JP2018143211A

JP2018143211A - Cell culture substrate, cell production method and cell culture kit

Info

Publication number: JP2018143211A
Application number: JP2017044607A
Authority: JP
Inventors: 浩小田嶋; Hiroshi Odajima; 聡杣本; Satoshi Somamoto
Original assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Current assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Priority date: 2017-03-09
Filing date: 2017-03-09
Publication date: 2018-09-20
Anticipated expiration: 2037-03-09
Also published as: JP6912903B2

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a cell culture substrate and a cell culture kit that have a high cell survival rate and a high cell adhesion rate and allow cells to be peeled off in a short time, and a cell production method using the cell culture substrate.SOLUTION: A cell culture substrate contains a crosslinked product (C) of a polysaccharide (A) with a crosslinker (B). The crosslinker (B) is an organic compound having at least two functional groups (b) that can react with an active hydrogen group, and the cell culture substrate has a 37°C storage elastic modulus G' of 1000-1×10Pa.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、細胞培養用基材、細胞の生産方法及び細胞培養用キットに関する。 The present invention relates to a cell culture substrate, a cell production method, and a cell culture kit.

従来、細胞培養は、ガラスの表面上又は種々の処理を施したポリスチレンの表面上で行なわれている。その一例として、例えば、プラズマ処理、コロナ処理等により表面処理されたポリスチレンに、コラーゲン、フィブロネクチン又はポリリジン等の細胞接着性タンパク質をコートしたポリスチレン等から構成される種々の形状の容器が細胞培養用基材として普及している。しかしながら、ポリスチレン等を用いて細胞培養した場合、トリプシンのようなタンパク質分解酵素で細胞を処理する必要があり、細胞への毒性が高く、さらにその後の使用で有益である細胞外基質をも分解してしまう問題がある。 Conventionally, cell culture is performed on the surface of glass or the surface of polystyrene subjected to various treatments. As an example, for example, various shapes of containers made of polystyrene coated with cell adhesion proteins such as collagen, fibronectin or polylysine on polystyrene surface-treated by plasma treatment, corona treatment, etc. Widely used as a material. However, when cells are cultured using polystyrene or the like, it is necessary to treat the cells with a proteolytic enzyme such as trypsin, which is highly toxic to cells and further degrades extracellular matrix that is beneficial for subsequent use. There is a problem.

これらの問題を解決するため、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）を表面グラフトした培養皿（特許文献１及び非特許文献１）、多糖類からなる培養皿（特許文献２〜４）が報告されている。ＰＮＩＰＡＭを表面グラフトした培養皿では、細胞を回収するために、２０℃で３０分程度細胞を処理するが、温度に対してセンシティビティが高い細胞に対して適用できないという問題点がある。
また、多糖類からなる培養皿は、親水性多糖類（アルギン酸等）を用いる方法と、難水溶性の多糖類（セルロース等）を用いる方法とがある。親水性多糖類を用いる方法においては、金属イオン等によりゲル化した親水性多糖類のゲル上で細胞を培養するものであるが、ポリスチレンのようなシャーレと異なり、ゲルの硬さが不十分であり、細胞接着の不良、接着細胞の形状不良を引き起こす問題がある。さらに、キレート剤によりゲルを硬くしたものが知られているが、ゲルを硬くするために用いられるキレート剤が細胞毒性の原因となっている。難水溶性の多糖類を用いる方法においては、糖分解酵素により細胞を剥離する方法及び変性セルロースをアミノ基含有化合物により分解する方法がある。糖分解酵素を用いる方法は難水溶性のため、基材が硬すぎるため、細胞を培養する水溶系では多糖類が分解されにくい問題がある。また、アミノ基含有化合物により分解する方法においては、細胞培養に必須のアミノ酸（アミノ基含有化合物）を培地に添加できない問題がある。 In order to solve these problems, culture dishes (Patent Document 1 and Non-Patent Document 1) onto which poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) is surface-grafted and culture dishes (Patent Documents 2 to 4) made of polysaccharides are reported. Has been. In a culture dish on which PNIPAM is surface-grafted, cells are treated at 20 ° C. for about 30 minutes in order to recover the cells, but there is a problem that the cells cannot be applied to cells having high sensitivity to temperature.
Moreover, the culture dish which consists of polysaccharide has the method of using hydrophilic polysaccharides (alginic acid etc.) and the method of using a poorly water-soluble polysaccharide (cellulose etc.). In the method using a hydrophilic polysaccharide, cells are cultured on a gel of a hydrophilic polysaccharide gelled with a metal ion or the like, but unlike a petri dish like polystyrene, the gel has insufficient hardness. There is a problem that causes poor cell adhesion and poor shape of adherent cells. Furthermore, although what hardened the gel with the chelating agent is known, the chelating agent used in order to harden the gel causes the cytotoxicity. In the method using a poorly water-soluble polysaccharide, there are a method of peeling cells with a glycolytic enzyme and a method of degrading modified cellulose with an amino group-containing compound. Since the method using a saccharolytic enzyme is sparingly water-soluble, the base material is too hard, so that there is a problem that polysaccharides are not easily degraded in a water-based system for culturing cells. Moreover, in the method of decomposing | disassembling with an amino group containing compound, there exists a problem which cannot add an amino acid (amino group containing compound) essential to cell culture to a culture medium.

特公平６−１０４０６１号公報Japanese Patent Publication No. 6-104061 特開２００７−２５９７３５号公報JP 2007-259735 A 特開２０１５−４８４６７号公報Japanese Patent Laying-Open No. 2015-48467 特開２００５−１１０５３７号公報JP 2005-110537 A

清水達也、岡野光夫、バイオサイエンスとバイオインダストリー、２０００年、５８（１２）、８５１〜８５４頁Tatsuya Shimizu, Mitsuo Okano, Bioscience and Bioindustry, 2000, 58 (12), pp. 851-854

本発明は、細胞生存率及び細胞接着率が高く、短時間で細胞を剥離可能な細胞培養用基材及び細胞培養用キット並びに細胞培養用基剤を用いた細胞の生産方法を提供することを目的とする。 The present invention provides a cell culture substrate, a cell culture kit, and a cell production method using a cell culture base, which have high cell viability and cell adhesion rate and are capable of peeling cells in a short time. Objective.

本発明者らは、これらの問題点を解決するべく鋭意検討した結果、本発明に到達した。
即ち、本発明は、多糖類（Ａ）の架橋剤（Ｂ）による架橋物（Ｃ）を含有する細胞培養用基材であって、架橋剤（Ｂ）が活性水素基と反応し得る官能基（ｂ）を少なくとも２個有する有機化合物であり、細胞培養用基材の３７℃における貯蔵弾性率Ｇ’が１０００〜１×１０¹⁰Ｐａである細胞培養用基材；細胞培養用基材を用いて細胞（Ｘ）を培養する細胞の生産方法；細胞培養用基材及び分解剤（Ｅ）を含む細胞培養用キットである。 As a result of intensive studies to solve these problems, the present inventors have reached the present invention.
That is, the present invention is a cell culture substrate containing a cross-linked product (C) of a polysaccharide (A) with a cross-linking agent (B), wherein the cross-linking agent (B) can react with an active hydrogen group. A cell culture substrate that is an organic compound having at least two (b) and has a storage elastic modulus G ′ of 1000 to 1 × 10 ¹⁰ Pa at 37 ° C. of the cell culture substrate; Cell production method for culturing cells (X); a cell culture kit comprising a cell culture substrate and a degradation agent (E).

本発明の細胞培養用基材及び細胞培養用キットは、細胞生存率及び細胞接着率が高く、短時間で細胞を剥離できるという効果を奏する。また、本発明の細胞培養用基剤を用いた細胞の生産方法は、細胞の生存率及び細胞接着率が高く、短時間で細胞を剥離できるという効果を奏する。 The cell culture substrate and the cell culture kit of the present invention have a high cell viability and cell adhesion rate, and have an effect that cells can be detached in a short time. In addition, the cell production method using the cell culture base of the present invention has a high cell survival rate and cell adhesion rate, and has the effect that cells can be detached in a short time.

本発明の細胞培養用基材は、多糖類（Ａ）の架橋剤（Ｂ）による架橋物（Ｃ）を含有する細胞培養用基材であって、架橋剤（Ｂ）が活性水素基と反応し得る官能基（ｂ）を少なくとも２個有する有機化合物であり、細胞培養用基材の３７℃における貯蔵弾性率Ｇ’が１０００〜１×１０¹⁰Ｐａである細胞培養用基材である。 The cell culture substrate of the present invention is a cell culture substrate containing a cross-linked product (C) of a polysaccharide (A) cross-linking agent (B), and the cross-linking agent (B) reacts with an active hydrogen group. It is an organic compound having at least two functional groups (b) that can be obtained, and is a cell culture substrate in which the storage elastic modulus G ′ at 37 ° C. of the cell culture substrate is 1000 to 1 × 10 ¹⁰ Pa.

多糖類（Ａ）としては、単糖（ａ）が１０個以上グリコシド結合により結合したもの及びこれらの誘導体が含まれる。
単糖（ａ）としては、炭素数３〜７の単糖（ａ１）又は前記（ａ１）が有するヒドロキシル基及び／若しくはヒドロキシメチル基がカルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、スルホオキシ基、メトキシカルボニル基及びカルボキシメチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基（Ｅ）で置換された単糖（ａ２）が含まれる。 Examples of the polysaccharide (A) include those in which 10 or more monosaccharides (a) are bonded by glycosidic bonds and derivatives thereof.
As the monosaccharide (a), a monosaccharide having 3 to 7 carbon atoms (a1) or the hydroxyl group and / or hydroxymethyl group of the (a1) is a carboxyl group, an amino group, an N-acetylamino group, a sulfooxy group, A monosaccharide (a2) substituted with at least one substituent (E) selected from the group consisting of a methoxycarbonyl group and a carboxymethyl group is included.

炭素数３〜７の単糖（ａ１）としては、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース及びヘプトース等が挙げられる。
トリオースとしては、ジヒドロキシアセトン及びグリセルアルデヒド等が挙げられる。
テトロースとしては、エリトロース、トレオース及びエリトルロース等が挙げられる。
ペントースとしては、アラビノース、キシロース、リボース、キシルロース、リブロース及びデオキシリボース等が挙げられる。
ヘキソースとしては、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、タガトース、フコース、フクロース及びラムノース等が挙げられる。
ヘプトースとしては、セドヘプツロース等が挙げられる。 Examples of the monosaccharide (a1) having 3 to 7 carbon atoms include triose, tetrose, pentose, hexose and heptose.
Examples of triose include dihydroxyacetone and glyceraldehyde.
Examples of tetrose include erythrose, threose and erythrulose.
Examples of pentose include arabinose, xylose, ribose, xylulose, ribulose and deoxyribose.
Examples of hexose include glucose, mannose, galactose, fructose, sorbose, tagatose, fucose, fucose, and rhamnose.
Examples of heptose include sedoheptulose.

単糖（ａ２）としては、１つ以上のヒドロキシメチル基（−ＣＨ₂ＯＨ）がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）で置換された単糖（ａ２−１）、１つ以上のヒドロキシル基（−ＯＨ）がアミノ基（−ＮＨ₂）で置換された単糖（ａ２−２）、１つ以上のヒドロキシル基がＮ−アセチルアミノ基（−ＮＨＣＯＣＨ₃）で置換された単糖（ａ２−３）、１つ以上のヒドロキシル基がスルホオキシ基（−ＯＳＯ₃Ｈ）で置換された単糖（ａ２−４）、１つ以上のヒドロキシメチル基がメトキシカルボニル基（−ＣＯＯＣＨ₃）で置換された単糖（ａ２−５）、１つ以上のヒドロキシメチル基がカルボキシメチル基（−ＣＨ₂ＣＯＯＨ）で置換された単糖（ａ２−６）及び２つ以上のヒドロキシル基及び／又はヒドロキシメチル基が複数種類の置換基（Ｅ）で置換された単糖（ａ２−７）等が挙げられる。 As the monosaccharide (a2), one or more hydroxymethyl groups (—CH ₂ OH) are substituted with carboxyl groups (—COOH), monosaccharides (a2-1), and one or more hydroxyl groups (—OH) Monosaccharide (a2-2) in which is substituted with an amino group (—NH ₂ ), monosaccharide (a2-3) in which one or more hydroxyl groups are substituted with N-acetylamino group (—NHCOCH ₃ ), 1 Monosaccharide (a2-4) in which one or more hydroxyl groups are substituted with sulfooxy group (—OSO ₃ H) Monosaccharide (a2) in which one or more hydroxymethyl groups are substituted with methoxycarbonyl group (—COOCH ₃ ) -5) Monosaccharide (a2-6) in which one or more hydroxymethyl groups are substituted with carboxymethyl group (—CH ₂ COOH), and two or more hydroxyl groups and / or hydroxymethyl groups are substituted in plural types Group (E In substituted monosaccharide (A2-7) and the like.

前記（ａ２−１）としては、グルクロン酸、イズロン酸、マンヌロン酸及びガラクツロン酸等のウロン酸等が挙げられる。
前記（ａ２−２）としては、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン及びムラミン酸等のアミノ糖等が挙げられる。
前記（ａ２−３）としては、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＮ−アセチルムラミン酸等が挙げられる。
前記（ａ２−４）としては、ガラクトース−３−硫酸等が挙げられる。
前記（ａ２−５）としては、グルコースメチルエステル及び前記（ａ２−１）中のカルボン酸をメチルエステル化したもの等が挙げられる。
前記（ａ２−７）としては、Ｎ−アセチルグルコサミン−４−硫酸、イズロン酸−２−硫酸、グルクロン酸−２−硫酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−硫酸、ノイラミン酸及びＮ−アセチルノイラミン酸等が挙げられる。 Examples of (a2-1) include uronic acids such as glucuronic acid, iduronic acid, mannuronic acid and galacturonic acid.
Examples of (a2-2) include amino sugars such as glucosamine, galactosamine, mannosamine and muramic acid.
Examples of (a2-3) include N-acetylglucosamine, N-acetylmannosamine, N-acetylgalactosamine, and N-acetylmuramic acid.
Examples of (a2-4) include galactose-3-sulfuric acid.
Examples of (a2-5) include glucose methyl ester and methyl esterified carboxylic acid in (a2-1).
As (a2-7), N-acetylglucosamine-4-sulfuric acid, iduronic acid-2-sulfuric acid, glucuronic acid-2-sulfuric acid, N-acetylgalactosamine-4-sulfuric acid, neuraminic acid and N-acetylneuraminic acid Etc.

多糖類（Ａ）として具体的には、セルロース、アミロース、アミロペクチン、グリコサミノグリカン、アルギン酸、カラギーナン、ヒアルロン酸、グリコーゲン、デキストリン、グルカン、フルクタン、キチン、タマリンドシードガム、グァーガム、ローカストビーンガム、アラビアガム、カラヤガム、ペクチン、キサンタンガム、ジュランガム、アグロバクテリウムスクシノグリカン、ダイユータンガム、マンナン、グルコマンナン、キトサン、タラガム、サイリウムシードガム及びこれらの誘導体（カルボキシメチルセルロース等）等が挙げられる。
多糖類（Ａ）のうち、産業利用性及び分解性の観点から、セルロース、アミロース、アミロペクチン、グリコサミノグリカン、アルギン酸、カラギーナン、ヒアルロン酸、グリコーゲン、デキストリン、グルカン、フルクタン、キチン、タマリンドシードガム、グァーガム、ローカストビーンガム、アラビアガム、カラヤガム、ペクチン、キサンタンガム、ジュランガム、アグロバクテリウムスクシノグリカン、ダイユータンガム、マンナン、グルコマンナン、キトサン、タラガム、サイリウムシードガム及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、さらに好ましくはセルロース、アルギン酸、カラギーナン、ヒアルロン酸、キサンタン、アミロース、デキストラン及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、特に好ましくはカルボキシメチルセルロースである。 Specific examples of the polysaccharide (A) include cellulose, amylose, amylopectin, glycosaminoglycan, alginic acid, carrageenan, hyaluronic acid, glycogen, dextrin, glucan, fructan, chitin, tamarind seed gum, guar gum, locust bean gum, Arabia Examples thereof include gum, karaya gum, pectin, xanthan gum, duran gum, Agrobacterium succinoglycan, diyutan gum, mannan, glucomannan, chitosan, tara gum, psyllium seed gum and derivatives thereof (carboxymethylcellulose and the like).
Among the polysaccharides (A), cellulose, amylose, amylopectin, glycosaminoglycan, alginic acid, carrageenan, hyaluronic acid, glycogen, dextrin, glucan, fructan, chitin, tamarind seed gum, from the viewpoints of industrial utilization and degradability Guar gum, locust bean gum, gum arabic, karaya gum, pectin, xanthan gum, juran gum, Agrobacterium succinoglycan, dieutan gum, mannan, glucomannan, chitosan, tara gum, psyllium seed gum and their derivatives At least one is preferable, and more preferably a small amount selected from the group consisting of cellulose, alginic acid, carrageenan, hyaluronic acid, xanthan, amylose, dextran, and derivatives thereof. A Kutomo one, particularly preferably carboxymethylcellulose.

カルボキシメチルセルロースにおいて、ヒドロキシル基のカルボキシメチル基による置換率は、水溶性の観点から、０．０２〜３が好ましく、さらに好ましくは０．２〜２である。 In the carboxymethyl cellulose, the substitution rate of the hydroxyl group with the carboxymethyl group is preferably 0.02 to 3, more preferably 0.2 to 2, from the viewpoint of water solubility.

本発明において、架橋剤（Ｂ）は、活性水素基と反応し得る官能基（ｂ）を少なくとも２個有する有機化合物である。
官能基（ｂ）としては、カルボキシル基、エポキシ基、イソシアネート基、カルボジイミド基、オキサゾリン基及び酸ハライド基等が挙げられる。
これらのうち、反応性及び架橋物（Ｃ）の強度の観点から、カルボキシル基、エポキシ基及びイソシアネート基からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましい。 In the present invention, the crosslinking agent (B) is an organic compound having at least two functional groups (b) capable of reacting with active hydrogen groups.
Examples of the functional group (b) include a carboxyl group, an epoxy group, an isocyanate group, a carbodiimide group, an oxazoline group, and an acid halide group.
Among these, at least one selected from the group consisting of a carboxyl group, an epoxy group, and an isocyanate group is preferable from the viewpoint of the reactivity and the strength of the crosslinked product (C).

架橋剤（Ｂ）は、官能基（ｂ）として１種を有しているものでもよく、２種以上を有しているものでもよい。 The crosslinking agent (B) may have one type as the functional group (b), or may have two or more types.

架橋剤（Ｂ）において、カルボキシル基を有しているものとしては、ポリカルボン酸が含まれる。
ポリカルボン酸として、具体的には、２個のカルボキシル基を有しているもの｛炭素数２〜５０のアルカンジカルボン酸（シュウ酸、マロン酸、コハク酸、アジピン酸、レパルギン酸及びセバシン酸等）及び炭素数８〜３６の芳香族ジカルボン酸（フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸及びナフタレンジカルボン酸等）、炭素数４〜５０の不飽和ジカルボン酸（マレイン酸、フマル酸及び炭素数１２〜４６のアルケニル基を有するアルケニルコハク酸等）等｝、３個以上のカルボキシル基を有しているもの｛炭素数９〜２０の芳香族ポリカルボン酸（トリメリット酸及びピロメリット酸等）、炭素数６〜３６の脂肪族トリカルボン酸（ヘキサントリカルボン酸等）等が挙げられる。 In the crosslinking agent (B), those having a carboxyl group include polycarboxylic acids.
Specific examples of polycarboxylic acids include those having two carboxyl groups {alkane dicarboxylic acids having 2 to 50 carbon atoms (oxalic acid, malonic acid, succinic acid, adipic acid, reparginic acid, sebacic acid, etc. ) And aromatic dicarboxylic acids having 8 to 36 carbon atoms (phthalic acid, isophthalic acid, terephthalic acid, naphthalenedicarboxylic acid, etc.), unsaturated dicarboxylic acids having 4 to 50 carbon atoms (maleic acid, fumaric acid, and 12 to 46 carbon atoms). Alkenyl succinic acid having a alkenyl group, etc.)} having three or more carboxyl groups {aromatic polycarboxylic acids having 9 to 20 carbon atoms (such as trimellitic acid and pyromellitic acid), carbon number 6-36 aliphatic tricarboxylic acid (hexane tricarboxylic acid etc.) etc. are mentioned.

カルボキシル基を有しているものとして、これらのカルボン酸の無水物、低級アルキル（炭素数１〜４）エステル（メチルエステル、エチルエステル及びイソプロピルエステル等）化物を用いてもよく、無水物及び／又は低級アルキルエステル化物と上記カルボキシル基を有しているものと併用してもよい。 As those having a carboxyl group, anhydrides of these carboxylic acids, lower alkyl (1 to 4 carbon atoms) esters (methyl esters, ethyl esters, isopropyl esters, etc.) may be used. Or you may use together with what has a lower alkyl esterification thing and the said carboxyl group.

また、架橋剤として不飽和モノカルボン酸を用いて、不飽和モノカルボン酸中のカルボキシル基を多糖類（Ａ）の活性水素と反応させて、さらに二重結合を反応させることにより架橋してもよい。
不飽和モノカルボン酸としては、炭素数２〜３０の不飽和モノカルボン酸が含まれ、具体的にはアクリル酸、メタクリル酸、プロピオル酸、２−ブチン酸、クロトン酸、イソクロトン酸、３−ブテン酸、アンゲリカ酸、チグリン酸、４−ペンテン酸、２−エチル−２−ブテン酸、１０−ウンデセン酸、２，４−ヘキサジエン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸及びネルボン酸等が挙げられる。 In addition, the unsaturated monocarboxylic acid may be used as a cross-linking agent, and the carboxyl group in the unsaturated monocarboxylic acid may be reacted with the active hydrogen of the polysaccharide (A) and further cross-linked by reacting with a double bond. Good.
Examples of the unsaturated monocarboxylic acid include unsaturated monocarboxylic acids having 2 to 30 carbon atoms. Specifically, acrylic acid, methacrylic acid, propiolic acid, 2-butyric acid, crotonic acid, isocrotonic acid, 3-butene Acid, angelic acid, tiglic acid, 4-pentenoic acid, 2-ethyl-2-butenoic acid, 10-undecenoic acid, 2,4-hexadienoic acid, myristoleic acid, palmitoleic acid, sapienoic acid, oleic acid, elaidic acid, Examples include vaccenic acid, gadoleic acid, eicosenoic acid, erucic acid, and nervonic acid.

カルボキシル基を有しているもののうち、反応性及び架橋物（Ｃ）の強度の観点から、好ましいものは、アジピン酸、炭素数１２〜４６のアルケニル基を有するアルケニルコハク酸、テレフタル酸、イソフタル酸、マレイン酸、フマル酸、トリメリット酸、ピロメリット酸及びこれらの併用である。また、これらの酸の無水物や低級アルキルエステルも同様に好ましい。 Among those having a carboxyl group, preferred are adipic acid, alkenyl succinic acid having an alkenyl group having 12 to 46 carbon atoms, terephthalic acid, and isophthalic acid from the viewpoint of the reactivity and strength of the crosslinked product (C). , Maleic acid, fumaric acid, trimellitic acid, pyromellitic acid and combinations thereof. Likewise preferred are anhydrides and lower alkyl esters of these acids.

エポキシ基を有しているものとしては、具体的には、ポリグリシジルエーテル（エチレングリコールジグリシジルエーテル、テトラメチレングリコールジグリシジルエーテル、ビスフェノールＡジグリシジルエーテル、ビスフェノールＦジグリシジルエーテル、グリセリントリグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールテトラグリシジルエーテル及びフェノールノボラックグリシジルエーテル化物等）等が挙げられる。 Specifically, those having an epoxy group include polyglycidyl ether (ethylene glycol diglycidyl ether, tetramethylene glycol diglycidyl ether, bisphenol A diglycidyl ether, bisphenol F diglycidyl ether, glycerin triglycidyl ether, Pentaerythritol tetraglycidyl ether, phenol novolac glycidyl ether and the like).

イソシアネート基を有しているものとしては、脂肪族ジイソシアネート化合物、脂環族ジイソシアネート及び芳香族ジイソシアネート化合物が含まれる。 As what has an isocyanate group, an aliphatic diisocyanate compound, an alicyclic diisocyanate, and an aromatic diisocyanate compound are contained.

脂肪族ジイソシアネート化合物としては、例えば、トリメチレンジイソシアネート、テトラメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート（以下においてＨＤＩと略記する）、ペンタメチレンジイソシアネート，１，２−プロピレンジイソシアネート、１，３−ブチレンジイソシアネート、ドデカメチレンジイソシアネート及び２，４，４−トリメチルヘキサメチレンジイソシアネート等が挙げられる。 Examples of the aliphatic diisocyanate compound include trimethylene diisocyanate, tetramethylene diisocyanate, hexamethylene diisocyanate (hereinafter abbreviated as HDI), pentamethylene diisocyanate, 1,2-propylene diisocyanate, 1,3-butylene diisocyanate, dodecamethylene diisocyanate. And 2,4,4-trimethylhexamethylene diisocyanate.

脂環族ジイソシアネート化合物としては、例えば、１，３−シクロペンテンジイソシアネート，１，３−シクロへキサンジイソシアネート、１，４−シクロヘキサンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネート（以下においてＩＰＤＩと略記する）、水素添加ジフェニルメタンジイソシアネート（以下において水添ＭＤＩと略記する）、水素添加キシリレンジイソシアネート、水素添加トリレンジイソシアネート及び水素添加テトラメチルキシリレンジイソシアネート等が挙げられる。 Examples of the alicyclic diisocyanate compound include 1,3-cyclopentene diisocyanate, 1,3-cyclohexane diisocyanate, 1,4-cyclohexane diisocyanate, isophorone diisocyanate (hereinafter abbreviated as IPDI), hydrogenated diphenylmethane diisocyanate (hereinafter referred to as IPDI). And hydrogenated xylylene diisocyanate, hydrogenated tolylene diisocyanate, hydrogenated tetramethyl xylylene diisocyanate, and the like.

芳香族ジイソシアネート化合物としては、例えば、フェニレンジイソシアネート、トリレンジイソシアネート（２，４−トリレンジイソシアネート及び２，６−トリレンジイソシアネート、以下においてＴＤＩと略記する）、２，２’一ジフェニルメタンジイソシアネート、４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート（以下においてＭＤＩと略記する）、４，４’−トルイジンジイソシアネート、４，４’−ジフェニルエーテルジイソシアネート、４，４’−ジフェニルジイソシアネート、１，５−ナフタレンジイソシアネート及びキシリレンジイソシアネート等が挙げられる。 Examples of the aromatic diisocyanate compound include phenylene diisocyanate, tolylene diisocyanate (2,4-tolylene diisocyanate and 2,6-tolylene diisocyanate, hereinafter abbreviated as TDI), 2,2 ′ monodiphenylmethane diisocyanate, 4, 4'-diphenylmethane diisocyanate (hereinafter abbreviated as MDI), 4,4'-toluidine diisocyanate, 4,4'-diphenyl ether diisocyanate, 4,4'-diphenyl diisocyanate, 1,5-naphthalene diisocyanate, xylylene diisocyanate and the like Can be mentioned.

イソシアネート基を有しているものとして、反応性及び架橋物（Ｃ）の強度の観点から、好ましいものは炭素数６〜１５の芳香族ジイソシアネート、炭素数４〜１２の脂肪族ジイソシアネート及び炭素数４〜１５の脂環式ジイソシアネートからなる群より選ばれる少なくとも１種であり、特に好ましいものはＴＤＩ、ＭＤＩ、ＨＤＩ、水添ＭＤＩ及びＩＰＤＩからなる群より選ばれる少なくとも１種である。 As what has an isocyanate group, from a reactive viewpoint and the viewpoint of the intensity | strength of a crosslinked material (C), a preferable thing is C6-C15 aromatic diisocyanate, C4-C12 aliphatic diisocyanate, and C4. ~ 15 selected from the group consisting of alicyclic diisocyanates, and particularly preferred is at least one selected from the group consisting of TDI, MDI, HDI, hydrogenated MDI and IPDI.

架橋剤（Ｂ）としては、反応性及び架橋物（Ｃ）の強度の観点から、エポキシ基を有しているものが好ましく、さらに好ましくはポリグリシジルエーテルである。 As the crosslinking agent (B), those having an epoxy group are preferable from the viewpoint of reactivity and the strength of the crosslinked product (C), and polyglycidyl ether is more preferable.

本発明の細胞培養用基材は、架橋物（Ｃ）を含有するものであれば特に限定はないが、細胞接着性の観点から、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン及び下記最小アミノ酸配列（Ｘ）を有する細胞接着性ペプチド（Ｄ）からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞接着因子を含有することが好ましい。
最小アミノ酸配列（Ｘ）：ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列（１）、ＹＩＧＳＲ配列（２）、ＰＤＳＧＲ配列（３）、ＲＹＶＶＬＰＲ配列（４）、ＬＧＴＩＰＧ配列（５）、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列（６）、ＩＫＶＡＶ配列（７）、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列（８）、ＧＶＫＧＤＫＧＮＰＧＷＰＧＡＰ配列（９）、ＧＥＦＹＦＤＬＲＬＫＧＤＫ配列（１０）、ＨＡＶ配列及びＹＫＬＮＶＮＤＳ配列（１１）からなる群より選ばれる少なくとも１種。
なお、本発明において、「配列（１）」は「配列表における配列番号（１）」を意味し、配列（１）以外の配列についても同様である。 The substrate for cell culture of the present invention is not particularly limited as long as it contains a cross-linked product (C), but has fibronectin, collagen, laminin and the following minimum amino acid sequence (X) from the viewpoint of cell adhesion. It is preferable to contain at least one cell adhesion factor selected from the group consisting of the cell adhesion peptide (D).
Minimum amino acid sequence (X): RGD sequence, LDV sequence, REDV sequence (1), YIGSR sequence (2), PDSGR sequence (3), RYVVLPR sequence (4), LGTIPG sequence (5), RNIAEIIKDI sequence (6), IKVAV At least one selected from the group consisting of a sequence (7), an LRE sequence, a DGEA sequence (8), a GVGKGDKGNPGPGAP sequence (9), a GEFYFDLRLKGGDK sequence (10), a HAV sequence and a YKLNVNDS sequence (11).
In the present invention, “sequence (1)” means “sequence number (1) in the sequence listing”, and the same applies to sequences other than sequence (1).

フィブロネクチン、コラーゲン及びラミニンは、細胞接着分子として一般的に知られているものである。
なお、本発明において、「細胞接着性」とは、特定の最小アミノ酸配列が細胞のインテグリンレセプターに認識され、細胞が基材に接着しやすくなる性質を意味する（大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻第１号、５８〜６６頁、１９９２年）。 Fibronectin, collagen and laminin are commonly known as cell adhesion molecules.
In the present invention, “cell adhesion” means a property in which a specific minimum amino acid sequence is recognized by an integrin receptor of a cell, and the cell easily adheres to a base material (Osaka Prefectural Maternal and Child Medical Center magazine, No. 1). 8: No. 1, 58-66, 1992).

最小アミノ酸配列（Ｘ）としては、「病態生理、第９巻第７号、５２７〜５３５頁、１９９０年」や「大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻第１号、５８〜６６頁、１９９２年」に記載されているもの等が知られており、細胞接着性の観点から、上記配列（１）〜（１１）が好ましく、さらに好ましくはＲＧＤ配列である。 As the minimum amino acid sequence (X), “Pathophysiology, Vol. 9, No. 7, pp. 527-535, 1990” or “Osaka Prefectural Maternal and Child Medical Center Magazine, Vol. 8, No. 1, pp. 58-66, 1992” From the viewpoint of cell adhesion, the above sequences (1) to (11) are preferable, and an RGD sequence is more preferable.

細胞接着性ペプチド（Ｄ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有すればよいが、細胞接着性の観点等から、１分子中に１〜５０個有するものが好ましく、さらに好ましくは２〜５０個、つぎに好ましくは３〜３０個、特に好ましくは４〜２０個、最も好ましくは５〜１５個有するものである。なお、２種以上の最小アミノ酸配列（Ｘ）が一分子中に含まれてもよい。 The cell adhesion peptide (D) may have at least one minimum amino acid sequence (X) in one molecule, but from the viewpoint of cell adhesion, etc., one having 1 to 50 in one molecule is preferable. More preferably 2-50, then 3-30, particularly preferably 4-20, most preferably 5-15. Two or more kinds of minimum amino acid sequences (X) may be included in one molecule.

細胞接着性ペプチド（Ｄ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ）以外に、細胞接着性ペプチド（Ｄ）の熱安定性向上の観点等から、補助アミノ酸配列（Ｙ）を有することが好ましい。 In addition to the minimum amino acid sequence (X), the cell adhesive peptide (D) preferably has an auxiliary amino acid sequence (Y) from the viewpoint of improving the thermal stability of the cell adhesive peptide (D).

補助アミノ酸配列（Ｙ）としては、最小アミノ酸配列（Ｘ）以外のアミノ酸配列が使用でき、細胞接着性ペプチド（Ｄ）の熱安定性の観点から、Ｇ（グリシン）及び／又はＡ（アラニン）を有する配列が好ましい。 As the auxiliary amino acid sequence (Y), an amino acid sequence other than the minimum amino acid sequence (X) can be used. From the viewpoint of the thermal stability of the cell adhesive peptide (D), G (glycine) and / or A (alanine) are used. The sequence having is preferred.

補助アミノ酸配列（Ｙ）としては、（ＧＡ）_a配列、（ＧＡＧＡＧＳ）_b配列、（ＧＡＧＡＧＹ）_c配列、（ＧＡＧＶＧＹ）_d配列、（ＧＡＧＹＧＶ）_e配列、｛ＤＧＧ（Ａ）_fＧＧＡ｝_g配列、（ＧＶＰＧＶ）_h配列、（Ｇ）_i配列、（Ａ）_j配列、（ＧＧＡ）_k配列、（ＧＶＧＶＰ）_m配列、（ＧＰＰ）_n配列、（ＧＡＱＧＰＡＧＰＧ）_o配列、（ＧＡＰＧＡＰＧＳＱＧＡＰＧＬＱ）_p配列及び／又は（ＧＡＰＧＴＰＧＰＱＧＬＰＧＳＰ）_q配列を有する配列等が含まれる。
これらのうち、熱安定性の観点から、（ＧＡ）_a配列、（ＧＡＧＡＧＳ）_b配列、（ＧＡＧＡＧＹ）_c配列、（ＧＡＧＶＧＹ）_d配列、（ＧＡＧＹＧＶ）_e配列、｛ＤＧＧ（Ａ）_fＧＧＡ｝_g配列、（ＧＶＰＧＶ）_h配列、（ＧＶＧＶＰ）_m配列及び（ＧＰＰ）_n配列からなる群より選ばれる少なくとも１種を有するものが好ましく、さらに好ましくは（ＧＡＧＡＧＳ）_b配列、（ＧＶＰＧＶ）_h配列、（ＧＶＧＶＰ）_m配列及び（ＧＰＰ）_n配列からなる群より選ばれる少なくとも１種を有するものであり、特に好ましくは（ＧＡＧＡＧＳ）_b配列を有するものである。
なお、ａは５〜１００の整数、ｂは１〜３３の整数、ｃ、ｄ及びｅは２〜３３の整数、ｆは１〜１９４の整数、ｇは｛１｝〜｛２００／（６＋ｆ）｝の小数点以下を切り捨てした整数、ｈは２〜４０の整数、ｉ及びｊは１０〜２００の整数、ｋは３〜６６の整数、ｍは２〜４０の整数、ｎは３〜６６の整数、ｏは１〜２２の整数、ｐ及びｑは１〜１３の整数である。 The auxiliary amino acid sequence (Y) includes (GA) _a sequence, (GAGAGS) _b sequence, (GAGAGY) _c sequence, (GAGVGY) _d sequence, (GAGYGV) _e sequence, {DGG (A) _f GGA} _g sequence, (GVPPGV) _h sequence, (G) _i sequence, (A) _j sequence, (GGA) _k sequence, (GVGVP) _m sequence, (GPP) _n sequence, (GAQGPAGPG) _o sequence, (GAPGGAPSQGAPGGLQ) _p sequence and / or (GAPGTPGPQGLPGSP) A sequence having a _q sequence and the like are included.
Among these, from the viewpoint of thermal stability, (GA) _a sequence, (GAGAGS) _b sequence, (GAGAGY) _c sequence, (GAGVGY) _d sequence, (GAGYGV) _e sequence, {DGG (A) _f GGA} _g It preferably has at least one selected from the group consisting of a sequence, (GVPPGV) _h sequence, (GVGVP) _m sequence and (GPP) _n sequence, more preferably (GAGAGS) _b sequence, (GVPPGV) _h sequence, ( It has at least one selected from the group consisting of (GVGVP) _m sequence and (GPP) _n sequence, and particularly preferably has (GAGAGS) _b sequence.
A is an integer of 5 to 100, b is an integer of 1 to 33, c, d and e are integers of 2 to 33, f is an integer of 1 to 194, and g is {1} to {200 / (6 + f). } Is an integer obtained by rounding down the decimal point, h is an integer of 2 to 40, i and j are integers of 10 to 200, k is an integer of 3 to 66, m is an integer of 2 to 40, and n is an integer of 3 to 66. , O is an integer from 1 to 22, and p and q are integers from 1 to 13.

補助アミノ酸配列（Ｙ）は、Ｇ（グリシン）及び／又はＡ（アラニン）を含むことが好ましい。Ｇ（グリシン）及びＡ（アラニン）を含む場合、これらの合計含有割合（％）は、補助アミノ酸配列（Ｙ）の全アミノ酸個数に基づいて、１０〜１００が好ましく、さらに好ましくは２０〜９５、特に好ましくは３０〜９０、最も好ましくは４０〜８５である。この範囲であると、熱安定性がさらに良好となる。
Ｇ（グリシン）及びＡ（アラニン）の両方を含む場合、これらの含有個数割合（Ｇ／Ａ）は、０．０３〜４０が好ましく、さらに好ましくは０．０８〜１３、特に好ましくは０．２〜５である。この範囲であると、熱安定性がさらに良好となる。 The auxiliary amino acid sequence (Y) preferably contains G (glycine) and / or A (alanine). When G (glycine) and A (alanine) are included, the total content ratio (%) is preferably 10 to 100, more preferably 20 to 95, based on the total number of amino acids in the auxiliary amino acid sequence (Y). Especially preferably, it is 30-90, Most preferably, it is 40-85. Within this range, the thermal stability is further improved.
When both G (glycine) and A (alanine) are included, the content ratio (G / A) is preferably 0.03 to 40, more preferably 0.08 to 13, particularly preferably 0.2. ~ 5. Within this range, the thermal stability is further improved.

補助アミノ酸配列（Ｙ）には、以上の例示の他に、他のアミノ酸｛Ａ（アラニン）、Ｇ（グリシン）、Ｓ（セリン）、Ｔ（トレオニン）、Ｖ（バリン）、Ｌ（ロイシン）、Ｉ（イソロイシン）、Ｃ（システイン）、Ｍ（メチオニン）、Ｆ（フェニルアラニン）、Ｙ（チロシン）、Ｐ（プロリン）、Ｗ（トリプトファン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｑ（グルタミン）、Ｄ（アスパラギン酸）、Ｅ（グルタミン酸）、Ｒ（アルギニン）、Ｋ（リジン）及びＨ（ヒスチジン）等｝を含んでいてもよい。 In addition to the above examples, the auxiliary amino acid sequence (Y) includes other amino acids {A (alanine), G (glycine), S (serine), T (threonine), V (valine), L (leucine), I (isoleucine), C (cysteine), M (methionine), F (phenylalanine), Y (tyrosine), P (proline), W (tryptophan), N (asparagine), Q (glutamine), D (aspartic acid) , E (glutamic acid), R (arginine), K (lysine), H (histidine) and the like}.

（ＧＡ）_a配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（１２）〜（１４）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（ＧＡＧＡＧＳ）_b配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（１５）〜（１７）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（ＧＡＧＡＧＹ）_c配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（１８）〜（２０）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（ＧＡＧＶＧＹ）_d配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２１）〜（２３）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（ＧＡＧＹＧＶ）_e配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２４）〜（２６）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
｛ＤＧＧ（Ａ）_fＧＧＡ｝_g配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２７）〜（２９）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（ＧＶＰＧＶ）_h配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３０）〜（３３）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇ）_i配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３４）〜（３６）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ａ）_j配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３７）〜（３９）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（ＧＧＡ）_k配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４０）〜（４２）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（ＧＶＧＶＰ）_m配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４３）〜（４５）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（ＧＰＰ）_n配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４６）〜（４８）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（ＧＡＱＧＰＡＧＰＧ）_o配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４９）〜（５１）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（ＧＡＰＧＡＰＧＳＱＧＡＰＧＬＱ）_p配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５２）〜（５４）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（ＧＡＰＧＴＰＧＰＱＧＬＰＧＳＰ）_q配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５５）〜（５７）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。 (GA) Examples of the auxiliary amino acid sequence having _a sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (12) to (14).
(GAGAGS) The auxiliary amino acid sequence having the _b sequence includes amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (15) to (17).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (GAGAGY) _c sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (18) to (20).
(GAGVGY) Examples of the auxiliary amino acid sequence having the _d sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (21) to (23).
(GAGYGV) Examples of auxiliary amino acid sequences having an _e sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (24) to (26).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the {DGG (A) _f GGA} _g sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (27) to (29).
(GVPGV) Examples of the auxiliary amino acid sequence having the _h sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (30) to (33).
(G) _Examples of the auxiliary amino acid sequence having _i sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (34) to (36).
(A) The auxiliary amino acid sequence having _j sequence includes the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (37) to (39).
(GGA) Examples of the auxiliary amino acid sequence having the _k sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (40) to (42).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having (GVGVP) _m sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (43) to (45).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having (GPP) _n sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (46) to (48).
(GAQGPAGPG) Examples of the auxiliary amino acid sequence having _o sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (49) to (51).
(GAPGAPGSQGAPGLQ) Examples of the auxiliary amino acid sequence having the _p sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (52) to (54).
(GAPGTPGPQGLPGSP) Examples of the auxiliary amino acid sequence having the _q sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (55) to (57).

これらの補助アミノ酸配列のうち、配列番号（１２）、（１３）、（１５）、（１６）、（１７）、（１８）、（１９）、（２１）、（２２）、（２４）、（２５）、（２７）、（２８）、（２９）、（３０）、（３１）、（３３）、（３４）、（３５）、（３７）、（３８）、（４０）、（４１）、（４３）、（４４）、（４６）、（４７）、（４９）、（５０）、（５２）、（５３）、（５５）又は（５６）で表されるアミノ酸配列が好ましく、さらに好ましくは配列番号（１３）、（１５）、（１６）、（１７）、（１９）、（２２）、（２５）、（２９）、（３０）、（３１）、（３２）、（３３）、（３５）、（３８）、（４１）、（４４）、（４７）、（５０）、（５３）又は（５６）で表されるアミノ酸配列、特に好ましくは配列番号（１５）、（１６）又は（３３）で表されるアミノ酸配列である。 Among these auxiliary amino acid sequences, SEQ ID NOs: (12), (13), (15), (16), (17), (18), (19), (21), (22), (24), (25), (27), (28), (29), (30), (31), (33), (34), (35), (37), (38), (40), (41 ), (43), (44), (46), (47), (49), (50), (52), (53), (55) or (56) is preferred, More preferably, SEQ ID NOs: (13), (15), (16), (17), (19), (22), (25), (29), (30), (31), (32), ( 33), (35), (38), (41), (44), (47), (50), (53) or (56), particularly preferably Column number (15), the amino acid sequence represented by (16) or (33).

補助アミノ酸配列（Ｙ）を含む場合、（Ｙ）の含有個数は、熱安定性の観点等から、細胞接着性ペプチド（Ｄ）１分子中に、２〜５０が好ましく、さらに好ましくは３〜３０、特に好ましくは４〜２０、最も好ましくは５〜１５である。また、細胞接着性ペプチド（Ｄ）は、２種以上の補助アミノ酸配列（Ｙ）を含んでもよい。 When the auxiliary amino acid sequence (Y) is included, the content of (Y) is preferably 2 to 50, more preferably 3 to 30 in one molecule of the cell adhesive peptide (D) from the viewpoint of thermal stability. Particularly preferably 4 to 20, most preferably 5 to 15. Further, the cell adhesive peptide (D) may contain two or more auxiliary amino acid sequences (Y).

細胞接着性ペプチド（Ｄ）は、細胞接着性及び熱安定性の観点等から、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが、必要により（Ｘ）と（Ｙ）の間に他のアミノ酸配列を介して、交互に化学結合してなる構造であることが好ましく、（Ｘ）の両端に介在アミノ酸配列（Ｚ）を含むアミノ酸配列と（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造であることがさらに好ましい。この場合、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との繰り返し単位（Ｘ−Ｙ）の数（個）は、細胞接着性の観点等から、１〜５０が好ましく、さらに好ましくは２〜４０、特に好ましくは３〜３０、最も好ましくは４〜２０である。 The cell adhesion peptide (D) has a minimum amino acid sequence (X) and an auxiliary amino acid sequence (Y), if necessary, between (X) and (Y) from the viewpoint of cell adhesion and thermal stability. It is preferable that the structure is formed by alternately chemical bonding via the amino acid sequence of (X), and the amino acid sequence including the intervening amino acid sequence (Z) at both ends of (X) and (Y) are alternately chemically bonded. More preferably, it is a structure. In this case, the number (units) of repeating units (XY) of the minimum amino acid sequence (X) and the auxiliary amino acid sequence (Y) is preferably 1 to 50, more preferably 2 from the viewpoint of cell adhesiveness. -40, particularly preferably 3-30, most preferably 4-20.

また、介在アミノ酸配列（Ｚ）を有してもよい。
介在アミノ酸配列（Ｚ）としては、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＮ末端には、細胞接着性の観点から、ＧＡＡＶＴＧ配列（５８）、ＧＬＰＧＰＫＧＤ配列（５９）、ＧＰＡＶＴＧ配列（６０）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＴＧ配列（６１）、ＧＡＡＶＣＥＰＧ配列（６２）、ＧＡＡＬＣＶＳＥＰＧ配列（６３）、ＳＰＡＳＡＡＬＣＶＳＥＰＧ配列（６４）、ＳＰＡＳＡＡＶＣＥＰＧ配列（６５）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＣＥＰＧ配列（６６）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＬＣＶＳＥＰＧ配列（６７）、ＧＰＡＶＣＥＰＧ配列（６８）、ＧＰＡＬＣＶＳＥＰＧ配列（６９）及びＧＡＡＰＧＡＳ配列（７０）からなる群より選ばれる少なくとも１種の介在アミノ酸配列（Ｚ）を結合していることが好ましく、ＧＡＡＶＴＧ配列（５８）、ＧＬＰＧＰＫＧＤ配列（５９）、ＧＰＡＶＴＧ配列（６０）及びＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＴＧ配列（６１）からなる群より選ばれる少なくとも１種がさらに好ましく、ＧＡＡＶＴＧ配列（５８）が特に好ましい。 Moreover, you may have an intervening amino acid sequence (Z).
As an intervening amino acid sequence (Z), from the viewpoint of cell adhesion, a GAAVTG sequence (58), a GLPGPKGD sequence (59), a GPAVTG sequence (60), an AGPKGADGSGPPAVTG sequence (61) ), GAAVCEPG sequence (62), GAALCVSEPG sequence (63), SPASAALC VSEPG sequence (64), SPASAAVCEPG sequence (65), AGPKGADGSGPPAVCCEPG sequence (66), AGPKGADGSPGPALCVSEPG sequence (67), GPAVCEPG sequence (68), GPG Preferably, at least one intervening amino acid sequence (Z) selected from the group consisting of the GAAPGAS sequence (70) is bound, and the GAAVTG sequence (58 , GLPGPKGD sequence (59), at least one more preferably selected from the group consisting of GPAVTG sequence (60) and AGPKGADGSPGPAVTG sequence (61), GAAVTG sequence (58) is particularly preferred.

介在アミノ酸配列（Ｚ）としては、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＣ末端には、細胞接着性の観点から、ＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（７１）、ＳＰＡＳＡＡＬＣＶＳ配列（７２）、ＳＰＡＳＡＡＶＣ配列（７３）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰ配列（７４）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＣ配列（７５）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＬＣＶＳ配列（７６）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰ配列（７７）、ＳＰＡＳＡＡＧＰＶＧＳＰ配列（７８）、ＣＤＡＧＹ配列（７９）、ＣＤＡＧＰＶＧＳＰ配列（８０）及びＳＡＧＰＳＡＧＹ配列（８１）からなる群より選ばれる少なくとも１種の介在アミノ酸配列（Ｚ）を結合していることが好ましく、ＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（７１）、ＳＰＡＳＡＡＬＣＶＳ配列（７２）、ＳＰＡＳＡＡＶＣ配列（７３）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰ配列（７４）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＣ配列（７５）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＬＣＶＳ配列（７６）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰ配列（７７）及びＳＰＡＳＡＡＧＰＶＧＳＰ配列（７８）からなる群より選ばれる少なくとも１種がさらに好ましく、ＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（７１）が特に好ましい。 As the intervening amino acid sequence (Z), the SPASAAGY sequence (71), SPASAALCVS sequence (72), SPASAAVC sequence (73), AGPKGADGSGPP sequence (74) are present at the C-terminus of the minimal amino acid sequence (X) from the viewpoint of cell adhesion. ), AGPKGADGSPGPAVC sequence (75), AGPKGADGSPGPALCVS sequence (76), AGPKGADGSP sequence (77), SPASAAGPVGSP sequence (78), CDAGY sequence (79), CDAGPVGSP sequence (80) and SAGPSAGY sequence (81) Preferably, one intervening amino acid sequence (Z) is linked, and SPASAAGY sequence (71), SPASAALCVS sequence (72), SPASAAVC sequence (73), AGPKG At least one selected from the group consisting of DGSGPP sequence (74), AGPKGADGSGPPAVC sequence (75), AGPKGADGSGPPALCVS sequence (76), AGPKGADGSP sequence (77) and SPASAAGPVGSP sequence (78) is more preferred, and SPASAAGY sequence (71) is particularly preferred. .

細胞接着性ペプチド（Ｄ）は、分岐鎖を含んでいてもよく、一部が架橋されていてもよく、環状構造を含んでいてもよい。しかし、細胞接着性ペプチド（Ｄ）は、架橋されていないことが好ましく、さらに好ましくは架橋されていない直鎖構造、特に好ましくは環状構造を持たず架橋されていない直鎖構造である。なお、直鎖構造には、β構造（直鎖状ペプチドが折れ曲がってこの部分同士が平行に並び、その間に水素結合が作られる二次構造）も含まれる。 The cell adhesive peptide (D) may contain a branched chain, may be partially crosslinked, or may contain a cyclic structure. However, the cell adhesive peptide (D) is preferably not cross-linked, more preferably a non-crosslinked linear structure, and particularly preferably a non-crosslinked linear structure having no cyclic structure. The linear structure also includes a β structure (secondary structure in which linear peptides are bent and the portions are arranged in parallel and a hydrogen bond is formed therebetween).

また、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との含有個数は同じでも異なっていてもよい。異なっている場合は、いずれかの含有個数が他方の含有個数より１個少ないことが好ましい｛この場合、補助アミノ酸配列（Ｙ）が少ないことが好ましい｝。細胞接着性ペプチド（Ｄ）中の最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との含有個数割合（Ｘ／Ｙ）は、０．５〜２が好ましく、さらに好ましくは０．９〜１．４、特に好ましくは１〜１．３である。 Further, the number of the minimum amino acid sequence (X) and the auxiliary amino acid sequence (Y) may be the same or different. When they are different from each other, it is preferable that the content of one of them is one less than the content of the other {in this case, the auxiliary amino acid sequence (Y) is preferably small}. The content ratio (X / Y) between the minimum amino acid sequence (X) and the auxiliary amino acid sequence (Y) in the cell adhesion peptide (D) is preferably 0.5 to 2, more preferably 0.9 to 1. .4, particularly preferably 1-1.3.

また、細胞接着性ペプチド（Ｄ）の末端部分（最小アミノ酸配列（Ｘ）又は補助アミノ酸配列（Ｙ）からペプチド末端まで）に他のアミノ酸を含んでもよい。他のアミノ酸を含む場合、その含有個数は、細胞接着性ペプチド（Ｄ）１個当たり、１〜１０００個が好ましく、さらに好ましくは３〜３００、特に好ましくは１０〜１００である。 Moreover, you may include another amino acid in the terminal part (Minimum amino acid sequence (X) or auxiliary amino acid sequence (Y) to the terminal of a peptide) of a cell adhesive peptide (D). When other amino acids are contained, the content is preferably 1 to 1000, more preferably 3 to 300, and particularly preferably 10 to 100 per cell adhesive peptide (D).

細胞接着性ペプチド（Ｄ）の重量平均分子量（以下、Ｍｗ）は、１，０００〜１，０００，０００が好ましく、さらに好ましくは２，０００〜７００，０００、特に好ましくは３，０００〜４００，０００、最も好ましくは４，０００〜２００，０００である。 The weight average molecular weight (hereinafter referred to as Mw) of the cell adhesion peptide (D) is preferably 1,000 to 1,000,000, more preferably 2,000 to 700,000, particularly preferably 3,000 to 400,000. 000, most preferably 4,000 to 200,000.

なお、細胞接着性ペプチド（Ｄ）のＭｗは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、測定サンプル｛ポリペプチド等｝を分離し、泳動距離を標準物質と比較する方法等の公知の方法によって求められる（以下、同じ）。 The Mw of the cell adhesion peptide (D) is a well-known method such as separating a measurement sample {polypeptide etc.} by SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis) and comparing the migration distance with a standard substance. (Hereinafter the same).

細胞接着性ペプチド（Ｄ）は、化合物（ＡＭ）でさらに修飾されていてもよい。化合物（ＡＭ）としては、１〜３級のアミノ基を含有する化合物及びその塩並びにアンモニウム塩（ＡＭ−１）、カルボキシル基を含有する化合物（ＡＭ−２）、スルホ基を含有する化合物（ＡＭ−３）並びにヒドロキシル基を含有する化合物（ＡＭ−４）が含まれる。（ＡＭ）で修飾されていると、細胞増殖性がさらに良好となる。 The cell adhesion peptide (D) may be further modified with a compound (AM). As the compound (AM), a compound containing a primary to tertiary amino group and a salt thereof, an ammonium salt (AM-1), a compound containing a carboxyl group (AM-2), a compound containing a sulfo group (AM -3) as well as compounds containing a hydroxyl group (AM-4). When it is modified with (AM), the cell proliferation is further improved.

１〜３級のアミノ基を含有する化合物及びその塩並びにアンモニウム塩を含有する化合物（ＡＭ−１）としては、ポリアミン、アミノアルコール、アミノ基を有するハロゲン化物、アミノ基含有モノマー及びアミノ基含有モノマーを構成単量体とする重合体、並びにこれらのハロゲン化水素塩及び４級化物等が使用できる。
ポリアミンとしては、少なくとも１個の１級アミノ基又は２級アミノ基を有するポリアミン（炭素数２〜５６）等が用いられ、脂肪族ポリアミン、脂環式ポリアミン、複素環式ポリアミン及び芳香族ポリアミン等が用いられる。 Examples of the compound containing a primary to tertiary amino group and a salt thereof and an ammonium salt-containing compound (AM-1) include polyamines, amino alcohols, halides having an amino group, amino group-containing monomers, and amino group-containing monomers. Can be used, as well as hydrogen halide salts and quaternized compounds thereof.
As the polyamine, a polyamine having at least one primary amino group or secondary amino group (having 2 to 56 carbon atoms) is used, such as an aliphatic polyamine, an alicyclic polyamine, a heterocyclic polyamine, and an aromatic polyamine. Is used.

脂肪族ポリアミンとしては、アルキレンジアミン（エチレンジアミン、プロピレンジアミン、トリメチレンジアミン、テトラメチレンジアミン及びヘキサメチレンジアミン等）、アルキレン基の炭素数が２〜６であるポリアルキレンポリアミン（ジエチレントリアミン、イミノビスプロピルアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン及びペンタエチレンヘキサミン等）、並びにこれらのアルキル（炭素数１〜１８）置換体（ジメチルアミノプロピルアミン、ジエチルアミノプロピルアミン、ジプロピルアミノプロピルアミン、メチルエチルアミノプロピルアミン、トリメチルヘキサメチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルエチレンジアミン、トリオクタデシルエチレンジアミン及びメチルイミノビスプロピルアミン等）等が挙げられる。 Aliphatic polyamines include alkylene diamines (ethylene diamine, propylene diamine, trimethylene diamine, tetramethylene diamine, hexamethylene diamine, etc.), polyalkylene polyamines having 2 to 6 carbon atoms in the alkylene group (diethylene triamine, iminobispropylamine, Triethylenetetramine, tetraethylenepentamine, pentaethylenehexamine, etc.), and alkyl (carbon number 1-18) substitution products thereof (dimethylaminopropylamine, diethylaminopropylamine, dipropylaminopropylamine, methylethylaminopropylamine, Trimethylhexamethylenediamine, N, N-dioctadecylethylenediamine, trioctadecylethylenediamine, methyliminobispropylamine, etc. Etc. The.

脂環式ポリアミンとしては、１，３−ジアミノシクロヘキサン、１，３−ビス（メチルアミノ）シクロヘキサン、１，３−ビス（ジヒドロキシアミノ）シクロヘキサン、イソホロンジアミン、メンタンジアミン及び４，４’−メチレンジシクロヘキサンジアミン等が挙げられる。 Examples of alicyclic polyamines include 1,3-diaminocyclohexane, 1,3-bis (methylamino) cyclohexane, 1,3-bis (dihydroxyamino) cyclohexane, isophorone diamine, menthane diamine, and 4,4′-methylene dicyclohexane. Examples include diamines.

複素環式ポリアミンとしては、ピペラジン、Ｎ−メチルピペラジン、Ｎ−アミノエチルピペラジン及び１，４−ジアミノエチルピペラジン等が挙げられる。 Examples of the heterocyclic polyamine include piperazine, N-methylpiperazine, N-aminoethylpiperazine and 1,4-diaminoethylpiperazine.

芳香族ポリアミンとしては、フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ジメチルフェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’−トリメチルフェニレンジアミン、ジフェニルメタンジアミン及び２，６−ジアミノピリジン、トリレンジアミン、ジエチルトリレンジアミン、４，４’−ビス（メチルアミノ）ジフェニルメタン及び１−メチル−２−メチルアミノ−４−アミノベンゼン等が挙げられる。 Aromatic polyamines include phenylenediamine, N, N′-dimethylphenylenediamine, N, N, N′-trimethylphenylenediamine, diphenylmethanediamine and 2,6-diaminopyridine, tolylenediamine, diethyltolylenediamine, 4, Examples include 4′-bis (methylamino) diphenylmethane and 1-methyl-2-methylamino-4-aminobenzene.

アミノアルコールとしては、炭素数２〜５８のアミノアルコール等が用いられ、炭素数２〜１０のアルカノールアミン［モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、モノブタノールアミン、トリエタノールアミン、トリプロパノールアミン、トリブタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン及びＮ，Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラキス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン等］、これらのアルキル（炭素数１〜１８）置換体［Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエタノールアミン、Ｎ−エチルジエタノールアミン、Ｎ−オクタデシルジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン及びＮ，Ｎ，Ｎ’−トリオクタデシル−Ｎ’−ヒドロキシエチルエチレンジアミン等］等が挙げられる。 As the amino alcohol, an amino alcohol having 2 to 58 carbon atoms is used, and an alkanolamine having 2 to 10 carbon atoms [monoethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, monoisopropanolamine, monobutanolamine, triethanolamine, triethanolamine, Propanolamine, tributanolamine, N, N-bis (hydroxyethyl) ethylenediamine and N, N, N ′, N′-tetrakis (hydroxyethyl) ethylenediamine, etc.], alkyl (C 1-18) substituted products thereof [ N, N-dimethylethanolamine, N, N-diethylethanolamine, N-ethyldiethanolamine, N-octadecyldiethanolamine, N, N-diethyl-N ′, N′-bis (hydroxyethyl) ethylenediamine, N, - dioctadecyl -N ', N'-bis (hydroxyethyl) ethylenediamine and N, N, N'trioctadecyl -N'- hydroxyethyl ethylenediamine] and the like.

アミノ基を有するハロゲン化物としては、炭素数２〜１７のアルキルアミンのハロゲン（塩素及び臭素等）化物等が用いられ、アミノエチルクロリド、Ｎ−メチルアミノプロピルクロリド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルクロリド、Ｎ，Ｎ−ジベンジルアミノエチルブロミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルブロミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピルクロリド及びＮ，Ｎ−ジベンジルアミノプロピルクロリド等が挙げられる。 Examples of the halide having an amino group include halogenated (such as chlorine and bromine) of alkylamines having 2 to 17 carbon atoms, such as aminoethyl chloride, N-methylaminopropyl chloride, N, N-dimethylaminoethyl chloride. N, N-diethylaminoethyl chloride, N, N-dibenzylaminoethyl bromide, N, N-dimethylaminopropyl bromide, N, N-diethylaminopropyl chloride, N, N-dibenzylaminopropyl chloride and the like.

アミノ基含有モノマーとしては、炭素数５〜２１のアミノ基含有ビニル化合物、エチレンイミン及び炭素数２〜２０のアミノ酸等が用いられる。
アミノ基含有ビニル化合物としては、アミノ基含有（メタ）アクリレート、アミノ基含有（メタ）アクリルアミド、アミノ基含有芳香族ビニル炭化水素及びアミノ基含有アリルエーテル等が用いられる。 As the amino group-containing monomer, an amino group-containing vinyl compound having 5 to 21 carbon atoms, ethyleneimine, an amino acid having 2 to 20 carbon atoms, or the like is used.
Examples of the amino group-containing vinyl compound include amino group-containing (meth) acrylates, amino group-containing (meth) acrylamides, amino group-containing aromatic vinyl hydrocarbons, amino group-containing allyl ethers, and the like.

アミノ基含有（メタ）アクリレートとしては、アミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−メチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジベンジルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジベンジルアミノプロピル（メタ）アクリレート、モルホリノエチル（メタ）アクリレート及びＮ−メチルピペチジノエチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。 As the amino group-containing (meth) acrylate, aminoethyl (meth) acrylate, N-methylaminoethyl (meth) acrylate, N, N-dimethylaminoethyl (meth) acrylate, N, N-diethylaminopropyl (meth) acrylate, N, N-dipropylaminoethyl (meth) acrylate, N-benzyl-N-methylaminoethyl (meth) acrylate, N, N-dibenzylaminoethyl (meth) acrylate, N, N-dibenzylaminopropyl (meth) ) Acrylate, morpholinoethyl (meth) acrylate, N-methylpipetidinoethyl (meth) acrylate, and the like.

アミノ基含有（メタ）アクリルアミドとしては、アミノエチルアクリルアミド、Ｎ−メチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、モルホリノエチル（メタ）アクリルアミド及びＮ−メチルピペチジノエチル（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。 Examples of amino group-containing (meth) acrylamides include aminoethyl acrylamide, N-methylaminopropyl acrylamide, N, N-dimethylaminoethyl (meth) acrylamide, N, N-diethylaminopropyl (meth) acrylamide, and N, N-dipropyl. Examples include aminoethyl (meth) acrylamide, N-benzyl-N-methylaminoethyl (meth) acrylamide, morpholinoethyl (meth) acrylamide, and N-methylpipetidinoethyl (meth) acrylamide.

アミノ基含有芳香族ビニル炭化水素としては、アミノエチルスチレン、Ｎ−メチルアミノエチルスチレン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスチレン、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノスチレン及びＮ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノスチレン等が挙げられる。 Examples of amino group-containing aromatic vinyl hydrocarbons include aminoethylstyrene, N-methylaminoethylstyrene, N, N-dimethylaminostyrene, N, N-dipropylaminostyrene, and N-benzyl-N-methylaminostyrene. Can be mentioned.

アミノ基含有アリルエーテルとしては、アミノエチルアリルエーテル、Ｎ−メチルアミノエチルアリルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアリルエーテル及びＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアリルエーテル等が挙げられる。 Examples of the amino group-containing allyl ether include aminoethyl allyl ether, N-methylaminoethyl allyl ether, N, N-dimethylaminoethyl allyl ether, and N, N-diethylaminoethyl allyl ether.

アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、プロリン、システイン、リシン、セリン、グリシン、３−アミノプロピオン酸、８−アミノアクタン酸及び２０−アミノエイコサン酸等が挙げられる。 As amino acids, arginine, histidine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, tyrosine, valine, alanine, asparagine, aspartic acid, glutamine, glutamic acid, proline, cysteine, lysine, serine, glycine, 3-aminopropionic acid , 8-aminoactanoic acid and 20-aminoeicosanoic acid.

アミノ基含有モノマーの重合体としては、アミノ基含有ビニル化合物からなるビニルポリマー、ポリエチレンイミン及びポリペプチド（（Ｂ１）は含まない。）等が挙げられる。
アミノ基含有モノマーの重合体の重量平均分子量は、５００〜１００万が好ましく、さらに好ましくは１，０００〜８０万、特に好ましくは２，０００〜５０万である。なお、重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定することができる｛基準物質：分子量４２０〜２０，６００，０００のポリスチレンスタンダード（東ソー製）等｝。 Examples of the polymer of the amino group-containing monomer include a vinyl polymer composed of an amino group-containing vinyl compound, polyethyleneimine, and a polypeptide (not including (B1)).
The weight average molecular weight of the polymer of amino group-containing monomers is preferably 500 to 1,000,000, more preferably 1,000 to 800,000, and particularly preferably 2,000 to 500,000. The weight average molecular weight can be measured by gel permeation chromatography (GPC) {reference substance: polystyrene standard having a molecular weight of 420 to 20,600,000 (manufactured by Tosoh Corp.)}.

ハロゲン化水素塩としては、上記アミノ基含有化合物とハロゲン化物（フッ化水素、塩化水素、臭化水素及びヨウ化水素等）との塩が挙げられる。
具体的には、塩酸Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリド及び塩酸Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルクロリド等が挙げられる。 Examples of the hydrogen halide salt include salts of the amino group-containing compound and halides (hydrogen fluoride, hydrogen chloride, hydrogen bromide, hydrogen iodide, etc.).
Specific examples include N, N-dimethylaminoethyl chloride hydrochloride and N, N-diethylaminoethyl chloride hydrochloride.

これらの４級化物としては、これらのアミノ基を４級化剤（メチルクロリド、エチルクロリド、ベンジルクロリド、ジメチル炭酸、ジメチル硫酸及びエチレンオキシド等）によって４級化したもの等が挙げられる。 Examples of these quaternized products include those obtained by quaternizing these amino groups with a quaternizing agent (such as methyl chloride, ethyl chloride, benzyl chloride, dimethyl carbonate, dimethyl sulfate and ethylene oxide).

これらの１〜３級のアミノ基を含有する化合物及びその塩並びにアンモニウム塩（ＡＭ−１）のうち、細胞増殖性の観点から、塩酸Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリド及び塩酸Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルクロリドが好ましく、さらに好ましくは塩酸Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリドである。 Among these compounds containing 1 to 3 amino groups and salts thereof and ammonium salts (AM-1), N, N-dimethylaminoethyl chloride hydrochloride and N, N-diethylamino hydrochloride are preferable from the viewpoint of cell proliferation. Ethyl chloride is preferable, and N, N-dimethylaminoethyl chloride hydrochloride is more preferable.

カルボキシル基を含有する化合物（ＡＭ−２）としては、炭素数２〜３０のカルボン酸であり、具体的には、ぎ酸、酢酸、プロピオン酸、こはく酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、りんご酸、酒石酸、くえん酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、サリチル酸、４−ヒドロキシ安息香酸及びフェニル酢酸等が挙げられる。また、これらカルボキシル基を有するハロゲン化物等も使用できる。具体的には、クロロ酢酸及びクロロぎ酸等が挙げられる。これらのカルボキシル基を含有する化合物（ＡＭ−２）のうち、細胞増殖性の観点からクロロ酢酸が好ましい。 The compound (AM-2) containing a carboxyl group is a carboxylic acid having 2 to 30 carbon atoms, specifically, formic acid, acetic acid, propionic acid, succinic acid, glycolic acid, gluconic acid, lactic acid, apple Acid, tartaric acid, citric acid, ascorbic acid, glucuronic acid, maleic acid, fumaric acid, pyruvic acid, aspartic acid, glutamic acid, benzoic acid, anthranilic acid, mesylic acid, salicylic acid, 4-hydroxybenzoic acid and phenylacetic acid . Moreover, the halide etc. which have these carboxyl groups can also be used. Specific examples include chloroacetic acid and chloroformic acid. Of these carboxyl group-containing compounds (AM-2), chloroacetic acid is preferred from the viewpoint of cell proliferation.

スルホ基を含有する化合物（ＡＭ−３）としては、炭素数２〜３０のスルホン酸であり、具体的には、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルファニル酸及びシクロヘキシルアミノスルホン酸等が挙げられる。また、これらスルホ基を有するハロゲン化物等も使用できる。具体的には、クロロスルホン酸及びクロロエタンスルホン酸等が挙げられる。これらのスルホン基を含有する化合物（ＡＭ−３）のうち、細胞増殖性の観点からクロロエタンスルホン酸が好ましい。 The compound (AM-3) containing a sulfo group is a sulfonic acid having 2 to 30 carbon atoms, specifically, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, pantothenic acid, 2-hydroxyethanesulfonic acid, toluenesulfone. Examples include acid, sulfanilic acid and cyclohexylaminosulfonic acid. Moreover, the halide etc. which have these sulfo groups can also be used. Specific examples include chlorosulfonic acid and chloroethanesulfonic acid. Of these sulfone group-containing compounds (AM-3), chloroethanesulfonic acid is preferred from the viewpoint of cell proliferation.

ヒドロキシル基を含有する化合物（ＡＭ−４）としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等が挙げられる。また、これらヒドロキシル基を有するハロゲン化物等も使用できる。具体的には、クロロエタノール及びクロロプロパノール等が挙げられる。これらのヒドロキシル基を含有する化合物（ＡＭ−４）のうち、細胞増殖性観点からクロロエタノールが好ましい。 Examples of the compound (AM-4) containing a hydroxyl group include methanol, ethanol, propanol, butanol and the like. Moreover, the halide etc. which have these hydroxyl groups can also be used. Specific examples include chloroethanol and chloropropanol. Of these hydroxyl group-containing compounds (AM-4), chloroethanol is preferred from the viewpoint of cell proliferation.

化合物（ＡＭ）で修飾する方法としては、（１）化合物（ＡＭ）と、修飾前の細胞接着性ペプチド（Ｄ）とを化学結合｛共有結合、イオン結合及び／又は水素結合等｝させる方法が適用できる。
これらのうち、細胞増殖性の観点等から、（１）の化学結合させる方法が好ましく、さらに好ましくは共有結合である。 Examples of the method of modifying with compound (AM) include (1) a method of chemically bonding {covalent bond, ionic bond and / or hydrogen bond, etc.} between compound (AM) and cell adhesive peptide (D) before modification. Applicable.
Among these, from the viewpoint of cell proliferation, the chemical bonding method (1) is preferable, and covalent bonding is more preferable.

（１）化合物（ＡＭ）と、修飾前の細胞接着性ペプチド（Ｄ）とを化学結合｛共有結合、イオン結合及び／又は水素結合等｝させる方法において、化学結合させるために、細胞接着性ペプチド（Ｄ）がアミノ酸残基として反応性基｛ヒドロキシル基、カルボキシル基、メルカプト基、及び１級又は２級アミノ基等｝をもつアミノ酸を持っていることが好ましい。反応性基のうち、細胞増殖性の観点から、ヒドロキシル基、カルボキシル基及び１級アミノ基が好ましく、さらに好ましくはヒドロキシル基及びカルボキシル基、特に好ましくはヒドロキシル基である。また、細胞接着性ペプチド（Ｄ）の１分子中に反応性基を少なくとも１個有すればよいが、細胞増殖性の観点から、１分子中に２〜５０個有するものが好ましく、さらに好ましくは１分子中に３〜３０個、特に好ましくは１分子中に５〜２０個有するものである。 (1) In order to chemically bond the compound (AM) and the cell adhesive peptide (D) before modification in a chemical bond {covalent bond, ionic bond and / or hydrogen bond, etc.} (D) preferably has an amino acid having a reactive group {hydroxyl group, carboxyl group, mercapto group, primary or secondary amino group, etc.} as an amino acid residue. Of the reactive groups, from the viewpoint of cell proliferation, a hydroxyl group, a carboxyl group and a primary amino group are preferable, a hydroxyl group and a carboxyl group are more preferable, and a hydroxyl group is particularly preferable. Further, at least one reactive group may be contained in one molecule of the cell adhesion peptide (D), but from the viewpoint of cell proliferation, those having 2-50 in one molecule are preferable, and more preferably One having 3 to 30 and particularly preferably 5 to 20 in one molecule.

化学結合させる方法としては、公知の方法が適用でき、特開２００７−５１１２７号公報等に記載の方法が挙げられる。化学結合形成反応には反応溶媒を使用してもよく、反応溶媒としては公知のものが使用でき、例えば、水、臭化リチウム水溶液、過塩素酸リチウム水溶液、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、ジメチルスルフォキシド、ジメチルアセトアミド及びテトラヒドロフランが挙げられる。 As a method for chemical bonding, a known method can be applied, and examples thereof include a method described in JP-A-2007-51127. A reaction solvent may be used for the chemical bond formation reaction, and a known solvent can be used, for example, water, lithium bromide aqueous solution, lithium perchlorate aqueous solution, methanol, ethanol, isopropanol, acetone, dimethyl Examples include sulfoxide, dimethylacetamide, and tetrahydrofuran.

化合物（ＡＭ）と修飾前の細胞接着性ペプチド（Ｄ）とを共有結合させる具体例としては、細胞接着性ペプチド（Ｄ）中の側鎖にヒドロキシル基を含有するアミノ酸（例えば、Ｓｅｒ及びＴｙｒ）を１〜３級のアミノ基、及び／又はアンモニウム塩、カルボキシル基、スルホン基、ヒドロキシル基を有するアルキルハロゲン化物でアルキルエーテル化する方法、及び側鎖にカルボキシル基を含有するアミノ酸（例えば、Ａｓｐ及びＧｌｕ）をアミノ基、及び／又はアンモニウム塩を有するアルコールでエステル化する方法が挙げられる。 Specific examples of covalently bonding the compound (AM) and the cell-adhesive peptide (D) before modification include amino acids containing a hydroxyl group in the side chain in the cell-adhesive peptide (D) (for example, Ser and Tyr) And alkyl ethers with alkyl halides having 1 to 3 amino groups and / or ammonium salts, carboxyl groups, sulfone groups, hydroxyl groups, and amino acids containing carboxyl groups in the side chain (for example, Asp and Glu) may be esterified with an alcohol having an amino group and / or an ammonium salt.

好ましい細胞接着性ペプチド（Ｄ）の一部を以下に例示する。
（１）最小アミノ酸配列（Ｘ）がＲＧＤ配列（ｘ１）の場合
ＲＧＤ配列（ｘ１）の１３個と（ＧＡＧＡＧＳ）₉配列（１６）（ｙ１）の１２個とを有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約１１万のポリペプチド（配列（８２））｛「プロネクチンＦ」、プロネクチンは三洋化成工業（株）の登録商標（日本及び米国）である。三洋化成工業（株）製＜以下同じ＞｝；
プロネクチンＦを化合物（ＡＭ）で修飾したタンパク質であり、具体的には、化合物（ＡＭ）として塩酸Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリドを用いて修飾したポリペプチド（「プロネクチンＦプラス」）；
（ｘ１）の５個と（ＧＡＧＡＧＳ）₃配列（１５）（ｙ２）の５個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約２万のポリペプチド（配列（８３））（「プロネクチンＦ２」）；（ｘ１）の３個と（ＧＶＰＧＶ）₂ＧＧ（ＧＡＧＡＧＳ）₃配列（３３）（ｙ３）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約１万のポリペプチド（配列（８４））（「プロネクチンＦ３」）等。 A part of preferable cell adhesion peptide (D) is illustrated below.
(1) When minimum amino acid sequence (X) is RGD sequence (x1) It has 13 RGD sequences (x1) and 12 (GAGAGS) ₉ sequences (16) (y1). Polypeptide with a molecular weight of about 110,000 (sequence (82)) {"pronectin F", pronectin is a registered trademark (Japan and USA) of Sanyo Chemical Industries. Manufactured by Sanyo Chemical Industries Co., Ltd.
A protein obtained by modifying pronectin F with compound (AM), specifically, a polypeptide ("pronectin F plus") modified with N, N-dimethylaminoethyl chloride hydrochloride as compound (AM);
A polypeptide having an Mw of about 20,000 (5) (x1) and 5 (GAGAGS) ₃ sequences (15) and (y2) and having a structure in which these are alternately chemically bonded (sequence (83)) (“Pronectin F2”); Mw having three (x1) and three (GVPVG) ₂ GG (GAGAGS) ₃ sequences (33) (y3), and these are alternately chemically bonded About 10,000 polypeptides (sequence (84)) ("pronectin F3") and the like.

（２）最小アミノ酸配列（Ｘ）がＩＫＶＡＶ配列（ｘ２）の場合
プロネクチンＦ、プロネクチンＦ２又はプロネクチンＦ３のＲＧＤ配列（ｘ１）をＩＫＶＡＶ配列（７）（ｘ２）に変更した「プロネクチンＬ」、「プロネクチンＬ２」、又は「プロネクチンＬ３」等。 (2) When the minimum amino acid sequence (X) is an IKVAV sequence (x2) “Pronectin L”, “Pronectin” in which the RGD sequence (x1) of pronectin F, pronectin F2 or pronectin F3 is changed to the IKVAV sequence (7) (x2) L2 "or" Pronectin L3 ".

（３）最小アミノ酸配列（Ｘ）がＹＩＧＳＲ配列（ｘ３）の場合
プロネクチンＦ、プロネクチンＦ２又はプロネクチンＦ３のＲＧＤ配列（ｘ１）をＹＩＧＳＲ配列（ｘ３）に変更した「プロネクチンＹ」、「プロネクチンＹ２」、又は「プロネクチンＹ３」等。 (3) When the minimum amino acid sequence (X) is a YIGSR sequence (x3) “Pronectin Y”, “Pronectin Y2”, wherein the RGD sequence (x1) of pronectin F, pronectin F2 or pronectin F3 is changed to the YIGSR sequence (x3), Or “pronectin Y3” or the like.

細胞接着性ペプチド（Ｄ）は、人工的に合成されるもの（人工ポリペプチド）が含まれ、例えば、有機合成法（固相合成法、液相合成法等）及び生化学的合成法［遺伝子組換え微生物（酵母、細菌、大腸菌等）］等によって製造する。すなわち、細胞接着性ペプチド（Ｄ）としては、動物由来のコラーゲンやフィブロネクチン等の細胞接着性蛋白質を含まない。 Cell adhesion peptides (D) include those artificially synthesized (artificial polypeptides). For example, organic synthesis methods (solid phase synthesis methods, liquid phase synthesis methods, etc.) and biochemical synthesis methods [genes Recombinant microorganisms (yeast, bacteria, E. coli, etc.)] and the like. That is, the cell adhesion peptide (D) does not include cell adhesion proteins such as animal-derived collagen and fibronectin.

有機合成法に関しては、例えば、日本生化学会編「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）」第６４１〜６９４頁（昭和６２年５月２０日；株式会社東京化学同人発行）に記載されている方法等が用いられる。生化学的合成法に関しては、例えば、特表平３−５０２９３５号公報に記載されている方法等が用いられる。細胞接着性ペプチド（Ｄ）を容易に合成できる点で、遺伝子組換え微生物による生化学的合成法が好ましく、特に好ましくは遺伝子組換え大腸菌を用いて合成する方法である。 The organic synthesis method is described in, for example, “Sequel Biochemistry Experiment Course 2, Protein Chemistry (Part 2)” pages 641-694 (May 20, 1987; published by Tokyo Chemical Co., Ltd.). The method etc. currently used are used. As for the biochemical synthesis method, for example, the method described in JP-T-3-502935 is used. A biochemical synthesis method using a genetically modified microorganism is preferable in that the cell adhesive peptide (D) can be easily synthesized, and a method using a genetically modified Escherichia coli is particularly preferable.

細胞接着因子としては、細胞接着性の観点から、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、プロネクチンＦ及びプロネクチンＦプラスからなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましい。 The cell adhesion factor is preferably at least one selected from the group consisting of fibronectin, collagen, laminin, pronectin F and pronectin F plus from the viewpoint of cell adhesion.

本発明の細胞培養用基材において、細胞接着因子の含有量は、細胞接着性の観点から、細胞培養用基材の重量を基準として、０〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜５重量％である。 In the cell culture substrate of the present invention, the content of the cell adhesion factor is preferably 0 to 10% by weight, more preferably 0 to 5%, based on the weight of the cell culture substrate, from the viewpoint of cell adhesion. % By weight.

本発明の細胞培養用基材の形状は、特に制限はなく、例えば、シート状、繊維状、ロッド状及び球状（ビーズ状等）等の形状が挙げられる。これらのうち、細胞培養に用いやすい観点から、シート状及び球状が好ましい。
シートである場合、シートの厚さとしては特に制限はないが、細胞培養のしやすさ及び分解性の観点から、０．５〜５００ｎｍのものが好ましく挙げられる。 The shape of the cell culture substrate of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a sheet shape, a fiber shape, a rod shape, and a spherical shape (such as a bead shape). Among these, from the viewpoint of easy use in cell culture, a sheet shape and a spherical shape are preferable.
In the case of a sheet, the thickness of the sheet is not particularly limited, but preferably 0.5 to 500 nm from the viewpoint of ease of cell culture and degradability.

本発明の細胞培養用基材は、３７℃における貯蔵弾性率Ｇ’が１０００〜１×１０¹⁰Ｐａであり、好ましくは１×１０⁴〜１×１０⁸である。貯蔵弾性率Ｇ’が１０００Ｐａ未満であると、細胞の接着性低下、接着細胞の形状変化が起こる問題がある。また、１×１０¹⁰Ｐａを超えると、細胞培養用基材の作製が困難であり、また後述する分解剤（Ｅ）により分解されにくい問題がある。
貯蔵弾性率Ｇ’はレオメータにより測定した値である。 The substrate for cell culture of the present invention has a storage elastic modulus G ′ at 37 ° C. of 1000 to 1 × 10 ¹⁰ Pa, preferably 1 × 10 ⁴ to 1 × 10 ⁸ . When the storage elastic modulus G ′ is less than 1000 Pa, there are problems that the adhesiveness of the cells is lowered and the shape of the adherent cells is changed. Moreover, when it exceeds 1 × 10 ¹⁰ Pa, it is difficult to produce a cell culture substrate, and there is a problem that it is difficult to be decomposed by the decomposition agent (E) described later.
The storage elastic modulus G ′ is a value measured by a rheometer.

本発明の細胞培養用基材の細胞培養表面における水（３７℃）に対する接触角は、細胞接着性の観点から、２０〜６０°が好ましく、さらに好ましくは３０〜５０°である。 The contact angle with respect to water (37 ° C.) on the cell culture surface of the cell culture substrate of the present invention is preferably 20 to 60 °, more preferably 30 to 50 ° from the viewpoint of cell adhesion.

本発明の細胞培養用基材の細胞培養表面における表面粗さ（Ｒａ）は、細胞接着性の観点から、１μｍ以下であることが好ましく、さらに好ましくは０．５μｍ以下である。 From the viewpoint of cell adhesion, the surface roughness (Ra) of the cell culture substrate of the present invention is preferably 1 μm or less, more preferably 0.5 μm or less.

本発明の細胞培養用基材の製造方法としては、例えば、多糖類（Ａ）がカルボキシメチルセルロースであり、下記（１）〜（５）の工程を含むものが挙げられる。
（１）カルボキシメチルセルロース（以下において、ＣＭＣと略記する）を水に溶解させる工程。
（２）前記（１）で得られた基材に架橋剤（Ｂ）を添加し、架橋反応を進行させる工程。
（３）前記（２）で得られた基材をシート状、もしくはビーズ状に加工する工程。
（４）前記（３）で得られた基材を乾燥させ、水分を除去する工程。
（５）前記（４）で得られた基材に細胞接着性ペプチド（Ｄ）を修飾する工程。 As a manufacturing method of the base material for cell cultures of this invention, a polysaccharide (A) is carboxymethylcellulose and the thing including the process of following (1)-(5) is mentioned, for example.
(1) A step of dissolving carboxymethyl cellulose (hereinafter abbreviated as CMC) in water.
(2) A step of adding a crosslinking agent (B) to the substrate obtained in (1) and causing the crosslinking reaction to proceed.
(3) The process of processing the base material obtained by said (2) into a sheet form or bead form.
(4) The process of drying the base material obtained by said (3), and removing a water | moisture content.
(5) A step of modifying the cell adhesion peptide (D) on the substrate obtained in (4).

ＣＭＣを水に溶解させる方法としては、例えば攪拌機で水を撹拌しながら、ＣＭＣを添加する方法等が挙げられる。溶解液の均一さを確保するため、好ましくはＣＭＣを徐々に添加する方法が含まれる。 Examples of the method for dissolving CMC in water include a method of adding CMC while stirring water with a stirrer. In order to ensure the uniformity of the solution, a method of gradually adding CMC is preferably included.

ＣＭＣを水に溶解させる攪拌方法としては、例えば撹拌子をスターラーで回す方法、撹拌羽で撹拌する方法、前記２つの方法にさらに加熱をする方法等が挙げられる。
ＣＭＣ溶解液の粘度が高いため、撹拌羽で撹拌する方法が好ましく、さらに好ましくは加熱しながら撹拌羽で撹拌する方法である。 Examples of the stirring method for dissolving CMC in water include a method of rotating a stirring bar with a stirrer, a method of stirring with a stirring blade, and a method of further heating the two methods.
Since the viscosity of the CMC solution is high, a method of stirring with a stirring blade is preferable, and a method of stirring with a stirring blade while heating is more preferable.

架橋剤（Ｂ）の添加方法としては、例えば攪拌機でＣＭＣ溶解液を撹拌しながら、架橋剤（Ｂ）を添加する方法等が挙げられる。この場合、架橋剤（Ｂ）は一度に全量添加してもよく、ポンプ等を用いて徐々に添加してもよいが、架橋反応を均一に進行させる観点から、ポンプ等を用いて徐々に添加する方法が好ましい。 Examples of the method of adding the crosslinking agent (B) include a method of adding the crosslinking agent (B) while stirring the CMC solution with a stirrer. In this case, the cross-linking agent (B) may be added all at once, or may be gradually added using a pump or the like, but from the viewpoint of allowing the crosslinking reaction to proceed uniformly, it is gradually added using a pump or the like. Is preferred.

架橋剤（Ｂ）添加後のＣＭＣ溶解液をシャーレ上に均一にシート状に加工する方法としては、例えば浸漬塗り、吹付、ローラー塗り及びスピンコート等が挙げられる。
生産性及びハンドリング性の観点から、浸漬塗りは好ましくなく、吹付、ローラー塗り及びスピンコートが好ましい。塗膜の均一性の観点から、より好ましくはローラー塗り、スピンコートである。塗布から乾燥までの効率の観点から、最も好ましくはスピンコートである。 Examples of the method for uniformly processing the CMC solution after addition of the crosslinking agent (B) on a petri dish into a sheet form include dip coating, spraying, roller coating, and spin coating.
From the viewpoint of productivity and handling properties, dip coating is not preferred, and spraying, roller coating and spin coating are preferred. From the viewpoint of the uniformity of the coating film, roller coating and spin coating are more preferable. From the viewpoint of efficiency from application to drying, spin coating is most preferable.

架橋剤（Ｂ）添加後のＣＭＣ溶解液をビーズ状に加工する方法としては、例えば、ＣＭＣ溶液を乾燥後に物理的に粉砕して粒子状にする粉砕法及び架橋剤添加後のＣＭＣ溶解液を疎水性有機溶剤中に分散させる分散法等が挙げられる。 As a method of processing the CMC solution after addition of the cross-linking agent (B) into beads, for example, a pulverizing method in which the CMC solution is physically pulverized after drying and a CMC solution after addition of the cross-linking agent is used. Examples of the dispersion method include dispersion in a hydrophobic organic solvent.

粉砕法としては、まず、乾燥物を粗粉砕し、次いで微粉砕することが好ましい。この際ジェット気流中で衝突板に衝突させて粉砕したり、ジェット気流中で粒子同士を衝突させて粉砕したり、機械的に回転するローターとステーターの狭いギャップで粉砕する方式が好ましく用いられる。 As a pulverization method, it is preferable to first coarsely pulverize the dried product and then finely pulverize. At this time, a method of pulverizing by colliding with a collision plate in a jet stream, pulverizing particles by colliding with each other in a jet stream, or pulverizing with a narrow gap between a mechanically rotating rotor and a stator is preferably used.

分級工程では、前記粉砕工程にて得られた粉砕物を分級し、所定粒径の粒子に調整する。分級は、例えば、サイクロン、デカンター及び遠心分離等により、微粒子部分を取り除くことにより行うことができる。 In the classification step, the pulverized product obtained in the pulverization step is classified and adjusted to particles having a predetermined particle size. Classification can be performed, for example, by removing fine particle portions by a cyclone, a decanter, centrifugation, or the like.

分散法において、架橋剤（Ｂ）添加後のＣＭＣ溶解液を有機溶剤中に分散させる方法としては、逆相懸濁法等が挙げられ、粒子径の均一性、粒子の円形度及び粒子表面形状の滑らかさの観点から、逆相懸濁法による分散が好ましい。
疎水性有機溶媒は公知（特許第３３６３０００号、特開２００３−１４７００５号公報記載）のものが使用でき、基本的に水に溶け難ければいかなるものも使用できる。その一例を挙げれば、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン及びｎ−オクタン等の脂肪族炭化水素、シクロヘキサン及びメチルシクロヘキサン等の脂環族炭化水素、ベンゼン、トルエン及びキシレン等の芳香族炭化水素等が挙げられる。
分散剤としては、逆相懸濁重合分散剤として公知のものが使用でき、例えば、アニオン分散剤（ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩（特開平６−９３００８号公報記載）、モノアルキルリン酸塩（特開昭６１−２０９２０１号公報記載のもの等）等）、ノニオン分散剤（ショ糖脂肪酸エステル、ソルビトール脂肪酸エステル、脂肪族アルコールアルキレンオキサイド付加物及びアルキルフェノールアルキレンオキサイド付加物等）等が挙げられる。 In the dispersion method, as a method of dispersing the CMC solution after addition of the crosslinking agent (B) in the organic solvent, there may be mentioned a reverse phase suspension method, etc., including uniformity of particle diameter, particle circularity and particle surface shape. From the viewpoint of smoothness, dispersion by a reverse phase suspension method is preferred.
As the hydrophobic organic solvent, known ones (Patent No. 3363000, JP-A No. 2003-147005) can be used, and basically any solvent can be used as long as it is hardly soluble in water. For example, aliphatic hydrocarbons such as n-pentane, n-hexane, n-heptane and n-octane, alicyclic hydrocarbons such as cyclohexane and methylcyclohexane, aromatic carbons such as benzene, toluene and xylene. Hydrogen etc. are mentioned.
As the dispersant, those known as reverse phase suspension polymerization dispersants can be used. For example, anionic dispersants (polyoxyethylene alkyl ether sulfate (described in JP-A-6-93008), monoalkyl phosphates ( Nonionic dispersant (sucrose fatty acid ester, sorbitol fatty acid ester, aliphatic alcohol alkylene oxide adduct, alkylphenol alkylene oxide adduct, etc.) and the like.

余分な水分を除去する方法としては特に限定されず、乾燥機を用いた乾燥方法があげられる。例えば、ディスクドライヤー、ターボドライヤー及びドラムドライヤー等の乾燥機を使用して乾燥する方法が挙げられる。
乾燥温度は、６０〜２３０℃が好ましく、さらに好ましくは１００〜２００℃である。乾燥温度が、６０℃以上であると、乾燥に長くの時間を必要とせずエネルギー消費量の点で経済的であり、一方、２３０℃以下であると、副反応や樹脂の分解などが起こらないので好ましい。乾燥雰囲気は常圧下でも減圧下（例えば５００ｍｍＨｇ以下）でもよい。 The method for removing excess water is not particularly limited, and examples thereof include a drying method using a dryer. For example, the method of drying using dryers, such as a disk dryer, a turbo dryer, and a drum dryer, is mentioned.
The drying temperature is preferably 60 to 230 ° C, more preferably 100 to 200 ° C. When the drying temperature is 60 ° C. or higher, drying does not require a long time and it is economical in terms of energy consumption. On the other hand, when the drying temperature is 230 ° C. or lower, side reactions and resin decomposition do not occur. Therefore, it is preferable. The drying atmosphere may be normal pressure or reduced pressure (for example, 500 mmHg or less).

乾燥後の含水率は、貯蔵弾性率Ｇ‘が１０００〜１×１０¹⁰Ｐａになる水分量で規定される。貯蔵弾性率Ｇ‘が１０００Ｐａ未満では、細胞培養用基材の形状がビーズ状の場合、粒子同士が合着する問題がある。また、細胞培養用基材の形状がシート状の場合は他の材料と触れたときに変形又は接着する問題がある。 The moisture content after drying is defined by the amount of water that gives a storage elastic modulus G ′ of 1000 to 1 × 10 ¹⁰ Pa. When the storage elastic modulus G ′ is less than 1000 Pa, there is a problem that the particles are coalesced when the cell culture substrate has a bead shape. Further, when the cell culture substrate is in the form of a sheet, there is a problem that it deforms or adheres when it is in contact with other materials.

貯蔵弾性率Ｇ‘が１０００〜１×１０¹⁰Ｐａになる水分量は、細胞培養用基材の重量を基準として、４０重量％以下が好ましく、貯蔵弾性率を向上させる観点から、さらに好ましくは３０重量％以下である。一方、水分量が減少しすぎると、体積収縮によって表面粗さＲａが大きくなるため、１０％重量以上がより好ましい。 The water content at which the storage elastic modulus G ′ is 1000 to 1 × 10 ¹⁰ Pa is preferably 40% by weight or less based on the weight of the cell culture substrate, and more preferably 30 from the viewpoint of improving the storage elastic modulus. % By weight or less. On the other hand, if the amount of water is excessively reduced, the surface roughness Ra increases due to volume shrinkage, and thus it is more preferably 10% weight or more.

細胞接着性ペプチド（Ｄ）を細胞培養基材へ修飾する方法としては、（１）化学結合｛共有結合、イオン結合及び／又は水素結合等｝させる方法、（２）細胞接着ペプチド（Ｄ）を物理吸着（ファンデルワールス力による吸着）させる方法、並びに、（３）酵素修飾させる方法が挙げられる。 As a method for modifying the cell adhesion peptide (D) to the cell culture substrate, (1) a chemical bond {covalent bond, ionic bond and / or hydrogen bond, etc.}, (2) a cell adhesion peptide (D) Examples include physical adsorption (adsorption by van der Waals force) and (3) enzyme modification.

化学結合する方法（１）としては、細胞接着性ペプチド（Ｄ）が有するの反応性基（−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−、−ＮＨ₂、−ＳＨ等）と多糖類（Ａ）が有する反応性基（−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＮＨ₂及び−ＳＨ等）を架橋することにより行われる方法等が挙げられる。
物理的吸着する方法（２）としては、所定濃度の細胞接着性ペプチド（Ｄ）を含有する溶液と細胞培養用基材とを所定時間共存させてることにより物理吸着させる方法等が挙げられる。
酵素修飾する方法（３）としては、グリコシドトランスフェラーゼ等の酵素を用いて細胞接着性ペプチド（Ｄ）に多糖類（Ａ）を結合させる方法等が挙げられる。 As the chemical bonding method (1), the reactive group (—OH, —COOH, —NH—, —NH ₂ , —SH, etc.) possessed by the cell adhesive peptide (D) and the polysaccharide (A) are possessed. Examples thereof include a method performed by crosslinking a reactive group (—OH, —COOH, —CHO, —C (═O) —, —NH—, —NH _2, —SH, etc.).
Examples of the physical adsorption method (2) include a physical adsorption method in which a solution containing a cell-adhesive peptide (D) having a predetermined concentration and a cell culture substrate coexist for a predetermined time.
Examples of the enzyme modification method (3) include a method of binding the polysaccharide (A) to the cell adhesive peptide (D) using an enzyme such as glycoside transferase.

本発明の細胞の生産方法は、上記細胞培養用基材を用いて細胞（Ｘ）を培養する細胞の生産方法である。 The cell production method of the present invention is a cell production method for culturing cells (X) using the cell culture substrate.

細胞（Ｘ）としては細胞であれば制限がないが、本発明の細胞培養用基材を用いると細胞増殖性が高いため、医薬品等の有用物質生産や治療等に用いられる哺乳動物由来の正常細胞、哺乳動物由来の株化細胞及び昆虫細胞が適している。 The cell (X) is not limited as long as it is a cell. However, when the cell culture substrate of the present invention is used, cell proliferation is high, and normal derived from mammals used for production of useful substances such as pharmaceuticals and treatment. Cells, mammalian cell lines and insect cells are suitable.

哺乳動物由来の正常細胞としては、皮膚に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等）、血管に関与する細胞（血管内皮細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞等）、筋肉に関与する細胞（筋肉細胞等）、脂肪に関与する細胞（脂肪細胞等）、神経に関与する細胞（神経細胞等）、肝臓に関与する細胞（肝細胞等）、膵臓に関与する細胞（膵ラ島細胞等）、腎臓に関与する細胞（腎臓細胞、腎上皮細胞、近位尿細管上皮細胞及びメサンギウム細胞等）、肺・気管支に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等）、目に関与する細胞（視細胞、角膜上皮細胞及び角膜内皮細胞等）、前立腺に関与する細胞（上皮細胞、間質細胞及び平滑筋細胞等）、骨に関与する細胞（骨芽細胞、骨細胞及び破骨細胞等）、軟骨に関与する細胞（軟骨芽細胞及び軟骨細胞等）、歯に関与する細胞（歯根膜細胞及び骨芽細胞等）、血液に関与する細胞（白血球及び赤血球等）、及び幹細胞｛例えば、骨髄未分化間葉系幹細胞、骨格筋幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞（ｏｖａｌｃｅｌｌ、ｓｍａｌｌｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ等）、脂肪組織幹細胞、ｉＰＳ細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、表皮幹細胞、腸管幹細胞、***幹細胞、胚生殖幹（ＥＧ）細胞、膵臓幹細胞（膵管上皮幹細胞等）、白血球系幹細胞、リンパ球系幹細胞、角膜系幹細胞等｝、前駆細胞（脂肪前駆細胞、血管内皮前駆細胞、軟骨前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、ＮＫ前駆細胞等）等｝等が挙げられる。 Normal cells derived from mammals include cells involved in the skin (epithelial cells, fibroblasts, vascular endothelial cells, smooth muscle cells, etc.), cells involved in blood vessels (vascular endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, etc.) ), Cells involved in muscle (muscle cells, etc.), cells involved in fat (fat cells, etc.), cells involved in nerves (nerve cells, etc.), cells involved in liver (hepatocytes, etc.), involved in pancreas Cells (pancreatic islet cells, etc.), kidney-related cells (kidney cells, renal epithelial cells, proximal tubular epithelial cells, mesangial cells, etc.), lung-bronchial cells (epithelial cells, fibroblasts, blood vessels) Endothelial cells and smooth muscle cells, etc.), cells involved in the eyes (visual cells, corneal epithelial cells, corneal endothelial cells, etc.), cells involved in the prostate (epithelial cells, stromal cells, smooth muscle cells, etc.), and bones Cells (osteoblasts, bone cells and fractures) Cells), cells involved in cartilage (such as chondroblasts and chondrocytes), cells involved in teeth (such as periodontal ligament cells and osteoblasts), cells involved in blood (such as leukocytes and erythrocytes), and stem cells { For example, bone marrow undifferentiated mesenchymal stem cells, skeletal muscle stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, hepatic stem cells (such as oval cells, small hepatocytes), adipose tissue stem cells, iPS cells, embryonic stem (ES) cells, epidermal stem cells, Intestinal stem cells, sperm stem cells, embryonic germ stem (EG) cells, pancreatic stem cells (pancreatic duct epithelial stem cells, etc.), leukocyte stem cells, lymphocyte stem cells, corneal stem cells, etc.}, precursor cells (adipose precursor cells, vascular endothelial precursor cells, Cartilage progenitor cells, lymphocyte progenitor cells, NK progenitor cells, etc.)} and the like.

哺乳動物由来の株化細胞としては、ＣＲＦＫ細胞、３Ｔ３細胞、Ａ５４９細胞、ＡＨ１３０細胞、Ｂ９５−８細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＯＳＣ２３細胞、ＢＳ−Ｃ−１細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、Ｃ−６細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＶ−１細胞、Ｆ９細胞、ＦＬ細胞、ＦＬ５−１細胞、ＦＭ３Ａ細胞、Ｇ−３６１細胞、ＧＰ＋Ｅ−８６細胞、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２細胞、Ｈ４−ＩＩ−Ｅ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥｐ−２細胞、ＨＬ−６０細胞、ＨＴＣ細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、ＩＭＲ−３２細胞、ＩＭＲ−９０細胞、Ｋ５６２細胞、ＫＢ細胞、Ｌ細胞、Ｌ５１７８Ｙ細胞、Ｌ−９２９細胞、ＭＡ１０４細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＩＡＰａＣＧ−２細胞、Ｎ１８細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、ＮＧ１０８−１５細胞、ＮＲＫ細胞、ＯＣ１０細胞、ＯＴＴ６０５０細胞、Ｐ３８８細胞、ＰＡ１２細胞、ＰＡ３１７細胞、ＰＣ−１２細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＰＧ１３細胞、ＱＧＨ細胞、Ｒａｊｉ細胞、ＲＰＭＩ−１７８８細胞、ＳＧＥ１細胞、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４細胞、ＳＴ２細胞、ＴＨＰ−１細胞、Ｕ−９３７細胞、Ｖ７９細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＷＩ−３８細胞、ψ２細胞、及びψＣＲＥ細胞等が挙げられる｛細胞培養の技術（日本組織培養学会編集、株式会社朝倉書店発行、１９９９年）｝。 Cell lines derived from mammals include CRFK cells, 3T3 cells, A549 cells, AH130 cells, B95-8 cells, BHK cells, BOSC23 cells, BS-C-1 cells, C3H10T1 / 2 cells, C-6 cells, CHO cells, COS cells, CV-1 cells, F9 cells, FL cells, FL5-1 cells, FM3A cells, G-361 cells, GP + E-86 cells, GP + envAm12 cells, H4-II-E cells, HEK293 cells, HeLa cells HEp-2 cells, HL-60 cells, HTC cells, HUVEC cells, IMR-32 cells, IMR-90 cells, K562 cells, KB cells, L cells, L5178Y cells, L-929 cells, MA104 cells, MDBK cells, MDCK cells, MIA PaCG-2 cells, N18 cells, Namalwa cells, NG108- 5 cells, NRK cells, OC10 cells, OTT6050 cells, P388 cells, PA12 cells, PA317 cells, PC-12 cells, PER. C6 cell, PG13 cell, QGH cell, Raji cell, RPMI-1788 cell, SGE1 cell, Sp2 / O-Ag14 cell, ST2 cell, THP-1 cell, U-937 cell, V79 cell, VERO cell, WI-38 cell , Ψ2 cells, ψCRE cells, etc. {Cell culture technology (edited by the Japanese Society for Tissue Culture, published by Asakura Shoten Co., Ltd., 1999)}.

昆虫細胞としては、カイコ細胞（ＢｍＮ細胞及びＢｏＭｏ細胞等）、クワコ細胞、サクサン細胞、シンジュサン細胞、ヨトウガ細胞（Ｓｆ９細胞及びＳｆ２１細胞等）、クワゴマダラヒトリ細胞、ハマキムシ細胞、ショウジョウバエ細胞、センチニクバエ細胞、ヒトスジシマカ細胞、アゲハチョウ細胞、ワモンゴキブリ細胞及びイラクサキンウワバ細胞（Ｔｎ−５細胞、ＨＩＧＨＦＩＶＥ細胞及びＭＧ１細胞等）等が挙げられる｛昆虫バイオ工場（木村滋編著、株式会社工業調査会発行、２０００年）。 Insect cells include silkworm cells (BmN cells, BoMo cells, etc.), mulberry cells, sakusan cells, synjusan cells, mung bean cells (Sf9 cells, Sf21 cells, etc.), stag beetle humans cells, caterpillar cells, Drosophila cells, sentinic fly, Cells, human striped swallowtail cells, swallowtail butterfly cells, American cockroach cells, and nettle cottonweed cells (Tn-5 cells, HIGH FIVE cells, MG1 cells, etc.) {Insect Bio Factory (edited by Shigeru Kimura, published by Industrial Research Institute, Inc., 2000) Year).

これらの細胞（Ｘ）のうち、医薬品等の有用物質生産や治療等の観点から、哺乳動物由来の正常細胞及び哺乳動物由来の株化細胞が好ましい。そして、治療に有用な点で、さらに好ましくは腎臓細胞、筋肉細胞、肝細胞、骨芽細胞、上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、幹細胞及び前駆細胞である。また、医薬品等の有用物質生産に有用な点で、さらに好ましくはＣＲＦＫ細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ−９２９細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＶＥＲＯ細胞及びＷＩ−３８細胞、特に好ましくはＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞及びＶＥＲＯ細胞である。 Of these cells (X), normal cells derived from mammals and established cell lines derived from mammals are preferred from the viewpoint of production of useful substances such as pharmaceuticals and treatment. In terms of usefulness for treatment, kidney cells, muscle cells, hepatocytes, osteoblasts, epithelial cells, fibroblasts, vascular endothelial cells, stem cells and progenitor cells are more preferable. Further, CRFK cells, 3T3 cells, BHK cells, CHO cells, HEK293 cells, HeLa cells, L-929 cells, MDCK cells, PER. C6 cells, VERO cells and WI-38 cells, particularly preferably CRFK cells, MDCK cells and VERO cells.

本発明の細胞の生産方法に用いられる培地（ＭＥ）としては、無血清培地（ＳＴＥＭＰＲＯｈＥＳＣＳＦＭ１７、ＴｅＳＲ２、Ｅ８培地、ｈＥＳＦ９培地、ｈＥＳＦ−ＦＸ培地、ｈＥＳＦ９２ａｉ、ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ、Ｓ−ｍｅｄｉｕｍ、ｍＴｅＳＲ^TM、Ｇｒａｃｅ培地、ＩＰＬ−４１培地、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ培地、Ｏｐｔｉ−ＰＲＯ^TMＳＦＭ培地、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ^TMＩ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^TM２９３培地、ＣＤ−ＣＨＯＡＴＧ^TM培地及びこれらの混合培地等）；一般の培地（ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ−１００培地、Ｓｆ−９００ＩＩ培地、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地）；及びこれらの混合培地等が挙げられる。 As a medium (ME) used in the method for producing cells of the present invention, a serum-free medium (STEMPRO hESC SFM17, TeSR 2, E8 medium, hESF9 medium, hESF-FX medium, hESF92ai, StemFit AK02N, S-medium, mTeSR ^™ Grace medium, IPL-41 medium, Schneider's medium, Opti-PRO ^™ SFM medium, Opti-MEM ^™ I medium, VP-SFM medium, CD293 medium, 293SFMII medium, CD-CHO medium, CHO-S-SFMII medium , FreeStyle ^™ 293 medium, CD-CHO ATG ^™ medium, and mixed media thereof; general medium (RPMI medium, MEM medium, Eagle's MEM medium, BME medium, DME medium, αMEM medium, IMEM medium, ES medium, DM-160 medium, Fisher medium, F12 medium, WE medium, ASF103 medium, ASF104 medium, ASF301 medium, TC-100 medium, Sf-900II medium, Ex-cell405 medium, Express-Five medium, Drosophila medium and mixed medium thereof ); And mixed media thereof.

また、これらの培地には、血清を添加することができる。
血清としては、ヒト血清、及び動物血清（ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清、ラット血清、及びマウス血清等）が含まれる。
血清を添加する場合、これらのうち、ヒト血清、ウシ血清、及びウマ血清が好ましい。また、動物血清の由来は、成体由来の血清、仔由来の血清、新生由来の血清、及び胎児由来の血清等が挙げられる。血清を添加する場合、これらのうち、仔由来の血清、新生由来の血清、及び胎児由来の血清が好ましく、さらに好ましくは新生由来の血清、及び胎児由来の血清、特に好ましくは胎児由来の血清である。血清を添加する場合、さらに血清は、非働化処理や、抗体の除去処理等を行ってもよい。 Moreover, serum can be added to these culture media.
Serum includes human serum and animal serum (bovine serum, horse serum, goat serum, sheep serum, pig serum, rabbit serum, chicken serum, rat serum, mouse serum, etc.).
Of these, human serum, bovine serum, and horse serum are preferred when serum is added. The origin of animal serum includes adult-derived serum, offspring-derived serum, newborn-derived serum, fetal-derived serum, and the like. When adding serum, among these, serum derived from offspring, serum derived from newborn, and serum derived from fetus are more preferable, serum derived from newborn, and serum derived from fetus, particularly preferably serum derived from fetus. is there. When serum is added, the serum may be further subjected to inactivation treatment, antibody removal treatment, or the like.

血清を使用する場合、血清の使用量（重量％）は、培地の重量に基づいて、０．１〜５０が好ましく、さらに好ましくは０．３〜３０、特に好ましくは１〜２０である。 When using serum, the amount of serum used (% by weight) is preferably 0.1 to 50, more preferably 0.3 to 30, and particularly preferably 1 to 20, based on the weight of the medium.

培地中には、必要に応じて、細胞増殖因子を含有させることができる。細胞増殖因子を含有させることにより、細胞の増殖速度を高めたり、細胞活性を高めたりすることができる。 In the culture medium, a cell growth factor can be contained as necessary. By containing a cell growth factor, the cell growth rate can be increased and the cell activity can be increased.

細胞増殖因子としては、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、上皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インシュリン様増殖因子、血管内皮増殖因子、神経成長因子、幹細胞因子、白血病阻害因子、骨形成因子、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子、神経栄養因子、結合組織成長因子、アンジオポエチン、サイトカイン、インターロイキン、アドレナモジュリン及びナトリウム利尿ペプチド等の生理活性ペプチドが含まれる。これらのうち、適用できる細胞の範囲が広く、治癒期間がより短縮できるという観点から、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、インシュリン様増殖因子及び骨形成因子が好ましく、さらに好ましくは線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子及びインシュリン様増殖因子である。 Cell growth factors include fibroblast growth factor, transforming growth factor, epithelial growth factor, hepatocyte growth factor, platelet-derived growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor, nerve growth factor, stem cell factor, leukemia Inhibitory factors, osteogenic factors, heparin-binding epithelial cell growth factor, neurotrophic factor, connective tissue growth factor, angiopoietin, cytokines, interleukins, adrenamodulin and natriuretic peptides are included. Of these, fibroblast growth factor, transforming growth factor, insulin-like growth factor, and osteogenic factor are preferable, and more preferably fibroblast, from the viewpoint that the range of applicable cells is wide and the healing period can be further shortened. Growth factors, transforming growth factors and insulin-like growth factors.

細胞増殖因子を使用する場合、細胞増殖因子の含有量（重量％）は細胞増殖因子の種類によって異なるが、培地の重量に基づいて、１０^-16〜１０^-3が好ましく、さらに好ましくは１０^-14〜１０^-5、特に好ましくは１０^-12〜１０^-7である。 When a cell growth factor is used, the content (% by weight) of the cell growth factor varies depending on the type of cell growth factor, but is preferably 10 ⁻¹⁶ to 10 ⁻³ , more preferably 10 ⁻ based on the weight of the medium. ¹⁴ to 10 ⁻⁵ , particularly preferably 10 ⁻¹² to 10 ⁻⁷ .

これらの培地には、さらに抗菌剤（アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、ペニシリン及びストレプトマイシン等）を含有させることができる。抗菌剤を含有させる場合、この含有量（重量％）は抗菌剤の種類によって異なるが、培地の重量に基づいて、１０^-6〜１０が好ましく、さらに好ましくは１０^-5〜１、特に好ましくは１０^-4〜０．１である。 These media can further contain an antibacterial agent (amphotericin B, gentamicin, penicillin, streptomycin, etc.). When the antibacterial agent is contained, the content (% by weight) varies depending on the type of the antibacterial agent, but is preferably 10 ⁻⁶ to 10, more preferably 10 ⁻⁵ to 1, particularly preferably based on the weight of the medium. 10 ^{−4 to} 0.1.

培地に分散させる細胞の濃度（個／ｍＬ）としては特に制限はないが、培地１ｍＬ当たり、１００〜１億が好ましく、さらに好ましくは１０００〜１千万、特に好ましくは１万〜１００万である。 Although there is no restriction | limiting in particular as a density | concentration (cell / mL) of the cell disperse | distributed to a culture medium, 100-100 million is preferable per 1 mL of culture medium, More preferably, it is 1000-10 million, Most preferably, it is 10,000-1 million. .

細胞の個数の計数方法は公知の方法が使用でき、例えば、トリパンブルー又はクリスタルバイオレットを用いた細胞核計数法で測定することができる｛細胞培養の技術（日本組織培養学会編集、株式会社朝倉書店発行、１９９９年）｝。
また、培地に投入する細胞培養用基材の乾燥重量（ｇ）は、培養する細胞の種類等によって適宜決定できるが、培地１Ｌ当たり、０．００５〜８００が好ましく、さらに好ましくは０．０２〜２００、特に好ましくは０．１〜４０である。 A known method can be used for counting the number of cells. For example, it can be measured by a cell nucleus counting method using trypan blue or crystal violet. {Cell culture technology (edited by the Japanese Society for Tissue Culture, published by Asakura Shoten Co., Ltd.) 1999)}.
The dry weight (g) of the cell culture substrate to be introduced into the medium can be appropriately determined depending on the type of cells to be cultured, etc., but is preferably 0.005 to 800, more preferably 0.02 to 1 L of the medium. 200, particularly preferably 0.1 to 40.

培養条件としては、特に制限は無く、二酸化炭素（ＣＯ₂）濃度１〜２０体積％、５〜４５℃で１時間〜１００日間、必要に応じて１〜１０日毎に培地交換しなら培養する条件等が適用できる。好ましい条件としては、ＣＯ₂濃度３〜１０体積％、３０〜４０℃、１〜２０日間、１〜３日毎に培地交換しながら培養する条件である。 There are no particular limitations on the culture conditions, and carbon dioxide (CO ₂ ) concentration of 1 to 20% by volume, 5 to 45 ° C. for 1 hour to 100 days, and if necessary, culture conditions are changed every 1 to 10 days. Etc. are applicable. Preferable conditions are conditions of culturing while changing the medium every 1 to 3 days at a CO ₂ concentration of 3 to 10% by volume, 30 to 40 ° C., for 1 to 20 days.

本発明の細胞の生産方法は、上記細胞培養用基材を用いて細胞（Ｘ）を培養するものであれば特に制限はないが、産業利用性の観点から、細胞培養用基材上で細胞（Ｘ）を培養後、分解剤（Ｅ）により細胞培養用基材を分解する工程を含んでいることが好ましい。
分解剤（Ｅ）としては、多糖類分解酵素（Ｅ１）、有機酸（Ｅ２）及び無機酸（Ｅ３）等が挙げられる。
これらのうち、多糖類分解酵素（Ｅ１）が好ましい。
多糖類分解酵素（Ｅ１）としては、多糖を分解する酵素として知られているものを制限なく使用でき、具体的には、セルラーゼ、アミラーゼ、デキストラナーゼ、カラギナーゼ、アルギン酸リアーゼ、ヒアルロニダーゼ、キチナーゼ及びキトサナーゼ等が挙げられる。
細胞培養用基材を分解剤（Ｅ）で分解することにより、増殖した細胞の形状を壊さずに細胞を回収することができるので、例えば、シート状、球状及び組織状の細胞を得ることができる。 The method for producing cells of the present invention is not particularly limited as long as the cells (X) are cultured using the cell culture substrate, but from the viewpoint of industrial applicability, the cells are produced on the cell culture substrate. It is preferable to include a step of decomposing the cell culture substrate with the decomposing agent (E) after culturing (X).
Examples of the decomposing agent (E) include polysaccharide degrading enzymes (E1), organic acids (E2), and inorganic acids (E3).
Of these, polysaccharide degrading enzyme (E1) is preferred.
As the polysaccharide degrading enzyme (E1), those known as enzymes degrading polysaccharides can be used without limitation. Specifically, cellulase, amylase, dextranase, carrageenase, alginate lyase, hyaluronidase, chitinase and chitosanase Etc.
By decomposing the cell culture substrate with the decomposing agent (E), the cells can be recovered without destroying the shape of the proliferated cells. For example, sheet-like, spherical and tissue-like cells can be obtained. it can.

好ましい多糖類分解酵素（Ｅ１）としては、細胞培養用基材の分解性の観点から、細胞培養用基材を構成する架橋物（Ｃ）に用いられている多糖（Ａ）により適宜選択されるが、具体的には下記の組み合わせが好ましい。
多糖（Ａ）｛セルロース、カルボキシメチルセルロース及びその他のセルロース誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種｝と分解剤（Ｅ）｛セルラーゼ｝との組み合わせ。
多糖（Ａ）｛デキストリン及びデキストリン誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種｝と分解剤（Ｅ）｛デキストラナーゼ｝との組み合わせ。
多糖（Ａ）｛カラギーナン及びカラギーナン誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種｝と分解剤（Ｅ）｛カラギナーゼ｝との組み合わせ。
多糖（Ａ）｛アルギン酸及びアルギン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種｝と分解剤（Ｅ）｛アルギン酸リアーゼ｝との組み合わせ。
多糖（Ａ）｛ヒアルロン酸及びヒアルロン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種｝と分解剤（Ｅ）｛ヒアルロニダーゼ｝との組み合わせ。
多糖（Ａ）｛キチン及びキチン誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種｝と分解剤（Ｅ）｛キチナーゼ｝との組み合わせ。
多糖（Ａ）｛キトサン及びキトサン誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種｝と分解剤（Ｅ）｛キトサナーゼ｝との組み合わせ。 A preferred polysaccharide-degrading enzyme (E1) is appropriately selected depending on the polysaccharide (A) used in the cross-linked product (C) constituting the cell culture substrate from the viewpoint of degradability of the cell culture substrate. However, specifically, the following combinations are preferable.
A combination of a polysaccharide (A) {at least one selected from the group consisting of cellulose, carboxymethylcellulose and other cellulose derivatives} and a degradation agent (E) {cellulase}.
Combination of polysaccharide (A) {at least one selected from the group consisting of dextrin and dextrin derivatives} and degradation agent (E) {dextranase}.
A combination of a polysaccharide (A) {at least one selected from the group consisting of carrageenan and carrageenan derivatives} and a degradation agent (E) {carrageenase}.
A combination of a polysaccharide (A) {at least one selected from the group consisting of alginic acid and alginic acid derivatives} and a degradation agent (E) {alginate lyase}.
Combination of polysaccharide (A) {at least one selected from the group consisting of hyaluronic acid and hyaluronic acid derivatives} and a decomposing agent (E) {hyaluronidase}.
A combination of a polysaccharide (A) {at least one selected from the group consisting of chitin and chitin derivatives} and a degradation agent (E) {chitinase}.
A combination of a polysaccharide (A) {at least one selected from the group consisting of chitosan and chitosan derivatives} and a degradation agent (E) {chitosanase}.

分解剤（Ｅ）は分解剤（Ｅ）溶液として用いることができる。
分解剤（Ｅ）溶液中の分解剤（Ｅ）の濃度は、使用する分解剤（Ｅ）の種類及び細胞培養用基材を構成する架橋物（Ｃ）に用いられている多糖（Ａ）の種類により適宜選択されるが、細胞毒性及び細胞培養用基材の分解性の観点から、分解剤（Ｅ）溶液の重量を基準として、０．１〜５重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１重量％である。 The decomposer (E) can be used as a decomposer (E) solution.
The concentration of the decomposing agent (E) in the decomposing agent (E) solution depends on the type of the decomposing agent (E) used and the polysaccharide (A) used in the cross-linked product (C) constituting the substrate for cell culture. Although it is appropriately selected depending on the kind, from the viewpoint of cytotoxicity and degradability of the substrate for cell culture, 0.1 to 5% by weight is preferable based on the weight of the decomposition agent (E) solution, and more preferably 0.8. 1-1% by weight.

細胞の生産方法として、好ましい具体例を以下に示す。
（１）一般的な細胞培養による細胞の生産方法
接着性細胞（Ｘ−１）を、上記細胞培養用基材を用いて所定期間培養する。培養後、分解剤（Ｅ）を用いて細胞培養基材から細胞を回収する。
（２）細胞シートの培養
接着性細胞（Ｘ−１）を、上記細胞培養用基材を用いて所定期間培養する。細胞がコンフルエントになった後、分解剤（Ｅ）を用いて細胞培養基材から細胞シートを回収する。
（３）細胞構成物の培養
接着性細胞（Ｘ−１）を、望ましい構造に成形した上記細胞培養用基材を用いて所定期間培養する。培養後、分解剤（Ｅ）により細胞培養基材を除去し、細胞構成物を得る。 Preferred specific examples of the cell production method are shown below.
(1) Cell production method by general cell culture Adhesive cells (X-1) are cultured for a predetermined period using the cell culture substrate. After culturing, the cells are recovered from the cell culture substrate using the degradation agent (E).
(2) Culture of cell sheet Adhesive cells (X-1) are cultured for a predetermined period using the cell culture substrate. After the cells become confluent, the cell sheet is recovered from the cell culture substrate using the degradation agent (E).
(3) Culture of cell components Adhesive cells (X-1) are cultured for a predetermined period using the cell culture substrate formed into a desired structure. After culturing, the cell culture substrate is removed with a degrading agent (E) to obtain a cell composition.

本発明の細胞培養用キットは、上記細胞培養用基材及び上記分解剤（Ｅ）を含むものである。
細胞培養用基材及び分解剤（Ｅ）として好ましいものは、上記と同様である。
また、分解剤（Ｅ）は上記分解剤（Ｅ）溶液としてキットに含まれていてもよい。 The cell culture kit of the present invention comprises the cell culture substrate and the degradation agent (E).
Preferable examples of the cell culture substrate and the degradation agent (E) are the same as described above.
Moreover, the decomposition agent (E) may be contained in the kit as the decomposition agent (E) solution.

以下に実施例として掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、特記しない限り部は重量部を、％は重量％を意味する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples, but the present invention is not limited to these examples. In the following, unless otherwise specified, “part” means “part by weight” and “%” means “% by weight”.

＜実施例１＞
撹拌装置を備えた容器に水８００部を入れ、ＣＭＣ（第一工業製薬（株）、「セロゲンＦ−ＳＣ」）を１００部、撹拌（５０ｒｐｍ）しながらダマにならないように徐々に添加し、ＣＭＣ溶解液を得た。その後、架橋剤（Ｂ）としてエポキシ基を有する化合物であるエチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス（株）、「デナコールＥＸ−８１０」）１００部を撹拌しながら添加した。
得られた溶液を直径７０ｍｍの円形ガラス板上スピンコーター（（株）井元製作所製、「スピンコーター７０９４」）を用いて塗布し、１００℃の乾燥機で架橋反応を進行させながら３時間乾燥させ、含水率２０重量％のシート状（直径７０ｍｍ、厚み０．１ｍｍ）の細胞培養用基材（１）を得た。得られた基材（１）の貯蔵弾性率Ｇ‘は１０⁸Ｐａであった。 <Example 1>
Add 800 parts of water to a container equipped with a stirrer, and gradually add 100 parts of CMC (Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd., “Serogen F-SC”) while stirring (50 rpm) so as not to become lumps. A CMC solution was obtained. Thereafter, 100 parts of ethylene glycol diglycidyl ether (Nagase ChemteX Co., Ltd., “Denacol EX-810”), which is a compound having an epoxy group, was added as a crosslinking agent (B) with stirring.
The obtained solution was applied using a spin coater (“Spin Coater 7094” manufactured by Imoto Seisakusho Co., Ltd.) on a circular glass plate having a diameter of 70 mm and dried for 3 hours while proceeding with a crosslinking reaction with a dryer at 100 ° C. A cell culture substrate (1) in a sheet form (diameter 70 mm, thickness 0.1 mm) having a water content of 20% by weight was obtained. The obtained substrate (1) had a storage elastic modulus G ′ of 10 ⁸ Pa.

＜実施例２＞
架橋剤（Ｂ）の添加量を「１００部」に代えて「６７部」とする以外は、実施例１と同様にして、含水率２０重量％のシート状（直径７０ｍｍ、厚み０．１ｍｍ）の細胞培養用基材（２）を得た。得られた基材（２）の貯蔵弾性率Ｇ‘は１０⁶Ｐａであった。 <Example 2>
Except for changing the addition amount of the crosslinking agent (B) to “67 parts” instead of “100 parts”, a sheet shape having a water content of 20% by weight (diameter: 70 mm, thickness: 0.1 mm), except that the amount is “67 parts”. The cell culture substrate (2) was obtained. The storage modulus G ′ of the obtained substrate (2) was 10 ⁶ Pa.

＜実施例３＞
架橋剤（Ｂ）の添加量を「１００部」に代えて「５０部」とする以外は、実施例１と同様にして、含水率２０重量％のシート状（直径７０ｍｍ、厚み０．１ｍｍ）の細胞培養用基材（３）を得た。得られた基材（３）の貯蔵弾性率Ｇ‘は１０⁴Ｐａであった。 <Example 3>
Except for changing the addition amount of the crosslinking agent (B) to “50 parts” instead of “100 parts”, a sheet shape (diameter 70 mm, thickness 0.1 mm) having a water content of 20% by weight is the same as in Example 1. A cell culture substrate (3) was obtained. The storage modulus G ′ of the obtained substrate (3) was 10 ⁴ Pa.

＜実施例４＞
実施例２で得られた細胞培養用基材（２）を、細胞接着性ペプチド（Ｄ）であるプロネクチンＦ（配列番号（８２）の配列を有するＭｗ約１１万のポリペプチド、三洋化成工業（株）製）を０．００１重量％含有するＰｒｏｎｅｃｔｉｎＦ溶液（３７℃）中に２時間浸漬し、物理的吸着によりＰｒｏｎｅｃｔｉｎＦを表面に修飾した細胞培養用基材（４）を得た。 <Example 4>
The cell culture substrate (2) obtained in Example 2 was used as a cell adhesion peptide (D), Pronectin F (polypeptide having a sequence of Mw of about 110,000 having the sequence of SEQ ID NO: (82), Sanyo Chemical Industries ( The cell culture substrate (4) whose surface was modified by physical adsorption was obtained by immersing in a ProctinF solution (37 ° C.) containing 0.001% by weight).

＜実施例５＞
実施例２で得られた細胞培養用基材（２）を、フィブロネクチン（和光純薬工業（株）製、「ＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎＳｏｌｕｔｉｏｎ，ｆｒｏｍＨｕｍａｎＰｌａｓｍａ」）を０．００１重量％含有するフィブロネクチン溶液（３７℃）中に２時間浸漬し、物理的吸着によりフィブロネクチンを表面に修飾した細胞培養用基材（５）を得た。 <Example 5>
The cell culture substrate (2) obtained in Example 2 was used as a fibronectin solution (37 ° C.) containing 0.001% by weight of fibronectin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., “Fibroctin Solution, from Human Plasma”). ) To obtain a cell culture substrate (5) having a surface modified with fibronectin by physical adsorption.

＜実施例６＞
実施例２で得られた細胞培養用基材（２）を、コラーゲン（新田ゼラチン（株）製、「ＣｅｌｌｍａｔｒｉｘＴｙｐｅＩ−Ａ」）を０．３重量％含有するコラーゲン溶液（３７℃、ｐＨ３）中に２時間浸漬し、物理的吸着によりコラーゲンを表面に修飾した細胞培養用基材（６）を得た。 <Example 6>
The cell culture substrate (2) obtained in Example 2 is a collagen solution (37 ° C, containing 0.3% by weight of collagen (manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd., “Cell matrix Type I-A”)). It was immersed in pH 3) for 2 hours to obtain a cell culture substrate (6) in which collagen was modified on the surface by physical adsorption.

＜比較例１＞
架橋剤（Ｂ）を加えない以外は、実施例１と同様にして含水率２０重量％のシート状（直径７０ｍｍ、厚み０．１ｍｍ）の比較用の細胞培養用基材（１’）を得た。得られた基材（１’）の貯蔵弾性率Ｇ‘は８００Ｐａであった。 <Comparative Example 1>
A cell culture substrate (1 ′) for comparison in the form of a sheet (diameter 70 mm, thickness 0.1 mm) having a water content of 20% by weight was obtained in the same manner as in Example 1 except that the cross-linking agent (B) was not added. It was. The obtained base material (1 ′) had a storage elastic modulus G ′ of 800 Pa.

＜比較例２＞
架橋剤（Ｂ）の添加量を「１００部」に代えて「２００部」とする以外は、実施例１と同様にして含水率２０重量％の比較用の細胞培養用基材（２’）を得た。得られた基材（２’）の貯蔵弾性率Ｇ‘は１×１０¹¹Ｐａであった。なお、スピンコーターで成形する前にダマ状になってしまい、シート状に成形することができなかった。 <Comparative Example 2>
Comparative cell culture substrate (2 ′) for comparison having a water content of 20% by weight in the same manner as in Example 1 except that the amount of the crosslinking agent (B) added was changed to “200 parts” instead of “100 parts”. Got. The storage modulus G ′ of the obtained substrate (2 ′) was 1 × 10 ¹¹ Pa. In addition, before forming with a spin coater, it became lumpy and could not be formed into a sheet.

＜比較例３＞
細胞培養用９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）を比較用の細胞培養用基材（３’）として用いた。 <Comparative Example 3>
A 96-well plate for cell culture (manufactured by Nunc) was used as a cell culture substrate (3 ′) for comparison.

＜比較例４＞
撹拌装置を備えた容器に、水８００部を入れ、アルギン酸（和光純薬工業（株）製、「アルギン酸ナトリウム３００〜４００」）を２．４部、撹拌（８００ｒｐｍ）しながらダマにならないように徐々に添加し、アルギン酸溶解液を得た。得られた溶液を直径７０ｍｍの円形ガラス板上スピンコーター（株式会社井元製作所製、「スピンコーター７０９４」）を用いて塗布し、１Ｍ塩化カルシウム溶液へ３時間浸漬させアルギン酸を架橋した。１Ｍ塩化カルシウム溶液から取り出し、１００℃の乾燥機で１時間乾燥し、含水率２０重量％のシート状（直径７０ｍｍ、厚み０．１ｍｍ）の細胞培養用基材（４’）を得た。得られた基材（４’）の貯蔵弾性率Ｇ‘は９００Ｐａであった。 <Comparative example 4>
Put 800 parts of water in a container equipped with a stirrer, and 2.4 parts of alginic acid (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., “Sodium Alginate 300-400”), so as not to become lumpy while stirring (800 rpm). The solution was gradually added to obtain an alginic acid solution. The obtained solution was applied using a spin coater (“Spin Coater 7094” manufactured by Imoto Seisakusho Co., Ltd.) on a circular glass plate having a diameter of 70 mm, and immersed in 1M calcium chloride solution for 3 hours to crosslink alginic acid. The sheet was taken out from the 1M calcium chloride solution and dried with a dryer at 100 ° C. for 1 hour to obtain a cell culture substrate (4 ′) having a water content of 20% by weight (diameter 70 mm, thickness 0.1 mm). The obtained base material (4 ′) had a storage elastic modulus G ′ of 900 Pa.

＜比較例５＞
特開２００１−３２１１５７の記載に準じてセルロースフィルム（Ｗｈａｔｍａｎ社製、「純セルロースペーパー」）にフィブロネクチン（和光純薬工業（株）製、「ＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎＳｏｌｕｔｉｏｎ，ｆｒｏｍＨｕｍａｎＰｌａｓｍａ」）を修飾し、比較用の細胞培養用基材（５’）を得た。 <Comparative Example 5>
According to the description in JP-A No. 2001-321157, fibronectin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., “Fibroticin Solution, from Human Plasma”) is modified on a cellulose film (manufactured by Whatman, “pure cellulose paper”) for comparison. A cell culture substrate (5 ′) was obtained.

＜細胞培養用基材の物性評価＞
貯蔵弾性率Ｇ’：ＪＩＳＫ７２４４−１０「プラスチック―動的機械特性の試験方法―第１０部：平行平板振動レオメータによる複素せん断粘度」に準じて、粘弾性測定装置［機器名「ＡＲＥＳ−２４Ａ」、レオメトリック（株）製］を用いて、３７℃での貯蔵弾性率を測定した。
水（３７℃）に対する接触角：ＪＩＳＲ３２５７に準拠して測定した。
表面粗さ（Ｒａ）：市販のカンチレバー及び原子間力顕微鏡［機器名「Ｅ−ｓｗｅｅｐ」、エスアイアイ・ナノテクノロジー（株）製］を用いて表面粗さを測定した。測定範囲を４μｍとして、一定速度（０．３Ｈｚから１．２Ｈｚ）で走査させ、高さ像（立体像）を計測した。ＪＩＳＢ０６０１に定義された方法に準じて、計測結果より表面粗さ（Ｒａ）を算出した。 <Evaluation of physical properties of cell culture substrate>
Storage elastic modulus G ′: JIS K7244-10 “Plastics—Testing method of dynamic mechanical properties—Part 10: Complex shear viscosity by parallel plate vibration rheometer” Viscoelasticity measuring device [equipment name “ARES-24A” , Manufactured by Rheometric Co., Ltd.], and the storage elastic modulus at 37 ° C. was measured.
Contact angle to water (37 ° C.): Measured according to JIS R3257.
Surface roughness (Ra): The surface roughness was measured using a commercially available cantilever and an atomic force microscope [device name “E-sweep”, manufactured by SII Nanotechnology, Inc.]. The height range (stereoscopic image) was measured by scanning at a constant speed (0.3 Hz to 1.2 Hz) with a measurement range of 4 μm. The surface roughness (Ra) was calculated from the measurement results according to the method defined in JIS B0601.

＜細胞毒性の評価：細胞生存率＞
細胞培養用基材（１）〜（６）及び（１’）〜（５’）に３×１０⁵個／ｃｍ²でＶＥＲＯ細胞を播種し、ＤＭＥＭ培地（１０重量％ＦＢＳを含有）中で３７℃、５体積％ＣＯ₂、湿潤条件（湿度１００％ＲＨ）で培養した。２４時間後、ＤＭＥＭ培地を除去し、分解剤（Ｅ）としてセルラーゼ（エンドラーゼ５０００Ｌ、ノボザイムズ社製）１００倍希釈液を０．１ｍｌ添加し２時間、３７℃、５体積％ＣＯ₂、湿潤条件（湿度１００％ＲＨ）で培養した。２時間後、培養液に生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク（株）製）を１０μｌ／１００μｌとＤＭＥＭ培地（１０重量％ＦＢＳを含有）を１００μｌ添加し、１時間後４５０ｎｍ（参照波長６００ｎｍ）を測定した。細胞生存率は分解剤（Ｅ）未添加のもの（ブランク）を細胞生存率１００％として算出した。
また、比較例３の細胞培養基材（３）においては、「セルラーゼを０．１ｍｌ」に代えて「トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡＳｏｌｕｔｉｏｎ、Ｔｈｅｒｍｏ製）を０．１ｍｌ」用いる以外は同様にして細胞生存率を評価した。
細胞生存率（％）＝［サンプルの吸光度−ブランクの吸光度］／［未添加の吸光度−ブランクの吸光度］×１００ <Evaluation of cytotoxicity: cell viability>
Cell culture substrates (1) to (6) and (1 ′) to (5 ′) were seeded with VERO cells at 3 × 10 ⁵ cells / cm ² and in DMEM medium (containing 10 wt% FBS). The cells were cultured at 37 ° C., 5% by volume CO ₂ , and wet conditions (humidity 100% RH). After 24 hours, the DMEM medium was removed, 0.1 ml of a 100-fold dilution of cellulase (Endolase 5000L, Novozymes) was added as a degrading agent (E), and 2 hours at 37 ° C., 5 vol% CO ₂ , wet conditions ( (Humidity 100% RH). After 2 hours, 10 μl / 100 μl of live cell count reagent SF (manufactured by Nacalai Tesque) and 100 μl of DMEM medium (containing 10 wt% FBS) were added to the culture solution, and 450 nm (reference wavelength 600 nm) after 1 hour. Was measured. The cell viability was calculated assuming that the cell viability was 100% when no degradation agent (E) was added (blank).
Further, in the cell culture substrate (3) of Comparative Example 3, the procedure was the same except that “trypsin / EDTA (trypsin / EDTA Solution, manufactured by Thermo) 0.1 ml” was used instead of “cellulase 0.1 ml”. Cell viability was assessed.
Cell viability (%) = [absorbance of sample−absorbance of blank] / [absorbance without addition−absorbance of blank] × 100

＜細胞培養の評価：接着率＞
細胞培養用基材（１）〜（６）及び（１’）〜（５’）に３×１０⁵個／ｃｍ²でＶＥＲＯ細胞を播種し、ＤＭＥＭ培地（１０重量％ＦＢＳを含有）中で３７℃、５体積％ＣＯ₂、湿潤条件（湿度１００％ＲＨ）で培養した。
２時間培養後、非接着の細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄して除去した。ＰＢＳを除去後、生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク（株）製）を１０μｌ／１００μｌとＤＭＥＭ培地（１０重量％ＦＢＳを含有）を１００μｌを添加し、１時間後４５０ｎｍ（参照波長６００ｎｍ）を測定した。非接着細胞の除去処理を行わなかったものを１００％として細胞接着率を算出した。 <Evaluation of cell culture: adhesion rate>
Cell culture substrates (1) to (6) and (1 ′) to (5 ′) were seeded with VERO cells at 3 × 10 ⁵ cells / cm ² and in DMEM medium (containing 10 wt% FBS). The cells were cultured at 37 ° C., 5% by volume CO ₂ , and wet conditions (humidity 100% RH).
After culturing for 2 hours, non-adherent cells were removed by washing with phosphate buffer (PBS). After removing PBS, 10 μl / 100 μl of live cell count reagent SF (manufactured by Nacalai Tesque) and 100 μl of DMEM medium (containing 10 wt% FBS) were added, and 450 nm (reference wavelength 600 nm) was added after 1 hour. It was measured. The cell adhesion rate was calculated assuming that the non-adherent cell removal treatment was not performed as 100%.

＜細胞培養の評価：剥離時間＞
細胞培養用基材（１）〜（６）及び（１’）〜（５’）に３×１０⁵個／ｃｍ²でＶＥＲＯ細胞を播種し、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）中で３７℃、５体積％ＣＯ₂、湿潤条件（湿度１００％ＲＨ）で培養した。
２４時間後、細胞培養液に分解剤（Ｅ）としてセルラーゼ（エンドラーゼ５０００Ｌ、ノボザイムズ社製）１００倍希釈液を添加し、経時的な細胞の剥離具合を確認し、細胞が完全に剥離した時間（分）を計測した。 <Evaluation of cell culture: peeling time>
Cell culture substrates (1) to (6) and (1 ′) to (5 ′) are seeded with VERO cells at 3 × 10 ⁵ cells / cm ² , in DMEM (10% FBS) at 37 ° C., 5 ° The culture was performed under the conditions of volume% CO ₂ and humid conditions (humidity 100% RH).
After 24 hours, a 100-fold dilution of cellulase (Endolase 5000L, Novozymes) was added to the cell culture medium as a decomposing agent (E), the degree of cell detachment over time was confirmed, and the time when the cells were completely detached ( Minute).

表１から、貯蔵弾性率Ｇ’が１０００〜１×１０¹⁰Ｐａの範囲内である実施例１〜６の細胞培養用基材は、細胞培養に適した形状に成形しやすいことがわかる。一方、貯蔵弾性率Ｇ’が１０¹¹である比較例２の細胞培養用基材は、細胞培養に適した形状に成形できなかった。
また、実施例１〜６の細胞培養用基材は、細胞生存率及び細胞接着率が極めて高く、分解剤により分解されやすく、細胞の剥離時間が短いことから、細胞培養に極めて適していることがわかる。特に、実施例４〜６の細胞培養用基材の結果から、細胞接着因子を含有することで、細胞接着率を向上させることができることがわかる。一方、比較例１（架橋していないもの）及び４（金属架橋であるもの）の細胞培養用基材では、細胞生存率及び分解性は高いものの、細胞接着性が低く、細胞培養に適していないことがわかる。また、比較例３の細胞剥離にタンパク質分解酵素を使用する必要がある細胞培養用基材では、細胞毒性が高く、細胞生存率が低いことがわかる。また、比較例５（セルロース）の細胞培養用基材は、貯蔵弾性率が５×１０¹⁰と高すぎるため、分解剤により分解されにくく、細胞を剥離するのに長時間かかることがわかる。 From Table 1, it can be seen that the cell culture substrates of Examples 1 to 6 having a storage elastic modulus G ′ in the range of 1000 to 1 × 10 ¹⁰ Pa are easily formed into a shape suitable for cell culture. On the other hand, the cell culture substrate of Comparative Example 2 having a storage elastic modulus G ′ of 10 ¹¹ could not be formed into a shape suitable for cell culture.
In addition, the cell culture substrates of Examples 1 to 6 have extremely high cell viability and cell adhesion rate, are easily decomposed by a degrading agent, and have a short cell detachment time, so that they are extremely suitable for cell culture. I understand. In particular, it can be seen from the results of the cell culture substrates of Examples 4 to 6 that the cell adhesion rate can be improved by containing a cell adhesion factor. On the other hand, the cell culture substrates of Comparative Examples 1 (not cross-linked) and 4 (metal cross-linked) have high cell viability and degradability, but have low cell adhesion and are suitable for cell culture. I understand that there is no. It can also be seen that the cell culture substrate that requires the use of a proteolytic enzyme for cell detachment in Comparative Example 3 has high cytotoxicity and low cell viability. Further, it can be seen that the cell culture substrate of Comparative Example 5 (cellulose) has a storage elastic modulus of 5 × 10 ^{10 which} is too high, so that it is difficult to be decomposed by the decomposing agent and it takes a long time to peel off the cells.

本発明の細胞培養用基材は、優れた細胞生存率及び細胞接着性を発揮し、短時間で細胞を剥離することがでるので、細胞が関係する、研究開発、有用物質生産及び治療等に極めて有用である。
研究開発用としては、分化機能等の細胞機能評価用細胞の培養、動物実験（毒性試験、刺激性試験及び代謝機能試験等）の代替用細胞の培養、遺伝子や蛋白質導入用細胞の培養等に利用できる。
有用物質生産用としては、サイトカイン、血栓溶解剤、血液凝固因子製剤、ワクチン、ホルモン、抗生物質、抗体及び増殖因子等の生産用細胞の培養に利用できる。これらのうち、ワクチンの生産用細胞の培養に好適である。
治療用としては、皮膚、頭蓋骨、筋肉、皮膚組織、骨、軟骨、血管、神経、腱、靭帯、毛胞組織、粘膜組織、歯周組織、象牙質、骨髄、網膜、漿膜、胃腸管及び脂肪等の組織、並びに肺、肝、膵及び腎等の臓器の細胞培養に利用できる。 The cell culture substrate of the present invention exhibits excellent cell viability and cell adhesion, and can detach cells in a short time. Therefore, for cell-related research and development, production of useful substances, treatment, etc. Very useful.
For research and development, cell culture for cell function evaluation such as differentiation function, culture of substitute cells for animal experiments (toxicity test, stimulation test, metabolic function test, etc.), cell culture for gene and protein introduction, etc. Available.
For the production of useful substances, it can be used for culturing cells for production of cytokines, thrombolytic agents, blood coagulation factor preparations, vaccines, hormones, antibiotics, antibodies, growth factors and the like. Among these, it is suitable for culturing cells for vaccine production.
For treatment, skin, skull, muscle, skin tissue, bone, cartilage, blood vessel, nerve, tendon, ligament, follicular tissue, mucosal tissue, periodontal tissue, dentin, bone marrow, retina, serosa, gastrointestinal tract and fat It can be used for cell culture of tissues such as lung, liver, pancreas and kidney.

Claims

多糖類（Ａ）の架橋剤（Ｂ）による架橋物（Ｃ）を含有する細胞培養用基材であって、架橋剤（Ｂ）が活性水素基と反応し得る官能基（ｂ）を少なくとも２個有する有機化合物であり、細胞培養用基材の３７℃における貯蔵弾性率Ｇ’が１０００〜１×１０¹⁰Ｐａである細胞培養用基材。 A cell culture substrate containing a cross-linked product (C) of a polysaccharide (A) cross-linking agent (B), wherein the cross-linking agent (B) has at least 2 functional groups (b) capable of reacting with active hydrogen groups. A cell culture substrate, which is an organic compound and has a storage elastic modulus G ′ at 37 ° C. of 1000 to 1 × 10 ¹⁰ Pa of the cell culture substrate.

多糖類（Ａ）がセルロース、アミロース、アミロペクチン、グリコサミノグリカン、アルギン酸、カラギーナン、ヒアルロン酸、グリコーゲン、デキストリン、グルカン、フルクタン、キチン、タマリンドシードガム、グァーガム、ローカストビーンガム、アラビアガム、カラヤガム、ペクチン、キサンタンガム、ジュランガム、アグロバクテリウムスクシノグリカン、ダイユータンガム、マンナン、グルコマンナン、キトサン、タラガム、サイリウムシードガム及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の細胞培養用基材。 Polysaccharide (A) is cellulose, amylose, amylopectin, glycosaminoglycan, alginic acid, carrageenan, hyaluronic acid, glycogen, dextrin, glucan, fructan, chitin, tamarind seed gum, guar gum, locust bean gum, gum arabic, caraya gum, pectin 2. The cell according to claim 1, which is at least one selected from the group consisting of xanthan gum, duran gum, Agrobacterium succinoglycan, diyutan gum, mannan, glucomannan, chitosan, tara gum, psyllium seed gum and derivatives thereof. Culture substrate.

官能基（ｂ）がカルボキシル基、エポキシ基及びイソシアネート基からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１又は２に記載の細胞培養用基材。 The cell culture substrate according to claim 1 or 2, wherein the functional group (b) is at least one selected from the group consisting of a carboxyl group, an epoxy group and an isocyanate group.

細胞培養用基材の細胞培養表面における水（３７℃）に対する接触角が２０〜６０°である請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養用基材。 The cell culture substrate according to any one of claims 1 to 3, wherein a contact angle with respect to water (37 ° C) on the cell culture surface of the cell culture substrate is 20 to 60 °.

細胞培養用基材の細胞培養表面における表面粗さ（Ｒａ）が１μｍ以下である請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞培養用基材。 The cell culture substrate according to any one of claims 1 to 4, wherein the cell culture substrate has a surface roughness (Ra) of 1 µm or less on the cell culture surface.

フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン及び下記最小アミノ酸配列（Ｘ）を有する細胞接着性ペプチド（Ｄ）からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞接着因子を含有する請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞培養用基材。
最小アミノ酸配列（Ｘ）：ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列（１）、ＹＩＧＳＲ配列（２）、ＰＤＳＧＲ配列（３）、ＲＹＶＶＬＰＲ配列（４）、ＬＧＴＩＰＧ配列（５）、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列（６）、ＩＫＶＡＶ配列（７）、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列（８）、ＧＶＫＧＤＫＧＮＰＧＷＰＧＡＰ配列（９）、ＧＥＦＹＦＤＬＲＬＫＧＤＫ配列（１０）、ＨＡＶ配列及びＹＫＬＮＶＮＤＳ配列（１１）からなる群より選ばれる少なくとも１種。 6. The cell according to claim 1, comprising at least one cell adhesion factor selected from the group consisting of fibronectin, collagen, laminin and a cell adhesion peptide (D) having the following minimum amino acid sequence (X). Cell culture substrate.
Minimum amino acid sequence (X): RGD sequence, LDV sequence, REDV sequence (1), YIGSR sequence (2), PDSGR sequence (3), RYVVLPR sequence (4), LGTIPG sequence (5), RNIAEIIKDI sequence (6), IKVAV At least one selected from the group consisting of a sequence (7), an LRE sequence, a DGEA sequence (8), a GVGKGDKGNPGPGAP sequence (9), a GEFYFDLRLKGGDK sequence (10), a HAV sequence and a YKLNVNDS sequence (11).

細胞接着性ペプチド（Ｄ）が配列表において配列番号（８２）で表されるポリペプチド及び／又は配列番号（８２）で表されるペプチドを塩酸Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリドを用いて化学修飾したポリペプチドである請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞培養用基材。 The cell adhesion peptide (D) is chemically modified with the polypeptide represented by SEQ ID NO: (82) and / or the peptide represented by SEQ ID NO: (82) in the sequence listing using N, N-dimethylaminoethyl chloride hydrochloride. The substrate for cell culture according to any one of claims 1 to 6, which is a polypeptide obtained.

形状がシート状である請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞培養用基材。 The cell culture substrate according to any one of claims 1 to 7, wherein the shape is a sheet.

請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞培養用基材を用いて細胞（Ｘ）を培養する細胞の生産方法。 The cell production method which culture | cultivates a cell (X) using the base material for cell cultures of any one of Claims 1-8.

細胞培養用基材上で細胞（Ｘ）を培養後、分解剤（Ｅ）により細胞培養用基材を分解する工程を含む請求項９に記載の細胞の生産方法。 The method for producing cells according to claim 9, comprising a step of decomposing the cell culture substrate with a degrading agent (E) after culturing the cells (X) on the cell culture substrate.

分解剤（Ｅ）が多糖類分解酵素（Ｅ１）である請求項９又は１０に記載の細胞の生産方法。 The method for producing cells according to claim 9 or 10, wherein the decomposing agent (E) is a polysaccharide degrading enzyme (E1).

請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞培養用基材及び分解剤（Ｅ）を含む細胞培養用キット。 A cell culture kit comprising the cell culture substrate according to any one of claims 1 to 8 and a degradation agent (E).