CN114729363A - Il-34反义剂及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本文公开了IL‑34抑制剂，包括IL‑34反义寡核苷酸序列，以及用于治疗与升高的IL‑34活性或表达相关的炎性疾病诸如炎性肠病和/或纤维化的方法。还公开了对于治疗炎性疾病和/或纤维化有用的包含IL‑34抑制剂，例如IL‑34反义寡核苷酸的药物组合物，和待在治疗炎性疾病和/或纤维化中使用的包含所公开的IL‑34抑制剂的药物的制备。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年11月15日提交的美国临时专利申请第62/935,819号的权益和优先权，为了所有目的，特此将该申请的公开内容通过引用以其整体并入。
序列表
本申请包括序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子地提交并且在此通过引用以其整体并入。于2020年11月13日生成的所述ASCII副本被命名为GIU-060WO_SL_ST25.txt并且大小为21,080字节。
背景
白介素-34(IL-34)是最近发现的细胞因子，其在功能上与巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF，也称为MCSFl和MCSF-1)重叠，巨噬细胞集落刺激因子为在骨退行性疾病诸如类风湿性关节炎中的炎症和破骨细胞生成的介质。炎性疾病(急性的和慢性的二者)是仍未完全了解的重要疾病类别。
例如，炎性肠病是一种胃肠道慢性炎性紊乱，在美国约有140万患者患有该病。它是美国五大最普遍的胃肠疾病负担之一，总医疗保健费用超过17亿美元。在美国，炎性肠病每年导致超过700,000次门诊、100,000次住院和119,000名患者失能。目前无法医学治愈，因此疾病管理需要终生护理。
最常见的两种炎性肠病形式是克罗恩病和溃疡性结肠炎。虽然克罗恩病可以影响整个胃肠道，但它主要影响回肠(小肠的远端或下部)和大肠。溃疡性结肠炎主要影响结肠和直肠。炎性肠病的病因尚不完全清楚，尽管环境和遗传因素二者都被认为在该疾病中发挥作用。环境组成可能包括通过暴露于摄入的食物和药物而受到影响的肠道菌群改变。
炎性肠病伴随腹痛、呕吐、腹泻、直肠出血、严重痛性痉挛(severe cramp)、肌肉痉挛、体重减轻、营养不良、发热和贫血。患有炎性肠病患者也可能患有皮肤病变、关节痛、眼部炎症和肝紊乱，并且患有溃疡性结肠炎的儿童可能患有发育缺陷。虽然很少致命，但这些症状会降低患者的生活质量。
因此，迫切需要开发治疗炎性紊乱诸如炎性肠病的可靠方法。还需要鉴定为遍及广泛患者的症状提供有效和长期的缓解并且不伴随负面副作用或炎症和缓解循环(cyclesof inflammation and remission)的治疗方法。
概述
本文描述了抑制IL-34基因表达的剂，例如IL-34反义寡核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供了IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其包含本文描述的SEQ IDNO:1-8中任一项的反义寡核苷酸序列。例如，本发明的IL-34反义寡核苷酸可以是包含以下序列的反义寡核苷酸：5’-CTCACCAAGACCCACAG-3’(SEQ ID NO:1)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接；5’-GGCTTTGGGCCGCACCAGCT-3’(SEQ ID NO:2)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接；5’-CTTTGGGCCGCACCAGCTTC-3’(SEQ ID NO:3)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接；5’-TGGGCCGCACCAGCTTCAGG-3’(SEQ ID NO:4)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接；5’-TCCATGACCCGGAAGCAGTT-3’(SEQ ID NO:5)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接；或5’-TGTTTCATGTACTGAAG-3’(SEQ ID NO:6)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含SEQ ID NO:3的序列，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷酸和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接。在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含SEQ ID NO:3的序列，其中至少一个胞苷被化学修饰。在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含5’-CTTTGGGCXGCACCAGCTTC-3’(SEQ ID NO:7)的序列，其中X是5-甲基胞苷。在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含SEQ ID NO:5的序列，其中至少一个胞苷被化学修饰；任选地，其中SEQ ID NO:5的第10位的胞苷被化学修饰，并且核苷酸序列是5’-TCCATGACCXGGAAGCAGTT-3’(SEQ ID NO:8)，并且其中X是5-甲基胞苷。
在一些实施方案中，本文描述的反义寡核苷酸可以包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。例如，在本文描述的一些实施方案中，IL-34反义寡核苷酸，例如SEQ ID NO:1-8中任一项的IL-34反义寡核苷酸，可以包括一种或更多种核糖核苷酸。在本文描述的一些实施方案中，IL-34反义寡核苷酸，例如SEQ ID NO:1-8中任一项的IL-34反义寡核苷酸，可以包括一种或更多种脱氧核糖核苷酸。在本文描述的一些实施方案中，IL-34反义寡核苷酸可以包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物。
在本文描述的一些实施方案中，IL-34反义寡核苷酸可以包括一个或更多个锁核酸(“LNA”)核苷酸。本文描述的IL-34反义寡核苷酸，例如SEQ ID NO:1-8中任一项的IL-34反义寡核苷酸，可以包括一个或更多个LNA核苷酸，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、1-5个、5-10个、5-12个或更多个LNA核苷酸。在一些实施方案中，本文描述的IL-34反义寡核苷酸的每个核苷酸是LNA核苷酸。
在特定的实施方案中，IL-34反义寡核苷酸包括LNA核苷酸，并且IL-34反义寡核苷酸的序列选自以下之一：
·5’-cttTGGGCXGCACCAGCttc-3’(SEQ ID NO:9)，其中c为LNA胞苷，t为LNA胸苷，并且X为5-甲基胞苷；
·5’-ctttGGGCXGCACCAGcttc-3’(SEQ ID NO:10)，其中c为LNA胞苷，t为LNA胸苷，并且X为5-甲基胞苷；
·5’-cttTGGGCcgCACCAGCttc-3’(SEQ ID NO:11)，其中c为LNA胞苷，t为LNA胸苷，并且g为LNA鸟苷；
·5’-cttTGGGCcGCACCAGCttc-3’(SEQ ID NO:12)，其中c为LNA胞苷，并且t为LNA胸苷；
·5’-ggcXGCACCAGCttc-3’(SEQ ID NO:13)，其中c是LNA胞苷，t是LNA胸苷，g是LNA鸟苷，并且X是5-甲基胞苷；
·5’-cttTGGGCXGCACcag-3’(SEQ ID NO:14)，其中c为LNA胞苷，t为LNA胸苷，g为LNA鸟苷，a为LNA腺苷，并且X为5-甲基胞苷；和
·5’-tgaCCXGGAAGCAgtt-3’(SEQ ID NO:15)，其中a为LNA腺苷，t为LNA胸苷，g为LNA鸟苷，并且X为5-甲基胞苷，
或其药学上可接受的盐。
此外，在本文描述的实施方案中，IL-34反义寡核苷酸可以包含化学修饰的核苷，例如2’-O-甲基(“2’-OMe”)核糖核苷，例如2’-O-甲基胞苷、2’-O-甲基鸟苷、2’-O-甲基胸苷、2’-O-甲基尿苷，和/或2’-O-甲基腺苷。本文描述的IL-34反义寡核苷酸也可以包含一个或更多个化学修饰的碱基，包括5-甲基嘧啶，例如5-甲基胞嘧啶；和/或5-甲基嘌呤，例如5-甲基鸟嘌呤。本文描述的IL-34反义寡核苷酸还可以包含任何以下化学修饰的核苷：5-甲基-2’-O-甲基胞苷、5-甲基-2’-O-甲基胸苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷和/或5-甲基-2’-脱氧胞苷。此外，本文描述的IL-34反义寡核苷酸可以包含一个或更多个2’-O-(2-甲氧基乙基)(“2’-MOE”)核苷、2’-脱氧-2’-氟核苷、2’-氟-β-D-阿糖核苷、桥接核酸、LNA核苷酸、约束乙基’(cET)核酸、三环-DNA(tcDNA)、2’-O,4’-C-亚乙基连接核酸(ENA)和/或肽核酸(PNA)。本文描述的实施方案包括SEQ ID NO:1-15中任一项的IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其包含一个或更多个前述化学修饰核苷中的任一种。在一些实施方案中，IL-34反义寡核苷酸序列的至少一个核苷是化学修饰的核苷。例如，在一些实施方案中，IL-34反义寡核苷酸序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、1-5个、1-10个、1-14个、1-15个、1-16个、1-19个、5-10个、5-14个、5-15个、5-19个、10-14个、10-15个或10-19个核苷是化学修饰的核苷。
在特定实施方案中，本文描述的IL-34反义寡核苷酸包含2’-MOE核苷。在一些实施方案中，IL-34反义寡核苷酸的序列选自以下之一：
·5’-CxTxTxTxGxGGCXGCACCAGxCxTxTxCx-3’(SEQ ID NO:16)，其中Cx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷，Tx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷，Gx为2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷，并且X为5-甲基胞苷；
·5’-TxCxCxAxTxGACCXGGAAGCxAxGxTxTx-3’(SEQ ID NO:17)，其中Cx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷，Tx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷，Gx为2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷，Ax为2’-O-(2-甲氧基乙基)腺苷，并且X为5-甲基胞苷；
·5’-CxTxTxTxGxGxGCXGCACCAxGxCxTxTxCx-3’(SEQ ID NO:18)，其中Cx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷，Tx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷，Gx为2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷，Ax为2’-O-(2-甲氧基乙基)腺苷，并且X为5-甲基胞苷；
·5’-TxCxCxAxTxGxACCXGGAAGxCxAxGxTxTx-3’(SEQ ID NO:19)，其中Cx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷，Tx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷，Gx为2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷，Ax为2’-O-(2-甲氧基乙基)腺苷，并且X为5-甲基胞苷；
·5’-CxTxTxTxGxGxGxCxXGxCxAxCxCxAxGxCxTxTxCx-3’(SEQ ID NO:20)，其中Cx是2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷，Tx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷，Gx为2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷，Ax为2’-O-(2-甲氧基乙基)腺苷，并且X为5-甲基胞苷；和
·5’-TxCxCxAxTxGxAxCxCxXGxGxAxAxGxCxAxGxTxTx-3’(SEQ ID NO:21)，其中Cx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷，Tx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷，Gx为2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷，Ax为2’-O-(2-甲氧基乙基)腺苷，并且X为5-甲基胞苷，
或其药学上可接受的盐。
另外，在一些实施方案中，本文描述的IL-34反义寡核苷酸包含2’-OMe核苷。在一些实施方案中，IL-34反义寡核苷酸的序列选自以下之一：
·5’-CyTyTyTyGyGGCXGCACCAGyCyTyTyCy-3’(SEQ ID NO:22)，其中Cy为2’-O-甲基胞苷，Ty是2’-O-甲基胸苷，Gy是2’-O-甲基鸟苷，并且X是5-甲基胞苷；和
·5’-TyCyCyAyTyGACCXGGAAGCyAyGyTyTy-3’(SEQ ID NO:23)，其中Cy为2’-O-甲基胞苷，Ty是2’-O-甲基胸苷，Gy是2’-O-甲基鸟苷，Ay为2’-O-甲基腺苷，并且X是5-甲基胞苷，
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本文描述的IL-34反义寡核苷酸包含一个或更多个修饰的核苷间连接。例如，在一些实施方案中，IL-34反义寡核苷酸是其中序列的至少一个核苷间连接是以下的反义寡核苷酸：硫代磷酸酯连接、二硫代磷酸酯连接、磷酸三酯连接、烷基膦酸酯连接、氨基烷基磷酸三酯连接、亚烷基膦酸酯连接、亚膦酸酯连接(phosphinatelinkage)、磷酰胺连接和氨基烷基磷酰胺连接、硫代磷酰胺连接、硫羰烷基膦酸酯连接、硫羰烷基磷酸三酯连接、硫代磷酸酯连接、硒代磷酸酯连接或硼烷磷酸酯连接。在特定实施方案中，IL-34反义寡核苷酸序列的至少一个核苷间连接是硫代磷酸酯连接。例如，在一些实施方案中，IL-34反义寡核苷酸序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、1-5个、1-10个、1-14个、1-15个、1-16个、1-19个、5-10个、5-14个、5-15个、5-19个、10-14个、10-15个或10-19个核苷间连接是硫代磷酸酯连接。在一些实施方案中，反义寡核苷酸序列的所有核苷间连接均为硫代磷酸酯连接。
本文描述的IL-34反义寡核苷酸中包含的核苷酸的数目可以变化。例如，在一些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为15-20个、15-25个、15-30个、15-35个、20-25个、20-30个、20-35个、25-30个、25-35个或30-35个核苷酸。在特定实施方案中，反义寡核苷酸的长度为15-25个核苷酸。在特定实施方案中，反义寡核苷酸的长度为20-25个核苷酸。在一些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个或35个核苷酸。在一些实施方案中，本文描述的反义寡核苷酸包含最大数目的核苷酸。在一些实施方案中，IL-34反义寡核苷酸的长度不超过15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个或35个核苷酸。
在一种实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:1-23中任一项的反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐的化合物。例如，在一些实施方案中，化合物包含SEQ ID NO:3的反义寡核苷酸，其中至少一个胞苷被化学修饰。在一些实施方案中，化合物包含SEQ ID NO:7的反义寡核苷酸，其中X是5-甲基胞苷。
在本文描述的实施方案中，IL-34反义寡核苷酸，例如SEQ ID NO:1-15中任一项的IL-34反义寡核苷酸，或其药学上可接受的盐的核苷，可以被化学修饰的核苷取代。例如，在一些实施方案中，IL-34反义寡核苷酸的一个或更多个胞苷被5-甲基胞苷代替。在一些实施方案中，反义寡核苷酸可以包含一个或更多个修饰的核苷酸，例如，5-甲基-2’-脱氧胞苷。例如，在不同的实施方案中，本公开内容的IL-34反义寡核苷酸包括或可以包括包含脱氧胞苷和/或5-甲基-2’-脱氧胞苷的核苷酸，包括但不限于5-甲基-2’-脱氧胞苷5’-单磷酸和5-甲基-2’-脱氧胞苷-5’-单硫代磷酸酯。例如，在本文描述的实施方案中，SEQ ID NO:1-15中任一项的IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐的一个或更多个胞苷核苷可各自被5-甲基胞苷取代。在一些特定实施方案中，本文描述的IL-34反义寡核苷酸的一个胞苷核苷被5-甲基胞苷取代。
本文还描述了其中向有相应需要的患者施用IL-34反义寡核苷酸的治疗方法。例如，本文描述了治疗炎性疾病的方法，包括向有相应需要的患者施用有效量的本文描述的IL-34反义寡核苷酸，例如SEQ ID NO:1-23中任一项的IL-34反义寡核苷酸。本文还描述了抑制患有炎性疾病的患者的细胞中炎性细胞因子产生的方法，包括施用有效量的本文描述的IL-34反义寡核苷酸，例如SEQ ID NO:1-15中任一项的IL-34反义寡核苷酸。
本文还描述了减少或抑制患有炎性疾病的患者的一个或更多个细胞中IL-34介导的炎症应答的方法，包括施用有效量的IL-34反义寡核苷酸，例如SEQ ID NO:1-15中任一项的IL-34反义寡核苷酸。本文还描述了治疗有相应需要的患者的与改变的IL-34表达相关的炎性疾病的方法，该方法包括施用有效量的IL-34反义寡核苷酸。例如，本文描述了治疗有相应需要的患者中与增加的IL-34表达相关的炎性疾病的方法，其中该方法包括施用有效量的SEQ ID NO:1-23中任一项的IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐。增加的IL-34表达可以是相对于IL-34表达的对照水平，例如，在健康对照患者或健康对照患者队列中测量的IL-34的平均或中位水平，或者在与增加的IL-34表达相关的疾病发作或检测到之前在患者中测量的IL-34水平。
本文还描述了治疗有相应需要的患者的与改变的IL-34表达相关的炎性疾病的方法，包括施用有效量的IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，例如SEQ ID NO:1-23中任一项的IL-34反义寡核苷酸。
本文还描述了抑制患有炎性疾病的患者的细胞中IL-34介导的巨噬细胞集落刺激因子受体(M-CSFR-1)信号传导的方法，包括施用有效量的IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，例如SEQ ID NO:1-23中任一项的IL-34反义寡核苷酸。
本文还描述了减少或消除患有炎性疾病的患者的纤维化狭窄的方法，包括施用有效量的IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，例如SEQ ID NO:1-23中任一项的IL-34反义寡核苷酸。在一些实施方案中，纤维化狭窄位于肠中，例如大肠或小肠中。在特定实施方案中，纤维化狭窄位于大肠中。在一些实施方案中，纤维化狭窄定位于大肠和/或小肠的一个或更多个部分，例如盲肠、回肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠、直肠、***、十二指肠和/或空肠。
本文描述的方法可用于治疗一种或更多种炎性疾病，包括但不限于炎性肠病、类风湿性关节炎、银屑病、骨关节炎、糖尿病(I型和II型)、组织或器官排斥、多发性硬化、牙周炎症、牙周炎、色素沉着绒毛结节性滑膜炎、肝炎、鼻窦炎、结肠癌、结肠直肠癌、结肠炎相关性结肠癌、散发性结肠直肠癌、冠状动脉疾病、干燥综合征(SS)、肥胖症、慢性炎症、肺结节病、皮肤病变、CNS炎性疾病和自身免疫性疾病。在一些实施方案中，本发明的方法可用于治疗哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)或特发性肺纤维化(IPF)。在一些实施方案中，炎性疾病是炎性肠病。在一些实施方案中，炎性肠病是克罗恩病、胃十二指肠克罗恩病、克罗恩(肉芽肿性)结肠炎、炎性克罗恩病、纤维狭窄性克罗恩病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、白塞病、微观结肠炎、溃疡性直肠炎、直肠乙状结肠炎、空肠回肠炎、左侧结肠炎、全结肠炎、回肠结肠炎、回肠炎或未定型性结肠炎。在特定的实施方案中，炎性肠病是炎性克罗恩病或纤维狭窄性克罗恩病。
在一些实施方案中，IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐局部(topically)、肠胃外、口服、肺部、气管内、鼻内、透皮或十二指肠内施用。在特定的实施方案中，IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐口服施用。
在一些实施方案中，需要治疗的患者是人类。
本文还描述了药学上可接受的组合物，其包含本文描述的IL-34反义寡核苷酸，例如SEQ ID NO:1-23中任一项的IL-34反义寡核苷酸，或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物适用于局部、肠胃外、口服、肺部、气管内、鼻内、透皮或十二指肠内施用。
本文还描述了用作药物的IL-34反义寡核苷酸。例如，SEQ ID NO:1-23中任一项的IL-34反义寡核苷酸可用作药物。
本文还描述了IL-34反义寡核苷酸，例如SEQ ID NO:1-23中任一项的IL-34反义寡核苷酸在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途。在一些实施方案中，炎性疾病是炎性肠病、类风湿性关节炎、银屑病、骨关节炎、糖尿病(I型和II型)、组织或器官排斥、多发性硬化、牙周炎症、牙周炎、色素沉着绒毛结节性滑膜炎、肝炎、鼻窦炎、结肠癌、结肠直肠癌、结肠炎相关性结肠癌、散发性结肠直肠癌、冠状动脉疾病或干燥综合征(SS)、肥胖症、慢性炎症、肺结节病、皮肤病变、CNS炎性疾病或自身免疫性疾病。本文还描述了IL-34反义寡核苷酸在制备用于治疗哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)或特发性肺纤维化(IPF)的药物中的用途。在一些实施方案中，炎性疾病是炎性肠病。在一些实施方案中，炎性肠病是克罗恩病、炎性克罗恩病、纤维狭窄性克罗恩病、胃十二指肠克罗恩病、克罗恩(肉芽肿性)结肠炎、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、白塞病、微观结肠炎、溃疡性直肠炎、直肠乙状结肠炎、空肠回肠炎、左侧结肠炎、全结肠炎、回肠结肠炎、回肠炎或未定型性结肠炎。在一些实施方案中，炎性肠病是炎性克罗恩病或纤维狭窄性克罗恩病。
本文还描述了用于治疗炎性疾病的IL-34反义寡核苷酸，例如SEQ ID NO:1-23中任一项的IL-34反义寡核苷酸。在一些实施方案中，炎性疾病是炎性肠病、类风湿性关节炎、银屑病、骨关节炎、糖尿病(I型和II型)、组织或器官排斥、多发性硬化、牙周炎症、牙周炎、色素沉着绒毛结节性滑膜炎、肝炎、鼻窦炎、结肠癌、结肠直肠癌、结肠炎相关性结肠癌、散发性结肠直肠癌、冠状动脉疾病或干燥综合征(SS)、肥胖症、慢性炎症、肺结节病、皮肤病变、CNS炎性疾病或自身免疫性疾病。本文还描述了用于治疗哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)或特发性肺纤维化(IPF)的IL-34反义寡核苷酸。在一些实施方案中，炎性疾病是炎性肠病。在一些实施方案中，炎性肠病是克罗恩病、炎性克罗恩病、纤维狭窄性克罗恩病、胃十二指肠克罗恩病、克罗恩(肉芽肿性)结肠炎、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、白塞病、微观结肠炎、溃疡性直肠炎、直肠乙状结肠炎、空肠回肠炎、左侧结肠炎、全结肠炎、回肠结肠炎、回肠炎或未定型性结肠炎。在一些实施方案中，炎性肠病是炎性克罗恩病或纤维狭窄性克罗恩病。
本文还描述了抑制受试者细胞中IL-34表达的方法，包括向受试者施用药学有效量的药物制品，所述药物制品包括IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，例如SEQ IDNO:1-23中任一项的反义寡核苷酸。本文还描述了抑制受试者细胞中一种或更多种胶原表达的方法，包括向受试者施用药学有效量的药物制品，所述药物制品包括IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，例如SEQ ID NO:1-23中任一项的反义寡核苷酸。在上述方法的一些实施方案中，细胞是肠细胞，例如，肠***(intestinal stromal cell)、肠上皮细胞、肠干细胞、分泌细胞、肠细胞(enterocyte)、杯形细胞、肠内分泌细胞、帕内特细胞、转运扩增细胞、微皱褶细胞、杯状细胞或簇状细胞。在一些实施方案中，细胞形成肠纤维化狭窄的一部分。在上述实施方案中，受试者可以需要炎性疾病或纤维化，例如炎性克罗恩病或纤维狭窄性克罗恩病的治疗的受试者。在一些实施方案中，本文描述的方法可用于抑制受试者细胞中一种或更多种胶原的表达，例如，I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原、V型胶原、VI型胶原、VII型胶原、VIII型胶原、IX型胶原、X型胶原、XI型胶原、XII型胶原、XIII型胶原、XIV型胶原、XV型胶原、XVI型胶原、XVII型胶原、XVIII型胶原、XIX型胶原、XX型胶原、XXI型胶原、XXII型胶原、XXIII型胶原、XXIV型胶原、XXV型胶原、XXVI型胶原、XXVII型胶原、XXVIII型胶原或XXIX型胶原。例如，在本文描述的实施方案中，胶原是COL1A1、COL1A2II、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2、COL5A3、COL6A1、COL6A2、COL6A3、COL6A5、COL7A1、COL8A1、COL8A2、COL9A1、COL9A2、COL9A3、COL10A1、COL11A1、COL11A2、COL12A1、COL13A1、COL14A1、COL15A1、COL16A1、COL17A1、COL18A1、COL19A1、COL20A1、COL21A1、COL22A1、COL23A1、COL24A1、COL25A1、EMID2、COL27A1、COL28A1或COL29A1。在特定的实施方案中，胶原是COL1A1(胶原1A)、COL3A1(胶原3A)或其混合物。在某些实施方案中，药物制品可以口服施用。在某些实施方案中，受试者是人类。
在各种实施方案中，本发明是治疗或预防纤维化，例如肠纤维化、肺纤维化或肝纤维化，或防止胶原沉积的方法，包括抑制患有纤维化的患者中的IL-34。本发明还可以是治疗或防止纤维化或防止胶原沉积的方法，其中该方法包括抑制细胞例如肠细胞中的IL-34。在一些实施方案中，本发明可以是治疗或预防患者中的纤维化或防止胶原沉积的方法，其中该方法包括向患者施用有效量的IL-34特异性抑制剂，例如，IL-34反义寡核苷酸，例如，包含SEQ ID NO:1-23中任一项的核苷酸序列的IL-34反义寡核苷酸，或其药学上可接受的盐。
本文还描述了IL-34反义寡核苷酸在制备用于治疗纤维化的药物中的用途。在一些实施方案中，纤维化是肠纤维化。在一些实施方案中，纤维化是肺纤维化。在其他实施方案中，纤维化是肾纤维化、心脏纤维化、心内膜心肌纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化或肾源性***性纤维化。
本文还描述了用于治疗纤维化的IL-34反义寡核苷酸。在一些实施方案中，纤维化是肠纤维化。在一些实施方案中，纤维化是肺纤维化。在其他实施方案中，纤维化是肾纤维化、心脏纤维化、心内膜心肌纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化或肾源性***性纤维化。
在一些实施方案中，患有纤维化(例如肠纤维化)的患者先前已患有炎性肠病或正在患有炎性肠病，或者患者在肠纤维化之前患有炎性肠病。在一些实施方案中，炎性肠病是炎性克罗恩病或纤维狭窄性克罗恩病。
在一些实施方案中，患有肠纤维化的患者先前已患有结肠炎或正在患有结肠炎，或者患者在肠纤维化之前患有结肠炎。在一些实施方案中，结肠炎是急性结肠炎。在一些实施方案中，结肠炎是慢性结肠炎。
在本发明的一些实施方案中，患者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人类。
应当理解，在本文描述的本发明的方法中向患有纤维化的患者施用IL-34反义寡核苷酸可以通过各种施用途径施用。在各种实施方案中，IL-34反义寡核苷酸可以通过一种或数种途径施用，包括口服、局部、肠胃外，例如，通过皮下注射，通过吸入喷雾，或直肠。如本文使用的术语肠胃外包括皮下注射，胰腺内施用，以及静脉内、肌内、腹膜内和胸骨内注射或输注技术。在优选实施方案中，可以向患有纤维化例如肠纤维化或肺纤维化的患者口服施用IL-34反义寡核苷酸。
本发明可提供包括施用能够靶向IL-34RNA进行降解、干扰RNA剪接或阻止IL-34基因表达或蛋白翻译的IL-34反义寡核苷酸的方法。本发明的IL-34反义寡核苷酸可以靶向小鼠和/或人类IL-34mRNA的各种区域以进行结合。人类IL-34mRNA序列为以下NCBI参考序列的序列：NM_001172771.1(SEQ ID NO:24)、NM_001172772.1(SEQ ID NO:25)或NM_152456.2(SEQ ID NO:26)。小鼠IL-34mRNA序列为以下NCBI参考序列的序列：NM_001135100.2(SEQID NO:27)或NM_029646.3(SEQ ID NO:28)。
IL-34反义寡核苷酸的序列可选自能够靶向IL-34RNA的多个序列。在本发明的一些实施方案中，反义寡核苷酸是硫代磷酸酯反义寡核苷酸，即其中至少一些核苷酸间连接是硫代磷酸酯连接的寡核苷酸，其适于递送到患者细胞。此外，本发明的反义寡核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如，含有修饰碱基的核苷酸，例如，5-甲基-2’-脱氧胞苷。
在本发明的一些实施方案中，治疗患者中的纤维化例如肠纤维化，预防肠纤维化或肺纤维化或防止胶原沉积的方法包括施用药物组合物，例如，包含IL-34的特异性抑制剂例如IL-34反义寡核苷酸和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物肠胃外施用。在一些实施方案中，药物组合物口服施用。在一些实施方案中，药物组合物包含肠溶包衣，例如，包含丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物的肠溶包衣。
在本发明的实施方案中，治疗和/或预防炎性疾病(例如，炎性克罗恩病或纤维狭窄性克罗恩病)，治疗、减少和/或消除患者(例如，患有纤维狭窄性克罗恩病的患者)中的纤维性狭窄，治疗纤维化(例如，肠纤维化或肺纤维化)、预防纤维化(例如，肠纤维化或肺纤维化)、或治疗、改善或防止患者中的胶原沉积的方法包括施用不同量的IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，或包含IL-34反义寡核苷酸例如包含SEQ ID NO:1-23之一的序列的IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐的药物组合物。在一些实施方案中，本发明的方法包括施用至少1μg、至少5μg、至少10μg、至少20μg、至少30μg、至少40μg、至少50μg、至少60μg、至少70μg、至少80μg、至少90μg或至少100μg的反义寡核苷酸。在一些实施方案中，本发明的方法包括施用35mg至500mg、1mg至10mg、10mg至20mg、20mg至30mg、30mg至40mg、40mg至50mg、50mg至60mg、60mg至70mg、70mg至80mg、80mg至90mg、90mg至100mg、100mg至150mg、150mg至200mg、200mg至250mg、250mg至300mg、300mg至350mg、350mg至400mg、400mg至450mg、450mg至500mg、500mg至600mg、600mg至700mg、700mg至800mg、800mg至900mg、900mg至1g、1mg至50mg、20mg至40mg或1mg至500mg的IL-34反义寡核苷酸或包含IL-34反义寡核苷酸的药物组合物。
本文还提供了预防或治疗肝纤维化、肺纤维化或肠纤维化的方法，其中该方法包括向有相应需要的患者施用包含IL-34抑制剂，例如IL-34反义寡核苷酸诸如本文公开的IL-34反义寡核苷酸的药物制品。还提供了预防或治疗肾纤维化、心脏纤维化、心内膜心肌纤维化、特发性肺纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化和/或肾源性***性纤维化的方法，其中该方法包括向有相应需要的患者施用包含IL-34反义寡核苷酸诸如本文公开的IL-34反义寡核苷酸的药物制品。
本文还描述了基于核苷酸的IL-34抑制剂，其包括但不限于IL-34小发夹RNA(shRNA)、IL-34小干扰RNA(siRNA)和IL-34吗啉寡聚物、IL-34微RNA(miRNA)以及包含这样的化合物的组合物。在一些实施方案中，本文描述的IL-34抑制剂可以包含SEQ ID NO:1-23中任一项的核苷酸序列，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本文描述的IL-34抑制剂可以包含SEQ ID NO:1-8中任一项的核苷酸序列，或其药学上可接受的盐。例如，IL-34抑制剂包括包含SEQ ID NO:1-23中任一项的核苷酸序列，例如，SEQ ID NO:1-8中任一项的核苷酸序列的IL-34小发夹RNA、IL-34小干扰RNA、IL-34微RNA和IL-34吗啉寡聚物，以及包含这样的化合物的组合物，例如包含药学上可接受的赋形剂的组合物。
在本文描述的特定实施方案中，IL-34抑制剂是IL-34siRNA，其包含SEQ ID NO:1-23中任一项的核苷酸序列，例如，SEQ ID NO:1-8中任一项的核苷酸序列，或其药学上可接受的盐。例如，本发明的IL-34siRNA可以是包括以下序列的siRNA：5’-CTCACCAAGACCCACAG-3’(SEQ IDNO:1)；5’-GGCTTTGGGCCGCACCAGCT-3’(SEQ ID NO:2)；5’-CTTTGGGCCGCACCAGCTTC-3’(SEQ ID NO:3)；5’-TGGGCCGCACCAGCTTCAGG-3’(SEQ ID NO:4)；5’-TCCATGACCCGGAAGCAGTT-3’(SEQ ID NO:5)；5’-TGTTTCATGTACTGAAG-3’(SEQ ID NO:6)；5’-CTTTGGGCXGCACCAGCTTC-3’(SEQ ID NO:7)，其中X为5-甲基胞苷；或5’-TCCATGACCXGGAAGCAGTT-3’(SEQ ID NO:8)，其中X是5-甲基胞苷，或SEQ ID NO:1-8之一的IL-34siRNA的药学上可接受的盐。
本文还描述了药学上可接受的组合物，其包含SEQ ID NO:1-23中任一项的IL-34siRNA，例如SEQ ID NO:1-8中任一项的核苷酸序列的siRNA，或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，本文描述的IL-34抑制剂，例如本文描述的IL-34siRNA，包含一个或更多个修饰的核苷间连接。例如，在一些实施方案中，IL-34抑制剂是其中序列的至少一个核苷间连接是以下的IL-34siRNA：硫代磷酸酯连接、二硫代磷酸酯连接、磷酸三酯连接、烷基膦酸酯连接、氨基烷基磷酸三酯连接、亚烷基膦酸酯连接、亚膦酸酯连接、磷酰胺连接和氨基烷基磷酰胺连接、硫代磷酰胺连接、硫羰烷基膦酸酯连接、硫羰烷基磷酸三酯连接、硫代磷酸酯连接、硒代磷酸酯连接或硼烷磷酸酯连接。在特定实施方案中，IL-34抑制剂序列的至少一个核苷间连接是硫代磷酸酯连接。例如，在一些实施方案中，IL-34抑制剂序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、1-5个、1-10个、1-14个、1-15个、1-16个、1-19个、5-10个、5-14个、5-15个、5-19个、10-14个、10-15个或10-19个核苷间连接是硫代磷酸酯连接。在一些实施方案中，IL-34抑制剂序列的所有核苷间连接均为硫代磷酸酯连接。
本文描述的IL-34抑制剂中包含的核苷酸的数目可以变化。例如，在一些实施方案中，IL-34siRNA的长度为20-25个、20-30个或25-30个核苷酸。在一些实施方案中，IL-34siRNA的长度为19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。在一些实施方案中，本文描述的IL-34siRNA包括最大数目的核苷酸。在一些实施方案中，IL-34siRNA的长度不超过19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。
在本文描述的实施方案中，IL-34抑制剂，例如SEQ ID NO:1-23中任一项的IL-34siRNA，例如SEQ ID NO:1-8中任一项的核苷酸序列的IL-34siRNA的核苷，可以被化学修饰的核苷取代。例如，在一些实施方案中，IL-34siRNA的一个或更多个胞苷被5-甲基胞苷代替。在一些实施方案中，IL-34siRNA可以包含一个或更多个修饰的核苷酸，例如，5-甲基-2’-脱氧胞苷。例如，在不同的实施方案中，本公开内容的IL-34siRNA包含或可以包含含有脱氧胞苷和/或5-甲基-2’-脱氧胞苷的核苷酸，包括但不限于5-甲基-2’-脱氧胞苷5’-单磷酸和5-甲基-2’-脱氧胞苷-5’-单硫代磷酸酯。例如，在本文描述的实施方案中，SEQ ID NO:1-23中任一项的IL-34siRNA或其药学上可接受的盐的一个或更多个胞苷核苷可各自被5-甲基胞苷取代。
此外，在本文描述的实施方案中，IL-34抑制剂，例如本文描述的IL-34siRNA，可以包含经化学修饰的核苷，例如2’-O-甲基(“2’-OMe”)核糖核苷，例如2’-O-甲基胞苷、2’-O-甲基鸟苷、2’-O-甲基胸苷、2’-O-甲基尿苷和/或2’-O-甲基腺苷。本文描述的IL-34抑制剂也可以包含一个或更多个化学修饰的碱基，包括5-甲基嘧啶，例如5-甲基胞嘧啶，和/或5-甲基嘌呤，例如5-甲基鸟嘌呤。本文描述的IL-34抑制剂还可以包含以下任何化学修饰的核苷：5-甲基-2’-O-甲基胞苷、5-甲基-2’-O-甲基胸苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷和/或5-甲基-2’-脱氧胞苷。此外，本文描述的IL-34抑制剂可以包含一个或更多个2’-O-(2-甲氧基乙基)(“2’-MOE”)核苷、2’-脱氧-2’-氟核苷、2’-氟-β-D-阿糖核苷、桥接核酸、LNA核苷酸、约束乙基’(cET)核酸、三环-DNA(tcDNA)、2’-O,4’-C-亚乙基连接核酸(ENA)和/或肽核酸(PNA)。本文描述的实施方案包括SEQ ID NO:1-23中任一项的IL-34抑制剂或其药学上可接受的盐，其包含一种或更多种前述化学修饰核苷中的任一种。在特定实施方案中，IL-34siRNA或其药学上可接受的盐包含SEQ ID NO:1-23中任一项的序列，该序列被修饰以包含一种或更多种前述化学修饰核苷中的任一种。
在一些实施方案中，本公开内容提供了治疗炎性疾病的方法，抑制患有炎性疾病的患者的细胞中炎性细胞因子产生的方法，减少或抑制患有炎性疾病的患者的一个或更多个细胞中IL-34介导的炎症应答的方法，治疗有相应需要的患者中与改变的IL-34表达相关的炎性疾病的方法，抑制患有炎性疾病的患者的一个或更多个细胞中IL-34介导的M-CSFR-1信号传导的方法，预防或治疗纤维化的方法，预防或治疗肠纤维化的方法，和/或减少或消除患有炎性疾病的患者中纤维化狭窄的方法，其中这些方法包括施用本文描述的IL-34抑制剂，例如IL-34siRNA。上述方法可以包括向有相应需要的患者施用有效量的IL-34抑制剂(例如SEQ ID NO:1-23，例如SEQ ID NO:1-8中的任一项的IL-34小发夹RNA、IL-34小干扰RNA、IL-34微RNA或IL-34吗啉寡聚物，或包含这样的IL-34抑制剂的组合物)或其药学上可接受的盐的步骤。例如，上述方法可以包括向有相应需要的患者施用有效量的SEQ ID NO:1-23中的任一项，例如，SEQ ID NO:1-8中的任一项的IL-34siRNA，或包含这样的IL-34siRNA的组合物，或其药学上可接受的盐的步骤。在一些实施方案中，炎性疾病是炎性肠病，例如，炎性克罗恩病或纤维狭窄性克罗恩病。
本文还公开了抑制受试者细胞中IL-34表达或抑制受试者细胞中一种或更多种胶原表达的方法，其中该方法包括施用IL-34抑制剂，例如本文描述的IL-34siRNA。例如，上述方法可以包括向受试者施用药学有效量的包含IL-34抑制剂(例如SEQ ID NO:1-23，例如SEQ ID NO:1-8中的任一项的IL-34小发夹RNA、IL-34小干扰RNA、IL-34微RNA或IL-34吗啉寡聚物，或包含这样的IL-34抑制剂的组合物)或其药学上可接受的盐的药物制品的步骤。例如，上述方法可以包括向受试者施用药学有效量的包含SEQ ID NO:1-23中的任一项，例如，SEQ ID NO:1-8中的任一项的IL-34siRNA，或包含这样的IL-34siRNA的组合物，或其药学上可接受的盐的的药物制品的步骤。在上述方法的一些实施方案中，受试者需要治疗炎性克罗恩病或纤维狭窄性克罗恩病。
本文还描述了其中向有相应需要的患者施用IL-34siRNA的治疗方法。例如，本文描述了治疗炎性疾病的方法，包括向有相应需要的患者施用有效量的SEQ ID NO:1-8中任一项的IL-34siRNA。本文还描述了抑制患有炎性疾病的患者的细胞中炎性细胞因子产生的方法，包括施用有效量的SEQ ID NO:1-8中任一项的IL-34siRNA。
本文还描述了减少或抑制患有炎性疾病的患者的一个或更多个细胞中IL-34介导的炎症应答的方法，包括施用有效量的SEQ ID NO:1-8中任一项的IL-34siRNA。本文还描述了治疗有相应需要的患者中与改变的IL-34表达相关的炎性疾病的方法，该方法包括施用有效量的IL-34siRNA。例如，本文描述了治疗有相应需要的患者中与增加的IL-34表达相关的炎性疾病的方法，其中该方法包括施用有效量的SEQ ID NO:1-8中任一项的IL-34siRNA或其药学上可接受的盐。增加的IL-34表达可以是相对于IL-34表达的对照水平，例如，在健康对照患者或健康对照患者队列中测量的IL-34的平均或中位水平，或者在与增加的IL-34表达相关的疾病发作或检测到之前在患者中测量的IL-34水平。
本文还描述了治疗有相应需要的患者中与改变的IL-34表达相关的炎性疾病的方法，包括施用有效量的SEQ ID NO:1-8中任一项的IL-34siRNA或其药学上可接受的盐。
本文还描述了抑制患有炎性疾病的患者的细胞中IL-34介导的M-CSFR-1信号传导的方法，包括施用有效量的SEQ ID NO:1-8中任一项的IL-34siRNA或其药学上可接受的盐。
本文还描述了减少或消除患有炎性疾病的患者的纤维化狭窄的方法，包括施用有效量的SEQ ID NO:1-8中任一项的IL-34siRNA或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，纤维化狭窄位于肠中，例如大肠或小肠中。在特定实施方案中，纤维化狭窄位于大肠中。在一些实施方案中，纤维化狭窄定位于大肠和/或小肠的一个或更多个部分，例如盲肠、回肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠、直肠、***、十二指肠和/或空肠。
在一些实施方案中，IL-34抑制剂，例如IL-34siRNA局部、肠胃外、口服、肺部、气管内、鼻内、透皮或十二指肠内施用。在特定的实施方案中，IL-34siRNA或其药学上可接受的盐口服施用。
本文还描述了药学上可接受的组合物，其包含本文描述的IL-34抑制剂，例如SEQID NO:1-8中任一项的IL-34siRNA，或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物适用于局部、肠胃外、口服、肺部、气管内、鼻内、透皮或十二指肠内施用。
本文还描述了用作药物的IL-34抑制剂，例如IL-34siRNA。例如，SEQ ID NO:1-8中任一项的IL-34siRNA可用作药物。
本文还描述了IL-34抑制剂，例如SEQ ID NO:1-8中任一项的IL-34siRNA在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途。本文还描述了用于治疗炎性疾病的IL-34抑制剂，例如SEQ ID NO:1-8中任一项的IL-34siRNA。在一些实施方案中，炎性疾病是炎性肠病、类风湿性关节炎、银屑病、骨关节炎、糖尿病(I型和II型)、组织或器官排斥、多发性硬化、牙周炎症、牙周炎、色素沉着绒毛结节性滑膜炎、肝炎、鼻窦炎、结肠癌、结肠直肠癌、结肠炎相关性结肠癌、散发性结肠直肠癌、冠状动脉疾病或干燥综合征(SS)、肥胖症、慢性炎症、肺结节病、皮肤病变、CNS炎性疾病或自身免疫性疾病。本文还描述了IL-34反义寡核苷酸在制备用于治疗哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)或特发性肺纤维化(IPF)的药物中的用途。在一些实施方案中，炎性疾病是炎性肠病。在一些实施方案中，炎性肠病是克罗恩病、炎性克罗恩病、纤维狭窄性克罗恩病、胃十二指肠克罗恩病、克罗恩(肉芽肿性)结肠炎、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、白塞病、微观结肠炎、溃疡性直肠炎、直肠乙状结肠炎、空肠回肠炎、左侧结肠炎、全结肠炎、回肠结肠炎、回肠炎或未定型性结肠炎。在一些实施方案中，炎性肠病是炎性克罗恩病或纤维狭窄性克罗恩病。
本文还描述了抑制受试者细胞中IL-34表达的方法，包括向受试者施用药学有效量的药物制品，所述药物制品包含IL-34抑制剂或其药学上可接受的盐，例如SEQ ID NO:1-8中任一项的IL-34siRNA。本文还描述了抑制受试者细胞中一种或更多种胶原表达的方法，包括向受试者施用药学有效量的药物制品，所述药物制品包含IL-34抑制剂或其药学上可接受的盐，例如SEQ ID NO:1-8中任一项的IL-34siRNA。在上述方法的一些实施方案中，细胞是肠细胞，例如，肠***、肠上皮细胞、肠干细胞、分泌细胞、肠细胞、杯形细胞、肠内分泌细胞、帕内特细胞、转运扩增细胞、微皱褶细胞、杯状细胞或簇状细胞。在一些实施方案中，细胞形成肠纤维化狭窄的一部分。在上述实施方案中，受试者可以需要炎性疾病或纤维化，例如炎性克罗恩病或纤维狭窄性克罗恩病的治疗的受试者。在一些实施方案中，本文描述的方法可用于抑制受试者细胞中一种或更多种胶原的表达。在某些实施方案中，药物制品可以口服施用。在某些实施方案中，受试者是人类。
在一些实施方案中，本发明可以是治疗或预防患者中纤维化或防止胶原沉积的方法，其中该方法包括向患者施用有效量的IL-34特异性抑制剂，例如SEQ ID NO:1-8中任一项的IL-34siRNA或其药学上可接受的盐。
本文还描述了IL-34抑制剂，例如IL-34siRNA在制备用于治疗纤维化的药物中的用途。在一些实施方案中，纤维化是肠纤维化。在一些实施方案中，纤维化是肺纤维化。在其他实施方案中，纤维化是肾纤维化、心脏纤维化、心内膜心肌纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化或肾源性***性纤维化。
本文还描述了用于治疗纤维化的IL-34抑制剂，例如IL-34siRNA。在一些实施方案中，纤维化是肠纤维化。在一些实施方案中，纤维化是肺纤维化。在其他实施方案中，纤维化是肾纤维化、心脏纤维化、心内膜心肌纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化或肾源性***性纤维化。
在各种实施方案中，IL-34抑制剂，例如IL-34siRNA，可以通过一种或数种途径施用，包括口服、局部、肠胃外，例如，通过皮下注射，通过吸入喷雾，或直肠。在优选实施方案中，可以向患有纤维化例如肠纤维化或肺纤维化的患者口服施用IL-34抑制剂。
本发明可提供包括施用能够靶向IL-34RNA进行降解、干扰RNA剪接或阻止IL-34基因表达或蛋白翻译的IL-34抑制剂的方法。本发明的IL-34抑制剂，包括本发明的IL-34siRNA，可以靶向小鼠和/或人类IL-34mRNA的各种区域用于进行结合。
在本发明的一些实施方案中，治疗患者中的纤维化例如肠纤维化，预防肠纤维化或肺纤维化或防止胶原沉积的方法包括施用药物组合物，例如，包含IL-34的特异性抑制剂例如IL-34siRNA和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物肠胃外施用。在一些实施方案中，药物组合物口服施用。在一些实施方案中，药物组合物包含肠溶包衣，例如，包含丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物的肠溶包衣。
在本发明的实施方案中，治疗和/或预防炎性疾病(例如，炎性克罗恩病或纤维狭窄性克罗恩病)，治疗、减少和/或消除患者(例如，患有纤维狭窄性克罗恩病的患者)中的纤维性狭窄，治疗纤维化(例如，肠纤维化或肺纤维化)、预防纤维化(例如，肠纤维化或肺纤维化)、或治疗、改善或防止患者中的胶原沉积的方法包括施用不同量的IL-34抑制剂，例如IL-34siRNA或其药学上可接受的盐，或包含IL-34抑制剂例如SEQ ID NO:1-8中任一项的IL-34siRNA或其药学上可接受的盐的药物组合物。在一些实施方案中，本发明的方法包括施用至少1μg、至少5μg、至少10μg、至少20μg、至少30μg、至少40μg、至少50μg、至少60μg、至少70μg、至少80μg、至少90μg或至少100μg的IL-34抑制剂。在一些实施方案中，本发明的方法包括施用35mg至500mg、1mg至10mg、10mg至20mg、20mg至30mg、30mg至40mg、40mg至50mg、50mg至60mg、60mg至70mg、70mg至80mg、80mg至90mg、90mg至100mg、100mg至150mg、150mg至200mg、200mg至250mg、250mg至300mg、300mg至350mg、350mg至400mg、400mg至450mg、450mg至500mg、500mg至600mg、600mg至700mg、700mg至800mg、800mg至900mg、900mg至1g、1mg至50mg、20mg至40mg或1mg至500mg的IL-34抑制剂或包含IL-34抑制剂的药物组合物。
本文还提供了预防或治疗肝纤维化、肺纤维化或肠纤维化的方法，其中该方法包括向有相应需要的患者施用包含IL-34抑制剂，例如本文公开的IL-34siRNA的药物制品。还提供了预防或治疗肾纤维化、心脏纤维化、心内膜心肌纤维化、特发性肺纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化和/或肾源性***性纤维化的方法，其中该方法包括向有相应需要的患者施用包含IL-34抑制剂，诸如本文公开的IL-34siRNA的药物制品。
附图简述
图1是显示DLD-1、HT-29、HCT-116和NCM-460细胞中归一化的IL-34mRNA表达水平的图。
图2A是显示用加扰的阴性对照寡核苷酸(Src AS)或SEQ ID NO:1、2、3或4的IL-34反义寡核苷酸(分别为AS34New1、AS34New2、AS34New3、AS34New4)转染24小时的HT-29细胞中归一化的IL-34mRNA表达的图。
图2B显示来自用SrcAS对照或IL-34反义寡核苷酸AS34New1或AS34New3转染的HT-29细胞的细胞提取物的蛋白质印迹。探测了IL-34(上)或β-肌动蛋白(下)的蛋白质印迹。
图2C显示来自用SrcAS对照或IL-34反义寡核苷酸AS34New1、AS34New3或AS34New4转染的RAW 264.7细胞的提取物的蛋白质印迹。探测了IL-34(上)或β-肌动蛋白(下)的蛋白质印迹。
图3A显示来自用SrcAS对照或IL-34反义寡核苷酸AS34New1或AS34New3转染的培养的纤维狭窄性克罗恩病(FS CD)成纤维细胞的提取物的蛋白质印迹。探测了IL-34(上)或β-肌动蛋白(下)的蛋白质印迹。
图3B显示来自用SrcAS对照或IL-34反义寡核苷酸AS34New3转染的癌相关成纤维细胞的提取物的蛋白质印迹。探测了IL-34(上)或β-肌动蛋白(下)的蛋白质印迹。
图4A显示来自用两个对照加扰反义寡核苷酸之一(对照ASNew-1-PS或对照ASNew-3-PS)或SEQ ID NO:1、3或7的IL-34反义寡核苷酸(分别为New1-PS、New-3-PS和New-3-PS-MEC)转染的HT-29细胞的提取物的蛋白质印迹。探测了IL-34(上)或β-肌动蛋白(下)的蛋白质印迹。
图4B显示来自用两个对照加扰反义寡核苷酸之一(对照ASNew-1-PS或对照ASNew-3-PS)或SEQ ID NO:1、3或7的IL-34反义寡核苷酸(分别为New1-PS、New-3-PS和New-3-PS-MEC)转染的RAW 264.7细胞的提取物的蛋白质印迹。探测了IL-34(上)或β-肌动蛋白(下)的蛋白质印迹。
图4C显示来自用两个对照加扰反义寡核苷酸之一(对照ASNew-1-PS或对照ASNew-3-PS)或SEQ ID NO:1、3或7的IL-34反义寡核苷酸(分别为New1-PS、New-3-PS和New-3-PS-MEC)转染的MC-38细胞的提取物的蛋白质印迹。探测了IL-34(上)或β-肌动蛋白(下)的蛋白质印迹。
图5A是显示通过RT-PCR评价的来自经历结肠癌手术的患者的回肠未受影响区域的回肠对照样本(回肠CTR)和来自CD患者的回肠炎性CD(ICD)和纤维狭窄性克罗恩病(FSCD)样本的归一化的M-CSFR-1mRNA表达的图。
图5B显示来自回肠CTR、I CD和FS CD组织样品的提取物的蛋白质印迹。探测了M-CSFR-1(上)或β-肌动蛋白(下)的蛋白质印迹。
图5C显示在来自回肠CTR、I CD和FS CD组织样品的提取物的蛋白质印迹中相对M-CSFR-1信号的定量分析。M-CSFR-1信号相对于β-肌动蛋白信号归一化。
图5D显示在经历结肠癌手术的患者的回肠切片(回肠CTR)中M-CSFR-1的免疫组织化学检测。
图5E显示CD患者回肠切片的纤维狭窄性克罗恩病样本(FS CD)中M-CSFR-1的免疫组织化学检测。
图5F显示同种型对照(同种型)回肠切片的M-CSFR-1抗体染色。
图5G是显示通过RT-PCR评价的回肠对照样本(回肠CTR)和纤维狭窄性克罗恩病(FS CD)样本中归一化的M-CSFR-1mRNA表达的图。
图6A是显示通过RT-PCR评价的未刺激(Unst)或用重组人类IL-34刺激(IL-34)的培养的肠成纤维细胞中归一化的I型胶原α1链(COL1A1)mRNA表达的条形图。
图6B是显示通过RT-PCR评价的未刺激(Unst)或用重组人类IL-34刺激(IL-34)的培养的肠成纤维细胞中归一化的III型胶原α1链(COL3A1)mRNA表达的条形图。
图6C显示来自未刺激(Unst)或用重组人类IL-34刺激(IL-34)的培养的肠成纤维细胞的提取物的蛋白质印迹。探测了COL1A1(上图)、COL3A1(中图)或β-肌动蛋白(下图)的蛋白质印迹。
图6D显示通过蛋白质印迹评价的未刺激(Unst)或用重组人类IL-34刺激(IL-34)的培养的肠成纤维细胞中归一化的COL1A1蛋白表达的图。
图6E显示通过蛋白质印迹评价的未刺激(Unst)或用重组人类IL-34刺激(IL-34)的培养的肠成纤维细胞中归一化的COL3A1蛋白表达的图。
图6F显示来自未刺激(Unst)或用重组人类IL-34刺激(IL-34)的培养的肠成纤维细胞的上清液中的总胶原含量。
图7A显示来自未刺激(Unst)或用重组人类IL-34、TNF-α或IL-6刺激的血清剥夺的肠成纤维细胞的提取物的蛋白质印迹。探测了总(p38)和磷酸化p38(p-p38)丝裂原活化蛋白(MAP)激酶的印迹。
图7B显示来自用二甲基亚砜对照(DMSO)或p38抑制剂SB202190预处理(SB202190)且未刺激、或用DMSO或SB202190预处理后用重组人类IL-34刺激(IL-34)的成纤维细胞的提取物的蛋白质印迹。探测了COL1A1(上图)、COL3A1(中图)或β-肌动蛋白(下图)的印迹。
图7C显示来自用DMSO或SB202190预处理且未刺激、或用DMSO或SB202190预处理后用重组人类IL-34刺激的成纤维细胞的提取物的蛋白质印迹中的COL1A1信号的定量。COL1A1信号相对于β-肌动蛋白信号归一化。
图7D显示来自用DMSO或SB202190预处理且未刺激、或用DMSO或SB202190预处理后用重组人类IL-34刺激的成纤维细胞的提取物的蛋白质印迹中的COL3A1信号的定量。COL3A1信号相对于β-肌动蛋白信号归一化。
图7E显示来自用DMSO或SB202190预处理且未刺激、或用DMSO或SB202190预处理后用重组人类IL-34刺激的成纤维细胞的上清液中的总胶原含量。
图8A是显示通过RT-PCR评价的取自回肠对照样本(回肠CTR)或炎性(I CD)或纤维狭窄性克罗恩病(FS CD)肠组织样品的肠样本中归一化的IL-34表达的条形图。
图8B显示来自回肠对照(回肠CTR)或炎性克罗恩病(I CD)或纤维狭窄性克罗恩病(FS CD)患者的配对肠粘膜组织样品的提取物的蛋白质印迹。探测了IL-34(上图)或β-肌动蛋白(下图)的印迹。
图8C显示在来自回肠CTR、I CD和FS CD样品的提取物的蛋白质印迹中IL-34信号的定量。
图8D显示回肠对照组织(回肠CTR)中IL-34的免疫组织化学染色。
图8E显示纤维狭窄性克罗恩病肠组织(FS CD)中IL-34的免疫组织化学染色。
图8F显示同种型对照(同种型)的肠组织的染色。
图8G是显示从对照(回肠CTR)和纤维狭窄性克罗恩病患者(FS CD)组织的回肠样品分离的成纤维细胞中相对IL-34mRNA表达的图。
图8H显示来自从对照患者(回肠CTR)和纤维狭窄性克罗恩病患者(FS CD)的回肠样品分离的成纤维细胞的提取物的蛋白质印迹，并探测IL-34(上图)和β-肌动蛋白(下图)信号。
图9A显示来自用SEQ ID NO:3的IL-34反义寡核苷酸(IL-34AS)或互补有义寡核苷酸(NCAS)转染的纤维狭窄性克罗恩病患者(FS CD)的培养的成纤维细胞的提取物的蛋白质印迹。探测了IL-34、COL1A1、COL3A1和β-肌动蛋白信号的印迹。
图9B显示培养和转染的FS CD成纤维细胞的提取物的蛋白质印迹中的IL-34信号的定量。
图9C显示培养和转染的FS CD成纤维细胞的提取物的蛋白质印迹中的COL1A1信号的定量。
图9D显示培养和转染的FS CD成纤维细胞的提取物的蛋白质印迹中的COL3A1信号的定量。
图9E显示来自用SEQ ID NO:3的IL-34反义寡核苷酸(IL-34AS)或互补有义寡核苷酸(NCAS)转染的FS CD成纤维细胞培养物的上清液中的总胶原含量。
图9F是显示用SEQ ID NO:3的IL-34反义寡核苷酸(IL-34AS)或互补有义寡核苷酸(NCAS)转染的培养的FS CD成纤维细胞的细胞死亡百分比的图。
图9G显示用NCAS转染的培养的FS CD成纤维细胞的荧光激活细胞分选(FACS)图。对细胞进行膜联蛋白V和异硫氰酸荧光素(膜联蛋白VFITC-A；Y轴)和碘化丙啶(碘化丙啶-A；X轴)染色。
图9H显示用IL-34AS转染的培养的FS CD成纤维细胞的荧光激活细胞分选(FACS)图。对细胞进行膜联蛋白V和异硫氰酸荧光素(膜联蛋白VFITC-A；Y轴)以及碘化丙啶(碘化丙啶-A；X轴)染色。
详述
IL-34抑制剂
IL-34水平(例如，IL-34mRNA或蛋白质水平)和/或活性(例如，生物活性，例如，IL-34受体刺激)可以使用靶向IL-34基因或IL-34基因产物(例如，IL-34mRNA)的化合物或组合物降低。
IL-34抑制剂可以是但不限于基于核苷酸的IL-34抑制剂(例如，IL-34小发夹RNA(shRNA)、IL-34微RNA(miRNA)、IL-34小干扰RNA(siRNA)和IL-34反义寡核苷酸，包括包含LNA核苷酸、肽核酸(PNA)和吗啉寡聚物的IL-34反义寡核苷酸)，以及包含这样的化合物的组合物。
IL-34反义治疗剂
反义治疗剂是一类基于核酸的化合物，其可以用来抑制基因表达。反义治疗剂可以是基于单链或双链脱氧核糖核酸(DNA)的、基于核糖核酸(RNA)的、基于混合DNA和RNA的或DNA/RNA化学类似物的化合物。一般来说，反义治疗剂被设计为包括与从给定基因转录的mRNA或前体mRNA序列互补或接近互补，以促进反义治疗剂与前体mRNA或mRNA之间的结合的核苷酸序列。不受理论的约束，人们认为，在大多数情况下，反义治疗剂通过与mRNA或前体mRNA结合而起作用，从而抑制蛋白质翻译，改变前体mRNA到成熟mRNA的剪接，和/或导致mRNA的破坏。在大多数情况下，反义治疗剂核苷酸序列与靶基因或mRNA有义序列的部分互补。本文描述的IL-34反义治疗剂是基于寡核苷酸的化合物，其包含与IL-34基因有义、IL-34前体mRNA有义和/或IL-34mRNA有义序列互补的寡核苷酸序列或其一部分。本文描述的IL-34反义治疗剂也可以是能够结合IL-34基因有义、IL-34前体mRNA有义和/或IL-34mRNA有义序列或其一部分的基于核苷酸化学类似物的化合物。IL-34反义治疗剂包括IL-34反义寡核苷酸、IL-34shRNA、IL-34siRNA、IL-34PNA、IL-34LNA和IL-34吗啉寡聚物。
反义寡核苷酸(AON)是短的基于寡核苷酸的序列，其包含与靶RNA序列互补的寡核苷酸序列。AON的长度通常在8个至50个核苷酸之间，例如长度为20个核苷酸。
本文描述的AON可以包含化学修饰的核苷。如本文使用的“化学修饰的核苷”意指除腺苷、胞苷、胸苷、鸟苷或尿苷以外的任何核苷。例如，在一些实施方案中，化学修饰的核苷可以包括但不限于：锁核酸(LNA)，例如，LNA胞苷、LNA胸苷、LNA腺苷或LNA鸟苷；具有稳定化末端5’-磷酸或5’-磷酸的抗磷酸酶类似物，例如，5’-甲基膦酸酯、5’-亚甲基膦酸酯、5’-亚甲基膦酸酯类似物、5’-E-乙烯基膦酸酯(5’-E-VP)、5’-硫代磷酸酯和5’-C-甲基类似物的核苷；2’-O-甲基核糖核苷，例如，2’-O-甲基胞苷、2’-O-甲基鸟苷、2’-O-甲基尿苷、2’-O-甲基胸苷和2’-O-甲基腺苷；5-甲基嘧啶，例如，5-甲基胞嘧啶；5-甲基嘌呤，例如，5-甲基鸟嘌呤；5-甲基-2’-O-甲基胞苷；5-甲基-2’-O-甲基胸苷；5-甲基胞苷；5-甲基尿苷；或5-甲基2’-脱氧胞苷。
本文描述的AON可以包含至少一个修饰的核苷间连接。如本文所用，“核苷间连接”意指核苷的3’位置和相邻核苷的5’位置之间的连接。“修饰的核苷间连接”是指核苷的3’位置和相邻核苷的5’位置之间非天然的连接。例如，在一些实施方案中，修饰的核苷间连接可以包括但不限于：硫代磷酸酯连接、二硫代磷酸酯连接、磷酸三酯连接、烷基膦酸酯连接、氨基烷基磷酸三酯连接、亚烷基膦酸酯连接、亚膦酸酯连接、磷酰胺连接、氨基烷基磷酰胺连接、硫代磷酰胺连接、硫羰烷基膦酸酯连接、硫羰烷基磷酸三酯连接、硫代磷酸酯连接、硒代磷酸酯连接或硼烷磷酸酯连接。
在一些实施方案中，本文描述的AON可包含至少一个化学修饰的核苷和至少一个修饰的核苷间连接。在一些实施方案中，本文描述的AON可包含至少一个化学修饰的核苷或至少一个修饰的核苷间连接。
本文描述的IL-34AON包含与IL-34RNA序列互补的寡核苷酸序列。
肽核酸(PNA)是短的、人工合成的聚合物，其具有类似于DNA或RNA的结构。PNA包含由重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成的主链，这些单元通过肽键连接。本文描述的IL-34PNA可用作以高特异性结合IL-34RNA序列并抑制IL-34基因表达的反义治疗剂。
锁核酸(LNA)是包含一个或更多个修饰的RNA核苷酸的寡核苷酸序列，在修饰的RNA核苷酸中，核糖部分被额外的连接2’氧和4’碳的桥修饰。LNA被认为具有比类似的寡核苷酸序列更高的Tm。本文描述的IL-34LNA可用作以高特异性结合IL-34RNA序列并抑制IL-34基因表达的反义治疗剂。
吗啉寡聚物是包含附接到通过磷酸二酰胺基团连接的亚甲基***环的主链的DNA碱基的寡核苷酸化合物。本发明的吗啉寡聚物可以设计成与特定的感兴趣的IL-34RNA序列(例如，感兴趣的IL-34mRNA或IL-34前体mRNA序列)结合，从而阻止基因表达。本文描述的IL-34吗啉寡聚物可用作以高特异性结合IL-34mRNA序列并抑制IL-34基因表达的反义治疗剂。本文描述的IL-34吗啉寡聚物也可用于结合IL-34前体mRNA序列，改变IL-34前体mRNA剪接和IL-34基因表达。
小发夹RNA(shRNA)通常是具有发夹状结构的RNA分子，其可以用来使基因表达沉默。shRNA通常从编码shRNA序列的质粒表达，并可以从病毒载体表达，以允许慢病毒、腺病毒或腺相关病毒表达。不受理论的约束，人们认为shRNA通过利用RNA干扰(RNAi)过程抑制基因表达。简单地说，shRNA转录物由Drosha和Dicer加工，并且然后装载到RNA诱导沉默复合物(RISC)上，允许靶向特定mRNA，和mRNA降解或阻遏蛋白质翻译。本文描述的IL-34shRNA可以抑制IL-34基因的表达。
小干扰RNA(siRNA)是长度为约20-25个碱基对(但长度也可以是，例如，18-30个碱基对)的双链RNA分子，其利用RNAi机制(例如，Drosha和RISC)来结合和靶向mRNA进行降解。siRNA不依赖于质粒或载体来表达，并且通常可以直接递送到靶细胞，例如通过转染。IL-34siRNA是包括与IL-34mRNA序列互补的RNA序列并阻止IL-34蛋白翻译的双链RNA序列。本文描述的IL-34siRNA包括包含SEQ ID NO:1-23中任一项的核苷酸序列，例如，SEQ ID NO:1-8中任一项的核苷酸序列的siRNA，或其药学上可接受的盐。
微RNA(miRNA)是含有约22个核苷酸的在RNA沉默和基因表达的转录后调控方面发挥作用的小的非编码RNA分子。miRNA包含与mRNA序列的部分互补的序列。miRNA由表现出高度特异性茎环结构的长单链RNA分子产生。人工miRNA通过将天然存在的miRNA序列中成熟的21个核苷酸序列替换为来自靶例如IL-34mRNA靶的21个核苷酸序列来设计。
本文描述的IL-34抑制剂可以包含促进寡核苷酸末端5’-磷酸稳定的化学修饰和5’-磷酸的抗磷酸酶类似物。促进寡核苷酸末端5’-磷酸稳定的化学修饰或5’-磷酸的抗磷酸酶类似物包括但不限于5’-甲基膦酸酯、5’-亚甲基膦酸酯、5’-亚甲基膦酸酯类似物、5’-E-乙烯基膦酸酯(5’-E-VP)、5’-硫代磷酸酯和5’-C-甲基类似物。促进AON末端5’-磷酸酯稳定的化学修饰和5’-磷酸的抗磷酸酶类似物在Khvorova和Watts,(2017)“The chemicalevolution of oligonucleotide therapies of clinical utility”Nat Biotechnol.,35(3):238-48中描述，其内容通过引用并入本文。
在本文描述的一些实施方案中，IL-34抑制剂可以包含化学修饰的核苷，例如2’-O-甲基核糖核苷，例如2’-O-甲基胞苷、2’-O-甲基鸟苷、2’-O-甲基尿苷、2’-O-甲基胸苷和/或2’-O-甲基腺苷。本文描述的IL-34抑制剂可以包含一个或更多个化学修饰的碱基，包括5-甲基嘧啶，例如5-甲基胞嘧啶，和/或5-甲基嘌呤，例如5-甲基鸟嘌呤。本文描述的IL-34抑制剂可以包含以下化学修饰的核苷中的任一种：5-甲基-2’-O-甲基胞苷、5-甲基-2’-O-甲基胸苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷和/或5-甲基2’-脱氧胞苷。
2’-OMe核苷酸自然存在于tRNA和其他小RNA中。在寡核苷酸序列中掺入2’-OMe核苷酸防止核酸酶的降解并增加抗水解的稳定性。在寡核苷酸中掺入2’-OMe修饰通常增加RNA-RNA双链体的Tm，每个添加增加1-4℃。
引入2’-MOE基团通常使所得的寡核苷酸的Tm增加约1.1℃并提高对核酸酶降解的抗性。此外，2’-MOE寡核苷酸常用于gapmer化合物中，以防止RNA酶H介导的靶mRNA链的降解。
本文描述的IL-34抑制剂可以包含磷酸酯主链，其中一个或更多个寡核苷连接是磷酸酯连接。本文描述的IL-34抑制剂可以包含修饰的寡核苷酸主链，其中核苷酸序列的一个或更多个核苷连接选自由以下组成的组：硫代磷酸酯连接、二硫代磷酸酯连接、磷酸三酯连接、烷基膦酸酯连接、氨基烷基磷酸三酯连接、亚烷基膦酸酯连接、亚膦酸酯连接、磷酰胺连接、氨基烷基磷酰胺连接、硫代磷酰胺连接、硫羰烷基膦酸酯连接、硫羰烷基磷酸三酯连接、硫代磷酸酯连接、硒代磷酸酯连接和硼烷磷酸酯连接。在本文描述的IL-34抑制剂的一些实施方案中，核苷酸序列的至少一个核苷间连接是硫代磷酸酯连接。例如，在本文描述的IL-34抑制剂的一些实施方案中，核苷酸序列的一个、两个、三个或更多个核苷间连接是硫代磷酸酯连接。在本文描述的IL-34抑制剂的一些实施方案中，核苷酸序列的所有核苷间连接是硫代磷酸酯连接。因此，在一些实施方案中，SEQ ID NO:1-23中任一项的IL-34抑制剂的所有核苷酸连接都是硫代磷酸酯连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1-23中任一项的IL-34抑制剂的一个或更多个核苷酸连接是硫代磷酸酯连接。例如，本文描述的IL-34siRNA可以包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或更多个硫代磷酸键。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1-8中任一项的IL-34siRNA的所有核苷酸连接都是硫代磷酸酯连接。
IL-34反义寡核苷酸
本文描述的IL-34反义寡核苷酸(AON)是与IL-34转录物(例如，IL-34mRNA转录物)互补的短的合成的寡核苷酸序列。
IL-34AON包含与IL-34mRNA序列完全或几乎完全互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，IL-34AON可以包括非双链的寡核苷酸。在一些实施方案中，IL-34AON可以包括两个寡核苷酸的双链体，其中第一寡核苷酸包含与IL-34mRNA序列完全或几乎完全互补的核苷酸序列，并且第二寡核苷酸包含与第一寡核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。AON结合特异性可以经由参数(诸如解离常数、解链温度(Tm))或其他标准(诸如蛋白或RNA表达水平的变化)的测量或其他测量IL-34活性或表达的测定来评估。
诸如本文公开的IL-34AON可以是长度为例如15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核苷酸，或长度为15-20个、15-25个、15-30个、15-35个、20-25个、20-30个、20-35个、25-30个、25-35个或30-35个核苷酸的寡核苷酸序列。在一些实施方案中，IL-34反义寡核苷酸受到大小上限(upper size limit)的限制，使得AON的长度不超过20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个或35个核苷酸。
IL-34AON可以是与IL-34mRNA序列或IL-34基因序列，例如小鼠或人类IL-34mRNA或基因序列的一部分互补的寡核苷酸序列。
在本公开内容的一些实施方案中，IL-34AON包含与IL-34mRNA转录物变体的一部分互补或几乎互补的核苷酸序列或其一部分，例如，NCBI参考序列NM_001172771.1(SEQ IDNO:24)、NM_001172772.1(SEQ IDNO:25)或NM_152456.2(SEQ ID NO:26)的人类IL-34mRNA序列；或NCBI参考序列NM_001135100.2(SEQ ID NO:27)或NM_029646.3(SEQ IDNO:28)的小鼠IL-34mRNA序列。
在本文描述的本发明的实施方案中，IL-34AON可以靶向由一个或更多个物种的IL-34基因产生的靶IL-34mRNA，例如，小鼠和人类IL-34mRNA转录物。例如，IL-34AON可以靶向哺乳动物IL-34基因例如人类(即，智人(Homo sapiens))IL-34基因或小鼠(即，小家鼠(mus musculus))IL-34基因的IL-34mRNA。在特定实施方案中，IL-34AON靶向人类IL-34mRNA。在一些实施方案中，IL-34AON包含与IL-34基因或IL-34mRNA的核苷酸序列或其一部分互补的核苷酸序列。
本文描述的IL-34AON包括包含以下核苷酸序列的IL-34AON：5’-CTCACCAAGACCCACAG-3’(SEQ ID NO:1)；5’-GGCTTTGGGCCGCACCAGCT-3’(SEQ ID NO:2)；5’-CTTTGGGCCGCACCAGCTTC-3’(SEQ ID NO:3)；5’-TGGGCCGCACCAGCTTCAGG-3’(SEQ ID NO:4)；5’-TCCATGACCCGGAAGCAGTT-3’(SEQ ID NO:5)；5’-TGTTTCATGTACTGAAG-3’(SEQ ID NO:6)；5’-CTTTGGGCXGCACCAGCTTC-3’(SEQ ID NO:7)或5’-TCCATGACCXGGAAGCAGTT-3’(SEQ IDNO:8)；或其药学上可接受的盐，其中X是5-甲基胞苷。
本文描述的IL-34AON可以包含化学修饰的核苷，包括修饰的核糖核苷和修饰的脱氧核糖核苷。化学修饰的核苷包括但不限于2’-O-(2-甲氧基乙基)修饰，例如2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷、2’-O-(2-甲氧基乙基)腺苷、2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷、2’-O-(2-甲氧基乙基)尿苷和2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷。在某些实施方案中，本公开内容提供了IL-34抑制剂的混合模式，例如，IL-34肽核酸(PNA)和IL-34锁核酸(LNA)的组合。化学修饰的核苷还包括但不限于，锁核酸(LNA)、2’-O-甲基、2’-氟和2’-氟-β-D-***糖核苷酸(FANA)修饰。可包含在本文描述的IL-34AON中的化学修饰的核苷描述于Johannes和Lucchino,(2018)“Current Challenges in Delivery andCytosolic Translocation of TherapeuticRNAs”Nucleic Acid Ther.28(3):178–93；Rettig和Behlke,(2012)“Progress toward invivo use of siRNAs-II”MolTher 20:483–512；以及Khvorova和Watts,(2017)“Thechemical evolution ofoligonucleotide therapies of clinical utility”NatBiotechnol.,35(3):238-48，其中每一个的内容通过引用并入本文。
本文描述的IL-34AON可以包含促进寡核苷酸末端5’-磷酸稳定的化学修饰和5’-磷酸的抗磷酸酶类似物。促进寡核苷酸末端5’-磷酸稳定的化学修饰或5’-磷酸的抗磷酸酶类似物包括但不限于5’-甲基膦酸酯、5’-亚甲基膦酸酯、5’-亚甲基膦酸酯类似物、5’-E-乙烯基膦酸酯(5’-E-VP)、5’-硫代磷酸酯和5’-C-甲基类似物。促进AON末端5’-磷酸酯稳定的化学修饰和5’-磷酸的抗磷酸酶类似物在Khvorova和Watts,(2017)“Thechemicalevolution of oligonucleotide therapies of clinical utility”NatBiotechnol.,35(3):238-48中描述，其内容通过引用并入本文。
在本文描述的一些实施方案中，本文描述的IL-34AON可以包含化学修饰的核苷，包括2’-O-甲基核糖核苷，例如2’-O-甲基胞苷、2’-O-甲基鸟苷、2’-O-甲基尿苷、2’-O-甲基胸苷和/或2’-O-甲基腺苷。本文描述的IL-34AON可以包含一个或更多个化学修饰的核苷，其中化学修饰的核苷包含碱基，包括5-甲基嘧啶，例如5-甲基胞嘧啶，和/或5-甲基嘌呤，例如5-甲基鸟嘌呤。本文描述的IL-34AON可包含以下化学修饰的核苷中的任一种：5-甲基-2’-O-甲基胞苷、5-甲基-2’-O-甲基胸苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷和/或5-甲基2’-脱氧胞苷。
在一些实施方案中，本文描述的IL-34AON包括包含以下核苷酸序列的IL-34AON：5’-CTCACCAAGACCCACAG-3’(SEQ ID NO:1)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接；5’-GGCTTTGGGCCGCACCAGCT-3’(SEQ ID NO:2)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接；5’-CTTTGGGCCGCACCAGCTTC-3’(SEQ ID NO:3)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接；5’-TGGGCCGCACCAGCTTCAGG-3’(SEQ ID NO:4)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接；5’-TCCATGACCCGGAAGCAGTT-3’(SEQ ID NO:5)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接；或5’-TGTTTCATGTACTGAAG-3’(SEQ ID NO:6)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，IL-34AON包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷。例如，在一些实施方案中，SEQ ID NO:3的第三个胞苷(自5’末端)可以被化学修饰的核苷取代。在一些实施方案中，SEQ ID NO:3的第三个胞苷(自5’末端)被5-甲基胞苷取代，产生包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列的IL-34AON。在一些实施方案中，SEQ IDNO:3的除了第三个胞苷(自5’末端)之外的核苷被化学修饰的核苷取代，产生具有与SEQ IDNO:7不同的核苷酸序列的IL-34AON。在一些实施方案中，SEQ ID NO:3的第三个胞苷(自5’末端)被不是5-甲基胞苷的化学修饰的核苷取代，产生具有与SEQ ID NO:7不同的核苷酸序列的IL-34AON。
在一些实施方案中，IL-34AON包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷。例如，在一些实施方案中，SEQ ID NO:5的第五个胞苷(自5’末端)可以被化学修饰的核苷取代。在一些实施方案中，SEQ ID NO:5的第五个胞苷(自5’末端)被5-甲基胞苷取代，产生包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列的IL-34AON。在一些实施方案中，SEQ IDNO:3的除了第五个胞苷(自5’末端)之外的核苷被化学修饰的核苷取代，产生具有与SEQ IDNO:8不同的核苷酸序列的IL-34AON。在一些实施方案中，SEQ ID NO:3的第五个胞苷(自5’末端)被不是5-甲基胞苷的化学修饰的核苷取代，产生具有与SEQ ID NO:8不同的核苷酸序列的IL-34AON。
本文描述的IL-34AON还包括包含一个或更多个LNA核苷酸的IL-34AON。例如，本文描述的IL-34AON包括包含以下任一项的核苷酸序列的IL-34AON：
·5’-cttTGGGCXGCACCAGCttc-3’(SEQ ID NO:9)，其中c为LNA胞苷，t为LNA胸苷，并且X为5-甲基胞苷；
·5’-ctttGGGCXGCACCAGcttc-3’(SEQ ID NO:10)，其中c为LNA胞苷，t为LNA胸苷，并且X为5-甲基胞苷；
·5’-cttTGGGCcgCACCAGCttc-3’(SEQ ID NO:11)，其中c为LNA胞苷，t为LNA胸苷，并且g为LNA鸟苷；
·5’-cttTGGGCcGCACCAGCttc-3’(SEQ ID NO:12)，其中c为LNA胞苷，并且t为LNA胸苷；
·5’-ggcXGCACCAGCttc-3’(SEQ ID NO:13)，其中c是LNA胞苷，t是LNA胸苷，g是LNA鸟苷，并且X是5-甲基胞苷；
·5’-cttTGGGCXGCACcag-3’(SEQ ID NO:14)，其中c为LNA胞苷，t为LNA胸苷，g为LNA鸟苷，a为LNA腺苷，并且X为5-甲基胞苷；和
·5’-tgaCCXGGAAGCAgtt-3’(SEQ ID NO:15)，其中a为LNA腺苷，t为LNA胸苷，g为LNA鸟苷，并且X为5-甲基胞苷，
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，IL-34AON包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列，其中至少一个核苷是LNA。例如，在一些实施方案中，SEQ ID NO:3的第一和第二十个核苷(相对于5’末端)各自独立地被LNA胞苷取代；SEQ ID NO:3的第二、第三、第十八和第十九个核苷各自独立地被LNA胸苷取代；并且SEQ ID NO:3的第九个核苷被5-甲基胞苷取代，得到包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列的IL-34AON。
在另一种实施方案中，SEQ ID NO:3的第一、第十七和第二十个核苷(相对于5’末端)各自独立地被LNA胞苷取代；SEQ ID NO:3的第二、第三、第四、第十八和第十九个核苷各自独立地被LNA胸苷取代；并且SEQ ID NO:3的第九个核苷被5-甲基胞苷取代，得到包含SEQID NO:10的核苷酸序列的IL-34AON。
在另一种实施方案中，SEQ ID NO:3的第一、第九和第二十个核苷(相对于5’末端)各自独立地被LNA胞苷取代；SEQ ID NO:3的第二、第三、第十八和第十九个核苷各自独立地被LNA胸苷取代；并且SEQ ID NO:3的第十个核苷被LNA鸟苷取代，得到包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列的IL-34AON。
在又另一种实施方案中，SEQ ID NO:3的第一、第九和第二十个核苷(相对于5’末端)各自独立地被LNA胞苷取代；并且SEQ ID NO:3的第二、第三、第十八和第十九个核苷各自独立地被LNA胸苷取代，产生包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列的IL-34AON。
在其他实施方案中，SEQ ID NO:3中的一个或更多个核苷可被与在SEQ ID NO:9、10、11或12中任一项中取代的核苷不同的LNA核苷取代。在其他实施方案中，SEQ ID NO:3可以在与在SEQ ID NO:9、10、11或12中任一项中取代的位置不同的一个或更多个位置处被LNA核苷取代。
在特定实施方案中，IL-34AON包含2’-MOE核苷并且IL-34AON的序列选自以下之一：
·5’-CxTxTxTxGxGGCXGCACCAGxCxTxTxCx-3’(SEQ ID NO:16)，其中Cx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷，Tx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷，Gx为2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷，并且X为5-甲基胞苷；
·5’-TxCxCxAxTxGACCXGGAAGCxAxGxTxTx-3’(SEQ ID NO:17)，其中Cx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷，Tx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷，Gx为2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷，Ax为2’-O-(2-甲氧基乙基)腺苷，并且X为5-甲基胞苷；
·5’-CxTxTxTxGxGxGCXGCACCAxGxCxTxTxCx-3’(SEQ ID NO:18)，其中Cx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷，Tx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷，Gx为2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷，Ax为2’-O-(2-甲氧基乙基)腺苷，并且X为5-甲基胞苷；
·5’-TxCxCxAxTxGxACCXGGAAGxCxAxGxTxTx-3’(SEQ ID NO:19)，其中Cx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷，Tx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷，Gx为2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷，Ax为2’-O-(2-甲氧基乙基)腺苷，并且X为5-甲基胞苷；
·5’-CxTxTxTxGxGxGxCxXGxCxAxCxCxAxGxCxTxTxCx-3’(SEQ ID NO:20)，其中Cx是2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷，Tx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷，Gx为2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷，Ax为2’-O-(2-甲氧基乙基)腺苷，并且X为5-甲基胞苷；和
·5’-TxCxCxAxTxGxAxCxCxXGxGxAxAxGxCxAxGxTxTx-3’(SEQ ID NO:21)，其中Cx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷，Tx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷，Gx为2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷，Ax为2’-O-(2-甲氧基乙基)腺苷，并且X为5-甲基胞苷，
或其药学上可接受的盐。
例如，在一些实施方案中，IL-34AON包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列，其中至少一个核苷是2’-MOE核苷。例如，在一些实施方案中，SEQ ID NO:3的第一、第十七和第二十个核苷(相对于5’末端)各自独立地被2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷取代；SEQ ID NO:3的第二、第三、第四、第十八和第十九个核苷各自独立地被2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷取代；SEQ IDNO:3的第五和第十六个核苷各自独立地被2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷取代；并且SEQ IDNO:3的第九个核苷被5-甲基胞苷取代，得到包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列的IL-34AON。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:3的第一、第十七和第二十个核苷(相对于5’末端)各自独立地被2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷取代；SEQ ID NO:3的第二、第三、第四、第十八和第十九个核苷各自独立地被2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷取代；SEQ ID NO:3的第五、第六和第十六个核苷各自独立地被2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷取代；SEQ ID NO:3的第十五个核苷被2’-O-(2-甲氧基乙基)腺苷取代；并且SEQ ID NO:3的第九个核苷被5-甲基胞苷取代，得到包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列的IL-34AON。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:3的第一、第八、第十一、第十三、第十四、第十七和第二十个核苷(相对于5’末端)各自独立地被2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷取代；SEQ ID NO:3的所有胸苷都各自独立地被2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷取代；SEQ ID NO:3的所有鸟苷都各自独立地被2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷取代；SEQ ID NO:3的所有腺苷都各自独立地被2’-O-(2-甲氧基乙基)腺苷取代；并且SEQ ID NO:3的第九个核苷被5-甲基胞苷取代，得到包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列的IL-34AON。
在其他实施方案中，SEQ ID NO:3中的一个或更多个核苷可被与在SEQ ID NO:16、18或20中任一项中取代的核苷不同的2’-MOE核苷取代。在仍其他实施方案中，SEQ ID NO:3可以在与在SEQ ID NO:16、18或20中任一项中取代的位置不同的一个或更多个位置处被2’-MOE核苷取代。
在一些实施方案中，IL-34AON包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列，其中至少一个核苷是2’-MOE核苷。例如，在一些实施方案中，SEQ ID NO:5的第一、第五、第十九和第二十个核苷(相对于5’末端)各自独立地被2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷取代；SEQ ID NO:5的第二、第三和第十六个核苷各自独立地被2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷取代；SEQ ID NO:5的第四和第十七个核苷各自独立地被2’-O-(2-甲氧基乙基)腺苷取代；SEQ ID NO:5的第十八个核苷被2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷取代；并且SEQ ID NO:5的第十个核苷被5-甲基胞苷取代，得到包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列的IL-34AON。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:5的第一、第五、第十九和第二十个核苷(相对于5’末端)各自独立地被2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷取代；SEQ ID NO:5的第二、第三和第十六个核苷各自独立地被2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷取代；SEQ ID NO:5的第四和第十七个核苷各自独立地被2’-O-(2-甲氧基乙基)腺苷取代；SEQ ID NO:5的第六、第十五和第十八个核苷各自独立地被2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷取代；并且SEQ ID NO:5的第十个核苷被5-甲基胞苷取代，得到包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列的IL-34AON。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:5的第二、第三、第八、第九和第十六个核苷(相对于5’末端)各自独立地被2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷取代；SEQ ID NO:5的所有胸苷各自独立地被2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷取代；SEQ ID NO:5的所有鸟苷各自独立地被2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷取代；SEQ ID NO:5的所有腺苷各自独立地被2’-O-(2-甲氧基乙基)腺苷取代；并且SEQ ID NO:5的第十个核苷被5-甲基胞苷取代，得到包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列的IL-34AON。
在其他实施方案中，SEQ ID NO:5中的一个或更多个核苷可被与在SEQ ID NO:17、19或21中任一项中取代的核苷不同的2’-MOE核苷取代。在仍其他实施方案中，SEQ ID NO:5可以在与在SEQ ID NO:17、19或21中任一项中取代的位置不同的一个或更多个位置处被2’-MOE核苷取代。
另外，在一些实施方案中，IL-34AON包含2’-OMe核苷并且IL-34AON的序列选自以下之一：
·5’-CyTyTyTyGyGGCXGCACCAGyCyTyTyCy-3’(SEQ ID NO:22)，其中Cy为2’-O-甲基胞苷，Ty是2’-O-甲基胸苷，Gy是2’-O-甲基鸟苷，并且X是5-甲基胞苷；和
·5’-TyCyCyAyTyGACCXGGAAGCyAyGyTyTy-3’(SEQ ID NO:23)，其中Cy为2’-O-甲基胞苷，Ty是2’-O-甲基胸苷，Gy是2’-O-甲基鸟苷，Ay为2’-O-甲基腺苷，并且X是5-甲基胞苷，
或其药学上可接受的盐。
例如，在一些实施方案中，IL-34AON包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列，其中至少一个核苷是2’-OMe核苷。例如，在一些实施方案中，SEQ ID NO:3的第一、第十七和第二十个核苷(相对于5’末端)各自独立地被2’-O-甲基胞苷取代；SEQ ID NO:3的第二、第三、第四、第十八和第十九个核苷各自独立地被2’-O-甲基胸苷取代；SEQ ID NO:3的第五和第十六个核苷各自独立地被2’-O-甲基鸟苷取代；并且SEQ ID NO:3的第九个核苷被5-甲基胞苷取代，得到包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列的IL-34AON。
在其他实施方案中，SEQ ID NO:3中的一个或更多个核苷可被与在SEQ ID NO:22中取代的核苷不同的2’-OMe核苷取代。在仍其他实施方案中，SEQ ID NO:3可以在与在SEQID NO:22中取代的位置不同的一个或更多个位置处被2’-OMe核苷取代。
在一些实施方案中，IL-34AON包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列，其中至少一个核苷是2’-OMe核苷。例如，在一些实施方案中，SEQ ID NO:5的第一、第五、第十九和第二十个核苷(相对于5’末端)各自独立地被2’-O-甲基胸苷取代；SEQ ID NO:5的第二、第三和第十六个核苷各自独立地被2’-O-甲基胞苷取代；SEQ ID NO:5的第四和第十七个核苷各自独立地被2’-O-甲基腺苷取代；SEQ ID NO:5的第十八个核苷被2’-O-甲基鸟苷取代；并且SEQ IDNO:5的第十个核苷被5-甲基胞苷取代，得到包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列的IL-34AON。
在其他实施方案中，SEQ ID NO:5中的一个或更多个核苷可被与在SEQ ID NO:23中取代的核苷不同的2’-OMe核苷取代。在仍其他实施方案中，SEQ ID NO:5可以在与在SEQID NO:23中取代的位置不同的一个或更多个位置处被2’-OMe核苷取代。
本文描述的IL-34AON可以包含其中一个或更多个寡核苷连接是修饰的核苷间连接的磷酸主链。例如，在一些实施方案中，本文描述的IL-34AON可包含至少一个磷酸酯连接。本文描述的IL-34AON可以包含选自由以下组成的组的一个或更多个修饰的核苷间连接：硫代磷酸酯连接、二硫代磷酸酯连接、磷酸三酯连接、烷基膦酸酯连接、氨基烷基磷酸三酯连接、亚烷基膦酸酯连接、亚膦酸酯连接、磷酰胺连接、氨基烷基磷酰胺连接、硫代磷酰胺连接、硫羰烷基膦酸酯连接、硫羰烷基磷酸三酯连接、硫代磷酸酯连接、硒代磷酸酯连接和硼烷磷酸酯连接。在本文描述的IL-34AON的一些实施方案中，核苷酸序列的至少一个核苷间连接是硫代磷酸酯连接。例如，在本文描述的IL-34AON的一些实施方案中，核苷酸序列的一个、两个、三个或更多个核苷间连接是硫代磷酸酯连接。在本文描述的IL-34AON的优选实施方案中，核苷酸序列的所有核苷间连接是硫代磷酸酯连接。因此，在一些实施方案中，SEQID NO:1-23中任一项的IL-34AON的所有核苷酸连接都是硫代磷酸酯连接。例如，在一些实施方案中，SEQ ID NO:3的IL-34AON的所有核苷酸连接是硫代磷酸酯连接。在另一个实例中，在一些实施方案中，SEQ ID NO:7的IL-34AON的所有核苷酸连接是硫代磷酸酯连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1-23中任一项的IL-34AON的一个或更多个核苷酸连接是硫代磷酸酯连接。例如，在一些实施方案中，SEQ ID NO:3的IL-34AON的一个或更多个核苷酸连接是硫代磷酸酯连接。在另一个实例中，在一些实施方案中，SEQ ID NO:7的IL-34AON的一个或更多个核苷酸连接是硫代磷酸酯连接。
在一些实施方案中设想了，所公开的IL-34AON或其药学上可接受的盐可以任选地具有至少一个修饰的核碱基(例如5-甲基胞嘧啶)和/或至少一个甲基膦酸酯核苷酸，其被放置在例如5’末端或3’末端中的仅一个处，或5’末端和3’末端两处，或沿着寡核苷酸序列放置。
设想的IL-34AON可任选地包含至少一个修饰的糖。例如，构成寡核苷酸的至少一个核苷酸的糖部分是核糖，其中2’-OH基团可以被选自由以下组成的组的任一种代替：OR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NR2、N3、CN、F、Cl、Br和I(其中R是烷基或芳基并且R’是亚烷基)。
在本文描述的一些实施方案中，IL-34AON是gapmer化合物。gapmer化合物是包含修饰的核苷酸的5’和3’侧翼基团的寡核苷酸序列。修饰的核苷酸的这些侧翼基团被认为保护核苷酸的内部基团免受核酸酶的降解。核苷酸的内部基团的长度通常是6个至10个核苷酸。侧翼核苷酸的每个5’或3’基团的长度可以是3个、4个、5个、6个或更多个的核苷酸。gapmer化合物中侧翼核苷酸的5’和3’基团的长度可以是相同数目的核苷酸。修饰的核苷酸的侧翼基团包括，例如，2’-MOE、2’-OMe和LNA核苷酸。gapmer化合物序列还可以掺入修饰，包括修饰的核苷间连接(例如，硫代磷酸酯连接)、2’-MOE、2’-OMe、LNA、PNA、5-甲基胞苷和本文描述的其他化学修饰的核苷。
反义寡核苷酸可以被设计成使得每种反义寡核苷酸的掺入核苷酸序列的靶向部分与IL-34mRNA序列或IL-34相互作用伴侣的mRNA序列完全或几乎完全互补。这种互补或几乎互补的核苷酸序列的掺入允许人们工程化出针对特定的靶具有高度特异性的反义寡核苷酸。特异性可以经由参数(诸如解离常数)或其他标准(诸如蛋白或RNA表达水平的变化)的测量或其他测量IL-34活性或表达的测定来评估。
自身免疫性疾病和炎性疾病
本公开内容部分地设想了治疗有相应需要的患者中的与IL-34活性相关的炎性紊乱，包括施用所公开的反义化合物。在一些实施方案中，本文提供了用于治疗有相应需要的患者中的炎性疾病的方法，包括施用所公开的反义化合物。在本公开内容的一些实施方案中，可以向有相应需要的患者施用有效量的所公开的IL-34抑制剂，例如IL-34反义寡核苷酸，以治疗炎性疾病，例如，抑制患有炎性疾病的患者的细胞中炎性细胞因子的产生，和/或减少或抑制IL-34介导的炎症应答。
如本文使用的“炎性疾病”是指许多急性和慢性炎性紊乱，包括但不限于炎性肠病、类风湿性关节炎、银屑病、骨关节炎、糖尿病(I型和II型)、组织或器官排斥、多发性硬化、牙周炎症(如牙周炎)、色素沉着绒毛结节性滑膜炎、肝炎、鼻窦炎、结肠癌、冠状动脉疾病、干燥综合征(SS)、肥胖症、慢性炎症、肺结节病、皮肤病变、CNS炎性疾病或自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，提供了治疗有相应需要的患者中的与狼疮相关的皮肤病变的方法，包括施用所公开的化合物。在一些实施方案中，治疗与狼疮相关的皮肤病变包括至少一种选自以下的效果：减少皮肤病变的数量、降低皮肤病变的形成速度和减少皮肤病变的严重程度。提供了治疗患有狼疮和/或狼疮肾炎的患者中的狼疮和/或狼疮肾炎的方法，包括施用所公开的反义化合物。在一些实施方案中，提供了减缓与狼疮相关的肾脏状况进展的方法。
本文提供了在有相应需要的受试者中治疗CNS炎性疾病、降低发展CNS炎性疾病的风险或延迟CNS炎性疾病发作的方法，包括施用所公开的化合物。所述方法包括例如，治疗处于发展CNS炎性疾病风险的受试者；例如，向受试者施用有效量的公开的IL-34抑制剂，例如IL-34反义寡核苷酸。可以用这种方式治疗的CNS炎性疾病包括多发性硬化、实验性自身免疫性脑脊髓炎、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)和帕金森病。
本文还提供了在有相应需要的受试者中治疗自身免疫性疾病、降低发展自身免疫性疾病的风险或延迟自身免疫性疾病发作的方法，包括施用所公开的化合物，例如本文描述的IL-34抑制剂，例如IL-34反义寡核苷酸。这些方法包括治疗患有自身免疫性疾病或处于发展自身免疫性疾病风险的受试者。可以用这种方式治疗的自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、I型糖尿病、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和特发性肺纤维化。
炎性肠病
本公开内容还提供了用于治疗有相应需要的患者的炎性肠病的方法，包括施用所公开的化合物。如本文使用的“炎性肠病”是指许多慢性炎性疾病，包括克罗恩病、炎性克罗恩病、纤维狭窄性克罗恩病、胃十二指肠克罗恩病、克罗恩(肉芽肿性)结肠炎、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、白塞病、微观结肠炎、溃疡性直肠炎、直肠乙状结肠炎、空肠回肠炎、左侧结肠炎、全结肠炎、回肠结肠炎、回肠炎和未定型性结肠炎。克罗恩病和溃疡性结肠炎是炎性肠病的两种最常见形式。炎性肠病是消化***的自身免疫性疾病。克罗恩病可以定位于胃肠道的任何部分，包括末端回肠，并且可以影响胃肠道的所有细胞类型。溃疡性结肠炎定位于结肠和直肠，并且仅影响粘膜的细胞。
炎性克罗恩病的特征是免疫应答异常，其引起胃肠道过度炎症。炎性克罗恩病最常影响肠壁，包括小肠和/或大肠的部分，例如回肠和结肠。炎性克罗恩病还与厚和肿胀组织的发展以及溃疡有关。在免疫***功能中起作用的基因(例如，NOD2、ATG16L1、IL23R和IRGM)中的突变与克罗恩病相关，与适当的自噬相关的基因也与克罗恩病相关。
纤维狭窄性克罗恩病是克罗恩病的一种形式，包括胃肠道纤维狭窄性病变/纤维性狭窄的发生。纤维化狭窄更常与回肠而不是结肠的克罗恩病相关。炎症一般先于发展狭窄。狭窄可与以下任何症状相关：腹部痉挛、腹痛、腹胀(abdominal bloating anddistension)、食欲不振、疲劳、恶心、呕吐和便秘。50％以上的克罗恩病患者经历纤维狭窄。
纤维化狭窄与细胞表面IL-17A受体表达和增加的胶原包括I、III和V亚型胶原产生有关。纤维化狭窄也与瘘管的共现有关。狭窄的组织学特征是存在炎性细胞和间充质细胞的混合物，并有过多的细胞外基质(ECM)沉积。激活的肠间充质细胞积累ECM成分，包括纤维连接蛋白和胶原(例如，III型和IV型胶原)。杂乱的平滑肌增殖和过多的ECM沉积被认为改变了狭窄的肠组织的力学特性，导致与纤维化狭窄相关的增加的肠道僵硬和狭窄。纤维化狭窄的存在导致肠壁粘膜层、粘膜下层和肌层的肠组织异常。
环境和遗传因素二者都被认为在炎性肠病中起作用，尽管这些因素的身份还没有充分地定义。例如，习惯性吸烟使发展克罗恩病的风险加倍。环境组成可能包括肠道菌群改变，肠道菌群受暴露于摄入的食物和药物的影响。
炎性肠病伴随包括以下的症状：腹痛、呕吐、腹泻、直肠出血、严重痛性痉挛、肌肉痉挛、体重减轻、营养不良、发热、贫血、皮肤病变、关节痛、眼部炎症、肝紊乱、关节炎、坏疽性脓皮病、原发性硬化性胆管炎和非甲状腺疾病综合征，并且在实施方案中也设想使用所公开的反义化合物治疗这些症状，例如治疗患有溃疡性结肠炎的儿童，该儿童也可能患有生长缺陷。
肠纤维化
肠纤维化通常是肠道组织对炎症的反应的结果，诸如由炎性肠病(IBD)引起的慢性炎症。在IBD中，SMAD7的增加的水平阻断了经由TGF-β通路激活和Smad2/3磷酸化介导的抗炎基因表达。暴露于增加的TGF-β信号转导的肌成纤维细胞产生增加量的胶原。在克罗恩病的背景下，持续和慢性炎症促进纤维化过程，导致狭窄(包括小肠狭窄和结肠狭窄)的形成。
肠纤维化可以通过许多成像技术中的任何一种诸如造影增强超声波检查法来鉴定。参见例如，Quaia等人.The value of small bowel wall contrast enhancementafter sulfur hexafluoride-filled microbubble injection to differentiateinflammatory from fibrotic strictures in patients with Crohn’sdisease.Ultrasound Med.Biol.38,1324–1332(2012)；Nylund等人.Quantitativecontrast-enhanced ultrasound comparison between inflammatory and fibroticlesions in patients with Crohn’s disease.Ultrasound Med.Biol.39,1197–1206(2013)；Stidham等人.Ultrasound elasticity imaging for detecting intestinalfibrosis and inflammation in rats and humans with Crohn’sdisease.Gastroenterology 141,819–826(2011)。还可以使用MRI技术，诸如磁化传递MRI。参见例如，Maccioni等人.Value of T2-weighted magnetic resonance imaging inthe assessment of wall inflammation and fibrosis in Crohn’sdisease.Abdom.Imaging 37,944–957(2012)；Adler等人.Magnetization transfer helpsdetect intestinal fibrosis in an animal model of Crohn disease.Radiology 259,127–135(2011)；Pazahr等人.Magnetization transfer for the assessment of bowelfibrosis in patients with Crohn’s disease:initial experience.Magn.Reson.Mat.Phys.Biol.Med.26,291–301(2013)。
纤维化
预防或治疗纤维化，诸如肝纤维化、肺纤维化和/或肠纤维化的方法构成本公开内容的一部分。这样的方法可以包括向有相应需要的患者或处于风险的患者施用包含本文公开的IL-34抑制剂，例如IL-34反义寡核苷酸的药物制品。例如，提供了预防或治疗肝纤维化的方法，包括向有相应需要的患者施用本文公开的IL-34抑制剂，例如IL-34反义寡核苷酸。可选地，提供了预防或治疗肠纤维化的方法，包括向有相应需要的患者施用本文公开的IL-34抑制剂，例如IL-34反义寡核苷酸。可选地，提供了预防或治疗肺纤维化的方法，包括向有相应需要的患者施用本文公开的IL-34抑制剂，例如IL-34反义寡核苷酸。
使用上述方法治疗的患者可以具有或可以不具有可检测到的纤维化。在一些实施方案中，在施用IL-34反义寡核苷酸后，在例如1天、2天、1周、1个月或6个月或更长时间后，患者具有患者体内存在的纤维化的量至少约5％、10％、20％、30％、40％或甚至50％或更多的减少。施用这样的IL-34抑制剂，例如IL-34反义寡核苷酸，可以基于例如至少每天一次。化合物可口服施用。与未施用IL-34抑制剂诸如本文公开的IL-34抑制剂的患者相比，由于施用本文公开的IL-34抑制剂，例如IL-34反义寡核苷酸，患者的纤维化临床表现的延迟可为至少例如6个月、1年、18个月或甚至2年或更长。
有需要的患者可以具有已经发展成肝硬化的肝纤维化。处于肝纤维化风险的患者可以包括患有乙型肝炎、丙型肝炎或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者。NASH被包括在非酒精性脂肪性肝病(包括脂肪变性和肝硬化)的范围内。NASH是以肥胖症、2型糖尿病和血脂异常为特征的代谢综合征的组成部分，并且最终可导致肝细胞癌。
还提供了治疗与肝纤维化相关的紊乱的方法，诸如治疗以下至少一种紊乱：某些贮积病和先天性代谢缺陷错误，诸如α1-抗胰蛋白酶缺乏症、铜贮积病(例如威尔逊氏病)、果糖血症、半乳糖血症、糖原贮积病(例如III、IV、VI、IX和X型)、铁超负荷综合征(例如血色素沉着症)、脂质异常(例如戈谢氏病)、过氧化物酶体紊乱(例如泽尔韦格综合征)和酪氨酸血症；细菌感染(如布鲁氏菌病)；寄生虫感染(如棘球蚴病)；NASH；病毒感染(例如乙型肝炎或丙型肝炎，包括慢性乙型或丙型肝炎)；巴德–基亚里综合征；心力衰竭；肝静脉闭塞病；和门静脉血栓形成。还设想了治疗先天性肝纤维化的方法。组合物可口服施用。
在肝纤维化的病例中牵涉滥用药物和/或酒精。本文设想了治疗有药物和/或酒精滥用史的患者的肝纤维化的方法。例如，有滥用以下至少一种药物的病史的患者：酒精、胺碘酮、氯丙嗪、异烟肼、甲氨蝶呤、甲基多巴、酚丁和甲苯磺丁脲。
处于肠道纤维化风险的患者可以包括患有溃疡性结肠炎、炎性肠病或克罗恩病的患者。处于风险中的患者还可以包括诊断为克罗恩病或结肠炎时年龄较早的患者，广泛和/或严重的结肠疾病的患者，存在原发性硬化性胆管炎的患者，和/或有癌症家族史的患者。
还提供了治疗与肠纤维化相关的紊乱的方法，诸如治疗溃疡性结肠炎、炎性肠病或克罗恩病中的至少一种。
本文设想了预防或治疗肾纤维化、心脏纤维化、心内膜心肌纤维化、特发性肺纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化或肾源性***性纤维化的方法，包括向有相应需要的患者施用包含IL-34抑制剂，例如IL-34反义寡核苷酸，例如本文公开的IL-34反义寡核苷酸的药物制品。
本发明的IL-34抑制剂，包括例如IL-34AON，可以单独使用或相互组合使用，由此至少两种本发明的IL-34抑制剂在单一组合物中一起或作为治疗方案的一部分使用。本发明的IL-34抑制剂还可与用于治疗药物和/或酒精滥用、肾纤维化、心脏纤维化、心内膜心肌纤维化、特发性肺纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化或肾源性***性纤维化、药物和/或酒精滥用的其他药物组合使用。
治疗与评价
本文所述的“患者”或“受试者”是指任何处于炎性和/或纤维化疾病风险、患有或诊断为炎性和/或纤维化疾病的动物，包括但不限于哺乳动物、灵长类动物和人类。在某些实施方案中，患者可以是非人类哺乳动物，诸如猫、狗或马。患者可以是被诊断为具有发展炎性和/或纤维化疾病的高风险的个体、已被诊断为炎性和/或纤维化疾病的个体、先前患有炎性和/或纤维化疾病的个体、或对于炎性和/或纤维化疾病的症状或指征例如IL-34表达信号进行评价的个体。
如本文使用的“有需要的患者”是指患有任何炎性和/或纤维化疾病症状或表现的患者、可能患有任何炎性和/或纤维化疾病症状或表现的患者、或可能从本公开内容的用于治疗炎性和/或纤维化疾病的方法受益的任何患者。有需要的患者可以包括被诊断具有发展成炎性和/或纤维化疾病风险的患者、过去曾患有炎性和/或纤维化疾病的患者、或先前已经接受过炎性和/或纤维化疾病治疗的患者。特别相关的是患有与增加的IL-34表达或活性水平相关的炎性和/或纤维化疾病的个体。
本文使用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等通常指获得期望的药理学和/或生理学效果。该效果可以是预防性的(就完全或部分预防疾病或其症状而言)和/或可以是治疗性的(就部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的副作用而言)。如本文使用的术语“治疗(treatment)”包括对哺乳动物(特别是人类)疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防可能易患疾病但尚未被诊断为具有疾病的受试者中发生疾病；(b)抑制疾病，即预防疾病的严重程度或范围增加；(c)缓解疾病，即引起疾病的部分或完全减轻；或(d)预防疾病复发，即在以前成功治疗疾病的症状或治疗疾病之后，预防疾病恢复到活跃状态。
如本文使用的“有效量”或“药学有效量”是指当施用至患者时足以至少部分地治疗状况的剂的量。治疗有效量将取决于状况的严重程度、组分的施用途径以及治疗的患者的年龄、体重等而变化。因此，所公开的IL-34反义寡核苷酸的有效量是治疗患者炎性和/或纤维化疾病所必需的IL-34反义寡核苷酸的量，使得该剂的施用预防受试者发生炎性和/或纤维化疾病，预防炎性和/或纤维化疾病进展(例如，预防炎性肠病症状(诸如直肠出血、贫血或胃肠道炎症)的发作或加重)，或者缓解或完全减轻炎性和/或纤维化疾病的一些或所有相关症状，例如引起疾病消退。
治疗效果可以通过与炎性和/或纤维化疾病相关的总体症状的评价、组织的组织学分析、生物化学测定、成像方法(诸如，例如磁共振成像)或其他已知方法来评价。例如，治疗效果可以通过在向患有炎性疾病的患者施用所公开的IL-34反义寡核苷酸后，分析疾病的总体症状(诸如腹痛、呕吐、腹泻、直肠出血、痛性痉挛、肌肉痉挛、体重减轻、营养不良、发热、贫血或与炎性疾病相关的总体疾病的其他方面)的变化来评价。
治疗效果也可以在组织或细胞水平进行评价，例如，通过获得组织活检样品(例如胃肠组织活检样品)并评价总体组织或细胞形态或染色特性的方法。检查蛋白或RNA表达的生物化学测定也可用于评价治疗效果。例如，人们可以经由免疫细胞化学、免疫组织化学、蛋白质印迹或RNA印迹方法，或可用于评价RNA水平的方法诸如定量或半定量聚合酶链式反应，评价解离细胞或非解离组织中IL-34、IL-6、IL-8、TNF-α或指示炎性和/或纤维化疾病的另一蛋白质或基因产物的水平、炎性细胞因子产生或IL-34介导的炎症应答。人们也可以评价粪便物、血浆或血清中发现的有用生物标志物的存在或表达水平来评价疾病状态和治疗效果。
在评价治疗效果时，可以选择合适的对照以确保有效的评估。例如，人们可以将在向患有炎性和/或纤维化疾病的患者施用所公开的IL-34抑制剂例如IL-34反义寡核苷酸后评价的症状与同一患者在治疗前或在治疗过程的较早时间点的那些症状或与其他未被诊断患炎性和/或纤维化疾病的患者进行比较。可选地，人们可以将在施用所公开的IL-34抑制剂(例如IL-34反义寡核苷酸)之后胃肠组织的生化或组织学分析结果与来自同一患者或来自未诊断为炎性和/或纤维化疾病的个体的胃肠组织的结果或来自在施用IL-34抑制剂之前的同一患者的胃肠组织的结果进行比较。此外，人们可以将在施用IL-34抑制剂(例如IL-34反义寡核苷酸)之后的血液、血清、细胞或粪便样品与来自未被诊断为炎性和/或纤维化疾病的个体的可比样品或来自在施用IL-34反义抑制剂之前的同一患者的可比样品进行比较。
IL-34抑制的验证可以通过直接或间接评估IL-34表达水平或活性来确定。例如，测量IL-34蛋白或RNA表达的生物化学测定可用于评价总体IL-34抑制。例如，人们可以通过蛋白质印迹测量胃肠组织中的IL-34蛋白水平以评价总体IL-34水平。人们也可以通过RNA印迹或定量聚合酶链式反应测量IL-34mRNA水平以确定总体IL-34抑制。人们也可以经由免疫细胞化学或免疫组织化学方法评价解离细胞、非解离组织、血液、血清或粪便物中的IL-34蛋白水平或指示IL-34信号传导活性的其他蛋白的水平。
IL-34抑制也可以通过测量参数诸如巨噬细胞或单核细胞产生或增殖，或测量与IL-34活性变化相关的其他参数的改变，包括MAP激酶磷酸化和IL-34受体-巨噬细胞集落刺激因子受体(M-CSFR-1，也称为MCSFR-1、M-CSFR1和CSF1R)信号传导激活的其他指标来间接评价。例如，人们可以测量用所公开的IL-34抑制剂例如IL-34反义寡核苷酸治疗的患者的细胞中活性MAPK1或MAPK3磷酸化的水平，作为所述细胞中IL-34活性的指示。人们还可以评价血浆、血液、粪便物或组织中发现的有用生物标志物的存在或表达水平以评价IL-34抑制的功效。
本文公开的治疗方法包括抑制炎性细胞因子产生的方法。“炎性细胞因子产生”是指启动和/或促进炎性细胞因子应答的细胞因子的表达。“炎性细胞因子应答”是指可以表征为粒细胞募集、淋巴细胞募集、全身性炎症(尤其是胃肠道或其一部分或多于一个部分)、发热、组织破坏、休克和/或死亡的免疫应答。炎性细胞因子应答可以表征为个体细胞因子与其同源细胞表面受体的结合(例如，IL-34与CSF1R的结合)以及随后改变细胞功能和基因表达的细胞内信号传导级联。炎性细胞因子包括但不限于IL-1、IL-6、IL-8、IL-34和TNF-α。炎性细胞因子的表达可发生在例如巨噬细胞、单核细胞、固有层单个核细胞或胃肠道的其他细胞或免疫***的细胞中。抑制炎性细胞因子产生的方法包括降低患有炎性疾病的患者的一些或所有炎性细胞因子表达水平的方法。抑制炎性细胞因子产生的方法还包括降低患有炎性疾病的患者的细胞中一些或所有炎性细胞因子表达水平的方法。
本公开内容的抑制炎性细胞因子产生的方法包括减少或抑制IL-34介导的炎症应答的方法。如本文使用的“IL-34介导的炎症应答”是指由IL-34表达或IL-34信号传导活性启动、推动或促进的炎症应答。IL-34介导的炎症应答可导致包括但不限于IL-34、IL-6、IL-8或TNF-α的炎性细胞因子的表达，以及炎性细胞因子信号传导的激活。另外，IL-34介导的炎性应答可以表征为粒细胞募集、淋巴细胞募集、全身性炎症(尤其是胃肠道或其一部分或多于一部分)、发热、组织破坏、休克和/或死亡。IL-34介导的炎症应答也可以IL-34信号传导的激活为特征，例如，IL-34与CSF1R的结合和下游MAP激酶的磷酸化。减少或抑制IL-34介导的炎症应答是指减轻与IL-34介导的炎症应答相关的细胞和全身变化中的任一种或所有。例如，炎性细胞因子产生、免疫细胞募集或组织炎症的减少将指示IL-34介导的炎症应答的减少或抑制。
本公开内容还提供了抑制患有炎性和/或纤维化疾病的患者的细胞中的IL-34的方法。IL-34可以在IL-34表达或活性发生的任何细胞(包括胃肠道、免疫***和血液的细胞)中进行抑制。胃肠道的细胞(包括肠壁、胃、十二指肠、空肠、大肠、小肠、回肠、结肠、直肠和肛管的细胞)包括柱状上皮细胞、肠***、粘膜上皮细胞、产酶细胞、颈粘液细胞、壁细胞、胃泌素细胞、杯形细胞、帕内特细胞、少黏膜细胞和绒毛吸收细胞。免疫***的细胞包括白细胞、吞噬细胞(例如巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞)、单核细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、自然杀伤细胞、固有细胞(innate cell)、淋巴细胞、B细胞和T细胞。血细胞包括红细胞(red blood cell)(红细胞(erythrocyte))和白细胞(white bloodcell)(白细胞(leukocyte)、单核细胞和血小板)。
药物组合物和施用途径
本公开内容还提供了经由施用包含所公开的IL-34抑制剂例如IL-34反义寡核苷酸的药物组合物来治疗炎性和/或纤维化疾病的方法。在另一方面，本公开内容提供了用于治疗炎性和/或纤维化疾病的药物组合物。药物组合物可以包含靶向IL-34的所公开的IL-34抑制剂，例如IL-34反义寡核苷酸和药学上可接受的赋形剂。如本文使用的术语“药物组合物”意指例如，待施用至哺乳动物(例如人类)以治疗炎性和/或纤维化疾病的包含药学上可接受的赋形剂中的特定量的治疗性化合物(例如治疗有效量的治疗性化合物)的混合物。在一些实施方案中，本文设想了药物组合物，该药物组合物包含所公开的IL-34抑制剂，例如IL-34反义寡核苷酸，和药学上可接受的赋形剂。另一方面，本公开内容提供了所公开的IL-34抑制剂例如IL-34反义寡核苷酸在制备用于治疗炎性和/或纤维化疾病的药物中的用途。如本文使用的，“药物”与术语“药物组合物”具有实质相同的含义。
如本文所用，“药学上可接受的赋形剂”是指有助于活性剂向受试者的施用和/或活性剂被受试者的吸收，并且可以被包括在本发明的组合物中而不会对患者造成显著的不良毒理学影响的物质。药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括水、NaCl、生理盐水溶液(诸如磷酸盐缓冲盐水溶液)、乳液(例如诸如油/水或水/油乳液)、乳酸林格氏溶液、生理蔗糖、生理葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣、甜味剂、香料、盐溶液(诸如林格氏溶液)、醇、油、明胶、碳水化合物诸如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷和色素等。此类制品可以被灭菌且如果期望的话，可与辅助剂相混合，所述辅助剂诸如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂和/或芳香物质等，其不与本发明的IL-34抑制剂有害地反应。赋形剂的实例参见Martin,Remington’s Pharmaceutical Sciences,15th Ed.,Mack Publ.Co.,Easton,PA(1975)。
在一种实施方案中，所公开的IL-34抑制剂，例如IL-34反义寡核苷酸，及其任何药物组合物可以通过一种或数种途径施用，包括局部、肠胃外、口服、肺、气管内、鼻内、透皮或十二指肠内。如本文使用的术语肠胃外包括皮下注射，胰腺内施用，静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内注射或输注技术。例如，所公开的IL-34抑制剂，例如IL-34反义寡核苷酸，可以向受试者皮下施用。在另一个实例中，所公开的IL-34抑制剂，例如IL-34反义寡核苷酸，可以向受试者口服施用。在另一个实例中，所公开的IL-34抑制剂，例如IL-34反义寡核苷酸，可以经由肠胃外施用直接施用到胃肠***，或胃肠***的特定区域(例如，回肠、结肠或直肠)。
包含IL-34抑制剂例如IL-34反义寡核苷酸的药物组合物，诸如本文所公开的那些，可以以剂量单位形式存在并且可以通过任何合适的方法制备。药物组合物应当被配制为与其意图的施用途径相容。可用制剂可以通过制药领域熟知的方法制备。例如，参见Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th ed.(Mack Publishing Company,1990)。
药物制剂是例如无菌的。无菌可以通过例如通过无菌滤膜过滤来实现。在组合物是冻干的情况下，可以在冻干和重构之前或之后进行过滤灭菌。
肠胃外施用
本公开内容的药物组合物可以配制为用于肠胃外施用，例如配制为用于经由静脉内、肌内、皮下、病灶内或腹膜内途径注射。根据本公开内容，本领域技术人员将知晓水性组合物(诸如包含所公开的IL-34抑制剂例如IL-34反义寡核苷酸的水性药物组合物)的制备。通常，这样的组合物可以制备为可注射剂(injectables)如液体溶液或悬浮液；也可以制备为适合用于在注射前添加液体时制备溶液或悬浮液的固体形式；并且制剂也可以被乳化。
适于注射使用的药物形式包括无菌水性溶液或分散体；包括芝麻油、花生油或含水丙二醇的制剂；和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的、并且必须是达到存在易于注射能力的程度的流体。它必须在制备和储存条件下是稳定的，并且必须防止微生物诸如细菌和真菌的污染作用。
作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可以在水中合适地与表面活性剂诸如羟丙基纤维素混合制备。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中以及在油中制备。另外，无菌的不挥发性油可用作溶剂或悬浮介质。为了该目的，可以使用包括合成的甘油单酯或甘油二酯在内的任何温和的不挥发性油。另外，脂肪酸诸如油酸可用于制备可注射剂。无菌可注射制剂也可以是在无毒性的、肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳剂，例如，作为在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用水、林格氏溶液(U.S.P.)和等渗氯化钠溶液，以及可接受的媒介物和溶剂。在一种实施方案中，所公开的IL-34抑制剂可以悬浮于包含1％(w/v)羧甲基纤维素钠和0.1％(v/v)TWEENTM80的载体或赋形剂液体中。在通常的储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。
可注射制剂，例如无菌可注射的水性或油性悬浮液，可以根据已知技术使用合适的分散剂或湿润剂和助悬剂来配制。通常，分散体通过将各种灭菌的活性成分掺入到无菌媒介物中来制备，所述无菌媒介物包含基础分散介质和来自上文枚举的那些所需其他成分。本公开内容的无菌可注射溶液可以通过将所公开的IL-34抑制剂例如IL-34反义寡核苷酸掺入所需量的合适溶剂(根据需要，含有各种上文枚举的其他成分)中，然后过滤灭菌来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术从之前的活性成分加任何另外所需成分的无菌过滤的溶液产生其粉末。可注射制剂可以被灭菌，例如，通过细菌截留滤器过滤。
还设想了制备用于肌内注射的较浓缩或高度浓缩的溶液。在这方面，优选使用DMSO作为溶剂，因为这将导致极快的渗透，将高浓度的所公开的IL-34反义寡核苷酸递送至小区域。
适用于这样的溶液的防腐剂包括苯扎氯铵、苄索氯铵、氯丁醇、硫柳汞等。合适的缓冲剂包括硼酸、碳酸氢钠和碳酸氢钾、硼酸钠和硼酸钾、碳酸钠和碳酸钾、乙酸钠、磷酸二氢钠等，其量足以将pH保持在约pH 6和pH 8之间，并且例如约pH 7和pH 7.5之间。合适的张度剂是葡聚糖40、葡聚糖70、右旋糖、甘油、氯化钾、丙二醇、氯化钠等，使得溶液的氯化钠当量在0.9％±0.2％的范围内。合适的抗氧化剂和稳定剂包括亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、硫脲等。合适的湿润剂和澄清剂包括聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、泊洛沙姆282和泰洛沙泊。合适的增黏剂包括葡聚糖40、葡聚糖70、明胶、甘油、羟乙基纤维素、羟甲基丙基纤维素、羊毛脂、甲基纤维素、矿脂、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素等。
口服施用
在一些实施方案中，本文设想了适合于口服递送所公开的IL-34抑制剂，例如IL-34反义寡核苷酸的组合物，例如，包括肠溶包衣例如抗胃酸包衣的片剂，使得组合物可将IL-34抑制剂递送到，例如，患者的胃肠道。例如，这样施用可以产生局部效果，基本上将IL-34抑制剂直接局部施加至患者胃肠道的受影响部分。在一些实施方案中，这样施用基本上避免IL-34抑制剂的不期望的全身性吸收。
例如，提供了用于口服施用的片剂，其包括颗粒(例如，至少部分地从颗粒形成)，所述颗粒包含所公开的IL-34抑制剂，例如IL-34反义寡核苷酸，例如包含SEQ ID NO:1-23中任一项的核苷酸序列的反义寡核苷酸，以及药学上可接受的赋形剂。这样的片剂可以用肠溶包衣包覆。设想的片剂可以包括药学上可接受的赋形剂，诸如填充剂、粘合剂、崩解剂和/或润滑剂，以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂诸如冬青油(wintergreen)、橙味剂(orange)、木糖醇、山梨醇、果糖和麦芽糊精，以及芳香剂、防腐剂和/或抗氧化剂。
在一些实施方案中，设想的药物制剂包含颗粒内相(intra-granular phase)，所述颗粒内相包含所公开的IL-34抑制剂，例如IL-34反义寡核苷酸，例如包含SEQ ID NO:1-23中任一项的核苷酸序列的反义寡核苷酸、以及药学上可接受的盐和药学上可接受的填充剂。例如，所公开的IL-34抑制剂例如IL-34反义寡核苷酸和填充剂可以混合在一起，任选地与其他赋形剂混合，并形成颗粒。在一些实施方案中，可以使用湿法制粒形成颗粒内相，例如将液体(例如水)添加到混合的IL-34抑制剂和填充剂中，并且然后将该组合干燥、研磨和/或筛分以产生颗粒。本领域技术人员将理解，可以使用其他加工来实现颗粒内相。
在一些实施方案中，设想的制剂包含颗粒外相(extra-granular phase)，颗粒外相可以包含一种或更多种药学上可接受的赋形剂，并且颗粒外相可以与颗粒内相混合以形成所公开的制剂。
所公开的制剂可以包括包含填充剂的颗粒内相。示例性填充剂包括但不限于纤维素、明胶、磷酸钙、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、微晶纤维素、果胶、聚丙烯酸酯、右旋糖、醋酸纤维素、羟丙基甲基纤维素、部分预胶化淀粉、碳酸钙和其他物质，包括其组合。
在一些实施方案中，所公开的制剂可以包括包含粘合剂的颗粒内相和/或颗粒外相，粘合剂的通常作用是将药物制剂的成分保持在一起。本公开内容的示例性粘合剂可包括但不限于以下：淀粉、糖、纤维素或改性纤维素(诸如羟丙基纤维素)、乳糖、预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、低取代羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、糖醇和其他物质，包括其组合。
设想的制剂，例如包含颗粒内相和/或颗粒外相的那些，可以包含崩解剂，诸如但不限于淀粉、纤维素、交联的聚乙烯吡咯烷酮、羟基乙酸淀粉钠、羧甲基纤维素钠、藻酸盐、玉米淀粉、交联羧甲基纤维素钠、交联的羧甲基纤维素、低取代的羟丙基纤维素、***胶和其他物质，包括其组合。例如，颗粒内相和/或颗粒外相可以包含崩解剂。
在一些实施方案中，设想的制剂包含：颗粒内相，包含所公开的IL-34抑制剂例如IL-34反义寡核苷酸和选自以下的赋形剂：甘露醇、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素和羟基乙酸淀粉钠或其组合；和颗粒外相，包含以下一种或更多种：微晶纤维素、羟基乙酸淀粉钠和硬脂酸镁或其混合物。
在一些实施方案中，设想的制剂可以包含润滑剂，例如，颗粒外相可以包含润滑剂。润滑剂包括但不限于滑石、二氧化硅(silica)、脂肪、硬脂、硬脂酸镁、磷酸钙、二氧化硅(silicone dioxide)、硅酸钙、磷酸钙、胶体二氧化硅、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、苯甲酸钠、聚乙二醇、乙酸钠、硬脂酸钙、十二烷基硫酸钠、氯化钠、十二烷基硫酸镁、滑石和硬脂酸。
在一些实施方案中，药物制剂包含肠溶包衣。通常，肠溶包衣为口服药物形成控制药物沿消化道吸收所在的位置的屏障。肠溶包衣可以包含根据pH以不同速率崩解的聚合物。肠溶包衣可以包括，例如，邻苯二甲酸乙酸纤维素、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、乙酸琥珀酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物、C型甲基丙烯酸共聚物、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯和邻苯二甲酸乙酸纤维素。
示例性的肠溶包衣包括
AMB、
级。在一些实施方案中，肠溶包衣按重量计可以占设想片剂的约5％至约10％、约5％至约20％、8％至约15％、约8％至约20％、约10％至约20％、或约12％至约20％、或约18％。例如，肠溶包衣可以包括丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物。
例如，在设想的实施方案中，提供包含以下或主要由以下组成的片剂：按重量计约0.5％至约70％，例如约0.5％至约10％，或约1％至约20％的所公开的IL-34抑制剂例如IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐。这样的片剂可以包含例如按重量计约0.5％至约60％的甘露醇，例如按重量计约30％至约50％的甘露醇，例如按重量计约40％的甘露醇；和/或按重量计约20％至约40％的微晶纤维素或按重量计约10％至约30％的微晶纤维素。例如，所公开的片剂可以包括包含以下的颗粒内相：按重量计约30％至约60％、例如约45％至约65％、或可选地按重量计约5％至约10％的所公开的IL-34抑制剂例如IL-34反义寡核苷酸，按重量计约30％至约50％、或可选地约5％至约15％的甘露醇，约5％至约15％的微晶纤维素，约0％至约4％、或约1％至7％的羟丙基甲基纤维素，以及按重量计约0％至约4％、例如约2％至约4％的羟基乙酸淀粉钠。
在另一种设想的实施方案中，用于口服施用所公开的IL-34抑制剂例如IL-34反义寡核苷酸的药物片剂制剂包含颗粒内相，其中颗粒内相包含所公开的IL-34抑制剂或其药学上可接受的盐(诸如钠盐)和药学上可接受的填充剂，并且也可以包含颗粒外相，颗粒外相可以包含药学上可接受的赋形剂诸如崩解剂。颗粒外相可以包含选自微晶纤维素、硬脂酸镁及其混合物的组分。药物组合物也可以包含按片剂重量计约12％至20％的肠溶包衣。例如，用于口服使用的药学上可接受的片剂可以包含按重量计约0.5％至10％的所公开的IL-34抑制剂，例如IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，按重量计约30％至50％的甘露醇，按重量计约10％至30％的微晶纤维素，以及包含丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物的肠溶包衣。
在另一实例中，用于口服使用的药学上可接受的片剂可以包含：颗粒内相，包含按重量计约5％至约10％的所公开的IL-34抑制剂，例如IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，按重量计约40％的甘露醇，按重量计约8％的微晶纤维素，按重量计约5％的羟丙基甲基纤维素，和按重量计约2％的羟基乙酸淀粉钠；颗粒外相，包含按重量计约17％的微晶纤维素、按重量计约2％羟基乙酸淀粉钠、按重量计约0.4％的硬脂酸镁；以及盖住片剂的包含丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物的肠溶包衣。
在一些实施方案中，药物组合物可以含有包含按重量计约13％或约15％、16％、17％或18％的例如
的肠溶包衣(参见例如PCT公布第WO2010/054826号，其特此通过引用以其整体并入)。
包衣溶解并且释放活性成分的速率是包衣的溶解速率。在一种实施方案中，设想的片剂可具有以下溶解曲线：例如，当在37℃在pH为7.2的磷酸盐缓冲液中以100rpm的USP/EP 2型装置(桨)测试时，约120分钟至约240分钟后，例如约180分钟后，约50％至约100％的IL-34抑制剂释放。在另一实施方案中，设想的片剂可具有以下溶解曲线：例如，当在37℃在pH为1.0的稀释HCl中以100rpm的USP/EP 2型装置(桨)测试时，其中120分钟后基本上没有IL-34抑制剂释放。在另一实施方案中，设想的片剂可具有以下溶解曲线：例如，当在37℃在pH为6.6的磷酸盐缓冲液中以100rpm的USP/EP 2型装置(桨)测试时，30分钟后约10％至约30％或不超过约50％的IL-34抑制剂释放。
在一些实施方案中，当口服施用至患者时，设想的制剂例如片剂可以在患者体内产生极小血浆浓度的IL-34抑制剂例如IL-34反义寡核苷酸。在另一种实施方案中，当口服施用至患者时，所公开的制剂被局部递送至患者的结肠或直肠，例如递送至患者的受影响或病变的部位。
在一些实施方案中，本文提供的方法还可以包括施用至少一种涉及治疗本文公开的疾病和紊乱的其他的剂。在一种实施方案中，设想的其他的剂可以共施用(例如顺序或同时地)。
设想的剂包括免疫抑制剂，包括糖皮质激素、细胞抑制剂、抗体、作用于免疫亲和蛋白(immunophilin)的剂、干扰素、阿片类药物、TNF结合蛋白、霉酚酸酯和小的生物学剂。例如，设想的免疫抑制剂包括但不限于：他克莫司、环孢菌素、吡美莫司、西罗莫司、依维莫司、霉酚酸、芬戈莫德、***、氟达拉滨、环磷酰胺、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤、来氟米特、特立氟胺、阿那白滞素、抗胸腺细胞球蛋白、抗淋巴细胞球蛋白、莫罗单抗-CD3、afutuzumab、利妥昔单抗、teplizumab、依法利珠单抗(efalizumab)、达利珠单抗(daclizumab)、巴利昔单抗、阿达木单抗、英夫利昔单抗、certolizumab pegol、那他珠单抗(natalizumab)和依那西普。其他设想的剂包括抗生素、止泻剂、轻泻药、镇痛药、铁补充剂和钙或维生素D或B-12补充剂。
施用剂量和频率
示例性制剂包括包含约35mg至约500mg所公开的IL-34抑制剂例如IL-34反义寡核苷酸或主要由约35mg至约500mg所公开的IL-34抑制剂例如IL-34反义寡核苷酸组成的剂型。例如，本文设想了包含约35mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg或250mg公开的IL-34抑制剂例如IL-34反义寡核苷酸的制剂。在一种实施方案中，制剂可包括约40mg、80mg或160mg公开的IL-34抑制剂例如IL-34反义寡核苷酸。在一些实施方案中，制剂可包括至少100μg公开的IL-34抑制剂例如IL-34反义寡核苷酸。例如，制剂可包含约0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、1mg、5mg、10mg、15mg、20mg或25mg所公开的IL-34抑制剂例如IL-34反义寡核苷酸。施用的量将取决于诸如以下的变量：待治疗疾病或适应症的类型和程度、患者的总体健康状况和体重、IL-34抑制剂的体内效力、药物制剂和施用途径。初始剂量可以增加到超过上限水平，以便快速达到期望的血液水平或组织水平。可选地，初始剂量可以小于最佳剂量，并且在治疗过程期间可以逐渐增加剂量。可以优化人类剂量，例如，在设计从40mg至160mg运行的常规I期剂量递增研究中。取决于诸如施用途径、剂量和正在治疗的疾病等因素，给药频率可以不同。示例性的给药频率是每天一次、每周一次和每两周一次。在一些实施方案中，给药为每天一次，持续7天。
诊断方法
本公开内容还提供了诊断患有炎性和/或纤维化疾病的患者的方法，该方法依赖于检测患者的一种或更多种生物学样品中IL-34表达信号的水平。如本文使用的，术语“IL-34表达信号”可以指IL-34基因表达、或基因或基因产物活性的任何指示。IL-34基因产物包括RNA(例如mRNA)、肽和蛋白质。可评估的IL-34基因表达指标包括但不限于，IL-34基因或染色质状态、IL-34基因与调控基因表达的细胞组分的相互作用、IL-34基因产物表达水平(例如IL-34RNA表达水平、IL-34蛋白表达水平)或者IL-34RNA或蛋白与转录机制、翻译机制或翻译后加工机制的相互作用。IL-34基因产物活性的指标包括但不限于IL-34信号传导活性的评估(例如CSF1R激活或MAPK1/MAPK3磷酸化的评估)和IL-34受体结合(例如CSF1R结合)的评估。
IL-34表达信号的检测可以通过体内、体外或离体方法来完成。在优选的实施方案中，本公开内容的方法可以在体外进行。检测方法可以包括检测患者的血液、血清、粪便物、组织或细胞。检测可以通过测量整个组织、组织外植体、细胞培养物、解离的细胞、细胞提取物或体液(包括血液或血清)中的IL-34表达信号来实现。设想的检测方法包括测量IL-34基因产物表达水平的测定，诸如蛋白质印迹、FACS、ELISA、其他定量结合测定、细胞或组织生长测定、RNA印迹、定量或半定量聚合酶链式反应、医学成像方法(例如MRI)或免疫染色方法(例如免疫组织化学或免疫细胞化学)。
实施例
本公开内容通过以下实施例进一步说明。实施例仅为说明目的而提供，并且不应被解释为以任何方式限制本公开内容的范围或内容。
实施例1：HT-29CRC细胞系以高水平表达IL-34
为评价IL-34在人类CRC细胞系中的表达，通过RT-PCR分析了DLD-1、HT-29和HCT-116人类CRC细胞系以及NCM-460正常肠上皮细胞系中IL-34mRNA的表达。使用β-肌动蛋白mRNA水平为参照，对IL-34mRNA表达水平进行归一化。如图1所示，HT-29细胞中IL-34mRNA表达丰富。
实施例2：IL-34反义寡核苷酸的设计与评价
设计了与小鼠和人类IL-34mRNA序列互补的SEQ ID NO:1-4的IL-34反义寡核苷酸并产生为含有硫代磷酸酯骨架。在HT-29人类和RAW 264.7小鼠细胞系中评价IL-34表达的敲低。将HT-29细胞(ATCC Manassas,Virginia,USA)在补充有10％FBS、1％P/S(均来自Lonza)的McCoy’s 5A(Lonza,Verviers,Belgium)中培养并在37℃和5％CO2维持在加湿的保温箱里。将鼠RAW264.7巨噬细胞(ATCC Manassas,Virginia,USA)在含有10％FBS、1％P/S和1％非必需氨基酸(NEA)(均来自Lonza)的Dulbecco改良Eagle培养基(1g/L葡萄糖)中培养并在37℃和5％CO2维持在加湿的保温箱里。将细胞不经处理或根据制造商的说明使用Opti-MEM培养基和Lipofectamine 3000试剂(Life Technologies，Milan，Intely)用特定的IL-34AON或加扰AON转染。提取总RNA和蛋白质。
通过实时聚合酶链式反应(RT-PCR)评价了HT-29细胞中的敲低。RT-PCR如下进行：将恒定量的RNA (0.5μg/样品)逆转录为互补DNA(cDNA)。然后使用以下方案扩增1μL cDNA/样品：在95℃变性1分钟；在60℃退火30秒，然后在72℃延伸30秒。使用了以下引物序列：IL-34正向,5’-ACAGGAGCCGACTTCAGTAC-3’(SEQ ID NO:29)；IL-34反向,5’-ACCAAGACCCACAGATACCG-3’(SEQ ID NO:30)；β-肌动蛋白正向,5’-AAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACC-3’(SEQ ID NO:31)；和β-肌动蛋白反向,5’-AGCCAGTCCAGACGCAGGAT-3’(SEQ ID NO:32)。相对于β-肌动蛋白mRNA表达计算mRNA表达。
用SEQ ID NO:1、2、3或4的人类IL-34AON或加扰的阴性对照寡核苷酸(SRC AS；5’-AACACGTCTATACGC-3’(SEQ ID NO:33))转染HT-29细胞24小时(图2A，AS34New1-4，分别相当于SEQ ID NO:1-4)。通过RT-PCR评价IL-34转录物，并针对β-肌动蛋白进行归一化。如通过RT-PCR评价的，用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的IL-34AON转染HT-29细胞显著降低了IL-34mRNA表达(图2A；Src AS对比AS34New1,p＝0.03；Src AS对比AS34New3，p＝0.03；数据以平均值±平均值的标准差(SEM)表示)。
还通过蛋白质印迹评价了HT-29细胞和RAW 264.7细胞中的敲低。蛋白质印迹如下进行：转染后，将细胞在含10mM HEPES(pH 7.9)、10mM KCl、0.1mM EDTA、0.2mM EGTA和0.5％Nonidet P40，并补充有1mM二硫苏糖醇、10mg/ml抑肽酶、10mg/mL亮抑蛋白酶肽、1mM苯甲基磺酰氟、1mM Na3VO4和1mM NaF的缓冲液中在冰上裂解。将裂解物在4℃，12.000xg离心30min澄清，并在10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离。使用小鼠抗人类IL-34抗体(1:1,000最终稀释；Abcam Cambridge,UK)与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二级IgG单克隆抗体(1:20,000最终稀释；Dako,Milan,Italy)检测IL-34。HRP反应用灵敏的增强化学发光试剂盒(Pierce，Rockford，IL)检测。分析后，剥离印迹并用小鼠抗人类β-肌动蛋白抗体(1:5,000最终稀释；Sigma-Aldrich)，随后用HRP缀合的二级IgG单克隆抗体(1:20,000最终稀释；Dako)探测。
图2B显示，用IL-34加扰对照或AS34New1或AS34New3 IL-34AON转染HT-29细胞导致IL-34蛋白表达下降。图2C显示，用IL-34加扰对照或AS34New1或AS34New3 IL-34AON转染RAW 264.7细胞导致IL-34蛋白表达下降。
进一步评价了IL-34AON AS34New1和AS34New 3在纤维狭窄性克罗恩病和癌相关成纤维细胞中的IL-34敲低。从肠结肠癌或纤维狭窄性CD(FS CD)外植体分离肠成纤维细胞。成纤维细胞新鲜使用或使用在传代3次和8次之间的成纤维细胞。将成纤维细胞在补充有10％FBS、1％P/S(Lonza)的DMEM高糖与UltraGlutamine中培养并在37℃和5％CO2维持在加湿的保温箱里。使用胰蛋白酶/EDTA溶液分离成纤维细胞。与用Src AS转染的FS CD外植体相比，用AS34New1或AS34New3转染FS CD外植体导致IL-34的敲低明显增加(图3A)。与用Src AS转染的成纤维细胞相比，用AS34New3转染癌相关成纤维细胞导致IL-34的敲低明显增加(图3B)。
在HT-29、RAW 264.7和MC-38细胞系中测试了包含5-甲基胞嘧啶修饰的IL-34AON(SEQ ID NO:7的IL-34AON)的敲低效力。MC38是鼠细胞系。将MC-38细胞(ATCC Manassas,Virginia,USA)在补充有10％的FBS和1％的P/S(Lonza)的McCoy’s 5A中培养，并在37℃和5％CO2维持在加湿的保温箱里。用IL-34AON转染所有细胞系24小时后，通过蛋白质印迹分析IL-34和β-肌动蛋白水平。用SEQ ID NO:1、3或7的含有硫代磷酸酯主链的IL-34AON(分别为New1-PS、New-3-PS、New-3-PS-MEC；图4A、图4B、图4C)或加扰对照(对照ASNew-1-PS、对照ASNew-3-PS)转染细胞。用包含5-甲基胞嘧啶的SEQ ID NO:7的IL-34AON转染导致相对于用所有其他测试AON转染增加的IL-34敲除(图4A、图4B和图4C)。这些结果表明，包括SEQ IDNO:7的IL-34AON在内的IL-34AON能够敲低小鼠和人类细胞系中IL-34mRNA和蛋白的表达。
实施例3：M-CSFR-1在克罗恩病纤维狭窄中过表达
通过RT-PCR评价来自CD患者的回肠炎性CD(I CD)和FS-CD样本中的M-CSFR-1的表达。手术样本取自10例因药物治疗响应不佳的慢性活动性疾病而经历手术治疗的患有I CD的患者和27例经历手术治疗的患有FS CD的患者。回肠对照(CTR)是取自27例经历结肠癌手术患者的肉眼观察和显微镜下观察未受影响区域的粘膜样本。每个参与研究的患者都给出了书面的知情同意书，并且研究方案得到了当地伦理委员会的批准。
RT-PCR如下进行：将RNA(0.5μg/样品)逆转录为cDNA。然后使用以下条件扩增1μlcDNA/样品：在95℃变性1分钟；对于M-CSFR-1在58℃或对于β-肌动蛋白在60℃退火30秒，然后在72℃延伸30秒。使用了以下引物序列：M-CSFR-1正向,5′-CTGCTCAACTTTCTGCGAAG-3’(SEQ ID NO:34)；M-CSFR-1反向,5′-CTCATCTCCACATAGGTGTC-3’(SEQ ID NO:35)；β-肌动蛋白正向,5’-AAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACC-3’(SEQ ID NO:31)；和β-肌动蛋白反向,5’-AGCCAGTCCAGACGCAGGAT-3’(SEQ ID NO:32)。相对于β-肌动蛋白mRNA表达计算mRNA表达。
如上所述地进行RT-PCR以评价M-CSFR-1在对照、I CD和FS CD样品中的表达。与CTR相比，I CD患者中M-CSFR-1mRNA转录物增加(图5A)。此外，FS CD样品中M-CSFR-1mRNA转录物相比于I CD和回肠CTR样品增加(图5A，回肠CTR对比I CD，p＝0.003；I CD对比FS CD，p＝0.01；平均值±SEM)。
进行I CD和FS CD样品的蛋白质印迹以评价M-CSFR-1表达。将细胞在含10mMHEPES(pH 7.9)、10mM KCl、0.1mM EDTA、0.2mM EGTA和0.5％Nonidet P40，并补充有1mM二硫苏糖醇、10mg/ml抑肽酶、10mg/mL亮抑蛋白酶肽、1mM苯甲基磺酰氟、1mM Na3VO4和1mM NaF的缓冲液中在冰上裂解。将裂解物在4℃离心30min澄清，并通过在10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺上凝胶电泳分离。将蛋白质转移到膜后，将膜与兔抗人类M-CSFR-1(1:500，NovusBiology Southpark Way,USA)、随后与HRP缀合的二级IgG单克隆抗体(最终稀释1:20,000，Dako，Milan，Italy)一起孵育。HRP反应用灵敏的增强化学发光试剂盒(Pierce，Rockford，IL)检测。分析后，剥离印迹，并与小鼠抗人类β-肌动蛋白(最终稀释1:5,000，Sigma-Aldrich)一起孵育。计算机辅助扫描密度测定法(Image-Lab 5.2.1,Bio-RadLaboratories,Milan,Italy)用于分析免疫反应带的强度。
I CD、FS CD和CTR样品中M-CSFR-1的蛋白提取和蛋白质印迹检测证实，I CD中M-CSFR-1的表达大于CTR中的，并且FS CD中M-CSFR-1的表达相对于CTR和I CD样品二者增加(图5B和图5C；回肠CTR对比I CD，p＝0.03；I CD对比FS CD，p＝0.01；平均值±SEM)。
还通过免疫组织化学评价了M-CSFR-1的表达。对回肠CTR、I CD和FS CD患者的***固定、石蜡包埋的回肠切片进行免疫组织化学。将切片用二甲苯脱石蜡和用乙醇脱水，并在Tris EDTA柠檬酸缓冲液(pH 7.8)中在98℃恒温浴(Dako)中进行抗原提取30分钟。免疫组织化学染色如下进行：使用针对人类M-CSFR-1的兔单克隆抗体(最终浓度1:200，Novus Biological)在室温(RT)孵育1小时，然后使用以3,3’二氨基联苯胺(DAB)作为发色团的不含生物素的HRP-聚合物检测技术(MACH 4通用HRP-聚合物试剂盒,BiocareMedical)检测。切片用苏木精进行复染，脱水并封固。同种型对照IgG染色的切片在如上所述的相同免疫组织化学条件下制备，用纯化的小鼠正常IgG对照抗体(R&D Systems)代替一抗。
回肠对照和FS CD样品的免疫组织化学分析显示，与对照切片(图5D)相比，FS CD(图5E)中M-CSFR-1表达增强。在同种型对照中未观察到M-CSFR-1的表达(图5F)。免疫组织化学分析还显示，***是M-CSFR-1阳性(图5E)。通过RT-PCR进一步证实了这些结果，其显示从FS CD患者回肠样品分离的成纤维细胞中M-CSFR-1mRNA表达相比于对照成纤维细胞增加(图5G；回肠CTR对比FS CD，p＝0.04；平均值±SEM))。这些结果表明，相对于非CD患者的回肠组织，CD患者组织中IL-34受体M-CSFR-1的表达增加。此外，这些结果表明，M-CSFR-1在FS CD组织中的表达高于来自I CD患者的组织。
实施例4：克罗恩病成纤维细胞中IL-34诱导胶原产生
通过用IL-34刺激对照肠成纤维细胞，评价了IL-34表达对肠成纤维细胞中胶原产生的调节。使用在传代3次和8次之间的成纤维细胞。将成纤维细胞维持在75cm2塑料烧瓶中，并在含5％CO2的加湿气氛中在37℃在补充有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)和1％非必需氨基酸(Lonza；Verviers,Belgium)的含高糖和UltraGlutamine的D-MEM中孵育。将5x104个正常成纤维细胞铺板到12孔板的每个孔中，静置至粘附24小时，饥饿6小时，并且最后不刺激或用重组人类IL-34(50ng/ml,R&D Systems,Minneapolis,MN)刺激。6-48小时后，收获细胞和无细胞上清液。细胞用于蛋白质和基因表达分析，并且分析了无细胞上清液的胶原含量。用以下引物对COL1A1和COL3A1进行RT-PCR：COL1A1正向，5′-GGACACAGAGGTTTCAGTGG-3′(SEQ ID NO:36)；COL1A1反向，3′-GGTGACTTTGGAGACACAGG-5(SEQ ID NO:37)；COL3A1正向5′-GGAGAATGTTGTGCAGTTTGC-3′(SEQ ID NO:38)；和COL3A1反向，3′-CGTTTGACGTGTTGTAAGAGG-5′(SEQ ID NO:39)。以下抗体用于蛋白质印迹：兔抗人类COL1A1(最终稀释1:1,000；Novus Biological,Italy)和兔抗人类COL3A1(最终稀释1:1,000；Novus Biological)。
RT-PCR分析表明，与未刺激的成纤维细胞(Unst)相比，用重组人类IL-34刺激显著增强了成纤维细胞中COL1A1和COL3A1 mRNA转录物的产生(图6A，Unst对比IL-34，p＝0.04；图6B，Unst对比IL-34，p＝0.03；平均值±SEM)。图6C是蛋白质印迹，显示与未刺激的成纤维细胞相比，用重组人类IL-34刺激也显著增强了成纤维细胞中COL1A1和COL3A1蛋白的表达。图6D和图6E分别为条形图，显示图6C的蛋白质印迹中COL1A1和COL3A1信号针对β-肌动蛋白对照归一化的定量(COL1A1，Unst对比IL-34，p＝0.03；COL3A1，Unst对比IL-34，p＝0.01；平均值±SEM)。
使用Sircol胶原测定试剂盒根据制造商的说明(Biocolor Ltd,Belfast,UK)在成纤维细胞上清液中测量总胶原。对成纤维细胞上清液中可溶形式胶原的定量表明，相对于未刺激的对照，用IL-34刺激导致胶原合成增加(图6F；Unst对比IL-34，p＝0.01；平均值±SEM)。这些结果表明，IL-34刺激了成纤维细胞中胶原的产生。
实施例5：IL-34经由p38MAP激酶依赖性通路刺激胶原产生
研究了IL-34对基于p38 MAP激酶的胶原合成的依赖性。IL-34激活上皮细胞中的p38 MAP激酶，这是一种控制肠成纤维细胞功能的信号通路。对照血清剥夺的肠成纤维细胞不刺激，或用重组人类IL-34(50ng/mL)、TNF-α(25ng/ml,R&D Systems)或IL-6(50ng/ml，R&D Systems)刺激30分钟，并且然后裂解。TNF-α和IL-6用作阳性对照。通过蛋白质印迹分析总提取物中磷酸化的(p-p38)和总p38丝裂原活化蛋白(MAP)激酶的含量。用以下抗体进行蛋白质印迹：兔抗人类p-p38(1:1,000EMD Millipore Corporation)和小鼠抗人类总p38(最终稀释1:500，Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Texas,USA)。与未刺激的细胞相比，IL-34刺激增强了成纤维细胞中p38 MAP激酶的磷酸化(图7A)。
为了评价MAP激酶p38对IL-34诱导的胶原产生的影响，将正常成纤维细胞与p38抑制剂SB202190(10mol/l；EMD Millipore Corporation,MA,USA)或二甲基亚砜(DMSO；媒介物)一起预孵育1小时，并且然后用IL-34(50ng/ml)刺激24-48小时或不刺激。通过蛋白质印迹分析细胞中蛋白质表达，并且分析无细胞上清液的胶原含量。图7B是蛋白质印迹，显示用SB202190预孵育细胞消除了IL-34诱导的COL1A1和COL3A1的产生。图7C和图7D为条形图，分别显示如通过蛋白质印迹评价的图7B所示的蛋白质印迹中COL1A1和COL3A1信号针对β-肌动蛋白对照归一化的定量(COL1A1(DMSO对比DMSO+IL-34，p＝0.0009；DMSO+IL-34对比SB202190，p＝0.0003；DMSO+IL-34对比SB202190+IL-34，p＝0.0001；DMSO对比SB202190+IL-34，p＝0.05)；COL3A1(DMSO对比DMSO+IL-34，p＝0.01；DMSO+IL-34对比SB202190，p＝0.002；DMSO+IL-34对比SB202190+IL-34，p＝0.002；DMSO对比SB202190+IL-34，p＝0.03)；平均值±SEM)，和通过Sircol测定评价的成纤维细胞中总胶原产生(图7E；DMSO对比DMSO+IL-34，p＝0.001；DMSO+IL-34对比SB202190+IL-34，p＝0.01；平均值±SEM)。这些结果表明，IL-34诱导的胶原产生依赖于p38 MAP激酶通路。
实施例6：克罗恩病纤维狭窄中的IL-34产生
评价纤维狭窄中IL-34的表达以确定纤维狭窄的细胞产生IL-34。评价在从I CD、FS CD和对照获取的肠样本中的IL-34RNA转录物。IL-34RNA转录物在I CD患者中与对照相比显著增加(图8A)。FS CD样品中IL-34RNA表达与对照和I CD样品相比增加(图8A；回肠CTR对比I CD，p＝0.002；I CD对比FS CD，p＝0.03；回肠CTR对比FS CD，p＝0.002；平均值±SEM)。图8B是从配对粘膜样品提取的总蛋白的蛋白质印迹分析，显示I CD患者中的IL-34表达与对照相比显著增加，并且FS CD患者中的IL-34表达与对照和I CD细胞二者相比显著增加。图8C是条形图，显示图8B所示的蛋白质印迹的IL-34信号针对β-肌动蛋白归一化的定量(回肠CTR对比ICD，p＝0.004；I CD对比FS CD，p＝0.04；回肠CTR对比FS CD，p＝0.004；平均值±SEM)。免疫组织化学分析还表明，与回肠对照(图8D)和同种型对照(图8F)相比，IL-34在FS CD细胞(图8E)中高表达。免疫组织化学还表明，在FS CD纤维狭窄中***表达IL-34(图8E)。与对照成纤维细胞相比，在从FS CD患者的回肠样品分离的成纤维细胞中观察到增强的IL-34RNA(图8G；平均值±SEM)和蛋白表达(图8H)二者。
实施例7：克罗恩病成纤维细胞中IL-34敲低导致减少的胶原产生
使用IL-34反义寡核苷酸评价IL-34抑制对从FS样本分离的CD成纤维细胞中胶原合成的影响。简而言之，将5x104个FS CD成纤维细胞铺板到12孔板的每个孔中，使其粘附24小时，并且然后不经处理或用SEQ ID NO:3的IL-34反义寡核苷酸(IL-34AS)或互补有义寡核苷酸(NCAS；均以200nM使用；Integrated DNA Technologies,Inc.Leuven,Belgium)使用Opti-MEM培养基和Lipofectamine 3000试剂按照制造商的说明(Life Technologies,Milan,Italy)转染24-48小时。通过蛋白质印迹确定转染效率。48小时后分析无细胞上清液的胶原含量。
与用对照反义序列转染相比，用IL-34反义寡核苷酸转染FS CD成纤维细胞显著降低了COL1A1和COL3A1蛋白的合成，如通过蛋白质印迹评价的(图9A)。
图9B、图9C和图9D为条形图，分别显示图9A所示的蛋白质印迹的IL-34、COL1A1和COL3A1信号针对β-肌动蛋白对照归一化的定量(IL-34，NCAS对比IL-34AS，p＝0.01；COL1A1，NCAS对比IL-34AS，p＝0.0004；COL3A1，NCAS对比IL-34AS，p＝0.004；平均值±SEM)。用IL-34反义寡核苷酸转染FS CD成纤维细胞也显著减少了成纤维细胞培养上清液中胶原的分泌(图9E；NCAS对比IL-34AS，p＝0.006，平均值±SEM)。
还评价了IL-34敲低对细胞死亡的影响。为了对细胞死亡评分，FS成纤维细胞在PBS中洗涤，按照制造商的说明用FITC-膜联蛋白V(AV,1:100最终稀释；Immunotools,Friesoyte,Germany)染色，并在4℃与5mg/ml PI(Life Technologies)一起孵育20分钟。荧光通过使用FACSVerse(BD Biosciences)流式细胞仪的FL-1和FL-2通道的流式细胞术测量。AV-/PI-细胞被认为是存活细胞，AV+/PI-细胞被认为是凋亡细胞，并且继发性坏死细胞通过AV+/PI+染色表征。图9G和图9H为用IL-34反义寡核苷酸或NCAS转染的FS CD成纤维细胞的流式细胞术点图。图9F是条形图，对应图9G和图9H的流式细胞术数据(平均值±SEM)，显示用IL-34反义寡核苷酸转染FS CD成纤维细胞没有导致增加的细胞死亡。这些结果表明，通过反义寡核苷酸敲低FS CD成纤维细胞中的IL-34导致显著减少的胶原产生，而对细胞死亡没有显著影响。
通过引用并入
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等同形式
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序列表
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<213> 智人(Homo sapiens)
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catcagacgg gaagcctgga ctgtgggttg ggggcagcct cagcctctcc aacctggcac 60
ccactgcccg tggcccttag gcacctgctt ggggtcctgg agccccttaa ggccaccagc 120
aaatcctagg agaccgagtc ttggcacgtg aacagagcca gatttcacac tgagcagctg 180
cagtcggaga aatcagagaa agcgtcaccc agccccagat tccgaggggc ctgccaggga 240
ctctctcctc ctgctccttg gaaaggaaga ccccgaaaga cccccaagcc accggctcag 300
acctgcttct gggctgccat gggacttgcg gccaccgccc cccggctgtc ctccacgctg 360
ccgggcagat aagggcagct gctgcccttg gggcacctgc tcactcccgc agcccagcca 420
ctcctccagg gccagccctt ccctgactga gtgaccacct ctgctgcccc gaggccatgt 480
aggccgtgct taggcctctg tggacacact gctggggacg gcgcctgagc tctcaggggg 540
acgaggaaca ccaccatgcc ccggggcttc acctggctgc gctatcttgg gatcttcctt 600
ggcgtggcct tggggaatga gcctttggag atgtggccct tgacgcagaa tgaggagtgc 660
actgtcacgg gttttctgcg ggacaagctg cagtacagga gccgacttca gtacatgaaa 720
cactacttcc ccatcaacta caagatcagt gtgccttacg agggggtgtt cagaatcgcc 780
aacgtcacca ggctgagggc ccaggtgagc gagcgggagc tgcggtatct gtgggtcttg 840
gtgagcctca gtgccactga gtcggtgcag gacgtgctgc tcgagggcca cccatcctgg 900
aagtacctgc aggaggtgga gacgctgctg ctgaatgtcc agcagggcct cacggatgtg 960
gaggtcagcc ccaaggtgga atccgtgttg tccctcttga atgccccagg gccaaacctg 1020
aagctggtgc ggcccaaagc cctgctggac aactgcttcc gggtcatgga gctgctgtac 1080
tgctcctgct gtaaacaaag ctccgtccta aactggcagg actgtgaggt gccaagtcct 1140
cagtcttgca gcccagagcc ctcattgcag tatgcggcca cccagctgta ccctccgccc 1200
ccgtggtccc ccagctcccc gcctcactcc acgggctcgg tgaggccggt cagggcacag 1260
ggcgagggcc tcttgccctg agcaccctgg atggtgactg cggatagggg cagccagacc 1320
agctcccaca ggagttcaac tgggtctgag acttcaaggg gtggtggtgg gagcccccct 1380
tgggagagga cccctgggaa gggtgttttt cctttgaggg ggattctgtg ccacagcagg 1440
gctcagcttc ctgccttcca tagctgtcat ggcctcacct ggagcggagg ggacctgggg 1500
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tgcaggggag acagccagca cggcgtggcc attctatgac cccccagcct ggcagactgg 1680
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gtttcttttt tctattaaac accccacttc ctttggaaaa aaaaaaaaaa aaa 1793
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<213> 智人(Homo sapiens)
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tctgggagtg gctgccagag ccagatttca cactgagcag ctgcagtcgg agaaatcaga 180
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agagccctca ttgcagtatg cggccaccca gctgtaccct ccgcccccgt ggtcccccag 1200
ctccccgcct cactccacgg gctcggtgag gccggtcagg gcacagggcg agggcctctt 1260
gccctgagca ccctggatgg tgactgcgga taggggcagc cagaccagct cccacaggag 1320
ttcaactggg tctgagactt caaggggtgg tggtgggagc cccccttggg agaggacccc 1380
tgggaagggt gtttttcctt tgagggggat tctgtgccac agcagggctc agcttcctgc 1440
cttccatagc tgtcatggcc tcacctggag cggaggggac ctggggacct gaaggtggat 1500
ggggacacag ctcctggctt ctcctggtgc tgccctcact gtccccccgc ctaaaggggg 1560
tactgagcct cctgtggccc gcagcagtga gggcacagct gtgggttgca ggggagacag 1620
ccagcacggc gtggccattc tatgaccccc cagcctggca gactggggag ctgggggcag 1680
agggcggtgc caagtgccac atcttgccat agtggatgct cttccagttt cttttttcta 1740
ttaaacaccc cacttccttt ggaaaaaaaa aaaaaaaaa 1779
<210> 26
<211> 1796
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
catcagacgg gaagcctgga ctgtgggttg ggggcagcct cagcctctcc aacctggcac 60
ccactgcccg tggcccttag gcacctgctt ggggtcctgg agccccttaa ggccaccagc 120
aaatcctagg agaccgagtc ttggcacgtg aacagagcca gatttcacac tgagcagctg 180
cagtcggaga aatcagagaa agcgtcaccc agccccagat tccgaggggc ctgccaggga 240
ctctctcctc ctgctccttg gaaaggaaga ccccgaaaga cccccaagcc accggctcag 300
acctgcttct gggctgccat gggacttgcg gccaccgccc cccggctgtc ctccacgctg 360
ccgggcagat aagggcagct gctgcccttg gggcacctgc tcactcccgc agcccagcca 420
ctcctccagg gccagccctt ccctgactga gtgaccacct ctgctgcccc gaggccatgt 480
aggccgtgct taggcctctg tggacacact gctggggacg gcgcctgagc tctcaggggg 540
acgaggaaca ccaccatgcc ccggggcttc acctggctgc gctatcttgg gatcttcctt 600
ggcgtggcct tggggaatga gcctttggag atgtggccct tgacgcagaa tgaggagtgc 660
actgtcacgg gttttctgcg ggacaagctg cagtacagga gccgacttca gtacatgaaa 720
cactacttcc ccatcaacta caagatcagt gtgccttacg agggggtgtt cagaatcgcc 780
aacgtcacca ggctgcagag ggcccaggtg agcgagcggg agctgcggta tctgtgggtc 840
ttggtgagcc tcagtgccac tgagtcggtg caggacgtgc tgctcgaggg ccacccatcc 900
tggaagtacc tgcaggaggt ggagacgctg ctgctgaatg tccagcaggg cctcacggat 960
gtggaggtca gccccaaggt ggaatccgtg ttgtccctct tgaatgcccc agggccaaac 1020
ctgaagctgg tgcggcccaa agccctgctg gacaactgct tccgggtcat ggagctgctg 1080
tactgctcct gctgtaaaca aagctccgtc ctaaactggc aggactgtga ggtgccaagt 1140
cctcagtctt gcagcccaga gccctcattg cagtatgcgg ccacccagct gtaccctccg 1200
cccccgtggt cccccagctc cccgcctcac tccacgggct cggtgaggcc ggtcagggca 1260
cagggcgagg gcctcttgcc ctgagcaccc tggatggtga ctgcggatag gggcagccag 1320
accagctccc acaggagttc aactgggtct gagacttcaa ggggtggtgg tgggagcccc 1380
ccttgggaga ggacccctgg gaagggtgtt tttcctttga gggggattct gtgccacagc 1440
agggctcagc ttcctgcctt ccatagctgt catggcctca cctggagcgg aggggacctg 1500
gggacctgaa ggtggatggg gacacagctc ctggcttctc ctggtgctgc cctcactgtc 1560
cccccgccta aagggggtac tgagcctcct gtggcccgca gcagtgaggg cacagctgtg 1620
ggttgcaggg gagacagcca gcacggcgtg gccattctat gaccccccag cctggcagac 1680
tggggagctg ggggcagagg gcggtgccaa gtgccacatc ttgccatagt ggatgctctt 1740
ccagtttctt ttttctatta aacaccccac ttcctttgga aaaaaaaaaa aaaaaa 1796
<210> 27
<211> 1747
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 27
tctagaaaca aatctgagct gctgtagcgt gtgtcccccg ccctccgaga agactgtagg 60
ctgaacacac aacagcctgt cccacacagc atttactgcc acagccccca aggcacctgc 120
tccaggcctt gagctgctca aagcttccgg cgacggcgac tgtagaagcc cacatcctgg 180
caggtgagca gagctagact tcacgctgag cagctgcagc cgaagaaacc agagaaagcg 240
ccacccagcc ccagattcca agaggcctgc ctgctgggga ctcccttctc ttcttcctcc 300
tcctcctctt cctcctcctg agaccctcaa agtcactgtc tcacaccagt tcctgagctg 360
caatgggact ggcagccact gccccctggc tgtcctccgc cctgccaagc agatagggcg 420
gtagctaccc caggagtatc tgccccctct cagcctggac cagccctttc tggacttggt 480
ggccaccttt gctgacctaa ggccatgtag tccctggctc aggcctctgg acacacttct 540
ggggacagtg cctctgctct cagggggcac ccagtgcacc accatgccct ggggactcgc 600
ctggctatac tgtcttggga tcctacttga cgtggctttg ggaaacgaga atttggagat 660
atggactctg acccaagata aggagtgtga ccttacaggc taccttcggg gcaagctgca 720
gtacaagaac cggcttcagt acatgaaaca ttacttcccc atcaactaca ggattgctgt 780
gccttatgag ggggtactca gagtggccaa catcacaagg ctgcagaagg ctcacgtgag 840
tgagcgagag cttcggtacc tgtgggtctt ggtgagtctc aatgccactg agtctgtgat 900
ggatgtactt ctcgagggcc acccgtcctg gaagtatcta caggaggttc agacattgct 960
ggagaacgta cagcggagcc tcatggatgt ggagattggc cctcacgtgg aagctgtgtt 1020
atctcttctg agtactccag gcctaagcct gaagctggtg cggcccaaag ccttgctgga 1080
caactgcttc cgggtcatgg aactgctgta ctgttcttgc tgtaaacaaa gccccatctt 1140
aaaatggcag gactgcgagc tgcccaggct ccatccccac agtccggggt ccttgatgca 1200
atgtacagct acaaatgtgt accctttgtc tcggcagacc cccacctccc tgcccggatc 1260
cccaagctca agccatggct cgttgccctg agcaatctat gtattgaccc tgggtcgggc 1320
cactggatgc atttcagaaa ctggcctgga tctgagacct tcctggatgg tgggtaggta 1380
gcccctttag gaaaggcctt cagggaaagg cctcctgcct tctcttccac acccaggctt 1440
cctgccttct ggtggtatca cggagcctca ggggagggat gtggagggga gggctggttg 1500
ctatccctta cagccacctc tgcttgtggc ccggtccgaa atctgcaaac actgttgccc 1560
cacaggcggg tggccaagaa cgacggggtg cctcctagga tcccaggact tactggggct 1620
tttcagttgt gctgactgtg gggtgctggg ccgaggacca accaaatgcc gtatcttgcc 1680
atgacgatgc tcttctggtt cctttttcta ttaaatggcc atttatttgg tttggcttgc 1740
aaaaaaa 1747
<210> 28
<211> 1865
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 28
tctagaaaca aatctgagct gctgtagcgt gtgtcccccg ccctccgaga agactgtagg 60
ctgaacacac aacagcctgt cccacacagc atttactgcc acagccccca aggcacctgc 120
tccaggcctt gagctgctca aagcttccgg cgacggcgac tgtagaagcc cacatcctgg 180
caggtgagca gagctagact tcacgctgag cagctgcagc cgaagaaacc agagaaagcg 240
ccacccagcc ccagattcca agaggcctgc ctgctgggga ctcccttctc ttcttcctcc 300
tcctcctctt cctcctcctg agaccctcaa agtcactgtc tcacaccagt tcctgagctg 360
caatgggact ggcagccact gccccctggc tgtcctccgc cctgccaagc agatagggcg 420
gtagctaccc caggagtatc tgccccctct cagcctggac cagccctttc tggacttggt 480
ggccaccttt gctgacctaa ggccatgtag tccctggctc aggcctctgg acacacttct 540
ggggacagtg cctctgctct cagggggcac ccagtgcacc accatgccct ggggactcgc 600
ctggctatac tgtcttggga tcctacttga cgtggctttg ggaaacgaga atttggagat 660
atggactctg acccaagata aggagtgtga ccttacaggc taccttcggg gcaagctgca 720
gtacaagaac cggcttcagt acatgaaaca ttacttcccc atcaactaca ggattgctgt 780
gccttatgag ggggtactca gagtggccaa catcacaagg ctgcagaagg ctcacgtgag 840
tgagcgagag cttcggtacc tgtgggtctt ggtgagtctc aatgccactg agtctgtgat 900
ggatgtactt ctcgagggcc acccgtcctg gaagtatcta caggaggttc agacattgct 960
ggagaacgta cagcggagcc tcatggccgt tggtgtacac ctgccgggac acgtacttgt 1020
gaccctgctc agccagctgc ctggcctccc cagcccatgg gccagatcat ttgacaccag 1080
ctgggagctt ctgatgatga aaggatgtgg agattggccc tcacgtggaa gctgtgttat 1140
ctcttctgag tactccaggc ctaagcctga agctggtgcg gcccaaagcc ttgctggaca 1200
actgcttccg ggtcatggaa ctgctgtact gttcttgctg taaacaaagc cccatcttaa 1260
aatggcagga ctgcgagctg cccaggctcc atccccacag tccggggtcc ttgatgcaat 1320
gtacagctac aaatgtgtac cctttgtctc ggcagacccc cacctccctg cccggatccc 1380
caagctcaag ccatggctcg ttgccctgag caatctatgt attgaccctg ggtcgggcca 1440
ctggatgcat ttcagaaact ggcctggatc tgagaccttc ctggatggtg ggtaggtagc 1500
ccctttagga aaggccttca gggaaaggcc tcctgccttc tcttccacac ccaggcttcc 1560
tgccttctgg tggtatcacg gagcctcagg ggagggatgt ggaggggagg gctggttgct 1620
atcccttaca gccacctctg cttgtggccc ggtccgaaat ctgcaaacac tgttgcccca 1680
caggcgggtg gccaagaacg acggggtgcc tcctaggatc ccaggactta ctggggcttt 1740
tcagttgtgc tgactgtggg gtgctgggcc gaggaccaac caaatgccgt atcttgccat 1800
gacgatgctc ttctggttcc tttttctatt aaatggccat ttatttggtt tggcttgcaa 1860
aaaaa 1865
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> source
<223> /注解="人工序列的描述：合成的引物"
<400> 29
acaggagccg acttcagtac 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> source
<223> /注解="人工序列的描述：合成的引物"
<400> 30
accaagaccc acagataccg 20
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> source
<223> /注解="人工序列的描述：合成的引物"
<400> 31
aagatgaccc agatcatgtt tgagacc 27
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> source
<223> /注解="人工序列的描述：合成的引物"
<400> 32
agccagtcca gacgcaggat 20
<210> 33
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> source
<223> /注解="人工序列的描述：合成的寡核苷酸"
<400> 33
aacacgtcta tacgc 15
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> source
<223> /注解="人工序列的描述：合成的引物"
<400> 34
ctgctcaact ttctgcgaag 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> source
<223> /注解="人工序列的描述：合成的引物"
<400> 35
ctcatctcca cataggtgtc 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> source
<223> /注解="人工序列的描述：合成的引物"
<400> 36
ggacacagag gtttcagtgg 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> source
<223> /注解="人工序列的描述：合成的引物"
<400> 37
ggacacagag gtttcagtgg 20
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> source
<223> /注解="人工序列的描述：合成的引物"
<400> 38
ggagaatgtt gtgcagtttg c 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> source
<223> /注解="人工序列的描述：合成的引物"
<400> 39
ggagaatgtt gtgcagtttg c 21
Claims (136)
1.一种IL-34反义寡核苷酸，所述IL-34反义寡核苷酸包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
5’-CTCACCAAGACCCACAG-3’(SEQ ID NO:1)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接；
5’-GGCTTTGGGCCGCACCAGCT-3’(SEQ ID NO:2)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接；
5’-CTTTGGGCCGCACCAGCTTC-3’(SEQ ID NO:3)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接；
5’-TGGGCCGCACCAGCTTCAGG-3’(SEQ ID NO:4)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接；
5’-TCCATGACCCGGAAGCAGTT-3’(SEQ ID NO:5)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接；和
5’-TGTTTCATGTACTGAAG-3’(SEQ ID NO:6)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接，
或
其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:3，并且其中至少一个胞苷被化学修饰。
3.根据权利要求2所述的反义寡核苷酸，其中所述核苷酸序列是5’-CTTTGGGCXGCACCAGCTTC-3’(SEQ ID NO:7)，并且其中X是5-甲基胞苷。
4.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:5，并且其中至少一个胞苷被化学修饰；任选地其中SEQ ID NO:5的第10位的胞苷被化学修饰，并且所述核苷酸序列是5’-TCCATGACCXGGAAGCAGTT-3’(SEQ ID NO:8)，并且其中X是5-甲基胞苷。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含一个或更多个锁核酸(LNA)。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸的每个核苷酸包含锁核酸(LNA)。
7.一种IL-34反义寡核苷酸，所述IL-34反义寡核苷酸包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
5’-cttTGGGCXGCACCAGCttc-3’(SEQ ID NO:9)，其中c为LNA胞苷，t为LNA胸苷，并且X为5-甲基胞苷；
5’-ctttGGGCXGCACCAGcttc-3’(SEQ ID NO:10)，其中c为LNA胞苷，t为LNA胸苷，并且X为5-甲基胞苷；
5’-cttTGGGCcgCACCAGCttc-3’(SEQ ID NO:11)，其中c为LNA胞苷，t为LNA胸苷，并且g为LNA鸟苷；
5’-cttTGGGCcGCACCAGCttc-3’(SEQ ID NO:12)，其中c为LNA胞苷，并且t为LNA胸苷；
5’-ggcXGCACCAGCttc-3’(SEQ ID NO:13)，其中c是LNA胞苷，t是LNA胸苷，g是LNA鸟苷，并且X是5-甲基胞苷；
5’-cttTGGGCXGCACcag-3’(SEQ ID NO:14)，其中c为LNA胞苷，t为LNA胸苷，g为LNA鸟苷，a为LNA腺苷，并且X为5-甲基胞苷；和
5’-tgaCCXGGAAGCAgtt-3’(SEQ ID NO:15)，其中a为LNA腺苷，t为LNA胸苷，g为LNA鸟苷，并且X为5-甲基胞苷，或
其药学上可接受的盐。
8.一种IL-34反义寡核苷酸，所述IL-34反义寡核苷酸包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
5’-CxTxTxTxGxGGCXGCACCAGxCxTxTxCx-3’(SEQ ID NO:16)，其中Cx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷，Tx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷，Gx为2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷，并且X为5-甲基胞苷；
5’-TxCxCxAxTxGACCXGGAAGCxAxGxTxTx-3’(SEQ ID NO:17)，其中Cx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷，Tx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷，Gx为2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷，Ax为2’-O-(2-甲氧基乙基)腺苷，并且X为5-甲基胞苷；
5’-CxTxTxTxGxGxGCXGCACCAxGxCxTxTxCx-3’(SEQ ID NO:18)，其中Cx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷，Tx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷，Gx为2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷，Ax为2’-O-(2-甲氧基乙基)腺苷，并且X为5-甲基胞苷；
5’-TxCxCxAxTxGxACCXGGAAGxCxAxGxTxTx-3’(SEQ ID NO:19)，其中Cx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷，Tx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷，Gx为2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷，Ax为2’-O-(2-甲氧基乙基)腺苷，并且X为5-甲基胞苷；
5’-CxTxTxTxGxGxGxCxXGxCxAxCxCxAxGxCxTxTxCx-3’(SEQ ID NO:20)，其中Cx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷，Tx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷，Gx为2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷，Ax为2’-O-(2-甲氧基乙基)腺苷，并且X为5-甲基胞苷；和
5’-TxCxCxAxTxGxAxCxCxXGxGxAxAxGxCxAxGxTxTx-3’(SEQ ID NO:21)，其中Cx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胞苷，Tx为2’-O-(2-甲氧基乙基)胸苷，Gx为2’-O-(2-甲氧基乙基)鸟苷，Ax为2’-O-(2-甲氧基乙基)腺苷，并且X为5-甲基胞苷，或
其药学上可接受的盐。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含一个或更多个核糖核苷酸。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含一个或更多个脱氧核糖核苷酸。
11.根据权利要求1-8中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述序列的至少一个核苷间连接选自由以下组成的组：硫代磷酸酯连接、二硫代磷酸酯连接、磷酸三酯连接、烷基膦酸酯连接、氨基烷基磷酸三酯连接、亚烷基膦酸酯连接、亚膦酸酯连接、磷酰胺连接和氨基烷基磷酰胺连接、硫代磷酰胺连接、硫羰烷基膦酸酯连接、硫羰烷基磷酸三酯连接、硫代磷酸酯连接、硒代磷酸酯连接和硼烷磷酸酯连接。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述序列的至少一个核苷间连接为硫代磷酸酯连接。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述序列的所有核苷间连接均为硫代磷酸酯连接。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的反义寡核苷酸，其中一个或更多个胞苷被5-甲基胞苷代替。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸的长度为20个核苷酸，或长度为20-25个、20-30个、20-35个、25-30个、25-35个或30-35个核苷酸。
17.根据权利要求16所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸的长度为20-25个核苷酸。
18.根据权利要求1-15中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸的长度不超过20个、25个、30个或35个核苷酸。
19.一种化合物，包含根据权利要求1-18中任一项所述的反义寡核苷酸，或其药学上可接受的盐。
20.一种化合物，包含根据权利要求1-3和5-18中任一项所述的反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述反义寡核苷酸包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列，并且其中至少一个胞苷被化学修饰。
21.根据权利要求20所述的化合物，其中所述反义寡核苷酸包含核苷酸序列5’-CTTTGGGCXGCACCAGCTTC-3’(SEQ ID NO:7)，并且其中X是5-甲基胞苷。
22.一种治疗炎性疾病的方法，所述方法包括向有相应需要的患者施用有效量的根据权利要求1-18中任一项所述的IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，或根据权利要求19-21中任一项所述的化合物。
23.一种抑制患有炎性疾病的患者的细胞中炎性细胞因子产生的方法，所述方法包括施用有效量的根据权利要求1-18中任一项所述的IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，或根据权利要求19-21中任一项所述的化合物。
24.一种减少或抑制患有炎性疾病的患者的细胞中IL-34介导的炎症应答的方法，所述方法包括施用有效量的根据权利要求1-18中任一项所述的IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，或根据权利要求19-21中任一项所述的化合物。
25.一种治疗有相应需要的患者的与改变的IL-34表达相关的炎性疾病的方法，所述方法包括施用有效量的根据权利要求1-18中任一项所述的IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，或根据权利要求19-21中任一项所述的化合物。
26.一种抑制患有炎性疾病的患者的细胞中IL-34介导的巨噬细胞集落刺激因子受体(M-CSFR-1)信号传导的方法，所述方法包括施用有效量的根据权利要求1-18中任一项所述的IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，或根据权利要求19-21中任一项所述的化合物。
27.一种减少或消除患有炎性疾病的患者的纤维化狭窄的方法，所述方法包括施用有效量的根据权利要求1-18中任一项所述的IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，或根据权利要求19-21中任一项所述的化合物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述纤维化狭窄位于肠内。
29.根据权利要求22-28中任一项所述的方法，其中所述炎性疾病选自由以下组成的组：炎性肠病、类风湿性关节炎、银屑病、骨关节炎、糖尿病(I型和II型)、组织或器官排斥、多发性硬化、牙周炎症、牙周炎、色素沉着绒毛结节性滑膜炎、肝炎、鼻窦炎、结肠癌、结肠直肠癌、结肠炎相关性结肠癌、散发性结肠直肠癌、冠状动脉疾病、干燥综合征(SS)、肥胖症、慢性炎症、肺结节病、皮肤病变、CNS炎性疾病或自身免疫性疾病。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述炎性疾病是炎性肠病。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述炎性肠病选自由以下组成的组：克罗恩病、胃十二指肠克罗恩病、克罗恩(肉芽肿性)结肠炎、炎性克罗恩病、纤维狭窄性克罗恩病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、白塞病、微观结肠炎、溃疡性直肠炎、直肠乙状结肠炎、空肠回肠炎、左侧结肠炎、全结肠炎、回肠结肠炎、回肠炎和未定型性结肠炎。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述炎性肠病是炎性克罗恩病。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述炎性肠病是纤维狭窄性克罗恩病。
34.根据权利要求22-33中任一项所述的方法，其中所述IL-34反义寡核苷酸局部、肠胃外、口服、肺部、气管内、鼻内、透皮或十二指肠内施用。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述IL-34反义寡核苷酸口服施用。
36.根据权利要求22-35中任一项所述的方法，其中所述患者是人类。
37.一种药学上可接受的组合物，包含根据权利要求1-18中任一项所述的IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，或根据权利要求19-21中任一项所述的化合物，以及药学上可接受的赋形剂。
38.根据权利要求37所述的药物组合物，其中所述药物组合物适用于局部、肠胃外、口服、肺部、气管内、鼻内、透皮或十二指肠内施用。
39.根据权利要求1-18中任一项所述的IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，或根据权利要求19-21中任一项所述的化合物在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途。
40.根据权利要求39所述的用途，其中所述炎性疾病选自由以下组成的组：炎性肠病、类风湿性关节炎、银屑病、骨关节炎、糖尿病(I型和II型)、组织或器官排斥、多发性硬化、牙周炎症、牙周炎、色素沉着绒毛结节性滑膜炎、肝炎、鼻窦炎、结肠癌、结肠直肠癌、结肠炎相关性结肠癌、散发性结肠直肠癌、冠状动脉疾病或干燥综合征(SS)、肥胖症、慢性炎症、肺结节病、皮肤病变、CNS炎性疾病或自身免疫性疾病。
41.根据权利要求40所述的用途，其中所述炎性疾病是炎性肠病。
42.根据权利要求41所述的用途，其中所述炎性肠病选自由以下组成的组：克罗恩病、炎性克罗恩病、纤维狭窄性克罗恩病、胃十二指肠克罗恩病、克罗恩(肉芽肿性)结肠炎、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、白塞病、微观结肠炎、溃疡性直肠炎、直肠乙状结肠炎、空肠回肠炎、左侧结肠炎、全结肠炎、回肠结肠炎、回肠炎和未定型性结肠炎。
43.根据权利要求42所述的用途，其中所述炎性肠病是炎性克罗恩病。
44.根据权利要求42所述的用途，其中所述炎性肠病是纤维狭窄性克罗恩病。
45.一种抑制受试者细胞中IL-34表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用药学有效量的药物制品，所述药物制品包含根据权利要求1-18中任一项所述的IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，或根据权利要求19-21中任一项所述的化合物。
46.一种抑制受试者细胞中一种或更多种胶原表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用药学有效量的药物制品，所述药物制品包含根据权利要求1-18中任一项所述的IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，或根据权利要求19-21中任一项所述的化合物。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述细胞是肠细胞。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述细胞是肠***。
49.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述细胞形成肠纤维狭窄的一部分。
50.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述受试者需要治疗选自炎性克罗恩病或纤维狭窄性克罗恩病的疾病。
51.根据权利要求46所述的方法，其中所述一种或更多种胶原选自由胶原1A、胶原3A及其混合物组成的组。
52.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述药物制品口服施用。
53.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述受试者是人类。
54.一种用于预防或治疗纤维化的方法，所述方法包括向有相应需要的患者施用治疗有效量的根据权利要求1-18中任一项所述的IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，或根据权利要求19-21中任一项所述的化合物。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述纤维化是肠纤维化。
56.根据权利要求54所述的方法，其中所述纤维化是肺纤维化。
57.根据权利要求54所述的方法，其中所述纤维化选自由以下组成的组：肾纤维化、心脏纤维化、心内膜心肌纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化和肾源性***性纤维化。
58.一种预防或治疗肠纤维化的方法，所述方法包括向有相应需要的患者施用药学有效量的药物制品，所述药物制品包含根据权利要求1-18中任一项所述的IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，或根据权利要求19-21中任一项所述的化合物。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述药物制品口服施用。
60.根据权利要求58或59所述的方法，其中所述患者是人类。
61.根据权利要求58-60中任一项所述的方法，其中所述患者还患有克罗恩病。
62.一种预防或治疗肺纤维化的方法，所述方法包括向有相应需要的患者施用药学有效量的药物制品，所述药物制品包含根据权利要求1-18中任一项所述的IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，或根据权利要求19-21中任一项所述的化合物。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述药物制品口服施用。
64.根据权利要求62或63所述的方法，其中所述患者是人类。
65.根据权利要求1-18中任一项所述的IL-34反义寡核苷酸，或其药学上可接受的盐，或根据权利要求19-21中任一项所述的化合物，用于作为药物。
66.根据权利要求1-18中任一项所述的IL-34反义寡核苷酸，或其药学上可接受的盐，或根据权利要求19-21中任一项所述的化合物，用于治疗炎性疾病。
67.根据权利要求66所述的用于使用的IL-34反义寡核苷酸，其中所述炎性疾病选自由以下组成的组：炎性肠病、类风湿性关节炎、银屑病、骨关节炎、糖尿病(I型和II型)、组织或器官排斥、多发性硬化、牙周炎症、牙周炎、色素沉着绒毛结节性滑膜炎、肝炎、鼻窦炎、结肠癌、结肠直肠癌、结肠炎相关性结肠癌、散发性结肠直肠癌、冠状动脉疾病或干燥综合征(SS)、肥胖症、慢性炎症、肺结节病、皮肤病变、CNS炎性疾病或自身免疫性疾病。
68.根据权利要求67所述的用于使用的IL-34反义寡核苷酸，其中所述炎性疾病是炎性肠病。
69.根据权利要求68所述的用于使用的IL-34反义寡核苷酸，其中所述炎性肠病选自由以下组成的组：克罗恩病、炎性克罗恩病、纤维狭窄性克罗恩病、胃十二指肠克罗恩病、克罗恩(肉芽肿性)结肠炎、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、白塞病、微观结肠炎、溃疡性直肠炎、直肠乙状结肠炎、空肠回肠炎、左侧结肠炎、全结肠炎、回肠结肠炎、回肠炎和未定型性结肠炎。
70.根据权利要求69所述的用于使用的IL-34反义寡核苷酸，其中所述炎性肠病是炎性克罗恩病。
71.根据权利要求69所述的用于使用的IL-34反义寡核苷酸，其中所述炎性肠病是纤维狭窄性克罗恩病。
72.根据权利要求1-18中任一项所述的IL-34反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，用于治疗纤维化。
73.根据权利要求72所述的用于使用的IL-34反义寡核苷酸，其中所述纤维化是肠纤维化。
74.根据权利要求72所述的用于使用的IL-34反义寡核苷酸，其中所述纤维化是肺纤维化。
75.根据权利要求72所述的用于使用的IL-34反义寡核苷酸，其中所述纤维化选自由以下组成的组：肾纤维化、心脏纤维化、心内膜心肌纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化和肾源性***性纤维化。
76.一种IL-34抑制剂，所述IL-34抑制剂包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
5’-CTCACCAAGACCCACAG-3’(SEQ ID NO:1)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接；
5’-GGCTTTGGGCCGCACCAGCT-3’(SEQ ID NO:2)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接；
5’-CTTTGGGCCGCACCAGCTTC-3’(SEQ ID NO:3)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接；
5’-TGGGCCGCACCAGCTTCAGG-3’(SEQ ID NO:4)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接；
5’-TCCATGACCCGGAAGCAGTT-3’(SEQ ID NO:5)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接；和5’-TGTTTCATGTACTGAAG-3’(SEQ ID NO:6)，其中至少一个核苷是化学修饰的核苷和/或至少一个连接是修饰的核苷间连接，
或
其药学上可接受的盐。
77.根据权利要求76所述的IL-34抑制剂，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:3，并且其中至少一个胞苷被化学修饰。
78.根据权利要求77所述的IL-34抑制剂，其中所述核苷酸序列是5’-CTTTGGGCXGCACCAGCTTC-3’(SEQ ID NO:7)，并且其中X是5-甲基胞苷。
79.根据权利要求76所述的IL-34抑制剂，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:5，并且其中至少一个胞苷被化学修饰；任选地其中SEQ ID NO:5的第10位的胞苷被化学修饰，并且所述核苷酸序列是5’-TCCATGACCXGGAAGCAGTT-3’(SEQ ID NO:8)，并且其中X是5-甲基胞苷。
80.根据权利要求76-79中任一项所述的IL-34抑制剂，其中所述反义寡核苷酸包含一个或更多个锁核酸(LNA)。
81.根据权利要求76-80所述的IL-34抑制剂，其中所述反义寡核苷酸的每个核苷酸包含锁核酸(LNA)。
82.根据权利要求76-81中任一项所述的IL-34抑制剂，其中所述IL-34抑制剂是IL-34siRNA，或其药学上可接受的盐。
83.根据权利要求82所述的IL-34抑制剂，其中所述序列的至少一个核苷间连接选自由以下组成的组：硫代磷酸酯连接、二硫代磷酸酯连接、磷酸三酯连接、烷基膦酸酯连接、氨基烷基磷酸三酯连接、亚烷基膦酸酯连接、亚膦酸酯连接、磷酰胺连接和氨基烷基磷酰胺连接、硫代磷酰胺连接、硫羰烷基膦酸酯连接、硫羰烷基磷酸三酯连接、硫代磷酸酯连接、硒代磷酸酯连接和硼烷磷酸酯连接。
84.根据权利要求82或83所述的IL-34抑制剂，其中所述序列的至少一个核苷间连接为硫代磷酸酯连接。
85.根据权利要求82-84中任一项所述的IL-34抑制剂，其中所述序列的所有核苷间连接均为硫代磷酸酯连接。
86.根据权利要求82-85中任一项所述的IL-34抑制剂，其中一个或更多个胞苷被5-甲基胞苷代替。
87.根据权利要求82-86中任一项所述的IL-34抑制剂，其中所述IL-34siRNA的长度为17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、20-25个、20-30个或25-30个核苷酸。
88.根据权利要求87所述的IL-34抑制剂，其中所述IL-34siRNA的长度为20-25个核苷酸。
89.根据权利要求82-86中任一项所述的IL-34抑制剂，其中所述IL-34siRNA的长度不超过20个、25个或30个核苷酸。
90.一种治疗炎性疾病的方法，所述方法包括向有相应需要的患者施用有效量的根据权利要求76-89中任一项所述的IL-34抑制剂或其药学上可接受的盐。
91.一种抑制患有炎性疾病的患者的细胞中炎性细胞因子产生的方法，所述方法包括施用有效量的根据权利要求76-89中任一项所述的IL-34抑制剂或其药学上可接受的盐。
92.一种减少或抑制患有炎性疾病的患者的细胞中IL-34介导的炎症应答的方法，所述方法包括施用有效量的根据权利要求76-89中任一项所述的IL-34抑制剂或其药学上可接受的盐。
93.一种治疗有相应需要的患者的与改变的IL-34表达相关的炎性疾病的方法，所述方法包括施用有效量的根据权利要求76-89中任一项所述的IL-34抑制剂或其药学上可接受的盐。
94.一种抑制患有炎性疾病的患者的细胞中IL-34介导的巨噬细胞集落刺激因子受体(M-CSFR-1)信号传导的方法，所述方法包括施用有效量的根据权利要求76-89中任一项所述的IL-34抑制剂或其药学上可接受的盐。
95.一种减少或消除患有炎性疾病的患者的纤维化狭窄的方法，所述方法包括施用有效量的根据权利要求76-89中任一项所述的IL-34抑制剂或其药学上可接受的盐。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述纤维化狭窄位于肠内。
97.根据权利要求90-96中任一项所述的方法，其中所述炎性疾病选自由以下组成的组：炎性肠病、类风湿性关节炎、银屑病、骨关节炎、糖尿病(I型和II型)、组织或器官排斥、多发性硬化、牙周炎症、牙周炎、色素沉着绒毛结节性滑膜炎、肝炎、鼻窦炎、结肠癌、结肠直肠癌、结肠炎相关性结肠癌、散发性结肠直肠癌、冠状动脉疾病、干燥综合征(SS)、肥胖症、慢性炎症、肺结节病、皮肤病变、CNS炎性疾病或自身免疫性疾病。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述炎性疾病是炎性肠病。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述炎性肠病选自由以下组成的组：克罗恩病、胃十二指肠克罗恩病、克罗恩(肉芽肿性)结肠炎、炎性克罗恩病、纤维狭窄性克罗恩病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、白塞病、微观结肠炎、溃疡性直肠炎、直肠乙状结肠炎、空肠回肠炎、左侧结肠炎、全结肠炎、回肠结肠炎、回肠炎和未定型性结肠炎。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述炎性肠病是炎性克罗恩病。
101.根据权利要求99所述的方法，其中所述炎性肠病是纤维狭窄性克罗恩病。
102.根据权利要求90-101中任一项所述的方法，其中所述IL-34抑制剂局部、肠胃外、口服、肺部、气管内、鼻内、透皮或十二指肠内施用。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述IL-34抑制剂口服施用。
104.根据权利要求90-103中任一项所述的方法，其中所述患者是人类。
105.一种药学上可接受的组合物，包含根据权利要求76-89中任一项所述的IL-34抑制剂或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的赋形剂。
106.根据权利要求105所述的方法，其中所述药物组合物适用于局部、肠胃外、口服、肺部、气管内、鼻内、透皮或十二指肠内施用。
107.根据权利要求76-89中任一项所述的IL-34抑制剂或其药学上可接受的盐在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途。
108.根据权利要求107所述的用途，其中所述炎性疾病选自由以下组成的组：炎性肠病、类风湿性关节炎、银屑病、骨关节炎、糖尿病(I型和II型)、组织或器官排斥、多发性硬化、牙周炎症、牙周炎、色素沉着绒毛结节性滑膜炎、肝炎、鼻窦炎、结肠癌、结肠直肠癌、结肠炎相关性结肠癌、散发性结肠直肠癌、冠状动脉疾病或干燥综合征(SS)、肥胖症、慢性炎症、肺结节病、皮肤病变、CNS炎性疾病或自身免疫性疾病。
109.根据权利要求108所述的用途，其中所述炎性疾病是炎性肠病。
110.根据权利要求109所述的用途，其中所述炎性肠病选自由以下组成的组：克罗恩病、炎性克罗恩病、纤维狭窄性克罗恩病、胃十二指肠克罗恩病、克罗恩(肉芽肿性)结肠炎、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、白塞病、微观结肠炎、溃疡性直肠炎、直肠乙状结肠炎、空肠回肠炎、左侧结肠炎、全结肠炎、回肠结肠炎、回肠炎和未定型性结肠炎。
111.根据权利要求110所述的用途，其中所述炎性肠病是炎性克罗恩病。
112.根据权利要求110所述的用途，其中所述炎性肠病是纤维狭窄性克罗恩病。
113.一种抑制受试者细胞中IL-34表达的方法，所述方法包括向受试者施用药学有效量的药物制品，所述药物制品包含根据权利要求76-89中任一项所述的IL-34抑制剂或其药学上可接受的盐。
114.一种抑制受试者细胞中一种或更多种胶原表达的方法，所述方法包括向受试者施用药学有效量的药物制品，所述药物制品包含根据权利要求76-89中任一项所述的IL-34抑制剂或其药学上可接受的盐。
115.根据权利要求113或114所述的方法，其中所述细胞是肠细胞。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述细胞是肠***。
117.根据权利要求113或114所述的方法，其中所述细胞形成肠纤维狭窄的一部分。
118.根据权利要求113或114所述的方法，其中所述受试者需要治疗选自炎性克罗恩病或纤维狭窄性克罗恩病的疾病。
119.根据权利要求114所述的方法，其中所述一种或更多种胶原选自由胶原1A、胶原3A及其混合物组成的组。
120.根据权利要求113或114所述的方法，其中所述药物制品口服施用。
121.根据权利要求113或114所述的方法，其中所述受试者是人类。
122.一种用于预防或治疗纤维化的方法，所述方法包括向有相应需要的患者施用治疗有效量的根据权利要求76-89中任一项所述的IL-34抑制剂或其药学上可接受的盐。
123.根据权利要求122所述的方法，其中所述纤维化是肠纤维化。
124.一种预防或治疗肠纤维化的方法，所述方法包括向有相应需要的患者施用药学有效量的药物制品，所述药物制品包含根据权利要求76-89中任一项所述的IL-34抑制剂或其药学上可接受的盐。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述药物制品口服施用。
126.根据权利要求124或125所述的方法，其中所述患者是人类。
127.根据权利要求124-126中任一项所述的方法，其中所述患者还患有克罗恩病。
128.根据权利要求76-89中任一项所述的IL-34抑制剂或其药学上可接受的盐，用作药物。
129.根据权利要求76-89中任一项所述的IL-34抑制剂或其药学上可接受的盐，用于治疗炎性疾病。
130.根据权利要求129所述的用于使用的IL-34抑制剂，其中所述炎性疾病选自由以下组成的组：炎性肠病、类风湿性关节炎、银屑病、骨关节炎、糖尿病(I型和II型)、组织或器官排斥、多发性硬化、牙周炎症、牙周炎、色素沉着绒毛结节性滑膜炎、肝炎、鼻窦炎、结肠癌、结肠直肠癌、结肠炎相关性结肠癌、散发性结肠直肠癌、冠状动脉疾病或干燥综合征(SS)、肥胖症、慢性炎症、肺结节病、皮肤病变、CNS炎性疾病或自身免疫性疾病。
131.根据权利要求130所述的用于使用的IL-34抑制剂，其中所述炎性疾病是炎性肠病。
132.根据权利要求131所述的用于使用的IL-34抑制剂，其中所述炎性肠病选自由以下组成的组：克罗恩病、炎性克罗恩病、纤维狭窄性克罗恩病、胃十二指肠克罗恩病、克罗恩(肉芽肿性)结肠炎、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、白塞病、微观结肠炎、溃疡性直肠炎、直肠乙状结肠炎、空肠回肠炎、左侧结肠炎、全结肠炎、回肠结肠炎、回肠炎和未定型性结肠炎。
133.根据权利要求132所述的用于使用的IL-34抑制剂，其中所述炎性肠病是炎性克罗恩病。
134.根据权利要求132所述的用于使用的IL-34抑制剂，其中所述炎性肠病是纤维狭窄性克罗恩病。
135.根据权利要求76-89中任一项所述的IL-34抑制剂或其药学上可接受的盐，用于治疗纤维化。
136.根据权利要求135所述的用于使用的IL-34抑制剂，其中所述纤维化是肠纤维化。
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