JP3511399B2 - Cell culture substrate and cell culture method - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、少なくとも表面が、特
定の高分子電解質錯体からなる細胞培養基材及び該基材
を用いる細胞培養方法に関する。更には、少なくとも表
面が、特定の高分子電解質錯体からなり、接着増殖性細
胞を無血清で培養するための細胞培養基材及び該基材を
用いる接着増殖性細胞の無血清培養方法にも関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a cell culture substrate having at least a surface made of a specific polyelectrolyte complex and a cell culture method using the substrate. Furthermore, the present invention relates to a cell culture substrate for culturing adherent-proliferating cells in the serum-free, which comprises at least the surface of a specific polyelectrolyte complex, and a serum-free culture method of the adherent-proliferating cells using the substrate. .

【０００２】[0002]

【従来の技術】細胞培養は、生理学、生化学、分子生物
学又は遺伝学等の研究を行う上で重要な実験手段であ
り、多くの研究機関等で日常的に行われている。また、
近年はワクチンの製造やインターフェロン等のように、
細胞が産生する生理活性物質を効率的且つ大量生成させ
るための研究や実用化が進み、更に、人工臓器等のバイ
オテクノロジー分野の急速な発展に伴い、生体内（ｉｎ
ｖｉｖｏ）の細胞が有する機能を生体外（ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ）で培養した細胞に発現させるための研究等、細
胞培養は多岐に渡って応用されその価値も大きい。2. Description of the Related Art Cell culture is an important experimental means for conducting research on physiology, biochemistry, molecular biology, genetics and the like, and is routinely carried out at many research institutions. Also,
In recent years, like the manufacture of vaccines and interferon,
With the progress of research and practical application for efficient and large-scale production of physiologically active substances produced by cells, and with rapid development of biotechnology fields such as artificial organs, in vivo (in
The function of a cell in vivo is determined in vitro.
Cell culture is applied in various ways, such as research for expressing it in cells cultured in tro), and its value is great.

【０００３】上記のように細胞培養の応用分野は広範で
あり、従来からそれぞれの分野に適した細胞培養基材
（担体）や培養方法について多数検討されている。継代
培養等の少量の細胞を扱う実験室レベルでは、合成高分
子やガラスからなるディッシュ型、フラスコ型、プレー
ト型等の培養容器が一般的に用いられている。また、生
理活性物質を大量に生成させるために細胞を大量に扱う
工業レベルでは、合成又は天然高分子、多糖類、金属、
無機質等からなるビーズ、多孔性粒子などのマイクロキ
ャリア、フィルム、中空糸等を基材として用い、より高
密度な培養が行われている。この場合、動物細胞、とり
わけ接着増殖性動物細胞を培養するには、細胞が適当な
基材に固定（接着）されていることが必須で、前記のよ
うな基材表面と細胞の接着性が良好であることと共に、
接着した細胞の形態や配列が、細胞の伸展や増殖に有効
な形態や配列となっていることが重要である。多くの動
物細胞は、最初にある適切な基質に接着し、***を始め
たり単層になったりする前に、まず伸展しなくてはなら
ないことから、以前より培養に用いられる培地と、基質
である基材の両面から検討が行われてきた。As described above, the field of application of cell culture is wide-ranging, and many cell culture substrates (carriers) and culture methods suitable for each field have been studied. At the laboratory level handling a small amount of cells such as subculture, culture vessels such as dish type, flask type, plate type, etc. made of synthetic polymer or glass are generally used. At the industrial level, where a large amount of cells are used to produce a large amount of physiologically active substances, synthetic or natural polymers, polysaccharides, metals,
Higher-density culture is performed using beads made of inorganic material, microcarriers such as porous particles, films, hollow fibers, etc. as a substrate. In this case, in order to culture animal cells, particularly adherent-proliferating animal cells, it is essential that the cells are fixed (adhered) to an appropriate base material, and the adhesiveness between the base material surface and the cells as described above is required. Along with being good
It is important that the morphology and arrangement of the adhered cells be a shape and arrangement effective for cell spreading and proliferation. Many animal cells first adhere to a suitable substrate and must first spread before they can begin to divide or become monolayers, so the medium and substrate used for culture are more Studies have been undertaken from both sides of a substrate.

【０００４】多くの細胞培養基材は、シリコーンコート
処理やプラズマ処理等により表面電荷をマイナスにして
いるが、これでは細胞の接着が不十分であり、細胞は生
存・増殖はするものの急速に脱分化して機能を失う場合
がほとんどである。そこで、基材表面をバイオマトリッ
クスでコートする方法がとられるようになった。例え
ば、ポリ−Ｄ−リジンのような正電荷ポリマーでコート
する方法（Method in Enzymology, Vol.53,1979 ）、接
着因子であるコラーゲン、フィブロネクチンやビトロネ
クチンをコートする方法等である。しかし、ポリリジン
は細胞毒を有すること、コラーゲン、フィブロネクチン
やビトロネクチン自体が生体成分であるため高価であ
り、また製品の均一性欠如、劣化、剥離又は増殖阻害等
の問題点がある。Many cell culture substrates have a negative surface charge due to silicone coating treatment, plasma treatment, etc. However, this causes insufficient adhesion of cells, so that the cells survive and proliferate but are rapidly removed. Most of the time, they differentiate and lose their functions. Therefore, a method of coating the substrate surface with a biomatrix has come to be adopted. For example, a method of coating with a positively charged polymer such as poly-D-lysine (Method in Enzymology, Vol.53, 1979), a method of coating adhesion factors collagen, fibronectin and vitronectin and the like. However, polylysine is expensive because it has cytotoxicity, and collagen, fibronectin and vitronectin themselves are biological components, and there are problems such as lack of uniformity of products, deterioration, peeling or growth inhibition.

【０００５】また、近年は細胞から産生する生理活性物
質を活用するため、大量培養に適した基材も開発されて
いる。例えば、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸
を必須構成単位とした接着性ペプチドを基材表面に共有
結合させたもの（特開平１−３０９６８２号公報、特開
平４−１７３０８６号公報）、基材表面を正に荷電し得
る官能基又はタンパク質を化学的に結合させたもの（特
開平２−１６３０７７号公報、特開平３−４３０７６号
公報）、改質セルロース多孔体をポリアニオン又はその
塩でコーティング、ブレンド又は含浸したもの（特開平
４−９１１４２号公報）等が開発されている。しかし、
基材表面を化学的に処理する方法は煩雑であり、ポリア
ニオンのコートは、不均一性や使用時の剥離等の問題点
が依然として残っている。Further, in recent years, a substrate suitable for mass culture has been developed in order to utilize a physiologically active substance produced from cells. For example, those in which an adhesive peptide containing arginine-glycine-aspartic acid as an essential constituent unit is covalently bonded to the surface of the base material (JP-A-1-309682, JP-A-4-178066), the surface of the base material is positive. With chemically bonded functional groups or proteins that can be charged (JP-A-2-163077 and JP-A-3-43076), and a modified cellulose porous body coated, blended or impregnated with a polyanion or a salt thereof. (Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-91142) and the like have been developed. But,
The method for chemically treating the surface of the substrate is complicated, and the polyanion coating still has problems such as non-uniformity and peeling during use.

【０００６】[0006]

【発明が解決しようとする課題】特に基材表面上に接着
性ペプチドを結合させた基材は、無血清で細胞を接着さ
せることを可能としたものの、完全無血清下での細胞の
増殖性については満足できるものではない。また、接着
性ペプチドの合成や基材表面への導入は煩雑である。細
胞の接着及び増殖にはそれぞれ必要な因子があり、細胞
を培養する際に、それら因子を含有する血清、特には牛
胎児血清を培地に添加することは、細胞の接着及び増殖
の点でも意義がある。しかし、細胞培養において血清を
使用する際の欠点として、初代培養における繊維芽細胞
の増殖過多、血清のロット間による培養状態の変動や再
現性の低下、細胞汚染、血清の毒性、培養産物の精製の
煩雑さ、コスト高等がある。その一方で、無血清培地、
即ち、基本的な栄養培地に、血清の役割を果たすような
種々の増殖因子、つまり細胞に特異的又は非特異的なホ
ルモン、結合タンパク質、接着・伸展因子などをいろい
ろ組合せたものも多く開発されている。しかし、無血清
培地は対象となる個々の細胞に至適なものをそれぞれ選
択する必要があり、また、ホルモンや増殖因子を添加す
ると、血清の使用とコスト的に差はあまりない。In particular, a substrate having an adhesive peptide bonded to the surface of the substrate enables cells to adhere in the absence of serum, but the growth of cells in the complete absence of serum. Is not happy about. Further, the synthesis of the adhesive peptide and the introduction on the surface of the base material are complicated. There are factors necessary for cell adhesion and proliferation, and addition of serum containing these factors, particularly fetal calf serum, to the medium when culturing cells is also significant in terms of cell adhesion and proliferation. There is. However, the disadvantages of using serum in cell culture include hyperproliferation of fibroblasts in primary culture, variation in reproducibility of culture conditions between lots of serum and poor reproducibility, cell contamination, serum toxicity, and purification of culture products. Is complicated and costly. On the other hand, serum-free medium,
That is, many combinations of various growth factors that play a role of serum, that is, various cell-specific or non-specific hormones, binding proteins, adhesion / spreading factors, etc. have been developed in a basic nutrient medium. ing. However, it is necessary to select the optimal serum-free medium for each target cell, and when hormones and growth factors are added, there is not much difference in cost from the use of serum.

【０００７】従って、本発明の目的は、動物細胞、特に
は接着増殖性細胞を培養する際に、血清の不在下で、あ
るいはその使用量を軽減化した条件下で、細胞を接着
し、かつ増殖することができる基材であって、しかもそ
の製法が容易で、細胞毒がない細胞培養基材を提供する
ことにある。Therefore, an object of the present invention is to adhere animal cells, especially adherent-proliferating cells, in the absence of serum or under conditions where the amount used is reduced, and It is an object of the present invention to provide a cell culture substrate that is a substrate that can grow, is easy to produce, and is free of cytotoxins.

【課題を解決するための手段】[Means for Solving the Problems]

【０００８】前記の目的は、本発明により、少なくとも
表面が、（Ｃ）カチオン性高分子電解質としての（ｃ−
１）カチオン性多糖類と、（Ａ）（ａ−１）一般式
（Ｉ）：According to the present invention, the above-mentioned object is to provide (c) as a cationic polyelectrolyte (C) at least on the surface.
1) a cationic polysaccharide, and (A) (a-1) general formula (I):

【化１０】 （式中、Ｒ₁₁は水素原子又は炭素数１〜４個のアルキル
基であり、Ｒ₁₂は炭素数４〜２０個の直鎖若しくは分枝
鎖のアルキル基又はアルケニル基であり、Ｙはカルボン
酸基若しくはその塩、スルホン酸基若しくはその塩、リ
ン酸基若しくはその塩、又は、カルボン酸基若しくはそ
の塩を含有するアリール基、スルホン酸基若しくはその
塩を含有するアリール基、又はリン酸基若しくはその塩
を含有するアリール基であり、ａは２０〜１００であ
り、ｐは１０以上の数、好ましくは１０〜５０００の数
である）で示されるアニオンポリマー及び（ａ−２）ア
ニオン性多糖類からなる群から選択されたアニオン性高
分子電解質とを反応させることによって得られる高分子
電解質錯体により形成されていることを特徴とする、細
胞培養基材によって達成される。また、本発明は、前記
の高分子電解質錯体により形成されている細胞培養基材
を用いることを特徴とする、細胞培養方法にも関する。[Chemical 10] (In the formula, R ₁₁ is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, R ₁₂ is a linear or branched alkyl group or alkenyl group having 4 to 20 carbon atoms, and Y is a carboxyl group. Acid group or salt thereof, sulfonic acid group or salt thereof, phosphoric acid group or salt thereof, or aryl group containing carboxylic acid group or salt thereof, aryl group containing sulfonic acid group or salt thereof, or phosphoric acid group Or an aryl group containing a salt thereof, a is 20 to 100, and p is a number of 10 or more, preferably a number of 10 to 5000) and (a-2) an anionic polymer. A cell culture substrate characterized by being formed by a polyelectrolyte complex obtained by reacting with an anionic polyelectrolyte selected from the group consisting of saccharides. It is made. The present invention also relates to a cell culture method characterized by using a cell culture substrate formed of the above polyelectrolyte complex.

【０００９】更に、本発明は、無血清培地による接着増
殖性細胞用の培養基材であって、少なくとも表面が、
（Ｃ）（ｃ−１）カチオン性多糖類、（ｃ−２）一般式
（II）：Furthermore, the present invention is a culture substrate for adherent and proliferating cells in a serum-free medium, at least the surface of which is
(C) (c-1) cationic polysaccharide, (c-2) general formula (II):

【化１１】 〔式中、Ａは一般式（II−１）：[Chemical 11] [In formula, A is general formula (II-1):

【化１２】 （式中、Ｂは炭素数１又は２個のアルキレン基であり、
Ｒ₂₁、Ｒ₂₂及びＲ₂₃はそれぞれ独立に水素原子又は炭素
数１〜３個のアルキル基であり、Ｘ₁ ^- は対イオンであ
る）で表される基であるか、一般式（II−２）：[Chemical 12] (In the formula, B is an alkylene group having 1 or 2 carbon atoms,
R _21, R ₂₂ and R ₂₃ are each independently a hydrogen atom or a number 1-3 alkyl group having a carbon, X ₁ ^- or is a group represented by a is) counterion, Formula (II- 2):

【化１３】 （式中、Ｒ₂₄は炭素数１〜３個のアルキル基又はベンジ
ル基であり、Ｘ₂ ^- は対イオンである）で表される基で
あるか、又は一般式（II−３）：[Chemical 13] (Wherein, R ₂₄ is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms or a benzyl group, and X ₂ ⁻ is a counter ion), or a group represented by the general formula (II-3):

【化１４】 （式中、Ｒ₂₅は炭素数１又は２個のアルキル基であり、
Ｒ₂₆、Ｒ₂₇及びＲ₂₈はそれぞれ独立に水素原子又は炭素
数１〜３個のアルキル基であり、Ｘ₃ ^- は対イオンであ
る）で表される基であり、ｎは１０以上の数、好ましく
は１０〜１００の数である〕で示される４級アンモニウ
ム塩ポリマー及び（ｃ−３）一般式（III)：[Chemical 14] (In the formula, R ₂₅ is an alkyl group having 1 or 2 carbon atoms,
R ₂₆ , R ₂₇ and R ₂₈ are each independently a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, X ₃ ⁻ is a counter ion), and n is a number of 10 or more. , Preferably a number of 10 to 100] and (c-3) the general formula (III):

【化１５】 〔式中、Ｒ₃₁及びＲ₃₄はそれぞれ独立に炭素数１〜１０
個のアルキレン基、好ましくは炭素数２〜８個の直鎖又
は分枝鎖のアルキレン基、一般式(III−１）：[Chemical 15] [In the formula, R ₃₁ and R ₃₄ each independently have 1 to 10 carbon atoms.
Alkylene groups, preferably linear or branched alkylene groups having 2 to 8 carbon atoms, the general formula (III-1):

【化１６】 （式中、Ｒ₃₇及びＲ₃₈は、それぞれ独立に、炭素数１又
は２個のアルキレン基であり、好ましくはＲ₃₇及びＲ₃₈
はｐ位で結合しているものとする）で表される基又はア
リーレン基であって、Ｒ₃₂、Ｒ₃₃、Ｒ₃₅及びＲ₃₆はそれ
ぞれ独立に炭素数１〜３個のアルキル基であるか、又は
Ｒ₃₁は式中の２個の窒素原子及びＲ₃₂、Ｒ₃₃、Ｒ₃₅及び
Ｒ₃₆と一緒になって式(III−２）：[Chemical 16] (In the formula, R ₃₇ and R ₃₈ are each independently an alkylene group having 1 or 2 carbon atoms, preferably R ₃₇ and R ₃₈
Is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, wherein R ₃₂ , R ₃₃ , R ₃₅ and R ₃₆ are each independently an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms. Or, R ₃₁ together with two nitrogen atoms in the formula and R ₃₂ , R ₃₃ , R ₃₅ and R ₃₆ has the formula (III-2):

【化１７】 （式中、Ｒ₄₁は水素原子又は炭素数１〜３個のアルキル
基である）で表される基であってＲ₃₄は前記と同じ意味
であるものとし、そしてＸ₄ ^- は対イオンであり、ｍは
５以上の数、好ましくは５〜１００の数である〕で示さ
れる４級アンモニウム塩ポリマーからなる群から選択さ
れたカチオン性高分子電解質と、（Ａ）（ａ−１）前記
一般式（Ｉ）で示されるアニオンポリマー及び（ａ−
２）アニオン性多糖類からなる群から選択されたアニオ
ン性高分子電解質とを反応させることによって得られる
高分子電解質錯体により形成されていることを特徴とす
る、無血清培地用の細胞培養基材に関する。[Chemical 17] (Wherein R ₄₁ is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms), R ₃₄ has the same meaning as described above, and X ₄ ⁻ is a counter ion. And m is a number of 5 or more, preferably 5 to 100], a cationic polyelectrolyte selected from the group consisting of quaternary ammonium salt polymers, and (A) (a-1) An anionic polymer represented by the general formula (I) and (a-
2) A cell culture substrate for a serum-free medium, which is formed of a polyelectrolyte complex obtained by reacting with an anionic polyelectrolyte selected from the group consisting of anionic polysaccharides. Regarding

【００１０】また、本発明は、前記の無血清培地用細胞
培養基材を用いて無血清条件下で接着増殖性細胞を培養
することを特徴とする、接着増殖性細胞の培養方法にも
関する。更にまた、本発明は、前記の無血清培地用細胞
培養基材を用いて、少なくとも細胞増殖工程においては
無血清培地を用いることを特徴とする、接着増殖性細胞
の培養方法にも関する。The present invention also relates to a method for culturing adherent-proliferating cells, which comprises culturing adherent-proliferating cells under serum-free conditions using the above-mentioned cell culture substrate for serum-free medium. . Furthermore, the present invention also relates to a method for culturing adherent-proliferating cells, which comprises using the above-mentioned cell culture substrate for serum-free medium and using a serum-free medium at least in the cell growth step.

【００１１】以下、発明を詳細に説明する。本発明に用
いられる高分子電解質錯体（ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌ
ｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ：以下、ＰＥＣともいう）は、
それ自体公知の物質である。ＰＥＣは正荷電を有する高
分子電解質であるカチオンポリマーの溶液と負荷電を有
する高分子電解質であるアニオンポリマーの溶液とを混
合することにより瞬時に形成することができる。こうし
て得られたＰＥＣは、特殊な３元系溶媒（例えば、特定
の組成からなる、水／アセトン／低分子塩）には溶解す
るが、一般的な溶媒には不溶性である。ＰＥＣは、出発
ポリマー（高分子電解質）の種類、それらの混合比、調
製条件などにより、多様な性質を有する各種の高分子電
解質錯体を提供することができる。The invention will be described in detail below. The polymer electrolyte complex (polyelectrolyte) used in the present invention
yte complex: hereinafter also referred to as PEC),
It is a substance known per se. PEC can be instantaneously formed by mixing a solution of a cationic polymer which is a polyelectrolyte having a positive charge and a solution of an anion polymer which is a polyelectrolyte having a negative charge. The PEC thus obtained is soluble in a special ternary solvent (for example, water / acetone / low-molecular-weight salt having a specific composition), but is insoluble in general solvents. PEC can provide various polyelectrolyte complexes having various properties depending on the types of starting polymers (polyelectrolytes), their mixing ratio, preparation conditions, and the like.

【００１２】この高分子電解質錯体を細胞培養基材に適
用する技術は、特開昭６３−７９５８７号公報から既に
公知であり、無血清で細胞を接着したことを示す具体例
も記載されている。しかしながら、特に、正荷電のＰＥ
Ｃからなる基材に細胞を接着させた場合には、静電気的
力で細胞を基材に吸引させた状態が主体となる。この場
合、細胞は基材に接着はするものの、増殖形態をとれる
細胞伸展状態には至らないので、細胞は増殖しない。ま
た、前記公報では細胞が基材に接着した割合をそのまま
生存率として記載しているが、これは事実を正確に表現
するものではない。すなわち、本発明者らの追試によれ
ば、正荷電ＰＥＣからなる基材への細胞の接着において
は、確かに浮遊細胞の個数が少なく、一見充分な接着が
行われたかのように思われるが、接着した細胞を顕微鏡
で観察すると、細胞は基材表面に強固に吸引されて潰れ
た形態を呈しており、また細胞活性を測定すると、明ら
かにその活性が認められなかった。言い換えれば、前記
公報記載の生存率のデータは、単に基材に接着した細胞
数を求めたものであり、接着した生存細胞数を示すもの
ではなく、死滅した細胞を含むものである。また、前記
公報には、接着後の細胞の増殖については何ら検討され
ていない。The technique of applying this polyelectrolyte complex to a cell culture substrate is already known from JP-A-63-79587, and specific examples showing that cells are adhered without serum are also described. . However, in particular, positively charged PE
When the cells are adhered to the base material made of C, the state in which the cells are attracted to the base material by electrostatic force is the main condition. In this case, although the cells adhere to the base material, the cells do not proliferate because they do not reach a cell extension state in which they can take a proliferative form. Further, in the above-mentioned publication, the ratio of cells adhering to the base material is described as it is as the survival rate, but this does not accurately represent the fact. That is, according to the follow-up test by the present inventors, in the adhesion of cells to the base material made of positively charged PEC, the number of floating cells was certainly small, and it seems that sufficient adhesion was performed at first sight. When the adhered cells were observed with a microscope, the cells were strongly sucked onto the surface of the substrate and had a crushed form, and when the cell activity was measured, the activity was not clearly observed. In other words, the data on the survival rate described in the above-mentioned publication is simply the number of cells that have adhered to the substrate, and does not indicate the number of viable cells that have adhered, but includes dead cells. In addition, the above publication does not discuss proliferation of cells after adhesion.

【００１３】これに対し、本発明者が見出した前記の特
定ＰＥＣからなる基材を用いると、その荷電バランス
（後述）が中性からマイナス側であっても、接着因子
（特には血清）の不在下で、細胞が基材に接着し、しか
も増殖する。これは、前記特開昭６３−７９５８７号公
報の記載から考えても、驚くべき予想外のことである。On the other hand, when the base material made of the above-mentioned specific PEC found by the present inventor is used, even if the charge balance (described later) is from neutral to negative, the adhesion factor (particularly serum) is In the absence, cells adhere to the substrate and grow. This is a surprising and unexpected result, even considering the description in the above-mentioned JP-A-63-79587.

【００１４】本発明で用いられるカチオン性多糖類（ｃ
−１）の具体例としては、ＷＯ９２／０９１９８号公報
に記載されているように、キトサン及びその誘導体、並
びに中性多糖類のジエチルアミノエチル誘導体を挙げる
ことができる。キトサン及びその誘導体の脱アセチル化
度は好ましくは５０〜１００％、より好ましくは７０〜
１００％であり、重合度は好ましくは１０〜３０００、
より好ましくは１０〜２０００である。なお、４級化ア
ミノ基のＮ⁺ 原子とアニオンポリマーのアニオン基とが
結合する。また、中性多糖類としては、デキストラン、
セルロース、マンナン、スターチ又はアガロース等を挙
げることができ、これら誘導体のジエチルアミノエチル
置換度は、糖残基１個当たり好ましくは０．５〜４基、
より好ましくは０．７〜３基であり、重合度は好ましく
は５０〜５０００、より好ましくは１００〜３０００で
ある。なお、ジエチルアミノエチル基の窒素原子とアニ
オンポリマーのアニオン基とが結合する。The cationic polysaccharide (c used in the present invention
Specific examples of -1) include chitosan and its derivatives, and a neutral polysaccharide diethylaminoethyl derivative, as described in WO92 / 09198. The degree of deacetylation of chitosan and its derivatives is preferably 50 to 100%, more preferably 70 to 100%.
100%, the degree of polymerization is preferably 10-3000,
More preferably, it is 10 to 2000. The N ⁺ atom of the quaternized amino group and the anion group of the anionic polymer are bonded. Also, as the neutral polysaccharide, dextran,
Cellulose, mannan, starch, agarose and the like can be mentioned. The diethylaminoethyl substitution degree of these derivatives is preferably 0.5 to 4 groups per sugar residue,
The number of groups is more preferably 0.7 to 3, and the degree of polymerization is preferably 50 to 5,000, more preferably 100 to 3,000. The nitrogen atom of the diethylaminoethyl group and the anionic group of the anionic polymer are bonded.

【００１５】また、前記一般式（II）のカチオンポリマ
ー（ｃ−２）の具体例を挙げれば、ポリ（ビニルベンジ
ルトリメチルアンモニウムクロライド）、ポリビニルピ
リジニウムクロライド、ポリ（Ｎ−ベンジル−４−ビニ
ルピリジニウムクロライド）、４級化ポリアリルアミン
等である。Specific examples of the cationic polymer (c-2) of the general formula (II) include poly (vinylbenzyltrimethylammonium chloride), polyvinylpyridinium chloride and poly (N-benzyl-4-vinylpyridinium chloride). ) Quaternized polyallylamine and the like.

【００１６】前記一般式（III)のカチオンポリマー（ｃ
−３）の具体例を挙げれば、第４級ポリエチレンイミン
クロライド、ポリ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル
−アルキレン−ｐ−キシリレンジアンモニウムクロライ
ド）、ポリ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−アル
キレン−ジアンモニウムジクロライド）、ポリ（Ｎ，
Ｎ，−ジメチル−３−ヒドロキシプロピルアンモニウム
クロライド）、ポリ（２−ヒドロキシ−３−メタクロイ
ルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライ
ド）、ポリ（２−メタクロイルオキシエチルトリメチル
アンモニウムクロライド）、ポリ（グリシジルトリメチ
ルアンモニウムクロライド）、ポリ〔（ジメチルイミニ
オ）エチレン（ジメチルイミニオ）メチレン−１，４−
フェニレンメチレンジクロライド〕〔一般に、２Ｘと称
される〕、ポリ〔（ジメチルイニオ）ヘキサメチレン
（ジメチルイミニオ）メチレン−１，４−フェニレンメ
チレンジクロライド〕〔一般に、６Ｘと称される〕、ポ
リ〔（ジメチルイミニオ）ヘキサメチレンクロライド〕
〔一般に、６，６と称される〕、ポリ（Ｎ−エチル−４
−ビニルピリジニウムブロマイド）、ポリ（ジメチルジ
アリルアンモニウムクロライド）等である。The cationic polymer (c) of the general formula (III)
-3) Specific examples include quaternary polyethyleneimine chloride, poly (N, N, N ', N'-tetramethyl-alkylene-p-xylylenediammonium chloride), poly (N, N, N'). , N′-tetramethyl-alkylene-diammonium dichloride), poly (N,
N, -dimethyl-3-hydroxypropylammonium chloride), poly (2-hydroxy-3-methacryloyloxypropyltrimethylammonium chloride), poly (2-methacryloyloxyethyltrimethylammonium chloride), poly (glycidyltrimethylammonium chloride) , Poly [(dimethyliminio) ethylene (dimethyliminio) methylene-1,4-
Phenylene methylene dichloride] [generally referred to as 2X], poly [(dimethylinio) hexamethylene (dimethyliminio) methylene-1,4-phenylenemethylene dichloride] [generally referred to as 6X], poly [(dimethyl (Iminio) hexamethylene chloride]
[Generally referred to as 6,6], poly (N-ethyl-4)
-Vinylpyridinium bromide), poly (dimethyldiallylammonium chloride), and the like.

【００１７】前記一般式（Ｉ）のアニオンポリマー（ａ
−１）の具体例を挙げれば、ポリアクリル酸、ポリメタ
クリル酸、ポリイタコン酸、ポリイタコン酸モノエステ
ル、ポリマレイン酸モノエステル、ポリビニルスルホン
酸、ポリスチレンスルホン酸、これらポリマーを構成す
る単量体のいずれか２種以上のコポリマー、更に、これ
ら単量体とその単量体のカルボキシル基にエステル結合
によって結合した炭素数４〜２０個のアルキル基を有す
るカルボン酸誘導体とのコポリマーである。The anionic polymer of the general formula (I) (a
Specific examples of -1) include any one of polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyitaconic acid, polyitaconic acid monoester, polymaleic acid monoester, polyvinylsulfonic acid, polystyrenesulfonic acid, and monomers constituting these polymers. It is a copolymer of two or more kinds, and further, a copolymer of these monomers and a carboxylic acid derivative having an alkyl group having 4 to 20 carbon atoms which is bonded to a carboxyl group of the monomer by an ester bond.

【００１８】アニオン性多糖類（ａ−２）の具体例とし
ては、ＷＯ９２／０９１９８号公報に記載されているよ
うに、ヒアルロン酸及びその誘導体、アルギン酸及びそ
の誘導体、各タイプのコンドロイチン硫酸類及びそれら
の誘導体、ヘパラン硫酸及びその誘導体、ヘパリン及び
その誘導体、κ−カラギナン及びその誘導体、λ−カラ
ギナン及びその誘導体、セルロース誘導体、キチン誘導
体、カルボキシメチルスターチ及びその誘導体、アミロ
ース誘導体、アミロペクチン誘導体、各種グルカン誘導
体、デキストラン誘導体、プルラン誘導体、アガロース
誘導体、β−１，４’−ガラクタン誘導体、マンナン誘
導体、又はイヌリン誘導体等を挙げることができる。Specific examples of the anionic polysaccharide (a-2) include, as described in WO92 / 09198, hyaluronic acid and its derivatives, alginic acid and its derivatives, various types of chondroitin sulfates, and them. , Heparan sulfate and its derivatives, heparin and its derivatives, κ-carrageenan and its derivatives, λ-carrageenan and its derivatives, cellulose derivatives, chitin derivatives, carboxymethyl starch and its derivatives, amylose derivatives, amylopectin derivatives, various glucan derivatives , A dextran derivative, a pullulan derivative, an agarose derivative, a β-1,4′-galactan derivative, a mannan derivative, or an inulin derivative.

【００１９】上記のカチオンポリマーとアニオンポリマ
ーとを通常の方法で反応させることによって容易にＰＥ
Ｃを調製することができる。即ち、各水溶液（１０^-5モ
ル／リットル〜１０^-2モル／リットル）を、カチオンポ
リマーのカチオン席とアニオンポリマーのアニオン席と
の濃度比（カチオン席／アニオン席）が０．２５〜４．
０の範囲内、好ましくは０．４〜２．５の範囲内で、水
溶液中で混合して反応させれば良い。カチオン席とアニ
オン席の濃度比が０．２５〜４．０の範囲外になると、
ＰＥＣが形成され難くなるので好ましくない。各ポリマ
ーを溶解する溶媒としては、精製水や各種緩衝液（例え
ばリン酸緩衝液等）、あるいはそれらと水混和性有機溶
媒（例えばメタノール、エタノール、アセトン等）との
混合液を用いることができる。この反応は比較的活性が
高いので、溶液のｐＨ、イオン強度、温度などは比較的
広い範囲であることができるが、一般的にはｐＨ３〜
９、イオン強度０〜１．０及び２０〜６０℃で実施す
る。こうして得られる高分子電解質錯体を直接細胞培養
基材として形成するか、あるいは従来の適当な材料に被
覆することによって、細胞培養基材として用いることが
できる。PE can be easily prepared by reacting the above-mentioned cationic polymer and anionic polymer by a conventional method.
C can be prepared. That is, each aqueous solution (10 ⁻⁵ mol / liter to 10 ⁻² mol / liter) has a concentration ratio (cation seat / anion seat) of cation seat of cation polymer and anion seat of anion polymer of 0.25 to 4.
The reaction may be carried out by mixing in an aqueous solution within a range of 0, preferably within a range of 0.4 to 2.5. When the concentration ratio between the cation seat and the anion seat is outside the range of 0.25 to 4.0,
It is not preferable because PEC becomes difficult to be formed. As a solvent for dissolving each polymer, purified water, various buffer solutions (eg, phosphate buffer solution, etc.), or a mixed solution thereof with a water-miscible organic solvent (eg, methanol, ethanol, acetone, etc.) can be used. . Since this reaction is relatively active, the pH, ionic strength, temperature, etc. of the solution can be in a relatively wide range, but generally pH 3 to
9, carried out at an ionic strength of 0 to 1.0 and 20 to 60 ° C. The polyelectrolyte complex thus obtained can be used as a cell culture substrate by directly forming it as a cell culture substrate or coating it with a conventional appropriate material.

【００２０】本発明においては、カチオンポリマーとア
ニオンポリマーとの組合せや配合比を変化させることに
より、生成するＰＥＣの荷電バランスを容易に変更し、
調整することができる。即ち、種々の荷電バランスを有
するＰＥＣを用いることで、細胞培養基材の表面電荷を
調整し、その使用条件に従って表面特性を適宜選択する
ことが可能となる。本発明で用いるＰＥＣの荷電バラン
スは、−６〜＋６の範囲で選択し得る。ここで、荷電バ
ランスとは、ＰＥＣの荷電状態を、その出発原料である
カチオンポリマー及びアニオンポリマーの、各々のカチ
オン席及びアニオン席の濃度比で表現するものである。
すなわち、ＰＥＣの表面電荷を測定するためには特殊な
装置を必要とし、また操作も煩雑なため、ＰＥＣの表面
電荷の状態を「荷電バランス」によって示す。その荷電
バランスを計算する際には、使用するカチオンポリマー
のカチオン席及びアニオンポリマーのアニオン席の総モ
ル数（ここでモルはイオン席濃度）の合計を１０とす
る。例えば、使用するカチオンポリマーのカチオン席及
びアニオンポリマーのアニオン席の濃度比が等しい場合
は、濃度比（５／５）は１となり、荷電バランスは両者
の差（５−５）から±０となる。濃度比がこれより大き
ければ（すなわち、カチオン席の濃度の方が高ければ）
荷電バランスはプラスとなり、小さければ（すなわち、
アニオン席の濃度の方が高ければ）マイナスとなる。例
えば、カチオンポリマーのカチオン席の濃度が６モルで
あり、アニオンポリマーのアニオン席の濃度が４モルで
ある場合には、濃度比（６／４）は１．５となり、荷電
バランスは両者の差（６−４）から＋２となる。また、
カチオンポリマーのカチオン席の濃度が３．３モルであ
り、アニオンポリマーのアニオン席の濃度が６．６モル
である場合には、濃度比（３．３／６．６）は０．５と
なり、荷電バランスは両者の差（３．３−６．６）から
−３．３となる。以上のように、荷電バランスの調整
は、等濃度のカチオンポリマー溶液及びアニオンポリマ
ー溶液の混合量を変化させることによって容易に行うこ
とができる。In the present invention, the charge balance of the PEC to be produced can be easily changed by changing the combination of the cationic polymer and the anionic polymer and the compounding ratio.
Can be adjusted. That is, by using PECs having various charge balances, it becomes possible to adjust the surface charge of the cell culture substrate and appropriately select the surface characteristics according to the usage conditions. The charge balance of the PEC used in the present invention can be selected in the range of -6 to +6. Here, the charge balance expresses the charge state of PEC by the concentration ratio of each cation seat and anion seat of the cation polymer and the anion polymer which are the starting materials.
That is, since a special device is required to measure the surface charge of PEC and the operation is complicated, the state of the surface charge of PEC is indicated by "charge balance". When the charge balance is calculated, the total number of moles of the cation seats of the cation polymer and the anion seats of the anion polymer to be used (here, mol is the ionic seat concentration) is 10 in total. For example, when the concentration ratio of the cation seat of the cation polymer and the anion seat of the anion polymer used are equal, the concentration ratio (5/5) is 1, and the charge balance is ± 0 from the difference (5-5) between the two. . If the concentration ratio is higher than this (that is, if the concentration at the cation seat is higher)
The charge balance is positive, and if it is small (ie,
It becomes negative if the anion seat concentration is higher). For example, when the concentration of the cation seat of the cationic polymer is 6 mol and the concentration of the anion seat of the anion polymer is 4 mol, the concentration ratio (6/4) is 1.5, and the charge balance is the difference between the two. It becomes +2 from (6-4). Also,
When the concentration of the cation seat of the cationic polymer is 3.3 mol and the concentration of the anion seat of the anion polymer is 6.6 mol, the concentration ratio (3.3 / 6.6) becomes 0.5, The charge balance is -3.3 from the difference (3.3-6.6) between the two. As described above, the charge balance can be easily adjusted by changing the mixing amounts of the cationic polymer solution and the anionic polymer solution having the same concentration.

【００２１】ＰＥＣの調製時における溶液のｐＨ、塩濃
度、水混和性有機溶媒の含有量を変化させることによ
り、生成ＰＥＣの物性（例えば、硬度や弾性）を自由に
調整することが可能で、粒子状、板状、フィルム状等の
成型も容易に行えるので、ＰＥＣそれ自体から本発明の
細胞培養基材を形成することができる。また、ＰＥＣは
種々の材料に簡便且つ容易に被覆できるので、適当な担
体や従来の基材に、ＰＥＣを被覆して本発明の細胞培養
基材を形成することもできる。更に、ＰＥＣそれ自体か
らなる部分と、適当な担体や従来の基材にＰＥＣを被覆
した部分とから形成してもよい。By changing the pH of the solution, the salt concentration, and the content of the water-miscible organic solvent during the preparation of PEC, it is possible to freely adjust the physical properties (eg hardness and elasticity) of the produced PEC. Since it is possible to easily form particles, plates, films, etc., the cell culture substrate of the present invention can be formed from PEC itself. Since PEC can be easily and easily coated on various materials, it is also possible to form a cell culture substrate of the present invention by coating PEC on a suitable carrier or conventional substrate. Further, it may be formed of a portion consisting of PEC itself and a portion of PEC coated on a suitable carrier or conventional substrate.

【００２２】ＰＥＣを被覆することのできる担体又は従
来の細胞培養基材としては、既に適当な材質（ガラス、
セルロース、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアク
リル酸、ポリスチレン、ポリエステル、ポリイソプレ
ン、ポリプロピレン、ポリアミド等の合成高分子樹脂、
綿、紙等の天然高分子、キュプロファン、レーヨン等の
再生樹脂、金属、セラミックス等）で加工されたシャー
レ、プレート、培養容器、培養バッグ、フィルム、繊
維、マイクロキャリア、ビーズ等が挙げられる。従来の
細胞培養基材は、既に形状やサイズ、多孔質の孔径等が
管理されているので、単にＰＥＣをコートするだけで、
種々の規格が管理された本発明による細胞培養基材を簡
便に製造することができる。As a carrier which can be coated with PEC or a conventional cell culture substrate, a suitable material (glass,
Synthetic polymer resins such as cellulose, polyethylene, polyvinyl chloride, polyacrylic acid, polystyrene, polyester, polyisoprene, polypropylene and polyamide,
Examples include natural polymers such as cotton and paper, regenerated resins such as cuprophane and rayon, metals, ceramics and the like), plates, culture vessels, culture bags, films, fibers, microcarriers, beads and the like. Since the conventional cell culture substrate has already been controlled in shape, size, and pore diameter of the porous material, simply coating PEC
The cell culture substrate according to the present invention in which various standards are controlled can be easily produced.

【００２３】ＰＥＣを担体又は従来の基材に被覆させる
には、例えば、塗布、噴霧又は浸漬などの方法で行うこ
とができる。ＰＥＣ溶液を担体に単に接触させるだけで
も良い。例えば、ＰＥＣ溶液と基材を０．５〜４８時間
程度接触させておき、そうして処理した担体又は従来の
基材を生理食塩水や精製水で洗浄した後、室温で風乾あ
るいは５０〜１００℃程度に加温し乾燥する。このと
き、例えばＮａＣｌ等の塩を０．０１〜５Ｍ、温度を０
〜１００℃の雰囲気範囲でＰＥＣを生成させ、担体又は
従来の基材と接触又は浸漬させることによって、ＰＥＣ
の被覆処理時間を短縮（例えば温度を高めることによ
る）し、温和な条件下でＰＥＣを被覆することもでき
る。The PEC can be coated on a carrier or a conventional substrate by a method such as coating, spraying or dipping. The PEC solution may simply be contacted with the carrier. For example, the PEC solution and the base material are kept in contact with each other for 0.5 to 48 hours, and the carrier thus treated or a conventional base material is washed with physiological saline or purified water, and then air-dried at room temperature or 50 to 100. Heat to about ℃ and dry. At this time, for example, a salt such as NaCl is 0.01 to 5 M and the temperature is 0.
PEC by generating PEC in an atmosphere range of ~ 100 ° C and contacting or soaking with a carrier or conventional substrate.
It is also possible to shorten the coating treatment time (for example, by increasing the temperature) and coat PEC under mild conditions.

【００２４】本発明による無血清培養用の基材に適用す
ることのできる細胞は、動物細胞、特には接着増殖性細
胞であり、例えば、繊維芽細胞のような結合組織細胞、
軟骨のような骨組織の骨芽細胞、心筋や平滑筋、上皮組
織の上皮細胞、神経細胞等が挙げられる。The cells applicable to the substrate for serum-free culture according to the present invention are animal cells, in particular adherent proliferating cells, for example connective tissue cells such as fibroblasts,
Examples thereof include osteoblasts of bone tissues such as cartilage, myocardium and smooth muscle, epithelial cells of epithelial tissues, nerve cells and the like.

【００２５】本発明の好適な態様を以下に説明する。等
濃度のカチオンポリマーとアニオンポリマーの溶液を配
合比として等量、あるいはアニオン過剰となるように混
合して荷電バランスが中性からマイナス（例えば、荷電
バランス±０〜−６）を呈するＰＥＣを形成させる。直
ちに適当な基材（細胞が接触する部位）にＰＥＣ溶液を
分注するか、あるいはＰＥＣ溶液に基材自体を含浸させ
てＰＥＣを基材表面にコーティングし、細胞培養基材を
調製する。血清無添加の培地を用いて細胞を基材に接触
させるだけで、培養に必要充分な量の細胞が基材表面に
接着することができる。そして無血清培地の使用を継続
しても、ＰＥＣ基材上の細胞は良好に増殖していく。こ
の際、接着した細胞の基材表面上での自由度が大きい方
が増殖時の効率の面で有利であることが確認された。ま
た、ＰＥＣの荷電バランスがマイナス側で調製された基
材のとき、場合によっては細胞の接着が満足にできない
ＰＥＣがあっても、接着時のみ、血清を添加した培地を
用いて細胞を基材に接着させ、その後無血清の培地に交
換し、最終的には無血清状態で細胞を培養することがで
きる。この場合、接着時に添加される血清の量は、通常
１０％〜２０％の濃度を必要とするのに対し、５％程度
以下の血清使用で接着が可能である。更に、荷電バラン
スに関係なく、ＰＥＣ上に接着した細胞は、未処理基材
と比べて、自然には剥離しにくく、しかも人為的な剥離
操作を用いると容易に剥離することもできる。A preferred embodiment of the present invention will be described below. A solution of a cationic polymer and an anionic polymer having an equal concentration is mixed in an equal amount or anion excess to form a PEC having a neutral to negative charge balance (for example, charge balance ± 0 to -6). Let Immediately, the PEC solution is dispensed to an appropriate base material (site where cells come into contact), or the base material itself is impregnated with the PEC solution to coat PEC on the surface of the base material to prepare a cell culture base material. Only by contacting the cells with the substrate using a serum-free medium, a sufficient amount of cells necessary for culturing can adhere to the substrate surface. Then, even if the use of the serum-free medium is continued, the cells on the PEC substrate grow well. At this time, it was confirmed that the greater the degree of freedom of the adhered cells on the surface of the base material, the more advantageous in terms of efficiency during growth. Further, in the case of a substrate prepared by adjusting the charge balance of PEC to the negative side, in some cases, even if there is a PEC in which cell adhesion is not satisfactory, the cell is used as a substrate by using a medium to which serum is added only at the time of adhesion. The cells can be finally cultured in a serum-free state by replacing the medium with a serum-free medium. In this case, the amount of serum added at the time of adhesion usually requires a concentration of 10% to 20%, whereas adhesion can be achieved by using serum at about 5% or less. Furthermore, regardless of the charge balance, the cells adhered on the PEC are naturally less likely to be peeled off as compared with the untreated substrate, and can be easily peeled off by using an artificial peeling operation.

【００２６】本発明の基材を用いると、血清を使用する
必要がない。従って、血清の使用を回避ないし軽減させ
るだけでも実験室レベル及び工業的レベルの双方で、経
済的メリットがあり、且つ、血清に起因する種々の不都
合を軽減あるいは除去することができる。例えば、再現
の良い培養を行うことができる。また、細胞から産生さ
れる生理活性物質を得る場合にも、精製時における血清
の除去工程を省略することができる。血清を含まない培
地としては、従来から用いられているＥＭＥＭ培地、Ｄ
ＭＥＭ培地、ＭＣＤＢ培地、ＩＭＤＭ培地、ＲＰＭＩ１
６４０培地等が挙げられる。これらの基本培地に、必要
に応じてアミノ酸、ビタミン及び／又は金属等を添加し
て使用したり、市販の無血清培地を用いることができ
る。With the substrate of the present invention, it is not necessary to use serum. Therefore, it is possible to reduce or eliminate various inconveniences caused by serum, both on a laboratory level and on an industrial level, simply by avoiding or reducing the use of serum. For example, culture with good reproducibility can be performed. Also, when obtaining a physiologically active substance produced from cells, the step of removing serum during purification can be omitted. As the serum-free medium, the conventionally used EMEM medium, D
MEM medium, MCDB medium, IMDM medium, RPMI1
640 medium and the like. If necessary, amino acids, vitamins and / or metals, etc. may be added to these basal media before use, or commercially available serum-free media may be used.

【００２７】更に、カチオンポリマーとアニオンポリマ
ーとの特定の組合せからなるＰＥＣを用いた基材におい
ては、細胞が三次元的に増殖し、生体内での形態に近い
状態で細胞が増殖する。従って、生理活性物質の産生量
の向上、長期間培養への適合性、細胞剥離時の細胞損失
の低減化等、従来の基材には見られない様々な機能を有
する培養基材を提供することができることが認められ、
目的に応じ、多岐の分野への応用が期待できるものであ
る。Further, in the base material using PEC consisting of a specific combination of a cationic polymer and an anionic polymer, cells proliferate three-dimensionally and the cells proliferate in a state close to their morphology in vivo. Therefore, it provides a culture substrate having various functions not found in conventional substrates such as an increase in the production amount of physiologically active substances, compatibility with long-term culture, and reduction of cell loss during cell detachment. It is recognized that
Depending on the purpose, application to the field of multi-Toki is what can be expected.

【００２８】なお、カチオン性多糖類（ｃ−１）と、一
般式（Ｉ）のアニオンポリマー（ａ−１）又はアニオン
性多糖類（ａ−２）とからなるＰＥＣを培養基材に適用
することは従来知られていないが、このＰＥＣを用いた
基材は、無血清培養用基材としての前記の利点を有する
だけでなく、血清を用いる従来と同様の培養法に使用し
ても、前記特開昭６３−７９５８７号公報記載の基材と
同等もしくはそれ以上の機能を示す。従って、血清を用
いる培養法に、前記ＰＥＣを用いた基材を用いる場合に
は、従来と同様の細胞を適用することができる。The PEC comprising the cationic polysaccharide (c-1) and the anionic polymer (a-1) of the general formula (I) or the anionic polysaccharide (a-2) is applied to the culture substrate. Although not known so far, the substrate using this PEC not only has the above-mentioned advantages as a substrate for serum-free culture, but also when used in a conventional culture method using serum, It has a function equivalent to or higher than that of the base material described in JP-A-63-79587. Therefore, when the substrate using PEC is used in the culture method using serum, the same cells as in the conventional case can be applied.

【００２９】[0029]

【作用】細胞と基材の接着は、血清に含まれる接着因子
による作用以外にも、静電的な結合力を介して相互作用
する。このため、基材表面の親水性・疎水性、表面エネ
ルギー、ミクロドメイン構造などが深く関与しているこ
とが考えられる。ＰＥＣを構成する各ポリマーの組合せ
やＰＥＣ形成環境差により、生成するＰＥＣは規則的構
造を呈する梯子状や不規則的構造を呈するスクランブル
状等、立体構造的にも複雑な形状を示す。従って、解離
基の種類、密度、位置により、理論的に中性であっても
イオン結合に関与しないフリーの解離基が生じ、細胞の
接着性や増殖性に何らかの影響を与えたり、ＰＥＣ自体
が細胞の増殖に因子的機能を有する可能性等、従来には
予測し得なかった機能を発現させているものと考えられ
る。更に、ＰＥＣはハイドロゲルとしても機能している
ので、物理的な表面の運動性、排除体積効果なども関与
していることが考えられる。このような幾つかの要因が
あいまって従来に無い、極めて好適な細胞培養基材とし
ての機能を発現しているものと思われる。[Function] The adhesion between the cell and the substrate interacts via an electrostatic binding force in addition to the effect of the adhesion factor contained in serum. Therefore, it is considered that the hydrophilicity / hydrophobicity of the substrate surface, the surface energy, the microdomain structure, etc. are deeply involved. Depending on the combination of polymers constituting PEC and the difference in PEC formation environment, the generated PEC exhibits a complicated three-dimensional structure such as a ladder-like structure having a regular structure and a scramble-like structure having an irregular structure. Therefore, depending on the type, density, and position of the dissociating group, a free dissociating group that is not theoretically involved in ionic bonding is generated depending on the type, density, or position, which may affect cell adhesion or proliferation, or PEC itself may It is considered that it expresses a function that could not be predicted in the past, such as the possibility of having a factorial function in cell growth. Furthermore, since PEC also functions as a hydrogel, it is considered that physical surface mobility, excluded volume effect, etc. are also involved. It is considered that these several factors are combined to exert a function as an extremely suitable cell culture substrate, which has never existed before.

【００３０】[0030]

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。なお、以下の実施例に記載の平均分子量は蒸気圧降
下法で測定した数平均分子量である。また、以下の実施
例において使用したポリマー及びその略称を以下に示
す。（１）カチオンポリマー ２Ｘ：ポリ［（ジメチルイミニオ）エチレン（ジメチル
イミニオ）メチレン−１，４−フェニレンメチレンジク
ロライド］（平均分子量約6000） ６Ｘ：ポリ［（ジメチルイミニオ）ヘキサメチレン（ジ
メチルイミニオ）メチレン−１，４−フェニレンメチレ
ンジクロライド］（平均分子量約10000 ） ＰＶＢＭＡ：ポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモニ
ウムクロライド）（平均分子量約15000 ） ＱＰＡＬ：四級化ポリアリルアミン（平均分子量約300
0） ＣＳ７０：キトサン（脱アセチル化度７０％；平均分子
量約2000） ＣＳ１００：キトサン（脱アセチル化度１００％；平均
分子量約2000）（２）アニオンポリマー ＣＬＡ：アクリル酸／ラウリルアクリレートのランダム
共重合体（アクリル酸含量約７０モル％；平均分子量約
10000 ） ＣＯＡ：アクリル酸／２−エチルヘキシルアクリレート
のランダム共重合体（アクリル酸含量約７０モル％；平
均分子量約8000） ＰＡＡ：ポリアクリル酸（平均分子量約56000 ） ＰＳＳ：ポリスチレンスルホン酸（平均分子量約15000
） ＳＬＡ：スチレンスルホン酸／ラウリルアクリレ−トの
共重合体（スルホン酸含量約７０モル％；平均分子量約
32000 ） ＳＯＡ：スチレンスルホン酸／２−エチルヘキシルアク
リレ−トの共重合体（スルホン酸含量約７０モル％；平
均分子量約32000 ） Ａｌｇ：アルギン酸ナトリウム（平均分子量約50000 〜
200000） κ−Ｃａｒ：κ−カラジ−ナン（平均分子量約200000） ＣＣＥＬ：カルボキシメチルセルロ−ス（１ピラノ−ス
酸基当たりの官能基導入率０．９；平均分子量約18000
0） ＣＣＨＮ７０：カルボキシメチルキチン（１ピラノ−ス
酸基当たりの官能基導入率０．７；平均分子量約59000
） ＣＣＨＮ１００：カルボキシメチルキチン（１ピラノ−
ス酸基当たりの官能基導入率１．０；平均分子量約5900
0 ） ＣｈＳ：コンドロイチン硫酸（タイプＡ；平均分子量約
30000 ） ＰＣＨＮ：リン酸化キチン（１ピラノ−ス酸基当たりの
官能基導入率１．０；平均分子量約60000 ） ＳＣＨＮ７０：硫酸化キチン（１ピラノ−ス酸基当たり
の官能基導入率０．７；平均分子量約32000 ） ＳＣＨＮ１００：硫酸化キチン（１ピラノ−ス酸基当た
りの官能基導入率１．１；平均分子量約32000 ） Ｈｙａ：ヒアルロン酸ナトリウム（平均分子量約140000
0 ）EXAMPLES The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but these do not limit the scope of the present invention. The average molecular weight described in the following examples is the number average molecular weight measured by the vapor pressure drop method. The polymers used in the following examples and their abbreviations are shown below. (1) Cationic polymer 2X: poly [(dimethyliminio) ethylene (dimethyliminio) methylene-1,4-phenylenemethylenedichloride ] (average molecular weight about 6000) 6X: poly [(dimethyliminio) hexamethylene (dimethylimine) Minio) methylene-1,4-phenylene methylene dichloride ] (average molecular weight about 10,000) PVBMA: poly (vinylbenzyltrimethylammonium chloride) (average molecular weight about 15,000) QPAL: quaternized polyallylamine (average molecular weight about 300)
0) CS70: Chitosan (Deacetylation degree 70%; Average molecular weight about 2000) CS100: Chitosan (Deacetylation degree 100%; Average molecular weight about 2000) (2) Anionic polymer CLA: Random copolymerization of acrylic acid / lauryl acrylate Combined (acrylic acid content about 70 mol%; average molecular weight about
10000) COA: Random copolymer of acrylic acid / 2-ethylhexyl acrylate (acrylic acid content about 70 mol%; average molecular weight about 8000) PAA: polyacrylic acid (average molecular weight about 56000) PSS: polystyrene sulfonic acid (average molecular weight about 6000) 15000
) SLA: Styrene sulfonic acid / lauryl acrylate copolymer (sulfonic acid content about 70 mol%; average molecular weight about
32000) SOA: styrene sulfonic acid / 2-ethylhexyl acrylate copolymer (sulfonic acid content about 70 mol%; average molecular weight about 32000) Alg: sodium alginate (average molecular weight about 50,000-
200,000) κ-Car: κ-carrageenan (average molecular weight: about 200,000) CCEL: carboxymethylcellulose (functional group introduction ratio per pyranoic acid group: 0.9; average molecular weight: about 18,000)
0) CCHN70: carboxymethyl chitin (functional group introduction rate per pyrano-acid group: 0.7; average molecular weight: about 59000)
) CCHN100: carboxymethyl chitin (1 pyrano-
Functional group introduction rate per sulphonic acid group 1.0; average molecular weight about 5900
0) ChS: Chondroitin sulfate (Type A; average molecular weight of about
30,000) PCHN: Phosphorylated chitin (functional group introduction ratio of 1.0 per pyrano-acid group; average molecular weight of about 60,000) SCHN70: Sulfated chitin (functional group introduction ratio of 0.7 per pyrano-acid group: 0.7) SCHN100: sulfated chitin (functional group introduction ratio per pyrano-acid group 1.1; average molecular weight about 32000) Hya: sodium hyaluronate (average molecular weight about 140000)
0)

【００３１】実施例１：ＰＥＣ（ＣＳ１００−ＰＡＡ）
コーティングプレートの調製 カチオンポリマーとしてＣＳ１００を１．６２ｍｇ／ｍ
ｌの濃度（イオン席として１０^-2Ｍ；以下１０^-2ＵＭと
もいう）となるように１％酢酸溶液（ｐＨ６．０）を用
いて調製し、ＣＳ１００溶液とした。アニオンポリマー
としてはＰＡＡを０．７２ｍｇ／ｍｌの濃度（１０
^-2Ｍ）となるよう蒸留水（ｐＨ７．５）を用いて調製
し、ＰＡＡ溶液とした。これらの溶液を等量ずつ混合し
てＰＥＣを形成させ、直ちにこのＰＥＣ溶液１ｍｌを培
養用プレート（FALCON LABOWARE ）の各ウエルに注入
し、室温で一晩静置した後、上清を除去し、次いで６５
℃で一晩乾燥した。乾燥後、蒸留水１ｍｌを注入してプ
レートを洗浄し、再度６５℃で乾燥させ、ＰＥＣコーテ
ィングプレートを得た。更に、表１に示す各カチオンポ
リマー及び各アニオンポリマーについても前記と同様の
方法で各ポリマー溶液（１０^-2ＵＭ）を調製した。但
し、キトサン以外についてはすべて蒸留水を用いた。次
いで、それらのカチオンポリマー溶液とアニオンポリマ
ー溶液を、表１に示される組合せごとに等量ずつ混合し
て各ＰＥＣを形成させ、前記と同様にプレートにコート
し、各ＰＥＣコーティングプレートを調製した。 Example 1: PEC (CS100-PAA)
Preparation of coating plate CS100 as the cationic polymer 1.62 mg / m
A CS100 solution was prepared by using a 1% acetic acid solution (pH 6.0) so that the concentration was 1 (10 ⁻² M as an ion seat; hereinafter also referred to as 10 ⁻² UM). PAA was used as an anionic polymer at a concentration of 0.72 mg / ml (10
^-2 M) was prepared using distilled water (pH 7.5) to give a PAA solution. Equal amounts of these solutions were mixed to form PEC, 1 ml of this PEC solution was immediately injected into each well of a culture plate (FALCON LABOWARE), and the mixture was allowed to stand at room temperature overnight, and the supernatant was removed. Then 65
Dry overnight at ° C. After drying, 1 ml of distilled water was added to wash the plate, and the plate was dried again at 65 ° C. to obtain a PEC coated plate. Further, for each cation polymer and each anion polymer shown in Table 1, each polymer solution (10 ⁻² UM) was prepared by the same method as described above. However, distilled water was used except for chitosan. Then, the cationic polymer solution and the anionic polymer solution were mixed in equal amounts for each combination shown in Table 1 to form each PEC, which was coated on the plate in the same manner as described above to prepare each PEC coated plate.

【００３２】実施例２：細胞接着性の評価 供試細胞としてヒト歯根膜由来の繊維芽細胞（以下、Ｈ
ＰＤＬという）を用い、培養液はDulbecco's Modified
Eagle's Medium （以下、ＤＭＥＭという）に、終濃度
１０％のウシ胎児血清（以下、ＦＢＳという）を加えた
培養液を用いた。ＨＰＤＬをその培養液にて培養した
後、血清無添加のＤＭＥＭにて１ｘ１０⁴ｃｅｌｌｓ／
ｍｌの細胞懸濁液を調製した。この液１．０ｍｌずつを
実施例１で調製した各プレートのウエルに注入し（１ｘ
１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、５％ＣＯ₂ 及び３７℃
で２４時間培養した。その後、培養上清を除去し、更に
２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４；以下、ＰＢＳとい
う）１ｍｌで各ウエルをリンスすることにより、非接着
細胞を完全に除去した。次いで、各ウエルにＥＤＴＡ
０．０２％とトリプシン０．０５％とを含む溶液（以
下、ＥＤＴＡ／トリプシン溶液という）１ｍｌを注入
し、３７℃で１５分間静置した後、ピペッティングして
溶液を回収することにより接着した細胞を完全に剥離回
収した。この接着細胞を血球計算盤（ビルケルチュルク
型）を用いて位相差顕微鏡下で計数し、接着性を対照試
験と比較した。対照としてＰＥＣ未コートのプレートを
用いた。結果を表１に示す。なお、以下の表１〜表３に
おいて、＋は対照と比較して接着性が同等のＰＥＣの組
合せを示し、＋＋は対照と比較して接着性が極めて優れ
ているＰＥＣの組合せを示す。 Example 2: Evaluation of cell adhesiveness As a test cell, human periodontal ligament-derived fibroblasts (hereinafter referred to as H
PDL) and the culture medium is Dulbecco's Modified
A culture solution obtained by adding fetal bovine serum (hereinafter referred to as FBS) having a final concentration of 10% to Eagle's Medium (hereinafter referred to as DMEM) was used. After culturing HPDL in the culture medium, 1 × 10 ⁴ cells / in serum-free DMEM
ml cell suspension was prepared. 1.0 ml of this solution was poured into the wells of each plate prepared in Example 1 (1x
10 ⁴ cells / well), 5% CO ₂ and 37 ° C
The cells were cultured for 24 hours. Thereafter, the culture supernatant was removed, and each well was rinsed with 1 ml of 20 mM phosphate buffer (pH 7.4; hereinafter referred to as PBS) to completely remove non-adherent cells. Then, add EDTA to each well
1 ml of a solution containing 0.02% and 0.05% trypsin (hereinafter referred to as EDTA / trypsin solution) was injected, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 15 minutes and then pipetted to collect the solution for adhesion. The cells were completely detached and collected. The adherent cells were counted under a phase-contrast microscope using a hemocytometer (Birker-Turku type), and the adherence was compared with the control test. A PEC uncoated plate was used as a control. The results are shown in Table 1. In Tables 1 to 3 below, + represents a combination of PECs having the same adhesiveness as that of the control, and ++ represents a combination of PECs having extremely excellent adhesiveness as compared with the control.

【００３３】[0033]

【表１】 接着性試験結果（ＨＰＤＬ） ポリカチオン CS100 CS70 ２Ｘ ６Ｘ PVBMA QPAL ポリアニオン ＰＡＡ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＣＯＡ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＣＬＡ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋ ＰＳＳ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＳＯＡ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＳＬＡ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ Ａｌｇ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ SCHN70 ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ SCHN110 ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＰＣＨＮ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ CCHN70 ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ CCHN100 ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＣＣＥＬ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ κ−Car ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＣｈＳ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ Ｈｙａ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ [Table 1] Adhesion test results (HPDL) Polycation CS100 CS70 2X 6X PVBMA QPAL Polyanion PAA ++ ++ ++ ++ ++ COA ++ ++ ++ ++ ++ CLA ++ ++ ++ ++ ++ ++ PS ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ ++ ++ ++ ++ SLA ++ + ++ ++ ++ ++ Alg ++ ++ ++ ++ ++ ++ ＋ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +. ++ ++ ++ ++ CCEL ++ ++ ++ ++ + ++ κ-Car ++ ++ ++ ++ ++ ++ ChS ++++++++++++++++ Hya +++++++++

【００３４】実施例３：細胞接着性の評価 供試細胞としてヒト角化細胞（以下、ＨＫという）を用
い、ＢＳＬ−Ｋ１００培地（極東製薬）と、コラーゲン
（新田ゼラチン）をコートしたディッシュ（FALCON LAB
OWARE ）を用いて培養した。この培養したＨＫを０．０
２％ＥＤＴＡと０．００７５％プロナーゼ（ダルベッコ
社）とを含むＰＢＳ（以下、プロナーゼ溶液という）に
より剥離回収し、ＢＳＬ−Ｋ１００培地にて、４ｘ１０
⁴ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。この懸濁
液１．０ｍｌずつを実施例１で調製した各プレートのウ
エルに注入し（１ｘ１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、５
％ＣＯ₂ 及び３７℃で２４時間培養した。その後、培養
上清を除去し、更にＰＢＳ１ｍｌで各ウエルをリンスす
ることにより、非接着細胞を完全に除去した。次いで各
ウエルにプロナーゼ溶液１．０ｍｌを注入し、３７℃で
１５分間静置した後、ピペッティングして溶液を回収す
ることにより接着した細胞を完全に剥離回収した。この
接着細胞を実施例２と同様に計数し、接着性を対照試験
と比較した。結果を表２に示す。 Example 3: Evaluation of cell adhesiveness Human keratinocytes (hereinafter referred to as HK) were used as test cells, and BSL-K100 medium (Far East Pharmaceutical Co., Ltd.) and a dish coated with collagen (Nitta gelatin) ( FALCON LAB
OWARE). 0.0% of this cultured HK
Exfoliation and recovery were performed using PBS containing 2% EDTA and 0.0075% pronase (Dulbecco) (hereinafter referred to as pronase solution), and 4 × 10 in BSL-K100 medium.
A cell suspension of ⁴ cells / ml was prepared. 1.0 ml of this suspension was injected into the wells of each plate prepared in Example 1 (1 × 10 ⁴ cells / well), and 5
Culturing was performed for 24 hours at 37 ° C. and% CO ₂ . Then, the culture supernatant was removed, and each well was rinsed with 1 ml of PBS to completely remove non-adherent cells. Then, 1.0 ml of pronase solution was injected into each well, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 15 minutes, and then the solution was collected by pipetting to completely detach and collect the adhered cells. The adherent cells were counted as in Example 2 and the adherence was compared to the control test. The results are shown in Table 2.

【００３５】[0035]

【表２】 接着性試験結果（ＨＫ） ポリカチオン CS100 CS70 ２Ｘ ６Ｘ QPAL ポリアニオン ＰＡＡ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＣＯＡ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＣＬＡ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＰＳＳ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＳＯＡ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＳＬＡ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ Ａｌｇ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ SCHN70 ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ SCHN110 ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＰＣＨＮ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ CCHN70 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ CCHN100 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＣＣＥＬ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ κ−Car ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋＋ ＣｈＳ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ Ｈｙａ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ [Table 2] Adhesion test results (HK) Polycation CS100 CS70 2X 6X QPAL Polyanion PAA ++ ++ ++ ++ ++ COA ++ ++ + ++ ++ ++ C ++ ++ + + + + + + + + + + + + + + SOA + ++ ++ ++ ++ ++ Alg ++ ++ ++ ++ SCHN70 ++ ++ ++ ++ SCHN110 ++ ++ ++ + + + + + + + + + + + + CCHN70 + + + + + + + + + CCHN70 + + + + + + + + CCHN70 + + + + + + + + CCHN70 + + + + + + + + + + ++ ++ ++ ChS ++ ++ ++ Hya + ++ ++ ++

【００３６】実施例４：細胞増殖性の評価 実施例２と同様の操作で、ＨＰＤＬを実施例１で調製し
た各プレートのウエルに接着させた細胞を、更に血清無
添加のＤＭＥＭにて２日毎に培地交換を行い、５％ＣＯ
₂ 及び３７℃で６日間培養を行った。その後、実施例２
と同様の操作により、培養上清中の浮遊細胞を除去し、
接着した細胞を完全に剥離回収し、血球計算盤を用いて
計数し、増殖性を対照試験と比較した。結果を表３に示
す。また、ＨＫについても同様に増殖性を試験したとこ
ろ、良好な結果が得られた。対照としては、ＰＥＣ未コ
ートのプレートを用いた。 Example 4 Evaluation of Cell Proliferation By the same procedure as in Example 2, cells in which HPDL was adhered to the wells of each plate prepared in Example 1 were further subjected to serum-free DMEM every 2 days. Replace the medium with 5% CO
Culture was performed at ₂ and 37 ° C. for 6 days. Then, Example 2
By the same operation as above, remove floating cells in the culture supernatant,
The adhered cells were completely detached and collected, counted using a hemocytometer, and the proliferation was compared with that of the control test. The results are shown in Table 3. Similarly, when HK was tested for proliferation, good results were obtained. As a control, a PEC uncoated plate was used.

【００３７】[0037]

【表３】 増殖性試験結果 ポリカチオン CS100 CS70 ２Ｘ ６Ｘ PVBMA QPAL ポリアニオン ＰＡＡ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＣＯＡ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＣＬＡ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＰＳＳ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＳＯＡ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＳＬＡ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ Ａｌｇ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ SCHN70 ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ SCHN110 ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＰＣＨＮ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋＋ CCHN70 ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋＋ CCHN100 ＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋＋ ＣＣＥＬ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ κ−Car ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＣｈＳ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ Ｈｙａ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ [Table 3] Proliferative test results Polycation CS100 CS70 2X 6X PVBMA QPAL Polyanion PAA ++++++++++++ COA ++++++++++++++++ CLA ++++++++++++++++++++++++++ ++ ++ SLA ++ ++ ++ ++ ++ Alg ++ ++ ++ ++ ++ SCHN70 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ SCHN110 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋＋＋＋＋＋＋ ++ CCEL ++ ++ ++ ++ ++ κ-Car ++ ++ ++ ++ ++ ++ ChS ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ Hya ++ ++ ++ ++ ++ ++

【００３８】実施例５：細胞増殖性の評価 実施例１と同様の操作で調製した各カチオンポリマー溶
液と各アニオンポリマー溶液を５：６の比率で混合（荷
電バランス：−１）し、実施例１と同様の操作によりＰ
ＥＣコーティングプレートを調製した。これらの各プレ
ートについて実施例４と同様の操作により細胞増殖性の
評価を行った。また、細胞の接着時にのみ、ウシ胎児血
清５％を添加して、同様に細胞評価を行った。その結
果、接着時に無血清の場合には充分な増殖性が得られな
い一部のＰＥＣコートプレートについても、血清を通常
使用量の１／２以下の量で添加し、その後無血清の培養
液に変更して培養を続けると、対照と同等以上、又は場
合により極めて良好に細胞の増殖が進むことを確認し
た。特に、解離基がスルホン酸基である場合に、無血清
下で接着した細胞数に対する増殖率を求めたとき、他の
解離基（リン酸又はカルボン酸）と比べて効果が高いこ
とも認められた。 Example 5: Evaluation of cell proliferation property Each cation polymer solution and each anion polymer solution prepared by the same operation as in Example 1 were mixed at a ratio of 5: 6 (charge balance: -1), P by the same operation as 1
EC coated plates were prepared. Cell proliferation was evaluated for each of these plates by the same procedure as in Example 4. Further, only at the time of cell adhesion, 5% fetal calf serum was added, and cell evaluation was performed in the same manner. As a result, even for some PEC coated plates, which do not have sufficient proliferative properties when serum-free at the time of adhesion, the serum was added in an amount of 1/2 or less of the normal amount used, and then the serum-free culture solution was added. It was confirmed that when the culture was continued after changing to, the cell growth proceeded at a level equal to or higher than that of the control, or in some cases extremely good. In particular, when the dissociating group is a sulfonic acid group, it was also found that the effect was higher than other dissociating groups (phosphoric acid or carboxylic acid) when the growth rate against the number of cells adhered in the absence of serum was determined. It was

【００３９】実施例６：ＰＥＣコ−ティングプレ−トの
調製 カチオンポリマ−としてＣＳ１００を１．６２ｍｇ／ｍ
ｌの濃度（イオン席として１０^-2Ｍ：以下１０^-2ＵＭと
もいう）となるように１％酢酸溶液（ｐＨ６．０）を用
いて調製し、ＣＳ１００溶液とした。アニオンポリマ−
としてはＰＡＡを０．７２ｍｇ／ｍｌの濃度（１０^-2Ｕ
Ｍ）となるよう蒸留水（ｐＨ７．５）を用いて調製し、
ＰＡＡ溶液とした。これらの溶液をカチオン：アニオン
比率を２：３（荷電バランス−２）の容量で混合してＰ
ＥＣ溶液とし、この溶液１ｍｌを培養用プレ−ト（FALC
ON LABOWARE)の各ウエルに注入し、室温で二晩静置した
後で上清を除去し、次いで６５℃で一晩乾燥した。乾燥
後、蒸留水１ｍｌを注入してプレ−トを洗浄し、再度６
５℃で乾燥させて、ＰＥＣコ−ティングプレ−トを得
た。その他、表４に示される各カチオンポリマ−及び各
アニオンポリマ−についても上記と同様にして各ポリマ
−溶液（１０^-2ＵＭ）を調製して、表４に示す荷電バラ
ンスとなるように各ポリマー溶液を混合して各ＰＥＣ溶
液を調製し、同様の操作によりＰＥＣコ−ティングプレ
−トを得た。荷電バランスが＋２のＰＥＣはカチオン：
アニオン比率を３：２として調製した。但し、キトサン
以外についてはすべて蒸留水を用いた。 Example 6: PEC coating plate
Preparation CS100 as cationic polymer 1.62 mg / m
A CS100 solution was prepared by using a 1% acetic acid solution (pH 6.0) so as to have a concentration of 1 (10 ⁻² M as an ion seat: hereinafter also referred to as 10 ⁻² UM). Anion polymer
PAA at a concentration of 0.72 mg / ml (10 ^-2 U
M) to prepare distilled water (pH 7.5),
It was a PAA solution. These solutions were mixed at a cation: anion ratio of 2: 3 (charge balance -2) to obtain P.
An EC solution was prepared, and 1 ml of this solution was used as a culture plate (FALC).
ON LABOWARE), and the mixture was allowed to stand at room temperature for two nights, the supernatant was removed, and then dried at 65 ° C. overnight. After drying, 1 ml of distilled water was added to wash the plate, and the plate was washed again.
It was dried at 5 ° C. to obtain a PEC coating plate. In addition, for each cation polymer and each anion polymer shown in Table 4, a polymer solution (10 ^-2 UM) was prepared in the same manner as described above, and each polymer was adjusted so that the charge balance shown in Table 4 was obtained. The solutions were mixed to prepare each PEC solution, and the PEC coating plate was obtained by the same operation. PECs with a charge balance of +2 are cations:
The anion ratio was 3: 2. However, distilled water was used except for chitosan.

【００４０】実施例７：細胞増殖性の評価 実施例２と同様に、細胞としてＨＰＤＬを用い、培養液
としてはＤＭＥＭにＦＢＳを終濃度１０％で加えた培養
液を用いた。ＨＰＤＬを先の培養液にて培養した後、血
清無添加のＤＭＥＭにて１×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの
細胞懸濁液を調製した。この液１．０ｍｌずつを実施例
６で調製した各プレ−トのウエルに注入（１×１０⁴ ｃ
ｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）し、５％ＣＯ₂ 、３７℃で２４時
間培養した。その後、２日毎に培地交換を行い、６日間
培養した。その後、培養上清を除去し、更にＰＢＳ１．
０ｍｌで各ウエルをリンスすることにより、非接着細胞
を完全に除去した。次いで各ウエルにＥＤＴＡ／トリプ
シン溶液１．０ｍｌを注入し、３７℃、１５分間、静置
した後、ピペッティングし溶液を回収することにより接
着した細胞を完全に剥離回収した。この接着細胞を血球
計算盤（ビルケルチュルク型）を用いて位相差顕微鏡下
で計数し増殖性を対照試験と比較した。対照としてＰＥ
Ｃ未コ−トのプレ−トを用いた。結果を表４に示す。 Example 7: Evaluation of cell proliferation property As in Example 2, HPDL was used as cells, and the culture medium was a culture medium in which FBS was added to DMEM at a final concentration of 10%. After culturing HPDL in the above culture solution, a cell suspension of 1 × 10 ⁴ cells / ml was prepared with serum-free DMEM. 1.0 ml of this solution was injected into the well of each plate prepared in Example 6 (1 × 10 ⁴ c).
cells / well) and cultured for 24 hours at 37 ° C. in 5% CO ₂ . Then, the medium was replaced every 2 days, and the cells were cultured for 6 days. Then, the culture supernatant was removed, and PBS1.
Non-adherent cells were completely removed by rinsing each well with 0 ml. Next, 1.0 ml of an EDTA / trypsin solution was injected into each well, left standing at 37 ° C. for 15 minutes, and pipetted to collect the solution, whereby the adhered cells were completely peeled and collected. The adherent cells were counted under a phase-contrast microscope using a hemocytometer (Birker-Turku type), and the proliferation was compared with that of the control test. PE as a control
A C uncoated plate was used. The results are shown in Table 4.

【００４１】[0041]

【表４】 増殖性試験結果（HPDL） ポリカチオン 荷電ハ゛ランス CS100 CS70 ２Ｘ ６Ｘ PVBMA QPALポリアニオン ＰＡＡ −２ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋＋ ＣＯＡ −２ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＰＳＳ ＋２ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ Ａｌｇ −２ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＳＣＨＮ100 −２ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＰＣＨＮ −２ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋２ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＣＣＨＮ70 −２ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＣＣＨＮ100 −２ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＣＣＥＬ −２ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ κ−Ｃａｒ ＋２ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＣｈＳ −２ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ ：対照と比較して増殖性が同等のＰＥＣの組み合わせを示す。 ＋＋：対照と比較して増殖性が優れているＰＥＣの組み合わせを示す。TABLE 4 Growth Test Results (HPDL) polycation charged Ha Bu lance CS100 CS70 2X 6X PVBMA QPAL polyanionic PAA -2 ++ ++ ++ + + ++ COA -2 + + + + + ++ PSS +2 + + + ++ + ++ Alg - 2 + + + + + + + + SCHN100 -2 +++ + + + + + + + + PCHN -2 + + + + + + + + + +2 + + + + + + + + CCHN70 +2 + + + + + + + + + + CCHN100 + -2 CCEL −2 ++ ++ ++ κ−Car +2 + ++ ++ + + + ChS −2 ++ ++ ++ ++ ++ : indicates a combination of PECs with comparable proliferative properties compared to controls. ++: Shows a combination of PECs that are more proliferative than the control.

【００４２】実施例８：細胞増殖性の評価 実施例３と同様に、細胞としてＨＫを用い、ＢＳＬ−Ｋ
１００培地（極東製薬）と、コラーゲン（新田ゼラチ
ン）をコートしたディッシュ(FALCON LABOWARE)を用い
て培養した。この培養したＨＫをプロナーゼ溶液により
剥離回収し、ＢＳＬ−Ｋ１００培地にて、４×１０⁴ ｃ
ｅｌｌｓ／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。この懸濁液
１．０ｍｌずつを実施例６と同様の方法で表５に示す各
ポリカチオンとポリアニオンの組み合わせのＰＥＣコー
テイングプレートを調製した。但し、荷電バランス±０
のＰＥＣは各カチオンポリマー溶液と各アニオンポリマ
ー溶液を等量混合して調製した。各プレートのウエルに
細胞懸濁液を注入（４×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）
し、５％ＣＯ₂ で３７℃にて２４時間培養した。その
後、２日毎に培地交換を行い、６日間培養した。その
後、培養上清を除去し、更にＰＢＳ１ｍｌで各ウエルを
洗浄することにより、非接着性細胞を完全に除去した。
次いで各ウエルにＥＤＴＡ／トリプシン溶液１ｍｌを注
入し、３７℃で１５分間、静置した後、ピペッティング
し、溶液を回収することにより、接着した細胞を完全に
剥離回収した。この接着細胞を実施例７と同様に計数
し、増殖性を対照試験と比較した。対照としてＰＥＣ未
コ−トのプレ−トを用いた。結果を表５及び表６に示
す。 Example 8: Evaluation of cell proliferation property As in Example 3, HK was used as cells and BSL-K was used.
Culture was performed using 100 medium (Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.) and a dish (FALCON LABOWARE) coated with collagen (Nitta gelatin). The cultivated HK was exfoliated and collected with a pronase solution, and then 4 × 10 ⁴ c in BSL-K100 medium.
A cell suspension of ells / ml was prepared. In the same manner as in Example 6, 1.0 ml of this suspension was used to prepare PEC coating plates of combinations of each polycation and polyanion shown in Table 5. However, charge balance ± 0
Was prepared by mixing equal amounts of each cation polymer solution and each anion polymer solution. Inject the cell suspension into the wells of each plate (4 × 10 ⁴ cells / well)
Then, the cells were cultured in 5% CO ₂ at 37 ° C for 24 hours. Then, the medium was replaced every 2 days, and the cells were cultured for 6 days. Then, the culture supernatant was removed, and each well was washed with 1 ml of PBS to completely remove the non-adherent cells.
Then, 1 ml of an EDTA / trypsin solution was injected into each well, left standing at 37 ° C. for 15 minutes, pipetted, and the solution was collected to completely detach and collect the adhered cells. The adherent cells were counted as in Example 7 and their proliferation was compared with the control test. A plate not coated with PEC was used as a control. The results are shown in Tables 5 and 6.

【００４３】[0043]

【表５】 増殖性試験結果（HK） ポリカチオン 荷電ハ゛ランス CS100 CS70 ２Ｘ ６Ｘ PVBMA QPALポリアニオン ＰＡＡ ±０ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ −２ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋２ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋＋ ＣＯＡ ±０ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ −２ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋２ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＣＬＡ ±０ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ −２ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋２ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋＋ ＰＳＳ ±０ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋ −２ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋２ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＳＯＡ ±０ ＋＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ −２ ＋＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋２ ＋＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＳＬＡ ±０ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋ −２ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋２ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋ Ａｌｇ ±０ ＋＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ −２ ＋＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋２ ＋＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋TABLE 5 Growth Test Results (HK) polycation charged Ha Bu lance CS100 CS70 2X 6X PVBMA QPAL polyanionic PAA ± 0 ++ ++ ++ ++ + ++ -2 ++ ++ ++ + + ++ +2 ++ ++ ++ + + ++ COA ± 0 ++ + + + + + + + -2 + + + + + + + + + + +2 + + + + + + + + + CLA ± 0 + + + + + + + + + + + -2 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -2 + + + + + + + + +2 + + + + + + + + SOA ± 0 ++ + + + + + + + + + + -2 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -2 +++ + + + + + + + +2 + + + + + + + + + Alg ± 0 ++ + + + + + + + + + -2 + + + + + + + + + + 2 + + + + + + + +

【００４４】[0044]

【表６】 増殖性試験結果（HK）（続き） ポリカチオン 荷電ハ゛ランス CS100 CS70 ２Ｘ ６Ｘ PVBMA QPALポリアニオン ＳＣＨＮ７０ ±０ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ −２ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋２ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＰＣＨＮ ±０ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ −２ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋２ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＣＣＨＮ７０ ±０ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ −２ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋２ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＣＣＥＬ ±０ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋ −２ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋２ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋ κ- Ｃａｒ ±０ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ −２ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋２ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＣｈＳ ±０ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ −２ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋２ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ Ｈｙａ ±０ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ −２ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋２ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ：対照と比較して接着性が同等のＰＥＣの組み合わせを示す。 ＋＋：対照と比較して接着性が優れているＰＥＣの組み合わせを示す。Table 6 Proliferative Test Results (HK) (continued) polycation charged Ha Bu lance CS100 CS70 2X 6X PVBMA QPAL polyanion SCHN70 ± 0 ++ ++ + ++ + ++ -2 ++ ++ + ++ + ++ +2 ++ ++ + ++ + ++ PCHN ± 0 + + + + + + + + -2 + + + + + + + + +2 + + + + + + + + CCHN70 ± 0 + + + + + + + + -2 + + + + + + + +2 + + + + + + CCEL ± ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + + κ-Car ± 0 ++ ++ + ++ + + + ++ + + + + + + +2 + + + + + + +2 ++ + ++ ++ + + -2 ++ + ++ ++ + + +2 + + ++ ++ + ++ Hya ± 0 + + + + + + -2 + + + + + + 2 + + + + + + +: indicates a combination of as compared to control adhesion equivalent PEC. ++: indicates a combination of PECs with better adhesion compared to the control.

【００４５】実施例９：細胞接着性の評価 細胞として、新生マウス頭蓋冠由来の骨芽細胞株（以
下、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ1 という）を用い、培養液は１０％
ＦＢＳを含有したＤＭＥＭを用いた。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ1
を先の培養液にて培養した後、血清無添加のＤＭＥＭに
て５×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞懸濁液を調製し
た。この液１．０ｍｌずつを、実施例６と同様に調製し
た表７に示す各ポリマ−溶液を等量混合して得たＰＥＣ
（荷電バランス：±０）にて、同様にコ−ティングされ
たプレ−トへ注入し（５×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌ
ｌ）、５％ＣＯ₂ 、３７℃で２４時間培養した。その
後、培養上清を除去し、更にＰＢＳ１．０ｍｌで各ウエ
ルをリンスすることにより、非接着細胞を完全に除去し
た。次いで各ウエルにＥＤＴＡ／トリプシン溶液１．０
ｍｌを注入し、３７℃で１５分間静置した後、ピペッテ
ィングにより接着した細胞を完全に剥離回収した。この
接着細胞を血球計算盤（ビルケルチュルク型）を用いて
位相差顕微鏡下で計数し接着性を対照試験と比較した。
対照としてＰＥＣ未コ−トのプレ−トを用いた。結果を
表７に示す。 Example 9: Evaluation of cell adhesiveness As a cell, an osteoblastic cell line derived from a newborn mouse calvaria (hereinafter referred to as MC3T3-E1) was used, and the culture solution was 10%.
DMEM containing FBS was used. MC3T3-E1
Was cultured in the above culture broth and then a cell suspension of 5 × 10 ⁴ cells / ml was prepared with serum-free DMEM. PEC obtained by mixing 1.0 ml of each of the solutions with equal amounts of each polymer solution shown in Table 7 prepared in the same manner as in Example 6
(Charge balance: ± 0) and then inject into a plate coated in the same manner (5 × 10 ⁴ cells / wel).
l) Culture was carried out at 37 ° C. in 5% CO ₂ for 24 hours. Then, the culture supernatant was removed, and each well was rinsed with 1.0 ml of PBS to completely remove non-adherent cells. Then add EDTA / trypsin solution 1.0 to each well.
After injecting ml, the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 15 minutes, and then the adhered cells were completely separated and collected by pipetting. The adherent cells were counted under a phase-contrast microscope using a hemocytometer (Birker-Turku type) and the adherence was compared with that of the control test.
A plate not coated with PEC was used as a control. The results are shown in Table 7.

【００４６】[0046]

【表７】 接着性試験結果（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ1 ） ポリカチオン CS100 CS70 ２Ｘ ６Ｘ PVBMA QPALポリアニオン ＰＡＡ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＣＯＡ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＣＬＡ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＰＳＳ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＳＬＡ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ Ａｌｇ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＳＣＨＮ70 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＰＣＨＮ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＣＣＨＮ70 ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＣＣＨＮ100 ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＣＣＥＬ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ κ−Ｃａｒ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ ＣｈＳ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ Ｈｙａ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ：対照と比較して接着性が同等のＰＥＣの組み合わせを示す。 ＋＋：対照と比較して接着性が優れているＰＥＣの組み合わせを示す。Table 7 Adhesion Test Results (MC3T3-E1) polycations CS100 CS70 2X 6X PVBMA QPAL polyanionic PAA ++ ++ ++ ++ + ++ COA ++ + + + + + CLA ++ + + + + + PSS + + + + + ++ SLA ++ ++ ++ ++ Alg ++ ++ ++ ++ SCHN70 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ PCH + ++ ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + CCHN100 + + + + + + + + + + + + + + -Car ++++++++ ChS ++++++++++ Hya ++++++++++++: indicates a combination of PECs with comparable adhesiveness compared to the control. ++: indicates a combination of PECs with better adhesion compared to the control.

【００４７】実施例１０：細胞増殖性の評価 実施例８と同様の操作で、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ1 について、
表４に示した各ポリマー溶液を実施例６及び７に準じて
調製した各プレ−トのウエルに接着させた細胞を更に血
清無添加のＤＭＥＭにて３日毎に培地交換を行い、５％
ＣＯ₂ 下で３７℃にて６日間培養を行った。その後、実
施例７と同様の操作により、培養上清中の浮遊細胞を除
去し、接着した細胞を完全に剥離回収し、血球計算盤を
用いて計数した。対照としてＰＥＣ未コ−トのプレ−ト
を用いた。結果を表８及び表９に示す。 Example 10: Evaluation of cell proliferation property In the same manner as in Example 8, MC3T3-E1 was prepared.
The cells prepared by adhering the polymer solutions shown in Table 4 to the wells of the respective plates prepared according to Examples 6 and 7 were subjected to medium replacement with serum-free DMEM every 3 days to give 5%.
Culturing was carried out under CO ₂ at 37 ° C. for 6 days. Then, by the same procedure as in Example 7, the floating cells in the culture supernatant were removed, the adhered cells were completely separated and collected, and counted using a hemocytometer. A plate not coated with PEC was used as a control. The results are shown in Tables 8 and 9.

【００４８】[0048]

【表８】 増殖性試験結果（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ1 ） ポリカチオン 荷電ハ゛ランス CS100 CS70 ２Ｘ ６Ｘ PVBMA QPALポリアニオン ＰＡＡ ±０ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋２ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＰＳＳ ±０ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋＋ −２ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋２ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＳＯＡ ＋２ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ±０ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ −２ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＳＬＡ ±０ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ −２ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋２ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ Ａｌｇ ＋２ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＳＣＨＮ70 ±０ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ −２ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋２ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＣＣＨＮ100 −２ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ±０ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋２ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋[Table 8] proliferative test result (MC3T3-E1) poly cationic charged Ha Bu lance CS100 CS70 2X 6X PVBMA QPAL polyanionic PAA ± 0 ++ + + + + ++ +2 + + + + ++ ++ PSS ± 0 + + ++ + + ++ - 2 + + + + + + + + + + + + 2 + + + + + + + + + + SOA +2 + + + + + + + + ± 0 + + + + + + + + + + + -2 + + + + + + + + + + + + + + + + + ++++++++++++ 2 ++++++++ Alg + 2 +++++++ SCHN70 ± 0 +++++++++++++++++++++++++++++++ + + + ± 0 + + + + + + + + + + +2 + + + + + + + + + + +

【００４９】[0049]

【表９】 増殖性試験結果（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ1 ）（続き） ポリカチオン 荷電ハ゛ランス CS100 CS70 ２Ｘ ６Ｘ PVBMA QPALポリアニオン ＣＣＥＬ ±０ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ −２ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ κ−Ｃａｒ ±０ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋２ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ −２ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＣｈＳ ±０ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋２ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ −２ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ Ｈｙａ ±０ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ −２ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋２ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ：対照と比較して増殖性が同等のＰＥＣの組み合わせを示す。 ＋＋：対照と比較して増殖性が優れているＰＥＣの組み合わせを示す。TABLE 9 Growth Test Results (MC3T3-E1) (continued) polycation charged Ha Bu lance CS100 CS70 2X 6X PVBMA QPAL polyanion CCEL ± 0 + + ++ + + + -2 + + + + + ++ κ-Car ± 0 + +++++++++++++++++++++++++++++++ ChS ± 0 +++++++++ 2 ++++++++++++++++++++++++ + + + + + -2 ++ ++ + + + + + + 2 + + + + + + + + + + + +: indicates a combination of PEC and proliferative and equivalent compared to controls. ++: Shows a combination of PECs that are more proliferative than the control.

【００５０】[0050]

【発明の効果】動物細胞、特には接着増殖性細胞を培養
する際に、血清の不在下で、あるいはその使用量を軽減
化した条件下で、細胞を接着し、かつ増殖することがで
きる基材であって、しかもその製法が容易で、細胞毒が
ない細胞培養基材が提供される。EFFECT OF THE INVENTION When culturing animal cells, particularly adherent-proliferating cells, a group capable of adhering and proliferating cells in the absence of serum or under conditions in which the amount used is reduced. There is provided a cell culture substrate which is a material, is easy to produce, and is free of cytotoxins.

フロントページの続き (72)発明者 金子 守 東京都千代田区東神田１丁目11番４号 株式会社ヤトロン内 (56)参考文献 特開 昭63−79587（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−116692（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 5/00 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＯＩＳ)Front page continuation (72) Inventor Mamoru Kaneko 1-14-1 Higashi-Kanda, Chiyoda-ku, Tokyo Inside Yatron Co., Ltd. (56) Reference JP-A-63-79587 (JP, A) JP-A-63-116692 ( (58) Fields investigated (Int.Cl. ⁷ , DB name) C12N 5/00 BIOSIS / WPI (DIALOG) JSTPlus (JOIS)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 少なくとも表面が、カチオン性高分子電
解質としてのカチオン性多糖類と、一般式（Ｉ）： 【化１】 （式中、Ｒ₁₁は水素原子又は炭素数１〜４個のアルキル
基であり、Ｒ₁₂は炭素数４〜２０個の直鎖若しくは分枝
鎖のアルキル基又はアルケニル基であり、Ｙはカルボン
酸基若しくはその塩、スルホン酸基若しくはその塩、リ
ン酸基若しくはその塩、又は、カルボン酸基若しくはそ
の塩を含有するアリール基、スルホン酸基若しくはその
塩を含有するアリール基、又はリン酸基若しくはその塩
を含有するアリール基であり、ａは２０〜１００であ
り、ｐは１０以上の数である）で示されるアニオンポリ
マー及びアニオン性多糖類からなる群から選択されたア
ニオン性高分子電解質とを反応させることによって得ら
れる高分子電解質錯体により形成されていることを特徴
とする、細胞培養基材。1. A cationic polysaccharide as a cationic polyelectrolyte at least on the surface and a compound of the general formula (I): (In the formula, R ₁₁ is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, R ₁₂ is a linear or branched alkyl group or alkenyl group having 4 to 20 carbon atoms, and Y is a carboxyl group. Acid group or salt thereof, sulfonic acid group or salt thereof, phosphoric acid group or salt thereof, or aryl group containing carboxylic acid group or salt thereof, aryl group containing sulfonic acid group or salt thereof, or phosphoric acid group Or an aryl group containing a salt thereof, a is 20 to 100, and p is a number of 10 or more) and an anionic polyelectrolyte selected from the group consisting of anionic polymers and anionic polysaccharides. A cell culture substrate, which is formed of a polyelectrolyte complex obtained by reacting with. 【請求項２】 請求項１に記載の高分子電解質錯体によ
り形成されている細胞培養基材を用いることを特徴とす
る、細胞培養方法。2. A cell culture method comprising using the cell culture substrate formed of the polyelectrolyte complex according to claim 1. 【請求項３】 無血清培地による接着増殖性細胞用の培
養基材であって、少なくとも表面が、カチオン性多糖
類、一般式（II）： 【化２】 〔式中、Ａは一般式（II−１）： 【化３】 （式中、Ｂは炭素数１又は２個のアルキレン基であり、
Ｒ₂₁、Ｒ₂₂及びＲ₂₃はそれぞれ独立に水素原子又は炭素
数１〜３個のアルキル基であり、Ｘ₁ ^- は対イオンであ
る）で表される基であるか、一般式（II−２）： 【化４】 （式中、Ｒ₂₄は炭素数１〜３個のアルキル基又はベンジ
ル基であり、Ｘ₂ ^- は対イオンである）で表される基で
あるか、又は一般式（II−３）： 【化５】 （式中、Ｒ₂₅は炭素数１又は２個のアルキル基であり、
Ｒ₂₆、Ｒ₂₇及びＲ₂₈はそれぞれ独立に水素原子又は炭素
数１〜３個のアルキル基であり、Ｘ₃ ^- は対イオンであ
る）で表される基であり、ｎは１０以上の数である〕で
示される４級アンモニウム塩ポリマー及び一般式（II
I)： 【化６】 〔式中、Ｒ₃₁及びＲ₃₄はそれぞれ独立に炭素数１〜１０
個のアルキレン基、一般式(III−１）： 【化７】 （式中、Ｒ₃₇及びＲ₃₈は、それぞれ独立に、炭素数１又
は２個のアルキレン基である）で表される基又はアリー
レン基であって、Ｒ₃₂、Ｒ₃₃、Ｒ₃₅及びＲ₃₆はそれぞれ
独立に炭素数１〜３個のアルキル基であるか、又はＲ₃₁
は式中の２個の窒素原子及びＲ₃₂、Ｒ₃₃、Ｒ₃₅及びＲ₃₆
と一緒になって式(III−２）： 【化８】 （式中、Ｒ₄₁は水素原子又は炭素数１〜３個のアルキル
基である）で表される基であってＲ₃₄は前記と同じ意味
であるものとし、そしてＸ₄ ^- は対イオンであり、ｍは
５以上の数である〕で示される４級アンモニウム塩ポリ
マーからなる群から選択されたカチオン性高分子電解質
と、一般式（Ｉ）： 【化９】 （式中、Ｒ₁₁は水素原子又は炭素数１〜４個のアルキル
基であり、Ｒ₁₂は炭素数４〜２０個の直鎖若しくは分枝
鎖のアルキル基又はアルケニル基であり、Ｙはカルボン
酸基若しくはその塩、スルホン酸基若しくはその塩、リ
ン酸基若しくはその塩、又は、カルボン酸基若しくはそ
の塩を含有するアリール基、スルホン酸基若しくはその
塩を含有するアリール基、又はリン酸基若しくはその塩
を含有するアリール基であり、ａは２０〜１００であ
り、ｐは１０以上の数である）で示されるアニオンポリ
マー及びアニオン性多糖類からなる群から選択されたア
ニオン性高分子電解質とを反応させることによって得ら
れる高分子電解質錯体により形成されていることを特徴
とする、無血清培地用の細胞培養基材。3. A culture substrate for adherent and proliferating cells in a serum-free medium, wherein at least the surface is a cationic polysaccharide, represented by the general formula (II): [In the formula, A is a general formula (II-1): (In the formula, B is an alkylene group having 1 or 2 carbon atoms,
R ₂₁ , R ₂₂ and R ₂₃ each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and X ₁ ⁻ is a group represented by the formula (II- 2): (Wherein R ₂₄ is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms or a benzyl group, and X ₂ ⁻ is a counter ion ), or a group represented by the general formula (II-3): Chemical 5] (In the formula, R ₂₅ is an alkyl group having 1 or 2 carbon atoms,
R ₂₆ , R ₂₇ and R ₂₈ are each independently a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, X ₃ ⁻ is a counter ion), and n is a number of 10 or more. And a quaternary ammonium salt polymer represented by the general formula (II
I): [In the formula, R ₃₁ and R ₃₄ each independently have 1 to 10 carbon atoms.
Number alkylene group of one general formula (III-1): ## STR00007 ## (Wherein, R ₃₇ and R ₃₈ are each independently, a is the number 1 or 2 alkylene groups of atoms) group or represented by the an arylene _{group, R 32, R 33, R} 35 and R ₃₆ Are each independently an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, or R ₃₁
Is two nitrogen atoms in the formula and R ₃₂ , R ₃₃ , R ₃₅ and R ₃₆
Together with formula (III-2): (Wherein R ₄₁ is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms), R ₃₄ has the same meaning as described above, and X ₄ ⁻ is a counter ion. And m is a number of 5 or more], and a cationic polyelectrolyte selected from the group consisting of quaternary ammonium salt polymers represented by the formula (I): (In the formula, R ₁₁ is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, R ₁₂ is a linear or branched alkyl group or alkenyl group having 4 to 20 carbon atoms, and Y is a carboxyl group. Acid group or salt thereof, sulfonic acid group or salt thereof, phosphoric acid group or salt thereof, or aryl group containing carboxylic acid group or salt thereof, aryl group containing sulfonic acid group or salt thereof, or phosphoric acid group Or an aryl group containing a salt thereof, a is 20 to 100, and p is a number of 10 or more) and an anionic polyelectrolyte selected from the group consisting of anionic polymers and anionic polysaccharides. A cell culture substrate for a serum-free medium, which is formed of a polyelectrolyte complex obtained by reacting with. 【請求項４】 請求項３に記載の高分子電解質錯体によ
り形成されている細胞培養基材を用いて無血清条件下で
接着増殖性細胞を培養することを特徴とする、接着増殖
性細胞の培養方法。4. A method for culturing adherent proliferative cells, which comprises culturing adherent proliferative cells under serum-free conditions using the cell culture substrate formed of the polyelectrolyte complex according to claim 3. Culture method. 【請求項５】 請求項３に記載の高分子電解質錯体によ
り形成されている細胞培養基材を用い、少なくとも細胞
増殖工程においては無血清培地を用いることを特徴とす
る、接着増殖性細胞の培養方法。5. A culture of adherent-proliferating cells, which uses the cell culture substrate formed of the polyelectrolyte complex according to claim 3 and uses a serum-free medium at least in the cell growth step. Method.