JP2007051127A - Cell adhesive polypeptide - Google Patents

Cell adhesive polypeptide Download PDF

Info

Publication number
JP2007051127A
JP2007051127A JP2006170069A JP2006170069A JP2007051127A JP 2007051127 A JP2007051127 A JP 2007051127A JP 2006170069 A JP2006170069 A JP 2006170069A JP 2006170069 A JP2006170069 A JP 2006170069A JP 2007051127 A JP2007051127 A JP 2007051127A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
sequence
gly
arg
polypeptide
ala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2006170069A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
Kazuhiro Takahashi
一裕 高橋
Sukehito Kurokawa
祐人 黒川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanyo Chemical Industries Ltd
Original Assignee
Sanyo Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanyo Chemical Industries Ltd filed Critical Sanyo Chemical Industries Ltd
Priority to JP2006170069A priority Critical patent/JP2007051127A/en
Publication of JP2007051127A publication Critical patent/JP2007051127A/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a cell adhesive polypeptide expressing excellent cell adhesiveness even under special conditions such as a serum-free culture medium. <P>SOLUTION: The cell adhesive polypeptide comprises a cell adhesive minimum amino acid sequence (X2) chemically bound to an amino acid residue other than the N- and C-termini of a linear polypeptide (P) in which a cell adhesive minimum amino acid sequence (X1) and an auxiliary amino acid sequence (Y) äwherein, (X1) and (X2) are each preferably at least one kind selected from the group consisting of an Arg Gly Asp sequence, an Leu Asp Val sequence, an Leu Arg Glu sequence, an His Ala Val sequence and other specific sequences} are alternately and chemically bound. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、細胞接着性ポリペプチドに関する。さらに詳しくは、基材等に対する細胞の接着性を向上させる細胞接着性ポリペプチドに関する。   The present invention relates to a cell adhesion polypeptide. More specifically, the present invention relates to a cell adhesion polypeptide that improves cell adhesion to a substrate or the like.

人工の細胞接着性ポリペプチドとして、プロネクチンＦ｛Arg Gly Asp配列と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（２０）とを各々約１３個有し、遺伝子組み換え大腸菌により製造される数平均分子量約１１万のポリペプチド｝及びプロネクチンＬ｛Ile Lys Val Ala Val配列（７）と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（２０）とを各々約１３個有し、遺伝子組み換え大腸菌により製造される数平均分子量約１１万のポリペプチド｝（非特許文献１）や、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造を有し、（Ｙ）に含まれる全アミノ酸個数が１〜５０個であり、かつ（Ｙ）に含まれるグリシン（Gly）及びアラニン（Ala）の合計含有割合が（Ｙ）の全アミノ酸個数に基づいて４２〜１００個数％である細胞接着性ポリペプチド（特許文献１）が知られている。 As an artificial cell-adhesive polypeptide, it has about 13 each of pronectin F {Arg Gly Asp sequence and (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) 9 sequence (20), and has a number average molecular weight of about 110,000 polypeptides} and pronectin L {Ile Lys Val Ala Val sequence (7) and (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) 9 sequences (20), each of which is about 13 and is produced by recombinant E. coli Polypeptide having an average molecular weight of about 110,000} (Non-patent Document 1), or a structure in which a cell adhesion minimal amino acid sequence (X) and an auxiliary amino acid sequence (Y) are alternately chemically bonded, (Y) The total number of amino acids contained in 1 to 50, and the total content of glycine (Gly) and alanine (Ala) contained in (Y) is 42 to 100% by number based on the total number of amino acids in (Y). Cell adhesive poly Peptide (Patent Document 1) it is known.

ハンドブック オブ バイオデグラダブル ポリマーズ（アブラハム著，ハーウッド アカデミック パブリッシャーズ発行，アムステルダム１９９７（Abraham J. Dombら著, Handbook of Biodegradable Polymers, Harwood Academic Publishers発行, Amsterdam 1997年）Handbook of Biodegradable Polymers (Abraham, published by Harwood Academic Publishers, Amsterdam 1997 (Abraham J. Domb et al., Handbook of Biodegradable Polymers, published by Harwood Academic Publishers, Amsterdam 1997) 特開２００５−２１０６号公報Japanese Patent Laying-Open No. 2005-2106

従来の細胞接着性ポリペプチドは、無血清培地等の特殊な条件下において細胞培養する場合、細胞接着性が不十分な場合がある。本発明の目的は、無血清培地等の特殊な条件においても、著しく優れた細胞接着性を発現し得る細胞接着性ポリペプチドを提供することである。   Conventional cell adhesion polypeptides may have insufficient cell adhesion when cultured under special conditions such as serum-free medium. An object of the present invention is to provide a cell adhesion polypeptide capable of expressing remarkably excellent cell adhesion even under special conditions such as a serum-free medium.

本発明者は、鋭意研究を重ねてきた結果、特定のポリペプチドを使用することにより上記目的を達成することを見いだし本発明に到達した。
すなわち、本発明の細胞接着性ポリペプチドの特徴は、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ１）及び補助アミノ酸配列（Ｙ）が交互に化学結合してなる直鎖状ポリペプチド（Ｐ）のＮ末端及びＣ末端以外のアミノ酸残基に細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）が化学結合してなる点を要旨とする。 As a result of intensive studies, the inventor has found that the above object can be achieved by using a specific polypeptide, and has reached the present invention.
That is, the cell adhesion polypeptide of the present invention is characterized by the N-terminal of the linear polypeptide (P) formed by alternately chemically bonding the cell adhesion minimal amino acid sequence (X1) and the auxiliary amino acid sequence (Y) and The gist is that the cell adhesion minimal amino acid sequence (X2) is chemically bonded to an amino acid residue other than the C-terminal.

「細胞接着性」とは、特定の最小アミノ酸配列が細胞のインテグリンレセプターに認識され、細胞が基材に接着しやすくなる性質を意味する（大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年）。
細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ１）としては、例えば、「病態生理、第９巻 第７号、５２７〜５３５頁、１９９０年」や「大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年」に記載されているもの等が用いられる。 “Cell adhesion” means a property in which a specific minimum amino acid sequence is recognized by a cell integrin receptor, and the cell easily adheres to a substrate (Osaka Prefectural Maternal and Child Medical Center, Vol. 8, No. 1, 58-66, 1992).
As the cell adhesion minimal amino acid sequence (X1), for example, “Pathophysiology, Vol. 9, No. 7, pp. 527-535, 1990” or “Osaka Prefectural Maternal and Child Medical Center Magazine, Vol. 8, No. 1, 58” -66 pages, 1992 "etc. are used.

これらの最小アミノ酸配列（Ｘ１）の中で、
Arg Gly Asp配列、Leu Asp Val配列、Leu Arg Glu配列、His Ala Val配列、Arg Glu Asp Val配列（１）、Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）、Pro Asp Ser Gly Arg配列（３）、Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg配列（４）、Leu Gly Thr Ile Pro Gly配列（５）、Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile配列（６）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）、Asp Gly Glu Ala 配列（８）、Gly Val Lys Gly Asp Lys Gly Asn Pro Gly Trp Pro Gly Ala Pro配列（９）、Gly Glu Phe Tyr Phe Asp Leu Arg Leu Lys Gly Asp Lys配列（１０）、Tyr Lys Leu Asn Val Asn Asp Ser配列（１１）、Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys配列（１２）、Asn Arg Trp His Ser Ile Tyr Ile Thr Arg Phe Gly配列（１３）、Thr Trp Tyr Lys Ile Ala Phe Gln Arg Asn Arg Lys配列（１４）、Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr（１５）、Tyr Thr Ile Thr Ile Arg Gly Val配列（７４）、Pro His Ser Arg Asn配列（７５）、Lys Arg Ser Arg配列（７６）及びPhe His Arg Arg Ile Lys Ala配列（７７）からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、細胞接着性の観点等から、さらに好ましくはArg Gly Asp配列、Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）及びArg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr（１５）からなる群より選ばれる少なくとも１種、特に好ましくはArg Gly Asp配列である。 Among these minimum amino acid sequences (X1),
Arg Gly Asp sequence, Leu Asp Val sequence, Leu Arg Glu sequence, His Ala Val sequence, Arg Glu Asp Val sequence (1), Tyr Ile Gly Ser Arg sequence (2), Pro Asp Ser Gly Arg sequence (3), Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg sequence (4), Leu Gly Thr Ile Pro Gly sequence (5), Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile sequence (6), Ile Lys Val Ala Val sequence (7), Asp Gly Glu Ala sequence (8), Gly Val Lys Gly Asp Lys Gly Asn Pro Gly Trp Pro Gly Ala Pro sequence (9), Gly Glu Phe Tyr Phe Asp Leu Arg Leu Lys Gly Asp Lys sequence (10), Tyr Lys Leu Asn Val Asn Asp Ser sequence (11), Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys sequence (12), Asn Arg Trp His Ser Ile Tyr Ile Thr Arg Phe Gly sequence (13), Thr Trp Tyr Lys Ile Ala Phe Gln Arg Asn Arg Lys sequence (14), Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr (15), Tyr Thr Ile Thr Ile Arg Gly Val sequence (74), Pro His Ser Arg Asn sequence (75), Lys Arg Ser Arg sequence (76) and Phe His A At least one selected from the group consisting of rg Arg Ile Lys Ala sequence (77) is preferred, and from the viewpoint of cell adhesion, Arg Gly Asp sequence, Tyr Ile Gly Ser Arg sequence (2), Ile Lys Val At least one selected from the group consisting of Ala Val sequence (7) and Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr (15), particularly preferably Arg Gly Asp sequence.

直鎖状ポリペプチド（Ｐ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ１）を１分子中に少なくとも１個有すればよいが、細胞接着性の観点から、１分子中に２〜５０個有するものが好ましく、さらに好ましくは３〜３０個、特に好ましくは４〜２０個、最も好ましくは５〜１８個有するものである。
なお、２種以上の最小アミノ酸配列（Ｘ１）が一分子中に含まれてもよい。 The linear polypeptide (P) may have at least one minimum amino acid sequence (X1) in one molecule, but from the viewpoint of cell adhesion, one having 2 to 50 in one molecule is preferable. More preferably, it is 3-30, particularly preferably 4-20, most preferably 5-18.
Two or more kinds of minimum amino acid sequences (X1) may be contained in one molecule.

補助アミノ酸配列（Ｙ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ１）以外のアミノ酸配列であれば制限なく使用できるが、直鎖状ポリペプチド（Ｐ）の耐熱性及び細胞接着性の観点等から、Gly 及び／又はAlaを有するものが好ましく、例えば（Gly Ala）a 配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）c配列、（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）d配列、（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）e配列、｛Asp Gly Gly (Ala)f Gly Gly Ala｝g配列、（Gly Val Pro Gly Val）h配列、（Gly）i、（Ala）j、（Gly Gly Ala）k配列、（Gly Val Gly Val Pro）ｍ配列、（Gly Pro Pro）ｎ配列、（Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly）ｏ配列、（Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln）ｐ配列及び／又は（Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro）ｑ配列を有するものが挙げられる。これらのうち、（Gly Ala）a配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）c配列、（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）d配列、（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）e、｛Asp Gly Gly (Ala)f Gly Gly Ala｝g配列、（Gly Val Pro Gly Val）h配列、（Gly Val Gly Val Pro）ｍ配列及び／又は（Gly Pro Pro）ｎ配列を有するものが好ましく、さらに好ましくは（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列、（Gly Val Pro Gly Val）h配列、（Gly Val Gly Val Pro）ｍ配列及び／又は（Gly Pro Pro）ｎ配列を有するもの、特に好ましくは（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列を有するものである。
なお、aは５〜１００の整数、b、ｃ、ｄ及びｅは２〜３３の整数、fは１〜１９４の整数、ｇは｛１｝〜｛２００／（６＋ｆ）｝の小数点以下を切り捨てした整数、hは２〜４０の整数、i及びjは１０〜２００の整数、kは３〜６６の整数、ｍは２〜４０の整数、ｎは３〜６６の整数、ｏは１〜２２の整数、ｐ及びｑは１〜１３の整数である。 The auxiliary amino acid sequence (Y) can be used without limitation as long as it is an amino acid sequence other than the minimum amino acid sequence (X1). From the viewpoint of heat resistance and cell adhesiveness of the linear polypeptide (P), Gly and / or Or those having Ala are preferred, for example, (Gly Ala) a sequence, (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) b sequence, (Gly Ala Gly Ala Gly Tyr) c sequence, (Gly Ala Gly Val Gly Tyr) d sequence, Gly Ala Gly Tyr Gly Val) e sequence, {Asp Gly Gly (Ala) f Gly Gly Ala} g sequence, (Gly Val Pro Gly Val) h sequence, (Gly) i, (Ala) j, (Gly Gly Ala) k sequence, (Gly Val Gly Val Pro) m sequence, (Gly Pro Pro) n sequence, (Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly) o sequence, (Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln) having a p sequence and / or (Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro) q sequence. Among these, (Gly Ala) a sequence, (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) b sequence, (Gly Ala Gly Ala Gly Tyr) c sequence, (Gly Ala Gly Val Gly Tyr) d sequence, (Gly Ala Gly Tyr Gly Val) e, {Asp Gly Gly (Ala) f Gly Gly Ala} g sequence, (Gly Val Pro Gly Val) h sequence, (Gly Val Gly Val Pro) m sequence and / or (Gly Pro Pro) n sequence Those having a (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) b sequence, (Gly Val Pro Gly Val) h sequence, (Gly Val Gly Val Pro) m sequence and / or (Gly Pro Pro) n sequence are preferred. Particularly preferred are those having the (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) b sequence.
Here, a is an integer of 5 to 100, b, c, d and e are integers of 2 to 33, f is an integer of 1 to 194, and g is truncated to the decimal point of {1} to {200 / (6 + f)}. , H is an integer of 2 to 40, i and j are integers of 10 to 200, k is an integer of 3 to 66, m is an integer of 2 to 40, n is an integer of 3 to 66, o is 1 to 22 , P and q are integers of 1-13.

補助アミノ酸配列（Ｙ）は、グリシン(Gly)及び／又はアラニン(Ala)を含むことが好ましい。グリシン（Gly）及び／又はアラニン（Ala）を含む場合、これらの合計含有割合（％）は、補助アミノ酸配列（Ｙ）の全アミノ酸個数に基づいて、１０〜１００が好ましく、さらに好ましくは２０〜９５、特に好ましくは３０〜９０、最も好ましくは４０〜８５である。この範囲であると、耐熱性がさらに良好となる。
グリシン（Gly）及びアラニン（Ala）の両方を含む場合、これらの含有個数割合（Gly／Ala）は、０．０３〜４０が好ましく、さらに好ましくは０．０８〜１３、特に好ましくは０．２〜５である。この範囲であると、耐熱性がさらに良好となる。 The auxiliary amino acid sequence (Y) preferably contains glycine (Gly) and / or alanine (Ala). When glycine (Gly) and / or alanine (Ala) is contained, the total content (%) of these is preferably 10 to 100, more preferably 20 to 20 based on the total number of amino acids in the auxiliary amino acid sequence (Y). 95, particularly preferably 30 to 90, most preferably 40 to 85. Within this range, the heat resistance is further improved.
When both glycine (Gly) and alanine (Ala) are included, the content ratio (Gly / Ala) is preferably 0.03 to 40, more preferably 0.08 to 13, particularly preferably 0.2. ~ 5. Within this range, the heat resistance is further improved.

補助アミノ酸配列（Ｙ）には、以上の例示の他に、他のアミノ酸｛アラニン（Ala）、グリシン（Gly）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、システイン（Cys）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、プロリン（Pro）、トリプトファン（Trp）、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、アルギニン（Arg）、リジン（Lys）及びヒスチジン（His）等｝を含んでいてもよい。   In addition to the above examples, the auxiliary amino acid sequence (Y) includes other amino acids {alanine (Ala), glycine (Gly), serine (Ser), threonine (Thr), valine (Val), leucine (Leu), Isoleucine (Ile), Cysteine (Cys), Methionine (Met), Phenylalanine (Phe), Tyrosine (Tyr), Proline (Pro), Tryptophan (Trp), Asparagine (Asn), Glutamine (Gln), Aspartic acid (Asp) , Glutamic acid (Glu), arginine (Arg), lysine (Lys), histidine (His), etc.}.

（Gly Ala）a配列を有する補助与アミノ酸配列としては、配列番号（１６）〜（１８）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（１９）〜（２１）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）c配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２２）〜（２４）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）d配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２５）〜（２７）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）e配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２８）〜（３０）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
｛Asp Gly Gly (Ala)f Gly Gly Ala｝g配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３１）〜（３３）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Val Pro Gly Val）h配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３４）〜（３７）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly）i配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３８）〜（４０）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ala）j配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４１）〜（４３）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Gly Ala）k配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４４）〜（４６）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Val Gly Val Pro）ｍ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４７）〜（４９）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Pro Pro）ｎ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５０）〜（５２）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly）ｏ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５３）〜（５５）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln）ｐ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５６）〜（５８）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro）ｑ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５９）〜（６１）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。 Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (Gly Ala) a sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (16) to (18).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) b sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (19) to (21).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (Gly Ala Gly Ala Gly Tyr) c sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (22) to (24).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (Gly Ala Gly Val Gly Tyr) d sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (25) to (27).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (Gly Ala Gly Tyr Gly Val) e sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (28) to (30).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the {Asp Gly Gly (Ala) f Gly Gly Ala} g sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (31) to (33).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having (Gly Val Pro Gly Val) h sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (34) to (37).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (Gly) i sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (38) to (40).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (Ala) j sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (41) to (43).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (Gly Gly Ala) k sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (44) to (46).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having (Gly Val Gly Val Pro) m sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (47) to (49).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having (Gly Pro Pro) n sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (50) to (52).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having (Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly) o sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (53) to (55).
(Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln) Examples of the auxiliary amino acid sequence having the p sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (56) to (58).
(Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro) Examples of the auxiliary amino acid sequence having the q sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (59) to (61).

これらの補助アミノ酸配列のうち、配列番号（１６）、（１７）、（１９）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）、（２５）、（２６）、（２８）、（２９）、（３１）、（３２）、（３３）、（３４）、（３５）、（３７）、（３８）、（３９）、（４１）、（４２）、（４４）、（４５）、（４７）、（４８）、（５０）、（５１）、（５３）、（５４）、（５６）、（５７）、（５９）又は（６０）で表されるアミノ酸配列が好ましく、さらに好ましくは配列番号（１７）、（１９）、（２０）、（２１）、（２３）、（２６）、（２９）、（３３）、（３４）、（３５）、（３６）、（３７）、（３９）、（４２）、（４５）、（４８）、（５１）、（５４）、（５７）又は（６０）で表されるアミノ酸配列、特に好ましくは配列番号（１９）、（２０）又は（３７）で表されるアミノ酸配列である。   Among these auxiliary amino acid sequences, SEQ ID NOs: (16), (17), (19), (20), (21), (22), (23), (25), (26), (28), (29), (31), (32), (33), (34), (35), (37), (38), (39), (41), (42), (44), (45 ), (47), (48), (50), (51), (53), (54), (56), (57), (59) or (60) is preferred, More preferably, SEQ ID NOs: (17), (19), (20), (21), (23), (26), (29), (33), (34), (35), (36), ( 37), (39), (42), (45), (48), (51), (54), (57) or (60), particularly preferably Column number (19), the amino acid sequence represented by (20) or (37).

直鎖状ポリペプチド（Ｐ）は、補助アミノ酸配列（Ｙ）を１分子中に少なくとも１個有すればよいが、細胞接着性及び熱安定性の観点等から、１分子中に２〜５０個有するものが好ましく、さらに好ましくは３〜３０個、特に好ましくは４〜２０個有するものである。また、２種以上の補助アミノ酸配列（Ｙ）が１分子中に含まれてもよい。   The linear polypeptide (P) may have at least one auxiliary amino acid sequence (Y) in one molecule, but from the viewpoint of cell adhesion and thermal stability, 2 to 50 in one molecule. What has is preferable, More preferably, it is 3-30 pieces, Most preferably, it has 4-20 pieces. Two or more auxiliary amino acid sequences (Y) may be included in one molecule.

直鎖状ポリペプチド（Ｐ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ１）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが交互に化学結合してなる直鎖構造を有するものである（分岐構造、環状構造及び架橋構造を持たない。）。なお、直鎖構造にはβ構造（直鎖状ペプチドが折れ曲がってこの部分同士が平行に並び、その間に水素結合が作られる二次構造）も含まれる。   The linear polypeptide (P) has a linear structure in which the minimum amino acid sequence (X1) and the auxiliary amino acid sequence (Y) are alternately chemically bonded (branched structure, cyclic structure, and crosslinked structure). do not have.). The linear structure also includes a β structure (secondary structure in which linear peptides are bent and the portions are arranged in parallel and a hydrogen bond is formed therebetween).

直鎖状ポリペプチド（Ｐ）中の最小アミノ酸配列（Ｘ１）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との繰り返し単位（Ｘ１−Ｙ）数（個）は、２〜５０が好ましく、さらに好ましくは３〜３０、特に好ましくは４〜２０、最も好ましくは５〜１８である。   The number (number) of repeating units (X1-Y) of the minimum amino acid sequence (X1) and auxiliary amino acid sequence (Y) in the linear polypeptide (P) is preferably 2-50, more preferably 3-30. Especially preferably, it is 4-20, Most preferably, it is 5-18.

直鎖状ポリペプチド（Ｐ）の数平均分子量（Ｍｎ）は、３００〜３，０００，０００が好ましく、さらに好ましくは１，０００〜１，０００，０００、特に好ましくは３，０００〜３００，０００。なお、数平均分子量（Ｍｎ）は、公知の方法により測定でき、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、測定サンプルを分離し、泳動距離を標準物質と比較することによって求められる（以下、同じ）。   The number average molecular weight (Mn) of the linear polypeptide (P) is preferably 300 to 3,000,000, more preferably 1,000 to 1,000,000, particularly preferably 3,000 to 300,000. . The number average molecular weight (Mn) can be measured by a known method, for example, by separating a measurement sample by SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis) and comparing the migration distance with a standard substance. (Hereinafter the same).

直鎖状ポリペプチド（Ｐ）の好適な例を以下に示す。
（１）最小アミノ酸配列（Ｘ１）がArg Gly Asp配列（ｘ１）の場合
（ｘ１）の１３個と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（２０）（ｙ１）の１３個とを有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約１１万のポリペプチド｛「プロネクチンＦ」、プロネクチンは三洋化成工業（株）の登録商標（日本及び米国）である。三洋化成工業（株）製＜以下同じ＞｝；
（ｘ１）の５個と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（１９）（ｙ２）の５個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約２万のポリペプチド（「プロネクチンＦ２」）；
（ｘ１）の３個と（Gly Val Pro Gly Val）2 Gly Gly （Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（３７）（ｙ３）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約１万のポリペプチド（「プロネクチンＦ３」）等。 Suitable examples of the linear polypeptide (P) are shown below.
(1) When the minimum amino acid sequence (X1) is Arg Gly Asp sequence (x1), it has 13 (x1) and (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) 9 sequence (20) (13) (y1) A polypeptide having an Mn structure of about 110,000 {"Pronectin F", Pronectin is a registered trademark (Japan and USA) of Sanyo Chemical Industries, Ltd. Manufactured by Sanyo Chemical Industries Co., Ltd.
A polypeptide having an Mn of about 20,000 (5) of (x1) and 5 of (GlyAlaGlyAlaGlySer) 3 sequence (19) (y2) and having a structure in which these are alternately chemically bonded ( “Pronectin F2”);
(X1) 3 and (Gly Val Pro Gly Val) 2 Gly Gly (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) 3 Sequence (37) (y3) 3 and these are alternately chemically bonded A polypeptide having a Mn of about 10,000 (“pronectin F3”) and the like.

（２）最小アミノ酸配列（Ｘ１）がIle Lys Val Ala Val配列（ｘ２）の場合
プロネクチンＦ、プロネクチンＦ２又はプロネクチンＦ３のArg Gly Asp配列（ｘ１）をIle Lys Val Ala Val配列（７）（ｘ２）に変更した「プロネクチンＬ」、「プロネクチンＬ２」、又は「プロネクチンＬ３」等。 (2) When the minimum amino acid sequence (X1) is the Ile Lys Val Ala Val sequence (x2) The Arg Gly Asp sequence (x1) of pronectin F, pronectin F2 or pronectin F3 is converted to the Ile Lys Val Ala Val sequence (7) (x2) “Pronectin L”, “pronectin L2”, “pronectin L3”, etc.

（３）最小アミノ酸配列（Ｘ１）がTyr Ile Gly Ser Arg配列（ｘ３）の場合
プロネクチンＦ、プロネクチンＦ２又はプロネクチンＦ３のArg Gly Asp配列（ｘ１）をTyr Ile Gly Ser Arg配列（ｘ３）に変更した「プロネクチンＹ」、「プロネクチンＹ２」、又は「プロネクチンＹ３」等。 (3) When the minimum amino acid sequence (X1) is the Tyr Ile Gly Ser Arg sequence (x3) The Arg Gly Asp sequence (x1) of pronectin F, pronectin F2 or pronectin F3 was changed to the Tyr Ile Gly Ser Arg sequence (x3) “Pronectin Y”, “Pronectin Y2”, “Pronectin Y3” and the like.

直鎖状ポリペプチド（Ｐ）は、人工的に製造でき、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）、及び遺伝子組み換え法等によって容易に製造できる。有機合成法に関しては、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）又は続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。有機合成法及び遺伝子組み換え法とも、直鎖状ポリペプチド（Ｐ）を作製できるが、直鎖状ポリペプチド（Ｐ）を安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。   The linear polypeptide (P) can be artificially produced, and can be easily produced by an organic synthesis method (such as an enzyme method, a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method), a gene recombination method, or the like. Regarding organic synthesis methods, Biochemistry Experiment Course 1, Protein Chemistry IV (July 1, 1981, edited by the Japanese Biochemical Society, published by Tokyo Chemical Co., Ltd.) or Secondary Biochemistry Experiment Course 2, Protein Chemistry (bottom) (May 20, 1987, edited by the Japanese Biochemical Society, published by Tokyo Chemical Co., Ltd.) and the like can be applied. Regarding the gene recombination method, the method described in Japanese Patent No. 3338441 can be applied. Although both the organic synthesis method and the gene recombination method can produce a linear polypeptide (P), the gene recombination method is preferable from the viewpoint that the linear polypeptide (P) can be mass-produced at low cost.

直鎖状ポリペプチド（Ｐ）のＮ末端及びＣ末端以外のアミノ酸残基としては、直鎖状ポリペプチド（Ｐ）のＮ末端及びＣ末端以外に位置し、反応性基を有するアミノ酸残基等が含まれ、セリン残基、トレオニン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リシン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びトリプトファン残基等が挙げられる（バイオコンジュゲート テクニークス、Ｇｒｅｇ Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ発行、１９９６）。
これらのアミノ酸残基のうち、セリン残基、トレオニン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リシン残基及びアルギニン残基が好ましく、さらに好ましくはセリン残基、トレオニン残基、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基、特に好ましくはセリン残基及びトレオニン残基である。 Examples of amino acid residues other than the N-terminal and C-terminal of the linear polypeptide (P) include amino acid residues having reactive groups located at other than the N-terminal and C-terminal of the linear polypeptide (P) And serine residues, threonine residues, aspartic acid residues, glutamic acid residues, lysine residues, arginine residues, histidine residues and tryptophan residues (Bioconjugate Techniques, Greg T. et al. Hermanson, Academic Press, 1996).
Among these amino acid residues, serine residue, threonine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, lysine residue and arginine residue are preferable, serine residue, threonine residue, aspartic acid residue are more preferable. And glutamic acid residues, particularly preferably serine residues and threonine residues.

本発明の細胞接着性ポリペプチドは、このアミノ酸残基の反応性基｛水酸基、カルボキシル基、メルカプト基、及び１級又は２級アミノ基等｝に、最小アミノ酸配列（Ｘ２）が化学結合｛共有結合、イオン結合及び／又は水素結合等｝してなるものである。
化学結合のうち、結合の強さの観点等から、共有結合が好ましい。
これらの反応性基のうち、水酸基、カルボキシル基及び１級アミノ基が好ましく、さらに好ましくは水酸基及びカルボキシル基、特に好ましくは水酸基である。 In the cell adhesion polypeptide of the present invention, the minimal amino acid sequence (X2) is chemically bonded {shared by the reactive group {hydroxyl group, carboxyl group, mercapto group, primary or secondary amino group, etc.} of this amino acid residue. Bond, ionic bond and / or hydrogen bond, etc.}.
Of the chemical bonds, a covalent bond is preferable from the viewpoint of bond strength.
Of these reactive groups, a hydroxyl group, a carboxyl group and a primary amino group are preferred, a hydroxyl group and a carboxyl group are more preferred, and a hydroxyl group is particularly preferred.

細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）は、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ１）と同じでも、異なっていてもよいが、細胞接着性の観点等から、異なることが好ましい。   The cell adhesion minimal amino acid sequence (X2) may be the same as or different from the cell adhesion minimal amino acid sequence (X1), but is preferably different from the viewpoint of cell adhesion.

最小アミノ酸配列（Ｘ２）は、以上の例示の他に、他のアミノ酸（アラニン（Ala）、グリシン（Gly）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、システイン（Cys）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、プロリン（Pro）、トリプトファン（Trp）、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、アルギニン（Arg）、リジン（Lys）及びヒスチジン（His）等）を含んでいてもよい。他のアミノ酸を含む場合、その個数は、１５個以下が好ましく、さらに好ましくは１０個以下、特に好ましくは５個以下である。
他のアミノ酸を含む細胞接着性最小アミノ酸配列としては、Arg Gly Asp Ser配列（６２）、Arg Gly Asp Cys配列（６３）、Arg Gly Asp Thr配列（６４）、Tyr Arg Gly Asp Ser配列（６５）、Gly Arg Gly Asp Ser配列（６６）、Gly Arg Gly Asp Ser Pro配列（６７）、Gly Arg Gly Asp Asn Pro配列（６８）、Gly Arg Gly Asp Thr Pro配列（６９）、Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys配列（７０）、Gly Arg Gly Asp Ser Pro Lys配列（７１）、Ser Ile Lys Val Ala Val配列（７２）及びCys Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Ala Ser Ile Lys Val Ala Val Ser Ala Asp Arg配列（７３）等が挙げられる。 In addition to the above examples, the minimum amino acid sequence (X2) includes other amino acids (alanine (Ala), glycine (Gly), serine (Ser), threonine (Thr), valine (Val), leucine (Leu), isoleucine. (Ile), cysteine (Cys), methionine (Met), phenylalanine (Phe), tyrosine (Tyr), proline (Pro), tryptophan (Trp), asparagine (Asn), glutamine (Gln), aspartic acid (Asp), Glutamic acid (Glu), arginine (Arg), lysine (Lys), histidine (His), etc.) may be contained. When other amino acids are included, the number thereof is preferably 15 or less, more preferably 10 or less, and particularly preferably 5 or less.
Cell adhesion minimal amino acid sequences including other amino acids include Arg Gly Asp Ser sequence (62), Arg Gly Asp Cys sequence (63), Arg Gly Asp Thr sequence (64), Tyr Arg Gly Asp Ser sequence (65) Gly Arg Gly Asp Ser sequence (66), Gly Arg Gly Asp Ser Pro sequence (67), Gly Arg Gly Asp Asn Pro sequence (68), Gly Arg Gly Asp Thr Pro sequence (69), Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys sequence (70), Gly Arg Gly Asp Ser Pro Lys sequence (71), Ser Ile Lys Val Ala Val sequence (72) and Cys Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Ala Ser Ile Lys Val Ala Val Ser Ala Asp Arg sequence ( 73).

直鎖状ポリペプチド（Ｐ）１分子中に含まれる最小アミノ酸配列（Ｘ２）の個数は、細胞接着性の観点等から、２〜５０個が好ましく、さらに好ましくは３〜３０個、特に好ましくは４〜２０個である。
なお、２種以上の最小アミノ酸配列（Ｘ２）が一分子に結合していてもよい。
また、最小アミノ酸配列（Ｘ２）の結合位置及び含有個数は、公知の方法｛例えば、ポリペプチドを部位特異的に切断する消化酵素を用いて断片化した後、各断片の質量分析等によりペプチドマップを作製する方法（プロテオーム解析、平野久著、株式会社東京化学同人発行、２００１年）｝によって確認できる。 The number of the minimum amino acid sequence (X2) contained in one molecule of the linear polypeptide (P) is preferably 2 to 50, more preferably 3 to 30, particularly preferably from the viewpoint of cell adhesion. 4 to 20 pieces.
Two or more kinds of minimum amino acid sequences (X2) may be bound to one molecule.
In addition, the binding position and the number of contents of the minimum amino acid sequence (X2) can be determined by a known method {for example, a peptide map obtained by fragmenting a polypeptide using a digestive enzyme that specifically cleaves a polypeptide and then mass spectrometry of each fragment. (Proteome analysis, Hisashi Hirano, Tokyo Kagaku Doujin, 2001)}.

直鎖状ポリペプチド（Ｐ）のＮ末端及びＣ末端以外のアミノ酸残基に細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）を化学結合させる方法としては、公知の方法が適用でき、たとえば以下の方法等が挙げられる。
＜共有結合させる方法＞
（１）直鎖状ポリペプチド（Ｐ）中のセリン残基及び／又はトレオニン残基の水酸基と、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）からなるペプチド中のアミノ基とを反応させる方法。
（２）（Ｐ）中のアスパラギン酸残基及び／又はグルタミン酸残基のカルボキシル基と、（Ｘ２）からなるペプチド中のアミノ基や水酸基とを反応させる方法。
（３）（Ｐ）中のリシン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及び／又はトリプトファン残基の１級又は２級アミノ基と、（Ｘ２）からなるペプチド中のカルボキシル基とを反応させる方法。 As a method for chemically binding the cell adhesion minimal amino acid sequence (X2) to amino acid residues other than the N-terminus and C-terminus of the linear polypeptide (P), a known method can be applied. Can be mentioned.
<Method of covalent bond>
(1) A method of reacting a hydroxyl group of a serine residue and / or a threonine residue in a linear polypeptide (P) with an amino group in a peptide consisting of a cell adhesion minimal amino acid sequence (X2).
(2) A method of reacting the carboxyl group of the aspartic acid residue and / or glutamic acid residue in (P) with the amino group or hydroxyl group in the peptide comprising (X2).
(3) A method of reacting a primary or secondary amino group of a lysine residue, arginine residue, histidine residue and / or tryptophan residue in (P) with a carboxyl group in a peptide comprising (X2) .

これらの反応は公知の方法（例えば、「ペプチド合成の基礎と実験、平成９年１０月５日、丸善株式会社発行」に記載の方法等）で行うことができる。具体的には、以下の（１）〜（３）の通りである。
（１）直鎖状ポリペプチド（Ｐ）中のセリン残基及び／又はトレオニン残基の水酸基と、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）からなるペプチド中のアミノ基とを反応させる場合、（Ｐ）の水酸基を予めカルボニルジイミダゾール化合物と反応させ、イミダゾール誘導体｛Ｒ−Ｉｍ；Ｉｍはイミダゾリン環、Ｒは（Ｐ）に由来｝とした後、（Ｘ２）からなるペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものを加えることによって、カルバメート結合を形成させて共有結合させることができる。カルボニルジイミダゾール化合物としては、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール等が挙げられる。 These reactions can be carried out by a known method (for example, the method described in “Basics and Experiments of Peptide Synthesis, October 5, 1997, published by Maruzen Co., Ltd.”). Specifically, it is as the following (1) to (3).
(1) When reacting a hydroxyl group of a serine residue and / or threonine residue in a linear polypeptide (P) with an amino group in a peptide consisting of the cell adhesion minimal amino acid sequence (X2), (P ) Is previously reacted with a carbonyldiimidazole compound to give an imidazole derivative {R-Im; Im is an imidazoline ring, R is derived from (P)}, and then a primary amino group of the peptide consisting of (X2) or By adding one having a secondary amino group, a carbamate bond can be formed and covalently bonded. Examples of the carbonyldiimidazole compound include N, N′-carbonyldiimidazole.

（２）（Ｐ）中のアスパラギン酸残基及び／又はグルタミン酸残基のカルボキシル基と、（Ｘ２）からなるペプチド中のアミノ基や水酸基とを反応させる場合、（Ｐ）のカルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素｛Ｒ’−Ｎ＝Ｃ（−ＯＣＯＲ）−ＮＨ−Ｒ’；−ＯＣＯＲが（Ｐ）に由来する部分｝とした後、（Ｘ２）からなるペプチドのうち１級アミノ基若しくは２級アミノ基を有するもの、又は水酸基を有するものを加えることによって、アミド結合もしくはエステル結合を形成させて共有結合させることができる。カルボジイミド化合物としては、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等が挙げられる。   (2) When the carboxyl group of the aspartic acid residue and / or glutamic acid residue in (P) is reacted with the amino group or hydroxyl group in the peptide consisting of (X2), the carboxyl group of (P) is previously converted to carbodiimide. After reacting with a compound to form acylisourea {R′—N═C (—OCOR) —NH—R ′; —OCOR is a moiety derived from (P)}, the primary amino acid of the peptide consisting of (X2) By adding a group or a group having a secondary amino group or a group having a hydroxyl group, an amide bond or an ester bond can be formed and covalently bonded. Examples of the carbodiimide compound include N, N′-dicyclohexylcarbodiimide and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride.

（３）（Ｐ）中のリシン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基、及び／又はトリプトファン残基の１級又は２級アミノ基と、（Ｘ２）からなるペプチド中のカルボキシル基とを反応させる場合、（Ｘ２）からなるペプチドのカルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素とした後、（Ｐ）を加えることによって、（Ｐ）に（Ｘ２）をアミド結合を形成させて共有結合させることができる。   (3) The primary or secondary amino group of the lysine residue, arginine residue, histidine residue, and / or tryptophan residue in (P) is reacted with the carboxyl group in the peptide consisting of (X2). In this case, the carboxyl group of the peptide consisting of (X2) is previously reacted with a carbodiimide compound to form acylisourea, and then (P) is added to form (X2) a covalent bond with (P2) by forming an amide bond. be able to.

＜イオン結合、水素結合させる方法＞
溶媒等に直鎖状ポリペプチド（Ｐ）と細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）からなるペプチドとを投入し混合して作製する方法（たとえば、特許文献１に記載された細胞接着性ポリペプチドと基材との結合方法と同様の方法）。 <Method of ion bonding and hydrogen bonding>
A method in which a linear polypeptide (P) and a peptide consisting of the cell adhesion minimal amino acid sequence (X2) are introduced into a solvent or the like and mixed (for example, the cell adhesion polypeptide described in Patent Document 1 and The same method as the bonding method to the substrate).

本発明の細胞接着性ポリペプチドは、アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）でさらに修飾されていてもよい。（ＡＭ）で修飾されていると、本発明の細胞接着性ポリペプチドの細胞接着性がさらに良好となる。なお、（ＡＭ）には細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ１、Ｘ２）は含まれない。   The cell adhesive polypeptide of the present invention may be further modified with a compound (AM) containing an amino group and / or an ammonio group. When it is modified with (AM), the cell adhesiveness of the cell adhesive polypeptide of the present invention is further improved. Note that (AM) does not include the cell adhesion minimal amino acid sequences (X1, X2).

アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）としては、ポリアミン、アミノアルコール、アミノ基を有するハロゲン化物、アミノ基含有モノマー及びアミノ基含有モノマーを構成単量体とする重合体、並びにこれらの４級化物等が使用できる。
ポリアミンとしては、少なくとも１個の１級アミノ基又は２級アミノ基を有するポリアミン（炭素数２〜５６）等が用いられ、脂肪族ポリアミン、脂環式ポリアミン、複素環式ポリアミン及び芳香族ポリアミン等が用いられる。 Examples of the compound (AM) containing an amino group and / or an ammonio group include polyamines, amino alcohols, halides having an amino group, amino group-containing monomers, polymers having amino group-containing monomers as constituent monomers, and these Can be used.
As the polyamine, a polyamine having at least one primary amino group or secondary amino group (having 2 to 56 carbon atoms) is used, such as an aliphatic polyamine, an alicyclic polyamine, a heterocyclic polyamine, and an aromatic polyamine. Is used.

脂肪族ポリアミンとしては、アルキレンジアミン（エチレンジアミン、プロピレンジアミン、トリメチレンジアミン、テトラメチレンジアミン及びヘキサメチレンジアミン等）、アルキレン基の炭素数が２〜６であるポリアルキレンポリアミン（ジエチレントリアミン、イミノビスプロピルアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン及びペンタエチレンヘキサミン等）、及びこれらのアルキル（炭素数１〜１８）置換体（ジメチルアミノプロピルアミン、ジエチルアミノプロピルアミン、ジプロピルアミノプロピルアミン、メチルエチルアミノプロピルアミン、トリメチルヘキサメチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルエチレンジアミン、トリオクタデシルエチレンジアミン及びメチルイミノビスプロピルアミン等）等が挙げられる。   Aliphatic polyamines include alkylene diamines (ethylene diamine, propylene diamine, trimethylene diamine, tetramethylene diamine, hexamethylene diamine, etc.), polyalkylene polyamines having 2 to 6 carbon atoms in the alkylene group (diethylene triamine, iminobispropylamine, Triethylenetetramine, tetraethylenepentamine, pentaethylenehexamine, etc.), and alkyl (C1-C18) substitution products thereof (dimethylaminopropylamine, diethylaminopropylamine, dipropylaminopropylamine, methylethylaminopropylamine, Trimethylhexamethylenediamine, N, N-dioctadecylethylenediamine, trioctadecylethylenediamine, methyliminobispropylamine, etc.) And the like.

脂環式ポリアミンとしては、１，３−ジアミノシクロヘキサン、１，３−ビス（メチルアミノ）シクロヘキサン、１，３−ビス（ジヒドロキシアミノ）シクロヘキサン、イソホロンジアミン、メンタンジアミン及び４，４’−メチレンジシクロヘキサンジアミン等が挙げられる。   Examples of alicyclic polyamines include 1,3-diaminocyclohexane, 1,3-bis (methylamino) cyclohexane, 1,3-bis (dihydroxyamino) cyclohexane, isophorone diamine, menthane diamine, and 4,4′-methylene dicyclohexane. Examples include diamines.

複素環式ポリアミンとしては、ピペラジン、Ｎ−メチルピペラジン、Ｎ−アミノエチルピペラジン及び１，４−ジアミノエチルピペラジン等が挙げられる。   Examples of the heterocyclic polyamine include piperazine, N-methylpiperazine, N-aminoethylpiperazine and 1,4-diaminoethylpiperazine.

芳香族ポリアミンとしては、フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ジメチルフェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’−トリメチルフェニレンジアミン、ジフェニルメタンジアミン及び２，６−ジアミノピリジン、トリレンジアミン、ジエチルトリレンジアミン、４，４’−ビス（メチルアミノ）ジフェニルメタン及び１−メチル−２−メチルアミノ−４−アミノベンゼン等が挙げられる。   Aromatic polyamines include phenylenediamine, N, N′-dimethylphenylenediamine, N, N, N′-trimethylphenylenediamine, diphenylmethanediamine and 2,6-diaminopyridine, tolylenediamine, diethyltolylenediamine, 4, Examples include 4′-bis (methylamino) diphenylmethane and 1-methyl-2-methylamino-4-aminobenzene.

アミノアルコールとしては、炭素数２〜５８のアミノアルコール等が用いられ、炭素数２〜１０のアルカノールアミン［モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、モノブタノールアミン、トリエタノールアミン、トリプロパノールアミン、トリブタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン及びＮ，Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラキス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン等］、これらのアルキル（炭素数１〜１８）置換体［Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエタノールアミン、Ｎ−エチルジエタノールアミン、Ｎ−オクタデシルジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン及びＮ，Ｎ，Ｎ’−トリオクタデシル−Ｎ’−ヒドロキシエチルエチレンジアミン等］等が挙げられる。   As the amino alcohol, an amino alcohol having 2 to 58 carbon atoms is used, and an alkanolamine having 2 to 10 carbon atoms [monoethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, monoisopropanolamine, monobutanolamine, triethanolamine, triethanolamine, Propanolamine, tributanolamine, N, N-bis (hydroxyethyl) ethylenediamine and N, N, N ′, N′-tetrakis (hydroxyethyl) ethylenediamine, etc.], alkyl (C 1-18) substituted products thereof [ N, N-dimethylethanolamine, N, N-diethylethanolamine, N-ethyldiethanolamine, N-octadecyldiethanolamine, N, N-diethyl-N ′, N′-bis (hydroxyethyl) ethylenediamine, N, - dioctadecyl -N ', N'-bis (hydroxyethyl) ethylenediamine and N, N, N'trioctadecyl -N'- hydroxyethyl ethylenediamine] and the like.

アミノ基を有するハロゲン化物としては、炭素数２〜１７のアルキルアミンのハロゲン（塩素及び臭素等）化物等が用いられ、アミノエチルクロリド、Ｎ−メチルアミノプロピルクロリド、ジメチルアミノエチルクロリド、ジエチルアミノエチルクロリド、ジベンジルアミノエチルブロミド、ジメチルアミノプロピルブロミド、ジエチルアミノプロピルクロリド及びジベンジルアミノプロピルクロリド等が挙げられる。   As the halide having an amino group, halogenated (such as chlorine and bromine) of alkylamine having 2 to 17 carbon atoms is used, and aminoethyl chloride, N-methylaminopropyl chloride, dimethylaminoethyl chloride, diethylaminoethyl chloride are used. , Dibenzylaminoethyl bromide, dimethylaminopropyl bromide, diethylaminopropyl chloride, dibenzylaminopropyl chloride and the like.

アミノ基含有モノマーとしては、炭素数５〜２１のアミノ基含有ビニル化合物、エチレンイミン及び炭素数２〜２０のアミノ酸等が用いられる。
アミノ基含有ビニル化合物としては、アミノ基含有（メタ）アクリレート、アミノ基含有（メタ）アクリルアミド、アミノ基含有芳香族ビニル炭化水素及びアミノ基含有アリルエーテル等が用いられる。なお、（メタ）アクリ・・・は、アクリ・・・及び／又はメタクリ・・・を意味する。 As the amino group-containing monomer, an amino group-containing vinyl compound having 5 to 21 carbon atoms, ethyleneimine, an amino acid having 2 to 20 carbon atoms, or the like is used.
Examples of the amino group-containing vinyl compound include amino group-containing (meth) acrylates, amino group-containing (meth) acrylamides, amino group-containing aromatic vinyl hydrocarbons, amino group-containing allyl ethers, and the like. In addition, (meth) acryl ... means acryl ... and / or methacryl ...

アミノ基含有（メタ）アクリレートとしては、アミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−メチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジベンジルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジベンジルアミノプロピル（メタ）アクリレート、モルホリノエチル（メタ）アクリレート及びＮ−メチルピペチジノエチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。   As the amino group-containing (meth) acrylate, aminoethyl (meth) acrylate, N-methylaminoethyl (meth) acrylate, N, N-dimethylaminoethyl (meth) acrylate, N, N-diethylaminopropyl (meth) acrylate, N, N-dipropylaminoethyl (meth) acrylate, N-benzyl-N-methylaminoethyl (meth) acrylate, N, N-dibenzylaminoethyl (meth) acrylate, N, N-dibenzylaminopropyl (meth) ) Acrylate, morpholinoethyl (meth) acrylate, N-methylpipetidinoethyl (meth) acrylate, and the like.

アミノ基含有（メタ）アクリルアミドとしては、アミノエチルアクリルアミド、Ｎ−メチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、モルホリノエチル（メタ）アクリルアミド及びＮ−メチルピペチジノエチル（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。   Examples of amino group-containing (meth) acrylamides include aminoethyl acrylamide, N-methylaminopropyl acrylamide, N, N-dimethylaminoethyl (meth) acrylamide, N, N-diethylaminopropyl (meth) acrylamide, and N, N-dipropyl. Examples include aminoethyl (meth) acrylamide, N-benzyl-N-methylaminoethyl (meth) acrylamide, morpholinoethyl (meth) acrylamide, and N-methylpipetidinoethyl (meth) acrylamide.

アミノ基含有芳香族ビニル炭化水素としては、アミノエチルスチレン、Ｎ−メチルアミノエチルスチレン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスチレン、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノスチレン及びＮ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノスチレン等が挙げられる。   Examples of amino group-containing aromatic vinyl hydrocarbons include aminoethylstyrene, N-methylaminoethylstyrene, N, N-dimethylaminostyrene, N, N-dipropylaminostyrene, and N-benzyl-N-methylaminostyrene. Can be mentioned.

アミノ基含有アリルエーテルとしては、アミノエチルアリルエーテル、Ｎ−メチルアミノエチルアリルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアリルエーテル及びＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアリルエーテル等が挙げられる。   Examples of the amino group-containing allyl ether include aminoethyl allyl ether, N-methylaminoethyl allyl ether, N, N-dimethylaminoethyl allyl ether, and N, N-diethylaminoethyl allyl ether.

アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、プロリン、システイン、リシン、セリン、グリシン、３−アミノプロピオン酸、８−アミノアクタン酸及び２０−アミノエイコサン酸等が挙げられる。   As amino acids, arginine, histidine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, tyrosine, valine, alanine, asparagine, aspartic acid, glutamine, glutamic acid, proline, cysteine, lysine, serine, glycine, 3-aminopropionic acid , 8-aminoactanoic acid and 20-aminoeicosanoic acid.

アミノ基含有モノマーの重合体としては、アミノ基含有ビニル化合物からなるビニルポリマー、ポリエチレンイミン及びポリペプチド（直鎖状ポリペプチド（Ｐ）は含まない。）等が挙げられる。
アミノ基含有モノマーの重合体の重量平均分子量は、５００〜１００万が好ましく、さらに好ましくは１，０００〜８０万、特に好ましくは２，０００〜５０万である。なお、重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定することができる｛基準物質：分子量４２０〜２０,６００,０００のポリスチレンスタンダード（東ソー製）等｝。 Examples of the polymer of the amino group-containing monomer include a vinyl polymer composed of an amino group-containing vinyl compound, polyethyleneimine, and a polypeptide (not including a linear polypeptide (P)).
The weight average molecular weight of the polymer of amino group-containing monomers is preferably 500 to 1,000,000, more preferably 1,000 to 800,000, and particularly preferably 2,000 to 500,000. The weight average molecular weight can be measured by gel permeation chromatography (GPC) {reference substance: polystyrene standard having a molecular weight of 420 to 20,600,000 (manufactured by Tosoh Corp.)}.

これらの４級化物としては、これらのアミノ基を４級化剤（メチルクロリド、エチルクロリド、ベンジルクロリド、ジメチル炭酸、ジメチル硫酸及びエチレンオキシド等）によって４級化したもの等が挙げられる。   Examples of these quaternized products include those obtained by quaternizing these amino groups with a quaternizing agent (such as methyl chloride, ethyl chloride, benzyl chloride, dimethyl carbonate, dimethyl sulfate and ethylene oxide).

アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）で修飾する方法としては、（１）アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）と、修飾前の細胞接着性ポリペプチドとを化学結合｛共有結合、イオン結合及び／又は水素結合等｝させる方法、並びに、（２）アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）を修飾前の細胞接着性ポリペプチドに物理吸着（ファンデルワールス力による吸着）させる方法等が適用できる。
これらのうち、結合強度の観点等から、（１）の化学結合させる方法が好ましく、さらに好ましくは共有結合である。
アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）と修飾前の細胞接着性ポリペプチドとを化学結合させる方法としては、直鎖状ポリペプチド（Ｐ）と最小アミノ酸配列（Ｘ２）との場合と同様である。
アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）と修飾前の細胞接着性ポリペプチドとを物理吸着させる方法としては、イオン結合及び／又は水素結合させる方法と同様の方法がそのまま利用でき、好ましいものも同じである。 As a method of modifying with a compound (AM) containing an amino group and / or an ammonio group, (1) a compound (AM) containing an amino group and / or an ammonio group and a cell adhesive polypeptide before modification A chemical bond {covalent bond, ionic bond and / or hydrogen bond, etc.} and (2) physical adsorption of a compound (AM) containing an amino group and / or an ammonio group to a cell-adhesive polypeptide before modification ( Adsorption method by van der Waals force) can be applied.
Among these, from the viewpoint of bond strength and the like, the method (1) of chemical bonding is preferable, and covalent bonding is more preferable.
In the case of a linear polypeptide (P) and a minimal amino acid sequence (X2), the compound (AM) containing an amino group and / or an ammonio group and the cell adhesion polypeptide before modification are chemically bonded. It is the same.
As a method for physically adsorbing a compound (AM) containing an amino group and / or an ammonio group and a cell-adhesive polypeptide before modification, a method similar to the method of ionic bonding and / or hydrogen bonding can be used as it is, The preferred ones are the same.

本発明の細胞接着性ポリペプチド中に含まれるアミノ基及びアンモニオ基｛以下、アミノ基と省略する。なお、このアミノ基には、化合物（ＡＭ）に由来するアミノ基を含み、アミノ酸に由来するアミノ基及びアミド結合の広義のアミノ基を含まない。｝の平均個数（個）は、本発明の細胞接着性ポリペプチド１分子あたり、０．００１〜１００，０００が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜１０，０００、特に好ましくは０．１〜１，０００である。
アミノ基の平均個数は、公知の方法等により定量でき、例えば、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）法［タンパク質の化学ＩＶ（東京化学同人発行、１９８１年）等］や塩酸・指示薬（ブロムフェノールブルー等）滴定法による全アミン価測定法［ＪＩＳ Ｋ７２３７−１９８６や、ＡＳＴＭ Ｄ２０７４−６６等］が適用できる。具体的には、例えば、アミノ基の個数が既知のアミノ基を含有する化合物を、単位容積当たりの濃度を変化させてＴＮＢＳ法によって測定し、検量線（アミノ基の個数と吸光度のグラフ）を作製する。また修飾前の細胞接着性ポリペプチドをＴＮＢＳ法で測定し、得られた吸光度を、検量線を用いてアミノ基の個数に換算する。同時に修飾後の細胞接着性ポリペプチドをＴＮＢＳ法で測定し、得られた吸光度を、検量線を用いてアミノ基の個数に換算する。これら修飾前後のアミノ基の個数の差を算出して、その値を測定に用いた細胞接着性ポリペプチドの分子数で除することで、細胞接着性ポリペプチドに修飾されるアミノ基の平均個数とする。 Amino group and ammonio group contained in the cell adhesive polypeptide of the present invention (hereinafter abbreviated as amino group). In addition, this amino group includes an amino group derived from the compound (AM), and does not include an amino group derived from an amino acid and an amino group in a broad sense of an amide bond. } Is preferably 0.001 to 100,000, more preferably 0.01 to 10,000, and particularly preferably 0.1 to 1 per molecule of the cell adhesive polypeptide of the present invention. , 000.
The average number of amino groups can be quantified by a known method or the like. For example, the trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) method [Protein Chemistry IV (published by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 1981)] or hydrochloric acid / indicator (bromophenol blue, etc.) ) A total amine value measuring method by a titration method [JIS K7237-1986, ASTM D2074-66, etc.] can be applied. Specifically, for example, a compound containing an amino group with a known number of amino groups is measured by the TNBS method while changing the concentration per unit volume, and a calibration curve (a graph of the number of amino groups and absorbance) is obtained. Make it. Further, the cell adhesive polypeptide before modification is measured by the TNBS method, and the obtained absorbance is converted into the number of amino groups using a calibration curve. At the same time, the cell adhesion polypeptide after modification is measured by the TNBS method, and the obtained absorbance is converted into the number of amino groups using a calibration curve. By calculating the difference in the number of amino groups before and after these modifications, and dividing that value by the number of molecules of the cell adhesive polypeptide used for the measurement, the average number of amino groups modified to the cell adhesive polypeptide And

本発明の細胞接着性ポリペプチドは、基材（Ｂ）とともに細胞接着性ポリペプチド含有基材とすることができる。
基材（Ｂ）の材質、形状、及び細胞接着性ポリペプチドの基材（Ｂ）への結合方法は、特許文献１に記載されたものをそのまま適用できる。 The cell adhesion polypeptide of the present invention can be used as a cell adhesion polypeptide-containing substrate together with the substrate (B).
As the material and shape of the substrate (B) and the method for binding the cell adhesive polypeptide to the substrate (B), those described in Patent Document 1 can be applied as they are.

本発明の基材中の細胞接着性ポリペプチドの含有量は、細胞接着性の観点等から、本発明の基材の単位面積あたり、０．１ｎｇ／ｃｍ2〜１００ｍｇ／ｃｍ2が好ましく、さらに好ましくは１ｎｇ／ｃｍ2〜１０ｍｇ／ｃｍ2、特に好ましくは１０ｎｇ／ｃｍ2〜１ｍｇ／ｃｍ2、最も好ましくは１００ｎｇ／ｃｍ2〜１００μｇ／ｃｍ2である。
なお、本発明において、単位面積は、基材（Ｂ）の表面のうち、培養される細胞が接着し得る表面の表面積を意味し、細胞が入り込まないような微小な凹凸（例えば、１μｍ以下）は平坦な表面として取扱うが、単位面積を高める目的でリブ（畝）等が設けてあるものについてはそのリブの表面積を単位面積に含まれる。
単位面積あたりの細胞接着性ポリペプチドの含有量の測定方法は特に限定されないが、例えば、免疫学的測定法が利用できる。具体的な方法としては、特許文献１に記載されたものをそのまま適用できる。 The content of the cell adhesive polypeptide in the substrate of the present invention is preferably 0.1 ng / cm 2 to 100 mg / cm 2 per unit area of the substrate of the present invention from the viewpoint of cell adhesiveness, etc. It is preferably 1 ng / cm 2 to 10 mg / cm 2 , particularly preferably 10 ng / cm 2 to 1 mg / cm 2 , most preferably 100 ng / cm 2 to 100 μg / cm 2 .
In the present invention, the unit area means the surface area of the surface of the base material (B) to which cells to be cultured can adhere, and minute irregularities (for example, 1 μm or less) such that cells do not enter. Is handled as a flat surface, but for the purpose of increasing the unit area, the surface area of the rib is included in the unit area for ribs or the like.
Although the measuring method of content of the cell-adhesive polypeptide per unit area is not specifically limited, For example, an immunoassay can be utilized. As a specific method, the method described in Patent Document 1 can be applied as it is.

本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。
滅菌方法としては、特に限定されないが、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、プラズマ滅菌、γ線滅菌、アルコール滅菌、オートクレーブ滅菌及び乾熱滅菌等が挙げられる。 The cell-adhesive polypeptide-containing substrate of the present invention may be sterilized as necessary.
Although it does not specifically limit as a sterilization method, Radiation sterilization, ethylene oxide gas sterilization, plasma sterilization, gamma ray sterilization, alcohol sterilization, autoclave sterilization, dry heat sterilization, etc. are mentioned.

細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いて細胞培養する工程を含む細胞の生産方法としては、公知の培養基材の代わりに本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材を使用する以外、公知の方法が適用できる。
細胞培養工程としては、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材又は、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材が入った適当な容器（シャーレ、プレート、フラスコ、ビーカー及びファーメンター等）に、細胞（ＣＥ）を縣濁させた培地を加えて適当な条件で培養する方法等が挙げられる。 As a method for producing cells including the step of culturing cells using a cell-adhesive polypeptide-containing substrate, a known method except that the cell-adhesive polypeptide-containing substrate of the present invention is used instead of the known culture substrate. The method is applicable.
As the cell culture process, the cell-adhesive polypeptide-containing substrate of the present invention or an appropriate container (a petri dish, plate, flask, beaker, fermenter, etc.) containing the cell-adhesive polypeptide-containing substrate of the present invention is used. And a method of culturing under appropriate conditions by adding a medium in which cells (CE) are suspended.

本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材に接着できる細胞（ＣＥ）としては細胞であれば制限がないが、主に医薬品等の有用物質生産や治療等に用いられる哺乳動物由来の正常細胞、哺乳動物由来の株化細胞及び昆虫細胞が適している。具体的には特許文献１に記載された細胞等が挙げられる。   The cells (CE) that can adhere to the cell-adhesive polypeptide-containing substrate of the present invention are not limited as long as they are cells, but normal cells derived from mammals that are mainly used for production and treatment of useful substances such as pharmaceuticals, Mammalian cell lines and insect cells are suitable. Specific examples include cells described in Patent Document 1.

本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いる細胞培養方法に用いる培地は、特に制限無く一般の細胞培養に用いられるものが利用でき、また、これら培地に必要に応じて、血清、細胞増殖因子、抗菌剤等を添加したものも利用できる。培地、血清およびその使用量、細胞増殖因子及びその使用量、抗菌剤及びその使用量の具体例としては、特許文献１に記載されたものがそのまま利用できる。
また、細胞の播取量、培養条件、培養後の細胞回収方法についても、特許文献１に記載されたものがそのまま利用できる。 The medium used for the cell culture method using the cell-adhesive polypeptide-containing substrate of the present invention is not particularly limited, and any medium used for general cell culture can be used. If necessary, serum, cell growth can be used for these media. Those added with factors, antibacterial agents and the like can also be used. As specific examples of the culture medium, serum and its use amount, cell growth factor and its use amount, antibacterial agent and its use amount, those described in Patent Document 1 can be used as they are.
Moreover, what was described in patent document 1 can be utilized as it is also about the seeding amount of a cell, culture conditions, and the cell collection method after culture | cultivation.

細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いる細胞培養で得られる細胞（ＣＥ２）としては、細胞接着性ペプチド含有基材に接着できる細胞（ＣＥ）と同じものが挙げられる。なお、細胞（ＣＥ）が分化して、元の細胞（ＣＥ）とは異なる細胞（ＣＥ２）が得られる場合がある。例えば、元の細胞（ＣＥ）が骨髄未分化間葉系幹細胞であって、細胞（ＣＥ２）が骨芽細胞、軟骨細胞又は脂肪細胞等の場合である（ティッシュ・エンジニアリング、上田実 編、財団法人名古屋大学出版会、１９９９年１０月１０日）。   Examples of the cell (CE2) obtained by cell culture using the cell-adhesive polypeptide-containing substrate include the same cells (CE) that can adhere to the cell-adhesive peptide-containing substrate. Note that the cell (CE) may be differentiated to obtain a cell (CE2) different from the original cell (CE). For example, when the original cell (CE) is an undifferentiated bone marrow mesenchymal stem cell and the cell (CE2) is an osteoblast, a chondrocyte, an adipocyte, or the like (Tissue Engineering, Minoru Ueda, Foundation) Nagoya University Press, October 10, 1999).

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜実施例１＞
（１）直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）の作製
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ile Lys Val Ala Val配列（７）と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（２０）とを各々約１３個有し、数平均分子量約１１万のペプチドを遺伝子組換え大腸菌により製造し、カラムクロマトグラフィーにて精製して直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）を得た。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited to this.
<Example 1>
(1) Preparation of linear polypeptide (P1-0) According to the method described in the examples in JP-T-3-502935, Ile Lys Val Ala Val sequence (7) and (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) 9 sequences (20) each having about 13 peptides and a number average molecular weight of about 110,000 peptides were produced by genetically modified E. coli and purified by column chromatography to obtain linear polypeptides (P1-0 )

（２）直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−１）の作製
直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）５０ｍｇと塩酸Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリド１５０ｍｇとを４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１．５ｍＬに溶解した後、その溶液を攪拌しながら、水酸化ナトリウム１００ｍｇを溶解した４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１．３２５ｍＬを一定速度で滴下した。室温（約２５℃）で１時間攪拌したのち、反応液を透析、凍結乾燥して、水溶性の直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−１）を得た。 (2) Preparation of linear polypeptide (P1-1) 50 mg of linear polypeptide (P1-0) and 150 mg of N, N-dimethylaminoethyl chloride hydrochloride were added to 1.5 mL of 4.5 M lithium perchlorate aqueous solution. Then, 1.325 mL of 4.5 M lithium perchlorate aqueous solution in which 100 mg of sodium hydroxide was dissolved was added dropwise at a constant rate while stirring the solution. After stirring at room temperature (about 25 ° C.) for 1 hour, the reaction solution was dialyzed and freeze-dried to obtain a water-soluble linear polypeptide (P1-1).

（３）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）の作製
直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−１）３ｍｇをガラス試験管中で乾燥（１００℃、３０分）した後、脱水ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）２ｍＬに溶解した。さらに、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール２ｍｇを加え、溶解した。細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）からなるペプチドとしてGly Arg Gly Asp Ser配列（６７）からなるペプチド７ｍｇを加え、室温（約２５℃）で２０時間攪拌した。得られた反応溶液を分画分子量１２，０００〜１４，０００の透析膜を用いて、脱イオン水１Ｌに対して２４時間透析した。なお、最初の１２時間は、4時間経過毎に脱イオン水を交換した。次いで、凍結乾燥して本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）を得た。 (3) Production of Cell Adhesive Polypeptide (P1-2) 3 mg of linear polypeptide (P1-1) was dried in a glass test tube (100 ° C., 30 minutes), and then 2 mL of dehydrated DMSO (dimethyl sulfoxide). Dissolved in. Further, 2 mg of N, N′-carbonyldiimidazole was added and dissolved. As a peptide consisting of the cell adhesion minimal amino acid sequence (X2), 7 mg of a peptide consisting of the Gly Arg Gly Asp Ser sequence (67) was added and stirred at room temperature (about 25 ° C.) for 20 hours. The obtained reaction solution was dialyzed for 24 hours against 1 L of deionized water using a dialysis membrane having a molecular weight cut off of 12,000 to 14,000. In the first 12 hours, deionized water was changed every 4 hours. Subsequently, it was lyophilized to obtain the cell adhesion polypeptide (P1-2) of the present invention.

（４）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１］の調製
細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）１ｍｇを脱イオン水１ｍＬに溶解し、さらに、９９．５重量％塩化ナトリウムを０．８５重量％含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、ＰＢＳ）で２００倍希釈して、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）溶液Ａ（Ｐ１−２の濃度：５μｇ／ｍＬ）を作製した。この溶液Ａを９６穴のポリスチレンプレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）中の８穴に５０μＬ／穴で投入し、室温（約２５℃）で２時間放置した。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、生理食塩水１００μＬ／穴で２回洗浄しさらに脱イオン水１００μＬ／穴で洗浄して、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１］を得た。 (4) Preparation of Cell Adhesive Polypeptide-Containing Substrate [PB1] 1 mg of cell adhesion polypeptide (P1-2) is dissolved in 1 mL of deionized water, and further, 99.5 wt% sodium chloride is 0.85 wt%. The cell-adhesive polypeptide (P1-2) solution A (P1-2 concentration: 5 μg / mL) was prepared by 200-fold dilution with the contained 0.02 M phosphate buffer (pH 7.2, PBS). This solution A was put into 8 holes in a 96-hole polystyrene plate (Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.) at 50 μL / hole and allowed to stand at room temperature (about 25 ° C.) for 2 hours. After removing the solution using an aspirator, it was washed twice with 100 μL / well of physiological saline and further washed with 100 μL / well of deionized water to obtain the cell-adhesive polypeptide-containing substrate [PB1] of the present invention. .

＜実施例２＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ２−２）の作製
「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）」を、「Ile Lys Val Ala Val配列（７）と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（２０）とを各々約４個有し、数平均分子量約３万５千の直鎖状ポリペプチド（Ｐ２−０）｛実施例１と同様にして調製した｝」に変更したこと以外、実施例１と同様にして本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ２−２）を得た。 <Example 2>
(1) Preparation of Cell Adhesive Polypeptide (P2-2) “Linear Polypeptide (P1-0)” is converted into “Ile Lys Val Ala Val Sequence (7) and (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) 9 Sequence” (20) and a linear polypeptide (P2-0) having a number average molecular weight of about 35,000 (prepared in the same manner as in Example 1). In the same manner as in Example 1, the cell adhesion polypeptide (P2-2) of the present invention was obtained.

（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ２］の調製
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ２−２）」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ２］を得た。 (2) Preparation of Cell Adhesive Polypeptide-Containing Substrate [PB2] Same as Example 1 except that “Cell Adhesive Polypeptide (P1-2)” is changed to “Cell Adhesive Polypeptide (P2-2)” Thus, the cell-adhesive polypeptide-containing substrate [PB2] of the present invention was obtained.

＜実施例３＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ３−２）の作製
「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）」を、「Ile Lys Val Ala Val配列（７）と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（１９）とを各々約５個有し、数平均分子量約２万の直鎖状ポリペプチド（Ｐ３−０）｛実施例１と同様にして調製した｝」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ３−２）を得た。 <Example 3>
(1) Production of Cell Adhesive Polypeptide (P3-2) “Linear Polypeptide (P1-0)” is converted into “Ile Lys Val Ala Val Sequence (7) and (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) 3 Sequence” (19) and about 1 each except that the linear polypeptide (P3-0) {prepared in the same manner as in Example 1} having a number average molecular weight of about 20,000 Similarly, the cell adhesion polypeptide (P3-2) of the present invention was obtained.

（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ３］の調製
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ３−２）」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ３］を得た。 (2) Preparation of Cell Adhesive Polypeptide-Containing Substrate [PB3] Same as Example 1 except that “Cell Adhesive Polypeptide (P1-2)” was changed to “Cell Adhesive Polypeptide (P3-2)” Thus, the cell adhesion polypeptide-containing substrate [PB3] of the present invention was obtained.

＜実施例４＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ４−２）の作製
「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）」を、「Ile Lys Val Ala Val配列（７）と（Gly Val Pro Gly Val）2 Gly Gly （Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（３７）とを各々約３個有し、数平均分子量約１万の直鎖状ポリペプチド（Ｐ４−０）｛実施例１と同様にして調製した｝」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ４−２）を得た。 <Example 4>
(1) Production of Cell Adhesive Polypeptide (P4-2) “Linear Polypeptide (P1-0)” is synthesized from “Ile Lys Val Ala Val Sequence (7) and (Gly Val Pro Gly Val) 2 Gly Gly (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) Linear polypeptide (P4-0) {prepared in the same manner as Example 1} having about 3 each of 3 sequences (37) and a number average molecular weight of about 10,000 The cell adhesion polypeptide (P4-2) of the present invention was obtained in the same manner as in Example 1 except that the above was changed.

（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ４］の調製
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ４−２）」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ４］を得た。 (2) Preparation of Cell Adhesive Polypeptide-Containing Substrate [PB4] Same as Example 1 except that “Cell Adhesive Polypeptide (P1-2)” was changed to “Cell Adhesive Polypeptide (P4-2)” Thus, the cell-adhesive polypeptide-containing substrate [PB4] of the present invention was obtained.

＜実施例５＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ５−２）の作製
「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）」を、「Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）９配列（２０）とを各々約１３個有し、数平均分子量約１１万の直鎖状ポリペプチド（Ｐ５−０）｛実施例１と同様にして調製した｝」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ５−２）を得た。 <Example 5>
(1) Production of Cell Adhesive Polypeptide (P5-2) “Linear Polypeptide (P1-0)” is composed of “Tyr Ile Gly Ser Arg Sequence (2) and (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) 9 Sequence” And (20) each having about 13 and a number average molecular weight of about 110,000 linear polypeptide (P5-0) {prepared in the same manner as in Example 1} " Similarly, the cell adhesion polypeptide (P5-2) of the present invention was obtained.

（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ５］の調製
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ５−２）」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ５］を得た。 (2) Preparation of Cell Adhesive Polypeptide-Containing Substrate [PB5] Same as Example 1 except that “Cell Adhesive Polypeptide (P1-2)” was changed to “Cell Adhesive Polypeptide (P5-2)” Thus, the cell-adhesive polypeptide-containing substrate [PB5] of the present invention was obtained.

＜実施例６＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ６−２）の作製
「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）」を、「Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（１９）とを各々約５個有し、数平均分子量約２万の直鎖状ポリペプチド（Ｐ６−０）｛実施例と同様にして調製した｝」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ６−２）を得た。 <Example 6>
(1) Production of Cell Adhesive Polypeptide (P6-2) “Linear Polypeptide (P1-0)” is divided into “Tyr Ile Gly Ser Arg Sequence (2) and (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) 3 Sequence” (19) each having about 5 and a number average molecular weight of about 20,000 linear polypeptide (P6-0) {prepared in the same manner as in Example} " Thus, the cell adhesion polypeptide (P6-2) of the present invention was obtained.

（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ６］の調製
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ６−２）」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ６］を得た。 (2) Preparation of Cell Adhesive Polypeptide-Containing Substrate [PB6] Same as Example 1 except that “Cell Adhesive Polypeptide (P1-2)” was changed to “Cell Adhesive Polypeptide (P6-2)” Thus, the cell-adhesive polypeptide-containing substrate [PB6] of the present invention was obtained.

＜実施例７＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ７−２）の作製
「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）」を、「Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）と（Gly Val Pro Gly Val）2 Gly Gly （Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（３７）とを各々約３個有し、数平均分子量約１万の直鎖状ポリペプチド（Ｐ７−０）｛実施例１と同様にして調製した｝」に変更した以外は実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ７−２）を得た。 <Example 7>
(1) Preparation of Cell Adhesive Polypeptide (P7-2) “Linear Polypeptide (P1-0)” is converted into “Tyr Ile Gly Ser Arg Sequence (2) and (Gly Val Pro Gly Val) 2 Gly Gly (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) Linear polypeptide (P7-0) {prepared in the same manner as in Example 1} having about 3 each of 3 sequences (37) and a number average molecular weight of about 10,000 The cell adhesive polypeptide (P7-2) of the present invention was obtained in the same manner as in Example 1 except that the above was changed.

（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ７］の調製
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ７−２）」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ７］を得た。 (2) Preparation of Cell Adhesive Polypeptide-Containing Substrate [PB7] Same as Example 1 except that “Cell Adhesive Polypeptide (P1-2)” was changed to “Cell Adhesive Polypeptide (P7-2)” Thus, the cell adhesion polypeptide-containing substrate [PB7] of the present invention was obtained.

＜実施例８＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ８−２）の作製
「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）」を、「Arg Gly Asp配列と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）９配列（２０）とを各々約１３個有し、数平均分子量約１１万の直鎖状ポリペプチド（Ｐ８−０）｛実施例１と同様にして調製した｝」に変更したこと、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）として、「Gly Arg Gly Asp Ser配列（１１１）」を「Ser Ile Lys Val Ala Val配列（７３）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ８−２）を得た。 <Example 8>
(1) Production of Cell Adhesive Polypeptide (P8-2) “Linear Polypeptide (P1-0)” is obtained by combining “Arg Gly Asp Sequence and (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) 9 Sequence (20)”. A linear polypeptide (P8-0) {prepared in the same manner as in Example 1} having a number average molecular weight of about 110,000 and having about 13 each, cell adhesion minimal amino acid sequence (X2) As described in Example 1, except that “Gly Arg Gly Asp Ser sequence (111)” was changed to “Ser Ile Lys Val Ala Val sequence (73)”, the cell adhesion polypeptide (P8- 2) was obtained.

（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ８］の調製
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ８−２）」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ８］を得た。 (2) Preparation of Cell Adhesive Polypeptide-Containing Substrate [PB8] Same as Example 1 except that “Cell Adhesive Polypeptide (P1-2)” was changed to “Cell Adhesive Polypeptide (P8-2)” Thus, the cell-adhesive polypeptide-containing substrate [PB8] of the present invention was obtained.

＜実施例９＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ９−２）の作製
「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）」を、「Arg Gly Asp配列と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（１９）とを各々約５個有し、数平均分子量約２万のペプチド（Ｐ９−０）｛実施例１と同様にして調製した｝」に変更したこと、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）として、「Gly Arg Gly Asp Ser配列（１１１）」を「Ser Ile Lys Val Ala Val配列（７３）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ９−２）を得た。 <Example 9>
(1) Production of Cell Adhesive Polypeptide (P9-2) “Linear Polypeptide (P1-0)” was prepared by combining “Arg Gly Asp Sequence and (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) 3 Sequence (19)”. It was changed to “Peptide (P9-0) {prepared in the same manner as Example 1}” having about 5 each and a number average molecular weight of about 20,000, and as the cell adhesion minimal amino acid sequence (X2), “Gly A cell adhesion polypeptide (P9-2) of the present invention was obtained in the same manner as in Example 1 except that “Arg Gly Asp Ser sequence (111)” was changed to “Ser Ile Lys Val Ala Val sequence (73)”. It was.

（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ９］の調製
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ９−２）」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ９］を得た。 (2) Preparation of Cell Adhesive Polypeptide-Containing Substrate [PB9] Same as Example 1 except that “Cell Adhesive Polypeptide (P1-2)” was changed to “Cell Adhesive Polypeptide (P9-2)” Thus, the cell adhesion polypeptide-containing substrate [PB9] of the present invention was obtained.

＜実施例１０＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１０−２）の作製
「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）」を、「Arg Gly Asp配列と（Gly Val Pro Gly Val）2 Gly Gly （Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（３７）とを各々約３個有し、数平均分子量約１万の直鎖状ポリペプチド（Ｐ１０−０）｛実施例１と同様にして調製した｝」に変更したこと、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）として、「Gly Arg Gly Asp Ser配列（１１１）」を「Ser Ile Lys Val Ala Val配列（７３）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１０−２）を得た。 <Example 10>
(1) Production of Cell Adhesive Polypeptide (P10-2) “Linear polypeptide (P1-0)” is synthesized with “Arg Gly Asp sequence and (Gly Val Pro Gly Val) 2 Gly Gly (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) 3 sequence (37) each having about 3 and a number average molecular weight of about 10,000 linear polypeptide (P10-0) {prepared in the same manner as in Example 1} In the same manner as in Example 1, except that “Gly Arg Gly Asp Ser sequence (111)” was changed to “Ser Ile Lys Val Ala Val sequence (73)” as the minimum cell adhesion amino acid sequence (X2). The cell adhesion polypeptide (P10-2) of the invention was obtained.

（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１０］の調製
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１０−２）」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１０］を得た。 (2) Preparation of Cell Adhesive Polypeptide-Containing Substrate [PB10] Same as Example 1 except that “Cell Adhesive Polypeptide (P1-2)” was changed to “Cell Adhesive Polypeptide (P10-2)” Thus, the cell-adhesive polypeptide-containing substrate [PB10] of the present invention was obtained.

＜比較例１＞
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−１）」に変更した以外、実施例１（４）と同様にして、比較用の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１１］を得た。 <Comparative Example 1>
Cell adhesive polypeptide-containing group for comparison in the same manner as in Example 1 (4) except that “cell adhesion polypeptide (P1-2)” was changed to “linear polypeptide (P1-1)” A material [PB11] was obtained.

＜比較例２＞
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「直鎖状ポリペプチド（Ｐ４−１）」に変更した以外、実施例１（４）と同様にして、比較用の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１２］を得た。 <Comparative example 2>
Cell adhesive polypeptide-containing group for comparison in the same manner as in Example 1 (4) except that “cell adhesion polypeptide (P1-2)” was changed to “linear polypeptide (P4-1)” A material [PB12] was obtained.

＜比較例３＞
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「直鎖状ポリペプチド（Ｐ７−１）」に変更した以外、実施例１（４）と同様にして、比較用の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１３］を得た。 <Comparative Example 3>
Cell adhesive polypeptide-containing group for comparison in the same manner as in Example 1 (4) except that “cell adhesion polypeptide (P1-2)” was changed to “linear polypeptide (P7-1)” A material [PB13] was obtained.

＜比較例４＞
９６穴のポリスチレンプレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）をそのまま比較用の基材［Ｂ１］とした。 <Comparative example 4>
A 96-hole polystyrene plate (Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.) was directly used as a comparative substrate [B1].

＜評価１：ＶＥＲＯ細胞（アフリカミドリザル腎由来細胞）の細胞接着活性＞
（１）ＰＢＳに牛血清アルブミンを０．２重量％含有する水溶液を評価基材に５０μＬ／穴で投入し、２７±３℃で２時間放置した。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、生理食塩水１００μＬ／穴で２回洗浄し、さらに脱イオン水１００μＬ／穴で洗浄した。次に、血清を含まないＤＭＥＭ（ICN Biomedicals社製）を１００μＬ／穴で添加し、３７℃インキュベーター内に１時間保存した。１時間後、ＶＥＲＯ細胞（大日本製薬株式会社製）を１万ｃｅｌｌｓ／穴で添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養した。 <Evaluation 1: Cell adhesion activity of VERO cells (cells derived from African green monkey kidney)>
(1) An aqueous solution containing 0.2% by weight of bovine serum albumin in PBS was added to the evaluation substrate at 50 μL / hole and allowed to stand at 27 ± 3 ° C. for 2 hours. After removing the solution using an aspirator, the plate was washed twice with 100 μL / hole of physiological saline, and further washed with 100 μL / hole of deionized water. Next, DMEM (ICN Biomedicals) without serum was added at 100 μL / well and stored in a 37 ° C. incubator for 1 hour. After 1 hour, VERO cells (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) were added at 10,000 cells / well and left to stand for 2 hours in an incubator at 37 ° C. and a carbon dioxide concentration of 5% by volume.

（２）培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／穴で添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去した。次にＰＢＳを５０μＬ／穴で添加し、さらにテトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／穴で添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。 (2) After completion of the culture, the medium was removed using an aspirator, and physiological saline was added at 100 μL / well, taking care not to directly hit the cells, and the physiological saline was removed using an aspirator. Next, PBS was added at 50 μL / well, and Tetra Color One (Seikagaku Corporation) was added at 10 μL / hole, and left in an incubator with a carbon dioxide concentration of 5% by volume at 37 ° C. for 4 hours.

（３）４時間後に、ホルマザン生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、この値を細胞接着活性とした。細胞接着活性は、当該吸光度の高さに比例する。これらの結果を表１に示す（これらの結果は各々８穴分の平均データである。）。 (3) After 4 hours, the amount of formazan produced was measured using a plate reader (MTP-32 manufactured by Corona Electric Co., Ltd.) at an absorbance of 450 nm (control wavelength 630 nm), and this value was defined as cell adhesion activity. The cell adhesion activity is proportional to the absorbance. These results are shown in Table 1 (these results are average data for 8 holes each).

＜評価２：ＨＴ−１０８０細胞（ヒト繊維肉腫由来細胞）の細胞接着活性＞
（１）ＰＢＳに牛血清アルブミンを０．２重量％含有する水溶液を評価基材に５０μＬ／穴で投入し、２７±３℃で２時間放置した。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、生理食塩水１００μＬ／穴で２回洗浄しさらに脱イオン水１００μＬ／穴で洗浄した。次に、血清を含まないＤＭＥＭ（ICN Biomedicals社製）を１００μＬ／穴で添加し、３７℃インキュベーター内に１時間保存した。１時間後、ＨＴ−１０８０細胞（大日本製薬株式会社製）を１万ｃｅｌｌｓ／穴で添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養した。 <Evaluation 2: Cell adhesion activity of HT-1080 cells (human fibrosarcoma-derived cells)>
(1) An aqueous solution containing 0.2% by weight of bovine serum albumin in PBS was added to the evaluation substrate at 50 μL / hole and allowed to stand at 27 ± 3 ° C. for 2 hours. After removing the solution using an aspirator, it was washed twice with 100 μL / hole of physiological saline and further washed with 100 μL / hole of deionized water. Next, DMEM (ICN Biomedicals) without serum was added at 100 μL / well and stored in a 37 ° C. incubator for 1 hour. One hour later, HT-1080 cells (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) were added at 10,000 cells / well and left to stand for 2 hours in an incubator at 37 ° C. and a carbon dioxide concentration of 5% by volume.

（２）培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／穴で添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去した。次にＰＢＳを５０μＬ／穴で添加し、さらにテトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／穴で添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。 (2) After completion of the culture, the medium was removed using an aspirator, and physiological saline was added at 100 μL / well, taking care not to directly hit the cells, and the physiological saline was removed using an aspirator. Next, PBS was added at 50 μL / well, and Tetra Color One (Seikagaku Corporation) was added at 10 μL / hole, and left in an incubator with a carbon dioxide concentration of 5% by volume at 37 ° C. for 4 hours.

（３）４時間後に、ホルマザン生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、この値を細胞接着活性とした。細胞接着活性は、当該吸光度の高さに比例する。これらの結果を表２に示す（これらの結果は各々８穴分の平均データである。）。 (3) After 4 hours, the amount of formazan produced was measured using a plate reader (MTP-32 manufactured by Corona Electric Co., Ltd.) at an absorbance of 450 nm (control wavelength 630 nm), and this value was defined as cell adhesion activity. The cell adhesion activity is proportional to the absorbance. These results are shown in Table 2 (these results are average data for 8 holes each).

＜実施例１１＞
（１）ポリウレタンフィルム（ＵＦ）の準備
ウレタンエマルション（商品名：パーマリンＵＡ２００、三洋化成工業株式会社製）６．６７ｇとイオン交換水３．３３ｇとを混合して、ウレタンエマルションを調製した。このウレタンエマルションを、縦２０ｃｍ×横２０ｃｍの剥離紙（ＥＶ１３０ＴＰＤ；リンテック株式会社製）上に均一に広げ、膜厚が３００μｍになるように、両端に３００μｍの高さにビニールテープを巻いたガラス棒を用いてキャストした後、室温（約２５℃）に放置した。室温放置２４時間後に、循風乾燥機中で１２０℃、１時間乾燥した。乾燥後、剥離紙上に形成されたフィルムを、剥離紙から剥離し、この中央部から１０ｃｍ×１０ｃｍの大きさを切り出して、ポリウレタンフィルム（ＵＦ）を得た。 <Example 11>
(1) Preparation of polyurethane film (UF) 6.67 g of urethane emulsion (trade name: Permarin UA200, manufactured by Sanyo Chemical Industries, Ltd.) and 3.33 g of ion-exchanged water were mixed to prepare a urethane emulsion. This urethane emulsion is uniformly spread on release paper (EV130TPD; manufactured by Lintec Co., Ltd.) having a length of 20 cm and a width of 20 cm, and a glass rod wound with vinyl tape at a height of 300 μm at both ends so that the film thickness becomes 300 μm. And then left at room temperature (about 25 ° C.). After 24 hours of standing at room temperature, the film was dried in a circulating dryer at 120 ° C. for 1 hour. After drying, the film formed on the release paper was peeled off from the release paper, and a size of 10 cm × 10 cm was cut out from the center to obtain a polyurethane film (UF).

（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１４］の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）の水溶液｛（Ｐ１−２）の濃度：５μｇ／ｍＬ｝５０ｍＬをガラスシャーレ(直径１５０ｍｍ)に投入し、この水溶液中にポリウレタンフィルム（ＵＦ）を浸漬させ、２５℃で１時間静置することにより、ポリウレタンフィルム（ＵＦ）に細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）を物理吸着させた。その後、１００ｍＬのイオン交換水で５回洗浄し、３７℃の循風乾燥機の中で１２時間乾燥させ、細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１４］を調製した。 (2) Preparation of Cell Adhesive Polypeptide-Containing Substrate [PB14] Aqueous solution of cell adhesive polypeptide (P1-2) {(P1-2) concentration: 5 μg / mL} 50 mL in a glass petri dish (diameter 150 mm) The polyurethane film (UF) was immersed in this aqueous solution and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour, whereby the cell adhesion polypeptide (P1-2) was physically adsorbed on the polyurethane film (UF). Then, it wash | cleaned 5 times with 100 mL ion-exchange water, and it was made to dry in a 37 degreeC circulating drier for 12 hours, and prepared cell-adhesive polypeptide containing base material [PB14].

＜実施例１２＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−ＡＭ１）の作製
直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−１）３ｍｇをガラス試験管中で乾燥（１００℃、３０分）した後、脱水ＤＭＳＯ２ｍＬに溶解し、さらに、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール２ｍｇを加え、溶解した後、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）からなるペプチドとしてGly Arg Gly Asp Ser配列（６７）からなるペプチド７ｍｇと、アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）としてポリエチレンイミン（数平均分子量４２３）１３ｍｇを加え、室温（約２５℃）で２０時間攪拌した。得られた反応溶液を分画分子量１２，０００〜１４，０００の透析膜を用いて、脱イオン水１Ｌに対して２４時間透析した。なお、最初の１２時間は、4時間経過毎に脱イオン水を交換した。次いで、透析液を凍結乾燥して本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−ＡＭ１）を得た。 <Example 12>
(1) Preparation of cell adhesion polypeptide (P1-AM1) 3 mg of linear polypeptide (P1-1) was dried in a glass test tube (100 ° C., 30 minutes), dissolved in 2 mL of dehydrated DMSO, and 2 mg of N, N′-carbonyldiimidazole, dissolved, 7 mg of a peptide consisting of the Gly Arg Gly Asp Ser sequence (67) as a peptide consisting of the cell adhesion minimal amino acid sequence (X2), an amino group and / or 13 mg of polyethyleneimine (number average molecular weight 423) was added as a compound (AM) containing an ammonio group, and the mixture was stirred at room temperature (about 25 ° C.) for 20 hours. The obtained reaction solution was dialyzed for 24 hours against 1 L of deionized water using a dialysis membrane having a molecular weight cut off of 12,000 to 14,000. In the first 12 hours, deionized water was changed every 4 hours. Subsequently, the dialysate was freeze-dried to obtain the cell adhesion polypeptide (P1-AM1) of the present invention.

（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１５］の調製
「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−ＡＭ１）」に変更した以外、実施例１１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１５］を得た。 (2) Preparation of Cell Adhesive Polypeptide-Containing Substrate [PB15] Example 11 was prepared except that “cell adhesive polypeptide (P1-2)” was changed to “cell adhesive polypeptide (P1-AM1)”. Similarly, the cell adhesive polypeptide-containing substrate [PB15] of the present invention was obtained.

＜実施例１３＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−ＡＭ２）の作製
「ポリエチレンイミン（数平均分子量４２３）１３ｍｇ」を「ポリエチレンイミン（数平均分子量６００）１８ｍｇ」に変更した以外、実施例１２（１）と同様にして、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−ＡＭ２）を得た。 <Example 13>
(1) Production of Cell Adhesive Polypeptide (P1-AM2) Example 12 (1) except that “polyethyleneimine (number average molecular weight 423) 13 mg” was changed to “polyethyleneimine (number average molecular weight 600) 18 mg” Similarly, a cell adhesion polypeptide (P1-AM2) was obtained.

（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１６］の調製
「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−ＡＭ２）」に変更した以外、実施例１１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１６］を得た。 (2) Preparation of Cell Adhesive Polypeptide-Containing Substrate [PB16] Example 11 was prepared except that “cell adhesive polypeptide (P1-2)” was changed to “cell adhesive polypeptide (P1-AM2)”. Similarly, the cell adhesion polypeptide containing base material [PB16] of this invention was obtained.

＜実施例１４＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−ＡＭ３）の作製
「ポリエチレンイミン（数平均分子量４２３）１３ｍｇ」を「ポリエチレンイミン（数平均分子量１８００）５３ｍｇ」に変更した以外、実施例１２（１）と同様にして、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−ＡＭ３）を得た。 <Example 14>
(1) Production of Cell Adhesive Polypeptide (P1-AM3) Example 12 (1) except that “polyethyleneimine (number average molecular weight 423) 13 mg” was changed to “polyethyleneimine (number average molecular weight 1800) 53 mg” Similarly, a cell adhesion polypeptide (P1-AM3) was obtained.

（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１７］の調製
「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−ＡＭ３）」に変更した以外、実施例１１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１７］を得た。 (2) Preparation of Cell Adhesive Polypeptide-Containing Substrate [PB17] Example 11 was prepared except that “cell adhesive polypeptide (P1-2)” was changed to “cell adhesive polypeptide (P1-AM3)”. In the same manner, the cell adhesion polypeptide-containing substrate [PB17] of the present invention was obtained.

＜比較例５＞
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−１）」に変更した以外、実施例１１と同様にして、比較用の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１８］を得た。 <Comparative Example 5>
A cell-adhesive polypeptide-containing substrate for comparison [PB18] in the same manner as in Example 11, except that “cell adhesion polypeptide (P1-2)” was changed to “linear polypeptide (P1-1)”. ] Was obtained.

＜評価３：ＮＨＤＦ細胞（正常ヒト表皮角化細胞）の細胞接着活性＞
実施例１１〜１４、比較例５の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１４］〜［ＰＢ１８］を各々直径１．２ｃｍの大きさに切り取ったものを、クリーンベンチ中で表裏各１時間づつＵＶ照射を行い、滅菌した。なお、１種類の細胞接着性ポリペプチド含有基材につき、６枚用意し、各基材について６回ずつ評価を繰り返した。
また、正常ヒト皮膚繊維芽細胞増殖用低血清培地（倉敷紡績株式会社製）１０ｍＬ中で正常ヒト皮膚線維芽細胞（倉敷紡績株式会社製）を５日間プレ培養して得た正常ヒト皮膚線維芽細胞を１．５万個／穴の割合で２４穴ポリスチレンプレート（ベクトンディッキンソン社製；２枚使用した）の各穴に置いたコラーゲンタイプＩゲル（商品名：セルマトリックス、新田ゼラチン社製）に播種した後、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のインキュベーター中にて７日間の細胞培養を行い、培養真皮モデルを作成した。 <Evaluation 3: Cell adhesion activity of NHDF cells (normal human epidermal keratinocytes)>
The cell adhesive polypeptide-containing bases [PB14] to [PB18] of Examples 11 to 14 and Comparative Example 5 were cut to a size of 1.2 cm in diameter, and UV for 1 hour on each side in a clean bench. Irradiated and sterilized. In addition, 6 sheets were prepared for each type of cell adhesive polypeptide-containing substrate, and evaluation was repeated 6 times for each substrate.
In addition, normal human skin fibroblasts obtained by pre-culturing normal human skin fibroblasts (manufactured by Kurashiki Boseki Co., Ltd.) for 5 days in 10 mL of a low serum medium for proliferation of normal human skin fibroblasts (Kurashiki Boseki Co., Ltd.) Collagen type I gel (trade name: Cell Matrix, manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.) in which cells were placed in each hole of a 24-well polystyrene plate (Becton Dickinson Co., Ltd .; two used) at a rate of 15,000 cells / hole Then, cell culture was performed for 7 days in an incubator with a carbon dioxide gas concentration of 5% by volume at 37 ° C. to prepare a cultured dermis model.

引き続き、培養真皮モデルを、無血清表皮角化細胞増殖用培地（倉敷紡績株式会社製）を各穴１５０μＬ入れた別の２４穴ポリスチレンプレートに移した後、培養真皮モデルの上面中央部に、正常ヒト表皮角化細胞（倉敷紡績株式会社製）３μＬを播種し、さらに播種した正常ヒト表皮角化細胞上に予め滅菌しておいた細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１４］〜［ＰＢ１８］を貼りつけた。貼りつけは、接着剤等は用いず、正常ヒト表皮角化細胞を播種した培養真皮モデルと細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１４］〜［ＰＢ１８］が接するように、正常ヒト表皮角化細胞を播種した培養真皮上にピンセットを用いて細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１４］〜［ＰＢ１８］を置いた。
細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１４］〜［ＰＢ１８］を貼りつけた培養真皮モデルは再び３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のインキュベーターに戻し、さらに７日間培養を行った。 Subsequently, the cultured dermis model was transferred to another 24-well polystyrene plate containing 150 μL of serum-free epidermal keratinocyte growth medium (Kurashiki Boseki Co., Ltd.) and then normal in the center of the upper surface of the cultured dermis model. Cell-adhesive polypeptide-containing substrates [PB14] to [PB18] previously seeded on normal human epidermal keratinocytes seeded with 3 μL of human epidermal keratinocytes (Kurashiki Boseki Co., Ltd.) Pasted. The normal human epidermal keratinocytes are attached so that the cultured dermis model seeded with normal human epidermal keratinocytes and the cell-adhesive polypeptide-containing substrates [PB14] to [PB18] are in contact without using an adhesive or the like. The cell-adhesive polypeptide-containing substrates [PB14] to [PB18] were placed on the cultured dermis seeded with a tweezer.
The cultured dermis model to which the cell-adhesive polypeptide-containing substrates [PB14] to [PB18] were attached was returned to an incubator with a temperature of 37 ° C. and a carbon dioxide gas concentration of 5% by volume, and further cultured for 7 days.

培養７日後に、細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１４］〜［ＰＢ１８］を培養真皮の上面から各々剥がし、新しい２４穴ポリスチレンプレートに、剥がした細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１４］〜［ＰＢ１８］を１枚／穴で投入した後、各穴へ、塩化ナトリウムを０．８５重量％で含有するリン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．２）１２５μＬ及びテトラカラーワン（生化学工業社製）２５μＬを投入し、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のインキュベーター中にて４時間インキュベートした。   After 7 days of culture, the cell-adhesive polypeptide-containing substrate [PB14] to [PB18] were peeled off from the upper surface of the cultured dermis, and the peeled cell-adhesive polypeptide-containing substrate [PB14] to a new 24-hole polystyrene plate. After putting [PB18] at 1 plate / hole, 125 μL of phosphate buffer solution (0.02M, pH 7.2) containing 0.85% by weight of sodium chloride and Tetra Color One (Seikagaku Corporation) 25 μL) was added and incubated in an incubator at 37 ° C. and a carbon dioxide gas concentration of 5% by volume for 4 hours.

次いで、インキュベートした２４穴プレートの各穴から６０μＬの液を抜き出し、液中のホルマザン生成量を、各々１穴について２回測定した｛４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度；プレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）｝。
各細胞接着性ポリペプチド含有基材について、１２個のデータ（６枚×２回）の平均値を算出し、この平均値を、細胞接着性ポリペプチド含有基材表面に付着している細胞の細胞接着活性とした。これらの数値を表３に示した。なお、細胞接着活性は吸光度の高さに比例する。 Next, 60 μL of the liquid was extracted from each well of the incubated 24-well plate, and the amount of formazan produced in the liquid was measured twice for each well {absorbance at 450 nm (control wavelength 630 nm); plate reader (Corona Electric Co., Ltd.) MTP-32)}.
For each cell-adhesive polypeptide-containing substrate, an average value of 12 data (6 sheets × 2 times) was calculated, and this average value was calculated for the cells attached to the cell-adhesive polypeptide-containing substrate surface. Cell adhesion activity was defined. These numerical values are shown in Table 3. Cell adhesion activity is proportional to the height of absorbance.

表１及び表２の結果から、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材は、比較用の基材に比べて、細胞接着性（細胞の接着活性）が極めて高かった。また、表３の結果から、アミノ基含有化合物を有することでさらに細胞接着性が高くなった。   From the results of Tables 1 and 2, the cell adhesive polypeptide-containing substrate of the present invention was extremely high in cell adhesiveness (cell adhesive activity) compared to the comparative substrate. Moreover, from the results of Table 3, the cell adhesion was further enhanced by having the amino group-containing compound.

本発明の細胞接着性ポリペプチドは、細胞接着性が極めて高いため、従来は無血清培養条件下において接着が困難であった細胞（ＶＥＲＯ細胞やＨＴ−１０８０細胞等）を基材上に効率良く接着させることができる。したがって、本発明の細胞接着性ポリペプチド、細胞接着性ポリペプチド含有基材及び細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いて細胞培養する工程を含む製造方法は、細胞が関係する、研究開発、有用物質生産及び治療等に極めて有用である。
研究開発用としては、動物実験（毒性試験、刺激性試験及び代謝機能試験等）の代替、遺伝子導入、目的物質（細胞、生理活性物質、遺伝子、有害化学物質及び薬効成分等）のスクリーニング及び細胞の精製や機能解析等に利用できる。
有用物質生産用としては、サイトカイン、血栓溶解剤、血液凝固因子製剤、ワクチン、ホルモン、抗生物質、抗体及び増殖因子等の生産に利用できる。
治療用としては、皮膚、頭蓋骨、筋肉、皮膚組織、骨、軟骨、血管、神経、腱、靭帯、毛胞組織、粘膜組織、歯周組織、象牙質、骨髄、網膜、漿膜、胃腸管及び脂肪等の組織、並びに肺、肝、膵及び腎等の臓器の治療に利用できる。 Since the cell adhesion polypeptide of the present invention has extremely high cell adhesion, cells (VERO cells, HT-1080 cells, etc.) that were conventionally difficult to adhere to under serum-free culture conditions can be efficiently used on a substrate. Can be glued. Therefore, the cell adhesion polypeptide of the present invention, the cell adhesion polypeptide-containing substrate, and the production method including the step of culturing cells using the cell adhesion polypeptide-containing substrate are related to cells, research and development, and useful. It is extremely useful for substance production and treatment.
For research and development, substitutes for animal experiments (toxicity tests, irritancy tests, metabolic function tests, etc.), gene transfer, screening of target substances (cells, bioactive substances, genes, harmful chemical substances, medicinal ingredients, etc.) and cells It can be used for purification and functional analysis.
For the production of useful substances, it can be used for the production of cytokines, thrombolytic agents, blood coagulation factor preparations, vaccines, hormones, antibiotics, antibodies and growth factors.
For treatment, skin, skull, muscle, skin tissue, bone, cartilage, blood vessel, nerve, tendon, ligament, follicular tissue, mucosal tissue, periodontal tissue, dentin, bone marrow, retina, serosa, gastrointestinal tract and fat Can be used for treatment of tissues such as lung, liver, pancreas and kidney.

Claims (7)

細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ１）及び補助アミノ酸配列（Ｙ）が交互に化学結合してなる直鎖状ポリペプチド（Ｐ）のＮ末端及びＣ末端以外のアミノ酸残基に細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）が化学結合してなることを特徴とする細胞接着性ポリペプチド。 Cell adhesion minimum amino acid sequence to amino acid residues other than N-terminal and C-terminal of linear polypeptide (P) in which cell adhesion minimum amino acid sequence (X1) and auxiliary amino acid sequence (Y) are alternately chemically bonded A cell adhesive polypeptide, wherein (X2) is chemically bonded. 細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ１、Ｘ２）が、Arg Gly Asp配列、Leu Asp Val配列、Leu Arg Glu配列、His Ala Val配列、Arg Glu Asp Val配列（１）、Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）、Pro Asp Ser Gly Arg配列（３）、Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg配列（４）、Leu Gly Thr Ile Pro Gly配列（５）、Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile配列（６）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）、Asp Gly Glu Ala 配列（８）、Gly Val Lys Gly Asp Lys Gly Asn Pro Gly Trp Pro Gly Ala Pro配列（９）、Gly Glu Phe Tyr Phe Asp Leu Arg Leu Lys Gly Asp Lys配列（１０）、Tyr Lys Leu Asn Val Asn Asp Ser配列（１１）、Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys配列（１２）、Asn Arg Trp His Ser Ile Tyr Ile Thr Arg Phe Gly配列（１３）、Thr Trp Tyr Lys Ile Ala Phe Gln Arg Asn Arg Lys配列（１４）、Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr（１５）、Tyr Thr Ile Thr Ile Arg Gly Val配列（７４）、Pro His Ser Arg Asn配列（７５）、Lys Arg Ser Arg配列（７６）及びPhe His Arg Arg Ile Lys Ala配列（７７）からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の細胞接着性ポリペプチド。 The cell adhesion minimal amino acid sequences (X1, X2) are Arg Gly Asp sequence, Leu Asp Val sequence, Leu Arg Glu sequence, His Ala Val sequence, Arg Glu Asp Val sequence (1), Tyr Ile Gly Ser Arg sequence (2) ), Pro Asp Ser Gly Arg sequence (3), Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg sequence (4), Leu Gly Thr Ile Pro Gly sequence (5), Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile sequence (6), Ile Lys Val Ala Val sequence (7), Asp Gly Glu Ala sequence (8), Gly Val Lys Gly Asp Lys Gly Asn Pro Gly Trp Pro Gly Ala Pro sequence (9), Gly Glu Phe Tyr Phe Asp Leu Arg Leu Lys Gly Asp Lys sequence (10), Tyr Lys Leu Asn Val Asn Asp Ser sequence (11), Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys sequence (12), Asn Arg Trp His Ser Ile Tyr Ile Thr Arg Phe Gly sequence (13 ), Thr Trp Tyr Lys Ile Ala Phe Gln Arg Asn Arg Lys sequence (14), Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr (15), Tyr Thr Ile Thr Ile Arg Gly Val sequence (74), Pro His Ser Arg Asn The cell adhesion polypeptide according to claim 1, which is at least one selected from the group consisting of a sequence (75), a Lys Arg Ser Arg sequence (76), and a Phe His Arg Arg Ile Lys Ala sequence (77). 補助アミノ酸配列（Ｙ）が、（Gly Ala）ａ配列 、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）ｂ配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）ｃ配列、（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）ｄ配列、（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）ｅ配列、｛Asp Gly Gly (Ala)ｆ Gly Gly Ala｝ｇ配列、（Gly Val Pro Gly Val）ｈ配列、（Gly）i、（Ala）j、（Gly Gly Ala）k配列、（Gly Val Gly Val Pro）ｍ配列及び（Gly Pro Pro）ｎ配列からなる群より選ばれる少なくとも１種を有する請求項１又は２に記載の細胞接着性ポリペプチド。
なお、aは５〜１００の整数、b、ｃ、ｄ及びｅは２〜３３の整数、fは１〜１９４の整数、ｇは｛１｝〜｛２００／（６＋ｆ）｝の小数点以下を切り捨てした整数、hは２〜４０の整数、i及びjは１０〜２００の整数、kは３〜６６の整数、ｍは２〜４０の整数、ｎは３〜６６の整数である。 The auxiliary amino acid sequence (Y) is (Gly Ala) a sequence, (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) b sequence, (Gly Ala Gly Ala Gly Tyr) c sequence, (Gly Ala Gly Val Gly Tyr) d sequence, (Gly Ala Gly Tyr Gly Val) e sequence, {Asp Gly Gly (Ala) f Gly Gly Ala} g sequence, (Gly Val Pro Gly Val) h sequence, (Gly) i, (Ala) j, (Gly Gly Ala) k sequence, (Gly Val Gly Val Pro) m sequence and (Gly Pro Pro) The cell adhesion polypeptide according to claim 1 or 2, which has at least one selected from the group consisting of n sequences.
Here, a is an integer of 5 to 100, b, c, d and e are integers of 2 to 33, f is an integer of 1 to 194, and g is truncated to the decimal point of {1} to {200 / (6 + f)}. H is an integer of 2 to 40, i and j are integers of 10 to 200, k is an integer of 3 to 66, m is an integer of 2 to 40, and n is an integer of 3 to 66. 直鎖状ポリペプチド（Ｐ）が遺伝子組換え法によって製造される請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド。 The cell adhesion polypeptide according to any one of claims 1 to 3, wherein the linear polypeptide (P) is produced by a genetic recombination method. アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）でさらに修飾されてなる請求項１〜４のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド。 The cell adhesion polypeptide according to any one of claims 1 to 4, which is further modified with a compound (AM) containing an amino group and / or an ammonio group. 請求項１〜５のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド及び基材（Ｂ）からなる細胞接着性ポリペプチド含有基材。 A cell adhesion polypeptide-containing substrate comprising the cell adhesion polypeptide according to any one of claims 1 to 5 and a substrate (B). 請求項６に記載の細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いて細胞培養する工程を含む細胞の生産方法。 A method for producing cells, comprising a step of culturing cells using the cell-adhesive polypeptide-containing substrate according to claim 6.
JP2006170069A 2005-07-22 2006-06-20 Cell adhesive polypeptide Pending JP2007051127A (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006170069A JP2007051127A (en) 2005-07-22 2006-06-20 Cell adhesive polypeptide

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005212252 2005-07-22
JP2006170069A JP2007051127A (en) 2005-07-22 2006-06-20 Cell adhesive polypeptide

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2007051127A true JP2007051127A (en) 2007-03-01

Family

ID=37915819

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006170069A Pending JP2007051127A (en) 2005-07-22 2006-06-20 Cell adhesive polypeptide

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2007051127A (en)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012060351A1 (en) 2010-11-04 2012-05-10 三洋化成工業株式会社 Cell adhesive material for biological tissue
JP2012126707A (en) * 2010-11-04 2012-07-05 Sanyo Chem Ind Ltd Chemically modified cell-adhesive polypeptide
JP2014117268A (en) * 2012-12-19 2014-06-30 Kyoto Institute Of Technology Coating of culture surface using modifying polypeptide
KR101865451B1 (en) * 2015-08-26 2018-07-13 윤원준 Protein adhesive for providing adhesion to or coating for surface of inorganic materials
JP2018143211A (en) * 2017-03-09 2018-09-20 三洋化成工業株式会社 Cell culture substrate, cell production method and cell culture kit

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012060351A1 (en) 2010-11-04 2012-05-10 三洋化成工業株式会社 Cell adhesive material for biological tissue
JP2012126707A (en) * 2010-11-04 2012-07-05 Sanyo Chem Ind Ltd Chemically modified cell-adhesive polypeptide
US9463262B2 (en) 2010-11-04 2016-10-11 Sanyo Chemical Industries, Ltd. Cell adhesive material for biological tissue
JP2014117268A (en) * 2012-12-19 2014-06-30 Kyoto Institute Of Technology Coating of culture surface using modifying polypeptide
KR101865451B1 (en) * 2015-08-26 2018-07-13 윤원준 Protein adhesive for providing adhesion to or coating for surface of inorganic materials
JP2018143211A (en) * 2017-03-09 2018-09-20 三洋化成工業株式会社 Cell culture substrate, cell production method and cell culture kit

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lee et al. Collagen mimetic peptide-conjugated photopolymerizable PEG hydrogel
Cai et al. One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides
Ranga et al. Hyaluronic acid hydrogels formed in situ by transglutaminase-catalyzed reaction
CN105189532B (en) Self-assembled ultrashort peptide hydrogels for wound healing, skin care and cosmetic applications
Anderson et al. Modulating the gelation properties of self-assembling peptide amphiphiles
JP5025059B2 (en) Formulation for introducing nucleic acid into cells
US20150367028A1 (en) Amphiphilic linear peptide/peptoid and hydrogel comprising the same
US7074615B2 (en) Peptides for enhanced cell attachment and cell growth
Dai et al. Fibroblast aggregation by suspension with conjugates of poly (ethylene glycol) and RGD
JP2007051127A (en) Cell adhesive polypeptide
Lee et al. Engineered phage matrix stiffness-modulating osteogenic differentiation
JP5000439B2 (en) Cell culture carrier
JP5847418B2 (en) Cell adhesion protein
Trossmann et al. Design of recombinant spider silk proteins for cell type specific binding
JP6077316B2 (en) Tissue regeneration material and tissue regeneration protein solution
US9932369B2 (en) Thermosensitive, bioactive biopolymer and associated method of cell harvesting
JP2012131757A (en) High-strength peptide gel
JP5860268B2 (en) Chemically modified cell adhesion polypeptide
JP2005263631A (en) Cell adhesion polypeptide
JP4705319B2 (en) Wound dressing
JP4493327B2 (en) Cell adhesion polypeptide
CN101829367B (en) Three-dimensional nano stent of gene delivery system, preparation method and application thereof
JP4510512B2 (en) Cell adhesion polypeptide
Favella et al. Diffusion-controlled release of the theranostic protein-photosensitizer Azulitox from composite of Fmoc-Phenylalanine Fibrils encapsulated with BSA hydrogels
JP2011030453A (en) Method for producing cell