JP2018021929A - サイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2009年12月15日に出願された米国特許仮出願第61/286,582号、および2009年6月17日に出願された同第61/355,970号の優先権を主張するものであり、これらの仮出願の全開示をこの参照により本明細書に組み込む。
本発明は、サイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置および方法に関する。本発明の実施形態は、通常の高速液体クロマトグラフィーまたは超高速液体クロマトグラフィー圧でのサイズ排除クロマトグラフィーのための装置および方法、とりわけ小粒子を使用する上記装置および方法を特徴とする。
入口および出口を有するチャンバを画成する少なくとも1つの壁を有するハウジングと、
前記チャンバ内に保持されたコアおよび表面組成物を含む固定相材料と
を含み、前記固定相材料は、式1:
W−[X]−Q
式1
によって表される粒子またはモノリスを含み
式中、
Xは、シリカコア材料、金属酸化物コア材料、有機−無機ハイブリッドコア材料またはこれらのブロックポリマーの一群を含む表面を有するコア組成物であり;
Wは、水素またはヒドロキシルであり;および
Qは、不在であり、または分析物との静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合性相互作用もしくは他の相互作用を最小にする官能基である。
n1は、0−30の整数であり;
n2は、0−30の整数であり;
R1、R2、R3およびR4の各存在は、水素、フルオロ、低級アルキル、保護もしくは脱保護アルコール、双性イオンまたは基Zを独立して表し;
Zは、
a)固定相材料の表面と式3:
(B1)x(R5)y(R6)zSi−
式3:
(式中、
xは、1−3の整数であり、
yは、0−2の整数であり、
zは、0−2の整数であり、および
x+y+z=3であり、
R5およびR6の各存在は、メチル、エチル、n−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、イソプロピル、テキシル、置換もしくは非置換アリール、環式アルキル、分岐アルキル、低級アルキル、保護もしくは脱保護アルコールまたは双性イオン基を独立して表し;
B1は、−OR7、−NR7’R7’’、−OSO2CF3または−Clを表し、この場合のR7、R7’およびR7’’のそれぞれは、水素、メチル、エチル、n−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、イソプロピル、テキシル、フェニル、分岐アルキルまたは低級アルキルを表す。);
の部分の間での共有もしくは非共有結合の形成により生成される表面連結基;
b)直接炭素−炭素結合形成による、またはヘテロ原子、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、尿素、カルボナート、カルバマート、複素環、トリアゾールもしくはウレタン結合によるXの表面ハイブリッド基への直接的連結;または
c)固定相材料の表面に共有結合で連結されていない吸着基;
d)Wが水素であるとき、反応により固定相材料の表面とビニルもしくはアルキニル基の間に共有結合を形成することによって生成される表面連結基
を表し;
Yは、直接結合;ヘテロ原子結合;エステル結合;エーテル結合;チオエーテル結合;アミン結合;アミド結合;イミド結合;尿素結合;チオ尿素結合;カルボナート結合;カルバマート結合;複素環結合;トリアゾール結合;ウレタン結合;ジオール結合;ポリオール結合;スチレン、エチレングリコールもしくはプロピレングリコールのオリゴマー;スチレン、エチレングリコールもしくはプロピレングリコールのポリマー;炭水化物基、多分岐型(multi−antennary)炭水化物、デンドリマーもしくはデンドリグラフ(dendrigraph)または双性イオン基を表し;および
Aは、
i.)親水性末端基;
ii.)水素、フルオロ、フルオロアルキル、低級アルキルもしくは基Z;または
iii.)官能化可能な基
を表す。
A.)入口および出口を有するチャンバを画成する少なくとも1つの壁を有するハウジングと、前記チャンバ内に保持されたコアおよび表面組成物を含む固定相材料とを用意する段階であり、
前記固定相材料は、式1:
W−[X]−Q
式1
によって表される、コア組成物と表面組成物とを有する、粒子を含み
式中、
Xは、シリカコア材料、金属酸化物コア材料、有機−無機ハイブリッドコア材料またはこれらのブロックポリマーの一群を含む表面を有するコア組成物であり;
Wは、水素またはヒドロキシルであり;および
Qは、不在であり、または分析物との静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合性相互作用もしくは他の相互作用を最小にする官能基である
段階、
B.)前記チャンバに試料を1,000psiより大きいカラム入口圧で負荷して、固定相媒体を通して試料を流す段階;および
C.)前記試料をサイズによって1つ以上の組成物に分離する段階
を含む。
D.)1つ以上の組成物を単離する段階
をさらに含む。
E.)1つ以上の組成物を検出する段階
をさらに含む。
D.)1つ以上の組成物を単離する段階;および
E.)1つ以上の組成物を検出する段階
をさらに含む。
n1は、0−30の整数であり;
n2は、0−30の整数であり;
R1、R2、R3およびR4の各存在は、水素、フルオロ、低級アルキル、保護もしくは脱保護アルコール、双性イオンまたは基Zを独立して表し;
Zは、
a)固定相材料の表面と式3:
(B1)x(R5)y(R6)zSi−
式3:
(式中、
xは、1−3の整数であり、
yは、0−2の整数であり、
zは、0−2の整数であり、および
x+y+z=3であり、
R5およびR6の各存在は、メチル、エチル、n−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、イソプロピル、テキシル、置換もしくは非置換アリール、環式アルキル、分岐アルキル、低級アルキル、保護もしくは脱保護アルコールまたは双性イオン基を独立して表し;
B1は、−OR7、−NR7’R7’’、−OSO2CF3または−Clを表し、この場合のR7、R7’およびR7’’のそれぞれは、水素、メチル、エチル、n−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、イソプロピル、テキシル、フェニル、分岐アルキルまたは低級アルキルを表す。);
の部分の間での共有もしくは非共有結合の形成により生成される表面連結基;
b)直接炭素−炭素結合形成による、またはヘテロ原子、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、尿素、カルボナート、カルバマート、複素環、トリアゾールもしくはウレタン結合によるXの表面ハイブリッド基への直接的連結;または
c)固定相材料の表面に共有結合で連結されていない吸着基;
d)Wが水素であるとき、反応により固定相材料の表面とビニルもしくはアルキニル基の間に共有結合を形成することによって生成される表面連結基
を表し;
Yは、直接結合;ヘテロ原子結合;エステル結合;エーテル結合;チオエーテル結合;アミン結合;アミド結合;イミド結合;尿素結合;チオ尿素結合;カルボナート結合;カルバマート結合;複素環結合;トリアゾール結合;ウレタン結合;ジオール結合;ポリオール結合;スチレン、エチレングリコールもしくはプロピレングリコールのオリゴマー;スチレン、エチレングリコールもしくはプロピレングリコールのポリマー;炭水化物基、多分岐型炭水化物、デンドリマーもしくはデンドリグラフまたは双性イオン基を表し;および
Aは、
i.)親水性末端基;
ii.)水素、フルオロ、フルオロアルキル、低級アルキルもしくは基Z;または
iii.)官能化可能な基
を表す。
A.)入口および出口を有するチャンバを画成する少なくとも1つの壁を有するハウジングと、前記チャンバ内に保持されたコアおよび表面組成物を含む固定相材料とを用意する段階であり、
前記固定相材料は、式1:
W−[X]−Q
式1
によって表される粒子またはモノリスを含み
式中、
Xは、シリカコア材料、金属酸化物コア材料、有機−無機ハイブリッドコア材料またはこれらのブロックポリマーの一群を含む表面を有するコア組成物であり;
Wは、水素またはヒドロキシルであり;および
Qは、不在であり、または分析物との静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合性相互作用もしくは他の相互作用を最小にする官能基である
段階、
B.)前記チャンバ内の前記固定相材料に試料を1,000psiより大きいカラム入口圧で負荷し、固定相媒体を通して試料を流す段階;
C.)試料をサイズによって1つ以上の組成物に分離する段階;および
D.)光散乱検出器を使用して1つ以上の組成物を検出する段階
を含む。
A.)入口および出口を有するチャンバを画成する少なくとも1つの壁を有するハウジングと、前記チャンバ内に保持されたコアおよび表面組成物を含む固定相材料とを用意する段階であり、
前記固定相材料は、式1:
W−[X]−Q
式1
によって表される粒子またはモノリスを含み
式中、
Xは、シリカコア材料、金属酸化物コア材料、有機−無機ハイブリッドコア材料またはこれらのブロックポリマーの一群を含む表面を有するコア組成物であり;
Wは、水素またはヒドロキシルであり;および
Qは、不在であり、または分析物との静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合性相互作用もしくは他の相互作用を最小にする官能基である
段階、
B.)前記チャンバ内の前記固定相材料に試料を1,000psiより大きいカラム入口圧で負荷し、前記固定相媒体を通して試料を流す段階;
C.)試料をサイズによって1つ以上の組成物に分離する段階;および
D.)光散乱検出器を使用して1つ以上の組成物を検出する段階
を含む。
上で用いたような用語「脂肪族基」は、1個と22個の間の炭素原子を概して有する直鎖または分岐鎖を特徴とする有機化合物を含む。
本発明の装置および方法は、固定相材料を利用する。このような材料は、モノリス、1個以上の粒子、1個以上の球形粒子、または1個以上の薄膜状粒子であり得る。
W−[X]−Q
式1
によって表される、コア組成物と表面組成物とを有する粒子またはモノリスを含み、
式中、
Xは、シリカコア材料、金属酸化物コア材料、有機−無機ハイブリッドコア材料またはこれらのブロックポリマーの一群を含む表面を有するコア組成物であり;
Wは、水素またはヒドロキシルであり;および
Qは、不在であり、または分析物との静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合性相互作用もしくは他の相互作用を最小にする官能基である。
n1は、0−30の整数であり;
n2は、0−30の整数であり;
R1、R2、R3およびR4の各存在は、水素、フルオロ、低級アルキル、保護もしくは脱保護アルコール、双性イオンまたは基Zを独立して表し;
Zは、
a)固定相材料の表面と式3:
(B1)x(R5)y(R6)zSi−
式3:
(式中、
xは、1−3の整数であり、
yは、0−2の整数であり、
zは、0−2の整数であり、および
x+y+z=3であり、
R5およびR6の各存在は、メチル、エチル、n−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、イソプロピル、テキシル、置換もしくは非置換アリール、環式アルキル、分岐アルキル、低級アルキル、保護もしくは脱保護アルコールまたは双性イオン基を独立して表し;
B1は、−OR7、−NR7’R7’’、−OSO2CF3または−Clを表し、この場合のR7、R7’およびR7’’のそれぞれは、水素、メチル、エチル、n−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、イソプロピル、テキシル、フェニル、分岐アルキルまたは低級アルキルを表す。);
の部分の間での共有もしくは非共有結合の形成により生成される表面連結基
b)直接炭素−炭素結合形成による、またはヘテロ原子、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、尿素、カルボナート、カルバマート、複素環、トリアゾールもしくはウレタン結合によるXの表面ハイブリッド基への直接的連結;または
c)固定相材料の表面に共有結合で連結されていない吸着基;
d)Wが水素であるとき、反応により固定相材料の表面とビニルもしくはアルキニル基の間に共有結合を形成することによって生成される表面連結基
を表し;
Yは、直接結合;ヘテロ原子結合;エステル結合;エーテル結合;チオエーテル結合;アミン結合;アミド結合;イミド結合;尿素結合;チオ尿素結合;カルボナート結合;カルバマート結合;複素環結合;トリアゾール結合;ウレタン結合;ジオール結合;ポリオール結合;スチレン、エチレングリコールもしくはプロピレングリコールのオリゴマー;スチレン、エチレングリコールもしくはプロピレングリコールのポリマー;炭水化物基、多分岐型炭水化物、デンドリマーもしくはデンドリグラフまたは双性イオン基を表し;および
Aは、
i.)親水性末端基;
ii.)水素、フルオロ、フルオロアルキル、低級アルキルもしくは基Z;または
iii.)官能化可能な基
を表す。
A.)親水性表面修飾を生じさせる結果となるシラン
本発明の装置の一部の実施形態において、ハウジングは、固定相材料を収容するために1つ以上のフリットを装備している。固定相材料がモノリスである実施形態では、1つ以上のフリットを含めずにハウジングを用いることができる。
もう1つの態様において、本発明は、サイズ排除クロマトグラフィーを行う方法を提供し、この方法は、
A.)入口および出口を有するチャンバを画成する少なくとも1つの壁を有するハウジングと、前記チャンバ内に保持されたコアおよび表面組成物を含む固定相材料とを用意する段階であり、
前記固定相材料は、式1:
W−[X]−Q
式1
によって表される、コア組成物と表面組成物とを有する、粒子を含み
式中、
Xは、シリカコア材料、金属酸化物コア材料、有機−無機ハイブリッドコア材料またはこれらのブロックポリマーの一群を含む表面を有するコア組成物であり;
Wは、水素またはヒドロキシルであり;および
Qは、不在であり、または分析物との静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合性相互作用もしくは他の相互作用を最小にする官能基である
段階、
B.)前記チャンバに試料を1,000psiより大きいカラム入口圧で負荷して、固定相媒体を通して試料を流す段階;および
C.)試料をサイズによって1つ以上の組成物に分離する段階
を含む。
D.)1つ以上の組成物を単離する段階
をさらに含む。
E.)1つ以上の組成物を検出する段階
をさらに含む。
D.)1つ以上の組成物を単離する段階;および
E.)1つ以上の組成物を検出する段階
をさらに含む。
n1は、0−30の整数であり;
n2は、0−30の整数であり;
R1、R2、R3およびR4の各存在は、水素、フルオロ、低級アルキル、保護もしくは脱保護アルコール、双性イオンまたは基Zを独立して表し;
Zは、
a)固定相材料の表面と式3:
(B1)x(R5)y(R6)zSi−
式3:
(式中、
xは、1−3の整数であり、
yは、0−2の整数であり、
zは、0−2の整数であり、および
x+y+z=3であり、
R5およびR6の各存在は、メチル、エチル、n−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、イソプロピル、テキシル、置換もしくは非置換アリール、環式アルキル、分岐アルキル、低級アルキル、保護もしくは脱保護アルコールまたは双性イオン基を独立して表し;
B1は、−OR7、−NR7’R7’’、−OSO2CF3または−Clを表し、この場合のR7、R7’およびR7’’のそれぞれは、水素、メチル、エチル、n−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、イソプロピル、テキシル、フェニル、分岐アルキルまたは低級アルキルを表す。);
の部分の間での共有もしくは非共有結合の形成により生成される表面連結基
b)直接炭素−炭素結合形成による、またはヘテロ原子、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、尿素、カルボナート、カルバマート、複素環、トリアゾールもしくはウレタン結合によるXの表面ハイブリッド基への直接的連結;または
c)固定相材料の表面に共有結合で連結されていない吸着基;
d)Wが水素であるとき、反応により固定相材料の表面とビニルもしくはアルキニル基の間に共有結合を形成することによって生成される表面連結基
を表し;
Yは、直接結合;ヘテロ原子結合;エステル結合;エーテル結合;チオエーテル結合;アミン結合;アミド結合;イミド結合;尿素結合;チオ尿素結合;カルボナート結合;カルバマート結合;複素環結合;トリアゾール結合;ウレタン結合;ジオール結合;ポリオール結合;スチレン、エチレングリコールもしくはプロピレングリコールのオリゴマー;スチレン、エチレングリコールもしくはプロピレングリコールのポリマー;炭水化物基、多分岐型炭水化物、デンドリマーもしくはデンドリグラフまたは双性イオン基を表し;および
Aは、
i.)親水性末端基;
ii.)水素、フルオロ、メチル、エチル、n−ブチル、t−ブチル、i−プロピル、低級アルキルもしくは基Z;または
iii.)官能化可能な基
を表す。
A.)入口および出口を有するチャンバを画成する少なくとも1つの壁を有するハウジングと、前記チャンバ内に保持されたコアおよび表面組成物を含む固定相材料とを用意する段階であり、
前記固定相材料は、式1:
W−[X]−Q
式1
によって表される粒子またはモノリスを含み
式中、
Xは、シリカコア材料、金属酸化物コア材料、有機−無機ハイブリッドコア材料またはこれらのブロックポリマーの一群を含む表面を有するコア組成物であり;
Wは、水素またはヒドロキシルであり;および
Qは、不在であり、または分析物との静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合性相互作用もしくは他の相互作用を最小にする官能基である
段階、
B.)前記チャンバ内の前記固定相材料に試料を1,000psiより大きいカラム入口圧で負荷し、固定相媒体を通して試料を流す段階;
C.)試料をサイズによって1つ以上の組成物に分離する段階;および
D.)光散乱検出器を使用して1つ以上の組成物を検出する段階
を含む。
A.)入口および出口を有するチャンバを画成する少なくとも1つの壁を有するハウジングと、前記チャンバ内に保持されたコアおよび表面組成物を含む固定相材料とを用意する段階であり、
前記固定相材料は、式1:
W−[X]−Q
式1
によって表される粒子またはモノリスを含み
式中、
Xは、シリカコア材料、金属酸化物コア材料、有機−無機ハイブリッドコア材料またはこれらのブロックポリマーの一群を含む表面を有するコア組成物であり;
Wは、水素またはヒドロキシルであり;および
Qは、不在であり、または分析物との静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合性相互作用もしくは他の相互作用を最小にする官能基である
段階、
B.)前記チャンバ内の前記固定相材料に試料を1,000psiより大きいカラム入口圧で負荷し、固定相媒体を通して試料を流す段階;
C.)前記試料をサイズによって1つ以上の組成物に分離する段階;および
D.)光散乱検出器を使用して前記1つ以上の組成物を検出する段階
を含む。
すべての試薬は、別の注記がない限り、受け取ったままで使用した。下記の供給物および供給業者と等価のものが存在することおよび従って下に列挙する供給業者を限定と解釈すべきでないことは、当業者には認識されよう。
下記の計器および供給業者と等価のものが存在することおよび従って下に列挙する計器を限定と解釈すべきでないことは、当業者には認識されよう。
Triton(登録商標)X−100(X100、ミシガン州ミッドランドのDow Chemical)と脱イオン水とエタノール(EtOH;無水、ニュージャージー州フィリップスバーグのJ.T.Baker)の水性混合物を55℃で0.5時間加熱した。別のフラスコの中で、US 6,686,035 B2からの実施例1hに詳述されているとおりに調製したPOSを0.5時間、トルエン(Tol;HPLCグレード;ニュージャージー州フィリップスバーグのJ.T.Baker)と混合することにより、油相溶液を調製した。急速攪拌しながらこの油相溶液をEtOH/水/X100混合物に添加し、ロータ/スタータミキサー(モデル100L、ニューヨーク州ホーポージのCharles Ross & Son Co.)を使用して水性相に乳化させた。その後、このエマルジョンに30%水酸化アンモニウム(NH4OH;ニュージャージー州フィリップスバーグのJ.T.Baker)を添加した。溶液に懸濁させて、ゲル化した生成物をフラスコに移し、55℃で18時間攪拌した。結果として生じた、式{(O1.5SiCH2CH2SiO1.5)(SiO2)4}の球形多孔質ハイブリッド無機/有機粒子を、0.5μm濾紙で回収し、水およびメタノール(HPLCグレード;ニュージャージー州フィリップスバーグのJ.T.Baker)で順次洗浄した。その後、生成物を真空オーブンにおいて80℃で一晩乾燥させた。これらの生成物を調製するために使用した出発原料の具体的な量を表3に列挙する。これらの材料の%C値、非表面積(SSA)、比細孔容積(SPV)および平均細孔直径(APD)を表1に列挙する。このアプローチによって調製した生成物は、SEMにより確認したところ、高球形易流動性粒子であった。
実施例1において調製した生成物の球形態およびSPVは多くの高品質SEC充填材料に匹敵するが、これらの生成物の大部分についてのAPDは、より大きな分子(例えば100−450Å)の分離のために設計された大部分の商用充填材料より小さい。より大きな分子のSECのためにより有用なSEC範囲内でAPDを増加させるために、この実施例ではこれらの材料に対する熱水処理の使用の開発を例証する。
実施例2に従って調製した多孔質粒子を20時間、98℃で1モルの塩酸溶液(ウィスコンシン州ミルウォーキーのAldrich)に分散させた。酸処理が完了した後、粒子を水で洗浄して中性pHにし、その後、アセトン(HPLCグレード;ニュージャージー州フィリップスバーグのJ.T.Baker)で洗浄した。アセトンでの沈降分離により粒子をさらに処理してサブミクロンの微粉を除去した。その後、粒子を80℃、真空下で16時間乾燥させた。これらの材料についての具体的な特性付けデータを表3に列挙する。
実施例2に従って調製した多孔質粒子を、70℃で60分間予混した20mM酢酸緩衝液(pH5.5;酢酸および酢酸ナトリウム、J.T.Bakerを使用した調製したもの)中のグリシドキシプロピルトリメトキシシラン(GLYMO、ウィスコンシン州ミルウォーキーのAldrich)の溶液に、分散させた。この混合物を70℃で20時間保持した。その後、反応物を冷却し、生成物を濾過し、水およびメタノール(J.T.Baker)で順次洗浄した。その後、生成物を80℃、減圧下で16時間乾燥させた。反応データを表4に列挙する。元素分析により測定した表面修飾前と後の粒子%Cの差によって5.72−6.09μmol/m2の表面被覆率を決定した。13C CP−MAS NMR分光法によるこれらの材料の分析は、エポキシ基とジオール基の混合物がこれらの材料には存在することを示す。
実施例2に従って調製した多孔質粒子を、70℃で60分間予混した酢酸緩衝液(20mM、pH5.5、希釈度5mL/g;酢酸および酢酸ナトリウム、J.T.Bakerを使用した調製したもの)中のグリシドキシプロピルトリメトキシシラン(GLYMO、ウィスコンシン州ミルウォーキーのAldrich)の溶液に、分散させた。反応5eには60mM緩衝溶液を使用した。混合物を70℃で20時間保持した。その後、反応物を冷却し、生成物を濾過し、水およびメタノール(J.T.Baker)で順次洗浄した。その後、この材料を0.1M酢酸溶液(希釈度5mL/g;J.T.Baker)中、70℃で20時間、還流させた。生成物5q−5sは2時間、還流させた。その後、反応物を冷却し、生成物を濾過し、水およびメタノール(J.T.Baker)で順次洗浄した。その後、生成物を80℃、減圧下で16時間乾燥させた。反応データを表5に列挙する。元素分析により測定した表面修飾前と後の粒子%Cの差によって0.55−7.05μmol/m2の表面被覆率を決定した。13C CP−MAS NMR分光法によるこれらの材料の分析は、生成物5a−5pには測定可能な量のエポキシ基は存在せず、これらの材料にはジオール基のみが存在したことを示す。生成物5q−5sには少量のエポキシ基が存在した。生成物5q−5sについては酢酸加水分解段階を繰り返し、20時間保持した。これらの反応の生成物は、同等の表面被覆率を有し、および13C CP−MAS NMR分光法により、残存する測定可能な量のエポキシ基を有さなかった。生成物5aには、100mMリン酸緩衝液(pH7.0、希釈度10mL/g)中、70℃で2時間加熱することによるさらなる処理を施した。得られた材料は、生成物5aと同等の表面被覆率を有した。
多孔質シリカまたはハイブリッド粒子をトルエン(175mL、ニュージャージー州フェアローンのFisher Scientific)中で1時間、還流させた。ディーン・スターク・トラップを使用して混合物から微量の水を除去した。冷却したら、イミダゾール(ウィスコンシン州ミルウォーキーのAldrich)および1つ以上の修飾剤を添加した。その後、反応物を16−18時間、加熱して還流させた。その後、反応物を冷却し、生成物を濾過し、トルエン、水およびアセトン(すべてFisher Scientificからの溶剤)で順次洗浄した。この材料をアセトン/0.12M酢酸アンモニウム水溶液(ミズーリ州セントルイスのSigma Chemical Co.)中で2時間さらに還流させた。反応物を冷却し、生成物を水およびアセトン(すべてFisher Scientificからの溶剤)で順次洗浄した。生成物を70℃、減圧下で16時間乾燥させた。元素分析を用いて表面修飾前と後の粒子%Cの差により表面被覆率を決定した。生成物を同様の条件下でトリメチルクロロシラン、トリメチルクロロシラン、トリ−n−ブチルクロロシラン、トリ−i−プロピルクロロシラン、t−ブチルジメチルクロロシランまたはヘキサメチルジシラザンと反応させて、表面シラノール基をさらに反応させた。
実施例5における試験材料5gからの多孔質粒子の試料をタンパク質の混合物の分離に使用した。スラリー充填技術を用いて4.6×150mmクロマトグラフカラムに充填した。クロマトグラフシステムは、AQUITY UPLC(登録商標)SystemおよびAQUITY UPLC(登録商標)Tunable UV検出器から成った。Empower 2 Chromatgraphy Data Software(Build 2154)をデータ収集および分析に使用した。移動相条件は、100mM Na2HPO4/NaH2PO4、pH6.8;流速:0.30mL/分;温度:30℃;検出:280nm;分析物:サイログロブリン、IgG、ウシ血清アルブミン、ミオグロビンおよび尿素であった。結果を図2に示す。
C18修飾表面の含有からの多孔質粒子の試料をポリスチレン標準物質の混合物の分離に使用した。スラリー充填技術を用いて4.6×150mmクロマトグラフカラムに充填した。クロマトグラフシステムは、AQUITY UPLC(登録商標)SystemおよびAQUITY UPLC(登録商標)Tunable UV検出器から成った。Empower 2 Chromatgraphy Data Software(Build 2154)をデータ収集および分析に使用した。移動相はテトラヒドロフランから成った。流速は0.30mL/分であった;温度:30℃;検出260nm;分析物:分子量が500Daから2,000,000Daの範囲にわたるポリスチレン標準物質。
本明細書に記載するクロマトグラフ媒体は、UPLC用途のための1.7マイクロメートル粒子について必要な機械的強度要件を維持することを示した。同様に、BEH粒子に関しての、従来のシリカと比較して低減されたシラノール酸性度は、荷電分析物についての二次的相互作用を減少させる結果となる。
この実施例では、クロマトグラフ分解能に対する粒径、細孔容積および細孔径分布の効果、ならびにSEC性能に対する温度の効果を考察する。モノクローナル抗体単量体の凝集体からの分離を含む、サイズに基づく分離の例を与える。
異なる総細孔容積、平均細孔径、表面積および平均粒径を有する固定相粒子を合成した。低いタンパク質結合を示す安定した化学的表面を生じさせるためにすべての材料にジオールを結合させた。
2マイクロメートル粒子および超高速液体クロマトグラフィー計器装備の導入は、逆相クロマトグラフィーについて従来のHPLC分離と比較してクロマトグラフィー効率および処理量の有意な向上をもたらした。しかし、今日まで、同様の利点はサイズ排除クロマトグラフィーなどの他のクロマトグラフィーモードについて実証されていない。Heldらによる最近の発表は、このような利点は2マイクロメートルより小さい粒子を充填したSEC用カラムでは達成できないと述べている。(D Held,G Reinhold and P Kilz,「U−GPC? Making GPC/SEC Faster」,The Column(April 6,2010)10−14)
表6に示すように、総細孔容積が0.68−1.63cm3/gと様々である材料A−Iを充填したカラムについてタンパク質の保持時間を判定した。log MWに対する保持容積のプロットを材料それぞれについてプロットした(図5)。各曲線の(代表線形領域における)勾配を各カラムについて決定した。図6は、勾配に対する細孔容積のプロットを示す。
モノクローナル抗体単量体と二量体の分解能に対する流速の効果を、プロトタイプ「K」を充填したカラム、4.6×150mmおよび比較カラム「L」、4.6×300mmカラムについて比較した。前のほうのカラム(プロトタイプ「K」充填カラム)のより短いカラム長にもかかわらず、同一の流速で動作したときに2つのカラムについて同等の分解能が見出された。プロトタイプ「K」を充填したカラム内のより小さい粒子は、必要な分解能を依然として達成しながら、より速い流速での動作を可能にすることによって、よりいっそう短い実行時間に備えたものであった。
クロマトグラフ分離に対する温度の影響を式:
ln k=ΔH./RT−ΔS./R+ln(φ)
(式中、ΔH°およびΔS°は、それぞれの標準エンタルピーおよびエントロピーであり、Rはモル気体定数であり、Tは絶対温度であり、ならびにφはカラムの相比である。)によって熱力学的に決定する。
移動相への異なる塩添加物の効果を探査した。保持とピーク形状の両方が塩タイプによる影響を受けることが判明した。
SO4 2−>PO4 2−>OCA−>Cl−>ClO4 −
に従って、図12および13に示す。一般に、ホフマイスター系列に従って保持の減少が観察されたが、塩化ナトリウムは注目に値する例外であった。この場合、保持は他の分析物でより長かった。加えて、ピークが有意に広かった。
ノイズ低減、カラムブリードおよびゴーストピークに対する効果
SECカラムが使用中に粒子を放出することは公知である。MALS検出器は、これらの粒子に対して高感度である。この研究では、「カラムブリード」をベースラインノイズの発生率を増加させる結果となる粒子のランダムな放出と定義する。LCカラムへの注入を行ったときにも粒子放出が発生する場合がある。この結果が、排除マーカーの保持時間で溶出する広い「ゴーストピーク」である。ゴーストピークは、排除ウィンドウ付近で溶出する分析物の定量を妨げる。ゴーストピークの原因は、カラムを通り抜けて検出器に進む粒子のバンドを生じさせる、注入中に発生する圧力衝撃からの結果であると考えられる。カラム製造業者は、カラムブリードおよびゴーストピークを低減するために使用前にカラムを十分に洗浄することを提唱している。
LCシステム:Waters ACQUITY UPLC(登録商標)H−Class Bio
移動相:100mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.8
温度:周囲温度
流速:0.2−0.5mL/分
試料:BSA 3mg/mL
注入容積:10μL
カラム平衡:0.2mL/分で20分
検出器1:Waters ACQUITY PDA、280nm
検出器2:Wyatt miniDAWN(商標)TREOS MALS Detector、入射から90°
MALSデータ収集速度:15Hz
プロトタイプ「K」を有する4.6×150mmカラムを、3つの4.6×300mmカラム(比較カラム「L」、「M」および「N」)と共に試験した。
図15−19は、プロトタイプ「K」を有するカラムならびに比較カラム「L」、「M」および「N」を使用するBSAの分離からのクロマトグラムを示す。図15および16は、0.2および0.5mL/分の流速でそれぞれ実行したときのプロトタイプ「K」での結果を示す。図17、18および19は、0.3mL/分の流速で実行したときの比較カラムL、MおよびNからの結果を示す。これらの図は、UV検出器と光散乱検出器の両方からのトレースを示す。カラムブリードは、ノイズの頻度と大きさの両方によって測定したとき、3つの比較カラムと比較してプロトタイプ「K」カラムでのほうが相当少ないことが判明した。プロトタイプカラム「K」は、比較カラムと比較してRMSノイズのおよびランダムノイズ頻度の5倍を超える低減を示した。
幾つかの要素の機能を、代替実施形態では、より少ない要素によってまたは単一要素によって行うことができる。同様に、一部の実施形態では、任意の機能要素を、例証実施形態に関して説明したものより少ない、または例証実施形態に関して説明したものとは異なる、動作で行うことができる。また、例証のために別個のものとして示した機能要素(モジュール、コンピュータおよびこれらに類するもの)を、他の機能要素内に組み込むことができ、異なるハードウェアに分けることができ、または特定の実装の際に分配することができる。
本明細書に引用したすべての特許、公開特許出願および他の参考文献の全内容は、本宣言により、これら全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。
Claims (55)
- サイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置であって、
入口および出口を有するチャンバを画成する少なくとも1つの壁を有するハウジング、
および
前記チャンバ内に保持されたコアおよび表面組成物を含む固定相材料
を含み、
前記固定相材料が、式1:
W−[X]−Q
式1
(式中、
Xは、シリカコア材料、金属酸化物コア材料、有機−無機ハイブリッドコア材料またはこれらのブロックポリマーの一群を含む表面を有するコア組成物であり;
Wは、水素またはヒドロキシルであり;および
Qは、不在であり、または分析物との静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合性相互作用もしくは他の相互作用を最小にする官能基である。)
によって表される粒子またはモノリスを含むものである、サイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。 - WおよびQが、コア組成物(X)のまたは前記コア組成物の表面の自由原子価を占有する、請求項1に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- WおよびQが、前記コア組成物の表面の表面組成物を形成するために選択され、ならびにXが、ブロックポリマーまたはブロックポリマー群を形成する、請求項1に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- 固定相が粒子を含む、請求項1に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- 固定相材料の粒子が、0.4−3.0マイクロメートルの平均粒径分布を有する直径を有する、請求項4に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- 固定相材料の粒子が、1.0−3.0マイクロメートルの平均粒径分布を有する直径を有する、請求項5に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- 固定相がモノリスを含む、請求項1に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- 固定相材料のモノリスが、0.4−3.0マイクロメートルの平均粒径分布を有する粒子を充填した粒子層のクロマトグラフィー効率および透過率を示す、請求項7に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- 固定相材料のモノリスが、1.0−3.0マイクロメートルの平均粒径分布を有する粒子を充填した粒子層のクロマトグラフィー効率および透過率を示す、請求項8に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- 固定相材料の粒子またはモノリスが0.8から1.7cm3/gの細孔容積を有する、請求項1に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- 固定相材料が1.0から1.5cm3/gの細孔容積を有する、請求項10に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- 固定相材料が、1.1から1.5cm3/gの細孔容積を有する、請求項11に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- チャンバが、1,000psiより大きいカラム入口圧でサイズ排除クロマトグラフィーを行うことができる、請求項1に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- チャンバが、5,000psiより大きいカラム入口圧でサイズ排除クロマトグラフィーを行うことができる、請求項13に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- チャンバが、7,000psiより大きいカラム入口圧でサイズ排除クロマトグラフィーを行うことができる、請求項14に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- チャンバが、10,000psiより大きいカラム入口圧でサイズ排除クロマトグラフィーを行うことができる、請求項15に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- Xが、シリカコア、酸化チタンコア、酸化アルミニウムコア、有機−無機ハイブリッドコア、または脂肪族架橋シランを含む有機−無機ハイブリッドコアである、請求項1に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- Xが、脂肪族架橋シランを含む有機−無機ハイブリッドコアである、請求項17に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- 脂肪族架橋シランの脂肪族基がエチレンである、静有効18に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- Qが親水性基である、請求項1に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- Qが疎水性基である、請求項1に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- Qが不在である、請求項1に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- Qが脂肪族基である、請求項20に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- 前記脂肪族基が脂肪族ジオールである、請求項23に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- Qが、式2
n1は、0−30の整数であり;
n2は、0−30の整数であり;
R1、R2、R3およびR4の各存在は、水素、フルオロ、低級アルキル、保護もしくは脱保護アルコール、双性イオンまたは基Zを独立して表し;
Zは、
a)固定相材料の表面と式3:
(B1)x(R5)y(R6)zSi−
式3:
(式中、
xは、1−3の整数であり、
yは、0−2の整数であり、
zは、0−2の整数であり、
およびx+y+z=3であり、
R5およびR6の各存在は、メチル、エチル、n−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、イソプロピル、テキシル、置換もしくは非置換アリール、環式アルキル、分岐アルキル、低級アルキル、保護もしくは脱保護アルコールまたは双性イオン基を独立して表し;
B1は、−OR7、−NR7’R7’’、−OSO2CF3または−Clを表し、ここでR7、R7’およびR7’’のそれぞれは、水素、メチル、エチル、n−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、イソプロピル、テキシル、フェニル、分岐アルキルまたは低級アルキルを表す。);
の部分の間での共有もしくは非共有結合の形成により生成される表面連結基
b)直接炭素−炭素結合形成による、またはヘテロ原子、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、尿素、カルボナート、カルバマート、複素環、トリアゾールもしくはウレタン結合によるXの表面ハイブリッド基への直接的連結;または
c)固定相材料の表面に共有結合で連結されていない吸着基;
d)Wが水素であるとき、反応により前記固定相材料の表面とビニルもしくはアルキニル基の間に共有結合を形成することによって生成される表面連結基
を表し;
Yは、直接結合;ヘテロ原子結合;エステル結合;エーテル結合;チオエーテル結合;アミン結合;アミド結合;イミド結合;尿素結合;チオ尿素結合;カルボナート結合;カルバマート結合;複素環結合;トリアゾール結合;ウレタン結合;ジオール結合;ポリオール結合;スチレン、エチレングリコールもしくはプロピレングリコールのオリゴマー;スチレン、エチレングリコールもしくはプロピレングリコールのポリマー;炭水化物基、多分岐型(multi−antennary)炭水化物、デンドリマーもしくはデンドリグラフ(dendrigraph)または双性イオン基を表し;および
Aは、
i.)親水性末端基;
ii.)水素、フルオロ、フルオロアルキル、低級アルキルもしくは基Z;または
iii.)官能化可能な基
を表す。)
によって表される、請求項1に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。 - n1が2−18の整数である、請求項25に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- n1が2−6の整数である、請求項26に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- n2が0−18の整数である、請求項25に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- n2が0−6の整数である、請求項28に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- n1が2−18の整数であり、およびn2が0−18の整数である、請求項25に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- n1が2−6の整数であり、およびn2が0−18の整数である、請求項30に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- n1が2−18の整数であり、およびn2が0−6の整数である、請求項25に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- n1が2−6の整数であり、およびn2が0−6の整数である、請求項32に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- Aが、i)親水性末端基を表し、および前記親水性末端基が、保護または脱保護形のアルコール、ジオール、グリシジルエーテル、エポキシ、トリオール、ポリオール、ペンタエリスリトール、ペンタエリスリトールエトキシラート、1,3−ジオキサン−5,5−ジメタノール、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンポリグリコールエーテル、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(プロピレングリコール)、一価、二価もしくは多価炭水化物基、多分岐型炭水化物、デンドリマー含有末梢親水性基、デンドリグラフ含有末梢親水性基、または双性イオン基である、請求項25に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- Aが、ii.)水素、フルオロ、メチル、エチル、n−ブチル、t−ブチル、i−プロピル、低級アルキル、フルオロアルキルまたは基Zを表す、請求項25に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- Aが、iii.)官能化可能な基を表し、および前記官能化可能な基が、保護または脱保護形のアミン、アルコール、シラン、アルケン、チオール、アジドまたはアルキンである、請求項25に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- 前記官能化可能な基が、後続の反応段階において新たな表面基を生じさせることができ、該反応段階が、カップリング、メタセシス、ラジカル付加、ヒドロシリル化、縮合、クリックまたは重合である、請求項36に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- ハウジングが、固定相材料を収容するために1つ以上のフリットを装備している、請求項1に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- ハウジングが、試料注入装置、検出器または両方と流体連通した状態に装置を配置することができる1つ以上の取付具を装備している、請求項1に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。
- サイズ排除クロマトグラフィーを行う方法であって、
A.)入口および出口を有するチャンバを画成する少なくとも1つの壁を有するハウジングと、前記チャンバ内に保持されたコアおよび表面組成物を含む固定相材料とを用意する段階であり、
前記固定相材料は、式1:
W−[X]−Q
式1
(式中、
Xは、シリカコア材料、金属酸化物コア材料、有機−無機ハイブリッドコア材料またはこれらのブロックポリマーの一群を含む表面を有するコア組成物であり;
Wは、水素またはヒドロキシルであり;および
Qは、不在であり、または分析物との静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合性相互作用もしくは他の相互作用を最小にする官能基である。)
によって表される粒子またはモノリスを含む、段階;
B.)前記チャンバ内の前記固定相材料に試料を1,000psiより大きいカラム入口圧で負荷し、および前記固定相媒体を通して前記試料を流す段階;および
C.)試料をサイズによって1つ以上の組成物に分離する段階
を含む方法。 - カラム入口圧が、5,000psiより大きい、請求項40のサイズ排除クロマトグラフィーを行う方法。
- カラム入口圧が、7,000psiより大きい、請求項41のサイズ排除クロマトグラフィーを行う方法。
- 前記カラム入口圧が、10,000psiより大きい、請求項42のサイズ排除クロマトグラフィーを行う方法。
- D.)1つ以上の組成物を単離する段階
をさらに含む、請求項40のサイズ排除クロマトグラフィーを行う方法。 - E.)1つ以上の組成物を検出する段階
をさらに含む、請求項40のサイズ排除クロマトグラフィーを行う方法。 - D.)1つ以上の組成物を単離する段階;および
E.)1つ以上の組成物を検出する段階
をさらに含む、請求項40のサイズ排除クロマトグラフィーを行う方法。 - 試料がバイオポリマーである、請求項40のサイズ排除クロマトグラフィーを行う方法。
- Qが親水性である、請求項47のサイズ排除クロマトグラフィーを行う方法。
- Qが脂肪族基である、請求項48のサイズ排除クロマトグラフィーを行う方法。
- 脂肪族基が脂肪族ジオールである、請求項49のサイズ排除クロマトグラフィーを行う方法。
- Qが、式2
n1は、0−30の整数であり;
n2は、0−30の整数であり;
R1、R2、R3およびR4の各存在は、水素、フルオロ、低級アルキル、保護もしくは脱保護アルコール、双性イオンまたは基Zを独立して表し;
Zは、
a)固定相材料の表面と式3:
(B1)x(R5)y(R6)zSi−
式3:
(式中、
xは、1−3の整数であり、
yは、0−2の整数であり、
zは、0−2の整数であり、
およびx+y+z=3であり、
R5およびR6の各存在は、メチル、エチル、n−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、イソプロピル、テキシル、置換もしくは非置換アリール、環式アルキル、分岐アルキル、低級アルキル、保護もしくは脱保護アルコールまたは双性イオン基を独立して表し;
B1は、−OR7、−NR7’R7’’、−OSO2CF3または−Clを表し、R7、R7’およびR7’’のそれぞれは、水素、メチル、エチル、n−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、イソプロピル、テキシル、フェニル、分岐アルキルまたは低級アルキルを表す。);
の部分の間での共有もしくは非共有結合の形成により生成される表面連結基
b)直接炭素−炭素結合形成による、またはヘテロ原子、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、尿素、カルボナート、カルバマート、複素環、トリアゾールもしくはウレタン結合によるXの表面ハイブリッド基への直接的連結;または
c)固定相材料の表面に共有結合で連結されていない吸着基;
d)Wが水素であるとき、反応により前記固定相材料の表面とビニルもしくはアルキニル基の間に共有結合を形成することによって生成される表面連結基
を表し;
Yは、直接結合;ヘテロ原子結合;エステル結合;エーテル結合;チオエーテル結合;アミン結合;アミド結合;イミド結合;尿素結合;チオ尿素結合;カルボナート結合;カルバマート結合;複素環結合;トリアゾール結合;ウレタン結合;ジオール結合;ポリオール結合;スチレン、エチレングリコールもしくはプロピレングリコールのオリゴマー;スチレン、エチレングリコールもしくはプロピレングリコールのポリマー;炭水化物基、多分岐型(multi−antennary)炭水化物、デンドリマーもしくはデンドリグラフ(dendrigraph)または双性イオン基を表し;および
Aは、
i.)親水性末端基;
ii.)水素、フルオロ、フルオロアルキル、低級アルキルもしくは基Z;または
iii.)官能化可能な基
を表す。)
によって表される、請求項40のサイズ排除クロマトグラフィーを行う方法。 - 試料が合成有機ポリマーである、請求項40のサイズ排除クロマトグラフィーを行う方法。
- Qが疎水性部分である、請求項52のサイズ排除クロマトグラフィーを行う方法。
- サイズ排除クロマトグラフィー排除クロマトグラフィー中に光散乱検出器によって得られるノイズの発生率を低減する方法であって、
A.)入口および出口を有するチャンバを画成する少なくとも1つの壁を有するハウジングと、前記チャンバ内に保持されたコアおよび表面組成物を含む固定相材料とを用意する段階であり、
前記固定相材料は、式1:
W−[X]−Q
式1
(式中、
Xは、シリカコア材料、金属酸化物コア材料、有機−無機ハイブリッドコア材料またはこれらのブロックポリマーの一群を含む表面を有するコア組成物であり;
Wは、水素またはヒドロキシルであり;および
Qは、不在であり、または分析物との静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合性相互作用もしくは他の相互作用を最小にする官能基である。)
によって表される粒子またはモノリスを含む、段階;
B.)前記チャンバ内の前記固定相材料に試料を1,000psiより大きいカラム入口圧で負荷し、および前記固定相媒体を通して前記試料を流す段階;
C.)前記試料をサイズによって1つ以上の組成物に分離する段階;および
D.)光散乱検出器を使用して前記1つ以上の組成物を検出する段階
を含む方法。 - サイズ排除クロマトグラフィー排除クロマトグラフィー中に光散乱検出器によって得られるゴーストピークの発生率を低減する方法であって、
A.)入口および出口を有するチャンバを画成する少なくとも1つの壁を有するハウジングと、前記チャンバ内に保持されたコアおよび表面組成物を含む固定相材料とを用意する段階であり、
前記固定相材料は、式1:
W−[X]−Q
式1
(式中、
Xは、シリカコア材料、金属酸化物コア材料、有機−無機ハイブリッドコア材料またはこれらのブロックポリマーの一群を含む表面を有するコア組成物であり;
Wは、水素またはヒドロキシルであり;および
Qは、不在であり、または分析物との静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合性相互作用もしくは他の相互作用を最小にする官能基である。)
によって表される粒子またはモノリスを含む、段階;
B.)前記チャンバ内の前記固定相材料に試料を1,000psiより大きいカラム入口圧で負荷し、および前記固定相媒体を通して前記試料を流す段階;
C.)前記試料をサイズによって1つ以上の組成物に分離する段階;および
D.)光散乱検出器を使用して前記1つ以上の組成物を検出する段階
を含む方法。
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