可变双氨基酸残基位点(repeat-variable di-residues,RVD)。与锌指结构域一样,这种TALE重复模块也能够串联起来,识别一长串的DNA序列。但是克隆这么一大段TALE蛋白DNA序列识别结构域的重复编码序列也是一个不小的挑战。为了解决这个问题,科学家们也想出了不少的办法,现在就已经有好几种方案能够让科研人员快速地组装出任意搭配的TALE蛋白DNA序列识别结构域。有多个使用了各种组装策略的大规模的、***性研究项目表明,TALE重复识别模块可以组装在一起,识别任何DNA序列。自2010年正式发明TALEN技术以来,全球范围内多个研究小组利用体外培养细胞、酵母、拟南芥、水稻、果蝇及斑马鱼等多个动植物体系验证了TALEN的特异性切割活性。
(3)CRISPR-Cas9
CRISPR(Clusters of Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)技术在2012年由麻省理工学院和加州大学伯克利分校的科学家共同发现,是一种由RNA序列介导的双链DNA内切酶工具。其由两个部分构成,其中之一是100bp左右的sgRNA,用于靶向识别目的双链DNA,另一部分是1369个氨基酸的Cas9蛋白,其可结合sgRNA,并且具有DNA酶活性,人为设计的sgRNA和Cas9蛋白形成复合体后可对目的DNA进行特异性切割,当切割造成错配修复,则导致基因移码而起到敲除目的,当添加一段修复DNA序列,则会进行有目的的编辑。自CRISPR-Cas9技术问世至今,已经在很多个领域得到应用。
CRISPR-Cas9基因敲除用到的递送载体包括:
1.质粒载体
质粒载体通常是把Cas9基因和sgRNA分别置于两个或一个质粒载体中表达,通过脂质体或者电穿孔方法将质粒转导入T细胞中。其优点是:操作简单,材料成本低。其缺点是:首先,DNA毒性对原代T细胞伤害大,不利于后面的培养扩增,其次,质粒递送使Cas9蛋白和sgRNA相对处于长时间的表达,会增大脱靶的概率。
2.慢病毒载体
慢病毒载体同样是将Cas9基因和sgRNA分别置于两个或一个慢病毒载体中,通过慢病毒包装、感染将CRISPR-Cas9组分递送入T细胞中。其优点是:对细胞损害小、对仪器要求低。缺点是:长时间表达Cas9蛋白和sgRNA导致更多的脱靶概率。
3.mRNA
mRNA递送方式是把Cas9蛋白编码的DNA在体外转录成mRNA,sgRNA也由体外转录而成。利用电穿孔的方法将Cas9 mRNA和sgRNA同时转入T细胞中。其优点是:脱靶率相对较低(因为Cas9 mRNA和sgRNA都是短暂表达)。
4.RNP
RNP方式是将Cas9蛋白和sgRNA在体外形成RNP复合体,然后通过电穿孔的方式将RNP送入T细胞中。其优点是:敲除效率高、脱靶率低(Cas9蛋白和sgRNA会在24小时内被T细胞全部降解)。其缺点是:绝对无内毒素的Cas9蛋白不易获得,对试剂和仪器要求都相对较高。
5.AAV
AAV递送是将Cas9基因和sgRNA分别或同时装入腺相关病毒载体(AAV),然后通过体外感染T细胞而达到敲除基因的目的,在体内目的基因敲除中AAV递送是最常用的方法。其在体外敲除T细胞基因的优势是:AAV相对慢病毒更加安全,AAV病毒不整合,理论上脱靶率更低。其缺点是:体外感染效率低,敲除效果不如其它方法,另外其病毒包装纯化相对慢病毒要复杂。
在原代T细胞中提高CRISPR-Cas9基因敲除效率的方法包括:
1.sgRNA的选择
通常在设计针对目的基因的sgRNA时,都是利用相应的专业网站,如crispr.mit.com、http://zifit.partners.org/ZiFiT/等。总体一个原则是尽量设计在一个基因CDS的5’端,但是具体的敲除效果也不一定是越靠近5’端越高,通常需要多设计几个,从中选出最佳一条sgRNA。
2.多次电穿孔方式
因为T细胞内部的RNA酶对于外来的sgRNA非常敏感,普通的mRNA电穿孔方法将Cas9 mRNA和sgRNA导入T细胞内,其中的sgRNA会在数小时内被核酸酶降解,此时的Cas9mRNA还并未翻译成蛋白质,所以导致这种方法敲除T细胞目的基因的效率并不高(10%不到)。宾夕法尼亚大学的赵阳兵博士通过将Cas9 mRNA和sgRNA分别于第一天和第二天电穿孔转导,在第二天转导sgRNA时,T细胞内已经有Cas9蛋白,这种方法能使敲除效率达到90%,但是,两次电击T细胞必然会导致其状态不好而影响其扩增。
发明内容
为了解决以上技术问题,本发明首先提供:
本发明的第一个方面,提供一种提高CRISPR-Cas9敲除原代T细胞基因的效率的方法,所述方法包括向T细胞递送Cas9 mRNA和化学修饰的sgRNA。
本发明的第二个方面,提供第一个方面所述的方法,其中所述化学修饰的sgRNA在头尾1-10个碱基具有(i)甲基化修饰;(ii)磷酸化修饰;和/或(iii)能够稳定sgRNA的其它修饰。
本发明的第三个方面,提供第二个方面所述的方法,其中所述甲基化修饰为2’-O-甲基化修饰,并且所述磷酸化修饰为3’硫代磷酸化修饰。
本发明的第四个方面,提供第一个方面所述的方法,其中所述Cas9类型包括:SpCas9、SaCas9、SpCas9-HF、eSpCas9、xCas9和cpf1,优选SpCas9,其氨基酸序列如SEQ IDNO:1。
本发明的第五个方面,提供第一个方面所述的方法,其中Cas9 mRNA采用如下方法获得:将Cas9基因克隆至质粒载体后,PCR扩增出5’端带有T7或SP6启动子的Cas9 DNA片段,并体外转录为Cas9 mRNA。
本发明的第六个方面,提供第一个至第五个方面中任一方面所述的方法,其中所述Cas9 mRNA含有入核信号,所述入核信号优选SV40 NLS和核质蛋白NLS,其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
本发明的第七个方面,提供第一个至第五个方面中任一方面所述的方法,其中靶向TRAC基因的sgRNA包含SEQ ID NO:4的DNA序列,靶向B2M基因的sgRNA包含SEQ ID NO:5的DNA序列。
本发明的第八个方面,提供第一个至第五个方面中任一方面所述的方法,所述方法还包括激活T细胞,并且在T细胞激活后2-5天采用电穿孔方式将所述Cas9 mRNA和化学修饰的sgRNA同时导入激活的T细胞。
本发明的第九个方面,提供第八个方面所述的方法,其中电转转导时Cas9 mRNA和化学修饰的sgRNA的质量比为1:1至10:1。
本发明的第十个方面,提供第一个方面所述的方法,其中所述Cas9mRNA可以用Cas9蛋白或者表达Cas9的质粒代替。
本发明的第十一个方面,提供一种基因敲入方法,一种基因敲入方法,所述基因敲入方法包括使用第一个方面至第十个方面中任一方面所述的方法进行敲除后应用修复模板,所述修复模板优选包括腺相关病毒、非整合型慢病毒、单链DNA、双链DNA、质粒DNA。
本发明的第十二个方面,提供根据第一个至第十个方面中任一方面所述的方法制备的细胞,所述细胞包括CAR-T细胞、TCR-T细胞和TIL细胞。
本发明的第十三个方面,提供第十二个方面的细胞,其中根据第一个至第十个方面中任一方面所述方法单敲除TRAC、TRBC1、或TRBC2基因以制备通用型CAR-T细胞;或者根据第一个至第十个方面中任一方面所述的方法同时敲除TRAC和TRBC(TRBC1或TRBC2)基因以制备通用型TCR-T细胞。
本发明的第十四个方面,提供第十二个方面所述的细胞,其中根据第一个至第十个方面中任一方面所述方法敲除基因CIITA、PD-1、LAG-3、TIM-3、TIGIT、CD96以用于增强CAR-T、TCR-T和TIL细胞的疗效。
本发明的第十五个方面,提供第十二个至十四个方面中任一方面所述的细胞在制备用于治疗白血病、实体肿瘤、艾滋病、I型糖尿病或自身免疫疾病的药物中的用途。
附图说明
图1显示了修饰sgRNA介导目的基因识别和编辑的发生过程。1.sgRNA和Cas9 mRNA通过电穿孔或其它方式进入T淋巴细胞胞浆。2.约8小时以后,Cas9 mRNA在核糖体翻译成Cas9蛋白。3.Cas9蛋白和sgRNA在细胞浆形成RNA蛋白复合体。4.该RNA蛋白复合体由入核信号引导进入细胞核。5.RNA蛋白复合体识别目的DNA并进行剪切。6.普通sgRNA在进入T淋巴细胞后很快发生降解。7.修饰sgRNA进入T淋巴细胞后能相对稳定的存在。
图2为修饰和未修饰的核糖核苷酸的效果图。
图3显示了CRISPR-Cas9敲除T细胞TCR基因后的流式检测。T细胞在电穿孔SpCas9mRNA和相应的sgRNA后7天检测TCR蛋白的表达。
图4显示了CRISPR-Cas9敲除T细胞B2M基因后的流式检测。T细胞在电穿孔SpCas9mRNA和相应的sgRNA后7天检测HLA-ABC蛋白的表达,由于B2M蛋白与HLA-ABC蛋白形成异源二聚体,敲除B2M基因后可以用HLA-ABC蛋白表达来指征。
图5显示了电穿孔不同组分后细胞存活状态监测。
具体实施方式
定义
“通用型CAR-T细胞治疗”涉及单次生产的CAR-T细胞可供数十个甚至上百个病人使用,不需要定制时间,是“摆在货架”上的货物。
“ZFN”,即锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases),其由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA识别域是由一系列Cys2-His2锌指蛋白(zinc-fingers)串联组成(一般3~4个),每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。ZFN是一种较早的基因编辑方法。
“TALEN”是指转录激活因子样效应因子核酸酶(Transcription activator-likeeffector nucleases),是一种新的基因编辑工具,原理是:通过DNA识别模块将TALEN元件靶向特异性的DNA位点并结合,然后在FokI核酸酶的作用下完成特定位点的剪切,并借助于细胞内固有的同源定向修复(HDR)或非同源末端连接途径(NHEJ)修复过程完成特定序列的***(或倒置)、删失及基因融合。
“CRISPR”是一种细菌免疫***,今年来被科学家改造为最热门的基因编辑工具。
“sgRNA”,即小向导RNA(small guide RNA),在CRISPR-Cas9技术中用于锚定靶向DNA。
“RNP”是指Cas9:crRNA:tracrRNA核糖核蛋白(RNP)复合物。
“免疫检查点基因”意指为抑制受体和抑制信号通路,这些“检查点”在正常情况下能抑制T细胞功能,同时在肿瘤组织中可能被肿瘤利用,形成免疫逃逸。
“TCR-T”是指T细胞受体疗法。
“TIL”是指肿瘤浸润淋巴细胞,它是一种新型的抗肿瘤效应细胞,具有高效、特异、副作用小等优点。
在一个方面,本发明涉及一种提高CRISPR-Cas9敲除原代T细胞基因的效率的方法,所述方法包括向T细胞递送Cas9 mRNA和化学修饰的sgRNA。
在一些实施方案中,sgRNA设计遵循PAM序列是NGG、靠近CDS区域原则,采用http://crispr.mit.edu、http://zifit.partners.org/ZiFiT/等软件设计。在一些实施方案中,化学修饰的sgRNA在头尾1-10个碱基(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基)具有(i)甲基化修饰;(ii)甲基化修饰同时磷酸化修饰;(iii)能够稳定sgRNA的其它修饰。合成的修饰sgRNA由专业的供应商提供。
在一些实施方案中,将Cas9基因克隆至质粒载体后,PCR扩增出5’端带有T7或SP6启动子的Cas9 DNA片段,并体外转录为Cas9 mRNA,其中所述Cas9基因的类型选自由以下组成的组:SpCas9、SaCas9、SpCas9-HF、eSpCas9、xCas9和cpf1。
在一些实施方案中,Cas9 mRNA含有入核信号,所述入核信号优选SV40 NLS和核质蛋白NLS。
在一些实施方案中,所述方法还包括从人血中分离PBMC,可选择分离纯化T淋巴细胞或者不分离。
在一些实施方案中,所述方法还包括激活T细胞,激活T细胞可以采用如下方法:单独的抗CD3抗体包被、抗CD3抗体/抗CD28抗体包被、直接添加单独的抗CD3抗体、直接添加抗CD3抗体/抗CD28抗体、抗CD3抗体/抗CD28抗体磁珠激活。激活时间为2到3天,若采用抗CD3抗体/抗CD28抗体磁珠激活,需去除磁珠。
在一些实施方案中,在T细胞激活后2-5天采用电穿孔方式将所述Cas9 mRNA和化学修饰的sgRNA同时导入激活的T细胞。
在一些实施方案中,其中电转转导时SpCas9 mRNA和化学修饰的sgRNA的质量比为1:1至10:1(诸如5:1)。
在一些实施方案中,培养扩增所得细胞。培养采用1640培养基+10%血清或者其它专用于T细胞培养的无血清培养基,如X-VIVO-15。放培养瓶、培养皿或者培养袋中培养,每隔1天换一次液,保证T细胞密度在1×106个/ml左右。
在另一个方面,本发明涉及一种基因敲入方法,所述基因敲入方法包括使用上述方法进行敲除后应用修复模板,所述修复模板可以包括腺相关病毒、非整合型慢病毒、单链DNA、双链DNA、质粒DNA。
在另一个方面,本发明的方法可以应用于T细胞治疗中,包括制备CAR-T细胞、TCR-T细胞、TIL细胞等。其中在CAR-T细胞治疗的应用主要是敲除TRAC、B2M基因来制备通用型CAR-T细胞,敲除PD-1及其他免疫检验点来提高CAR-T细胞疗效。在TCR-T细胞中同时敲除TCR-α和TCR-β防止内源性与外源性TCR发生错配。在TIL细胞中主要是敲除PD-1及其它免疫检验点来提高CAR-T细胞疗效。上述细胞治疗方法通过运用本专利方法来治疗白血病及各种实体肿瘤、艾滋病、I型糖尿病及一些自身免疫疾病。
本发明的有益技术效果在于:
1.敲除效率更高
经过修饰的sgRNA在T细胞中更加稳定,等到SpCas9 mRNA翻译成蛋白质后与修饰的sgRNA形成复合体对目的基因进行有效的编辑。而未修饰的sgRNA在Cas9 mRNA翻译之前大部分已经被T细胞内的核酸酶降解,所以无法与Cas9蛋白形成复合体。普通的sgRNA和SpCas9 mRNA可以在其它细胞系中起高效的敲除作用而无法适用在T细胞,原因是原代T具有相对较强的分子免疫机制。
2.无细胞毒性
Cas9 mRNA和修饰的sgRNA理论上都没有细胞毒性,本发明的实验结果也证明了这一点。
3.脱靶率更低
Cas9 mRNA通常只表达蛋白几天时间后就被细胞降解,而修饰的sgRNA也会在一天内被细胞降解,所以对目的基因和潜在脱靶区DNA的编辑是短暂的,理论上脱靶率更低。
4.更低的免疫原性
目前T细胞基因敲除中使用较多的递送方式是RNP,然而这种方式直接导入过量从细菌纯化的Cas9蛋白,容易被T细胞表面MHC蛋白提呈,如果输入体内会引起一定的免疫反应。而递送Cas9 mRNA和sgRNA至T细胞不会有过量的Cas9蛋白产生,同时RNA的免疫原性相对较低。
以下以实施例的方式描述本发明的某些具体实施方式,但是这些实施例仅用于说明目的,而不是用于限制本发明的范围。
实施例1:SpCas9 mRNA体外转录
a.体外转录所用的载体包含SpCas9基因,其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。N端为SV40 NLS肽段,其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。C端为核质蛋白NLS肽段,其氨基酸序列为SEQID NO:3:
b.设计一对引物将SV40-NLS-SpCas9-核质蛋白NLS DNA片段扩增出来,且扩增后其5端含有T7启动子序列,该引物序列如下所示:
上游引物 | TAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGACTATAAGGACCACGAC |
下游引物 | GCGAGCTCTAGGAATTCTTACTTTTTCTTTTTTGCCTG |
c.PCR扩增该DNA片段,PCR体系和扩增程序为:
d.PCR产物回收。根据试剂盒说明书进行操作,得到的回收产物测量浓度和260/280比值分别为:
浓度 | 280ng/ml |
260/280 | 1.90 |
e.SpCas9 mRNA的体外转录。按照顺序加入以下成分(20μl体系):
37℃水浴锅中反应2小时后,加入1μl的TURBO DNase,封口后轻敲离心管底部4-5次,使体系混匀。同样用封口膜封口后,用同样的方式放入37℃水浴锅消化20分钟。
f.SpCas9 mRNA加尾。按照顺序加入以下成分(100μl体系):
SpCas9 mRNA的体外转录20μl体系 | 20μl |
无RNase H2O | 36μl |
5×E-PAP缓冲液 | 20μl |
25mM MnCl2 | 10μl |
10mM ATP | 10μl |
E-PAP酶 | 4μl |
37℃水浴锅中反应45分钟。
g.根据试剂盒说明书操作纯化SpCas9 mRNA,最后得到的SpCas9 mRNA浓度测得为:540ng/ml。分装后零下80度冻存。
实施例2:sgRNA设计与合成
选取两个T细胞表面蛋白基因做为敲除对象,分别是TRAC和B2M基因。利用网站http://zifit.partners.org/ZiFiT/设计sgRNA,设计出的sgRNA序列分别是:
针对TRAC基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:4,针对B2M基因的sgRNA序列SEQ ID NO:5。
普通sgRNA体外转录:
a.首先,将sgRNA克隆至质粒载体pGRNA中,然后进行sgRNA模版PCR与产物回收,PCR扩增20μl,体系和反应条件如下:
其中上下游引物分别为:
b.PCR产物回收。根据试剂盒说明书进行操作,得到的回收产物测量浓度和260/280比值分别为:
样品 | 浓度 | 260/280 |
sgRNA(针对TRAC基因)T7转录模版 | 110ng/μl | 1.85 |
sgRNA(针对B2M基因)T7转录模版 | 90ng/μl | 1.92 |
c.根据体外转录试剂盒说明书进行sgRNA的体外转录,按照顺序加入以下成分(20μl体系):
T7 10X反应缓冲液 | 2μl |
T7 ATP溶液(75mM) | 2μl |
T7 CTP溶液(75mM) | 2μl |
T7 GTP溶液(75mM) | 2μl |
T7 UTP溶液(75mM) | 2μl |
PCR回收产物 | 8μl |
T7 Enzyme Mix | 2μl |
d.37度水浴反应4小时,加入1μl的TURBO DNase,封口后轻敲离心管底部4-5次,使体系混匀。同样用封口膜封口后,用同样的方式放入37℃水浴锅消化15min。
e.根据试剂盒说明书操作纯化sgRNA,最后得到的sgRNA浓度如下:
sgRNA(针对TRAC基因) | 1050ng/μl |
sgRNA(针对B2M基因) | 990ng/μl |
修饰sgRNA化学合成:
在上述两个sgRNA 5’和3’端各三个碱基同时进行2’-O-甲基化和3’硫代磷酸化修饰,修饰和未修饰的核糖核苷酸效果图如图2所示。
合成的sgRNA由美国synthego公司提供,共得到3nM干粉,加入TE缓冲液(pH=8.0)配制成20μl溶液,浓度为1μg/μl,分装冻存于负20度冰箱。
实施例3:PBMC提取
招募健康志愿者甲(不便透露信息),无感冒发烧症状。由专业医务人员在人肘正中静脉处取血100ml到BD抗凝血管。采完血后,血液与等量的PBS缓冲液(含2%的胎牛血清)混合。取PBMC分离管Sepmate-50,小心加入15ml的Ficoll缓冲液,再加入血液PBS的混合液,每管小心加入30ml左右。1200g离心10分钟后迅速将上清倒入新50ml管中,200g离心8分钟,弃上清,加入10ml PBS缓冲液重悬沉淀,再弃上清后加20mlPBS缓冲液重悬,离心弃上清后10ml上清PBS缓冲液重悬所有沉淀。对重悬细胞计数,取10μl混悬液加入10μl 0.1%的台盼蓝混匀,上机计细胞数和存活率,结果显示于表1中。
表1
PBMC细胞密度 | 4.99×10<sup>6</sup>个/ml |
细胞活率 | 91% |
实施例4:T细胞激活
取上步PBMC细胞4ml,200g离心5分钟后,去除上清,用12ml X-VIVO-15培养基重悬。抗-CD3/抗-CD28磁珠(Life Technology)用PBS缓冲液(含2mM的EDTA和1%的胎牛血清)重悬后,加入磁极中静置2分钟后小心弃去上清。重复4次上述过程。取洗后磁珠,将1.2×107个磁珠加入PBMC细胞中,混匀,放入37度培养箱培养3天。3天后取出磁珠,首先将T细胞用移液枪重悬多次。将细胞悬液置于磁极中,静置两分钟后,弃去管壁上的磁珠。重新计数,计数结果如表2所示。
实施例5:电穿孔转导Cas9 mRNA和sgRNA至激活的原代T细胞
激活3天后剩余11ml细胞体积,分别取其中1.74ml细胞悬液置于三个离心管中进行离心,转速为200g,5分钟。离心后完全去除培养基,并分别用Lonza电穿孔缓冲液进行重悬,然后分别加入Cas9 mRNA 5μg+普通sgRNA 1μg、Cas9 mRNA 5μg和Cas9 mRNA 5μg+修饰的sgRNA 1ug至T细胞悬液,混匀后加入电转杯中分别用Lonza 4D电穿孔仪的E-0115程序电击,放置37度培养箱5分钟后分别加入3ml预热的细胞培养基(X-VIVO-15+10ng/ml rIL-2)中,其中单转SpCas9 mRNA 5μg组在8小时后再电穿孔转导1μg普通sgRNA。继续培养,维持各T细胞生长密度在1×106个/ml左右,隔天换液。
实施例6:基因敲除效率检测
电穿孔后继续培养4天,取2×105个相应细胞做流式细胞分析,具体步骤为:取相应细胞加入1.5ml离心管中,用PBS+1%FBS缓冲液洗2遍,完全弃去上清,加入100ul缓冲液重悬细胞后加入PE-抗-人-TCR或APC-抗人HLA-ABC流式抗体5ul,混匀后室温避光静置15分钟,加入PBS缓冲液洗2遍后上机分别检测PE和APC通道,结果如图3和图4所示。由图3和图4我们可以看出未修饰的sgRNA和SpCas9 mRNA一次电转几乎无法敲除目的基因,我们推测是由于T淋巴细胞强大的分子免疫能力,使得SpCas9 mRNA在T细胞内翻译成蛋白质时,转导的sgRNA早已被胞内的内切核酸酶降解干净。针对这种可能,我们把SpCas9 mRNA和未修饰的sgRNA分别于0、8小时两次电转后,TRAC和B2M基因的敲除效率分别达到了79%和、83%左右,说明这种方式可以显著的提高CRISPR-Cas9敲除T细胞基因的效率。根据sgRNA易于降解的特性,我们为sgRNA加上了甲基化和硫代磷酸化修饰,使之更稳定存在于T细胞内,果然,当SpCas9和修饰的sgRNA共转入T细胞后,敲除效率相对未修饰的sgRNA得到了大幅度提升,图3和图4显示敲除效率达到了83%和84%左右。
实施例7:细胞毒性检测
分别取电穿孔后2、4、6、8天相应的T细胞10μl,分别加入10μl 0.1%的台盼蓝混匀,上机计细胞存活率,结果如图5所示,我们可以看到两次电转导致细胞活率只有60%左右,而SpCas9和修饰的sgRNA电转对细胞的伤害则相对较低,活率与一次电转SpCas9 mRNA和普通sgRNA差别不大,可以达到90%以上。由此结果说明两次分别电转SpCas9和普通sgRNA的方法虽然能够提高T细胞基因敲除的效率,但是给细胞带来极大的伤害不利于后续的扩增培养,而本专利采用的SpCas9和修饰的sgRNA电转方法一方面能提高基因敲除的效率,另一方面不会造成细胞活力的降低,利于制备经过基因编辑的细胞治疗药物,如CAR-T、TCR-T和TIL细胞。
Claims (15)
1.一种提高CRISPR-Cas9敲除原代T细胞基因的效率的方法,所述方法包括向T细胞递送Cas9 mRNA和化学修饰的sgRNA,其中靶向TRAC基因的sgRNA如SEQ ID NO: 4的DNA序列所示,靶向B2M基因的sgRNA如SEQ ID NO: 5的DNA序列所示,其中所述化学修饰的sgRNA的5’和3’端各三个碱基同时进行2’-O-甲基化和3’硫代磷酸化修饰。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述Cas9类型包括:SpCas9、SaCas9、SpCas9-HF、eSpCas9、xCas9和cpf1。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述Cas9类型为SpCas9。
4. 根据权利要求3所述的方法,其中所述SpCas9的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
5. 根据权利要求1所述方法,其中Cas9 mRNA采用如下方法获得:将Cas9基因克隆至质粒载体后,PCR扩增出5’端带有T7或SP6启动子的Cas9 DNA片段,并体外转录为Cas9 mRNA。
6. 根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其中所述Cas9 mRNA含有入核信号。
7. 根据权利要求6所述的方法,其中所述入核信号包括SV40 NLS和核质蛋白NLS,其氨基酸序列分别为SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3。
8. 根据权利要求1-5中任一项所述的方法,所述方法还包括激活T细胞,并且在T细胞激活后2-5天采用电穿孔方式将所述Cas9 mRNA和化学修饰的sgRNA同时导入激活的T细胞。
9. 根据权利要求8所述的方法,其中电转转导时Cas9 mRNA和化学修饰的sgRNA的质量比为1:1至10:1。
10. 根据权利要求1所述的方法,其中所述Cas9 mRNA可以用Cas9 蛋白或者表达Cas9的质粒代替。
11.一种基因敲入方法,所述基因敲入方法包括使用根据权利要求1-10中任一项所述的方法进行敲除后应用修复模板。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述修复模板包括腺相关病毒、非整合型慢病毒、单链DNA、双链DNA或质粒DNA。
13.根据权利要求1-10中任一项所述的方法制备的细胞,所述细胞包括CAR-T细胞、TCR-T细胞和TIL细胞。
14.根据权利要求13所述的细胞在制备用于治疗白血病、实体肿瘤、I型糖尿病或自身免疫疾病的药物中的用途。
15.根据权利要求14所述的用途,其中所述自身免疫疾病是艾滋病。
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