JP2018074954A - 人工合成mRNAの発現を効率化する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素の機能抑制物質と、を組み合わせてなる、
標的細胞内で目的遺伝子を発現させるための組成物。
[2]前記mRNAを含有する第1要素と、前記機能抑制物質を含有する第2要素とからなるキットであることを特徴とする、[1]に記載の組成物。
[3]前記mRNAと前記機能抑制物質を含有することを特徴とする、[1]に記載の組成物。
[4]前記mRNAを含有し、標的細胞への導入時に、前記機能抑制物質が併用導入されることを特徴とする、[1]に記載の組成物。
[5]前記機能抑制物質を含有し、標的細胞への導入時に、前記mRNAが併用導入されることを特徴とする、[1]に記載の組成物。
[6]前記mRNAが5'キャップ構造、コザック配列、前記目的遺伝子のコード領域、及びポリ(A)鎖を備える、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の組成物。
[7]前記mRNAが、前記コード領域と前記ポリ(A)鎖の間に配置される安定化シス配列を更に備える、[6]に記載の組成物。
[8]前記機能抑制物質が以下の(a)〜(d)からなる群より選択される化合物である、[1]〜[7]のいずれか一項に記載の組成物:
(a)2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素を標的とするsiRNA;
(b)2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素を標的とするsiRNAを細胞内で生成する核酸コンストラクト;
(c)2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素を標的とするアンチセンス核酸;
(d)2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素を標的とするリボザイム。
[9]前記機能抑制物質が2',5'-オリゴアデニル酸誘導体である、[1]〜[7]のいずれか一項に記載の組成物。
[10]前記2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素が2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素3である、[1]〜[9]のいずれか一項に記載の組成物。
[11]前記遺伝子が酵素遺伝子である、[1]〜[10]のいずれか一項に記載の組成物。
[12]前記酵素が、ZFN、TALEN及びCRISPR-Cas9からなる群より選択されるヌクレアーゼである、[11]に記載の組成物。
[13][12]に記載の組成物を有効成分とする、B型肝炎ウイルス除去剤。
[14]以下のステップ(1)及び(2)を含む、標的細胞内で目的タンパク質を発現させる方法:
(1)標的細胞に2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素の機能抑制物質を導入するステップ;
(2)前記標的細胞に目的遺伝子のmRNAを導入するステップ。
[15]前記2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素が2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素3である、[14]に記載の方法。
[16]前記標的細胞が、生体から分離された状態の細胞である、[14]又は[15]に記載の方法。
本発明の第1の局面は標的細胞内で目的遺伝子を発現させるための組成物(以下、「本発明の組成物」とも呼ぶ)に関する。本発明者らの検討によって、細胞内に侵入した合成mRNAを外来性として認識し、細胞内mRNAから識別する機構が解明され、細胞内における人工合成mRNAの分解経路の全体像が明らかとなった。また、解明に成功した識別機構の中心分子である2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素(OAS)を阻害することによって人工合成mRNAが安定化され且つその翻訳量も増大し、人工合成mRNAの発現が効率化することが実験的に確認された。即ち、人工合成mRNAを標的細胞に導入する際にOASの機能を抑制する物質を併せて導入すれば、標的細胞内での人工合成mRNAの発現を効率化することができるとの知見が得られた。この知見に基づき、本発明の組成物は、二つの要素、即ち、目的遺伝子のmRNA(以下、「本発明のmRNA」とも呼ぶ)とOASの機能抑制物質(以下、「本発明の機能抑制物質」とも呼ぶ)を組み合わせて用いる点に特徴を有する。本明細書において「・・・を組み合わせて用いる」又は「・・・を組み合わせてなる」とは、上記二つの要素が併用されることをいう。併用の具体的な態様を以下で説明する。尚、人為的な操作によって調製されるという特徴を表すとともに、細胞内(内在性)mRNAと区別する目的で、本発明のmRNAのことを「人工合成mRNA」と呼称することがある。また、二つの用語「抑制」と「阻害」は、その意味するところが重複し、しばしば置換可能に用いられる。そこで本明細書では、前後の文脈から区別が特に必要な場合を除き、統一して用語「抑制」を使用する。
本発明の組成物の構成要素であるmRNA(本発明のmRNA)は目的遺伝子のコード領域(目的遺伝子の発現産物であるタンパク質をコードする領域)を備える。「目的遺伝子」とは、本発明のmRNAを利用して標的細胞内で発現させる遺伝子である。様々な遺伝子を目的遺伝子として採用できる。目的遺伝子の例は、酵素(例えばヌクレアーゼ(ZFN(Zinc Finger Nuclease)、TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)、CRISPR-Cas9等)、サイトカイン、ホルモン、神経伝達物質等の遺伝子、その機能低下(例えば変異によるもの)や欠損などが疾患の原因となる遺伝子、正常に機能をしているがその発現の増強が望まれる遺伝子、標的細胞が本来有しない遺伝子であってそれが発現されることにより標的細胞の生存、維持等に有益な遺伝子、標的細胞に作用し、標的細胞が本来有する機能を高めるタンパク質又は標的細胞が本来有する機能とは異なる機能を発揮させるタンパク質をコードする遺伝子、標的細胞には作用せず、標的細胞から分泌されて周囲の細胞に作用するタンパク質(例えば、細胞間ネットワークに関与するタンパク質)をコードする遺伝子である。標的細胞及び周囲の細胞に対しては実質的に作用しないタンパク質をコードする遺伝子も目的遺伝子となり得る。このような遺伝子として、例えば医薬品等に利用されるタンパク質等をコードする遺伝子(例えば、ヒトエリスロポエチン遺伝子、ヒトフィブリノーゲン遺伝子、ヒト血清アルブミン遺伝子、ヒトラクトフェリン遺伝子、ヒトα-グルコシダーゼ遺伝子)が挙げられる。かかる遺伝子を採用することにより、標的細胞内で医薬品等として利用可能な組換えタンパク質を産生させることが可能である。尚、ZFN遺伝子(IL28Bを標的としたもの)の配列を配列番号7(ZFN-right)及び配列番号8(ZFN-left)に、TALEN遺伝子の配列を配列番号9に、CRISPR-Cas9遺伝子の配列(例えばScience. 2013 Feb 15;339(6121):819-23.を参照することができる)を配列番号10にそれぞれ示す。
本発明における機能抑制物質は2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素(OAS)に作用し、OASによる人工合成mRNAの識別を抑制ないし阻害する。即ち、本発明の機能抑制物質の標的はOASである。OASは大別して、OAS1、OAS2、OAS3の3種類が存在することが知られている。機能抑制物質は、これらの分子の少なくとも1つに対して抑制効果を発揮する。ここで、本発明者らが明らかにした人工合成mRNA分解のメカニズムでは(図6を参照)、(i)人工合成mRNAは、細胞質に導入されるとオリゴアデニル酸合成酵素OAS3によって結合識別される。(ii)この人工合成mRNAを結合したOAS3はATPを基質にして2',5'-オリゴアデニル酸(2-5A)を合成する。(iii)2-5AはエンドヌクレアーゼRNaseLに結合し、不活性型のモノマーを活性型のダイマーへと変換する。(iv)一方で、細胞質において人工合成mRNAはリボソームによって翻訳されるが、細胞内mRNAと違ってmRNPを形成できない外来性の人工合成mRNAは翻訳効率が低いことと二次構造を形成しやすいため、リボソームが途中でストールする。(v)そのストールしたリボソームを識別してDom34-GTPBP2が会合し、これが活性型ダイマーとなったRNaseLを特異的にリクルートする。(vi)その結果、外来性の人工合成mRNAがRNaseLによって特異的に分解される。
(a)2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素(OAS)を標的とするsiRNA
(b)2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素(OAS)を標的とするsiRNAを細胞内で生成する核酸コンストラクト
(c)2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素(OAS)を標的とするアンチセンス核酸
(d)2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素(OAS)を標的とするリボザイム
CUACAGAGAGACUUCCUGA dTdT(配列番号14。後述の実施例で使用した配列)
CGCUCUGAGCUUAAAUGAU dTdT(配列番号15。後述の実施例で使用した配列)
GAAGGAUGCUUUCAGCCUA dTdT(配列番号16。後述の実施例で使用した配列)
本発明を利用して標的細胞内で目的遺伝子を発現させるためには、典型的には以下のステップ(1)及び(2)を行う。
(1)標的細胞に2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素の機能抑制物質(本発明の第2要素)を導入するステップ
(2)前記標的細胞に目的遺伝子のmRNA(本発明の第1要素)を導入するステップ
本発明の組成物によれば、標的細胞内で人工合成mRNAの発現を効率化することができ、目的タンパク質が高発現する。従って、本発明は、目的タンパク質の高発現が望まれる様々な用途への適用が可能である。本発明の用途の例として、(A)各種ウイルス性疾患(例えばB型肝炎、後天性免疫不全症候群AIDS、成人T細胞白血病)や遺伝病(例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー、嚢胞性腺維症、βサラセミア、Hurler症候群、網膜色素変性症、X連鎖型腎性尿崩症)の治療、(B)癌免疫療法、(C)iPS細胞の作製、(D)幹細胞(例えばiPS細胞やES細胞などの多分化能幹細胞)又は前駆細胞の分化誘導、を挙げることができる。
様々な臨床応用が期待されている人工合成mRNAの標的細胞内での発現の効率化を目指し、以下の検討を行った。
(1)プラスミド
RNAトランスフェクション用のベクターpBK-5F-EGFP-pA72は以下のように作製した。まず、オリゴヌクレオチド5’-ACC CTC GAC CCC ACC ATG GCA TCA ATG GAT -3’(配列番号17)と、5’-ATC GAA TTC AAG CTT AGT ACA GCT CGT CCA TGC C -3’(配列番号18)を用いpCMV-5xFlag-EGFP(Hosoda, N., Funakoshi, Y., Hirasawa, M., Yamagishi, R., Asano, Y., Miyagawa, R., Ogami, K., Tsujimoto, M., Hoshino, S. (2011) Anti-proliferative protein Tob negatively regulates CPEB3 target by recruiting Caf1 deadenylase. EMBO J 30, 1311-1323.)を鋳型としたPCR法により得られたDNA断片を、XhoIおよびEcoRIにより処理した。このDNA断片をpBluskript II SK(-)(アジレント・テクノロジー株式会社)のXhoI、EcoRIサイトに挿入し、pBK-5F-EGFPを得た。次に、オリゴヌクレオチド5’-CTT GAA TTC GAT ATC GTC GAC GCT CGC TTT CTT GCT GTC CAA TTT CT -3’(配列番号19)と、5’- GTC TCT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT CTA GAC ATC ATT GCA ATG AAA A -3’(配列番号20)を用いpFlag-CMV5/TO-BGG(Funakoshi et al., Mechanism of mRNA deadenylation: evidence for a molecular interplay between translation termination factor eRF3 and mRNA deadenylases. Genes Dev. 2007 Dec 1;21(23):3135-48.)を鋳型としたPCR法により得られたDNA断片を、EcoRIにより処理した。このDNA断片をpBK-5F-EGFPのEcoRIサイトおよび平滑化したBamHIサイトに挿入し、pBK-5F-EGFP-pA72を作製した。
<OAS1を標的としたsiRNA>
CUACAGAGAGACUUCCUGA dTdT(配列番号14)
<OAS2を標的としたsiRNA>
CGCUCUGAGCUUAAAUGAU dTdT(配列番号15)
<OAS3を標的としたsiRNA>
GAAGGAUGCUUUCAGCCUA dTdT(配列番号16)
T7 RNAポリメラーゼを用いて、pBK-5F-EGFP-pA72をBsmBIで処理したものを鋳型として5xFlag-EGFP-pA72 mRNAを合成した。RNA合成はT7 RNAポリメラーゼ(タカラバイオ株式会社)を用い、その取扱い説明書に従って行った。
HeLa細胞は5% 牛胎仔血清を添加したDulbecco’s Modified Eagle’s Medium (日水製薬)を用い5% CO2存在下37℃で培養した。HeLa細胞を25%コンフルエントとなるように35 mmディッシュに撒種し、24時間培養後、ディッシュあたり10 nMまたは、50 nMのsiRNAをLipofectamine RNAiMAX(ライフテクノロジーズ)を用い取扱い説明書に従って導入した。siRNA導入後48時間後に1.0μgのRNAをLipofectamine RNAiMAX(ライフテクノロジーズ)を用い取扱い説明書に従って導入した。プラスミドについてはPEI MAX (Polysciences, Inc)を用い取扱説明書に従って導入した。
RNAトランスフェクション後のHeLa細胞からのtotal RNAの単離は、グアニジンチオシアン酸塩、酸性フェノール、クロロホルムを用いた方法(AGPC法)により行った。調製したtotal RNAは、アガロースMOPSバッファーゲル(20 mM MOPS (pH 7.0), 5 mM 酢酸ナトリウム, 1 mM EDTA, 2.0 % アガロース, 2.46 M ホルムアルデヒド)により分離した後、アルカリ条件下(3 M 塩化ナトリウム, 8 mM 水酸化ナトリウム)でナイロン膜Biodyne-B (Pall)に転写した。転写後のナイロン膜は、UVで固定したのち、7% SDS, 250 mM Na3PO4 (pH 7.4), 2 mM EDTA 溶液中においてFlagプローブと42℃で一晩ハイブリダイゼーションした。Flagプローブは、ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ(TdT) (ライフテクノロジーズ) により、オリゴヌクレオチド5’-CTT ATC GTC GTC ATC CTT GTA ATC-3’(配列番号31)の3’末端に[α-33P]dATPを取り込ませることにより作製した。ナイロン膜に取り込まれた放射活性は、バイオ・イメージングアナライザーTyhoon FLA 7000 (GE Healthcare)を用い検出した。
タンパク質の細胞内発現は、以下に示すウエスタンブロット法により行った。導入後の細胞からのタンパク質ライセートの調製は、SDS-PAGEサンプルバッファー(50 mM Tris-HCl (pH6.8), 4%グリセロール, 2% SDS, 2% 2-メルカプトエタノール, 0.004%ブロモフェノールブルー) を用い行った。タンパク質ライセートは8、10、12、もしくは15%のアクリルアミドを用いたSDS-PAGE法により分離した後、ニトロセルロース膜BioTrace NC (Pall)に電気的に転写した。転写後のニトロセルロース膜は、抗Flag M2マウスモノクローナル抗体(Sigma)、抗Myc 9E10マウスモノクローナル抗体(Roche)、抗Myc(A-14)ラビットポリクローナル抗体(Santa Cruz)、もしくは抗GAPDH抗体(Saito, S., Hosoda, N., Hoshino, S. (2013) Hbs1-Dom34 functions in non-stop mRNA decay (NSD) in mammalian cells. J Biol Chem 288, 17832-17843.)およびペルオキシダーゼ付加抗マウスIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)、ペルオキシダーゼ付加抗ラットIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)、もしくはペルオキシダーゼ付加抗ウサギIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)とインキュベートした。ニトロセルロース膜上のペルオキシダーゼ酵素活性は、ルミノール化学発光法を用い、LAS3000mini(富士写真フィルム株式会社)により検出した。
タンパク質の結合実験は、以下に示す免疫沈降法により行った。細胞回収後、バッファーA (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.5% Nonidet P-40, 1 mM DTT, 5 mg/ml cOmplete mini (Roche)及び1 μg/ml RNase A (Sigma))もしくはバッファーB(20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 0.5% Nonidet P-40, 1 mM DTT, 5 mg/ml cOmplete mini (Roche)及び40 U/ml RNase inhibitor (TAKARA))により細胞を溶解した。15000 rpm/10分の遠心により得られた可溶化画分にanti-Flag M2 agarose (Sigma)またはanti-c-Myc agarose affinity gel antibody produced in rabbit (Sigma)を添加し、10℃で1時間転倒混和した。その後バッファーC(20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.5% Nonidet P-40, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 2 μg/ml aprotinin, 2 μg/ml leupeptin及び2 μg/ml PepstatinA)またはバッファーD(20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 0.5% Nonidet P-40及び1 mM DTT)によりビーズを洗浄後、SDS-PAGEサンプルバッファーを添加した。ウエスタンブロット法によりタンパク質を、ノザンブロット法によりmRNAを検出した。
HeLa細胞にOAS1 siRNA、OAS2 siRNA、OAS3 siRNAもしくはコントロールsiRNAとしてLuciferase siRNAを導入した。導入48時間後に5xFlag-EGFP-pA72 mRNAを導入し、その3時間後に細胞をPBSで洗浄し、その0、1、2、4時間後に細胞を回収した。回収した細胞からtotal RNAを単離し、ノザンブロット法で解析した。その結果、図1に示すように、OAS3のノックダウンにより5xFlag-EGFP-pA72 mRNAの安定化が観察されるが、OAS1及びOAS2のノックダウンにおいては有意な効果は観察されなかった。人工合成mRNAの分解においてOAS3が機能していることが明らかとなった。この結果は、外来性人工合成mRNAを識別するOAS3(図3を参照)を阻害すれば外来性人工合成mRNAが安定化することを示す。
本検討の成果により、新たにOAS3が人工合成mRNAの分解に機能することが明らかとなった。図3の実験に示したように、OAS3のsiRNAをトランスフェクトしOAS3の機能を抑制することで、人工合成mRNAを細胞内で安定化させ、産生されるタンパク質を増大することが可能である。先に、Dom34およびGTPBP2は人工合成mRNAの分解に機能することを示している(特許文献1)。さらに3’→5’方向の分解を触媒するエキソヌクレアーゼ-Ski複合体およびRNaseLにより人工合成mRNAが分解されることを示している(特許文献1)。これら報告と併せて考察すれば、以下の分子機構が想定される。OAS3は人工合成mRNAを識別し2-5Aを合成する。2-5Aにより活性化されたRNaseLはDom34と結合する。Dom34はGTPBPとともにストールしたリボソームに結合することが報告されている。人工合成mRNAでストールしたリボソーム近傍にDom34、GTPBPおよびRNaseLがリクルートされる。その結果、人工合成mRNAはRNaseLのもつエンドヌクレアーゼ活性によりエンド切断を受ける。こうしてできた断片化人工合成mRNAはエキソヌクレアーゼ-Ski複合体により分解される。
配列番号3:人工配列の説明:ベクター由来の配列
配列番号4:人工配列の説明:EGFP
配列番号5:人工配列の説明:制限酵素サイト
配列番号14:人工配列の説明:siRNA
配列番号15:人工配列の説明:siRNA
配列番号16:人工配列の説明:siRNA
配列番号17〜30:人工配列の説明:プライマー
配列番号31:人工配列の説明:プローブ
Claims (16)
- 目的遺伝子のmRNAと、
2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素の機能抑制物質と、を組み合わせてなる、
標的細胞内で目的遺伝子を発現させるための組成物。 - 前記mRNAを含有する第1要素と、前記機能抑制物質を含有する第2要素とからなるキットであることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記mRNAと前記機能抑制物質を含有することを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記mRNAを含有し、標的細胞への導入時に、前記機能抑制物質が併用導入されることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記機能抑制物質を含有し、標的細胞への導入時に、前記mRNAが併用導入されることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記mRNAが5'キャップ構造、コザック配列、前記目的遺伝子のコード領域、及びポリ(A)鎖を備える、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記mRNAが、前記コード領域と前記ポリ(A)鎖の間に配置される安定化シス配列を更に備える、請求項6に記載の組成物。
- 前記機能抑制物質が以下の(a)〜(d)からなる群より選択される化合物である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物:
(a)2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素を標的とするsiRNA;
(b)2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素を標的とするsiRNAを細胞内で生成する核酸コンストラクト;
(c)2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素を標的とするアンチセンス核酸;
(d)2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素を標的とするリボザイム。 - 前記機能抑制物質が2',5'-オリゴアデニル酸誘導体である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素が2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素3である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記遺伝子が酵素遺伝子である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記酵素が、ZFN、TALEN及びCRISPR-Cas9からなる群より選択されるヌクレアーゼである、請求項11に記載の組成物。
- 請求項12に記載の組成物を有効成分とする、B型肝炎ウイルス除去剤。
- 以下のステップ(1)及び(2)を含む、標的細胞内で目的タンパク質を発現させる方法:
(1)標的細胞に2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素の機能抑制物質を導入するステップ;
(2)前記標的細胞に目的遺伝子のmRNAを導入するステップ。 - 前記2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素が2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素3である、請求項14に記載の方法。
- 前記標的細胞が、生体から分離された状態の細胞である、請求項14又は15に記載の方法。
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