JP2018113928A - 表面が生体適合性ポリマーで改質された生体物質との接触型機材 - Google Patents
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Abstract
Description
形態変化(例えば、分化、細胞死)を惹起しないように培養表面を改質できる。本発明者等は、前記ブロックコポリマーが、水性媒体中で高い可動性を有するPEG鎖を有するにもかかわらず、疎水性部側鎖に積極的にハロメチルスチレン部を含ませる(または残存させる)ことにより、単に、スピンコーティングするだけで、少なくとも細胞の培養条件下で市販の培養皿表面やポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル等の基板表面に安定に固定できることのみならず、一定の、別の機能性(リガンド結合性または活性エステル化)ポリマーも安定に共固定できることを見出したこと。さらに、こうして固定されたポリマー組成物に大気圧プラズマ照射すると、前記機能に悪影響を及ぼすことなく固定を強固にし得ることも見出した。例えば、前記機能として活性エステル化したポリマーは、かようなプラズマ照射により悪影響を受けないものの、エステル形成可能なペプチド等の官能基を有する化合物を共存させてプラズマ照射をすると、ポリマーが固定された表面にペプチド等を導入することが出来ることを見出した。なお、積極的にハロメチルスチレン部を含ませる(または残存させる)といているのは、特許文献4で使用されるブロックコポリマーのポリエチレン疎水性部にハロメチルスチレン部が残存し得ることが記載されていることが考慮されている。
(1) 生体適合性ポリマーが固定化された表面を有する生体または生体由来物質との接触型機材であって、
生体適合性ポリマーが
(a)式(I)
Aは、非置換または置換C1−C12アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式R'R"CH−基を表し、ここで、R'およびR"は独立してC1−C4アルコキシまたはR'とR"は一緒になって−OCH2CH2O−、−O(CH2)3O−もしくは−O(CH2)4O−を表し、
L1は、式
−(CH2)2−O−L1−部分は、結合、−(CH2)aS−、−CO(CH2)aS−、−(CH2)aNH−、−(CH2)aCO−、−CO−、−OCOO−、-CONH−からなる群より選ばれ連結基により置換されていてもよく、
L2−R1は、L2が−NH−または−O−であり、かつ、R1が下式
R3はクロロまたはブロモであり、
ZはH、SHまたはS(C=S)−Phであり、Phは1または2個のメチルまたはメトキシで置換されていてもよいフェニルを表し、
各aは0〜5の整数であり、
bは1〜5の整数であり、
mは5〜10,000の整数であり、
nは1〜50の整数であり、そして
kは1〜50の整数である、
ただし、nとkの付された単位(unit)は、一体となってmの付された反復単位のブロックセグメントとは別のブロックセグメントを形成し、nとkの付された単位はランダムに存在する、
で表されるコポリマーと、
(b)式(II)
Lは式
Xはクロロまたはブロモであり、
ZはH、SHまたはS(C=S)−Phであり、Phは1または2個のメチルまたはメトキシで置換されていてもよいフェニルを表し、
mは2〜10,000の整数であり、
nは1〜100の整数である、
で表されるコポリマー、または
式(III)
Ligはペプチド性リガンドを表し、
Yは水素であり、
mは2〜20の整数であり、
nは2〜10,000の整数である、
で表されるコポリマーである、
前記生体または生体由来物質との接触型機材。
(2) 式(I)のL1および式(II)のLが、パラキシリレン、メタキシリレンまたは−CH2CH2S−であり、式(III)のLigがArg−Gly−Aspを含むペプチドである、上記(1)に記載の生体または生体由来物質との接触型機材。
(3) 生体または生体由来物質との接触型機材の表面の改質方法であって、
当該表面に、
(a)式(I)
Aは、非置換または置換C1−C12アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式R'R"CH−基を表し、ここで、R'およびR"は独立してC1−C4アルコキシまたはR'とR"は一緒になって−OCH2CH2O−、−O(CH2)3O−もしくは−O(CH2)4O−を表し、
L1は、式
−(CH2)2−O−L1−部分は、結合、−(CH2)aS−、−CO(CH2)aS−、−(CH2)aNH−、−(CH2)aCO−、−CO−、−OCOO−、-CONH−からなる群より選ばれ連結基により置換されていてもよく、
L2−R1は、L2が−NH−または−O−であり、かつ、R1が下式
R3はクロロまたはブロモであり、
ZはH、SHまたはS(C=S)−Phであり、Phは1または2個のメチルまたはメトキシで置換されていてもよいフェニルを表し、
各aは0〜5の整数であり、
bは1〜5の整数であり、
mは5〜10,000の整数であり、
nは1〜50の整数であり、そして
kは1〜50の整数である、
ただし、nとkの付された単位(unit)は、一体となってmの付された反復単位のブロックセグメントとは別のブロックセグメントを形成し、nとkの付された単位はランダムに存在する、
で表されるコポリマーと、
(b)式(II)
Lは式
Xはクロロまたはブロモであり、
ZはH、SHまたはS(C=S)−Phであり、Phは1または2個のメチルまたはメトキシで置換されていてもよいフェニルを表し、
mは2〜10,000の整数であり、
nは1〜100の整数である、
で表されるコポリマー、または
式(III)
Ligはペプチド性リガンドを表し、
Yは水素であり、
mは2〜20の整数であり、
nは2〜10,000の整数である、
で表されるコポリマー
の水性溶液または水溶性有機溶媒の溶液をスピンコーティングする工程
を含んでなる、改質方法。
(4) 上記(3)に記載の改質方法であって、スピンコーティングする工程の後に、コーティング表面を大気圧低温プラズマ照射する工程をさらに含んでなる、改質方法。
(5) 上記(3)または(4)に記載の改質方法であって、式(II)に記載のポリマーを用いる場合に、大気圧低温プラズマ照射してリガンドを表面の活性エステルを介して表面に導入する工程をさらに含んでなる、改質方法。
(6) 式(II)
Lは式
Xはクロロまたはブロモであり、
ZはH、SHまたはS(C=S)−Phであり、Phは1または2個のメチルまたはメトキシで置換されていてもよいフェニルを表し、
mは2〜10,000の整数であり、
nは1〜100の整数である、
で表されるコポリマー。
(7) 式(III)
Ligはペプチド性リガンドを表し、
Yは水素であり、
mは1〜20の整数であり、
nは2〜10,000の整数である、
で表されるコポリマー。
式(I)で表せるコポリマーは、式中、Aは、非置換C1-12アルコキシが好ましく、C1-6アルコキシがより好ましく、C1アルコキシ(メチル)が最も好ましい。Aの定義に限定されるものでなく、本発明全体を通して、Ca−zアルコキシ若しくはアルキルのように表示される場合、炭素原子数a個〜z個を有する直鎖若しくは分岐のアルコキシ若しくはアルキルを意味し、アルキル部分若しくはアルキルとしては、限定されるものでないが、メチル、エチル、n−プロピル、iso−プロピル、n−ブチル、sec−ブチル、ペンチル、へキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、ウンデシル等を挙げることができる。
これらのポリマーはいずれも水溶性有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド(DMF)、テトラヒドロフラン(THP)等に溶解し、溶液を生体または生体由来物質との接触型機材の表面へ、それ自体公知のスピンコーティング法によりコーティングすればよい。例えば、生体または生体由来物質との接触型機材として市販の培養皿(コーニング社製)の表面へ周囲温度(25〜35℃)にて、1000rpm〜2500rpmにて、30秒〜数分間コーティングすればよい。
式(II)のポリマーとしては、NHS−PEG−CMSは、mが約114であり、nが4であるポリマー(以下、NHS−PEG−CMSという。)を使用し、
式(III)のポリマーとしては、次式
7.24−6.16ppm(m,16H),4.67−4.27ppm(m,8H),3.83−3.45ppm(s,470H),3.38ppm(m,2H),3.05(t、1H)2.81ppm(t、1H)、2.60ppm(m、4H),2.42(t、2H),2.00−1.50ppm(m,12H)
N454およびN442を10mg/mlの濃度でメタノールに溶解させ、0.45μmのフィルターを通して不溶物を除去した。下記の割合で混合し、そのうち30μLをスピンコート法によりコーティングした。コート条件は2000rpm、60秒で行った。コート後乾燥させ、乾燥した後にメタノール(1ml)で20回洗浄を行い、洗浄後乾燥
させて細胞培養に用いた。
上記の方法で作成した培養皿(コーニング社製)にインテグリン発現株であるHepG2を1X105 細胞を播種し一晩培養し顕微鏡により観察を行った。結果を表す図に代わる写真を図1に示す。
同様にMia PaCa2を用いて細胞の接着性について評価した。結果を表す図に代わる写真を図3に示す。
コーティングポリマーとして用いたNHS−PEG−CMSは、上記式中、mが約114であり、nが5である。
NHS−PEG−CMSの表面へのコーティング後、ペプチド(GRGDS)の水溶液をコーティング表面へ加えて反応させた。
用いたポリマーは、PEG−b−P(MTP−r−CMS)(N454)およびNHS−PEG−PCMSである。
・プラズマ処理:大気圧プラズマ。80 V,30 sec,He:2.5 L/分
・メタノール洗浄
・RGDペプチドとの反応。0.5mg/mlの生理食塩水。3時間反応。
下記手順を平板及び培養皿へのプラズマコーティング後に行った。
1. 平板をメタノール洗浄
2. 1.の後、PEG−b−P(MTP−r−CMS)(10mg/ml)をスピンコーティング
3. 2の後、コーティング表面のプラズマ照射(ポリエチレンおよびポリプロピレン:30秒、ポリスチレンおよびポリ塩化ビニル:2分)
4. 3の後、表面をメタノール洗浄
(1)実施例1 CH3SO3−(CH2CH2O)nSO2CH3: 1 の合成
得られた生成物1の1H NMRのスペクトルを図8に示す。
50mLフラスコ中に500mgの1、THF10mL、ジイソプロピルエチルアミン1mL、DMF20mLおよびRGD5mgを加え、室温で24時間反応させた。その後トリエチレンテトラミンを3g加えさらに24時間反応させた。反応混合液を500mLの冷2-プロパノールに沈殿させ、遠心分離(4℃C、9000rpm、2分)後、減圧乾燥した。生成物2の1H NMRスペクトルを図9に示す。
Claims (7)
- 生体適合性ポリマーが固定化された表面を有する生体または生体由来物質との接触型機材であって、
生体適合性ポリマーが
(a)式(I)
Aは、非置換または置換C1−C12アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式R'R"CH−基を表し、ここで、R'およびR"は独立してC1−C4アルコキシまたはR'とR"は一緒になって−OCH2CH2O−、−O(CH2)3O−もしくは−O(CH2)4O−を表し、
L1は、式
−(CH2)2−O−L1−部分は、結合、−(CH2)aS−、−CO(CH2)aS−、−(CH2)aNH−、−(CH2)aCO−、−CO−、−OCOO−、-CONH−からなる群より選ばれ連結基により置換されていてもよく、
L2−R1は、L2が−NH−または−O−であり、かつ、R1が下式
R3はクロロまたはブロモであり、
ZはH、SHまたはS(C=S)−Phであり、Phは1または2個のメチルまたはメトキシで置換されていてもよいフェニルを表し、
各aは0〜5の整数であり、
bは1〜5の整数であり、
mは5〜10,000の整数であり、
nは1〜50の整数であり、
kは1〜50の整数である、
ただし、nとkの付された単位(unit)は、一体となってmの付された反復単位のブロックセグメントとは別のブロックセグメントを形成し、nとkの付された単位はランダムに存在する、
で表されるコポリマーと、
(b)式(II)
Lは式
Xはクロロまたはブロモであり、
ZはH、SHまたはS(C=S)−Phであり、Phは1または2個のメチルまたはメトキシで置換されていてもよいフェニルを表し、
mは2〜10,000の整数であり、
nは1〜100の整数である、
で表されるコポリマー、または
式(III)
Ligはペプチド性リガンドを表し、
Yは水素であり、
mは1〜20の整数であり、
nは2〜10,000の整数である、
で表されるコポリマーである、
前記生体または生体由来物質との接触型機材。 - 式(I)のL1および式(II)のLが、パラキシリレン、メタキシリレンまたは−CH2CH2S−であり、式(III)のLigがArg−Gly−Aspを含むペプチドである、請求項1に記載の生体または生体由来物質との接触型機材。
- 生体または生体由来物質との接触型機材の表面の改質方法であって、
当該表面に、
(a)式(I)
Aは、非置換または置換C1−C12アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式R'R"CH−基を表し、ここで、R'およびR"は独立してC1−C4アルコキシまたはR'とR"は一緒になって−OCH2CH2O−、−O(CH2)3O−もしくは−O(CH2)4O−を表し、
L1は、式
−(CH2)2−O−L1−部分は、結合、−(CH2)aS−、−CO(CH2)aS−、−(CH2)aNH−、−(CH2)aCO−、−CO−、−OCOO−、-CONH−からなる群より選ばれ連結基により置換されていてもよく、
L2−R1は、L2が−NH−または−O−であり、かつ、R1が下式
R3はクロロまたはブロモであり、
ZはH、SHまたはS(C=S)−Phであり、Phは1または2個のメチルまたはメトキシで置換されていてもよいフェニルを表し、
各aは0〜5の整数であり、
bは1〜5の整数であり、
mは5〜10,000の整数であり、
nは1〜50の整数であり、そして
kは1〜50の整数である、
ただし、nとkの付された単位(unit)は、一体となってmの付された反復単位のブロックセグメントとは別のブロックセグメントを形成し、nとkの付された単位はランダムに存在する、
で表されるコポリマーと、
(b)式(II)
Lは式
Xはクロロまたはブロモであり、
ZはH、SHまたはS(C=S)−Phであり、Phは1または2個のメチルまたはメトキシで置換されていてもよいフェニルを表し、
mは2〜10,000の整数であり、
nは1〜100の整数である、
で表されるコポリマー、または
式(III)
Ligはペプチド性リガンドを表し、
Yは水素であり、
mは1〜20の整数であり、
nは2〜10,000の整数である、
で表されるコポリマー
の水性溶液または水溶性有機溶媒の溶液をスピンコーティングする工程
を含んでなる、改質方法。 - 請求項3に記載の改質方法であって、スピンコーティングする工程の後に、コーティング表面を大気圧低温プラズマ照射する工程をさらに含んでなる、改質方法。
- 請求項3または4に記載の改質方法であって、式(II)に記載のポリマーを用いる場合に、大気圧低温プラズマ照射してリガンドを表面の活性エステルを介して表面に導入する工程をさらに含んでなる、改質方法。
- 式(II)
Lは式
Xはクロロまたはブロモであり、
ZはH、SHまたはS(C=S)−Phであり、Phは1または2個のメチルまたはメトキシで置換されていてもよいフェニルを表し、
mは2〜10,000の整数であり、
nは1〜100の整数である、
で表されるコポリマー。 - 式(III)
Ligはペプチド性リガンドを表し、
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nは2〜10,000の整数である、
で表されるコポリマー。
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