JP2017532974A - Apparatus and method for generating and culturing 3D cell aggregates - Google Patents

Apparatus and method for generating and culturing 3D cell aggregates Download PDF

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Abstract

本開示は、細胞を培養するための装置、システム、及び方法に関する。特に、３Ｄ細胞凝集体の生成及び培養のための装置及び方法が提供される。The present disclosure relates to devices, systems, and methods for culturing cells. In particular, devices and methods for the generation and culture of 3D cell aggregates are provided.

Description

関連出願の相互参照Cross-reference of related applications

本出願は、各々の全体がここに参照することによって本願に援用される、２０１４年１０月２９日出願の米国仮特許出願第６２／０７２０１５号、２０１４年１０月２９日出願の同第６２／０７２１０３号、２０１４年１０月２９日出願の同第６２／０７２０８８号、及び、２０１４年１２月１９日出願の同第６２／０９４４７１号の優先権を主張する。   This application is incorporated by reference herein in its entirety for US Provisional Patent Application No. 62/072015, filed Oct. 29, 2014 and 62/2014, filed Oct. 29, 2014, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. No. 072103, No. 62/072088 filed Oct. 29, 2014, and No. 62/094741 filed Dec. 19, 2014.

本開示は、細胞を培養するための装置、システム、及び方法に関する。特に、３Ｄ細胞凝集体の生成及び培養のための装置及び方法が提供される。   The present disclosure relates to devices, systems, and methods for culturing cells. In particular, devices and methods for the generation and culture of 3D cell aggregates are provided.

三次元（３Ｄ）細胞培養は、細胞が、三次元のすべての次元において、増殖及び／又は主として互いに対する相互作用を可能にする、人工的に作り出された環境における細胞の増殖である。３Ｄ細胞培養は、少なくとも、３Ｄ条件がインビボ環境をより正確に具現化するという理由で、２Ｄ（例えば、ペトリ皿上）での細胞の増殖方法に対する改善を示す。   Three-dimensional (3D) cell culture is the growth of cells in an artificially created environment that allows the cells to grow and / or interact primarily with each other in all three dimensions. 3D cell culture exhibits an improvement over the method of growing cells in 2D (eg, on a Petri dish), at least because 3D conditions more accurately embody an in vivo environment.

スフェロイドなどの三次元で培養された細胞は、単層として二次元で培養されたそれらの対応物よりもさらにインビボ様の機能を呈しうる。二次元の細胞培養システムでは、細胞は、それらがその上で培養される基材に付着しうる。しかしながら、スフェロイドなど、細胞が三次元で増殖される場合、細胞は、基材に付着するよりはむしろ、互いに相互作用する。スフェロイドをベースとしたアッセイの問題の１つは、アッセイの結果が、典型的にはスフェロイドの寸法によって変動することである。例えば、システムごとの播種密度及び増殖時間などの変数の変動は、所与のシステム内のシステムごとに又はウェルごとに、アッセイの再現性に影響を及ぼしうる。したがって、別々のウェル内で増殖させたスフェロイド間の一貫性のあるスフェロイド寸法の維持は、課題を提示しうる。   Cells cultured in three dimensions, such as spheroids, may exhibit in vivo-like functions more than their counterparts cultured in two dimensions as a monolayer. In a two-dimensional cell culture system, cells can adhere to the substrate on which they are cultured. However, when cells are grown in three dimensions, such as spheroids, the cells interact with each other rather than adhere to the substrate. One problem with spheroid-based assays is that the results of the assay typically vary with the size of the spheroids. For example, variations in variables such as seeding density and growth time from system to system can affect the reproducibility of the assay from system to system within a given system or from well to well. Thus, maintaining consistent spheroid dimensions between spheroids grown in separate wells can present challenges.

細胞培養装置内で増殖する細胞の密度が増加するにつれて、より大きい容積の細胞培養培地、又は、細胞培養培地のより頻繁な交換が、細胞を維持するために必要とされうる。しかしながら、培地交換の頻度の増加は不便でありうる。加えて、細胞培養培地の容積の増加は、培養される細胞の上の培地の高さの望ましくない増加につながりうる。培地の高さが増加するにつれて、培地を通じた細胞のためのガス交換速度は低下する。   As the density of cells growing in the cell culture device increases, larger volumes of cell culture media or more frequent replacement of cell culture media may be required to maintain the cells. However, increasing the frequency of medium exchange can be inconvenient. In addition, increasing the volume of cell culture medium can lead to an undesirable increase in the height of the medium above the cells being cultured. As the height of the medium increases, the rate of gas exchange for the cells through the medium decreases.

細胞は、波状のバッグ、スピナ及び振とう機においてスフェロイド塊として高密度で増殖されている。しかしながら、このような装置内で増殖させたスフェロイドの寸法は一貫性がなく、このような装置に特有の剪断は、スフェロイドをより小さい塊へと破壊する傾向がある。さらには、このような装置は、顕在需要を満たすのに十分に高い細胞密度を達成することはできないであろう。   Cells are grown in high density as spheroids in wavy bags, spinners and shakers. However, the dimensions of spheroids grown in such devices are inconsistent and the shear inherent in such devices tends to break the spheroids into smaller clumps. Furthermore, such a device would not be able to achieve a sufficiently high cell density to meet the apparent demand.

本開示は、細胞を培養するための装置、システム及び方法に関する。特に、３Ｄ細胞凝集体の生成及び培養のための装置及び方法が提供される。例えば、装置及び方法は、細胞の３Ｄ培養にとって有害な、当技術分野で知られた又は知られていない問題に対処するために提供される。   The present disclosure relates to devices, systems, and methods for culturing cells. In particular, devices and methods for the generation and culture of 3D cell aggregates are provided. For example, devices and methods are provided to address problems known or unknown in the art that are detrimental to 3D culture of cells.

スフェロイドなどの三次元で培養された細胞は、単層として二次元で培養されたそれらの対応物よりも高いインビボ様の機能を示しうる。二次元の細胞培養システムでは、細胞は、それらがその上で培養される基材に付着しうる。しかしながら、スフェロイドなど、細胞が三次元で増殖される場合、細胞は、基材に付着するよりはむしろ、互いに相互作用する。三次元で培養された細胞は、細胞間コミュニケーション及び細胞外基質の発現の観点から、インビボ組織によく似ている。よって、スフェロイドは、細胞の移動、分化、生存、及び増殖の優れたモデルを提供し、したがって、研究、診断、並びに、薬効、薬理、及び毒性を試験するためのより良好なシステムを提供する。   Cells cultured in three dimensions, such as spheroids, may exhibit higher in vivo-like functions than their counterparts cultured in two dimensions as a monolayer. In a two-dimensional cell culture system, cells can adhere to the substrate on which they are cultured. However, when cells are grown in three dimensions, such as spheroids, the cells interact with each other rather than adhere to the substrate. Cells cultured in three dimensions are very similar to in vivo tissues in terms of intercellular communication and extracellular matrix expression. Thus, spheroids provide an excellent model of cell migration, differentiation, survival, and proliferation, thus providing a better system for studying, diagnosing, and testing drug efficacy, pharmacology, and toxicity.

幾つかの実施形態では、マイクロウェル又はウェルのアレイを備えた又は含む基材が提供される。基材は、細胞培養装置又はデバイスの一部を形成しうる。例えば、基材は、マルチウェルプレート、フラスコ、皿、管、多層細胞培養フラスコ、バイオリアクタ、若しくは、細胞又はスフェロイドの増殖を意図した他の研究用容器などの一部を形成しうる。マイクロウェル又はウェル（用語「マイクロウェル」及び「ウェル」は、本開示において同じ意味で用いられる）は、培養におけるスフェロイドの形成を促進する環境を提供するように構造化及び配置される。すなわち、実施形態において、マイクロウェルは、スフェロイドを誘発する幾何学形状を有する。加えて、ウェルは、基材とウェル内に取り込まれた液体又は液滴との間に空気を閉じ込めることなく、ウェルの内外への液体の移動をもたらすように構造化及び配置される。すなわち、実施形態において、マイクロウェルは毛管構造を有する。例えば、細胞がその中で増殖されるウェルは、ウェル内の細胞が互いに会合して球状物を形成するように、細胞に対して非接着性でありうる。スフェロイドは、ウェルの幾何学形状によって課せられた寸法の許容限界まで拡大する。幾つかの実施形態では、ウェルは、ウェルを細胞に対して非接着性にするために超低結合性の材料でコーティングされる。   In some embodiments, a substrate comprising or including a microwell or an array of wells is provided. The substrate can form part of a cell culture apparatus or device. For example, the substrate may form part of a multi-well plate, flask, dish, tube, multilayer cell culture flask, bioreactor, or other research vessel intended for cell or spheroid growth. Microwells or wells (the terms “microwell” and “well” are used interchangeably in this disclosure) are structured and arranged to provide an environment that promotes spheroid formation in culture. That is, in an embodiment, the microwell has a geometry that induces spheroids. In addition, the well is structured and arranged to provide liquid movement in and out of the well without confining air between the substrate and the liquid or droplets entrained in the well. That is, in the embodiment, the microwell has a capillary structure. For example, a well in which cells are grown can be non-adherent to the cells such that the cells in the wells associate with each other to form a spheroid. Spheroids expand to the dimensional tolerances imposed by the well geometry. In some embodiments, the well is coated with an ultra-low binding material to render the well non-adherent to the cells.

幾つかの実施形態では、細胞培養装置は、該装置の設置面積を含むフレームを有しており、該装置の基材は、装置内で培養された細胞がスフェロイドを形成するように構成されている。例えば、装置内の細胞培養基材は、細胞が基材の代わりに互いに会合するように、細胞に対して非接着性である。細胞培養基材はさらに、その幾何学形状によって、ウェル内で増殖した細胞が同様の大きさの細胞凝集体又はスフェロイドを形成可能にする、複数のマイクロウェル（又はウェル）から構成される。スフェロイドは、マイクロウェルの幾何学形状によって課せられた寸法の許容限界まで拡大する。幾つかの実施形態では、ウェルは、該ウェルを細胞に対して非接着性にするために、低結合化処理を有するか、又は、超低結合性の材料でコーティングされる。   In some embodiments, the cell culture device has a frame that includes a footprint of the device, and the substrate of the device is configured such that cells cultured in the device form spheroids. Yes. For example, the cell culture substrate in the device is non-adherent to the cells so that the cells associate with each other instead of the substrate. The cell culture substrate is further composed of a plurality of microwells (or wells) that, by virtue of their geometry, allow cells grown in the wells to form similarly sized cell aggregates or spheroids. Spheroids extend to the dimensional tolerances imposed by the microwell geometry. In some embodiments, the well has a low binding treatment or is coated with an ultra low binding material to render the well non-adherent to the cells.

非接着性の材料の例としては、パーフルオロ化ポリマー、オレフィン、又は同様のポリマー、若しくはそれらの混合物が挙げられる。他の例としては、アガロース、ポリアクリルアミドなどの非イオン性ヒドロゲル、ポリエチレンオキシドなどのポリエーテル及びポリビニルアルコールなどのポリオール、又は同様の材料、若しくはそれらの混合物が挙げられる。例えば、非接着性のウェル、ウェルの幾何学形状（例えば、寸法及び形状）、及び／又は重力の組合せは、ウェル内で培養された細胞を、スフェロイドへと自己組織化するように誘発する。一部のスフェロイドは、単層で増殖させた細胞と比較して、よりインビボ様の応答を示す、分化された細胞機能を維持する。間葉系間質細胞などの他の細胞型は、スフェロイドとして培養された場合、それらの多能性を保持する。   Examples of non-adhesive materials include perfluorinated polymers, olefins, or similar polymers, or mixtures thereof. Other examples include agarose, nonionic hydrogels such as polyacrylamide, polyethers such as polyethylene oxide and polyols such as polyvinyl alcohol, or similar materials, or mixtures thereof. For example, a combination of non-adherent wells, well geometry (eg, size and shape), and / or gravity induces cells cultured in the well to self-assemble into spheroids. Some spheroids maintain differentiated cell functions that exhibit a more in vivo-like response compared to cells grown in monolayers. Other cell types such as mesenchymal stromal cells retain their pluripotency when cultured as spheroids.

幾つかの実施形態では、本明細書に記載のシステム、装置、及び方法は、１つ以上の細胞を含む。幾つかの実施形態では、細胞は冷凍保存される。幾つかの実施形態では、細胞は、三次元培養におけるものである。幾つかのこのような実施形態では、システム、装置、及び方法は、１つ以上のスフェロイドを含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞は、活発に***する。幾つかの実施形態では、システム、装置、及び方法は、培養培地（例えば、栄養素（例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸）、エネルギー（例えば、炭水化物）、必須金属及びミネラル（例えば、カルシウム、マグネシウム、鉄、リン酸塩（phosphates）、硫酸塩（sulphates））、緩衝剤（例えば、リン酸塩、酢酸塩）、ｐＨ変化の指示薬（例えば、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル）、選択剤（例えば、化学薬剤、抗微生物剤）等を含む）を含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の試験化合物（例えば、薬物）が、システム、装置、及び方法に含まれる。   In some embodiments, the systems, devices, and methods described herein include one or more cells. In some embodiments, the cells are stored frozen. In some embodiments, the cells are in three-dimensional culture. In some such embodiments, the systems, devices, and methods include one or more spheroids. In some embodiments, one or more cells divide actively. In some embodiments, the systems, devices, and methods are based on culture media (eg, nutrients (eg, proteins, peptides, amino acids), energy (eg, carbohydrates), essential metals and minerals (eg, calcium, magnesium, iron). , Phosphates, sulfates), buffers (eg, phosphates, acetates), pH change indicators (eg, phenol red, bromocresol purple), selective agents (eg, chemical agents) , Antimicrobial agent) and the like. In some embodiments, one or more test compounds (eg, drugs) are included in the systems, devices, and methods.

多種多様の細胞型が培養されうる。幾つかの実施形態では、スフェロイドは単一の細胞型を含む。幾つかの実施形態では、スフェロイドは２つ以上の細胞型を含む。幾つかの実施形態では、２つ以上のスフェロイドが増殖される場合、各スフェロイドは同じ型のものであるが、他の実施形態では、２つ以上の異なる型のスフェロイドが増殖される。スフェロイド内で増殖した細胞は、天然の細胞又は改変された細胞（例えば、１つ以上の非天然型の遺伝子改変を含む細胞）でありうる。幾つかの実施形態では、細胞は体細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、分化の所望の状態（例えば、多能性（pluripotent、multi-potent）、運命が決定された、不死化した等）にある、幹細胞又は前駆細胞（例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞）である。幾つかの実施形態では、細胞は疾患細胞又は疾患モデル細胞である。例えば、幾つかの実施形態では、スフェロイドは、１つ以上の型のがん細胞又は過剰増殖性の状態へと誘発されうる細胞（例えば、形質転換細胞）を含む。細胞は、任意の所望の組織又は臓器の種類に由来するか、又はそれらから誘導されてよく、副腎、胆嚢（bladder）、血管、骨、骨髄、脳、軟骨、頸部、角膜、子宮内膜、食道、胃腸、免疫システム（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、白血球、マクロファージ、及び樹状細胞）、肝臓、肺、リンパ腺、筋肉（例えば、心筋）、神経、卵巣、膵臓（例えば、膵島細胞）、下垂体、前立腺、腎臓、唾液腺、皮膚、腱、精巣、及び甲状腺が挙げられるが、それらに限られない。幾つかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヤギ、ウマ等）である。   A wide variety of cell types can be cultured. In some embodiments, the spheroid comprises a single cell type. In some embodiments, the spheroid comprises more than one cell type. In some embodiments, when more than one spheroid is grown, each spheroid is of the same type, while in other embodiments, two or more different types of spheroids are grown. Cells grown within the spheroids can be natural cells or modified cells (eg, cells that contain one or more non-natural genetic modifications). In some embodiments, the cell is a somatic cell. In some embodiments, the cells are stem cells or progenitor cells (e.g., pluripotent, multi-potent, fate determined, immortalized, etc.) in a desired state of differentiation (e.g., pluripotent, multi-potent). Embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells). In some embodiments, the cell is a disease cell or a disease model cell. For example, in some embodiments, spheroids include one or more types of cancer cells or cells that can be induced to a hyperproliferative condition (eg, transformed cells). The cells may be derived from or derived from any desired tissue or organ type, adrenal glands, blades, blood vessels, bones, bone marrow, brain, cartilage, cervix, cornea, endometrium , Esophagus, gastrointestinal tract, immune system (eg T lymphocytes, B lymphocytes, leukocytes, macrophages and dendritic cells), liver, lung, lymph gland, muscle (eg myocardium), nerve, ovary, pancreas (eg Pancreatic islet cells), pituitary gland, prostate, kidney, salivary gland, skin, tendon, testis, and thyroid. In some embodiments, the cell is a mammalian cell (eg, human, mouse, rat, rabbit, dog, cat, cow, pig, chicken, goat, horse, etc.).

培養された細胞は、多種多様な研究、診断、薬物のスクリーニング及び試験、治療及び産業上の用途における利用が見出されている。   Cultured cells have found use in a wide variety of research, diagnostics, drug screening and testing, therapeutic and industrial applications.

幾つかの実施形態では、細胞は、タンパク質又はウイルスの産生に用いられる。多数のスフェロイドを並行して培養するシステム、装置、及び方法は、タンパク質の産生にとって特に有効である。三次元培養は、細胞増殖表面積１平方センチメートル当たりの細胞密度の増加、及びタンパク質収量の増加を可能にする。ワクチン生産のための所望のタンパク質又はウイルスは、細胞内で増殖させることができ、所望の用途のために単離又は精製されうる。幾つかの実施形態では、タンパク質は、細胞にとって天然型のタンパク質である。幾つかの実施形態では、タンパク質は、非天然型である。幾つかの実施形態では、タンパク質は、組換え的に発現される。好ましくは、タンパク質は、非天然型プロモータを使用して過剰発現される。タンパク質は、融合タンパク質として発現されてもよい。幾つかの実施形態では、精製又は検出用のタグが、対象とするタンパク質の融合パートナーとして発現されて、その精製及び／又は検出を促進する。幾つかの実施形態では、融合は、精製後の融合パートナーの分離を可能にするための開裂可能なリンカーを伴って発現される。   In some embodiments, the cells are used for the production of proteins or viruses. Systems, devices, and methods for culturing large numbers of spheroids in parallel are particularly effective for protein production. Three-dimensional culture allows for increased cell density per square centimeter of cell growth surface area and increased protein yield. The desired protein or virus for vaccine production can be propagated intracellularly and isolated or purified for the desired use. In some embodiments, the protein is a native protein for the cell. In some embodiments, the protein is non-naturally occurring. In some embodiments, the protein is expressed recombinantly. Preferably, the protein is overexpressed using a non-native promoter. The protein may be expressed as a fusion protein. In some embodiments, a purification or detection tag is expressed as a fusion partner of the protein of interest to facilitate its purification and / or detection. In some embodiments, the fusion is expressed with a cleavable linker to allow separation of the fusion partner after purification.

幾つかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。このようなタンパク質としては、欠乏している又は異常なタンパク質を置換する（例えば、インスリン）、既存経路を増強する（例えば、阻害剤又はアゴニスト）、新規の機能又は活性を提供する、分子又は有機体に干渉する、又は他の化合物又はタンパク質を送達する（例えば、放射性核種、細胞傷害性薬物、エフェクタータンパク質等）、タンパク質及びペプチドが挙げられるが、それらに限られない。幾つかの実施形態では、タンパク質は、任意の種類（例えば、ヒト化、二重特異性、多特異性等）の抗体（例えば、モノクローナル抗体）など、免疫グロブリンである。治療用タンパク質の分類としては、抗体ベースの薬物、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、抗原、血液因子、骨形成タンパク質、改変タンパク質足場、酵素、増殖因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、及び血栓溶解剤が挙げられるが、それらに限られない。治療用タンパク質は、がん、免疫異常、代謝異常、遺伝性遺伝病（inherited genetic disorders）、感染症、及び他の疾患及び状態の予防又は治療に使用されうる。   In some embodiments, the protein is a therapeutic protein. Such proteins include molecules or molecules that replace deficient or abnormal proteins (eg, insulin), enhance existing pathways (eg, inhibitors or agonists), provide new functions or activities. Examples include, but are not limited to, proteins and peptides that interfere with the aircraft or deliver other compounds or proteins (eg, radionuclides, cytotoxic drugs, effector proteins, etc.). In some embodiments, the protein is an immunoglobulin, such as an antibody (eg, a monoclonal antibody) of any type (eg, humanized, bispecific, multispecific, etc.). The classification of therapeutic proteins includes antibody-based drugs, Fc fusion proteins, anticoagulants, antigens, blood factors, bone morphogenetic proteins, modified protein scaffolds, enzymes, growth factors, hormones, interferons, interleukins, and thrombolytic agents However, it is not limited to them. Therapeutic proteins can be used for the prevention or treatment of cancer, immune disorders, metabolic disorders, inherited genetic disorders, infectious diseases, and other diseases and conditions.

幾つかの実施形態では、タンパク質は、診断用タンパク質である。診断用タンパク質としては、抗体、親和性結合パートナー（例えば、レセプタ結合リガンド）、阻害剤、アンタゴニストなどが挙げられるが、それらに限られない。幾つかの実施形態では、診断用タンパク質は、検出用部分（例えば、蛍光部分、発光部分（例えば、ルシフェラーゼ）、比色分析用部分等）であるか、又はそれらを伴って発現される。   In some embodiments, the protein is a diagnostic protein. Diagnostic proteins include, but are not limited to antibodies, affinity binding partners (eg, receptor binding ligands), inhibitors, antagonists, and the like. In some embodiments, the diagnostic protein is or is accompanied by a detection moiety (eg, a fluorescent moiety, a luminescent moiety (eg, luciferase), a colorimetric moiety, etc.).

幾つかの実施形態では、タンパク質は産業用タンパク質である。産業用タンパク質としては、食物成分、産業用酵素、農業用タンパク質、分析用酵素等が挙げられるが、これらに限られない。   In some embodiments, the protein is an industrial protein. Industrial proteins include, but are not limited to, food ingredients, industrial enzymes, agricultural proteins, analytical enzymes and the like.

幾つかの実施形態では、細胞は、創薬、特性付け、有効性試験、及び毒性試験に用いられる。このような試験としては、薬理効果評価、発癌性評価、医療用造影剤特性評価、半減期評価、放射線安全評価、遺伝毒性試験、免疫毒性試験、生殖及び発生試験、薬物相互作用評価、用量評価、吸着性評価、体内動態評価（disposition assessment）、代謝評価、除去研究等が挙げられるが、それらに限られない。特定の細胞型が、特定の試験に用いられうる（例えば、肝毒性には肝細胞、腎毒性には腎臓近位尿細管上皮細胞、血管毒性には血管内皮細胞、神経毒性には神経細胞及びグリア細胞、心毒性には心筋細胞、横紋筋融解には骨格筋細胞等）。処理された細胞は、膜統合性、細胞内代謝物含量、ミトコンドリア機能、リソソーム機能、アポトーシス、遺伝子変異、遺伝子発現の差異などを含むがそれらに限られない、あらゆる所望のパラメータについて評価されうる。   In some embodiments, the cells are used for drug discovery, characterization, efficacy testing, and toxicity testing. Such tests include pharmacological effect evaluation, carcinogenicity evaluation, medical contrast agent characteristic evaluation, half-life evaluation, radiation safety evaluation, genotoxicity test, immunotoxicity test, reproduction and developmental test, drug interaction evaluation, dose evaluation. , Adsorbability assessment, disposition assessment, metabolic assessment, removal studies, etc., but are not limited thereto. Specific cell types can be used for specific tests (eg, hepatocytes for hepatotoxicity, renal proximal tubular epithelial cells for nephrotoxicity, vascular endothelial cells for vascular toxicity, neurons for neurotoxicity and Glial cells, cardiomyocytes for cardiotoxicity, skeletal muscle cells for rhabdomyolysis, etc.). Treated cells can be evaluated for any desired parameter, including but not limited to membrane integrity, intracellular metabolite content, mitochondrial function, lysosomal function, apoptosis, gene mutation, gene expression differences, and the like.

幾つかの実施形態では、細胞培養装置は、より大きいシステムの構成要素である。幾つかの実施形態では、システムは、複数（例えば、２、３、４、５、…、１０、…、２０、…、５０、…、１００、…、１０００等）のこのような細胞培養装置を含んでいる。幾つかの実施形態では、システムは、最適な培養条件（例えば、温度、雰囲気、湿度等）に培養装置を維持するためのインキュベータを備えている。幾つかの実施形態では、システムは、細胞を撮像又は他の方法で解析するための検出器を備えている。このような検出器としては、蛍光光度計、照度計、カメラ、顕微鏡、プレートリーダ（例えば、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社のＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダ；ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社のＶｉｅｗＬｕｘプレートリーダ）、細胞分析器（例えば、ＧＥ社のＩＮセルアナライザー２０００及び２２００；ＴＨＥＲＭＯ社のＣＥＬＬＯＭＩＣＳ ＣＥＬＬＮＳＩＧＨＴハイコンテントスクリーニングプラットフォーム）、及び共焦点結像システム（例えば、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社のＯｐｅｒａＰｈｅｎｉｘハイスループットコンテントスクリーニングシステム；ＧＥ社のＩＮＣＥＬＬ６０００細胞結像システム）が挙げられるが、それらに限られない。幾つかの実施形態では、システムは、培養細胞に、培養培地又は他の成分を供給、再供給、及び循環させるための灌流システム又は他の構成要素を備えている。幾つかの実施形態では、システムは、培養装置の取り扱い、使用、及び／又は解析を自動化するためのロボット構成要素（例えば、ピペット、アーム、プレートムーバー等）を備えている。   In some embodiments, the cell culture device is a component of a larger system. In some embodiments, the system includes a plurality (eg, 2, 3, 4, 5,..., 10,..., 20,..., 50,..., 100,..., 1000, etc.) of such cell culture devices. Is included. In some embodiments, the system includes an incubator for maintaining the culture device at optimal culture conditions (eg, temperature, atmosphere, humidity, etc.). In some embodiments, the system comprises a detector for imaging or otherwise analyzing the cells. Such detectors include fluorometers, luminometers, cameras, microscopes, plate readers (eg, PERKIN ELMER's EnVision plate reader; PERKIN ELMER's ViewLux plate reader), cell analyzers (eg, GE's IN cell analyzers 2000 and 2200; THERMO CELLOMICS CELLNSIGHT high content screening platform), and confocal imaging systems (eg, PERKIN ELMER's OperaPhenix high throughput content screening system; GE INCELL 6000 cell imaging system) However, it is not limited to them. In some embodiments, the system comprises a perfusion system or other component for supplying, resupplying, and circulating culture media or other components to cultured cells. In some embodiments, the system includes robotic components (eg, pipettes, arms, plate movers, etc.) for automating the handling, use, and / or analysis of the culture apparatus.

マイクロウェルフォーマットのマイクロプレート又はマイクロウェルを有する他の容器の取り扱いにおいて、及び、特にマイクロウェルへの液体の添加の際には、水性液体の導入時にマイクロウェルからの空気の完全な排除を確実にすることに配慮すべきである。ウェルを含む容器に液体を添加する際に、空気は、特にウェルが円形の断面を有する場合には、液下で、かつ、ウェル（例えば、マイクロウェル）内に閉じ込められうる。ウェルに加えられる水性液体の表面張力は強力であるため、液滴は球形を保持しやすい。球形液滴は、同様の寸法の円形孔を容易に閉塞することができ、空気を孔（例えば、マイクロウェル）内に閉じ込めてしまう。   Ensure the complete exclusion of air from the microwells when introducing aqueous liquids in handling microplates in microwell format or other containers with microwells, and especially when adding liquids to microwells Should be considered. When adding a liquid to a container containing a well, air can be trapped under the liquid and within the well (eg, a microwell), particularly if the well has a circular cross section. Since the surface tension of the aqueous liquid applied to the well is strong, the droplet tends to retain a spherical shape. Spherical droplets can easily close circular holes of similar dimensions, confining air within the holes (eg, microwells).

幾つかの実施形態では、ウェルの細胞培養特性（例えば、３Ｄ細胞培養における有用性）を維持しつつ、空気がマイクロウェル内に閉じ込められる可能性を低下させるウェルの幾何学形状が、本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、ウェルの幾何学形状（例えば、マイクロウェルの幾何学形状）は、ウェルへの液体の導入の際に、空気の効率的な排除を可能にする。幾つかの実施形態では、ウェルの幾何学形状は、ウェルからの空気の抜けを遮断することなく、ウェル内への液体の流れのための経路を提供する。幾つかの実施形態では、ウェルの幾何学形状は、閉じ込められた空気を逃がすための経路を提供する。幾つかの実施形態では、細胞の凝集のための閉じ込め寸法を維持すると同時に、マイクロウェル内の空気の排除を促進し、かつ、マイクロウェル内への液体の流入を可能にする、さまざまなウェルの幾何学形状が、本明細書に提供される。   In some embodiments, a well geometry that reduces the likelihood that air is trapped within a microwell while maintaining well cell culture properties (eg, usefulness in 3D cell culture) is described herein. Provided in In some embodiments, the well geometry (eg, microwell geometry) allows for efficient exclusion of air upon introduction of liquid into the well. In some embodiments, the well geometry provides a path for the flow of liquid into the well without blocking air escape from the well. In some embodiments, the well geometry provides a path for escape of trapped air. In some embodiments, various wells of various wells that maintain confinement dimensions for cell aggregation while at the same time facilitating the elimination of air in the microwell and allowing the inflow of liquid into the microwell. Geometric shapes are provided herein.

実施形態において、本開示は、例えば、スフェロイド細胞塊又は他の凝集細胞群を、培養及び評価するための装置（例えば、マルチウェルプレート、ペトリ皿、フラスコ、多層フラスコ、又はＨｙｐｅｒＳｔａｃｋ）を提供する。幾つかの実施形態では、装置は、開口部（例えば、開口）、１つ又は複数の側壁、及び、１つ以上のマイクロウェルを有する底面を備えた、少なくとも１つのチャンバ（例えば、ウェル（例えば、マクロウェル）、フラスコ等）を備えている。幾つかの実施形態では、開口部、側壁、及び底部の幾何学形状は、チャンバ内での細胞（例えば、細胞凝集体、スフェロイド等）の３Ｄ培養、並びに、次のうち１つ以上（例えば、すべて）を可能にする：（１）チャンバへの試薬（例えば、液体試薬）の分配の際のチャンバからの空気の排除（例えば、空気が液下又は液体内に閉じ込められることなく）、（２）マイクロウェル内の液体の表面下の空気の閉じ込めの可能性を低下させる、マイクロウェルへの液体の流れのルート、（３）マイクロウェルへの液体の導入の際の空気の抜けのための経路、及び／又は（４）液面下に閉じ込められた空気の抜けのための経路。   In embodiments, the present disclosure provides an apparatus (eg, multiwell plate, petri dish, flask, multi-layer flask, or HyperStack) for culturing and evaluating, for example, spheroid masses or other aggregated cell populations. In some embodiments, an apparatus includes at least one chamber (eg, a well (eg, an opening), one or more sidewalls, and a bottom surface having one or more microwells (eg, a well (eg, a well (eg, an opening)). , Macrowell), flask and the like. In some embodiments, the geometry of the openings, sidewalls, and bottom is a 3D culture of cells (eg, cell aggregates, spheroids, etc.) in the chamber, and one or more of the following (eg, (1) Exclusion of air from the chamber during dispensing of a reagent (eg, liquid reagent) into the chamber (eg, without air being trapped under or in the liquid), (2 A) the flow path of the liquid into the microwell, which reduces the possibility of air confinement under the surface of the liquid in the microwell, and (3) the path for air escape upon introduction of the liquid into the microwell And / or (4) a path for escape of air confined below the liquid level.

幾つかの実施形態では、装置は、ウェル（例えば、マイクロウェル）及び表面が多角形の角度（例えば、９０度の角度）を有しない、１つ以上のウェル（例えば、マイクロウェル）を含む表面を伴って準備される。   In some embodiments, the apparatus includes a well (eg, a microwell) and a surface that includes one or more wells (eg, microwells) where the surface does not have a polygonal angle (eg, 90 degree angle). Prepared with.

幾つかの実施形態では、ウェル（例えばマイクロウェル）は、正弦波に似た断面形状を有する。このような実施形態では、ウェルの底部は丸みを帯び（例えば半球円形）、側壁はウェルの底部から上部へと直径が増大し、ウェル間の境界は丸みを帯びている。このように、ウェルの上部は直角には終結しない。幾つかの実施形態では、ウェルは、底部と上部との間の中間点における直径Ｄ（Ｄ中間ともいわれる）、ウェルの上部における直径Ｄ上部、及び、ウェルの底部から上部までの高さＨを有する。これらの実施形態では、Ｄ上部は、Ｄよりも大きい。ウェルの相対寸法及び絶対寸法は両方とも、所望の培養条件について選択されうる。スフェロイドの増殖では、直径Ｄは、好ましくは、ウェル内で培養される３Ｄ細胞凝集体の所望の直径の１〜３倍である。高さＨは、Ｄの０．７〜１．３倍である。直径Ｄ上部は、Ｄの１．５〜２．５倍である。Ｄは、好ましくは、１００マイクロメートル（μｍ）〜約２０００マイクロメートルである（以下の値のうちのいずれか２つの値の間の範囲（例えば、２００〜１０００μｍ、２００〜７５０μｍ、３００〜７５０μｍ、４００〜６００μｍ等）を含む、例えば、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、又は２０００マイクロメートル）。しかしながら、代替的な相対寸法又は絶対寸法を使用してもよい。例えば、Ｄは、細胞凝集体の所望の直径の１〜１０倍（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９）、若しくは、それらの間の任意の値又は範囲（例えば、１、１〜１．５、１〜２、２、１〜２．５、１〜３、２〜３、１〜５、３〜５、２〜７等）でありうる。Ｄは、１００μｍ〜１０，０００μｍ、若しくは、それらの間の任意の値（例えば、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００）又は範囲（例えば、１００〜２０００、２００〜１０００、３００〜７００、４００〜６００、５００等）でありうる。Ｈは、Ｄの０．５〜１０倍（例えば、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくは、それらの間の任意の値又は範囲）でありうる。Ｄ上部は、Ｄの１．１〜５倍（例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、若しくは、それらの間の任意の値又は範囲）でありうる。 In some embodiments, the well (eg, microwell) has a cross-sectional shape resembling a sine wave. In such an embodiment, the bottom of the well is rounded (eg, hemispherical), the sidewalls increase in diameter from the bottom of the well to the top, and the boundary between the wells is rounded. Thus, the top of the well does not terminate at a right angle. In some embodiments, the well has a diameter D at the midpoint between the bottom and top (also referred to as D middle ), a diameter D top at the top of the well, and a height H from the bottom to the top of the well. Have. In these embodiments, the top D is larger than D. Both the relative and absolute dimensions of the wells can be selected for the desired culture conditions. For spheroid growth, the diameter D is preferably 1 to 3 times the desired diameter of 3D cell aggregates cultured in the well. The height H is 0.7 to 1.3 times D. The upper part of the diameter D is 1.5 to 2.5 times D. D is preferably between 100 micrometers (μm) and about 2000 micrometers (range between any two of the following values (eg, 200-1000 μm, 200-750 μm, 300-750 μm, For example, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, or 2000 micrometers ). However, alternative relative or absolute dimensions may be used. For example, D is 1 to 10 times the desired diameter of the cell aggregate (eg 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9), or any value or range between them (eg 1, 1-1.5, 1-2, 2, 1-2.5, 1-3, 2-3, 1-5, 3-5, 2-7 etc.). D is 100 μm to 10,000 μm, or any value therebetween (for example, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000) or range (for example, 100 to 2000, 200 to 1000, 300 to 700, 400-600, 500, etc.). H is 0.5 to 10 times D (for example, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or any value or range therebetween. The upper part of D is 1.1 to 5 times D (for example, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9). 2, 3, 4, 5, or any value or range between them).

隣接するウェル（例えば、マイクロウェル）間の障壁は、隣接したウェルとは逆の同一形状を有してもよく、より大きい又はより小さい直径ＤＢを有してもよく、あるいは、別の方式で形状が異なっていてもよい（例えば、ウェル底部の形状は、ウェル／障壁上部の形状とは異なっていてもよい、例えば、図２参照）。所与の表面におけるウェルの数を最大化するため、ＤＢは、Ｄ未満であることが好ましい。ＤＢは、Ｄより１．１〜５倍（例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、若しくは、それらの間の任意の値又は範囲）、大きくても小さくてもよい。 Adjacent wells (eg, microwell) barrier between the the adjoining wells may have a reverse of the same shape, it may have a larger or smaller diameter D B, or another method The shape of the well bottom may be different from the shape of the well / barrier top (see, eg, FIG. 2). To maximize the number of wells in a given surface, D B is preferably less than D. D B is 1.1 to 5 times greater than D (e.g., 1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9 2, 3, 4, 5, or any value or range between them), may be larger or smaller.

ある特定の実施形態では、本明細書の細胞培養装置は、ウェル内で培養された細胞が特定の直径のスフェロイドを形成するように各々が構成された、複数のウェルを備えている。細胞培養装置は、複数のウェルを画成する構造を含みうる。幾つかの実施形態では、複数のウェルの各々は、上部開口、ウェル底部、及び上部開口からウェル底部まで延びる側壁表面を画成する。側壁表面は、上部開口とウェル底部との間のペン先領域を画成する。細胞培養容積は、底面、側壁表面の一部、及びペン先領域によって画成される。幾つかの実施形態では、ペン先領域は、５０マイクロメートル〜７００マイクロメートルの範囲（例えば、５０μｍ、７５μｍ、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、６００μｍ、７００μｍ、及びそれらの間の任意の範囲）のウェル底部からの高さにおいて、１００マイクロメートル〜７００マイクロメートルの範囲（例えば、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、６００μｍ、７００μｍ、及びそれらの間の任意の範囲）の直径寸法によって画成される。側壁表面又は細胞培養容積は、各ウェル内で増殖するスフェロイドの寸法を制御するように寸法決めされる。ペン先領域は、スフェロイドを誘発する幾何学形状をしている。   In certain embodiments, the cell culture devices herein comprise a plurality of wells, each configured to form cells of a particular diameter that are cultured in the wells. The cell culture device may include a structure that defines a plurality of wells. In some embodiments, each of the plurality of wells defines a top opening, a well bottom, and a sidewall surface extending from the top opening to the well bottom. The sidewall surface defines a nib area between the top opening and the well bottom. The cell culture volume is defined by the bottom surface, a portion of the sidewall surface, and the nib area. In some embodiments, the nib area ranges from 50 micrometers to 700 micrometers (eg, 50 μm, 75 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, and any range therebetween) ) With a diameter dimension in the range from 100 to 700 micrometers (eg, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, and any range in between) at a height from the well bottom. Made. The sidewall surface or cell culture volume is sized to control the size of the spheroids that grow in each well. The nib region has a geometric shape that induces spheroids.

実施形態は、例えば：細胞の播種又は培地交換の間の気泡の取り込みがないこと、培地交換の間の３Ｄ細胞凝集体の高い保持性、大面積の表面からのスフェロイドの採取の容易性、ガス透過性、複数のウェルの上の培地リザーバ、スフェロイド含有ウェル、及び／又は、大量かつ均一寸法でのスフェロイド生成能を含む、多くの特徴を提供する。   Embodiments include, for example: no cell entrapment during cell seeding or medium change, high retention of 3D cell aggregates during medium change, ease of collection of spheroids from large area surfaces, gas Many features are provided, including permeability, medium reservoirs over multiple wells, spheroid-containing wells, and / or the ability to produce spheroids in large and uniform dimensions.

幾つかの実施形態では、本明細書に記載のウェルは、ウェル内部の上部開口部から延びる、１つ以上の毛管構造（例えば、リッジ、割れ目、角部、鋭角、波形、ピラー等）を備えており、この毛管構造は、上部開口部からウェル底部へ又は上部開口部から口部の底部へと延びてよく、これが、ウェル内への液体の流入の際に空気を逃がすためのルートを提供する。本明細書に記載の実施形態の範囲内の適切なウェルの幾何学形状としては、次のものが挙げられる：（ａ）正方形の断面の上部開口部、丸みを帯びた（例えば、凹形）ウェル底部、及び、ウェルの上部の正方形の断面からウェル底部の円形の断面へと移行する側壁を有するウェル；（ｂ）上部開口部（例えば、円形の断面の上部開口部）からウェル底部（例えば、丸みを帯びた（例えば、凹形）ウェル底部）まで延びる１つ以上の突出するリッジ線を有するウェル（例えば、図１Ｂ参照）；（ｃ）上部開口部（例えば、円形の断面の上部開口部からウェル底部（例えば、丸みを帯びた（例えば、凹形）ウェル底部）まで延びる１つ以上の割れ目を有するウェル（例えば、図２Ｂ参照）；（ｄ）ウェルを完全には取り囲まない、第１及び第２の側壁によって画成される上部と、丸底を有し、側壁が完全にウェルを囲む、ウェルの下部を有する、ウェル（例えば、図２７又は図２８参照）；（ｅ）１つ以上の側壁が凸状断面を有し、それによって、ピラーによって形成されうる、２つの側壁の間に鋭角を生じる、ウェル（例えば、図５参照）。幾つかの実施形態では、ウェルは、上記幾何学形状のバリエーション及び／又は組合せを含む。   In some embodiments, the wells described herein comprise one or more capillary structures (eg, ridges, fissures, corners, acute angles, corrugations, pillars, etc.) extending from the top opening inside the well. The capillary structure may extend from the top opening to the bottom of the well or from the top opening to the bottom of the mouth, which provides a route for air to escape during the inflow of liquid into the well To do. Suitable well geometries within the scope of the embodiments described herein include: (a) a square cross-section top opening, rounded (eg, concave) A well having a well bottom and a sidewall that transitions from a square cross section at the top of the well to a circular cross section at the bottom of the well; (b) from the top opening (eg, the top opening of the circular cross section) to the well bottom (eg, A well having one or more protruding ridge lines extending to a rounded (eg, concave) well bottom) (eg, see FIG. 1B); (c) an upper opening (eg, an upper opening with a circular cross-section) A well (eg, see FIG. 2B) having one or more cracks extending from the well to the well bottom (eg, a rounded (eg, concave) well bottom); (d) a first that does not completely surround the well, 1 and 2 A well (eg, see FIG. 27 or FIG. 28) having an upper portion defined by the wall, a round bottom, and the sidewall completely surrounds the well, the lower portion of the well; (e) one or more sidewalls A well having a convex cross-section, thereby creating an acute angle between two sidewalls that can be formed by pillars (see, eg, FIG. 5.) In some embodiments, the well is of the above geometry Includes variations and / or combinations.

実施形態において、本明細書に記載のウェルを備えた細胞培養装置を製造する方法が本明細書に提供される。   In an embodiment, provided herein is a method of manufacturing a cell culture device comprising a well as described herein.

実施形態において、例えば、スフェロイド細胞培養又は細胞アッセイにおける、本明細書に記載のウェルを備えた細胞培養装置の使用方法が、本明細書に提供される。   In embodiments, provided herein are methods of using a cell culture device with wells as described herein, eg, in a spheroid cell culture or cell assay.

幾つかの実施形態では、その中に配置されたウェルを有するフレームを備えた細胞培養装置が、本明細書に提供され、該ウェルは、（ａ）上部開口部；（ｂ）丸みを帯びた断面形状を有するウェル底部；（ｃ）ウェル底部から上部開口部まで延びる１つ又は複数の側壁；（ｄ）必要に応じて、口部；及び（ｅ）必要に応じて、液体の表面下に持続的な空気溜まりを形成することなく、ウェル内への液体の導入及びウェルからの空気の抜けを促進する毛管構造を備えている。   In some embodiments, provided herein is a cell culture device comprising a frame having a well disposed therein, the well comprising: (a) a top opening; (b) rounded. A well bottom having a cross-sectional shape; (c) one or more sidewalls extending from the well bottom to the top opening; (d) an optional mouth; and (e) an optional liquid below the surface of the liquid. It has a capillary structure that facilitates the introduction of liquid into the well and the escape of air from the well without forming a persistent air pocket.

幾つかの実施形態では、ウェル底部は円形の断面形状を有し、ここで、上部開口部は、多角形の断面形状を有し、側壁は、円形から多角形の断面形状へと移行し、それによって、ウェル内への液体の導入及びウェルからの空気の抜けを促進する毛管構造としての役割をする角部を側壁間に生じる。幾つかの実施形態では、側壁の断面形状の移行は、ウェル内外への流体の流れに障害をもたらさない。幾つかの実施形態では、上部開口部は正方形又は六角形の断面形状を有する。   In some embodiments, the well bottom has a circular cross-sectional shape, wherein the top opening has a polygonal cross-sectional shape, and the sidewall transitions from a circular to a polygonal cross-sectional shape, This creates a corner between the sidewalls that serves as a capillary structure that facilitates the introduction of liquid into the well and the escape of air from the well. In some embodiments, the transition of the cross-sectional shape of the sidewall does not impede fluid flow into and out of the well. In some embodiments, the top opening has a square or hexagonal cross-sectional shape.

幾つかの実施形態では、ウェル内への液体の導入及びウェルからの空気の抜けを促進する構造的特徴は、１つ又は複数の側壁から突出し、ウェル底部から上部開口部まで延びるリッジである。幾つかの実施形態では、ウェルは、１つ又は複数の側壁から突出し、ウェル底部から上部開口部まで延びる、又は略そのような形状の１〜２０のリッジ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０）を備えている。幾つかの実施形態では、ウェル底部は円形の断面形状を有し、上部開口部は円形又は多角形の断面形状を有する。幾つかの実施形態では、リッジは、ウェルの外周の周りに対称的に離間されている。幾つかの実施形態では、リッジは、ウェルの外周の周りに非対称的に離間されている。幾つかの実施形態では、リッジは、上部開口部からウェル底部までの距離全体には及ばない。   In some embodiments, the structural feature that facilitates the introduction of liquid into the well and the escape of air from the well is a ridge that protrudes from one or more sidewalls and extends from the well bottom to the top opening. In some embodiments, the well protrudes from one or more sidewalls and extends from the bottom of the well to the top opening, or generally has such a shape of 1-20 ridges (eg, 1, 2, 3, 4 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20). In some embodiments, the well bottom has a circular cross-sectional shape and the top opening has a circular or polygonal cross-sectional shape. In some embodiments, the ridges are symmetrically spaced around the circumference of the well. In some embodiments, the ridges are asymmetrically spaced around the circumference of the well. In some embodiments, the ridge does not span the entire distance from the top opening to the well bottom.

幾つかの実施形態では、ウェル内への液体の導入及びウェルからの空気の抜けを促進する構造的特徴は、１つ又は複数の側壁内かつウェル底部から上部開口部まで延びる割れ目である。幾つかの実施形態では、ウェルは、１つ又は複数の側壁内かつウェル底部から上部開口部まで延びる１〜２０の割れ目（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０）を備えている。幾つかの実施形態では、ウェル底部は円形の断面形状を有し、上部開口部は円形又は多角形の断面形状を有する。幾つかの実施形態では、割れ目は、ウェルの外周の周りに対称的に離間されている。幾つかの実施形態では、割れ目は、ウェルの外周の周りに非対称的に離間されている。幾つかの実施形態では、割れ目は、上部開口部からウェル底部までの距離全体には及ばない。   In some embodiments, the structural feature that facilitates the introduction of liquid into the well and the escape of air from the well is a fissure that extends in one or more sidewalls and from the well bottom to the top opening. In some embodiments, the well has 1 to 20 cracks (eg, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,...) Extending in one or more sidewalls and from the bottom of the well to the top opening. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20). In some embodiments, the well bottom has a circular cross-sectional shape and the top opening has a circular or polygonal cross-sectional shape. In some embodiments, the splits are symmetrically spaced around the outer periphery of the well. In some embodiments, the cracks are asymmetrically spaced around the outer periphery of the well. In some embodiments, the split does not extend the entire distance from the top opening to the well bottom.

幾つかの実施形態では、ウェルは、３つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０）の隣接するピラーによって画成され、各ピラーの側部の一部は、ウェルの側壁を形成し；ここで、隣接するピラー同士の間の限定空間は、ウェル内への液体の導入及びウェルからの空気の抜けを促進する構造的特徴を形成する。幾つかの実施形態では、ウェル底部は、円形の断面形状を有し、ピラーの下に延びる。   In some embodiments, the well is defined by three or more (eg, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) adjacent pillars, with a portion of the side of each pillar being Forming the sidewalls of the well; where the confined space between adjacent pillars forms a structural feature that facilitates the introduction of liquid into the well and the escape of air from the well. In some embodiments, the well bottom has a circular cross-sectional shape and extends below the pillar.

幾つかの実施形態では、その中に配置された複数のウェルを有するフレームを備えた細胞培養装置が、本明細書に提供され；ここで、ウェルは、少なくとも一列に配置され；該列は、側壁同士の間の間隙が各波形に伴って拡大狭小するように位置合わせされた２つの波形状の側壁によって画成され；各ウェルの上部は、隣接するウェルの上部が流体連通するように、側壁の２つの狭くなった間隙の間の拡大した間隙によって画成され；各ウェルの下部は、波形状の側壁の下に延び、円形のウェル底部を形成する。幾つかの実施形態では、装置は、複数の列のウェルを備えている。   In some embodiments, provided herein is a cell culture device comprising a frame having a plurality of wells disposed therein; wherein the wells are disposed in at least one row; The gap between the sidewalls is defined by two corrugated sidewalls that are aligned to expand and narrow with each corrugation; the top of each well is in fluid communication with the top of the adjacent well Defined by an enlarged gap between two narrowed gaps in the sidewall; the lower portion of each well extends below the corrugated sidewall to form a circular well bottom. In some embodiments, the apparatus comprises a plurality of rows of wells.

幾つかの実施形態では、１つの側壁、複数の側壁、及び／又はウェル底部は、ガス透過性かつ液体非透過性である。すなわち、幾つかの実施形態では、ウェルを形成する基材は、ガス透過性かつ液体非透過性である。   In some embodiments, the side wall, the plurality of side walls, and / or the well bottom is gas permeable and liquid impermeable. That is, in some embodiments, the substrate forming the well is gas permeable and liquid impermeable.

幾つかの実施形態では、１つ又は複数の側壁は不透明であり、ウェル底部は透明である。   In some embodiments, the one or more sidewalls are opaque and the well bottom is transparent.

幾つかの実施形態では、ウェル底部は、凹状のアーチ形表面を含む。   In some embodiments, the well bottom includes a concave arcuate surface.

幾つかの実施形態では、１つの側壁、複数の側壁、及び／又はウェル底部は、低接着性又は非接着性の材料を含む、及び／又は、低接着性又は非接着性の材料でコーティングされる。   In some embodiments, the one sidewall, the plurality of sidewalls, and / or the well bottom includes a low adhesion or non-adhesive material and / or is coated with a low adhesion or non-adhesive material. The

幾つかの実施形態では、細胞培養装置は、８〜約１０，０００のウェル（８、１６、２４、３２、４８、６４、９６、１２８、２５６、３８４、５００、６００、７００、８００、１０００、１５３６、２０００、２４００、３２００、４０００、１００００、又はそれらの中のいずれかの範囲）を備えている。   In some embodiments, the cell culture device has 8 to about 10,000 wells (8, 16, 24, 32, 48, 64, 96, 128, 256, 384, 500, 600, 700, 800, 1000 1536, 2000, 2400, 3200, 4000, 10000, or any range thereof.

幾つかの実施形態では、マイクロウェルパターンを有する表面は、幅広い細胞培養製品に導入される。幾つかの実施形態では、例えば、１２−、２４−、及び６−ウェルプレートにおける、ウェル（例えば、マクロウェル）の底部は、マイクロウェル表面を伴ってパターン化される。幾つかの実施形態では、マイクロウェル表面は、Ｔ２５、Ｔ７５、Ｔ１２５、Ｔ１７５及びＴ２５０フラスコなどの大表面積の細胞培養容器、並びに、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ及びＨＹＰＥＲＳｔａｃｋラインの製品に導入される。幾つかの実施形態では、前記マイクロウェルを多数有する大表面積の容器内での細胞の培養は、細胞療法用途、クローン培養、幹細胞ニッチ、又はニッチ細胞の共培養に適用可能な大量の３Ｄ細胞凝集体を産生する。   In some embodiments, a surface having a microwell pattern is introduced into a wide range of cell culture products. In some embodiments, the bottom of a well (eg, a macrowell) is patterned with a microwell surface, for example, in 12-, 24-, and 6-well plates. In some embodiments, the microwell surface is introduced into large surface area cell culture vessels such as T25, T75, T125, T175 and T250 flasks, as well as products from the CellSTACK and HYPERSTack lines. In some embodiments, culturing the cells in a large surface area container having a large number of microwells comprises a large amount of 3D cell aggregation applicable to cell therapy applications, clonal cultures, stem cell niches, or niche cell co-cultures. Produce a collection.

幾つかの実施形態では、本明細書の細胞培養装置は、主面を画成する底部プレート、リザーバを画成する、底部プレートから延びる１つ以上の側壁、及び、主面に形成された複数のウェルを備えている。各ウェルは、主面と同一平面上にあり、かつリザーバに対して開放された上部開口、及び、主面の下に位置合わせされたウェル底部の底（nadir）を画成する。通常のウェルプレートとは対照的に、本明細書に記載のプレートは、ウェルの表面の上のリザーバを画成し、これが、使用される細胞培養培地の容積の増加を可能にし、よって、頻繁な培地交換をより少なくする。例えば、図２８を参照。   In some embodiments, the cell culture device herein includes a bottom plate defining a major surface, one or more sidewalls extending from the bottom plate defining a reservoir, and a plurality formed on the major surface. With wells. Each well defines a top opening that is flush with the major surface and is open to the reservoir, and a well bottom nadir aligned below the major surface. In contrast to normal well plates, the plates described herein define a reservoir above the surface of the wells, which allows for an increase in the volume of cell culture medium used, and thus frequent Fewer medium changes. See, for example, FIG.

さまざまな実施形態において、１つ以上の細胞培養コンパートメントを有する細胞培養装置が記載される。幾つかの実施形態では、細胞培養コンパートメントは積層される。幾つかの実施形態では、各細胞培養コンパートメントは、複数のガス透過性のウェルを画成する構造化された表面を画成する基材を備えている。幾つかの実施形態では、ウェルは、ガス透過性材料を通じて直接、若しくは、通気孔又は導管空間を介して、のいずれかによって装置の外部とガス連通する。幾つかの実施形態では、少なくとも一部に、ウェルがガス透過性材料から作られたマイクロウェルのアレイを有する基材を有する、細胞培養装置が記載される。したがって、幾つかの実施形態では、装置は、効率的な代謝ガスの交換のために、既存の細胞培養装置では高すぎるであろう、ある高さの細胞培養培地を、培養された細胞上に有しつつ、ウェル内で細胞を培養するために用いられる。細胞は、装置の外部とガス連通するガス透過性のウェル内で培養されることから、ガス交換はウェルを通じて行われ、細胞の上の培地の高さに起因する細胞培養培地を通じたガス交換の不足を克服する。   In various embodiments, a cell culture device having one or more cell culture compartments is described. In some embodiments, the cell culture compartments are stacked. In some embodiments, each cell culture compartment comprises a substrate that defines a structured surface that defines a plurality of gas permeable wells. In some embodiments, the wells are in gas communication with the exterior of the device, either directly through a gas permeable material, or through a vent or conduit space. In some embodiments, a cell culture device is described, at least in part, having a substrate having an array of microwells in which the wells are made from a gas permeable material. Thus, in some embodiments, the device can place a height of cell culture media on the cultured cells that would be too high for existing cell culture devices for efficient metabolic gas exchange. Used to cultivate cells in wells. Since the cells are cultured in gas permeable wells that are in gas communication with the outside of the device, gas exchange takes place through the wells, and gas exchange through the cell culture medium due to the height of the medium above the cells. Overcoming shortages.

ある特定の実施形態では、細胞培養装置は、１つ以上の細胞培養コンパートメントを備えている。幾つかの実施形態では、各細胞培養コンパートメントは内部を有し、第１の主面と、反対側の第２の主面とを有する基材を備えており；第１の主面は、コンパートメントの内部の構造化された表面を画成する。幾つかの実施形態では、構造化された表面は、複数のガス透過性のウェルを画成する。幾つかの実施形態では、ウェルは、装置の外部とガス連通している。   In certain embodiments, the cell culture device comprises one or more cell culture compartments. In some embodiments, each cell culture compartment has an interior and includes a substrate having a first major surface and an opposite second major surface; the first major surface is a compartment. Defines the structured surface inside. In some embodiments, the structured surface defines a plurality of gas permeable wells. In some embodiments, the well is in gas communication with the exterior of the device.

幾つかの実施形態では、本明細書に記載の細胞培養装置に培養培地を充填する工程；及び、スフェロイド形成細胞を培養培地に加える工程を含む、スフェロイドを培養する方法が本明細書に提供される。幾つかの実施形態では、方法は、培地を置換／交換（例えば、毎日、連続的に等）する工程をさらに含む。   In some embodiments, provided herein is a method of culturing spheroids comprising: filling a cell culture device described herein with a culture medium; and adding spheroid-forming cells to the culture medium. The In some embodiments, the method further comprises replacing / changing (eg, daily, continuously, etc.) the medium.

幾つかの実施形態では、スフェロイドの培養のための本明細書に記載の細胞培養装置の使用が本明細書に提供される。   In some embodiments, provided herein is the use of the cell culture device described herein for spheroid culture.

本開示の主題の追加の特徴及び利点は、以下の詳細な説明において記載され、一部にはその説明から当業者に容易に明らかになり又は以下の詳細な説明、特許請求の範囲、並びに添付の図面を含む本明細書に記載される開示の主題を実施することによって認識されよう。   Additional features and advantages of the subject matter of this disclosure will be set forth in the detailed description which follows, and in part will be readily apparent to those skilled in the art from the description or the following detailed description, claims, and appended claims It will be appreciated by implementing the disclosed subject matter described herein, including the drawings of:

前述の概要及び以下の詳細な説明は両方とも、本開示の主題の実施形態を提示するものであり、特許請求の範囲に記載される本開示の主題の性質及び特徴を理解するための概観又は枠組みを提供することが意図されているものと解されたい。添付の図面は、本開示の主題のさらなる理解をもたらすために含まれ、本明細書に取り込まれてその一部を構成する。図面は、本開示の主題のさまざまな実施形態を例証しており、その説明とともに本開示の主題の原理及び動作を説明する役割を果たす。加えて、図面及び説明は単に例証することが意図されており、いかなる方法によっても特許請求の範囲を限定することは意図されていない。   Both the foregoing summary and the following detailed description present embodiments of the subject matter of the present disclosure, and provide an overview or understanding of the nature and features of the subject matter of the present disclosure as set forth in the claims. It should be understood that it is intended to provide a framework. The accompanying drawings are included to provide a further understanding of the subject matter of this disclosure, and are incorporated in and constitute a part of this specification. The drawings illustrate various embodiments of the disclosed subject matter and, together with the description, serve to explain the principles and operations of the disclosed subject matter. In addition, the drawings and descriptions are intended to be illustrative only and are not intended to limit the scope of the claims in any way.

ウェルのアレイ１００の例示的な実施形態の概略図。図１Ａは断面図である。1 is a schematic diagram of an exemplary embodiment of an array of wells 100. FIG. FIG. 1A is a cross-sectional view. ウェルのアレイ１００の例示的な実施形態の概略図。図１Ｂは、図１Ａの線Ｂ−Ｂで切り取ったウェルのアレイの例示的な実施形態の上視図である。1 is a schematic diagram of an exemplary embodiment of an array of wells 100. FIG. FIG. 1B is a top view of an exemplary embodiment of an array of wells taken along line BB of FIG. 1A. ウェルのアレイ１００の別の例示的な実施形態の概略図。図２Ａは断面図である。FIG. 3 is a schematic diagram of another exemplary embodiment of an array of wells 100. FIG. 2A is a cross-sectional view. ウェルのアレイ１００の別の例示的な実施形態の概略図。図２Ｂは、図２Ａの線Ｂ−Ｂで切り取ったウェルのアレイの例示的な実施形態の上視図である。FIG. 3 is a schematic diagram of another exemplary embodiment of an array of wells 100. FIG. 2B is a top view of an exemplary embodiment of an array of wells taken along line BB of FIG. 2A. ウェルのアレイ１００の別の例示的な実施形態の概略図。図３Ａは断面図である。FIG. 3 is a schematic diagram of another exemplary embodiment of an array of wells 100. FIG. 3A is a cross-sectional view. ウェルのアレイ１００の別の例示的な実施形態の概略図。図３Ｂは、図３Ａの線Ｂ−Ｂで切り取ったウェルのアレイの例示的な実施形態の上視図である。FIG. 3 is a schematic diagram of another exemplary embodiment of an array of wells 100. FIG. 3B is a top view of an exemplary embodiment of an array of wells taken along line BB of FIG. 3A. ウェルのアレイ１００の別の例示的な実施形態の概略図。図３Ｃは、正弦波又は放物面の形状を有するウェルのアレイの図である。FIG. 3 is a schematic diagram of another exemplary embodiment of an array of wells 100. FIG. 3C is a diagram of an array of wells having a sinusoidal or parabolic shape. ウェルのアレイ１００の別の例示的な実施形態の概略図。図３Ｄは、ある実施形態における、スフェロイドを含むウェルのアレイの側面図である。FIG. 3 is a schematic diagram of another exemplary embodiment of an array of wells 100. FIG. 3D is a side view of an array of wells containing spheroids in an embodiment. 波形状の実施形態における、スフェロイド含有細胞培養コンパートメント又はウェルのアレイの別の例示的な実施形態を示す概略図。図４Ａは、ウェルのアレイを有する基材の波形状の実施形態の上視図である。FIG. 3 is a schematic diagram illustrating another exemplary embodiment of an array of spheroid-containing cell culture compartments or wells in a wavy embodiment. FIG. 4A is a top view of a corrugated embodiment of a substrate having an array of wells. 波形状の実施形態における、スフェロイド含有細胞培養コンパートメント又はウェルのアレイの別の例示的な実施形態を示す概略図。図４Ｂは、同じ実施形態の部分切り取り図である。FIG. 3 is a schematic diagram illustrating another exemplary embodiment of an array of spheroid-containing cell culture compartments or wells in a wavy embodiment. FIG. 4B is a partial cutaway view of the same embodiment. 波形状の実施形態における、スフェロイド含有細胞培養コンパートメント又はウェルのアレイの別の例示的な実施形態を示す概略図。図４Ｃは、ウェルのアレイを有する基材の波形状の実施形態の上視図である。FIG. 3 is a schematic diagram illustrating another exemplary embodiment of an array of spheroid-containing cell culture compartments or wells in a wavy embodiment. FIG. 4C is a top view of a corrugated embodiment of a substrate having an array of wells. 波形状の実施形態における、スフェロイド含有細胞培養コンパートメント又はウェルのアレイの別の例示的な実施形態を示す概略図。４Ｄは、同じ実施形態の部分切り取り図である。FIG. 3 is a schematic diagram illustrating another exemplary embodiment of an array of spheroid-containing cell culture compartments or wells in a wavy embodiment. 4D is a partial cutaway view of the same embodiment. 一連のピラーがウェルを画成する、追加の例示的な実施形態の概略図。図５Ａは上視図である。FIG. 6 is a schematic diagram of an additional exemplary embodiment in which a series of pillars define a well. FIG. 5A is a top view. 一連のピラーがウェルを画成する、追加の例示的な実施形態の概略図。図５Ｂは上視図である。FIG. 6 is a schematic diagram of an additional exemplary embodiment in which a series of pillars define a well. FIG. 5B is a top view. 一連のピラーがウェルを画成する、追加の例示的な実施形態の概略図。図５Ｃは、例示的な実施形態の部分的な切り取り斜視図である。FIG. 6 is a schematic diagram of an additional exemplary embodiment in which a series of pillars define a well. FIG. 5C is a partial cutaway perspective view of an exemplary embodiment. 一連のピラーがウェルを画成する、追加の例示的な実施形態の概略図。図５Ｄは、例示的な実施形態の部分的な切り取り斜視図である。FIG. 6 is a schematic diagram of an additional exemplary embodiment in which a series of pillars define a well. FIG. 5D is a partial cutaway perspective view of an exemplary embodiment. 一連のピラーがウェルを画成する、追加の例示的な実施形態の概略図。図５Ｅは、例示的な実施形態の部分的な切り取り斜視図である。FIG. 6 is a schematic diagram of an additional exemplary embodiment in which a series of pillars define a well. FIG. 5E is a partial cutaway perspective view of an exemplary embodiment. 側壁から突出するリッジの断面形状の例示的かつ非限定的な例Illustrative and non-limiting example of the cross-sectional shape of a ridge protruding from a sidewall 側壁から突出するリッジの断面形状の例示的かつ非限定的な例Illustrative and non-limiting example of the cross-sectional shape of a ridge protruding from a sidewall 側壁から突出するリッジの断面形状の例示的かつ非限定的な例Illustrative and non-limiting example of the cross-sectional shape of a ridge protruding from a sidewall 側壁から突出するリッジの断面形状の例示的かつ非限定的な例Illustrative and non-limiting example of the cross-sectional shape of a ridge protruding from a sidewall 側壁から突出するリッジの断面形状の例示的かつ非限定的な例Illustrative and non-limiting example of the cross-sectional shape of a ridge protruding from a sidewall 側壁内の割れ目の断面形状の例示的かつ非限定的な例Illustrative and non-limiting example of the cross-sectional shape of the crack in the sidewall 側壁内の割れ目の断面形状の例示的かつ非限定的な例Illustrative and non-limiting example of the cross-sectional shape of the crack in the sidewall 側壁内の割れ目の断面形状の例示的かつ非限定的な例Illustrative and non-limiting example of the cross-sectional shape of the crack in the sidewall 側壁内の割れ目の断面形状の例示的かつ非限定的な例Illustrative and non-limiting example of the cross-sectional shape of the crack in the sidewall 側壁内の割れ目の断面形状の例示的かつ非限定的な例Illustrative and non-limiting example of the cross-sectional shape of the crack in the sidewall マイクロウェルのアレイでマイクロパターン化された底面を有する培養フラスコCulture flask having a micropatterned bottom with an array of microwells 図８に示されるフラスコの底面を形成する、マイクロウェルのアレイでマイクロパターン化された基材の拡大図Enlarged view of a substrate micropatterned with an array of microwells forming the bottom of the flask shown in FIG. 図８に示されるマイクロパターン化されたＴ２５スフェロイド形成フラスコのマイクロウェルの内部のＨＴ２９細胞のスフェロイドHT29 cell spheroids inside the microwells of the micropatterned T25 spheroid-forming flask shown in FIG. マイクロパターン化されたＴ２５スフェロイド形成フラスコから採取されたスフェロイドSpheroids collected from micropatterned T25 spheroid-forming flasks Ｎｕｎｃ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社から市販されるＮＵＮＣＬＯＮ ＳＰＨＥＲＡ（商標）低結合表面上に形成された、ヒトＥＳＣ細胞のスフェロイド又は３Ｄ凝集体の顕微鏡写真Micrograph of spheroids or 3D aggregates of human ESC cells formed on NUNCLON SPHERA ™ low binding surface commercially available from Nunc / ThermoFisher Ｎｕｎｃ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社から市販されるＮＵＮＣＬＯＮ ＳＰＨＥＲＡ（商標）低結合表面上に形成された、マウスＥＳＣ細胞のスフェロイド又は３Ｄ凝集体の顕微鏡写真Photomicrograph of spheroids or 3D aggregates of mouse ESC cells formed on NUNCLON SPHERA ™ low binding surface commercially available from Nunc / ThermoFisher 実施形態に従ったマルチウェルアレイを有する基材の作製方法を示す図The figure which shows the preparation methods of the base material which has a multiwell array according to embodiment. 異なる底部厚さを有するマイクロウェルにおける、マイクロウェルのアレイを有する基材（実施例１に記載されるような）を有する６ウェルプレート内で細胞を増殖後に測定した生細胞カウント数を示すグラフGraph showing live cell counts measured after growing cells in 6-well plates with substrates with arrays of microwells (as described in Example 1) in microwells with different bottom thicknesses 平坦な表面に対し、マイクロウェルのアレイを有する基材についての生細胞カウント数を比較したグラフGraph comparing live cell counts for a substrate with an array of microwells against a flat surface 平坦な表面に対し、マイクロウェルのアレイを有する基材についての細胞増殖率を比較したグラフGraph comparing cell growth rates for substrates with an array of microwells against a flat surface 平坦な表面に対し、マイクロウェルのアレイを有する基材上で培養されたＭＨ６７７細胞から排出されたタンパク質の全力価を示すグラフGraph showing total titer of protein excreted from MH677 cells cultured on a substrate with an array of microwells against a flat surface 構造化された表面の実施形態の画像An image of an embodiment of a structured surface 構造化された表面の実施形態のウェル内で増殖した細胞の写真Photograph of cells grown in a well of a structured surface embodiment 多孔膜支持体を含む細胞培養装置の実施形態を示す側面図Side view showing an embodiment of a cell culture device including a porous membrane support 多孔膜支持体を含む細胞培養装置の追加的な実施形態を示す側面図Side view showing an additional embodiment of a cell culture device comprising a porous membrane support 細胞の共培養を示す、多孔膜支持体を含む細胞培養装置の追加的な実施形態を示す側面図Side view showing an additional embodiment of a cell culture device comprising a porous membrane support, showing cell co-culture 細胞培養装置の実施形態の概略的な斜視図Schematic perspective view of an embodiment of a cell culture device 細胞培養装置の実施形態の概略的な断面図Schematic cross-sectional view of an embodiment of a cell culture device 細胞培養装置の実施形態の概略的な断面図Schematic cross-sectional view of an embodiment of a cell culture device 図２１〜２３のいずれかに示される装置の一部を形成するために利用可能なトレイの実施形態の概略的な底面図Schematic bottom view of an embodiment of a tray that can be used to form part of the apparatus shown in any of FIGS. 図２４Ａに示されるトレイの実施形態の概略的な斜視図24A is a schematic perspective view of the embodiment of the tray shown in FIG. 24A. 細胞培養装置の実施形態の概略的な側面図Schematic side view of an embodiment of a cell culture device ウェルを有する細胞培養装置の実施形態の斜視図A perspective view of an embodiment of a cell culture device having a well 複数のウェルの実施形態の概略的な断面図Schematic cross-sectional view of an embodiment of multiple wells 複数のウェルの実施形態の概略的な断面図Schematic cross-sectional view of an embodiment of multiple wells 複数のウェルの実施形態の拡大した概略的な断面図Enlarged schematic cross-sectional view of a multi-well embodiment プレート及びウェルを有する細胞培養装置の実施形態の概略的な斜視図Schematic perspective view of an embodiment of a cell culture device having a plate and a well プレート及びウェルを有する細胞培養装置の実施形態の概略的な斜視図Schematic perspective view of an embodiment of a cell culture device having a plate and a well 細胞培養装置及びメッシュを備えたインサートの実施形態の概略的な斜視図Schematic perspective view of an embodiment of an insert with a cell culture device and a mesh 入口及び出口を有する装置の実施形態の概略的な斜視図Schematic perspective view of an embodiment of an apparatus having an inlet and an outlet ＣＨＯ５／９アルファ細胞における、９６ウェルスフェロイドマイクロウェルプレートでの１ｃｍ２あたりのタンパク質の産生を示すグラフGraph showing protein production per cm 2 in 96 well spheroid microwell plates in CHO5 / 9 alpha cells ＢＨＫ−２１ ｐｃ．ＤＮＡ３−１ＨＣ細胞における、９６ウェルスフェロイドマイクロウェルプレートでの１ｃｍ２あたりのタンパク質の産生を示すグラフBHK-21 pc. Graph showing protein production per cm 2 in a 96-well spheroid microwell plate in DNA3-1HC cells

本開示のさまざまな実施形態は、図面を参照して詳細に説明される。さまざまな実施形態への言及は、本発明の範囲を限定するものではない。加えて、本明細書に記載される例は、限定するものではなく、単に、特許請求の範囲に記載される発明の多くの可能な実施形態の幾つかを記載するに過ぎない。図面内で用いられる同様の番号は、同様の要素、工程などを示している。しかしながら、所与の図面中の要素について言及するためのある番号の使用は、同じ番号が付された別の図におけるその要素を限定することは意図されていないことが理解されよう。加えて、要素について言及するための異なる番号の使用は、その異なる番号が付された要素が、他の番号が付された要素と同一又は同様でありえないことを示すことは意図されていない。   Various embodiments of the present disclosure are described in detail with reference to the drawings. Reference to various embodiments does not limit the scope of the invention. In addition, the examples described herein are not limiting and merely describe some of the many possible embodiments of the claimed invention. Like numbers used in the drawings indicate like elements, steps, and the like. It will be understood, however, that the use of a number to refer to an element in a given drawing is not intended to limit that element in another figure with the same number. In addition, the use of different numbers to refer to elements is not intended to indicate that the different numbered elements may not be the same or similar to other numbered elements.

本明細書で用いられるすべての科学及び技術用語は、他に明記されない限り、当技術分野で通常用いられる意味を有する。本明細書に提供される定義は、本明細書において頻繁に用いられるある特定の用語の理解を容易にするためのものであって、本開示の範囲を限定することは意図されていない。   All scientific and technical terms used herein have meanings commonly used in the art unless otherwise specified. The definitions provided herein are for ease of understanding certain terms frequently used herein and are not intended to limit the scope of the present disclosure.

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の装置並びにこのような装置の製造及び使用方法は、例えば以下に論じられるものを含む、１つ以上の有利な特徴又は態様を提供する。特許請求の範囲に列挙される特徴又は態様は、概して、本発明のすべての態様に適用可能である。任意の１つの請求項における任意の記述された単一又は複数の特徴又は態様は、任意の他の請求項における任意の他の記述された特徴又は態様と組み合わせる、又は、それらの特徴又は態様で置き換えることができる。   In certain embodiments, the devices described herein and methods of making and using such devices provide one or more advantageous features or aspects, including, for example, those discussed below. The features or aspects recited in the claims are generally applicable to all aspects of the invention. Any described single or multiple feature or aspect in any one claim may be combined with or in any other described feature or aspect in any other claim Can be replaced.

「含む（Include, includes）」などの用語は、すなわち、包含的であって排他的ではないことを含むが、それらに限られないことを意味する。   Terms such as “include, includes” mean, including but not limited to, inclusive and not exclusive.

本開示の実施形態の説明に用いられる、例えば、組成物中の成分の量、濃度、容積、処理温度、処理時間、収量、流量、圧力、粘度等の値及びそれらの範囲、又は、構成要素の寸法等の値及びそれらの範囲を修飾する「約」とは、例えば：材料、組成物、複合体、濃縮物、構成部品、製造物品、又は使用配合物（use formulations）の調製に用いられる典型的な測定及び取り扱い手順を通じて；これらの手順における不注意による誤りを通じて；製造、供給源、又は、方法の実施に用いられる出発材料又は原料の純度における差異を通じて；などによって生じうる数量の変動のことを指す。用語「約」はまた、特定の初期濃度を有する組成物又は配合物若しくは混合物の劣化に起因して異なる量、及び、特定の初期濃度を有する組成物又は配合物若しくは混合物の混合又は加工に起因して異なる量も包含する。   For example, the amount, concentration, volume, processing temperature, processing time, yield, flow rate, pressure, viscosity, etc. of components in the composition and ranges thereof, or components used in the description of the embodiments of the present disclosure “About” that modifies values such as dimensions and ranges thereof is used, for example, in the preparation of: materials, compositions, composites, concentrates, components, manufactured articles, or use formulations. Through typical measurement and handling procedures; through inadvertent errors in these procedures; through differences in the purity of the starting materials or raw materials used in the manufacture, source, or performance of the method; Refers to that. The term “about” can also be attributed to different amounts due to deterioration of a composition or formulation or mixture having a particular initial concentration, and mixing or processing of a composition or formulation or mixture having a particular initial concentration. And different amounts are also included.

「随意的な」又は「必要に応じて」は、その後に記載される工程、特徴、状態、特性、又は構造が、記載される範囲内にありつつも、生じる／存在する、又は、生じない／存在しないことを意味する。   “Optional” or “as required” means that a process, feature, condition, property, or structure described thereafter occurs / exists or does not occur, even though it is within the stated range. / Means not present.

語句「好ましい」及び「好ましくは」は、ある特定の状況下において、ある特定の利益を提供しうる本開示の実施形態を指す。しかしながら、同一又は他の状況下において、他の実施形態が好ましい場合もありうる。さらには、１つ以上の好ましい実施形態についての記述は、他の実施形態が有用ではないという意味を含蓄せず、本発明に係る技術の範囲から他の実施形態を除外することは意図されていない。   The phrases “preferred” and “preferably” refer to embodiments of the present disclosure that may provide certain benefits under certain circumstances. However, other embodiments may be preferred under the same or other circumstances. Furthermore, the description of one or more preferred embodiments does not imply that other embodiments are not useful, and is not intended to exclude other embodiments from the scope of the technology according to the present invention. Absent.

本明細書に記載の装置、その作製方法、及びその使用方法は、本明細書に記載の構成要素又は工程に加えて、本明細書に記載されない他の構成要素又は工程も含みうる。   In addition to the components or steps described herein, the devices described herein, methods of making, and methods of use thereof can also include other components or steps not described herein.

本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられる場合、用語「又は」は、別段の明確な指示がない限り、概して、「及び／又は」を含む意味で用いられる。用語「及び／又は」は、列挙された要素の１つ又はすべて、若しくは、列挙された要素の任意の２つ以上の組合せを意味する。   As used herein and in the appended claims, the term “or” is generally employed in its sense including “and / or” unless the content clearly dictates otherwise. The term “and / or” means one or all of the listed elements or a combination of any two or more of the listed elements.

本明細書で用いられる場合には、「有する（have、has、having）」、「含む（include、includes、including、comprise、comprises、comprising）」などは、非限定的な（open ended）包含的意味で用いられ、概して、「〜を含むが、それらに限られない（include, but not limited to; includes, but not limited to; including, but not limited to）」ことを意味する。   As used herein, “have, has, having”, “include”, “include”, “comprise”, “comprises”, “comprising”, and the like are open ended inclusive. Used in the sense, generally means “include, but not limited to; includes, but not limited to; including, but not limited to”.

範囲は、本明細書では、「約」１つの特定の値から、及び／又は、「約」別の特定の値までとして表されうる。このような範囲が表される場合、例には、その１つの特定の値から、及び／又は、他の特定の値までが含まれる。同様に、値が、先行詞「約」を用いて近似値として表される場合、その特定の値は別の態様を形成すると解される。範囲の各々の端点は、他の端点に関連して、及び、他の端点とは無関係に、の両方の意味を表すこともさらに理解されよう。   Ranges may be expressed herein as from “about” one particular value and / or to “about” another particular value. When such a range is expressed, examples include from that one particular value and / or to the other particular value. Similarly, when a value is expressed as an approximation using the antecedent “about,” that particular value is understood to form another aspect. It will be further understood that each endpoint of the range represents both meaning in relation to and independent of the other endpoint.

本明細書で用いられる名詞は、他に明記されない限り、少なくとも１つ、又は１つ以上の対象を指す。   As used herein, a noun refers to at least one, or one or more subjects, unless otherwise specified.

当業者によく知られている略語が、使用されうる（例えば、時間についての「ｈ」又は「ｈｒｓ」、グラムについての「ｇ」又は「ｇｍ」、ミリリットルについての「ｍＬ」、及び、室温についての「ｒｔ」、ナノメートルについての「ｎｍ」など）。   Abbreviations well known to those skilled in the art can be used (eg, “h” or “hrs” for time, “g” or “gm” for grams, “mL” for milliliters, and room temperature) "Rt", "nm" for nanometers, etc.).

構成要素、成分、添加剤、寸法、状態、及び同様の態様についての特定の値及び好ましい値、並びにそれらの範囲は、単に例証のためであって；それらは、他に記載されない限り、他の定められた値又は定められた範囲内の他の値を除外しない。本開示の装置及び方法は、明示又は黙示の中間値及びそれらの間の範囲を含む、本明細書に記載される任意の値又は、その値、特定の値、さらに特定の値、及び好ましい値の任意の組合せを含む。   Specific values and preferred values for components, ingredients, additives, dimensions, conditions, and similar aspects, and ranges thereof, are for illustration only; they are other, unless otherwise stated. Do not exclude defined values or other values within defined ranges. The apparatus and method of the present disclosure may be any value described herein, including specified or implied intermediate values and ranges in between, or values thereof, specific values, specific values, and preferred values. Including any combination of

同様に本明細書において、端点による数値範囲の記述は、その範囲内に含まれるすべての数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等を含む）。値の範囲が、ある特定の値「より大きい」、ある特定の値「より小さい」等の場合、その数値はその範囲内に含まれる。   Similarly, in this specification, the recitation of numerical ranges by endpoints includes all numbers subsumed within that range (eg 1 to 5 is 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3,. 80, 4, 5, etc.). When a value range is a certain value “greater than”, a certain value “less than”, or the like, the numerical value is included in the range.

「上部」、「底部」、「左」、「右」、「上方」、「下方」、「上」、「下」、及び他の方向及び方向付けなど、本明細書において言及される方向は、図面に関して明確性の目的で本明細書に記載され、実際の装置又はシステム、若しくは、その装置又はシステムの使用を限定するものではない。本明細書に記載される多くの装置、物品、又はシステムは、多くの方向及び方向付けにおいて使用されうる。細胞培養装置に関して本明細書で用いられる方向記述子は、多くの場合、装置内で細胞を培養する目的でその装置が方向付けされる場合の方向のことを指す。   The directions referred to herein, such as “top”, “bottom”, “left”, “right”, “upper”, “lower”, “upper”, “lower”, and other directions and orientations are It is described herein for purposes of clarity in connection with the drawings and is not intended to limit the actual apparatus or system or use of the apparatus or system. Many devices, articles, or systems described herein can be used in many directions and orientations. The direction descriptor used herein with respect to a cell culture device often refers to the direction in which the device is oriented for the purpose of culturing cells within the device.

他に明記されない限り、本明細書に記載されるいかなる方法も決して、その工程が特定の順番で実施されることを要すると解釈されることを意図していない。したがって、方法の請求項が、その工程が従うべき順番について実際に記述していない場合、又は工程がある特定の順番に限定されるべきであることが、特許請求の範囲又は説明において他に明示されていない場合、任意の特定の順番が推測されることは、決して意図されていない。任意の１つの請求項における任意の記述された単一又は複数の特徴又は態様は、任意の他の請求項における任意の他の記述された特徴又は態様と組み合わせる、又は、それらの特徴又は態様で置き換えることができる。   Unless otherwise specified, any method described herein is not intended to be construed as requiring that the steps be performed in a particular order. Therefore, it is explicitly stated in the claims or the description that a method claim does not actually describe the order in which the steps are to be followed or that the steps should be limited to a certain order. If not, it is never intended that any particular order be inferred. Any described single or multiple feature or aspect in any one claim may be combined with or in any other described feature or aspect in any other claim Can be replaced.

本明細書における記述とは、特定の方法において機能するように「構成」又は「適合」された構成要素を指すことにも留意されたい。この点において、このような記述が、意図される用途の記述とは対照的に、構造的な記述である場合、このような構成要素は、特定の態様における特定の特性又は機能を具体化するように「構成」又は「適合」される。より詳細には、本明細書において、ある構成要素が「構成」又は「適合」された態様についての言及は、その構成要素の存在する物理的条件を意味し、このように、その構成要素の構造的な特徴の明確な記述と捉えられるべきである。   It should also be noted that the description herein refers to components that are “configured” or “adapted” to function in a particular manner. In this regard, where such a description is a structural description, as opposed to a description of an intended use, such component embodies a particular property or function in a particular aspect. As “configured” or “adapted”. More specifically, in this specification, reference to an aspect in which a component is “configured” or “adapted” means the physical condition in which the component exists, and thus, It should be taken as a clear description of the structural features.

特定の実施形態のさまざまな特徴、要素、又は工程は、移行句「〜を含む」を用いて開示されうるが、移行句「〜からなる」又は「〜から本質的になる」を使用して記載されうるものを含む代替的な実施形態が含蓄されるものと解されたい。よって、例えば、複数のウェルを画成する構造を含む細胞培養装置に含蓄された代替的な実施形態は、細胞培養装置が複数のウェルを画成する構造からなる実施形態、及び、細胞培養装置が複数のウェルを画成する構造から本質的になる実施形態を含む。   Various features, elements or steps of a particular embodiment may be disclosed using the transitional phrase “comprising”, but using the transitional phrase “consisting of” or “consisting essentially of”. It should be understood that alternative embodiments are included, including what may be described. Thus, for example, an alternative embodiment stored in a cell culture device that includes a structure that defines a plurality of wells includes an embodiment in which the cell culture device has a structure that defines a plurality of wells, and a cell culture device Includes an embodiment consisting essentially of a structure defining a plurality of wells.

さまざまな実施形態において、本開示は、ウェル（例えば、マイクロウェル）を画成する基材を備えた、細胞培養装置などの装置について記載する。ウェルは、１つの側壁（又は複数の側壁）、ウェル底部（又は底）、及び開放された上部（例えば、上部開口）を備えている。実施形態において、ウェルは、例えば、細胞培養又は細胞アッセイに用いられる組成物などの水性液体組成物を含むように構成される。例えば、水性液体組成物は、細胞アッセイに用いられる細胞培養培地、バッファ又は他の溶液又は混合物を含みうる。   In various embodiments, the present disclosure describes a device, such as a cell culture device, that includes a substrate that defines a well (eg, a microwell). The well has one sidewall (or multiple sidewalls), a well bottom (or bottom), and an open top (eg, top opening). In embodiments, the well is configured to contain an aqueous liquid composition, such as, for example, a composition used in cell culture or cell assays. For example, an aqueous liquid composition can include cell culture media, buffers or other solutions or mixtures used in cell assays.

本明細書に記載の実施形態は、例えば、液体を含むように構成された小さい（例えば、マイクロスケール）ウェル又は他の容器、若しくはチャンバを備えた、任意の装置を用いる用途を見出す。特定の実施形態では、本明細書に記載の装置のウェルは、細胞の培養における用途を見出す。より詳細には、装置及びその内部のマイクロウェルは、細胞凝集体又はスフェロイドの３Ｄ細胞培養における用途を見出す。   Embodiments described herein find use with any device, including, for example, small (eg, microscale) wells or other containers or chambers configured to contain a liquid. In certain embodiments, the wells of the devices described herein find use in cell culture. More specifically, the device and the microwells within it find use in 3D cell culture of cell aggregates or spheroids.

凝集体としての細胞の培養に使用されている幾つかの異なる形状が存在する。幾つかの実施形態では、細胞凝集体は、細胞の塊、胚様体、又はスフェロイドである。細胞凝集体を形成するための一般的な幾何学形状は、丸みを帯びたウェル底部のマイクロプレート上に見られる半球である。幾つかの実施形態では、細胞が表面に付着するのを防ぐために、非接着性表面が用いられる。非接着性の材料は、ウェル又はチャンバ（例えば、マイクロプレート内）が製造された後に施されてもよく、あるいは、ウェル又はチャンバ材料は、生来の非付着特性を有していてもよい。   There are several different shapes that have been used for culturing cells as aggregates. In some embodiments, the cell aggregate is a cell mass, embryoid body, or spheroid. A common geometry for forming cell aggregates is the hemisphere found on a rounded well bottom microplate. In some embodiments, a non-adhesive surface is used to prevent cells from attaching to the surface. The non-adhesive material may be applied after the well or chamber (eg, in the microplate) is manufactured, or the well or chamber material may have native non-adhesive properties.

図１は、個々のウェル１１５を示す、ウェルのアレイ１００の例示的な実施形態の概略図である。図１に示される実施形態では、ウェル１１５は口部１１０を有する。口部１１０は、ウェルが縮小されて、細胞が沈降してスフェロイドを形成する、ウェルの底部を形成する前に、より大きい開放領域をもたらす、ウェル１１５の上部開口部１１１に隣接したウェルの上部の領域である。実施形態において、口部１１０は、円錐状（口部の底部より口部の上部の方が幅広い）及び環形状（ウェルが円形である図１Ａ及び図２Ａに示されるように）でありうる。追加の実施形態では、例えば、図３Ａに示されるように、ウェルが、円形の開口部を有するが、放物面の形状である場合、口部１１０は放物面でありうるか、又は図２７及び図２８に示されるように、口部は各ウェル１１５内へと延びうる。実施形態において、口部は存在しない。口部構造の存在は、２つの機能をもたらしうる。第一に、口部はウェルの開口部を拡大し、液体がウェルの開口部内に導入されて、ウェルの底部へと流れ落ちることを可能にする。これは、ウェルの底部における細胞の凝集を促進し、かつ、培養におけるスフェロイドの形成を促進する。加えて、口部は、口部の環状の内面からウェルの内面への移行を作り出し、それによって、ウェル内への空気の閉じ込めを防ぐことができる幾何学形状の特徴を提供する。ウェルの上部とウェルの側壁との間の９０度の角度の存在は、気泡の形成のための場所を提供しうる。口部は、９０度の角度ではない、ウェルの上部と側壁との間の移行をもたらし、それによって、口部構造を有するウェル内における気泡の形成を低減する。   FIG. 1 is a schematic diagram of an exemplary embodiment of an array of wells 100 showing individual wells 115. In the embodiment shown in FIG. 1, the well 115 has a mouth 110. The mouth 110 is the top of the well adjacent to the top opening 111 of the well 115 that provides a larger open area before forming the bottom of the well where the well shrinks and the cells settle to form spheroids. It is an area. In embodiments, the mouth 110 can be conical (wider at the top of the mouth than at the bottom of the mouth) and ring-shaped (as shown in FIGS. 1A and 2A where the well is circular). In additional embodiments, for example, as shown in FIG. 3A, if the well has a circular opening but is in the shape of a paraboloid, the mouth 110 can be paraboloid, or FIG. And the mouth can extend into each well 115, as shown in FIG. In an embodiment, there is no mouth. The presence of the mouth structure can provide two functions. First, the mouth enlarges the well opening and allows liquid to be introduced into the well opening and flow down to the bottom of the well. This promotes cell aggregation at the bottom of the well and promotes spheroid formation in culture. In addition, the mouth provides a geometric feature that can create a transition from the annular inner surface of the mouth to the inner surface of the well, thereby preventing air trapping within the well. The presence of a 90 degree angle between the top of the well and the side wall of the well can provide a place for bubble formation. The mouth provides a transition between the top of the well and the sidewall that is not at a 90 degree angle, thereby reducing bubble formation in the well with the mouth structure.

凝集体細胞培養法における使用のためのウェルの寸法は、おおよそマイクロメートル〜ミリメートル（例えば、１００μｍ〜５０ｍｍ）でありうる。細胞培養のためのウェルを備えた装置は、多くのさまざまな製造業者（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｎｕｎｃ、Ｇｒｅｉｎｅｒ等）から市販されている。「マイクロウェル」は、概して、約マイクロメートル（例えば、≦１ｍｍ、≦５００μｍ、≦４００μｍ、≦２００μｍ）又は数ミリメートル（例えば、≦１０ｍｍ、≦５ｍｍ、≦３ｍｍ等）の寸法を有し、凝集体としての細胞の増殖にも使用されうるウェルである。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、３Ｄ細胞培養のための閉じ込めを提供する。本明細書の適切な実施形態では、用語「ウェル」は、文脈がそうでないことを説明又は示唆している場合（例えば、ウェルが複数のマイクロウェルを備えたウェル底部を有すると記載される場合）を除き、マイクロウェルの使用を包含する。マイクロウェル寸法以外であることが意図されたウェルは、「マクロウェル」又は単に「ウェル」と称されうる。幾つかの実施形態では、ウェルの高さ又はウェルの深さ（例えば、上部開口からウェル底部まで）は、上部開口におけるウェルの直径の１００％以上（例えば、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３２５％、３５０％、３７５％、４００％、又はそれらの間の任意の範囲）である。幾つかの実施形態では、ウェルの深さ（例えば、上部開口からウェル底部まで）は、上部開口とウェル底部との間の中間点におけるウェルの直径の１００％以上（例えば、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３２５％、３５０％、３７５％、４００％、又はそれらの間の任意の範囲）である。   Well dimensions for use in aggregate cell culture methods can be approximately from micrometer to millimeter (eg, 100 μm to 50 mm). Devices with wells for cell culture are commercially available from many different manufacturers (eg, Corning, Nunc, Greiner, etc.). “Microwells” generally have dimensions of about micrometers (eg, ≦ 1 mm, ≦ 500 μm, ≦ 400 μm, ≦ 200 μm) or several millimeters (eg, ≦ 10 mm, ≦ 5 mm, ≦ 3 mm, etc.) Wells that can also be used for cell growth. In some embodiments, the microwell provides confinement for 3D cell culture. In suitable embodiments herein, the term “well” describes or suggests that the context is not (eg, if the well is described as having a well bottom with a plurality of microwells. ), Including the use of microwells. Wells intended to be other than microwell dimensions may be referred to as “macrowells” or simply “wells”. In some embodiments, the well height or well depth (eg, from the top opening to the well bottom) is 100% or more (eg, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, or those Any range between). In some embodiments, the well depth (eg, from the top opening to the well bottom) is greater than or equal to 100% (eg, 100%, 110%) of the well diameter at the midpoint between the top opening and the well bottom. 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400 %, Or any range in between).

最も一般的に用いられるマイクロウェル製品の１つは、標準フォーマットのマイクロプレートウェルの底部に配列された、直径４００又は８００マイクロメートルの逆ピラミッド型の形状の幾何学形状を提示する、市販の「Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ」プレート（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から市販される）である。細胞を凝集体として増殖させるための別の幾何学形状は、「微細空間細胞培養」を用いた「Ｅｌｐｌａｓｉａ」マイクロプレート（Ｋｕｒａｒａｙ社）である；これらのプレートは、細胞を凝集可能にする、標準フォーマットのマイクロプレートウェルの底部に配列された直径２００マイクロメートルの正方形のマイクロウェルを有する。細胞を凝集体として培養するためのマイクロウェルを作製するためのさまざまなパラメータ、寸法、及び方法は、当技術分野で理解されている（参照することによってそれらの全体が本明細書に取り込まれる、米国特許出願公開第２００４／０１２５２６６号；米国特許出願公開第２０１２／００６４６２７号；米国特許出願公開第２０１４／０２２７７８４号；国際公開第２００８／１０６７７１号；国際公開第２０１４／１６５２７３号）。米国特許第６，３４８，９９９号には、微細な凹凸要素、及びそれらがどのように構築されるかについて、ポリマーレンズアレイとして以外のこれらの構築物の目的について言及することなく記載されている。米国特許第５，１５１，３６６号、同第５，２７２，０８４号、及び同第６，３０６，６４６号の各明細書には、基材上の細胞付着のための表面積を増加させるためにさまざまな種類の微細な凹凸パターンを有する容器、及び、培養パターンの作製方法について記載されているが、そのパターン自体は、細胞凝集体の形成を促進しないであろう。他の装置、組成物、試薬及び方法は、当技術分野において、例えば、参照することによってそれらの全体が本明細書に取り込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０３２２８０６号；米国特許第８，９０６，６８５号明細書；Haycock. Methods Mol Biol. 2011; 695: 1-15；米国特許出願公開第２０１４／０２２１２２５号明細書；国際公開第２０１４／１６５２７３号；米国特許出願公開第２００９／００１８０３３号明細書に記載されている。   One of the most commonly used microwell products is the commercially available “ Aggrewell "plates (commercially available from Stem Cell technologies). Another geometry for growing cells as aggregates is the “Elplaceia” microplate (“Kuraray”) with “fine space cell culture”; these plates allow the cells to aggregate, a standard It has square microwells with a diameter of 200 micrometers arranged at the bottom of the format microplate wells. Various parameters, dimensions, and methods for making microwells for culturing cells as aggregates are understood in the art (the entirety of which is incorporated herein by reference, U.S. Patent Application Publication No. 2004/0125266; U.S. Patent Application Publication No. 2012/0064627; U.S. Patent Application Publication No. 2014/0227784; International Publication No. 2008/107771; International Publication No. 2014/165273). US Pat. No. 6,348,999 describes the fine relief elements and how they are constructed without mentioning the purpose of these constructs other than as a polymer lens array. U.S. Pat. Nos. 5,151,366, 5,272,084, and 6,306,646 include a method for increasing the surface area for cell attachment on a substrate. Although various types of containers having fine concavo-convex patterns and methods for making culture patterns have been described, the patterns themselves will not promote the formation of cell aggregates. Other devices, compositions, reagents and methods are known in the art, eg, US Patent Application Publication No. 2014/0322806, which is incorporated herein by reference in its entirety. Haycock. Methods Mol Biol. 2011; 695: 1-15; U.S. Patent Application Publication No. 2014/0221225; International Publication No. 2014/165273; U.S. Patent Application Publication No. 2009/0018033. It is described in the book.

幾つかの市販されるウェルの幾何学形状は、細胞凝集体の形成を促進するが、必ずしも「閉じ込め」を促進しない。凝集体化された細胞が閉じ込められない場合、それらは、通常、それらの環境が許す限り大きく成長する。直径１５０超〜４００マイクロメートル（細胞型に応じて決まる）の細胞凝集体は、壊死性のコアを形成しうる。壊死は、例えば、細胞塊が大きすぎて、凝集体の中心への栄養素の拡散及び凝集体の中心の外への代謝廃棄物の排出が制限されることから生じる。幾つかの実施形態では、閉じ込めを生じさせるために、細胞凝集体の所望される最大直径寸法に非常に似ている（例えば、５０％以内、４０％以内、３０％以内、２０％以内、１５％以内、１０％以内、５％以内、２％以内、１％以内、又はそれらの中の適切な範囲内）が、深さが直径の少なくとも１．５〜２倍（例えば、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５２．６、２．６、２．８、３．０、３．５、４．０、又はそれらの中の適切な範囲内）である、マイクロウェルの幾何学形状が用いられる。幾つかの実施形態では、閉じ込めウェルの幾何学形状はまた、該閉じ込めウェルの外に細胞スフェロイドを持ち上げることなく、灌流又は手動のピペット操作を通じた液体培養培地の交換も可能にする。   Some commercially available well geometries promote the formation of cell aggregates, but not necessarily “confinement”. If aggregated cells are not confined, they usually grow as large as their environment allows. Cell aggregates with diameters greater than 150 to 400 micrometers (depending on cell type) can form a necrotic core. Necrosis occurs, for example, because the cell mass is too large, limiting the diffusion of nutrients to the center of the aggregate and the excretion of metabolic waste out of the center of the aggregate. In some embodiments, to produce confinement, it is very similar to the desired maximum diameter dimension of the cell aggregate (eg, within 50%, within 40%, within 30%, within 20%, 15 Within 10%, within 5%, within 2%, within 1%, or within an appropriate range thereof, at least 1.5 to 2 times the diameter in diameter (eg, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.52.6, 2.6, 2.8, Microwell geometries are used that are within 3.0, 3.5, 4.0, or any suitable range therein. In some embodiments, the confinement well geometry also allows liquid culture medium exchange through perfusion or manual pipetting without lifting cell spheroids out of the confinement well.

既存の装置（例えば、マイクロウェルフォーマットのマイクロプレート又はマイクロウェルを有する他の容器）は、３Ｄ細胞凝集構造の形成のためのこのような装置の使用に悪影響を及ぼす、設計上の欠陥を示す。マイクロウェルフォーマットのマイクロプレートの取り扱いは、かなり簡単ではあるが、液体（例えば、培地）の導入の際にマイクロウェルから空気が排除されないと、多くの場合、問題が生じる。空気の取り込みは、特にウェルが円形の場合における、３８４−ウェルフォーマットの大きさの幾何学形状を有するマイクロプレートウェルにおける一般的な問題である。水性液体の表面張力は強力であるため、液滴は球状のまま保たれる。球状の液滴は、同様の寸法の円形孔（例えば、ウェル断面形状）を塞ぐことができる。ウェル内の空気の存在は、そのウェル内の細胞の培養に悪影響を及ぼす、及び／又は、細胞の培養を抑制する。   Existing devices (eg, microplates in microwell format or other containers with microwells) exhibit design defects that adversely affect the use of such devices for the formation of 3D cell aggregate structures. Although handling microplates in a microwell format is fairly straightforward, problems often arise when air is not excluded from the microwells upon introduction of a liquid (eg, media). Air uptake is a common problem in microplate wells having a 384-well format size geometry, especially when the wells are circular. Since the surface tension of the aqueous liquid is strong, the droplets remain spherical. Spherical droplets can block circular holes of similar dimensions (eg, well cross-sectional shape). The presence of air in a well adversely affects the culture of cells in that well and / or inhibits the culture of cells.

非接着性の表面を有するスフェロイド形成ウェルのアレイを有する基材上に高密度で細胞培養容器内のスフェロイドを増殖させるためには、多くの変数の平衡を保つ培養表面が必要とされる。例えば、達成可能な最大スフェロイド密度、流体交換作業の間のスフェロイドの位置を維持すると同時に所望される場合にはそれらを取り出すことを可能にする能力、及び、容器が充填されるときにスフェロイド形成ウェル内の空気の取り込みの回避などのバランスをとることができる設計は、このような容器を扱う際の問題を避けるためには非常に望ましい。本明細書の実施形態は、閉じ込め寸法を維持するとともに、マイクロウェル内の空気の排除を助け、かつ、マイクロウェル内への液体の流入を可能にするウェルの幾何学形状を提供することによって、従来のウェルの空気の取り込みの問題に対処する。例えば、丸みを帯びたウェル底部の幾何学形状を有する、正方形の上部ウェルは、空気が水性液滴の周りのウェルの角部を伝って上ることができるため、液体を加えるときに空気を取り込む可能性がかなり低い。幾つかの実施形態では、ウェルの開口部からウェル底部まで延びるさまざまな構造（例えば、ピラー、波形、角部、リッジ、割れ目等）を包含することにより、ウェルに液体を導入する際に空気を逃がすための経路がもたらされる。幾つかの実施形態は、本明細書に記載の特徴に加えて、当技術分野に記載される及び／又は当技術分野で理解される幾何学形状、材料等も含む。   In order to grow spheroids in cell culture vessels at high density on a substrate having an array of spheroid-forming wells with non-adherent surfaces, a culture surface that balances many variables is required. For example, the maximum achievable spheroid density, the ability to maintain the position of the spheroids during the fluid exchange operation and at the same time allow them to be removed, and the spheroid formation well when the container is filled A design that can be balanced, such as avoiding internal air entrapment, is highly desirable to avoid problems when handling such containers. Embodiments herein provide well geometries that maintain confinement dimensions, assist in evacuating air in the microwells, and allow liquid to flow into the microwells. Address the problem of conventional well air uptake. For example, a square top well, with a rounded well bottom geometry, takes air in as liquid is added because air can travel up the corner of the well around an aqueous droplet The possibility is quite low. In some embodiments, including various structures (eg, pillars, corrugations, corners, ridges, crevices, etc.) extending from the well opening to the well bottom, air is introduced when introducing liquid into the well. A route is provided for escape. Some embodiments include, in addition to the features described herein, geometries, materials, etc. that are described in the art and / or understood in the art.

高密度スフェロイド増殖基材における空気の取り込みの問題を回避するために、一般的に用いられている設計特徴の１つは、鋭角の角部又は基材の幾何学形状の階段状の変化の回避、特に、表面を横切る液体の流路に対して直角に走るものの回避である。例えば、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌプレートは、９０度に近い角度で傾斜する壁を有する。これは、空気で満たされたウェルを残して容器が満たされる際に、表面からの液切りを促進する。   To avoid air entrapment problems in high density spheroid growth substrates, one of the commonly used design features is avoidance of stepped changes in sharp corners or substrate geometry. In particular, avoidance of running at right angles to the flow path of liquid across the surface. For example, AggreWell plates have walls that are inclined at an angle close to 90 degrees. This facilitates drainage from the surface as the container is filled, leaving wells filled with air.

個別のスフェロイドの増殖及び高密度の維持を促進するウェル特徴（例えば、丸みを帯びたウェル底部）を維持する、液体の導入の間の空気の取り込みの問題に対処する表面幾何学形状が、本明細書に提供される。   A surface geometry that addresses the problem of air uptake during liquid introduction, maintaining well features that promote the growth and maintenance of high density of individual spheroids (eg, rounded well bottom) is Provided in the description.

幾つかの実施形態では、ウェル形状の移行は、ウェルに液体を導入する際に空気を逃がす問題を軽減するために用いられる。例えば、幾つかの実施形態では、円形断面のウェル底部（又はウェルの底部部分）がスフェロイド形成に用いられる。しかしながら、円形の断面は、ポケットの形成なしに空気を逃がすためには特に問題でありうる。この問題を軽減するため、円形のウェル底部断面及び非円形（例えば、三角形、正方形、矩形、五角形、六角形等）の上部開口部を有するウェルが形成される。このような実施形態では、側壁は、非円形（例えば、多角形）の上部開口部から円形のウェル底部へと移行する。幾つかの実施形態では、移行は、ウェルに液体を導入する際に、ウェルから逃げる気泡の「ハングアップ（hanging up）」を生じうるような、干渉する、ギザギザした、又は水平を呈する側壁特徴を導入しないように、漸進的に移行する。幾つかの実施形態では、移行する壁及び上部開口部の非円形（例えば、多角形）の形状によって作り出された側壁の角部は、液体の流入及び／又は空気の抜けのための経路を提供する。   In some embodiments, the well-shaped transition is used to alleviate the problem of air escaping when introducing liquid into the well. For example, in some embodiments, a circular cross-section well bottom (or well bottom portion) is used for spheroid formation. However, the circular cross section can be particularly problematic for allowing air to escape without the formation of pockets. To alleviate this problem, a well is formed having a circular well bottom cross-section and a non-circular (eg, triangular, square, rectangular, pentagonal, hexagonal, etc.) top opening. In such embodiments, the sidewall transitions from a non-circular (eg, polygonal) top opening to a circular well bottom. In some embodiments, the transition is an interfering, jagged, or horizontal sidewall feature that can result in a “hanging up” of bubbles escaping from the well when introducing liquid into the well. Transition gradually so as not to introduce. In some embodiments, the corner of the sidewall created by the transition wall and the non-circular (eg, polygonal) shape of the top opening provides a path for liquid inflow and / or air escape. To do.

幾つかの実施形態では、ウェルの幾何学形状は、ウェルに液体を導入する際に空気の抜けを促進するために、ウェル壁内に毛管構造（例えば、口部、リッジ、割れ目、丸みを帯びた又は放物面の上部開口部等を含む）を含む。図１Ｂは、リッジ１７０を示す、図１Ａの線Ｂ−Ｂで切り取った上視図である。図１Ｂに示されるように、リッジは、ウェルの口部１１０又は側壁１１３からの***（bump）又は突起である。実施形態において、リッジは、上部開口部１１１からウェル底部１１６までのマイクロウェルの長さを延長する。追加の実施形態では、リッジは、口部の上部１１１から口部の底部１１２まで延びる。リッジ１７０のいずれかの側に形成される鋭角は、水性流体に毛管力を作り出して、空気溜まりのない、マイクロウェルへの流体の流入をもたらす。図２Ｂは、図２Ａにおける断面を示す、ウェルのアレイ１００の上視図である。図２Ｂは、割れ目２７０を示している。図２Ｂに示されるように、割れ目は、ウェル１１５の側壁１１３における刻み目（indentation）である。割れ目２７０のいずれかの側に形成される鋭角は、水性流体がマイクロウェル内へ流入可能にする毛管力を作り出す。   In some embodiments, the well geometry is a capillary structure (e.g., mouth, ridge, crack, rounded) in the well wall to facilitate the escape of air as liquid is introduced into the well. Or a paraboloid upper opening etc.). FIG. 1B is a top view of the ridge 170 taken along line BB of FIG. 1A. As shown in FIG. 1B, the ridge is a bump or protrusion from the well's mouth 110 or side wall 113. In an embodiment, the ridge extends the length of the microwell from the top opening 111 to the well bottom 116. In an additional embodiment, the ridge extends from the top 111 of the mouth to the bottom 112 of the mouth. The acute angle formed on either side of the ridge 170 creates a capillary force on the aqueous fluid, resulting in the inflow of fluid into the microwell without air pockets. FIG. 2B is a top view of the array of wells 100 showing the cross section in FIG. 2A. FIG. 2B shows a crack 270. As shown in FIG. 2B, the fissure is an indentation in the sidewall 113 of the well 115. The acute angle formed on either side of the crack 270 creates a capillary force that allows aqueous fluid to flow into the microwell.

図３Ａ及びＢは、ウェルのアレイ１００の別の例示的な実施形態の概略図である。図３Ａは断面図である。図３Ｂは、図３Ａの線Ｂ−Ｂで切り取ったウェルのアレイの例示的な実施形態の上視図である。図３Ａ及びＢは、各ウェル１１５が２つ以上のリッジ１７０又は割れ目２７０を有しうること、及び、リッジ１７０又は割れ目２７０がウェル１１５内にアレイ状に配置されうることを示している。図３Ａ及びＢに示されるように、実施形態において、リッジ及び／又は割れ目の径方向分布が想定されている。毛管構造の数は、１マイクロウェルあたり１つに限られない。幾つかの実施形態では、毛管の数が多いほうが、マイクロウェル内への流体の流入速度を低下させる。   3A and B are schematic views of another exemplary embodiment of an array 100 of wells. FIG. 3A is a cross-sectional view. FIG. 3B is a top view of an exemplary embodiment of an array of wells taken along line BB of FIG. 3A. FIGS. 3A and B show that each well 115 can have more than one ridge 170 or split 270 and that the ridges 170 or splits 270 can be arranged in the well 115 in an array. As shown in FIGS. 3A and B, in the embodiment, a radial distribution of ridges and / or cracks is assumed. The number of capillary structures is not limited to one per microwell. In some embodiments, a greater number of capillaries reduces the rate of fluid flow into the microwell.

図３Ａ〜Ｄは、単一のウェル内に複数の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１６、２０、２４、２８、３２、又はそれらの中のいずれかの範囲）垂直に方向づけられた毛管構造を包含することを実証している。特徴は、一定間隔で離間されてよく（図３に示すように）、不規則な間隔で離間されてもよく、集団化（grouped）／***等であってもよい。幾つかの実施形態では、毛管構造は、ウェルの上部開口部からウェル底部まで延びる。単一のウェル内に複数の毛管構造が存在する場合、その複数の特徴は、異なる種類（例えば、リッジ線及び／又は割れ目）のものであってよく、異なる形状（例えば、方形、円形等）を含んでいてもよい。   3A-D show a plurality of (e.g., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 16, 20, 24, 28, 32, or those within a single well. It has been demonstrated to encompass vertically oriented capillary structures). The features may be spaced at regular intervals (as shown in FIG. 3), may be spaced at irregular intervals, may be grouped / bumped, or the like. In some embodiments, the capillary structure extends from the top opening of the well to the bottom of the well. If there are multiple capillary structures in a single well, the features may be of different types (eg, ridge lines and / or cracks) and different shapes (eg, square, circular, etc.) May be included.

図３Ｃは、ウェルのアレイ１００が、正弦波又は放物面の形状を有しうることを示している。この形状は、丸みを帯びた上部エッジ又はウェルエッジを作り出し、このことにより、実施形態において、ウェルの上部の鋭角の角部又は９０度の角度における空気の取り込みを低減する。この正弦波又は放物面のウェル形状、又は丸みを帯びた上部ウェルエッジもまた、毛管構造である。図３Ｃに示されるように、ウェル１１５は、上部直径Ｄ上部、ウェルの底部１１６からウェルの上部までの高さＨ、及びウェルの上部とウェルの底部１１６との間の高さの中間点におけるウェルの直径Ｄ中間を有する、上部開口部を有する。 FIG. 3C shows that the array of wells 100 can have a sinusoidal or parabolic shape. This shape creates a rounded top edge or well edge, which, in embodiments, reduces air uptake at the acute corner or 90 degree angle of the top of the well. This sinusoidal or paraboloidal well shape or rounded upper well edge is also a capillary structure. As shown in FIG. 3C, the well 115 is at the midpoint of the top diameter D top , the height H from the bottom 116 of the well to the top of the well, and the height between the top of the well and the bottom 116 of the well. It has an upper opening with a mid- well diameter D.

図３Ｄは、上記図１〜３、及び実施形態に記載されるウェルのアレイの概略図である。図３Ｄは、基材１１１４内にアレイ状に配置された複数のマイクロウェル１１５を示している。複数のマイクロウェル１１５内に存在する複数のスフェロイド５００もまた図３Ｄに示されている。   FIG. 3D is a schematic diagram of the array of wells described in FIGS. 1-3 and embodiments above. FIG. 3D shows a plurality of microwells 115 arranged in an array within the substrate 1114. A plurality of spheroids 500 present in a plurality of microwells 115 are also shown in FIG. 3D.

図４Ａ及び４Ｂは、スフェロイド含有細胞培養コンパートメント、又はウェルのアレイの別の例示的な実施形態を示す概略図である。図４Ａは、ウェルのアレイの波形状の実施形態の上視図であり、図４Ｂは、同じ実施形態の部分切り取り図である。図４Ａ及び４Ｂに示される実施形態では、ウェルは隔離されておらず、ウェル同士間の液体の流れを可能にする。図４Ａ〜Ｂに示されるように、波形状の側壁４０３が該波形状の側壁４０３同士の間の間隙にマイクロウェル４０１を生成するように位置合わせされた、例示的な実施形態が示されている。図４Ａ及び４Ｂに示された波形状の側壁は、フレーム４０２によって取り囲まれ、マイクロウェル４０１の列が作り出す周期でそれらが遠く離れ、次には互いに近づく（例えば、接触して又は接触せずに）領域を有する。幾つかの実施形態では、マイクロウェルのくぼみは、より遠く離れた壁によって画成される、各セグメントのベースに位置している（例えば、スフェロイド５００を収容するため）。図４Ｃ及び４Ｄは、波形状のマイクロウェルアレイの実施形態の追加の概略図である。図４Ｃは実施形態の上視図であり、図４Ｄは実施形態の斜視図である。図４Ｄに示されるように、実施形態において、フレームは存在しない。図４Ｃ及び４Ｄは、スフェロイド形成を誘発するのに適した幾何学形状を有する空間４０１を形成する、波形状又は波状の側壁４０３を示している。ウェル内に存在するスフェロイド５００もまた図４Ｃ及び４Ｄに示されている。図４Ａ及びＢに示される実施形態に液体が導入される場合、排除された空気は、壁が互いに近づく領域を通じて局所領域の外に移動することができる。より幅広いウェルの領域の内外への流体及び空気の移動は、狭隘部によって促進され、空気の取り込みを回避する。これらの波形はまた、縮小された増殖領域をもたらすことによってスフェロイドの形成を促進する。すなわち、波形は、毛管構造であり、かつ、スフェロイドを誘発する幾何学形状である。   4A and 4B are schematic diagrams illustrating another exemplary embodiment of a spheroid-containing cell culture compartment, or array of wells. FIG. 4A is a top view of a corrugated embodiment of an array of wells, and FIG. 4B is a partial cutaway view of the same embodiment. In the embodiment shown in FIGS. 4A and 4B, the wells are not isolated, allowing liquid flow between the wells. As shown in FIGS. 4A-B, an exemplary embodiment is shown in which corrugated sidewalls 403 are aligned to create a microwell 401 in the gap between the corrugated sidewalls 403. Yes. The corrugated sidewalls shown in FIGS. 4A and 4B are surrounded by the frame 402 and they are far apart in the period created by the rows of microwells 401 and then approach each other (eg, with or without contact). ) Region. In some embodiments, the wells of the microwell are located at the base of each segment (eg, to accommodate the spheroid 500) defined by more distant walls. 4C and 4D are additional schematic diagrams of embodiments of corrugated microwell arrays. FIG. 4C is a top view of the embodiment, and FIG. 4D is a perspective view of the embodiment. As shown in FIG. 4D, in the embodiment, there is no frame. 4C and 4D show a corrugated or corrugated sidewall 403 that forms a space 401 having a geometry suitable for inducing spheroid formation. Spheroid 500 present in the well is also shown in FIGS. 4C and 4D. When liquid is introduced into the embodiment shown in FIGS. 4A and B, the excluded air can move out of the local region through the region where the walls approach each other. Fluid and air movement into and out of the wider well region is facilitated by the narrowing to avoid air entrainment. These waveforms also promote spheroid formation by providing a reduced growth area. That is, the waveform is a capillary structure and a geometric shape that induces spheroids.

図５Ａ及び５Ｂは、一連のピラーがウェルを画定する、ウェルのアレイ１００の例示的な実施形態の概略的な上視図を示している。図５Ｃ〜５Ｅは、ウェル５１５を形成するようにアレイ状に配置されたピラー５０１を示すマイクロウェルのアレイの実施形態の斜視図である。実施形態において、ピラー５０１の上部５１０は、平坦でありうる（図５Ａに示される）。この実施形態では、ピラー５０１によって作り出される凸面壁は、ピラー形成側壁間の接合部に非常に鋭角又は不連続性を作り出す。図５Ｂは、培養においてスフェロイド５００の形成を誘発するのに適した閉じ込めの幾何学形状を作り出すようにピラーによって取り囲まれたマイクロウェルのくぼみを示している。ピラー５０１間の空間５０５を通って、空気は逃げ、流体が入る。ピラー５０１は上部５１０を有する。実施形態において、ピラー上部５１０は、図５Ｂ、５Ｄ及び５Ｅに示されるように、図３Ａに示される放物面又は正弦波の形状を有するウェルを生じるであろう、丸みを帯びうる。ピラーはまた、縮小された増殖領域をもたらすことによってスフェロイドの形成も促進する。すなわち、ピラーは毛管構造であり、かつ、スフェロイドを誘発する幾何学形状である。   5A and 5B show a schematic top view of an exemplary embodiment of an array of wells 100 in which a series of pillars define the wells. FIGS. 5C-5E are perspective views of an embodiment of an array of microwells showing pillars 501 arranged in an array to form wells 515. In an embodiment, the upper portion 510 of the pillar 501 may be flat (shown in FIG. 5A). In this embodiment, the convex wall created by the pillar 501 creates a very acute angle or discontinuity at the junction between the pillar forming sidewalls. FIG. 5B shows a microwell indentation surrounded by pillars to create a confinement geometry suitable for inducing spheroid 500 formation in culture. Air escapes and fluid enters through the space 505 between the pillars 501. The pillar 501 has an upper portion 510. In an embodiment, the pillar top 510 may be rounded, as shown in FIGS. 5B, 5D and 5E, which will result in a well having the paraboloid or sinusoidal shape shown in FIG. 3A. Pillars also promote spheroid formation by providing a reduced growth area. That is, the pillar has a capillary structure and a geometric shape that induces spheroids.

例えば、リッジ、割れ目、***、ディボット、上部開口又は口部構造の開放環構造、ピラー、不連続な壁、口部構造、放物面又は正弦波のウェル形状、丸みを帯びたウェル開口部、又はウェルの側壁の滑らかな内面における中断、若しくは、これらの特徴の任意の組合せを含む、これらの構造は、毛管構造である。毛管構造はまた、液体を加えた後に閉じ込められうる空気を逃がすルートも提供する。幾つかの実施形態では、不連続な壁、リッジ又は割れ目を含む壁、若しくは、ウェルの側壁の滑らかさを中断する他の特徴は、充填の間に、ウェル内に通気場所を設けることによって、空気の取り込みを回避するために使用される。   For example, ridges, fissures, ridges, divots, open rings with top openings or mouth structures, pillars, discontinuous walls, mouth structures, parabolic or sinusoidal well shapes, rounded well openings, These structures, including breaks in the smooth inner surface of the well sidewalls, or any combination of these features, are capillary structures. The capillary structure also provides a route to escape air that can be trapped after the liquid is added. In some embodiments, discontinuous walls, walls containing ridges or fissures, or other features that interrupt the smoothness of the sidewalls of the well can be achieved by providing a venting location in the well during filling, Used to avoid air entrapment.

幾つかの実施形態では、毛管構造は、ウェルの壁の垂直方向の長さに沿って延びる。幾つかの実施形態では、毛管構造は、ウェルの上部開口部まで又はその上まで延びる。他の実施形態では、毛管構造は、ウェルの上部開口部の近くに延びる（例えば、上部開口部から＜０．１μｍ、０．１μｍ、０．２μｍ、０．５μｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、１０μｍ、又は２０μｍ（又はそれらの間の範囲））。幾つかの実施形態では、毛管構造は、ウェル底部まで延びる。他の実施形態では、毛管構造は、ウェル底部の近くまで延びる（例えば、ウェル底部から＜０．１μｍ、０．１μｍ、０．２μｍ、０．５μｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、１０μｍ、又は２０μｍ（又はそれらの間の範囲））。   In some embodiments, the capillary structure extends along the vertical length of the well wall. In some embodiments, the capillary structure extends to or above the upper opening of the well. In other embodiments, the capillary structure extends near the top opening of the well (eg, <0.1 μm, 0.1 μm, 0.2 μm, 0.5 μm, 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm from the top opening). 5 μm, 10 μm, or 20 μm (or the range between them)). In some embodiments, the capillary structure extends to the well bottom. In other embodiments, the capillary structure extends near the well bottom (eg, <0.1 μm, 0.1 μm, 0.2 μm, 0.5 μm, 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 10 μm from the well bottom). , Or 20 μm (or the range between them)).

幾つかの実施形態では、毛管特徴は、ウェルに入る液体が、ウェル内に空気を取り込むことなく移動するための経路をもたらすという利益を提供する。幾つかの実施形態では、毛管構造は、ウェルに入る液体の導入に応答してウェルを出る空気のための経路を提供する。技術は、空気の取り込みを防ぐための特定の作用機構に限られず、また、本発明の実施するためには機構の理解は必要ではない。   In some embodiments, the capillary feature provides the benefit that liquid entering the well provides a path for movement without taking air into the well. In some embodiments, the capillary structure provides a path for air exiting the well in response to introduction of liquid entering the well. The technology is not limited to a specific mechanism of action to prevent air entrapment, and an understanding of the mechanism is not necessary to practice the present invention.

急速な容器の充填又は別の流体導入事象が空気の取り込みにつながる場合には、このような取り込みを防ぐように構成されたウェルの幾何学形状にもかかわらず、毛管特徴は、閉じ込められた空気下での液体の移動を可能にし、それによってウェルから空気を放出する。例えば、図４に示される波形状の実施形態では、液体及び空気は、アレイの狭隘部を通じて、１つのウェル領域から次のウェル領域へと開放ウェル構造を通って流れることができる。あるいは、図５に示されるピラーの実施形態では、液体又は閉じ込められた空気は、ピラー間の空間を通じてウェルから出ることができる。幾つかの実施形態では、毛管構造を通る液体の下向きの力は、ウェル壁から空気を分離し、空気を液体で取り囲み、それによって空気溜まりを泡としてウェルの外へと上昇させる役割をする。   If rapid container filling or another fluid introduction event leads to air uptake, the capillary features will be confined to the trapped air, despite the well geometry configured to prevent such uptake. Allows movement of the liquid below, thereby releasing air from the well. For example, in the wavy embodiment shown in FIG. 4, liquid and air can flow through the open well structure from one well region to the next through the narrow portion of the array. Alternatively, in the pillar embodiment shown in FIG. 5, liquid or trapped air can exit the well through the space between the pillars. In some embodiments, the downward force of the liquid through the capillary structure serves to separate the air from the well wall and surround the air with the liquid, thereby raising the air reservoir as a bubble and out of the well.

さまざまな異なる垂直に方向づけられた構造は、毛管特徴としての用途を見出す。例えば、ある特定の実施形態では、特徴は、***したリッジ（例えば、図１Ａ及び図１Ｂに示すように）、若しくは、隠れ溝又は割れ目（例えば、図２Ａ及びＢに示されるように）である。本明細書の実施形態における用途を見出すリッジ線及び割れ目は、図示される物理的な幾何学形状に限られない。幾つかの実施形態では、特徴は、水平に移動することなく、ウェルの側壁に沿って垂直に延びる。大抵の場合、水平な構造特徴は、既存のウェル幾何学形状に用いられる急角度と同様の方式でウェル内の空気の取り込みを促進する。リッジの適切な断面形状は図６に示されており、丸みを帯びた（図６Ａ）、角のある（図６Ｂ）、針状（図６Ｃ）、半六角形（図６Ｄ及び６Ｅ）の形状等が挙げられる。割れ目の適切な断面形状は図７に示されており、丸みを帯びた（図７Ａ）、角のある（図７Ｂ）、針状（図７Ｃ）、半六角形（図７Ｄ及び７Ｅ）の形状等が挙げられる。リッジ及び／又は割れ目は、任意の適切な断面寸法のものでありうる（例えば、０．１〜２０マイクロメートル（例えば、０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、１５、２０、又はそれらの間のいずれかの適切な範囲）の幅、長さ等を有する）。リッジ及び／又は割れ目の形状及び寸法を最適化して、液面下に空気溜まりを形成することなく、液体の導入及び空気の排出を促進するため、及び／又は、閉じ込められた空気溜まりの除去を促進するために、工学的原理及びマイクロ流体原理を本明細書の実施形態と組み合わせて使用してもよい。   A variety of different vertically oriented structures find use as capillary features. For example, in certain embodiments, the feature is a raised ridge (eg, as shown in FIGS. 1A and 1B) or a hidden groove or crack (eg, as shown in FIGS. 2A and B). . Ridge lines and cracks that find use in the embodiments herein are not limited to the physical geometry shown. In some embodiments, the features extend vertically along the sidewalls of the well without moving horizontally. In most cases, the horizontal structural features facilitate the uptake of air in the wells in a manner similar to the steep angles used for existing well geometries. A suitable cross-sectional shape of the ridge is shown in FIG. 6 and is rounded (FIG. 6A), angular (FIG. 6B), acicular (FIG. 6C), semi-hexagonal (FIGS. 6D and 6E). Etc. A suitable cross-sectional shape of the fissure is shown in FIG. 7 and is rounded (FIG. 7A), angular (FIG. 7B), acicular (FIG. 7C), semi-hexagonal (FIGS. 7D and 7E). Etc. The ridges and / or fissures can be of any suitable cross-sectional dimension (eg, 0.1-20 micrometers (eg, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10 , 15, 20, or any suitable range in between) width, length, etc.). Optimize the shape and size of the ridges and / or cracks to facilitate the introduction of liquid and discharge of air and / or the removal of trapped air pockets without forming air pockets below the liquid level. To facilitate, engineering principles and microfluidic principles may be used in combination with the embodiments herein.

幾つかの実施形態では、ウェル内への液体の移動及びウェル外への空気の移動は、不連続な側壁の幾何学形状を介して行われる。不連続なウェルの幾何学形状は、ウェルの側壁の不連続性という形態を取る。不連続な側壁の形状の例は、図４の「波状の壁」又は「波形状」の幾何学形状、及び図５の「ピン壁」又は「ピラー壁」の幾何学形状に示されるようなものである。これらの形状は単なる例証にすぎず、側壁の一部分（例えば、上部）に間隙又は他の不連続性を導入する他の側壁の方向性は、本明細書の実施形態における用途を見出しうる。これらの幾何学形状において、壁における中断は、流体が容器に入る際に、空気を、その低粘着性によって、ウェルの外へと急速に移動可能にする。幾つかの実施形態では、不連続な幾何学形状は、基材の壁の特徴における鋭角での変化の回避（例えば、水平の障害物（obstructions）を作り出す特徴の回避）を維持する。幾つかの実施形態では、不連続な側壁の幾何学形状は、ウェル形状の移行及び／又は毛管の壁構造とともに用いられて、液体の導入の際に泡の放出及び／又は空気の排出を助ける。   In some embodiments, the movement of liquid into the well and the movement of air out of the well is performed through discontinuous sidewall geometry. The geometry of the discontinuous well takes the form of a discontinuity in the well sidewall. Examples of discontinuous sidewall shapes are as shown in the “wavy wall” or “wave shape” geometry of FIG. 4 and the “pin wall” or “pillar wall” geometry of FIG. Is. These shapes are merely illustrative, and other sidewall orientations that introduce gaps or other discontinuities in a portion (eg, the top) of the sidewall may find use in the embodiments herein. In these geometries, the interruption in the wall allows air to move rapidly out of the well due to its low tack as fluid enters the container. In some embodiments, the discontinuous geometry maintains avoidance of acute changes in the characteristics of the substrate wall (eg, avoidance of features that create horizontal obstructions). In some embodiments, discontinuous sidewall geometries are used in conjunction with well-shaped transitions and / or capillary wall structures to aid in bubble release and / or air evacuation upon liquid introduction. .

幾つかの実施形態では、１つ以上のウェルは、半球面又は丸底を有する円錐面、及び同様の表面形状又はそれらの組合せなど、凹曲面を有する。ウェル及びウェル底部は、くぼみ又はウェル、及び同様の凹形円錐台状の起伏表面など、丸みを帯びた面又は曲面、若しくはそれらの組合せにおいて、最終的に終結、終端、又は底付き（bottom-out）しうる。スフェロイドを助長するウェルの他の形状及び構成は、本開示と矛盾しない限り、その全体がここに参照することによって本明細書に取り込まれる、本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第１４／０８７，９０６号明細書に記載されている。実施形態において、ウェル底部は平坦であるか、又は先が細くなっている。ウェル底部は、任意の他の適切な形状又は寸法を有していてもよい。例えば、実施形態において、ウェル底部は丸みを帯びた面又は曲面を有し、あるいは、ウェル底部は、縮小された増殖領域をもたらすことによってスフェロイドの形成を促進する、くぼみ、凹み、及び同様の凹形円錐台状の起伏表面、複数のくぼみ又はペン先領域、若しくはそれらの組合せなどの構造を有しうる。すなわち、丸みを帯びた又は曲面状の又はくぼみのあるウェル底部若しくはペン先領域若しくは波形若しくはピラーは、スフェロイドを誘発する幾何学形状である。   In some embodiments, the one or more wells have a concave surface, such as a conical surface with a hemispherical surface or a round bottom, and similar surface shapes or combinations thereof. Wells and well bottoms are ultimately terminated, terminated, or bottomed in rounded surfaces or curved surfaces, such as indentations or wells, and similar concave frustoconical relief surfaces, or combinations thereof. out). Other shapes and configurations of wells that facilitate spheroids are assigned to the assignee of the present invention, which is incorporated herein by reference in its entirety, as long as it is not inconsistent with this disclosure. / 087,906. In embodiments, the well bottom is flat or tapered. The well bottom may have any other suitable shape or size. For example, in embodiments, the well bottom has a rounded surface or curved surface, or the well bottom promotes the formation of spheroids by providing a reduced growth area, indentations, depressions, and similar depressions. It may have a structure such as a frustoconical undulating surface, a plurality of indentations or nib areas, or combinations thereof. That is, a rounded or curved or indented well bottom or nib area or corrugation or pillar is a geometric shape that induces spheroids.

例示的なウェルの幾何学形状及び寸法は、例えば、図１及び２に示されている。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のウェル１００は、下記の値のうちのいずれか２つの値の間の範囲（例えば、２００〜１０００μｍ、２００〜７５０μｍ、３００〜７５０μｍ、４００〜６００μｍ等）を含む、例えば、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、又は２０００マイクロメートルなど、約１００マイクロメートル〜約２０００マイクロメートルの範囲のウェル底部直径１３０／２３０を有する。このような直径寸法は、スフェロイドの内部の細胞が健康な状態に維持されるように、その中で増殖するスフェロイドの寸法を制御する。すなわち、これらの寸法は、縮小された増殖領域をもたらすことによって、スフェロイドの形成を促進する。すなわち、これらの寸法は、スフェロイドを誘発する幾何学形状である。   Exemplary well geometries and dimensions are shown, for example, in FIGS. In some embodiments, the well 100 described herein has a range between any two of the following values (eg, 200-1000 μm, 200-750 μm, 300-750 μm, 400-600 μm): Etc.), for example, about 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, or 2000 micrometers, etc. It has a well bottom diameter 130/230 in the range of 100 micrometers to about 2000 micrometers. Such diameter dimensions control the dimensions of the spheroids that grow therein so that the cells inside the spheroids are maintained in a healthy state. That is, these dimensions promote spheroid formation by providing a reduced growth area. That is, these dimensions are geometric shapes that induce spheroids.

幾つかの実施形態では、本明細書に記載のウェル１００／２００は、下記の値のうちのいずれか２つの値の間の範囲を含む、例えば、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、又は２０００マイクロメートルなど、約１００マイクロメートル〜約２０００マイクロメートルの範囲の上部開口部の断面寸法１２０／２２０（例えば、直径又は幅）を有する。幾つかの実施形態では、ウェル１００は、下記の値のうちのいずれか２つの値の間の範囲を含む、例えば、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００マイクロメートルなど、約５００マイクロメートル〜約１５００マイクロメートルの範囲の上部開口部からウェル底部までの深さ１６０／２６０を有する。幾つかの実施形態では、ウェル１００／２００は、下記の値のうちのいずれか２つの値の間の範囲を含む、例えば、５０、６０、７０、８０、９０，１００、２００、３００、４００、又は５００マイクロメートルなど、約５０マイクロメートル〜約５００マイクロメートルの範囲の深さ１４０／２４０を有する上部を有する。幾つかの実施形態では、ウェル１００は、下記の値のうちのいずれか２つの値の間の範囲を含む、例えば、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、又は１４００マイクロメートルなど、約１００マイクロメートル〜約１４００マイクロメートルの範囲の深さ１５０／２５０を有する下部を有する。当然ながら、他の適切な寸法もまた用いられうる。   In some embodiments, the well 100/200 described herein includes a range between any two of the following values, eg, 100, 150, 200, 250, 300, 350 , 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, or 2000 micrometers, such as a cross-sectional dimension 120 of the upper opening in the range of about 100 micrometers to about 2000 micrometers. / 220 (eg, diameter or width). In some embodiments, well 100 includes a range between any two of the following values, eg, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, or It has a depth 160/260 from the top opening to the well bottom in the range of about 500 micrometers to about 1500 micrometers, such as 1000 micrometers. In some embodiments, the well 100/200 includes a range between any two of the following values, eg, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 Or having a depth 140/240 in the range of about 50 micrometers to about 500 micrometers, such as 500 micrometers. In some embodiments, well 100 includes a range between any two of the following values, eg, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600 , 700, 800, 900, 1000, 1200, or 1400 micrometers, with a bottom having a depth 150/250 in the range of about 100 micrometers to about 1400 micrometers. Of course, other suitable dimensions may also be used.

幾つかの実施形態では、移行ウェルの構造及び特性、並びに、ウェルへの液体の導入の際に空気の抜けを可能にするように構成された１つ以上の設計要素及び／又は物理的特徴に加えて、本明細書に記載の装置及びウェル（例えば、マイクロウェル）は、例えば、マイクロウェル内での細胞の３Ｄ培養に関する特化された機能を提供するように、追加の特徴を備えうる。以下の段落は、上述の実施形態と組み合わせた用途を見出しうる、このような特徴に対処するものである。   In some embodiments, the structure and characteristics of the transition well, as well as one or more design elements and / or physical features configured to allow air to escape upon introduction of liquid into the well. In addition, the devices and wells (eg, microwells) described herein can include additional features, such as to provide specialized functions related to 3D culture of cells within the microwells, for example. The following paragraphs address such features that may find use in combination with the above-described embodiments.

幾つかの実施形態では、ウェルの側壁及び／又はウェル底部のすべて又は一部は、ガス透過性である。幾つかの実施形態では、ガス透過性は、ウェル内に含まれる液体又は培地に溶解する酸素及び他のガスのウェル内への移動を可能にする。透過性の側壁、ウェル底部、又はそれらの一部は、ウェル液体内に空気溜まり又は泡を形成させない。   In some embodiments, all or part of the well sidewalls and / or well bottom is gas permeable. In some embodiments, gas permeability allows movement of oxygen and other gases dissolved in the liquid or medium contained within the well into the well. The permeable side walls, well bottoms, or parts thereof do not form air pockets or bubbles in the well liquid.

幾つかの実施形態では、複数のガス透過性のウェルを画成する構造化された表面を有する細胞培養装置が提供される。幾つかの実施形態では、ウェルは、装置の外部表面を画成する外面を備えうる。幾つかの実施形態では、ウェルは、装置の外部と連通した外部又は非培養表面を含みうる。幾つかの実施形態では、とりわけ、各々が複数のガス透過性のウェルを画成する構造化された表面を有する、複数の積層された細胞培養コンパートメントを有する細胞培養装置が、本明細書に提供される。幾つかの実施形態では、さまざまな実施形態におけるウェルは、通気孔を通じて又は導管空間を通じて間接的に、若しくは、外部壁を通じて直接的になど、装置の外部とガス連通している。   In some embodiments, a cell culture device is provided having a structured surface that defines a plurality of gas permeable wells. In some embodiments, the well can include an outer surface that defines an outer surface of the device. In some embodiments, the well can include an external or uncultured surface in communication with the exterior of the device. In some embodiments, provided herein is a cell culture device having a plurality of stacked cell culture compartments, each having a structured surface that defines a plurality of gas permeable wells, among others. Is done. In some embodiments, the wells in various embodiments are in gas communication with the exterior of the device, such as through a vent or indirectly through a conduit space, or directly through an external wall.

幾つかの実施形態では、ウェルは、ウェル内で培養された細胞がスフェロイドを形成するように構成される。例えば、幾つかの実施形態では、ウェルは、該ウェル内の細胞を互いに会合させる（例えば、スフェロイドを形成する）ように、細胞に対して非接着性である。スフェロイドは、ウェルの幾何学形状によって課せられた寸法の許容限界まで拡大する。幾つかの実施形態では、ウェルは、該ウェルを細胞に対して非接着性にするために超低結合性の材料でコーティングされる。   In some embodiments, the well is configured such that cells cultured in the well form spheroids. For example, in some embodiments, the well is non-adherent to the cells so that the cells in the well associate with each other (eg, form a spheroid). Spheroids expand to the dimensional tolerances imposed by the well geometry. In some embodiments, the well is coated with an ultra-low binding material to make the well non-adherent to the cells.

スフェロイドなどの三次元（３Ｄ）細胞凝集体の形成は、細胞が表面に単層を形成する二次元細胞培養とは対照的に、細胞培養装置内で増殖する細胞の密度を増加させるが、それにより、装置内で培養される細胞の栄養要求も増大させうる。代謝ガスの交換は、細胞がその中で培養されるガス透過性のウェルを通じて生じうることから、細胞培養装置内の培地容積は、代謝ガスの交換が、細胞培養培地を通じた拡散に本質的に制限される装置を用いた場合に可能な容積よりも大きくすることができる。したがって、本明細書に記載の細胞培養装置に用いる細胞培養培地の高さをより高くすることができ、したがって、容積もより大きくできる。   The formation of three-dimensional (3D) cell aggregates, such as spheroids, increases the density of cells growing in a cell culture device, as opposed to two-dimensional cell culture where the cells form a monolayer on the surface. This can also increase the nutritional requirements of the cells cultured in the device. Since metabolic gas exchange can occur through gas permeable wells in which cells are cultured, the volume of medium in the cell culture device is essentially dependent on diffusion of metabolic gas through the cell culture medium. It can be made larger than possible when using a limited device. Accordingly, the height of the cell culture medium used in the cell culture device described in the present specification can be increased, and thus the volume can be increased.

幾つかの実施形態では、細胞は、細胞培養培地が細胞の上２ｍｍ以上の高さにある、本明細書に記載の装置のウェル内で培養される。幾つかの実施形態では、細胞培養培地は、細胞の上５ｍｍ以上の高さにある。細胞が培養される基材又はその表面、又はその近くが、代謝ガスに対して非透過性又は比較的非透過性である場合（例えば、細胞培養培地と比較して）など、代謝ガスの交換が本質的に培地を通した交換に制限される場合には、細胞培養培地の最大高さ２ｍｍ〜５ｍｍは、概して、培地の高さの上限と考えられる。   In some embodiments, the cells are cultured in the wells of the devices described herein wherein the cell culture medium is at a height of 2 mm or more above the cells. In some embodiments, the cell culture medium is at a height of 5 mm or more above the cells. Metabolic gas exchange, such as when the substrate on which the cells are cultured or its surface is near or relatively impermeable to metabolic gases (eg, compared to cell culture media) Is essentially limited to exchange through the medium, a maximum height of 2-5 mm of cell culture medium is generally considered the upper limit of the height of the medium.

効率的な代謝ガス交換の目的で、幾つかの実施形態では、装置内の細胞培養培地が、細胞の上２ｍｍ以上、細胞の上５ｍｍ以上、又は細胞の上１０ｍｍ以上など、細胞の上の任意の高さにある場合、細胞は、本明細書に記載の装置のウェルの培養物内で維持される。しかしながら、当業者は、装置内の細胞培養培地の高さが細胞の上に増加するにつれて、細胞に与えられる静水圧も増加することを理解するであろう。したがって、細胞の上の細胞培養培地の高さには実施上の制限が存在しうる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の物品のウェル内で培養される細胞の上の細胞培養培地の高さは、以下のいずれか２つの間の範囲を含む、例えば５、６、７、８、９、１０、１５又は２０ｍｍなど、例えば５ｍｍ〜１５ｍｍ、６ｍｍ〜１５ｍｍ、５ｍｍ〜１０ｍｍ又は６ｍｍ〜１０ｍｍなどの５ｍｍ〜２０ｍｍの範囲内にある。   For the purpose of efficient metabolic gas exchange, in some embodiments, the cell culture medium in the device is any on the cell, such as 2 mm or more above the cell, 5 mm or more above the cell, or 10 mm or more above the cell. Cells are maintained in the well cultures of the devices described herein. However, one of ordinary skill in the art will appreciate that as the height of the cell culture medium in the device increases above the cells, the hydrostatic pressure applied to the cells also increases. Thus, there may be practical restrictions on the height of the cell culture medium above the cells. In some embodiments, the height of the cell culture medium above the cells cultured in the wells of the article described herein comprises a range between any two of the following, for example 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 or 20 mm, for example, in the range of 5 mm to 20 mm, such as 5 mm to 15 mm, 6 mm to 15 mm, 5 mm to 10 mm, or 6 mm to 10 mm.

ある特定の実施形態では、装置の外部とガス連通した非培養表面を有する細胞培養基材又は層は、本明細書に記載のガス透過性のウェルを画成する構造化された表面を有するように適合されうる。このような細胞培養装置の例としては、Ｔフラスコ、ＴＲＩＰＬＥ−ＦＬＡＳＫ細胞培養容器（Ｎｕｎｃ．，Ｉｎｔｌ．社）、ＨＹＰＥＲＦＬＡＳＫ細胞培養容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．社）、ＣＥＬＬＳＴＡＣＫ培養チャンバ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．社）、ＣＥＬＬＣＵＢＥモジュール（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．社）、ＣＥＬＬ ＦＡＣＴＯＲＹ培養装置（Ｎｕｎｃ，Ｉｎｔｌ．社）、及び、本明細書に提示される開示と矛盾しない限りにおいて、それぞれの全体がここに参照することによって本明細書に取り込まれる、国際公開第２００７／０１５７７０号、米国特許出願公開第２０１４／０３１５２９６号、米国特許第８，８４６，３９９号、米国特許第８，１７８，３４５号、及び米国特許第７，７４５，２０９号の各明細書に記載の細胞培養物品が挙げられる。   In certain embodiments, a cell culture substrate or layer having an uncultured surface in gas communication with the exterior of the device has a structured surface that defines a gas permeable well as described herein. Can be adapted. Examples of such cell culture devices include T-flasks, TRIPLE-FLASK cell culture vessels (Nunc., Intl.), HYPERFLASK cell culture vessels (Corning, Inc.), CELLSTACK culture chambers (Corning, Inc.). ), The CELLCUBE module (Corning, Inc.), the CELL FACTORY culture apparatus (Nunc, Intl.), And to the extent that they do not conflict with the disclosure presented herein, each by reference herein in its entirety. WO 2007/015770, US Patent Application Publication No. 2014/0315296, US Pat. No. 8,846,399, US Pat. No. 8,178,345, and US Pat. , 745, 209 Include cell culture article according to book.

幾つかの実施形態では、ガス透過性／液体不透過性の材料は、本明細書の細胞培養装置、又はそれらの一部（例えば、ウェル、微細構造等）の構成に用いられる。任意の適切なガス透過性／液体不透過性の材料、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、エチレン酢酸ビニル、ポリスルホン、ポリメチルペンテン（ＰＭＰ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）又は相容性のフッ素ポリマー、シリコーンゴム又は共重合体、ポリ（スチレン−ブタジエン−スチレン）、若しくは、ポリエチレン又はポリプロピレンなどのポリオレフィン、若しくは、これらの材料の組合せなどが用いられうる。基材は、ウェルの少なくとも一部に適切なガス透過性を有する、任意の適切な材料から形成されうる。適切な基材の例としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、（ポリ）４−メチルペンテン（ＰＭＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、及びポリスチレン（ＰＳ）が挙げられる。ＰＤＭＳは、高度のガス透過性を有することができ、最大４０ｍｍの厚さにおいて十分なガス透過性を達成することができる。ＰＭＰは、最大約０１ｍｍの厚さにおいて十分なガス透過性を達成することができる。幾つかの実施形態では、ＰＭＰは、約０．０２〜１ｍｍの範囲の厚さを有する。より薄い基材は十分な構造健全性を有しない可能性があるが、ＰＥ又はＰＳは、最大０．２ｍｍの厚さにおいて十分なガス透過性を達成することができる。乏しい構造健全性を補償するために、開口フレーム、スタンドオフなどが、底部から基材を支持するために用いられうる。実施形態において、ウェルの厚さは、下記のいずれか２つの間の範囲を含む、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０又は４０ｍｍでありうる。実施形態において、ウェルは、２０００ｃｍ３／ｍ２／日以上のガス透過性のポリマー材料を通る酸素透過速度を有する。幾つかの実施形態では、ウェルは、３０００ｃｍ３／ｍ２／日以上の基材を通るガス透過性を有する。幾つかの実施形態では、ウェルは、５０００ｃｍ３／ｍ２／日以上の基材を通るガス透過性を有する。 In some embodiments, gas permeable / liquid impermeable materials are used in the construction of the cell culture devices herein, or portions thereof (eg, wells, microstructures, etc.). Any suitable gas permeable / liquid impermeable material such as polystyrene, polycarbonate, ethylene vinyl acetate, polysulfone, polymethylpentene (PMP), polytetrafluoroethylene (PTFE) or compatible fluoropolymer, silicone Rubbers or copolymers, poly (styrene-butadiene-styrene), polyolefins such as polyethylene or polypropylene, or combinations of these materials may be used. The substrate can be formed from any suitable material that has suitable gas permeability for at least a portion of the well. Examples of suitable substrates include polydimethylsiloxane (PDMS), (poly) 4-methylpentene (PMP), polyethylene (PE), and polystyrene (PS). PDMS can have a high degree of gas permeability and can achieve sufficient gas permeability at a thickness of up to 40 mm. PMP can achieve sufficient gas permeability at a thickness of up to about 01 mm. In some embodiments, the PMP has a thickness in the range of about 0.02-1 mm. Although thinner substrates may not have sufficient structural integrity, PE or PS can achieve sufficient gas permeability at a thickness of up to 0.2 mm. To compensate for poor structural integrity, an open frame, standoff, etc. can be used to support the substrate from the bottom. In embodiments, the well thickness includes a range between any two of the following: 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, It can be 20 or 40 mm. In embodiments, the well has an oxygen transmission rate through the gas permeable polymeric material of 2000 cm 3 / m 2 / day or more. In some embodiments, the well has a gas permeability through the substrate of 3000 cm 3 / m 2 / day or more. In some embodiments, the well has a gas permeability through the substrate of 5000 cm 3 / m 2 / day or more.

このような材料は、外側と内部コンパートメントとの間の有効なガス交換を可能にし、液体又は汚染物質の通過を防ぐと同時に、酸素及び他のガスの進入を可能にする。   Such materials allow effective gas exchange between the outer and inner compartments and prevent the passage of liquids or contaminants while at the same time allowing the entry of oxygen and other gases.

幾つかの実施形態では、ウェル基材材料の厚さは、最適化されたガス交換を可能にするように調整される。幾つかの実施形態では、ウェルの厚さは、１０〜１００μｍ（例えば、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、及びそれらの間のいずれかの範囲）である。本明細書の実施形態の開発中に行われた実験は、厚さがより薄いウェルを用いると、産生される生細胞数がより多くなることを実証した（例えば、１７μｍ＞３０μｍ＞５７μｍ）。   In some embodiments, the thickness of the well substrate material is adjusted to allow optimized gas exchange. In some embodiments, the thickness of the well is 10-100 μm (eg, 10 μm, 15 μm, 20 μm, 25 μm, 30 μm, 35 μm, 40 μm, 45 μm, 50 μm, 60 μm, 70 μm, 80 μm, 90 μm, 100 μm, and the like) Any range between). Experiments conducted during the development of embodiments herein demonstrated that using thinner wells resulted in more viable cell numbers produced (eg, 17 μm> 30 μm> 57 μm).

図８は、細胞培養装置の表面として含まれる、マイクロウェルのアレイを有する基材を包含する実施形態を示す図である。図８では、細胞培養装置はフラスコ８００である。しかしながら、実施形態において、基材は、限定はしないが、マルチウェルプレート、フラスコ、皿、管、多層細胞培養フラスコ、バイオリアクタ、若しくは、細胞又はスフェロイドの増殖が意図されている任意の他の研究用容器を含む、任意の種類の細胞培養装置の一部を形成しうるものと解されたい。マイクロウェルのアレイを有する基材は、ガス透過性材料でありうる。図９は、図８に示されるフラスコの底面を形成する、マイクロウェルのアレイでマイクロパターン化された、９で示される基材の拡大図を示している。   FIG. 8 is a diagram illustrating an embodiment including a substrate having an array of microwells included as a surface of a cell culture device. In FIG. 8, the cell culture apparatus is a flask 800. However, in embodiments, the substrate is not limited to multiwell plates, flasks, dishes, tubes, multilayer cell culture flasks, bioreactors, or any other study intended for cell or spheroid growth. It should be understood that it can form part of any type of cell culture device, including containers for use. A substrate having an array of microwells can be a gas permeable material. FIG. 9 shows an enlarged view of the substrate shown at 9 that is micropatterned with an array of microwells forming the bottom of the flask shown in FIG.

図８及び図９に示される実施形態に関して、図示される装置は、細胞培養チャンバ８５０を備えたフラスコ又は筐体である。筐体は、マイクロウェルのアレイを有する基材（図９に示される）を含む。筐体はまた、上面８１５、及び構造化された表面１１０から上面８１５まで延びる１つ以上の側壁８２０も有する。幾つかの実施形態では、筐体８００は、円筒型の壁など、単一の取り囲む側壁を備えている。このような装置の追加の例は、例えば、本開示と矛盾しない限り、その全体が参照することによって本明細書に取り込まれる、本発明の譲受人に譲渡された米国仮特許出願第６２／０７２，０１５号に記載されている。   With respect to the embodiment shown in FIGS. 8 and 9, the apparatus shown is a flask or housing with a cell culture chamber 850. The housing includes a substrate (shown in FIG. 9) having an array of microwells. The housing also has a top surface 815 and one or more side walls 820 that extend from the structured surface 110 to the top surface 815. In some embodiments, the housing 800 includes a single surrounding sidewall, such as a cylindrical wall. Additional examples of such devices are, for example, U.S. Provisional Patent Application No. 62/072, assigned to the assignee of the present invention, which is hereby incorporated by reference in its entirety, unless otherwise inconsistent with the present disclosure. , 015.

筐体はポート８６０を備えている。ねじぶた８６１を有する開口部が図８に示されている。しかしながら、実施形態において、筐体は、液体及び細胞を筐体に出し入れ可能にするための任意の種類のポートを有しうる。ポート８６０は、側壁、上面８１５又は細胞培養表面１１０に存在しうる。ポート８６０は、細胞培養チャンバ８５０内へ細胞及び細胞培養培地を導入する又は取り出すために、管又は他の連結部に連結されうる。   The housing is provided with a port 860. An opening having a screw cap 861 is shown in FIG. However, in embodiments, the housing can have any type of port to allow liquids and cells to enter and exit the housing. Port 860 can be on the sidewall, top surface 815 or cell culture surface 110. Port 860 may be connected to a tube or other connection for introducing or removing cells and cell culture media into cell culture chamber 850.

図８に示される筐体は固定された側壁８２０を示しているが、実施形態において、側壁は、細胞培養チャンバ８５０内に入る細胞培養培地の可変容積を可能にするように、可撓性又は拡張性かつ折り畳み式でありうる。追加の細胞培養培地がポート８６０を介して細胞培養チャンバ８５０内へ導入される際に、可撓性の側壁８２０は伸長可能であり、また、細胞培養培地がポート８６０を介して細胞培養チャンバ８５０から取り出される際には、可撓性の側壁８２０はしぼみうる。幾つかの実施形態では、側壁８２０及び上部８１５は、バッグから形成される。加えて、細胞培養チャンバ８５０は、最大で筐体の固定容積まで、細胞培養培地の容積で満たされうる。幾つかの実施形態では（図示せず）、内部容積全体又はそれに近い容積が細胞培養培地で満たされる。   Although the housing shown in FIG. 8 shows a fixed side wall 820, in embodiments, the side wall is flexible or allows to allow a variable volume of cell culture medium to enter the cell culture chamber 850. It can be extensible and foldable. As additional cell culture media is introduced into the cell culture chamber 850 via port 860, the flexible sidewall 820 can extend and the cell culture media can be extended via port 860 to the cell culture chamber 850. When removed from the flexible side 820, the flexible sidewall 820 may deflate. In some embodiments, the sidewall 820 and the top 815 are formed from a bag. In addition, the cell culture chamber 850 can be filled with a volume of cell culture medium up to a fixed volume of the housing. In some embodiments (not shown), the entire internal volume or a volume close thereto is filled with cell culture medium.

図８に示される実施形態では、細胞培養チャンバ８５０内の細胞培養培地の容積は、細胞の上の培地の高さＨｍで存在する。上述のように、本明細書に記載される筐体内の培養された細胞の上の培地の高さＨｍは、ウェルがガス透過性ではない場合に可能であろう高さよりも高くできる。幾つかの実施形態では、細胞培養チャンバ８５０は、装置内で細胞を培養する目的で、その限度容量まで満たされる。 In the embodiment shown in FIG. 8, the volume of cell culture medium in the cell culture chamber 850 exists at the medium height H m above the cells. As described above, the height H m of the medium on the cells cultured in the housing as described herein, the well can be higher than possible will try height if not gas permeable. In some embodiments, the cell culture chamber 850 is filled to its limit capacity for the purpose of culturing cells in the device.

図１０Ａは、図９に示されるマイクロパターン化されたＴ２５スフェロイド形成フラスコのマイクロウェル１１０内のＨＴ２９細胞のスフェロイド５００を示している。図１０Ｂは、マイクロパターン化されたＴ２５スフェロイド形成フラスコから採取されたスフェロイド５００を示しており、両方とも、後述する実施例２に従っている。図１１Ａ及びＢは、Ｎｕｎｃ社から市販されるＮＵＮＣＬＯＮ ＳＰＨＥＲＡ（商標）低結合表面上で形成された３Ｄ凝集体（図１１ＡのヒトＥＳＣ細胞及び図１１ＢのマウスＥＳＣ）の広範囲のサイズ分布を示す顕微鏡写真である。ＮＵＮＣＬＯＮ ＳＰＨＥＲＡ（商標）低結合表面は、低細胞結合表面処理を有するが、均一なスフェロイドの形成を可能にする本明細書に開示される幾何学形状を欠いている。   FIG. 10A shows spheroid 500 of HT29 cells in microwell 110 of the micropatterned T25 spheroid-forming flask shown in FIG. FIG. 10B shows spheroid 500 taken from a micropatterned T25 spheroid-forming flask, both according to Example 2 described below. FIGS. 11A and B are microscopes showing a wide range of size distributions of 3D aggregates (human ESC cells in FIG. 11A and mouse ESCs in FIG. 11B) formed on a NUNCLON SPHERA ™ low binding surface commercially available from Nunc. It is a photograph. The NUNCLON SPHERA ™ low binding surface has a low cell binding surface treatment, but lacks the geometry disclosed herein that allows the formation of uniform spheroids.

図１２は、実施形態に従い、かつ、下記実施例１に記載される、マルチウェルアレイ基材の作製方法の図である。図１２は、熱エンボス／熱成形法を示しているが、コイニング、射出成形、エンボス加工及び当技術分野で知られた他の方法を含む、実施形態に従ったマイクロウェルアレイを製造する他の方法も予定されている。   FIG. 12 is a diagram of a method for producing a multiwell array substrate according to an embodiment and described in Example 1 below. FIG. 12 illustrates a hot embossing / thermoforming process, but other methods of manufacturing microwell arrays according to embodiments, including coining, injection molding, embossing, and other methods known in the art. A method is also planned.

図１３、図１４Ａ及びＢ、及び図１５は、平坦な表面に対し、マイクロウェルのアレイを有する基材についての生細胞カウント数（図１３及び図１４Ａ）及び細胞増殖率（図１４Ｂ及び図１５）を比較するグラフである。ウェルのガス透過性は、基材の材料及びウェルに沿った基材の厚さに部分的に依存しうる。実施形態において、ウェルのマイクロアレイを有する基材におけるウェルの側壁及び底部の厚さは一定であって差し支えなく、比較的薄くてよい。あるいは、実施形態において、マイクロウェルのアレイにおけるウェルの壁は、ウェル内への開口部の最も近くで比較的厚く、ウェルの底部で比較的薄くなっていてもよい。あるいは、実施形態において、マイクロウェルのアレイにおけるウェルの壁は、ウェル内への開口部の最も近くで比較的薄く、ウェルの底部で比較的厚くなっていてもよい。使用される材料及び採用される厚さに応じて、マイクロウェルのアレイを有する基材は、本開示の目的でガス透過性でありうる。   FIGS. 13, 14A and B, and FIG. 15 show the viable cell count (FIGS. 13 and 14A) and cell proliferation rate (FIGS. 14B and 15) for a substrate having an array of microwells over a flat surface. ). The gas permeability of the well can depend in part on the material of the substrate and the thickness of the substrate along the well. In an embodiment, the thickness of the sidewalls and bottom of the well in the substrate having the microarray of wells can be constant and can be relatively thin. Alternatively, in embodiments, the wall of the well in the array of microwells may be relatively thick near the opening into the well and relatively thin at the bottom of the well. Alternatively, in embodiments, the well walls in the array of microwells may be relatively thin near the opening into the well and relatively thick at the bottom of the well. Depending on the materials used and the thickness employed, a substrate having an array of microwells can be gas permeable for purposes of this disclosure.

図１５は、平坦な表面に対し、マイクロウェルのアレイを有する基材の上で培養されたＭＨ６７７細胞から排出されたタンパク質の全力価を表すグラフを示している。これらのデータは下記実施例２で論じられる。   FIG. 15 shows a graph representing the total titer of protein excreted from MH677 cells cultured on a substrate with an array of microwells against a flat surface. These data are discussed in Example 2 below.

図８に示される装置は、側部硬質性のフラスコ又は側部軟質性の細胞培養フラスコでありうるが、細胞培養装置の外面を画成する、又は、装置の外部とガス連通した、表面を有する構造化されたマイクロウェルアレイを備えた任意の他の細胞培養装置は、本明細書に記載のガス透過性材料から形成されるマイクロウェルのアレイを有する基材を有しうることが理解されよう。   The device shown in FIG. 8 can be a side rigid flask or a side soft cell culture flask, but it defines a surface that defines the outer surface of the cell culture device or is in gas communication with the outside of the device. It will be appreciated that any other cell culture device with a structured microwell array having a substrate having an array of microwells formed from the gas permeable materials described herein. Like.

本明細書に記載のマイクロウェルのアレイを有する細胞培養装置の構造化された表面は、適切な寸法又は形状を有しうる、適切な数のウェルを画成しうる。ウェルは、その寸法及び形状に基づいて容積を定める。多くの実施形態では、１つ以上又はすべてのウェルは、対称であり、及び／又は、長手方向軸の周りに対称に回転可能である。幾つかの実施形態では、１つ以上又はすべてのウェルの長手方向軸は、互いに平行である。ウェルは、均一又は不均一に離間されうる。幾つかの実施形態では、ウェルは、均一に離間される。１つ以上又はすべてのウェルは、同一の寸法及び形状を有していても、異なる寸法及び形状を有していてもよい。   A structured surface of a cell culture device having an array of microwells as described herein can define a suitable number of wells that can have a suitable size or shape. The well defines a volume based on its size and shape. In many embodiments, one or more or all wells are symmetrical and / or can be rotated symmetrically about the longitudinal axis. In some embodiments, the longitudinal axes of one or more or all wells are parallel to each other. The wells can be uniformly or non-uniformly spaced. In some embodiments, the wells are evenly spaced. One or more or all wells may have the same size and shape or different sizes and shapes.

幾つかの実施形態では、ウェルの周りの基材の厚さ及び形状は、内面に入り、外面から出る光の反射を補正するように構成される。幾つかの実施形態では、補正は、ウェルを形成する基材材料の厚さを調整することによって達成される。幾つかの実施形態では、ウェル底部（又は底）の最も近くにおける基材材料の厚さは、側壁及び／又は上部開口の最も近くの基材材料の厚さより大きい。幾つかの実施形態では、基材材料の厚さは、ウェル底部の底における最大から上部開口における最小まで、漸進的に低下する。例えば、形状及び厚さは、本開示と矛盾しない限り、その全体がここに参照することによって取り込まれる、本発明の譲受人に譲渡された米国仮特許出願第６２／０７２，０１９号明細書に記載されるものでありうる。   In some embodiments, the thickness and shape of the substrate around the well is configured to correct for reflections of light entering and exiting the inner surface. In some embodiments, the correction is achieved by adjusting the thickness of the substrate material that forms the well. In some embodiments, the thickness of the substrate material closest to the well bottom (or bottom) is greater than the thickness of the substrate material closest to the sidewall and / or top opening. In some embodiments, the thickness of the substrate material gradually decreases from a maximum at the bottom of the well bottom to a minimum at the top opening. For example, shapes and thicknesses are described in U.S. Provisional Patent Application No. 62 / 072,019, assigned to the assignee of the present invention, which is incorporated by reference herein in its entirety, unless otherwise contradicting this disclosure. May be described.

例えば、非接着性のウェル、スフェロイドを誘発するウェルの幾何学形状、及び重力の組合せは、ウェル内で培養される細胞の増殖が制限される閉じ込め容積を画成することができ、それにより、結果的に、閉じ込め容積によって画成される寸法を有するスフェロイドの形成を生じる。   For example, the combination of non-adherent wells, well geometry that induces spheroids, and gravity can define a confined volume in which the growth of cells cultured in the well is limited, thereby The result is the formation of spheroids with dimensions defined by the containment volume.

幾つかの実施形態では、ウェル２１１５の内面は、細胞に対して非接着性である。ウェルは、非接着性の材料から形成されて差し支えなく、あるいは、非接着性の材料でコーティングされて、非接着性のウェルを形成してもよい。非接着性の材料の例としてはパーフルオロ化ポリマー、オレフィン、又は同様のポリマー、若しくはそれらの混合物が挙げられる。他の例としては、アガロース、ポリアクリルアミドなどの非イオン性ヒドロゲル、ポリエチレンオキシドなどのポリエーテル及びポリビニルアルコールなどのポリオール、又は同様の材料、若しくはそれらの混合物が挙げられる。例えば、非接着性のウェル、ウェルの幾何学形状、及び重力の組合せは、ウェル内で培養された細胞を、スフェロイドへと自己組織化するように誘発しうる。一部のスフェロイドは、単層において増殖させた細胞と比較してより大きいインビボ様応答を示す、分化された細胞機能を維持することができる。   In some embodiments, the inner surface of the well 2115 is non-adherent to the cells. The well may be formed from a non-adhesive material or may be coated with a non-adhesive material to form a non-adhesive well. Examples of non-adhesive materials include perfluorinated polymers, olefins, or similar polymers, or mixtures thereof. Other examples include agarose, nonionic hydrogels such as polyacrylamide, polyethers such as polyethylene oxide and polyols such as polyvinyl alcohol, or similar materials, or mixtures thereof. For example, a combination of non-adherent wells, well geometry, and gravity can induce cells cultured in the wells to self-assemble into spheroids. Some spheroids can maintain differentiated cell functions that exhibit a greater in vivo-like response compared to cells grown in monolayers.

幾つかの実施形態では、１つ以上のウェルは、半球面などの凹曲面、丸底を有する円錐面などの表面幾何学形状、又はそれらの組合せを有する。ウェル及びウェル底部は、最終的には、くぼみ、凹み、及び同様の凹形円錐台状の起伏表面、又はそれらの組合せなど、スフェロイドを助長する丸みを帯びた面又は曲面に終結、終端、又は底付きしうる。ガス透過性のスフェロイドを助長するウェルの他の形状及び構成は、本開示と矛盾しない限り、その全体がここに参照することによって本明細書に取り込まれる、本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第１４／０８７，９０６号明細書に記載されている。   In some embodiments, the one or more wells have a concave surface such as a hemisphere, a surface geometry such as a conical surface with a round bottom, or a combination thereof. Wells and well bottoms eventually end, end, or end with rounded surfaces or curved surfaces that promote spheroids, such as indentations, depressions, and similar concave frustoconical relief surfaces, or combinations thereof Can bottom. Other shapes and configurations of wells that facilitate gas permeable spheroids are assigned to the assignee of the present invention, which is hereby incorporated by reference herein in its entirety, unless otherwise inconsistent with this disclosure. It is described in patent application No. 14 / 087,906.

幾つかの実施形態では、ウェル底部は平坦であるか、又は先が細くなっている。ウェル底部は、任意の他の適切な形状又は寸法を有しうる。   In some embodiments, the well bottom is flat or tapered. The well bottom can have any other suitable shape or size.

幾つかの実施形態では、本明細書に記載のウェル１１５は、下記の値のうちのいずれか２つの値の間の範囲を含む、例えば、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００マイクロメートルなど、約２００マイクロメートル〜約５００マイクロメートルの範囲の直径寸法ｗを有する。このような直径寸法によって、スフェロイドの内部の細胞が健康な状態に維持されるように、その中で増殖するスフェロイドの寸法を制御することができる。幾つかの実施形態では、ウェル１１５は、下記の値のうちのいずれか２つの値の間の範囲を含む、例えば、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００マイクロメートルなど、約１００マイクロメートル〜約５００マイクロメートルの範囲の高さＨを有する。当然ながら、他の適切な寸法もまた使用されうる。   In some embodiments, the well 115 described herein includes a range between any two of the following values, eg, 200, 250, 300, 350, 400, 450 or 500 Having a diameter dimension w ranging from about 200 micrometers to about 500 micrometers, such as micrometers. With such a diameter dimension, the dimension of the spheroids that grow therein can be controlled so that the cells inside the spheroids are maintained in a healthy state. In some embodiments, the well 115 includes a range between any two of the following values, eg, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 or 500 micrometers. Etc., having a height H in the range of about 100 micrometers to about 500 micrometers. Of course, other suitable dimensions may also be used.

幾つかの実施形態では、ウェルを画成する構造化された表面は、六方最密充填型のウェル構造のアレイを含む。六角形のマイクロウェルのアレイ１００を有するこのような基材の実施形態の画像が、六角形のウェル１６０１のアレイを有する基材を示す図１６に示されている。図１７は、六方最密充填型のウェル構造を有するマイクロウェルのアレイ１００を有する基材の実施形態のウェル１６０１内で増殖させた細胞（スフェロイド）５００を示す概略図である。幾つかの実施形態では、各ウェル１６０１内の細胞は、図示されるように、単一のスフェロイド５００を形成する。   In some embodiments, the structured surface defining the well comprises an array of hexagonal close-packed well structures. An image of an embodiment of such a substrate having an array of hexagonal microwells 100 is shown in FIG. 16 showing a substrate having an array of hexagonal wells 1601. FIG. 17 is a schematic diagram showing cells (spheroids) 500 grown in a well 1601 of a substrate embodiment having an array of microwells 100 having a hexagonal close-packed well structure. In some embodiments, the cells in each well 1601 form a single spheroid 500, as shown.

図１８は、多孔膜支持体を含む細胞培養装置の実施形態を示す側面図である。多孔膜支持体２５００を取り込む細胞培養装置２１００のさまざまな実施形態が図１８〜２０に示されている。多孔膜支持体２５００は、筐体の内部を別々の培養チャンバ２１５２及び２１５４へとコンパートメント化するように、筐体を横断して（例えば、１つ以上の側壁２１２０に連結されて）装置に配置される。第１の培養チャンバ２１５２は、装置の外部とガス連通したガス透過性のウェル２２００を画成する構造化された表面を形成する基材を備えている。チャンバ２１５２の上部は、多孔膜２５００によって画成される。第２の培養チャンバ２１５４の底部は、多孔膜２５００によって画成される。したがって、細胞の第１の集団２２００は、第１のチャンバ２１５２における、基材２１１０によって形成された構造化された表面のウェル２１１５内で培養されてよく、細胞の第２の集団２２０２は、第２のチャンバ２１５４内の多孔膜２５００上で培養されうる。   FIG. 18 is a side view showing an embodiment of a cell culture device including a porous membrane support. Various embodiments of a cell culture device 2100 that incorporates a porous membrane support 2500 are shown in FIGS. A porous membrane support 2500 is placed in the apparatus across the housing (eg, coupled to one or more sidewalls 2120) to compartmentalize the interior of the housing into separate culture chambers 2152 and 2154. Is done. The first culture chamber 2152 includes a substrate that forms a structured surface that defines a gas permeable well 2200 in gas communication with the exterior of the apparatus. The upper part of the chamber 2152 is defined by the porous film 2500. The bottom of the second culture chamber 2154 is defined by the porous membrane 2500. Accordingly, the first population of cells 2200 may be cultured in a structured surface well 2115 formed by the substrate 2110 in the first chamber 2152, and the second population of cells 2202 Can be cultured on a porous membrane 2500 in two chambers 2154.

図１８〜２０に示される装置は、第１のチャンバ２１５２と連通した第１のポート２１６２、及び、第２のチャンバ２１５４と連通した第２のポート２１６４を備えている。追加の実施形態では、第１のチャンバ２１５２又は第２のチャンバ２１５４は、チャンバを通って液体が流れることができるように、必要に応じて、追加のポート（出口ポート、図示せず）を有しうる。ポート２１６２、２１６４は、例えば、下記図２１〜２３に関して図示及び論述されるポート（例えば、ポート２１６０）と同様のポートでありうる。ポート２１６２、２１６４は、図示されるように、装置２１００の同一の側にあって差し支えなく、両側にあってもよく、又は、チャンバ又はチャンバ２１５２、２１５４を通る流れに対して別のアクセスを提供するために、任意の他の適切な方式で方向づけられてもよい。   The apparatus shown in FIGS. 18-20 includes a first port 2162 that communicates with the first chamber 2152 and a second port 2164 that communicates with the second chamber 2154. In additional embodiments, the first chamber 2152 or the second chamber 2154 may have additional ports (exit ports, not shown) as needed to allow liquid to flow through the chambers. Yes. Ports 2162 and 2164 may be, for example, ports similar to those illustrated and discussed with respect to FIGS. 21-23 below (eg, port 2160). The ports 2162, 2164 can be on the same side of the device 2100 as shown, can be on either side, or provide separate access to the flow through the chamber or chambers 2152, 2154. May be oriented in any other suitable manner.

図１８では、装置は、上部空間がない（限度容量まで細胞培養培地で満たされている）状態で操作されるように示されている。図１９〜２０では、装置は、上部空間を有する（限度容量までは培養培地で満たされていない）状態で操作されるように示されている。支持体２５００の多孔性の性質に起因して、チャンバ２１５２は、培養培地で満たされたままの状態にあるが、チャンバ２１５４は、上部空間を有する又は有しない状態で操作されうる。ウェル２１１５のガス透過性の性質に起因して、細胞２２００の上の培地の高さは、例えば上述のように、重大な懸念事項ではないかもしれない。しかしながら、筐体が他の方法でガス透過性ではない場合、多孔膜支持体２５００上で培養された細胞の上の培地の高さを制限することが望ましいことがある。図２０に示されるように、多孔膜支持体２５００は、例えば上述のように、マイクロウェルのアレイを有する基材を形成しうる。   In FIG. 18, the device is shown to be operated in the absence of headspace (filled with cell culture medium to the limit volume). In FIGS. 19-20, the apparatus is shown to be operated with headspace (not filled with culture medium up to the limit volume). Due to the porous nature of the support 2500, the chamber 2152 remains filled with culture medium, but the chamber 2154 can be operated with or without headspace. Due to the gas permeable nature of the well 2115, the height of the medium above the cells 2200 may not be a significant concern, for example, as described above. However, it may be desirable to limit the height of the culture medium above the cells cultured on the porous membrane support 2500 if the housing is not otherwise gas permeable. As shown in FIG. 20, the porous membrane support 2500 can form a substrate having an array of microwells, for example, as described above.

図１８〜２０に示される実施形態によれば、細胞の２つ以上の集団の共培養が予定されている。例えば、細胞の第１の集団は第１のチャンバ２１５２内に存在しうると同時に、細胞の第２の集団は第２のチャンバ２１５４内に存在しうる。これらの細胞集団は、透過性の膜２５００によって隔てられうる。この膜は、細胞の第１の集団と細胞の第２の集団との化学連通を可能にする。実施形態において、これらの細胞集団のうちの１つ又は両方は、スフェロイドでありうる。例えば、図２０に示されるように、スフェロイド細胞２２００の第１の集団は、細胞培養基材のスフェロイドを誘発する幾何学形状に起因してスフェロイドを形成する第１のチャンバ２１５２内で増殖しうるとともに、第２の細胞培養チャンバ内に存在する細胞培養基材のスフェロイドを誘発する幾何学形状に起因してスフェロイドを形成するスフェロイド細胞２２０２の第２の集団もまた、第２のチャンバ２１５４内で増殖しうる。多孔膜２５００を通じて、スフェロイド細胞２２０２の第２の集団は、スフェロイド細胞２２００の第１の集団と化学連通している。このように、スフェロイド細胞の２つの別々の集団を互いに化学連通可能にしつつ、スフェロイド細胞の２つの別々の集団を共培養することが可能である。あるいは、実施形態において、図１８に示されるように、細胞の第１の集団は、第１の細胞培養チャンバ２１５２内で増殖するスフェロイド細胞であってよく、スフェロイド細胞ではない細胞の第２の集団（第２の細胞培養チャンバはスフェロイドを誘発する幾何学形状を有しないため）は、第２の細胞培養チャンバ２１５４内で増殖されうると同時に、多孔膜２５００の存在が細胞の第１及び第２の集団を互いに化学連通可能にする。図１９に示されるように、細胞の第２の集団は、上部空間の存在下で増殖されてよく、あるいは、図１８に示されるように、細胞の第２の集団は、上部空間の不存在下で増殖されてもよい。同様に、上部空間は、第１の細胞培養チャンバに存在してもしていなくてもよい。あるいは、スフェロイドを誘発する幾何学形状は、第１の細胞培養チャンバに存在してもしていなくてもよい。当業者は、これらの特徴の多くの組合せが、ユーザの細胞培養要求に応じて、望ましい場合があることを認識するであろう。   According to the embodiment shown in FIGS. 18-20, co-culture of two or more populations of cells is scheduled. For example, a first population of cells can be in the first chamber 2152, while a second population of cells can be in the second chamber 2154. These cell populations can be separated by a permeable membrane 2500. This membrane allows chemical communication between the first population of cells and the second population of cells. In embodiments, one or both of these cell populations can be spheroids. For example, as shown in FIG. 20, a first population of spheroid cells 2200 may grow in a first chamber 2152 that forms spheroids due to the geometry that induces the spheroids of the cell culture substrate. In addition, a second population of spheroid cells 2202 that form spheroids due to the geometry that induces the spheroids of the cell culture substrate present in the second cell culture chamber is also within the second chamber 2154. Can proliferate. Through the porous membrane 2500, the second population of spheroid cells 2202 is in chemical communication with the first population of spheroid cells 2200. In this way, two separate populations of spheroid cells can be co-cultured while allowing two separate populations of spheroid cells to be in chemical communication with each other. Alternatively, in an embodiment, as shown in FIG. 18, the first population of cells may be spheroid cells growing in the first cell culture chamber 2152 and a second population of cells that are not spheroid cells. (Since the second cell culture chamber does not have a spheroid-inducing geometry) can be grown in the second cell culture chamber 2154, while the presence of the porous membrane 2500 is the first and second of the cells. The group of people can communicate with each other. As shown in FIG. 19, the second population of cells may be grown in the presence of headspace, or, as shown in FIG. 18, the second population of cells is absent in the headspace. May be grown under. Similarly, the top space may or may not be in the first cell culture chamber. Alternatively, the geometry that induces the spheroids may or may not be present in the first cell culture chamber. One skilled in the art will recognize that many combinations of these features may be desirable depending on the user's cell culture requirements.

幾つかの実施形態では、装置の筐体はガス透過性である。例として、ガス透過性のフィルム又はバッグは、筐体の少なくとも一部を形成しうる。   In some embodiments, the device housing is gas permeable. By way of example, a gas permeable film or bag may form at least a portion of the housing.

幾つかの実施形態では、１つ以上のウェルは、少なくとも一部には、それらの画定された寸法及び形状に基づいて、画定された寸法の単一のスフェロイドを増殖するように構成される。スフェロイドは、それらがその中で培養されるウェルの幾何学形状によって課せられた寸法の許容限界まで拡大しうる。例えば、各ウェルは、スフェロイドをある特定の直径まで増殖可能にするマイクロウェル又は細胞培養容積を含みうる。言い換えれば、マイクロウェル又は細胞培養容積の幾何学的寸法は、スフェロイドの直径が最大値に達し、その最大値にとどまるように、スフェロイドの増殖を強制しうる。一貫した寸法のスフェロイドの産生は、アッセイ結果の再現性の改善にとって理想的でありうる、組織様の、非膨張性スフェロイドを生じうる。一貫性のあるスフェロイドの産生は、１つ以上のウェルの内部によって画成されるさまざまな形作られ、寸法決めされた容積（例えば、マイクロウェル又は細胞培養容積）の結果として生じうる。例えば、マイクロウェル又は細胞培養容積は、約２００マイクロメートル〜５００マイクロメートル又は前述の値内のいずれかの範囲（例えば、１００マイクロメートル〜２００マイクロメートル、１００マイクロメートル〜５００マイクロメートル、又は２００マイクロメートル〜７００マイクロメートル）など、約１００マイクロメートル〜約７００マイクロメートルの範囲の直径寸法を有しうる。マイクロウェル又は細胞培養容積は、約１００マイクロメートル〜５００マイクロメートル、又は前述の値内のいずれかの範囲など、約５０マイクロメートル〜約７００マイクロメートルの範囲の深さを有しうる。   In some embodiments, the one or more wells are configured to grow a single spheroid of defined dimensions based at least in part on their defined dimensions and shape. Spheroids can expand to the dimensional tolerances imposed by the geometry of the well in which they are cultured. For example, each well can include a microwell or cell culture volume that allows the spheroids to grow to a certain diameter. In other words, the geometric dimensions of the microwell or cell culture volume may force spheroid growth so that the diameter of the spheroids reaches a maximum and remains at that maximum. The production of consistently sized spheroids can result in tissue-like, non-expandable spheroids that can be ideal for improved reproducibility of assay results. Consistent spheroid production can occur as a result of various shaped and sized volumes (eg, microwells or cell culture volumes) defined by the interior of one or more wells. For example, the microwell or cell culture volume can be about 200 micrometers to 500 micrometers or any range within the foregoing values (eg, 100 micrometers to 200 micrometers, 100 micrometers to 500 micrometers, or 200 micrometers). May have a diameter dimension in the range of about 100 micrometers to about 700 micrometers, such as meters to 700 micrometers). The microwell or cell culture volume can have a depth in the range of about 50 micrometers to about 700 micrometers, such as about 100 micrometers to 500 micrometers, or any range within the aforementioned values.

図１９は、多孔膜支持体を含む細胞培養装置の追加的な実施形態を示す側面図である。図２０は、細胞の共培養を示す、多孔膜支持体を含む細胞培養装置の追加的な実施形態を示す側面図である。   FIG. 19 is a side view showing an additional embodiment of a cell culture device including a porous membrane support. FIG. 20 is a side view showing an additional embodiment of a cell culture device including a porous membrane support showing cell co-culture.

図２１に関して、複数の積層された細胞培養コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃを有する細胞培養装置１４００の実施形態が示されている。各細胞培養コンパートメントは、本明細書に記載のマイクロウェルのアレイを有する基材を備えうる。装置１４００は、そこを通って細胞培養培地が導入及び除去されうる開口部１４３５を有する充填マニホルド１４３０を備えている。充填マニホルド１４３０は、複数の開口（図示せず）を備えている。各細胞培養コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃは、開口部１４３５を通して導入される細胞培養培地が細胞培養コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃ内へと流れることができるように、マニホルド１４３０の開口と流体連通した少なくとも１つの開口（図示せず）を有する。装置１４００が細胞培養位置に方向づけられる場合、開口部１４３５は、キャップ（図示せず）などで覆われてよい。装置１４００はまた、必要に応じて、そこを通って空気、代謝ガスなどが流れうる開口部１４２５を画成する通気マニホルド１４２０を備えている。通気マニホルド１４２０は、複数の開口（図示せず）を備えている。各細胞培養コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃは、細胞培養代謝ガスが開口部１４２５を介して細胞培養チャンバの内部と装置の外部１４００との間で交換可能なように、マニホルド１４２０の開口とガス連通した少なくとも１つの開口（図示せず）を有する。装置１４００が細胞培養位置に方向づけられる場合、開口部１４２５は、通気キャップ（図示せず）、フィルタ（図示せず）などで覆われうる。   With reference to FIG. 21, an embodiment of a cell culture device 1400 having a plurality of stacked cell culture compartments 1410A, 1410B, 1410C is shown. Each cell culture compartment may comprise a substrate having an array of microwells as described herein. Apparatus 1400 includes a filling manifold 1430 having an opening 1435 through which cell culture medium can be introduced and removed. Fill manifold 1430 includes a plurality of openings (not shown). Each cell culture compartment 1410A, 1410B, 1410C has at least one in fluid communication with the opening in manifold 1430 so that the cell culture medium introduced through opening 1435 can flow into cell culture compartments 1410A, 1410B, 1410C. Has two openings (not shown). When the device 1400 is oriented to the cell culture position, the opening 1435 may be covered with a cap (not shown) or the like. The apparatus 1400 also includes a vent manifold 1420 that defines an opening 1425 through which air, metabolic gases, etc. can flow, if desired. The ventilation manifold 1420 includes a plurality of openings (not shown). Each cell culture compartment 1410A, 1410B, 1410C is in gas communication with an opening in manifold 1420 such that cell culture metabolic gases can be exchanged between the interior of the cell culture chamber and the exterior 1400 of the apparatus via opening 1425. At least one opening (not shown). When the device 1400 is oriented to a cell culture position, the opening 1425 can be covered with a vent cap (not shown), a filter (not shown), or the like.

次に、図２２を参照すると、図２１に示されるタイプの装置でありうる、細胞培養装置１４００の断面図が示されている。装置１４００は、各々が上述のガス透過性のウェルのアレイを有する構造化された表面を画成する基材１１１０を有する、複数の積層された細胞培養コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃを有する。図２２に示す実施形態では、積層における最上部のコンパートメント１４１０Ａを除き、各コンパートメント（例えば、１４１０Ｂ、１４１０Ｃ）は、隣接するコンパートメントの構造化された基材１１１０の第２の主面によって画成される上面１４５０を有する。例えば、コンパートメント１４１０Ｂの基材１１１０の第２の主面は、コンパートメント１４１０Ｃの上部内面としての役割をする。したがって、隣接するコンパートメントの内部は、底部の構造化された表面／上面を形成する一般的な基材１１１０を通じて、互いにガス連通する。最上部のコンパートメント１４１０は、プレートでありうる、上部によって形成された上部内面１４５０を有している。   Referring now to FIG. 22, there is shown a cross-sectional view of a cell culture device 1400 that can be an apparatus of the type shown in FIG. The apparatus 1400 has a plurality of stacked cell culture compartments 1410A, 1410B, 1410C, each having a substrate 1110 defining a structured surface having an array of gas permeable wells as described above. In the embodiment shown in FIG. 22, except for the top compartment 1410A in the stack, each compartment (eg, 1410B, 1410C) is defined by the second major surface of the structured substrate 1110 of the adjacent compartment. And has an upper surface 1450. For example, the second main surface of the base material 1110 of the compartment 1410B serves as the upper inner surface of the compartment 1410C. Thus, the interiors of adjacent compartments are in gas communication with each other through a generic substrate 1110 that forms the bottom structured surface / top. The top compartment 1410 has a top inner surface 1450 formed by the top, which can be a plate.

コンパートメント（例えば、コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃ）の内部は、マイクロウェルのアレイを有する基材（例えば、図９に示されるアレイ１００）、上記コンパートメントの基材の外部の第２の主面によって画成される上面、及び、１つ以上の側壁１４４０によって画成される。１つ以上の側壁１４４０は、マニホルド１４２０によって画成された１つ以上の開口部１４２５、１４２６を介して装置の外部と連通した、マニホルド１４２０によって画成された通気カラム１４２９と連通した通気開口１４４２を有する。通気開口１４４２は、装置が細胞培養に方向付けられる場合（例えば、図２２に示されるように）、細胞培養チャンバの内部に存在しうる細胞培養培地１３００の最大容積を画成する。コンパートメント内の細胞培養培地の容積は、最大未満でありうる。通気開口１４４２はまた、細胞培養コンパートメントの内部の最小上部空間容積も画成する。コンパートメントの内部の上部空間の容積は、最小上部空間容積より大きくなりうる（細胞培養培地容積が最大の培地容積未満の場合）。   The interior of the compartment (eg, compartments 1410A, 1410B, 1410C) is defined by a substrate having an array of microwells (eg, array 100 shown in FIG. 9), a second major surface outside the compartment substrate. Defined by an upper surface formed and one or more sidewalls 1440. One or more sidewalls 1440 communicate with the exterior of the device through one or more openings 1425, 1426 defined by manifold 1420 and vent opening 1442 in communication with vent column 1429 defined by manifold 1420. Have Vent opening 1442 defines the maximum volume of cell culture medium 1300 that may be present inside the cell culture chamber when the device is directed to cell culture (eg, as shown in FIG. 22). The volume of cell culture medium in the compartment can be less than the maximum. Vent opening 1442 also defines a minimum headspace volume within the cell culture compartment. The volume of the headspace inside the compartment can be greater than the minimum headspace volume (if the cell culture medium volume is less than the maximum medium volume).

したがって、隣接するチャンバ（例えば、チャンバ１４１０Ｃ）の上のチャンバ（例えば、チャンバ１４１０Ｂ）の基材１１１０によって画成される構造化された表面のウェル内で培養される細胞は、ガス透過性のウェルを介して、隣接するチャンバ（例えば、チャンバ１４１０Ｃ）の上部空間１４４１とガス連通する。上部空間１４４１は、１つ以上の開口部１４２５、１４２６を介して装置の外部と連通した、マニホルドによって画成されるカラム１４２９と連通している。   Thus, cells cultured in a structured surface well defined by a substrate 1110 in a chamber (eg, chamber 1410B) above an adjacent chamber (eg, chamber 1410C) are gas permeable wells. Through the upper space 1441 of the adjacent chamber (for example, chamber 1410C). The upper space 1441 communicates with a column 1429 defined by a manifold that communicates with the exterior of the apparatus through one or more openings 1425, 1426.

随意的なフィルタ１４２７は、代謝ガスを通気するために、開口部１４２５又はキャップ１４２２内に導入されうる。装置の底部に通気孔を有することは、幾つかの実施形態では有利でありうる。例えば、代謝廃棄物ガスの二酸化炭素は大気よりも高密度であり、底部の通気孔を有しない培養装置の底部において最高濃度となる勾配を形成する傾向にある。したがって、装置の底部における通気孔の存在（例えば、通気カラム１４２９及び開口部１４２６によって形成される）は、廃棄物二酸化炭素の装置外への移動を促進しうる。   An optional filter 1427 may be introduced into the opening 1425 or cap 1422 to vent metabolic gases. Having a vent at the bottom of the device may be advantageous in some embodiments. For example, carbon dioxide, which is a metabolic waste gas, has a higher density than the atmosphere and tends to form a gradient with the highest concentration at the bottom of a culture device that does not have a bottom vent. Thus, the presence of vents at the bottom of the device (eg, formed by vent column 1429 and opening 1426) can facilitate the movement of waste carbon dioxide out of the device.

次に、図２３を参照すると、図２１に示されるタイプの装置でありえ、かつ、図２２に示される装置の一部でありうる、細胞培養装置１４００の断面図が示されている。図２３における各参照番号が明確に論じられない限り、図２２に関して上に述べた同様に番号付けされた構成要素の説明を参照されたい。例証される実施形態において、コンパートメント（例えば、コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃ）の内部は、基材１１１０の内部の構造化された表面、上記コンパートメントの基材の外面によって画成される上面、及び１つ以上の側壁１４４０によって画成される。１つ以上の側壁１４４０は、装置が細胞培養に方向付けられる場合、キャップ１４３２によって覆われうる、マニホルド１４３０によって画成される開口部１４３５を介して装置の外部と連通した、充填マニホルド１４３０によって画成されるカラム１４３９と連通した開口１４４３を有する。細胞培養培地１３００は、装置の操作によって、カラム１４３９及び開口部１４３５を介して、細胞培養コンパートメント（例えば、コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃ）内に導入又は細胞培養コンパートメントから除去されうる。   Referring now to FIG. 23, there is shown a cross-sectional view of a cell culture device 1400 that can be an apparatus of the type shown in FIG. 21 and can be part of the apparatus shown in FIG. Unless each reference number in FIG. 23 is specifically discussed, reference is made to the description of similarly numbered components described above with respect to FIG. In the illustrated embodiment, the interior of a compartment (eg, compartments 1410A, 1410B, 1410C) includes a structured surface within substrate 1110, a top surface defined by the exterior surface of the compartment substrate, and 1 Defined by one or more sidewalls 1440. One or more sidewalls 1440 are defined by a filling manifold 1430 in communication with the exterior of the device through an opening 1435 defined by a manifold 1430 that can be covered by a cap 1432 when the device is directed to cell culture. And an opening 1443 communicating with the formed column 1439. Cell culture medium 1300 can be introduced into or removed from the cell culture compartment (eg, compartments 1410A, 1410B, 1410C) via column 1439 and opening 1435 by operation of the device.

次に、図２４Ａ及び２４Ｂを参照すると、複数のトレイが互いの上部に積層される場合に、細胞培養コンパートメント（例えば、図２１〜２３に示されるコンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃ）を形成する役割をしうる、トレイ１４１５の概略的な底面図（２４Ａ）及び概略的な斜視図（２４Ｂ）が示されている。トレイ１４１５は、マイクロウェルのアレイを有する基材を画成する、基材１１１０から延びる側壁１４４０Ａ、１４４０Ｂ、１４４０Ｃ、１４４０Ｄを備えている。幾つかの実施形態では、トレイは、単一の取り囲む側壁（図示せず）を備えている。部分的な高さの壁１４７２は、側壁１４４０Ａ及び側壁１４４０Ｄに連結している。部分的な高さの壁１４７２及び側壁１４４０Ａ、１４４０Ｄは、通気開口１４４２を取り囲み、それを画成する。細胞培養装置が積層されたトレイから組み立てられる場合、トレイ１４１５によって形成されたチャンバの内部の代謝ガスは、部分的な壁１４７２を越えて、開口１４４２を通って流れうる。積層されたトレイ１４１５の通気開口１４４２、部分的な壁１４７２及び連結する側壁は、通気カラム（例えば、図２２に示される通気カラム１４２９）の少なくとも一部を形成しうる。   Next, referring to FIGS. 24A and 24B, when multiple trays are stacked on top of each other, they serve to form cell culture compartments (eg, compartments 1410A, 1410B, 1410C shown in FIGS. 21-23). A schematic bottom view (24A) and a schematic perspective view (24B) of a tray 1415 are shown. Tray 1415 includes sidewalls 1440A, 1440B, 1440C, 1440D extending from substrate 1110 that define a substrate having an array of microwells. In some embodiments, the tray comprises a single surrounding sidewall (not shown). Partial height wall 1472 is connected to side wall 1440A and side wall 1440D. Partial height wall 1472 and side walls 1440A, 1440D surround and define the vent opening 1442. When the cell culture device is assembled from stacked trays, metabolic gas inside the chamber formed by tray 1415 can flow through opening 1442 beyond partial wall 1472. The vent openings 1442, the partial walls 1472, and the connecting sidewalls of the stacked trays 1415 can form at least a portion of a vent column (eg, the vent column 1429 shown in FIG. 22).

トレイ１４１５はまた、側壁１４４０Ａ及び側壁１４４０Ｂに連結した部分的な高さの壁１４７３も備えている。部分的な高さの壁１４７３及び側壁１４４０Ａ、１４４０Ｂは、充填開口１４４３を取り囲み、それを画成する。細胞培養装置が積層されたトレイから組み立てられる場合、培養培地は、組み立てられた装置の操作によって、部分的な壁１４７３を越えて、充填開口１４４３を通って、トレイ１４１５によって形成されたチャンバの内部に導入され又はそこから除去されうる。積層されたトレイ１４１５の充填開口１４４３、部分的な壁１４７３及び連結する側壁は、充填カラム（例えば、図２３に示される充填カラム１４３９）の少なくとも一部を形成しうる。   The tray 1415 also includes a partial height wall 1473 connected to the side wall 1440A and the side wall 1440B. Partial height walls 1473 and side walls 1440A, 1440B surround and define the fill opening 1443. When the cell culture device is assembled from stacked trays, the culture medium passes through the filling opening 1443, over the partial wall 1473, by operation of the assembled device, and into the interior of the chamber formed by the tray 1415. Can be introduced into or removed from. The packed opening 1443, partial wall 1473, and connecting sidewalls of the stacked tray 1415 can form at least a portion of a packed column (eg, packed column 1439 shown in FIG. 23).

部分的な壁１４７３の高さは、トレイ１４１５によって形成された細胞培養コンパートメント内に含まれうる、細胞培養培地の最大の高さ及び容積を画成する。部分的な壁１４７３の上部は、構造化された表面を形成する基材１１１０から任意の適切な距離にありうる。幾つかの実施形態では、距離は、下記のいずれか２つの間の範囲を含む、６、７、８、９、１０、１２、１５、又は２０ｍｍなど、５ｍｍ以上である。このようなトレイから組み立てられた細胞培養装置の構造化された表面のガス透過性のウェルが、装置の外部と連通していることから、細胞の上の細胞培養培地の高さは、ガス交換が主に細胞培養培地を通して生じる、通常の細胞培養装置を用いた場合に利用できる高さよりも高くなりうる。   The height of the partial wall 1473 defines the maximum height and volume of the cell culture medium that can be contained within the cell culture compartment formed by the tray 1415. The top of the partial wall 1473 can be at any suitable distance from the substrate 1110 that forms the structured surface. In some embodiments, the distance is 5 mm or more, such as 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, or 20 mm, including a range between any two of the following: Because the gas permeable wells on the structured surface of the cell culture device assembled from such trays communicate with the outside of the device, the height of the cell culture medium above the cells is gas exchange Can occur above the height available when using normal cell culture equipment, which occurs primarily through the cell culture medium.

部分的な壁１４７２の上部から基材１１１０までの距離は、部分的な壁１４７３の上部から基材１１１０までの距離と同一又はそれ以上でありうる。したがって、コンパートメントが培養培地を過充填される場合、過剰の培地は、通気開口１４４２よりはむしろ、充填開口１４４３を通して排出される。通気カラムに底部フィルタ（図２２のフィルタ１４２７など）を採用する実施形態では、底部フィルタは、培地で汚染されないであろう。当然ながら、組み立てられた装置の適切な操作によっても、底部フィルタの培地による汚染を防ぐことができよう。   The distance from the top of the partial wall 1472 to the substrate 1110 can be the same as or greater than the distance from the top of the partial wall 1473 to the substrate 1110. Thus, if the compartment is overfilled with culture medium, excess medium is drained through the fill opening 1443 rather than through the vent opening 1442. In embodiments that employ a bottom filter (such as filter 1427 in FIG. 22) in the aeration column, the bottom filter will not be contaminated with media. Of course, proper operation of the assembled device could also prevent contamination of the bottom filter by the medium.

次に、図２５を参照すると、複数の積層された細胞培養コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃを有する細胞培養装置１４００の実施形態の概略的な側面図が示されている。各コンパートメントは、上述の構造化された表面を画成する基材１１１０を含みうる。装置１４００は、構造化された表面を形成する基材１１１０に隣接して位置づけられ、かつ、チャンバの外部への空気流のための通路を提供する、スペーサ１５００を備えており、該通路は「導管空間」（例えば、導管空間１４６０Ａ、１４６０Ｂ、１４６０Ｃ）と称される。構造化された表面は、細胞がその中で培養されうるガス透過性のウェルを画成することから、代謝ガスはウェルを通して、装置の外部１４００までスペーサ１５００によって画成される導管空間１４６０Ａ、１４６０Ｂ、１４６０Ｃへと交換されうる。装置１４００はまた、細胞培養培地がそこを通って導入又は除去されうる開口部を画成するマニホルド１４３０も備えている。マニホルド１４３０は、複数の開口（図示せず）を備えている。各細胞培養コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃは、マニホルド１４３０を通って導入される細胞培養培地が細胞培養コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃ内に流れうるように、マニホルド１４３０の開口と流体連通した少なくとも１つの開口（図示せず）を有する。   Referring now to FIG. 25, a schematic side view of an embodiment of a cell culture device 1400 having a plurality of stacked cell culture compartments 1410A, 1410B, 1410C is shown. Each compartment may include a substrate 1110 that defines the structured surface described above. The apparatus 1400 includes a spacer 1500 positioned adjacent to a substrate 1110 forming a structured surface and providing a passage for air flow to the exterior of the chamber, the passage “ Referred to as “conduit space” (eg, conduit spaces 1460A, 1460B, 1460C). Since the structured surface defines a gas permeable well in which the cells can be cultured, the metabolic gas passes through the well and the conduit spaces 1460A, 1460B defined by the spacer 1500 to the exterior 1400 of the device. , 1460C. The apparatus 1400 also includes a manifold 1430 that defines an opening through which the cell culture medium can be introduced or removed. Manifold 1430 includes a plurality of openings (not shown). Each cell culture compartment 1410A, 1410B, 1410C has at least one opening in fluid communication with an opening in manifold 1430 so that cell culture medium introduced through manifold 1430 can flow into cell culture compartments 1410A, 1410B, 1410C. (Not shown).

図２５における細胞培養装置１４００の底部は、スペーサ１５００がその上に配置されたプレート１５１０を備えている。実施形態において、プレート１５１０及びスペーサ１５００は、成形されたパーツなど、単一化されたパーツである。このようなプレートは、他の細胞培養コンパートメント（例えば、コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃ）の上面を形成しうる。各コンパートメントについて、１つ以上の側壁１４４０は、構造化された表面を画成する基材１１００から上面まで延び、この上面は、スペーサを備えたプレートから形成されうる。ポート１４３０の開口（図示せず）と連通した開口（図示せず）は、側壁によって画成されうる。   The bottom of the cell culture device 1400 in FIG. 25 includes a plate 1510 on which a spacer 1500 is disposed. In an embodiment, the plate 1510 and the spacer 1500 are unitized parts, such as molded parts. Such a plate may form the upper surface of other cell culture compartments (eg, compartments 1410A, 1410B, 1410C). For each compartment, one or more sidewalls 1440 extend from a substrate 1100 that defines a structured surface to the top surface, which may be formed from a plate with spacers. An opening (not shown) in communication with an opening (not shown) in port 1430 may be defined by the sidewall.

積層された細胞培養トレイ又はチャンバは、任意の適切な方式で組み立てられうる。例えば、このような構成要素は、溶接技法（例えば、熱、レーザ、長波ＩＲ又は超音波溶接など）、接着、溶剤接合などを使用して接合されうる。   The stacked cell culture trays or chambers can be assembled in any suitable manner. For example, such components can be joined using welding techniques (eg, heat, laser, long wave IR or ultrasonic welding, etc.), adhesion, solvent bonding, and the like.

幾つかの実施形態では、構造化された表面は、バッグに連結される。細胞培養に適したバッグは、加熱封止、レーザ溶接、接着剤の塗布、又は膨張式のバッグ製造の分野で知られたいずれかの他の方法によって、フィルムから形成されうる。バッグの壁又はそれらの一部は、壁を横切るガスの効率的な移動を可能にする厚さを有しうる。所望の厚さは、壁を形成する材料に応じて変化しうると解されたい。例として、壁又は壁を形成するフィルムは、約０．０２ミリメートル〜０．８ミリメートルの厚さでありうる。バッグは、細胞の培養に適した任意の材料から作製されうる。さまざまな実施形態において、バッグは、該バッグ内で培養された細胞の目視検査を可能にするために、場合に応じて透明な材料から形成される。バッグの形成に用いられうる、場合に応じて透明な、ガス透過性材料の例としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ（エチレン−酢酸ビニル）、ポリスルホン、ポリメチルペンテン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）又は相容性のフッ素ポリマー、シリコーンゴム又は共重合体、ポリ（スチレン−ブタジエン−スチレン）；又は、ポリエチレン又はポリプロピレンなどのポリオレフィン；若しくはこれらの材料の組合せが挙げられる。   In some embodiments, the structured surface is coupled to a bag. Bags suitable for cell culture can be formed from the film by heat sealing, laser welding, adhesive application, or any other method known in the field of inflatable bag manufacturing. The walls of the bag or portions thereof may have a thickness that allows for efficient movement of gas across the wall. It should be understood that the desired thickness can vary depending on the material forming the wall. By way of example, the wall or film forming the wall can be about 0.02 millimeters to 0.8 millimeters thick. The bag can be made from any material suitable for culturing cells. In various embodiments, the bag is optionally formed from a transparent material to allow visual inspection of cells cultured in the bag. Examples of optionally gas permeable materials that can be used to form bags include polystyrene, polycarbonate, poly (ethylene-vinyl acetate), polysulfone, polymethylpentene, polytetrafluoroethylene (PTFE) or Compatible fluoropolymers, silicone rubbers or copolymers, poly (styrene-butadiene-styrene); or polyolefins such as polyethylene or polypropylene; or combinations of these materials.

本明細書に記載される細胞培養装置は、構造化された表面のウェル内で細胞を培養するために用いられうる。上述のように、装置内の細胞培養培地は、細胞の上の任意の適切な高さで存在しうる。幾つかの実施形態では、細胞の上（例えば、ウェルの上部又は底の上）の装置における細胞培養培地の高さは、約５ｍｍ以上である。幾つかの実施形態では、細胞の上（例えば、ウェルの上部又は底の上）の装置における細胞培養培地の高さは、約６ｍｍ以上、約７ｍｍ以上、約８ｍｍ以上、約９ｍｍ以上又は約１０ｍｍ以上である。   The cell culture devices described herein can be used to culture cells in structured surface wells. As mentioned above, the cell culture medium in the device can be present at any suitable height above the cells. In some embodiments, the height of the cell culture medium in the device above the cells (eg, above the top or bottom of the well) is about 5 mm or greater. In some embodiments, the height of the cell culture medium in the device above the cells (eg, above the top or bottom of the well) is about 6 mm or more, about 7 mm or more, about 8 mm or more, about 9 mm or more, or about 10 mm. That's it.

ウェルのガス透過性の理由から、細胞培養培地のこのような高さは、細胞を健康な状態に維持するために用いられうる。したがって、本明細書に記載の装置内で培養された細胞は、このような高さの細胞培養培地とともに、長期間、培養されうる。例えば、細胞は、このような高さの培地とともに、２４時間以上、４８時間以上、７２時間以上、９６時間以上、又は、培地が交換されるまで、連続的に培養されうる。   For reasons of gas permeability of the well, such height of the cell culture medium can be used to keep the cells healthy. Accordingly, cells cultured in the devices described herein can be cultured for a long period of time with such high cell culture media. For example, cells can be cultivated continuously with such high media for 24 hours or more, 48 hours or more, 72 hours or more, 96 hours or more, or until the media is changed.

ウェルが細胞に対して非接着性の実施形態では、細胞は、重力によって細胞をウェルから移動可能にするために装置を反転させることによって、採取されうる。   In embodiments where the well is non-adherent to the cell, the cell can be harvested by inverting the device to allow the cell to move out of the well by gravity.

幾つかの実施形態では、多孔膜は、同一装置内であるが、装置の外部とガス連通した構造化された表面上で培養された第１の細胞型とは分離して、第２の細胞型の増殖を支援するために（又は、同一の型の追加の細胞の増殖を支援するために）、本明細書に記載される細胞培養装置内に配置される。幾つかの実施形態では、幹細胞は、装置の外部と連通したガス透過性のウェルを有する構造表面で培養され、支持細胞が、多孔膜上で培養される。当然ながら、このような装置を使用して、細胞とコンパートメント化の任意の他の所望される組合せも採用されうる。   In some embodiments, the porous membrane is in the same device, but separate from the first cell type cultured on a structured surface in gas communication with the exterior of the device and the second cell To support the growth of the mold (or to support the growth of additional cells of the same type), it is placed in the cell culture device described herein. In some embodiments, stem cells are cultured on a structured surface having gas permeable wells in communication with the exterior of the device, and feeder cells are cultured on the porous membrane. Of course, any other desired combination of cell and compartmentalization may be employed using such a device.

多孔膜は、筐体を２つの増殖チャンバへとコンパートメント化するために、細胞培養装置の筐体内に配置されうる。好ましくは、透過性の膜は、膜を通じた細胞移動を制限するが、生体分子の通過を可能にする。多孔膜の形成に用いられうる材料の例としては、トラックエッチドメンブレン若しくは、織られた又は織られていない多孔質の材料が挙げられる。多孔膜の材料は、細胞に対してより接着性又はより非接着性にするために処理又はコーティングされうる。処理は、プラズマ放電、コロナ放電、ガスプラズマ放電、イオン衝撃、電離放射、及び高輝度ＵＶ光線を含む、当技術分野で知られたあらゆる方法によって達成されうる。コーティングは、印刷、噴霧、凝縮（condensation）、放射エネルギー、イオン化法又は浸漬を含む、当技術分野で知られた任意の適切な方法によって導入することができる。コーティングは、次に、共有又は非共有のいずれかの結合部位を提供しうる。このような部位は、細胞培養成分（例えば、増殖又は接着を促進するタンパク質）などの部分を結合させるために用いられうる。さらには、コーティングはまた、細胞（例えば、ポリリシン）の結合を高めるために用いられうる。あるいは、上述の細胞非接着性のコーティングは、細胞結合を防止又は抑制するために用いられうる。幾つかの実施形態では、多孔膜は、複数のガス透過性のウェルを画成する構造化された表面を形成する基材に関して上述されるような複数のウェルを有する構造化された表面を有するように製作されうる。しかしながら、この事例では、多孔膜材料は、構造化された表面を有するように形成される。   The porous membrane can be placed within the housing of the cell culture device to compartmentalize the housing into two growth chambers. Preferably, the permeable membrane limits cell migration through the membrane but allows the passage of biomolecules. Examples of materials that can be used to form the porous membrane include track-etched membranes or woven or non-woven porous materials. The porous membrane material can be treated or coated to make it more or less adhesive to the cells. Processing can be accomplished by any method known in the art, including plasma discharge, corona discharge, gas plasma discharge, ion bombardment, ionizing radiation, and high intensity UV light. The coating can be introduced by any suitable method known in the art, including printing, spraying, condensation, radiant energy, ionization, or dipping. The coating can then provide either covalent or non-covalent binding sites. Such sites can be used to attach moieties such as cell culture components (eg, proteins that promote growth or adhesion). Furthermore, the coating can also be used to enhance cell (eg, polylysine) binding. Alternatively, the non-cell-adhesive coating described above can be used to prevent or inhibit cell binding. In some embodiments, the porous membrane has a structured surface with a plurality of wells as described above with respect to a substrate that forms a structured surface that defines a plurality of gas permeable wells. Can be made as follows. However, in this case, the porous membrane material is formed to have a structured surface.

構造化された表面のガス透過性のウェル（例えば、上述のもの）は、細胞増殖を可能にするように装置を配置したインキュベータ内のガス濃度を調節することによって、酸素張力を制御可能にする。透過性の膜支持体は、生物学的に活性な成分の移動を可能にしつつ、異なる細胞集団を物理的に分離する方法を提供する。   Structured surface gas permeable wells (eg, those described above) allow oxygen tension to be controlled by adjusting the gas concentration in an incubator where the device is positioned to allow cell growth . A permeable membrane support provides a method of physically separating different cell populations while allowing the transfer of biologically active components.

多孔膜は、任意の適切な方式で装置の筐体（例えば、側壁等）に取り付けられうる。例えば、多孔膜は、上述の複数のガス透過性のウェルを有する構造化された表面を画成する基材を形成する基材の導入と同様の方式で装置内に導入されうる。   The porous membrane can be attached to the device housing (eg, a sidewall, etc.) in any suitable manner. For example, the porous membrane can be introduced into the apparatus in a manner similar to the introduction of a substrate that forms a substrate that defines a structured surface having a plurality of gas permeable wells as described above.

図２６に示す実施形態では、細胞培養装置３１００は、フレーム３１１３によって取り囲まれたプレート３１１１内にウェル３１１５を有する９６−ウェルマルチウェルプレートである。しかしながら、上述のように、細胞培養装置は、適切な数のウェルを有しうる（例えば、３、６、１２、９６、又は任意の他の数のウェルが提供されうる）。図示された実施形態では、複数のウェル３１１５の各々の少なくとも一部は、マイクロウェルのアレイを有する基材を備え、かつ、上述のスフェロイドを形成するための位置を提供する。細胞の培養に使用されるウェルを有する、ほとんどあらゆる種類の細胞培養装置は、幾つかの実施形態では、ウェルの全容積を形成することができ、あるいは、幾つかの実施形態では、ウェルの細胞培養部分容積（sub-volume）を形成することができる、マイクロウェルのアレイを有する基材を採用することによって、設計されうる。幾つかの実施形態では、マイクロウェルの設計がそれを用いて実施されうる細胞培養装置は、例えば、９６−ウェルマルチウェルプレート、３８４−ウェルマルチウェルプレート、１５３６−ウェルマルチウェルプレートなどのマルチウェルプレートでありうる。幾つかの実施形態では、マルチウェルプレートの少なくとも表面はガス透過性である。   In the embodiment shown in FIG. 26, the cell culture device 3100 is a 96-well multiwell plate having wells 3115 in a plate 3111 surrounded by a frame 3113. However, as described above, the cell culture device may have an appropriate number of wells (eg, 3, 6, 12, 96, or any other number of wells may be provided). In the illustrated embodiment, at least a portion of each of the plurality of wells 3115 includes a substrate having an array of microwells and provides a location for forming the spheroids described above. Almost any type of cell culture device having wells used for culturing cells can form the entire volume of the well in some embodiments, or in some embodiments, cells in the well It can be designed by employing a substrate with an array of microwells that can form a sub-volume of culture. In some embodiments, a cell culture device with which a microwell design can be implemented is a multiwell such as, for example, a 96-well multiwell plate, a 384-well multiwell plate, a 1536-well multiwell plate, etc. It can be a plate. In some embodiments, at least the surface of the multiwell plate is gas permeable.

スフェロイドが形成されるように細胞を凝集可能にする複数のウェルの能力、並びに、複数のウェルにわたって一貫性のある寸法を維持するようにスフェロイドを複数のウェルの各々内に形成可能にする能力は、任意の適切な方式で達成されうる。例えば、複数のウェル３１１５は、細胞がその中でスフェロイド５００として増殖する図１〜５、又は１６に示されるマイクロウェルのように構造化及び配置されたマイクロウェルのアレイを備えうる。   The ability of multiple wells to allow cells to aggregate so that spheroids are formed, as well as the ability to allow spheroids to be formed within each of multiple wells to maintain consistent dimensions across multiple wells. Can be achieved in any suitable manner. For example, the plurality of wells 3115 can comprise an array of microwells structured and arranged like the microwells shown in FIGS. 1-5 or 16 in which cells grow as spheroids 500.

幾つかの実施形態では、１つ以上のウェルは、少なくとも一部には、それらの画定された寸法及び形状に基づいて、画定された寸法の単一のスフェロイドを増殖させるように構成される。スフェロイドは、それらがその中で培養されるウェルの幾何学形状によって課せられた寸法の許容限界まで拡大しうる。例えば、各ウェルは、スフェロイドをある特定の直径まで成長可能にするマイクロウェル又は細胞培養容積を備えうる。言い換えれば、マイクロウェル又は細胞培養容積の幾何学的寸法は、スフェロイドの直径が最大値に達し、その最大値にとどまるように、スフェロイドの成長を強いることができる。一貫した大きさのスフェロイドの生成は、アッセイ結果の再現性を改善するために理想的でありうる、組織様の非膨張性スフェロイドを結果的に生じうる。一貫性のあるスフェロイドの生成は、１つ以上のウェルの内部によって画成された、さまざまな形作られ、かつ寸法決めされた容積（例えば、マイクロウェル又は細胞培養容積）の結果でありうる。例えば、マイクロウェル又は細胞培養容積は、約２００マイクロメートル〜５００マイクロメートル又は前述の値内のいずれかの範囲（例えば、１００マイクロメートル〜２００マイクロメートル、１００マイクロメートル〜５００マイクロメートル、又は２００マイクロメートル〜７００マイクロメートル）など、約１００マイクロメートル〜約７００マイクロメートルの範囲の直径寸法を有しうる。マイクロウェル又は細胞培養容積は、約１００マイクロメートル〜５００マイクロメートル、又は前述の値内のいずれかの範囲など、約５０マイクロメートル〜約７００マイクロメートルの範囲の深さを有しうる。   In some embodiments, the one or more wells are configured to grow a single spheroid of defined dimensions based at least in part on their defined dimensions and shape. Spheroids can expand to the dimensional tolerances imposed by the geometry of the well in which they are cultured. For example, each well may comprise a microwell or cell culture volume that allows spheroids to grow to a certain diameter. In other words, the geometric dimensions of the microwell or cell culture volume can force spheroid growth so that the spheroid diameter reaches a maximum value and remains at that maximum value. The generation of consistently sized spheroids can result in tissue-like non-expandable spheroids that can be ideal for improving the reproducibility of assay results. Consistent spheroid production can be the result of various shaped and sized volumes (eg, microwells or cell culture volumes) defined by the interior of one or more wells. For example, the microwell or cell culture volume can be about 200 micrometers to 500 micrometers or any range within the foregoing values (eg, 100 micrometers to 200 micrometers, 100 micrometers to 500 micrometers, or 200 micrometers). May have a diameter dimension in the range of about 100 micrometers to about 700 micrometers, such as meters to 700 micrometers). The microwell or cell culture volume can have a depth in the range of about 50 micrometers to about 700 micrometers, such as about 100 micrometers to 500 micrometers, or any range within the aforementioned values.

本明細書に記載の複数のウェルの各々は、その中に堆積された細胞がスフェロイドを形成するように補助しうる。複数のウェルの各々はまた、各スフェロイドの直径を、約、例えば、５００マイクロメートル以下、４００マイクロメートル以下、３００マイクロメートル以下、２５０マイクロメートル以下、１５０マイクロメートル以下等又は前述の値内のいずれかの範囲（例えば、１５０〜２５０、１５０〜３００、１５０〜４００、１５０〜５００、２５０〜３００、２５０〜４００等）の値に制限又は強いることができる。幾つかの実施形態では、複数のウェルの各々は、該複数のウェル内で増殖したすべてのスフェロイドの平均直径とは、約、例えば、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、２％以下等又は前述の値内のいずれかの範囲だけ異なる直径によって画成されたスフェロイドを形成する。   Each of the plurality of wells described herein can assist the cells deposited therein to form spheroids. Each of the plurality of wells also has a diameter of each spheroid of about, for example, 500 micrometers or less, 400 micrometers or less, 300 micrometers or less, 250 micrometers or less, 150 micrometers or less, or any of the above values Such a range (for example, 150 to 250, 150 to 300, 150 to 400, 150 to 500, 250 to 300, 250 to 400, etc.) can be limited or enforced. In some embodiments, each of the plurality of wells has an average diameter of all spheroids grown in the plurality of wells of about, for example, 20% or less, 15% or less, 10% or less, 5% or less. Form spheroids defined by different diameters by less than 2% etc. or any range within the aforementioned values.

図２７〜２９に示される実施形態では、マイクロウェル３１１５のアレイは、基材３１１０内に形成される。複数のウェル３１１５の各々は、上部開口３１１８、底面３１１２、及び、上部開口３１１８から底面３１１２まで延びる側壁表面３１２０を有しうる。加えて、側壁表面３１２０は、上部開口３１１８と底面３１１２の間に、ウェルの底部における縮小された領域がペンの先端のように見えるためにそのように呼ばれる、ペン先領域３１１６（図２９参照）を画成しうる。ペン先領域は、スフェロイドを誘発する幾何学形状をしている。   In the embodiment shown in FIGS. 27-29, an array of microwells 3115 is formed in the substrate 3110. Each of the plurality of wells 3115 can have a top opening 3118, a bottom surface 3112, and a sidewall surface 3120 that extends from the top opening 3118 to the bottom surface 3112. In addition, the sidewall surface 3120 is referred to as a nib region 3116 (see FIG. 29) between the top opening 3118 and the bottom surface 3112 so that the reduced area at the bottom of the well looks like the tip of a pen. Can be defined. The nib region has a geometric shape that induces spheroids.

複数のウェル３１１５の各々の上部開口３１１８は、そこを通って細胞を複数のウェル３１１５の各々に播種するための開口部として利用されうる。上部開口３１１８は、さまざまな異なる形状及び寸法を有しうる。例えば、上部開口３１１８は、円形、楕円形、正方形、矩形、六角形、四辺形等である、形状によって画成されうる。上部開口３１１８はまた、直径寸法（形状に応じて、例えば、直径、幅等）によっても画成されうる。上部開口３１１８の直径寸法は、最も幅の広い地点における、上部開口を横切る距離として定義されうる。上部開口３１１８の直径寸法は、約、例えば、３００マイクロメートル以上、５００マイクロメートル以上、８００マイクロメートル以上、１０００マイクロメートル以上、１５００マイクロメートル以上、２０００マイクロメートル以上等、又は、７０００マイクロメートル以下、６０００マイクロメートル以下、４０００マイクロメートル以下、２５００マイクロメートル以下、１７００マイクロメートル以下、１２００マイクロメートル以下等、若しくは前述の値内のいずれかの範囲でありうる。   The upper opening 3118 of each of the plurality of wells 3115 can be used as an opening through which cells are seeded in each of the plurality of wells 3115. The top opening 3118 can have a variety of different shapes and dimensions. For example, the upper opening 3118 can be defined by a shape such as a circle, an ellipse, a square, a rectangle, a hexagon, a quadrilateral, and the like. The top opening 3118 can also be defined by a diameter dimension (eg, diameter, width, etc., depending on shape). The diameter dimension of the top opening 3118 can be defined as the distance across the top opening at the widest point. The diameter dimension of the upper opening 3118 is about, for example, 300 micrometers or more, 500 micrometers or more, 800 micrometers or more, 1000 micrometers or more, 1500 micrometers or more, 2000 micrometers or more, or 7000 micrometers or less, It can be 6000 micrometers or less, 4000 micrometers or less, 2500 micrometers or less, 1700 micrometers or less, 1200 micrometers or less, etc., or any range within the aforementioned values.

複数のウェル３１１５の各々の底面３１１２は、それらの上又はそれらの上方での細胞の培養を可能にするように促しうる。底面３１１２は、さまざまな異なる形状及び寸法を有しうる。例えば、底面３１１２は、円形、半球状、平坦、円錐状等でありうる。さらなる例として、底面３１１２はまた、円形、楕円形、正方形、矩形、六角形、四辺形等の形状によっても画成されうる。図２７〜２９に示されるように、底面３１１２は平坦であり、直径寸法によって画成される。底面の直径寸法は、約、例えば、０マイクロメートル以上、５０マイクロメートル以上、７５マイクロメートル以上、１００マイクロメートル以上、２００マイクロメートル以上、２７５マイクロメートル以上等、又は、７００マイクロメートル以下、５００マイクロメートル以下、４００マイクロメートル以下、３００マイクロメートル以下、２５０マイクロメートル以下、１５０マイクロメートル以下等、若しくは、前述の値内のいずれかの範囲でありうる。底が最下点に位置づけられた、丸底又は同様の表面（例えば、半球状、円錐状等）を有する底面３１１２については、底面３１１２の直径寸法は、ゼロと見なされる。幾つかの実施形態では、上部開口３１１８の直径寸法は、底面３１１２の直径寸法より大きい。他の実施形態では、上部開口３１１８の直径寸法は、底面３１１２の直径寸法に等しい。   The bottom surface 3112 of each of the plurality of wells 3115 may prompt to allow culturing of cells on or above them. The bottom surface 3112 can have a variety of different shapes and dimensions. For example, the bottom surface 3112 can be circular, hemispherical, flat, conical, or the like. As a further example, the bottom surface 3112 can also be defined by shapes such as circular, elliptical, square, rectangular, hexagonal, quadrilateral, and the like. As shown in FIGS. 27-29, the bottom surface 3112 is flat and is defined by a diameter dimension. The diameter dimension of the bottom surface is about, for example, 0 micrometer or more, 50 micrometers or more, 75 micrometers or more, 100 micrometers or more, 200 micrometers or more, 275 micrometers or more, or 700 micrometers or less, 500 micrometers It can be below a meter, below 400 micrometers, below 300 micrometers, below 250 micrometers, below 150 micrometers, etc., or any range within the aforementioned values. For a bottom surface 3112 having a round bottom or similar surface (eg, hemispherical, conical, etc.) with the bottom positioned at the lowest point, the diameter dimension of the bottom surface 3112 is considered zero. In some embodiments, the diameter dimension of the top opening 3118 is greater than the diameter dimension of the bottom surface 3112. In other embodiments, the diameter dimension of the top opening 3118 is equal to the diameter dimension of the bottom surface 3112.

幾つかの実施形態では、複数のウェル３１１５の各々の底面３１１２は、ウェルのマイクロアレイを有する基材を伴って、均一に構築されうる（図２９も参照）。他の実施形態では、底面３１１２は、基材３１１０の形成に用いられる材料とは異なる材料から製造されうる。複数のウェルを製造するさまざまな方法について以下にさらに記載する。底面３１１２又は側壁表面３１２０は、ウェル３１１５内で培養される細胞又はスフェロイド３１３０への酸素の供給を助けるためにガス透過性でありうる。幾つかの実施形態では、底面３１１２を画成する基材３１５０は、ガス透過性の基材でありうる。幾つかの実施形態では、基材３１５０は、ガス透過性のフィルムを含みうる。外部に対する底面３１１２のガス透過性は、該底面３１１２の材料及び底面３１１２の厚さに部分的に依存する。例えば、ウェルのガス透過性は、本開示と矛盾しない限り、その全体がここに参照することによって取り込まれる、２０１４年１０月２９日に出願した、「ガス透過性の培養フラスコ（GAS PERMEABLE CULTURE FLASK）」という発明の名称の米国仮特許出願第６２／０７２，０８８号に記載されうる。   In some embodiments, the bottom surface 3112 of each of the plurality of wells 3115 can be uniformly constructed with a substrate having a microarray of wells (see also FIG. 29). In other embodiments, the bottom surface 3112 can be manufactured from a different material than that used to form the substrate 3110. Various methods for manufacturing multiple wells are further described below. The bottom surface 3112 or sidewall surface 3120 can be gas permeable to help supply oxygen to the cells or spheroids 3130 cultured in the well 3115. In some embodiments, the substrate 3150 that defines the bottom surface 3112 can be a gas permeable substrate. In some embodiments, the substrate 3150 can include a gas permeable film. The gas permeability of the bottom surface 3112 to the outside depends in part on the material of the bottom surface 3112 and the thickness of the bottom surface 3112. For example, the gas permeability of wells was filed on October 29, 2014, “GAS PERMEABLE CULTURE FLASK,” which is incorporated by reference herein in its entirety, as long as it is consistent with the present disclosure. ) "In US Provisional Patent Application No. 62 / 072,088.

ペン先領域３１１６（図２９参照）は、上部開口３１１８と底面３１１２との間の側壁表面３１２０によって画成されうる。ペン先領域３１１６の位置は、ウェルの他の構成要素によって画成されてもよい。例えば、ペン先領域３１１６は、側壁表面３１２０を横切る直径寸法３１４４によって画成されうる。ペン先領域３１１６の直径寸法３１４４は、ペン先領域３１１６における側壁表面３１２０を横切る距離として定義されうる。ペン先領域３１１６は、約、例えば、５０マイクロメートル以上、１００マイクロメートル以上、２００マイクロメートル以上、３００マイクロメートル以上、４００マイクロメートル以上、５５０マイクロメートル以上等、又は、８００マイクロメートル以下、７００マイクロメートル以下、６００マイクロメートル以下、５００マイクロメートル以下、４５０マイクロメートル以下、３５０マイクロメートル以下等、若しくは、前述の値内のいずれかの範囲の直径寸法３１４４によって画成されうる。ペン先領域３１１６はまた、約、例えば、５０マイクロメートル以上、１００マイクロメートル以上、１５０マイクロメートル以上、２５０マイクロメートル以上、３５０マイクロメートル以上、４５０マイクロメートル以上等、又は、８００マイクロメートル以下、７００マイクロメートル以下、６００マイクロメートル以下、５００マイクロメートル以下、４００マイクロメートル以下、３００マイクロメートル以下等、若しくは、前述の値内のいずれかの範囲の底面３１１２からの高さ３１４２によっても画成されうる。高さ３１４２は、底面３１１２の最下点から測定されうる。このような実施形態では、ウェル３１１５の全容積は細胞培養容積３１４０である。   The nib region 3116 (see FIG. 29) may be defined by a sidewall surface 3120 between the top opening 3118 and the bottom surface 3112. The location of the nib area 3116 may be defined by other components of the well. For example, the nib region 3116 can be defined by a diameter dimension 3144 across the sidewall surface 3120. The diameter dimension 3144 of the nib area 3116 can be defined as the distance across the sidewall surface 3120 in the nib area 3116. The nib region 3116 is about, for example, 50 micrometers or more, 100 micrometers or more, 200 micrometers or more, 300 micrometers or more, 400 micrometers or more, 550 micrometers or more, or 800 micrometers or less, 700 micrometers. It may be defined by a diameter dimension 3144 of less than a meter, less than 600 micrometers, less than 500 micrometers, less than 450 micrometers, less than 350 micrometers, etc., or any range within the aforementioned values. The nib area 3116 may also be about, for example, 50 micrometers or more, 100 micrometers or more, 150 micrometers or more, 250 micrometers or more, 350 micrometers or more, 450 micrometers or more, etc., or 800 micrometers or less, 700 Micrometer or less, 600 micrometers or less, 500 micrometers or less, 400 micrometers or less, 300 micrometers or less, or the like, or may be defined by a height 3142 from the bottom surface 3112 in any range within the aforementioned values. . Height 3142 can be measured from the lowest point of bottom surface 3112. In such an embodiment, the total volume of well 3115 is cell culture volume 3140.

上部開口３１１８の直径寸法は、ペン先領域３１１６の直径寸法３１４４以上でありうる。ペン先領域３１１６の直径寸法３１４４は、底面３１１２の直径寸法以上でありうる。底面３１１２の直径寸法は、ペン先領域３１１６の直径寸法３１４４以下である、あるいは、ペン先領域３１１６の直径寸法３１４４は、上部開口３１１８の直径寸法以下でありうると記載することもできる。幾つかの実施形態では、上部開口３１１８はペン先領域３１１６でありうる。   The diameter dimension of the upper opening 3118 can be greater than or equal to the diameter dimension 3144 of the nib region 3116. The diameter dimension 3144 of the nib area 3116 may be greater than or equal to the diameter dimension of the bottom surface 3112. It can also be described that the diameter dimension of the bottom surface 3112 is less than or equal to the diameter dimension 3144 of the nib area 3116, or the diameter dimension 3144 of the nib area 3116 can be less than or equal to the diameter dimension of the upper opening 3118. In some embodiments, the top opening 3118 can be a nib area 3116.

複数のウェルの各々の側壁表面３１２０は、上部開口３１１８から底面３１１２まで延びる。側壁表面３１２０は、上部側壁表面３１２４及び下部側壁表面３１２２を含みうる。上部側壁表面３１２４は、上部開口３１１８とペン先領域３１１６との間に画成されうる。下部側壁表面３１２２は、ペン先領域３１１６と底面３１１２との間に画成されうる。幾つかの実施形態では、複数のウェル３１１５の各々の側壁表面３１２０は、細胞非接着性の表面を画成しうる。細胞非接着性の表面は、先に述べた細胞培養容積３１４０におけるスフェロイド３１３０への細胞の増殖を促進する。細胞非接着性の上部側壁表面３１２４は、細胞培養容積３１４０内への播種された細胞の沈降を促進しうる。上部側壁表面３１２４が細胞非接着性であるかどうかにかかわらず、上部側壁表面３１２４は、幾つかの実施形態では、ウェル内に播種された細胞のペン先領域３１１６内への沈降を生じさせ、重力の結果として細胞培養容積３１４０を形成するように構成されうる。   The sidewall surface 3120 of each of the plurality of wells extends from the top opening 3118 to the bottom surface 3112. The sidewall surface 3120 can include an upper sidewall surface 3124 and a lower sidewall surface 3122. Upper sidewall surface 3124 may be defined between upper opening 3118 and nib area 3116. Lower sidewall surface 3122 can be defined between nib region 3116 and bottom surface 3112. In some embodiments, the sidewall surface 3120 of each of the plurality of wells 3115 can define a non-cell-adhesive surface. The non-cell-adhesive surface promotes cell growth to spheroids 3130 in the previously described cell culture volume 3140. The non-cell-adherent upper sidewall surface 3124 can facilitate sedimentation of seeded cells into the cell culture volume 3140. Regardless of whether the upper sidewall surface 3124 is non-cell-adhesive, the upper sidewall surface 3124, in some embodiments, causes sedimentation of cells seeded in the well into the nib region 3116; It may be configured to form a cell culture volume 3140 as a result of gravity.

幾つかの実施形態では、上部側壁表面３１２４及び下部側壁表面３１２２は、例えば、放物面、円錐状、階段状、さまざまな角度、曲線状等の形状によって画成されうる。上部及び下部側壁表面３１２４、３１２２は、同一又は異なる形状を有しうる。幾つかの実施形態では、側壁表面３１２０は、上部及び下部側壁表面３１２４、３１２２が出会う位置に、変曲点３１２１を有しうる（例えば、図２９に示される）。他の実施形態では、側壁表面３１２０は、上部及び下部側壁３１２４、３１２２の表面が出会う変曲点３１２１に、連続した傾斜を有しうる。   In some embodiments, the upper sidewall surface 3124 and the lower sidewall surface 3122 can be defined by shapes such as, for example, paraboloids, cones, steps, various angles, curves, and the like. The upper and lower sidewall surfaces 3124, 3122 can have the same or different shapes. In some embodiments, the sidewall surface 3120 can have an inflection point 3121 where the upper and lower sidewall surfaces 3124, 3122 meet (eg, as shown in FIG. 29). In other embodiments, the sidewall surface 3120 can have a continuous slope at the inflection point 3121 where the surfaces of the upper and lower sidewalls 3124, 3122 meet.

幾つかの実施形態では、底面１１２と隣接している側壁３１２０の一部は、底面３１１２に対して垂直又は底面３１１２に対してある角度で存在しうる。底面３１１２と隣接する側壁３１２０の一部は、下部側壁表面３１２２として記載されうる。側壁３１２０の一部が底面３１１２と交差する角度は、底面３１１２に対して、例えば、９０度以上、９２度以上、９５度以上、１００度以上等、又は、１１０度以下、１０５度以下、１０２度以下、９７度以下等、若しくは、前述の値内のいずれかの範囲で画成されうる。幾つかの実施形態では、側壁表面３１２０を横切る直径寸法は、底面３１１２から上部開口３１１８の方へと増加するように説明されうる。側壁の幾何学形状は、細胞を複数のウェル３１１５の各々内に十分に沈降可能にするような幾何学形状でありうる。   In some embodiments, the portion of the side wall 3120 that is adjacent to the bottom surface 112 can exist perpendicular to the bottom surface 3112 or at an angle with respect to the bottom surface 3112. A portion of the side wall 3120 adjacent to the bottom surface 3112 can be described as a lower side wall surface 3122. The angle at which a part of the side wall 3120 intersects with the bottom surface 3112 is, for example, 90 degrees or more, 92 degrees or more, 95 degrees or more, 100 degrees or more, or 110 degrees or less, 105 degrees or less, 102 It can be defined in degrees or less, 97 degrees or less, etc., or any range within the aforementioned values. In some embodiments, the diameter dimension across the sidewall surface 3120 may be described as increasing from the bottom surface 3112 toward the top opening 3118. The sidewall geometry may be a geometry that allows the cells to settle well within each of the plurality of wells 3115.

平坦な表面を有しない底面３１１２に関しては、側壁３１２０の角度は、底面３１１２の底の接線方向にある仮想平面に対するものと考えられる。他の実施形態では、仮想平面はまた、仮想平面が底の接線方向であるかどうかにかかわらず、上部開口３１１８と同一平面上にあるものとして定められうる。   With respect to the bottom surface 3112 that does not have a flat surface, the angle of the side wall 3120 is considered relative to a virtual plane that is tangential to the bottom of the bottom surface 3112. In other embodiments, the virtual plane may also be defined as being coplanar with the top opening 3118 regardless of whether the virtual plane is tangential to the bottom.

底面３１１２、ペン先領域３１１６及び側壁表面３１２０の一部の組合せは、細胞培養容積３１４０を画成しうる。細胞培養容積３１４０を画成する側壁表面３１２０の一部は、下部側壁表面３１２２とも説明されうる。細胞は、細胞培養容積３１４０内でのみ培養されるように限定されない。しかしながら、複数のウェル３１１５の各々内に堆積された細胞は、スフェロイド３１３０を形成及び増殖するように、細胞培養容積３１４０内で凝集しうる。また、スフェロイド３１３０の寸法は、細胞培養容積３１４０の形状及び寸法の結果でありうる。例えば、複数のウェル３１１５の各々の細胞培養容積３１４０は、スフェロイド３１３０が、約、例えば、５００マイクロメートル以下、４００マイクロメートル以下、３００マイクロメートル以下、２５０マイクロメートル以下、１５０マイクロメートル以下等又は前述の値内のいずれかの範囲の直径まで増殖するように構成される。幾つかの実施形態では、複数のウェル３１１５の各々の細胞培養容積３１４０は、複数のウェル３１１５内で増殖したすべてのスフェロイド３１３０の平均直径とは、約、例えば、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、２％以下等だけ異なる、又は前述の値内のいずれかの範囲だけ異なる直径によって画成される、スフェロイド３１３０を形成する。   Some combination of bottom surface 3112, nib region 3116, and sidewall surface 3120 may define cell culture volume 3140. The portion of the sidewall surface 3120 that defines the cell culture volume 3140 can also be described as the lower sidewall surface 3122. The cells are not limited to being cultured only in the cell culture volume 3140. However, the cells deposited in each of the plurality of wells 3115 can aggregate within the cell culture volume 3140 to form and grow spheroids 3130. Also, the dimensions of the spheroid 3130 can be a result of the shape and dimensions of the cell culture volume 3140. For example, the cell culture volume 3140 of each of the plurality of wells 3115 has a spheroid 3130 of about, for example, 500 micrometers or less, 400 micrometers or less, 300 micrometers or less, 250 micrometers or less, 150 micrometers or less, or the like. Configured to grow to any range of diameters within the value of. In some embodiments, the cell culture volume 3140 of each of the plurality of wells 3115 has an average diameter of all spheroids 3130 grown in the plurality of wells 3115 of about, for example, 20% or less, 15% or less, Spheroids 3130 are defined that are defined by diameters that differ by no more than 10%, no more than 5%, no more than 2%, etc., or that differ by any range within the aforementioned values.

上部開口３１１８、ペン先領域３１１６及び側壁表面３１２０の一部の組合せは、第２の容積３１４５を画成する。第２の容積３１４５を画成する側壁表面３１２０の一部は、上部側壁表面３１２４としても説明されうる。第２の容積３１４５は、細胞培養容積３１４０よりも大きくてよい。例えば、第２の容積３１４５は、細胞培養容積３１４０の約、１００％以上、２００％以上、５００％以上、１，０００％以上、１０，０００％以上、１００，０００％以上、２００，０００％以上等、又は前述の値内のいずれかの範囲でありうる。例として、９６−ウェルプレートは、０．１マイクロリットルの容積によって画成される細胞培養容積と、２００マイクロリットルの容積によって画成される、結果的に細胞培養容積よりも２，０００倍大きい容積を生じうる、第２の容積とを有しうる。   A combination of the top opening 3118, the nib region 3116 and the sidewall surface 3120 defines a second volume 3145. The portion of the sidewall surface 3120 that defines the second volume 3145 may also be described as the upper sidewall surface 3124. Second volume 3145 may be larger than cell culture volume 3140. For example, the second volume 3145 is about 100% or more, 200% or more, 500% or more, 1,000% or more, 10,000% or more, 100,000% or more, 200,000% of the cell culture volume 3140. As above, it can be any range within the above-mentioned values. As an example, a 96-well plate is defined by a cell culture volume defined by a volume of 0.1 microliters and by a volume of 200 microliters, resulting in 2,000 times greater than the cell culture volume. A second volume that can produce a volume.

細胞培養装置３１００の一実施形態が図２７に示されている。図２７に示されるように、複数のウェル３１１５の各々の側壁表面３１２０は、上部開口３１１８から底面３１１２へと次第に細くなっている。特に、側壁表面３１２０は、ほぼ上部開口３１１８に垂直な方向であるが、側壁表面３１２０が底面３１１２の方へと延びるにつれて側壁表面３１２０を横切る直径寸法を低下させる僅かな角度で、上部開口３１１８から延びている。上部開口３１１８とペン先領域３１１６との間の側壁表面３１２０に沿った点３１２３において、側壁表面３１２０の角度は、側壁表面３１２０が底面３１１２の方へ延びるにつれて、側壁表面３１２０を横切る直径寸法をさらに低下させるように変化する。ペン先領域３１１６において、側壁表面３１２０の角度は、この場合も変化し、かつ底面３１１２の方へと延びる。側壁表面３１２０のこの最後の部分は、時折、下部側壁表面３１２２と記載される。図２７に示されるように、実施形態において、下部側壁表面３１２２は、底面３１１２に対して垂直から僅かに角度をなしてよく、側壁表面３１２０を横切る直径寸法は、側壁表面３１２０が底面３１１２の方に延びるにつれて低下する。スフェロイド３１３０は、下部側壁表面３１２２内かつ底面３１１２に対して位置づけられるように示されている（すなわちペン先領域３１１６内）。下部側壁表面３１２２は、スフェロイド３１３０が増殖可能な寸法を制限又は限定しうる。   One embodiment of a cell culture device 3100 is shown in FIG. As shown in FIG. 27, the side wall surface 3120 of each of the plurality of wells 3115 is gradually narrowed from the upper opening 3118 to the bottom surface 3112. In particular, the sidewall surface 3120 is generally in a direction perpendicular to the top opening 3118 but from the top opening 3118 at a slight angle that reduces the diameter dimension across the sidewall surface 3120 as the sidewall surface 3120 extends toward the bottom surface 3112. It extends. At a point 3123 along the sidewall surface 3120 between the top opening 3118 and the nib region 3116, the angle of the sidewall surface 3120 further increases the diameter dimension across the sidewall surface 3120 as the sidewall surface 3120 extends toward the bottom surface 3112. It changes to decrease. In the nib region 3116, the angle of the side wall surface 3120 again changes and extends toward the bottom surface 3112. This last portion of the sidewall surface 3120 is sometimes described as the lower sidewall surface 3122. As shown in FIG. 27, in an embodiment, the lower sidewall surface 3122 may be slightly angled from normal to the bottom surface 3112, and the diameter dimension across the sidewall surface 3120 is such that the sidewall surface 3120 is toward the bottom surface 3112. Decreases as it extends. Spheroid 3130 is shown positioned within lower sidewall surface 3122 and relative to bottom surface 3112 (ie, within nib region 3116). Lower sidewall surface 3122 may limit or limit the dimensions that spheroid 3130 can grow.

細胞培養装置３１００の一実施形態が図２８に示されている。図２８に示されるように、複数のウェル３１１５の各々の側壁表面３１２０は、上部開口３１１８から底面３１１２へと次第に細くなっている。詳細には、側壁表面３１２０は、最初に、上部開口３１１８から該上部開口３１１８に垂直な角度で伸び、次に、ペン先領域３１１６の方へ放物線軌道に沿って延びる。ペン先領域３１１６では、側壁表面３１２０の角度は変化し、かつ底面３１１２の方へと延びる。側壁表面３１２０のこの最後の部分は、時折、下部側壁表面３１２２と記載される。図２９に示されるように、下部側壁表面３１２２は、底面３１１２に対して垂直から僅かに角度をなし、側壁表面３１２０を横切る直径寸法は、側壁表面３１２０が底面３１１２の方に延びるにつれて低下する。スフェロイド３１３０は、ペン先領域３１１６内において下部側壁表面３１２２内かつ底面３１１２に対して位置づけられるように示されている。下部側壁表面３１２２は、スフェロイド３１３０が成長可能な寸法を制限又は限定しうる。ペン先領域は、スフェロイドを誘発する幾何学形状をしている。   One embodiment of a cell culture device 3100 is shown in FIG. As shown in FIG. 28, the side wall surface 3120 of each of the plurality of wells 3115 gradually narrows from the upper opening 3118 to the bottom surface 3112. Specifically, the sidewall surface 3120 first extends from the top opening 3118 at an angle perpendicular to the top opening 3118 and then extends along a parabolic trajectory toward the nib region 3116. In the nib region 3116, the angle of the side wall surface 3120 varies and extends toward the bottom surface 3112. This last portion of the sidewall surface 3120 is sometimes described as the lower sidewall surface 3122. As shown in FIG. 29, the lower sidewall surface 3122 is slightly angled from normal to the bottom surface 3112, and the diameter dimension across the sidewall surface 3120 decreases as the sidewall surface 3120 extends toward the bottom surface 3112. Spheroid 3130 is shown positioned within lower nib surface 3122 and relative to bottom surface 3112 within nib region 3116. The lower sidewall surface 3122 may limit or limit the dimensions over which the spheroid 3130 can grow. The nib region has a geometric shape that induces spheroids.

次に、図３０に着目すると、幾つかの実施形態では、細胞培養装置３６５０は、図３０に示されるように、底部プレート３６１０と１つ以上の側壁３６２０とを備えうる。底部プレート３６１０は主面３６１１を画成することができ、１つ以上の側壁３６２０は、底部プレート３６１０から延びうる。底部プレート３６１０は、全体的に又は部分的に、マイクロウェル３６１５のアレイを有する基材から形成されうる。図３０は、底部プレートがマイクロウェル３６１５の複数のアレイのうちの１つのアレイを有しうることを示している。すなわち、図３０に示されるマイクロウェル３６１５のアレイとして識別される領域の各々は、はるかに小さいマイクロウェルのアレイを含みうる。実施形態において、細胞培養装置３６５０はまた、底部プレート３６１０の主面３６１１に形成された複数のウェル３６１５も備えうる。マイクロウェル３６１５の複数のアレイの各ウェルは、スフェロイドの増殖を促進又は誘発する、先に記載したマイクロウェル又は細胞培養容積を画成しうる。底部プレート３６１０の主面３６１１及び１つ以上の側壁３６２０は、リザーバの容積を画成する。本明細書に記載のリザーバプレートは、培養培地の添加を可能にし、その過剰分が典型的にはマイクロウェルプレートの個々の浅いウェルを満たすのに用いられ、流体連通する異なるウェル内での細胞培養を可能にする。   Turning now to FIG. 30, in some embodiments, the cell culture device 3650 can comprise a bottom plate 3610 and one or more sidewalls 3620, as shown in FIG. The bottom plate 3610 can define a major surface 3611 and one or more sidewalls 3620 can extend from the bottom plate 3610. The bottom plate 3610 can be formed in whole or in part from a substrate having an array of microwells 3615. FIG. 30 shows that the bottom plate can have one of a plurality of arrays of microwells 3615. That is, each of the regions identified as the array of microwells 3615 shown in FIG. 30 can include a much smaller array of microwells. In an embodiment, the cell culture device 3650 may also include a plurality of wells 3615 formed in the major surface 3611 of the bottom plate 3610. Each well of the plurality of arrays of microwells 3615 can define a microwell or cell culture volume as described above that promotes or induces spheroid proliferation. The major surface 3611 and one or more side walls 3620 of the bottom plate 3610 define the reservoir volume. The reservoir plate described herein allows for the addition of culture medium, the excess of which is typically used to fill individual shallow wells of a microwell plate and cells in different wells in fluid communication. Allow culture.

幾つかの実施形態では、１つ以上の側壁３６２０は、幾つかの現行の市販される細胞培養装置よりも、底部プレート３６１０からさらに遠くに（例えば、側壁の高さ）延伸でき、リザーバが培地の通常の容積より多くの培地を保持可能にする。リザーバにとってより大きい限度容量の条件により、スフェロイドが、各個々のウェル内の培地の量にのみに依拠する必要がなくなりうるように、過剰の培養培地をリザーバに加えることを可能になりうる。言い換えれば、スフェロイドは、該スフェロイドが標準的なマイクロプレートウェル内で増殖する場合ほど頻繁には、細胞培養培地を供給する必要がなくなりうる。図３０に示されるように、リザーバ内の細胞培養培地はリザーバ内のすべてのウェルと連通していることから、栄養素及び代謝物は、細胞培養培地全体を通じて交換されうる。   In some embodiments, one or more sidewalls 3620 can extend farther from the bottom plate 3610 (eg, the height of the sidewalls) than some current commercially available cell culture devices, and the reservoir can be a medium. It is possible to hold more medium than the normal volume. Larger capacity conditions for the reservoir may allow excess culture medium to be added to the reservoir so that the spheroids may not need to rely solely on the amount of medium in each individual well. In other words, spheroids may not need to be supplied with cell culture media as often as the spheroids grow in standard microplate wells. As shown in FIG. 30, since the cell culture medium in the reservoir is in communication with all wells in the reservoir, nutrients and metabolites can be exchanged throughout the cell culture medium.

幾つかの実施形態では、細胞培養組立体３６００は、細胞培養装置３６５０及び流体透過性のメッシュ３６７０を備えうる。流体透過性のメッシュ３６７０は、細胞がウェル内に播種された後に、ウェル３６１５の上部に配置されうる。複数のウェル３６１５間で共通に連通する細胞培養培地は、ウェル内の細胞をかき乱すことなく、手動のバッチ供給プロセスの間に隔離及び置換されうる。細胞は、幾つかの実施形態では、ウェルの表面に対して非接着性でありうることから、スフェロイドをかき乱す又は失うことのない細胞培養培地の交換は困難でありうる。しかしながら、上述のメッシュ３６７０を使用することにより、このような困難さが緩和されうる。例えば、細胞培養装置と流体透過性のメッシュとの組合せは、本開示と矛盾しない限り、その全体がここに参照することによって取り込まれる、「リザーバ・スフェロイド・プレート（RESERVOIR SPHEROID PLATE）」という発明の名称で２０１４年１０月２９日に出願の、米国仮特許出願第６２／０７２，１０３号明細書に記載されるようなものでありうる。   In some embodiments, the cell culture assembly 3600 can include a cell culture device 3650 and a fluid permeable mesh 3670. A fluid permeable mesh 3670 can be placed on top of the well 3615 after the cells are seeded into the well. Cell culture media in common communication between multiple wells 3615 can be sequestered and replaced during a manual batch feed process without disturbing the cells in the wells. Since the cells can be non-adherent to the surface of the wells in some embodiments, changing the cell culture medium without disturbing or losing the spheroids can be difficult. However, such difficulty can be mitigated by using the mesh 3670 described above. For example, the combination of a cell culture device and a fluid permeable mesh is incorporated herein by reference in its entirety, as long as it is not inconsistent with the present disclosure. It may be as described in US Provisional Patent Application No. 62 / 072,103, filed October 29, 2014 by name.

本明細書に記載の細胞培養装置３６５０のウェル３６１５は、任意の寸法、形状又は構成でありうることが理解されよう。幾つかの実施形態では、ウェルは、図１７に示されるように六方最密充填型のウェル構造から形成される。小さい容積のウェルは、追加のリザーバ容積のない、細胞培養培地の頻繁な交換を必要とするであろうことから、密に充填された小さい容積のウェルを有する構造化された表面を有するリザーバプレート装置は、特に有利でありうる。   It will be appreciated that the well 3615 of the cell culture device 3650 described herein may be of any size, shape or configuration. In some embodiments, the well is formed from a hexagonal close-packed well structure as shown in FIG. Reservoir plates with structured surfaces with closely packed small volume wells, since small volume wells will require frequent replacement of cell culture media without additional reservoir volume The device can be particularly advantageous.

本明細書に記載のリザーバプレートは、例えば、培養培地の添加を可能にし、その過剰分は、典型的にはマイクロウェルプレートの個々の浅いウェルを満たすのに用いられ、かつ、異なるウェル内で培養された細胞を流体連通可能にする。   The reservoir plates described herein allow, for example, the addition of culture media, the excess of which is typically used to fill individual shallow wells of a microwell plate and within different wells. Allow cultured cells to be in fluid communication.

図３１に示されるように、細胞培養装置４１００は、底部プレート４１１０及び１つ以上の側壁４１２０を備えうる。底部プレートは主面を画成してよく、１つ以上の側壁４１２０は、底部プレートから延びうる。底部プレートと１つ以上の側壁との組合せは、リザーバを画成しうる。細胞培養装置はまた、底部プレートの主面に形成されたマイクロウェル４１１５のアレイを有する基材を、全体又は一部に含みうる。マイクロウェルアレイ内の複数のウェルの各ウェルは、上部開口及び底を画成しうる。上部開口は、主面と同一平面上にあってよく、底は、主面の下に位置づけされうる、すなわち、底は、１つ以上の側壁が底部プレートから延びる方向とは逆の方向に位置づけされうる。上部プレート（図示せず）は、細胞をインキュベートする間に、所望されるリザーバ上に配置されうる。   As shown in FIG. 31, the cell culture device 4100 can include a bottom plate 4110 and one or more sidewalls 4120. The bottom plate may define a major surface and one or more sidewalls 4120 may extend from the bottom plate. The combination of the bottom plate and one or more side walls can define a reservoir. The cell culture device can also include, in whole or in part, a substrate having an array of microwells 4115 formed on the major surface of the bottom plate. Each well of the plurality of wells in the microwell array can define a top opening and a bottom. The top opening may be coplanar with the main surface and the bottom may be positioned below the main surface, i.e., the bottom is positioned in a direction opposite to the direction in which one or more side walls extend from the bottom plate. Can be done. An upper plate (not shown) can be placed on the desired reservoir while incubating the cells.

幾つかの実施形態では、１つ以上の側壁は、典型的なものよりも底部プレートから遠くに延伸でき、したがって、リザーバを培地の通常の容積より大きい容積を保持可能にする。リザーバにとってより大きい限度容量の条件は、スフェロイドが、各個々のウェル内の培地の量にのみ依拠する必要がなくなりうるように、過剰の培養培地をリザーバに添加可能にしうる。言い換えれば、スフェロイドは、該スフェロイドが標準的なマイクロプレートウェル内で増殖する場合ほど頻繁には、細胞培養培地を供給する必要をなくしうる。図３１に示されるように、リザーバ内の細胞培養培地はリザーバ内のすべてのウェルと連通していることから、栄養素及び代謝物は、細胞培養培地全体を通じて交換されうる。   In some embodiments, one or more sidewalls can extend farther from the bottom plate than is typical, thus allowing the reservoir to hold a volume that is greater than the normal volume of the medium. Larger capacity conditions for the reservoir may allow excess culture medium to be added to the reservoir so that spheroids may not need to rely solely on the amount of medium in each individual well. In other words, spheroids may eliminate the need to supply cell culture media as often as the spheroids grow in standard microplate wells. As shown in FIG. 31, since the cell culture medium in the reservoir is in communication with all wells in the reservoir, nutrients and metabolites can be exchanged throughout the cell culture medium.

幾つかの実施形態では、細胞培養組立体４２００は本明細書に記載される。組立体は、装置４１００（例えば、図３１に関して示しかつ述べたような装置）及び流体透過性のメッシュ４５７０を備えうる。流体透過性のメッシュ４５７０は、細胞がウェル内に播種された後に、ウェル４１１５の上部に配置されうる。共通に連通する細胞培養培地は、ウェル内の細胞をかき乱すことなく、手動のバッチ供給プロセスの間に隔離及び置換されうる。   In some embodiments, cell culture assembly 4200 is described herein. The assembly may comprise a device 4100 (eg, a device as shown and described with respect to FIG. 31) and a fluid permeable mesh 4570. A fluid permeable mesh 4570 can be placed on top of the well 4115 after the cells are seeded into the well. Commonly communicating cell culture media can be sequestered and replaced during a manual batch feeding process without disturbing the cells in the well.

幾つかの実施形態（例えば、図３２に示される）では、フレーム４５６０は、図示されるようにメッシュ４５７０に連結しうる。フレーム４５６０は、メッシュ４５７０をウェルの第１のウェル４５１５上の適所に維持するように構成されうる。幾つかの実施形態では、メッシュ４５７０は、装置４１００の側壁４１２０の上部エッジ上に配置されるように構成されうる。フレーム４５６０は、締まり嵌め、スナップ嵌め、又はメッシュをプレート４１１０の主面上に保持するための任意の他の適切な機構を介して、１つ以上の側壁４１２０を係合することができる。幾つかの実施形態では、ユーザは、メッシュがウェル４１１５上のプレート４１１０の主面に保持されるように、フレーム４５６０を適所に手動で保持することができる。   In some embodiments (eg, shown in FIG. 32), the frame 4560 may be coupled to the mesh 4570 as shown. The frame 4560 may be configured to maintain the mesh 4570 in place on the first well 4515 of the well. In some embodiments, mesh 4570 can be configured to be disposed on the upper edge of sidewall 4120 of device 4100. The frame 4560 can engage one or more sidewalls 4120 via an interference fit, snap fit, or any other suitable mechanism for holding the mesh on the major surface of the plate 4110. In some embodiments, the user can manually hold the frame 4560 in place so that the mesh is held on the major surface of the plate 4110 on the well 4115.

流体透過性のメッシュ４５７０は、任意の適切な材料から形成されうる。幾つかの実施形態では、流体透過性のメッシュは、細孔を画成する。細孔は、任意の適切な寸法のものでありうる。幾つかの実施形態では、細孔は、１０マイクロメートル〜１００マイクロメートルの範囲の平均細孔寸法を画成する。幾つかの実施形態では、細孔は、４０マイクロメートル以下の平均細孔寸法を画成する。好ましくは、メッシュの細孔は、スフェロイドがメッシュを通り抜けるのを防ぐのに十分に小さい寸法のものである。   The fluid permeable mesh 4570 may be formed from any suitable material. In some embodiments, the fluid permeable mesh defines pores. The pores can be of any suitable size. In some embodiments, the pores define an average pore size ranging from 10 micrometers to 100 micrometers. In some embodiments, the pores define an average pore size of 40 micrometers or less. Preferably, the pores of the mesh are of sufficiently small dimensions to prevent spheroids from passing through the mesh.

幾つかの実施形態では、メッシュは、本開示と矛盾しない限り、その全体がここに参照することによって取り込まれる、例えば、本発明の譲受人に譲渡された米国仮特許出願第６２／０７２０９４号明細書に記載されている。   In some embodiments, the mesh is incorporated by reference herein in its entirety, as long as it is not inconsistent with the present disclosure, eg, US Provisional Patent Application No. 62/072094 assigned to the assignee of the present invention. It is described in the book.

幾つかの実施形態では、細胞培養培地を手動で置換する代わりに、本明細書に記載のリザーバプレートは、細胞培養培地をウェルの主面上のリザーバを越えて流すことができる、灌流装置として製作されうる。   In some embodiments, instead of manually replacing the cell culture medium, the reservoir plate described herein can serve as a perfusion device that allows the cell culture medium to flow past the reservoir on the major surface of the well. Can be produced.

例えば及び図３３を参照すると、図３１に記載され、かつ図３１に関して論じられる細胞培養装置４１００は、１つ以上の側壁が入口４１４０を形成し、かつ、１つ以上の側壁が出口４１４５を形成するように、適合されうる。細胞培養流体は、入口から出口までリザーバ全体に灌流されうる。図３３に示される装置の形状因子は、開放された上部の形状因子であってよく、あるいは、閉じられた上部であってもよい。形状因子が開放された上部である場合、図２に関して論じられたフレーム及びメッシュを含むインサートは、そうでなければ高い灌流速度がスフェロイドなどの細胞をウェルから移動させてしまうかもしれない場合に、細胞をウェル４１１５内に保持するために用いられうる。   For example and with reference to FIG. 33, the cell culture device 4100 described in FIG. 31 and discussed with respect to FIG. 31 has one or more sidewalls forming an inlet 4140 and one or more sidewalls forming an outlet 4145. Can be adapted. Cell culture fluid can be perfused through the reservoir from the inlet to the outlet. The form factor of the device shown in FIG. 33 may be an open top form factor or may be a closed top. If the form factor is the open top, the insert including the frame and mesh discussed with respect to FIG. 2 may otherwise cause high perfusion rates to move cells such as spheroids out of the well. Can be used to retain cells in well 4115.

本明細書に記載される細胞培養装置は、任意の適切な方式で製造されうる。さまざまな実施形態において、細胞培養装置の製造方法は、ポリマー材料、又は本明細書に記載の任意の他の適切な材料を成形して、細胞培養装置を形成する工程を含む。ポリマー材料は、細胞培養装置の複数のウェルを画成しうる。複数のウェルの各々は、上部開口、底面、及び、上部開口から底面まで延びる側壁表面を画成しうる。側壁表面はまた、上部開口と底面との間のペン先領域も画成しうる。ポリマー材料は、ピンの周りに成形されたポリマー材料が本明細書に記載の複数のウェルの特性を有するように、ピンを有する鋳型内へと注がれうる。   The cell culture devices described herein can be manufactured in any suitable manner. In various embodiments, a method of manufacturing a cell culture device includes forming a cell culture device by molding a polymeric material, or any other suitable material described herein. The polymeric material can define a plurality of wells of the cell culture device. Each of the plurality of wells may define a top opening, a bottom surface, and a sidewall surface extending from the top opening to the bottom surface. The sidewall surface may also define a nib area between the top opening and the bottom surface. The polymeric material can be poured into a mold with pins such that the polymeric material molded around the pins has the properties of multiple wells described herein.

幾つかの実施形態では、ポリマー材料は、基材上に被覆成形されて細胞培養装置を形成する。基材は底面を画成し、ポリマー材料と基材との組合せは複数のウェルを画成する。ポリマー材料は、ピンの周りに成形されたポリマー材料が本明細書に記載の複数のウェルの特性を有するように、ピンを有する鋳型内へと注がれうる。   In some embodiments, the polymeric material is overcoated on the substrate to form a cell culture device. The substrate defines a bottom surface, and the combination of polymeric material and substrate defines a plurality of wells. The polymeric material can be poured into a mold with pins such that the polymeric material molded around the pins has the properties of multiple wells described herein.

幾つかの実施形態では、本明細書に記載の細胞培養装置がどのように製造されるかにかかわらず、複数のウェルの各々の側壁表面は、本明細書にさらに記載される細胞非接着性の材料でコーティングされうる。   In some embodiments, regardless of how the cell culture device described herein is manufactured, each sidewall surface of the plurality of wells is cell non-adherent as described further herein. It can be coated with any material.

幾つかの実施形態では、ウェルは、側壁の一部又は側壁に付け加えられた、さまざまな特徴を含む。このような基材の特徴は、直接射出成形されてもよく、あるいは、それらは、形成された基材上に型押しされてもよい。特徴の材料は、任意のポリマー、ポリマーブレンド、共重合体、ガラス、金属、若しくは、本明細書に記載の又は当技術分野で理解されている任意の他の材料でありうる。   In some embodiments, the well includes various features added to a portion of the sidewall or to the sidewall. Such substrate features may be directly injection molded or they may be embossed onto the formed substrate. The feature material can be any polymer, polymer blend, copolymer, glass, metal, or any other material described herein or understood in the art.

本明細書に記載の装置、ウェル、側壁、ウェル底部、及び他の特徴は、任意の適切な材料で形成される。好ましくは、細胞又は培養培地との接触が意図される材料は、細胞及び培地と相容性である。典型的には、細胞培養構成要素は、ポリマー材料から形成される。適切なポリマー材料の例としては、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリスチレン共重合体、フッ素ポリマー、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレンブタジエン共重合体、完全水素化スチレンポリマー、ポリカーボネートＰＤＭＳ共重合体、並びに、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリプロピレン共重合体及び環状オレフィン共重合体などのポリオレフィンなどが挙げられる。   The devices, wells, sidewalls, well bottoms, and other features described herein are formed of any suitable material. Preferably, the material intended for contact with the cells or culture medium is compatible with the cells and the medium. Typically, the cell culture component is formed from a polymeric material. Examples of suitable polymer materials include polystyrene, polymethyl methacrylate, polyvinyl chloride, polycarbonate, polysulfone, polystyrene copolymer, fluoropolymer, polyester, polyamide, polystyrene butadiene copolymer, fully hydrogenated styrene polymer, polycarbonate PDMS. Examples include copolymers, and polyolefins such as polyethylene, polypropylene, polymethylpentene, polypropylene copolymers, and cyclic olefin copolymers.

実施形態において、ウェルの内面は細胞に対して非接着性である。ウェルは、非接着性の材料から形成されて差し支えなく、あるいは、非接着性の表面を形成するように非接着性の材料でコーティングされてもよい。例となる非接着性の材料としては、パーフルオロ化ポリマー、オレフィン、又は同様のポリマー、若しくはそれらの混合物が挙げられる。他の例としては、アガロース、ポリアクリルアミドなどの非イオン性ヒドロゲル、ポリエチレンオキシドなどのポリエーテル、及びポリビニルアルコールなどのポリオール、又は同様の材料、若しくはそれらの混合物が挙げられる。幾つかの実施形態では、例えば、非接着性のウェル、ウェルの幾何学形状、及び／又は重力のうちの２つ以上の組合せにより、ウェル内で培養された細胞がスフェロイドへと自己組織化するように誘発される。一部のスフェロイドは、単層において増殖した細胞と比較して、より大きいインビボ様応答を示す、分化された細胞機能を維持する。ウェルが細胞に対して非接着性の実施形態では、細胞は、重力によって細胞をウェルから移動可能にするように、装置を逆さまにすることによって採取されうる。   In embodiments, the inner surface of the well is non-adherent to the cells. The well can be formed from a non-adhesive material, or it can be coated with a non-adhesive material to form a non-adhesive surface. Exemplary non-adhesive materials include perfluorinated polymers, olefins, or similar polymers, or mixtures thereof. Other examples include agarose, nonionic hydrogels such as polyacrylamide, polyethers such as polyethylene oxide, and polyols such as polyvinyl alcohol, or similar materials, or mixtures thereof. In some embodiments, for example, a combination of two or more of non-adherent wells, well geometry, and / or gravity causes cells cultured in the well to self-assemble into spheroids. To be triggered. Some spheroids maintain differentiated cell function that exhibits a greater in vivo-like response compared to cells grown in a monolayer. In embodiments where the wells are non-adherent to the cells, the cells can be harvested by turning the device upside down to allow the cells to move out of the well by gravity.

幾つかの実施形態では、材料の表面改質は、所望の特性を達成するために用いられる。このような改質は、表面化学の改質を含み、機械的特性は、生物学的コーティング（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、コラーゲン、ラミニン等）及び合成コーティング（例えば、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）、シリコーンハイドロゲル等）を使用して利用されうる。材料に対する他の表面改質（例えばウェル又は微細構造内）は、本発明の範囲内にある。   In some embodiments, surface modification of the material is used to achieve the desired properties. Such modifications include modification of surface chemistry and mechanical properties include biological coatings (eg, Matrigel ™, collagen, laminin, etc.) and synthetic coatings (eg, Synthemax ™, silicones). Hydrogel etc.) can be used. Other surface modifications to the material (eg, in wells or microstructures) are within the scope of the invention.

本明細書に記載される構造化された表面を有する基材は、任意の適切な方式で、細胞培養チャンバ又はトレイへと組み立てられうる。例えば、細胞培養チャンバ又はトレイの構造化された表面及び１つ以上の他の構成要素は、単一のパーツとして成形されうる。幾つかの実施形態では、構造化された表面又はその一部は、底部及び１つ以上の構成要素を形成するように被覆成形され、該構造化された表面は、細胞培養装置の１つ以上の他の構成要素に、溶接（例えば、熱、レーザ、長波ＩＲ又は超音波溶接など）、接着、溶剤結合等がなされる。   A substrate having a structured surface as described herein can be assembled into a cell culture chamber or tray in any suitable manner. For example, the structured surface of the cell culture chamber or tray and one or more other components can be molded as a single part. In some embodiments, the structured surface or a portion thereof is overmolded to form a bottom and one or more components, the structured surface being one or more of the cell culture devices. Other components are welded (eg, heat, laser, long wave IR or ultrasonic welding, etc.), bonded, solvent bonded, and the like.

さまざまな実施形態において、細胞培養システムは、上述の細胞培養装置の構成要素を２つ以上備えうる。例として、装置の構成要素は、細胞培養システムを形成するように積層されうる。本明細書に記載の細胞培養装置の構成要素を取り込みうる積層された細胞培養システムの例としては、例えば、それらが本開示と矛盾しない限り、それぞれの全体がここに参照することによって本明細書に取り込まれる、（ｉ）「多層培養容器（MULTILAYER CULTURE VESSEL）」という発明の名称で２０１４年１０月２９日出願の米国仮特許出願第６２／０７２，０１５号明細書；（ｉｉ）「灌流バイオリアクタプラットフォーム（PERFUSION BIOREACTOR PLATFORM）」という発明の名称で２０１４年１０月２９日出願の米国仮特許出願第６２／０７２，０３９号明細書が挙げられる。   In various embodiments, the cell culture system may include two or more of the cell culture device components described above. As an example, the components of the device can be stacked to form a cell culture system. Examples of stacked cell culture systems that can incorporate the components of the cell culture devices described herein include, for example, each of which is hereby incorporated by reference herein in its entirety, unless they are inconsistent with the present disclosure. (I) US Provisional Patent Application No. 62 / 072,015 filed Oct. 29, 2014 under the name of the invention "MULTILAYER CULTURE VESSEL"; (ii) "Perfusion Bio US Provisional Patent Application No. 62 / 072,039, filed Oct. 29, 2014 under the name of the invention “PERFUSION BIOREACTOR PLATFORM”.

本明細書に記載される細胞培養装置は、装置のウェル内の細胞を任意の適切な方式で培養するために用いられうる。例えば、細胞を培養するための方法は、本明細書に記載される細胞培養装置の複数のウェルの１つ以上に細胞及び細胞培養培地を導入する工程を含む。細胞培養培地は、細胞培養容積のみに、又は、細胞培養容積及び第２の容積を含む、複数のウェルの各々の全体に、含まれうる。本方法はまた、複数のウェルの１つ以上における培地内で細胞を培養する工程も含む。複数のウェルの１つ以上において細胞を培養する工程は、１つ以上のウェル内でスフェロイドを形成する工程を含みうる。１つ以上のウェル内で培養されたスフェロイドは、約、例えば、５００マイクロメートル以下、４００マイクロメートル以下、３００マイクロメートル以下、２５０マイクロメートル以下、１５０マイクロメートル以下等、又は前述の値内のいずれかの範囲の直径によって画成されうる。１つのスフェロイドの直径は、複数のウェル内で増殖したすべてのスフェロイドの平均直径とは、約、例えば、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、２％以下等又は前述の値内のいずれかの範囲で異なりうる。   The cell culture devices described herein can be used to culture cells in the wells of the device in any suitable manner. For example, a method for culturing cells includes introducing cells and cell culture media into one or more of a plurality of wells of a cell culture device described herein. The cell culture medium can be included in the cell culture volume alone or in each of the plurality of wells, including the cell culture volume and the second volume. The method also includes culturing the cells in a medium in one or more of the plurality of wells. Culturing the cells in one or more of the plurality of wells can include forming spheroids in the one or more wells. Spheroids cultured in one or more wells may be about, for example, 500 micrometers or less, 400 micrometers or less, 300 micrometers or less, 250 micrometers or less, 150 micrometers or less, etc., or any of the above values Can be defined by a range of diameters. The diameter of one spheroid is about the average diameter of all spheroids grown in a plurality of wells, for example, 20% or less, 15% or less, 10% or less, 5% or less, 2% or less, or the like described above. It can vary within any range within the value.

幾つかの実施形態では、ウェル底部は、凹状のアーチ形表面又は「カップ」の幾何学形状、例えば、半球面、丸底を有する円錐面、及び同様の表面形状、又はそれらの組合せなどを含む。ウェル（例えば、マイクロウェル）及びウェル底部は、くぼみ、凹形円錐台状の起伏表面、又はそれらの組合せなど、スフェロイドに「フレンドリー」な丸みを帯びた面又は曲面内で最終的には終結、終端、又は底付きしうる。   In some embodiments, the well bottom includes a concave arcuate surface or “cup” geometry, such as a hemispherical surface, a conical surface with a round bottom, and similar surface shapes, or combinations thereof. . Wells (e.g., microwells) and well bottoms eventually terminate in rounded or curved surfaces that are "friendly" to spheroids, such as depressions, concave frustoconical relief surfaces, or combinations thereof, Can be terminated or bottomed.

ある特定の実施形態では、側壁の一部及び／又はウェル底部は、可視及び／又はＵＶスペクトル内の波長に対してさまざまな度合いの不透明性／透明性のものである。例えば、不透明な側壁は、透明なマイクロウェル底部と組み合わせられうる。不透明な部分から透明な部分への移行は、漸進的又は激的でありうる。   In certain embodiments, the portion of the sidewall and / or the bottom of the well is of varying degrees of opacity / transparency for wavelengths in the visible and / or UV spectrum. For example, opaque sidewalls can be combined with a transparent microwell bottom. The transition from the opaque part to the transparent part can be gradual or intense.

幾つかの実施形態では、ウェル（例えば、マイクロウェル）は、少なくとも１つの凹状のアーチ形表面上など、ウェルの一部の上に、低接着性、非接着性、又は高接着性のコーティングを含む。   In some embodiments, the well (eg, microwell) has a low-adhesion, non-adhesive, or high-adhesion coating on a portion of the well, such as on at least one concave arcuate surface. Including.

幾つかの実施形態では、本装置はさらに、吸引用のピペットの先端を受け入れるため、例えば、ウェル付属部（well annex）、ウェル拡張領域、又は補助サイドチャンバを備えている。幾つかの実施形態では、ウェル付属部又はウェル拡張部（例えば、サイドポケット）は、例えば、ウェル（例えば、マイクロウェル）に隣接し、かつ、流体連通した一体型表面である。幾つかの実施形態では、ウェル付属部は、ウェルのガス透過性の透明な底部から離間された底部を有する。ウェル付属部及びチャンバウェルの第２の底部は、例えば、より高い位置又は比較的高所など、ガス透過性の透明な底部から離間されている。幾つかの実施形態では、ウェル付属部の第２の底部は、スフェロイドの***又はかく乱を避けるために、ピペットから分配される流体を透明な底部から離すように偏向させる。   In some embodiments, the apparatus further comprises, for example, a well annex, a well extension region, or an auxiliary side chamber to receive the tip of a suction pipette. In some embodiments, the well appendage or well extension (eg, side pocket) is, for example, an integral surface adjacent to and in fluid communication with the well (eg, microwell). In some embodiments, the well appendage has a bottom spaced from the gas permeable transparent bottom of the well. The well appendage and the second bottom of the chamber well are spaced apart from a gas permeable transparent bottom, for example at a higher or relatively high location. In some embodiments, the second bottom of the well appendage deflects the fluid dispensed from the pipette away from the clear bottom to avoid spheroid disruption or perturbation.

ある特定の実施形態では、装置はさらに、ウェルの一部の内部に位置した、ウェル付属部の一部の内部に位置した、又はウェル及びウェル付属部分の両方の内部に位置した、ライナ又はメンブレンインサートなどの多孔膜を備えている。多孔膜は、底部近くの１つ又は両方のウェルの下部の第１の細胞材料から、ウェルの上部に位置した、多孔膜によって形成されたウェルの上部に位置した、又は両方のウェルの上部に位置した、異なる細胞型又は異なる細胞状態などの第２の細胞材料の単離又は分離を提供しうる。   In certain embodiments, the apparatus further includes a liner or membrane located within a portion of the well, located within a portion of the well appendage, or located within both the well and the well appendage. A porous membrane such as an insert is provided. The porous membrane is from the first cellular material at the bottom of one or both wells near the bottom, located at the top of the well, at the top of the well formed by the porous membrane, or at the top of both wells. Isolation or separation of the second cellular material, such as located, different cell types or different cell states may be provided.

装置及びウェルの幾何学形状は、当技術分野で知られた任意の適切な技法によって製造される。幾つかの実施形態では、熱エンボス加工、熱変形、及び／又は射出成形法が、細胞培養と相容性のプラスチックにおけるマイクロパターン化された表面の生成に使用される。図１２は、本明細書において使用される熱エンボス／熱成形の製造プロセスの図式を示している。幾つかの実施形態では、特定の厚さのポリスチレンフィルム（又は別の適切なポリマーフィルム）が耐熱性のシリコーン支持体上に配置される。次に、鋳型が下向きのマイクロポストを有するフィルム上に配置される。組立体全体が、１３０℃で１０分間、予備加熱したプレートの間で、５Ｎの荷重下で押圧される。１０分後、プレートが１００℃未満に冷却されて、マイクロパターン化され、型押し／熱成形されたフィルムが組立体から取り外され、３Ｄ凝集促進表面として標準的な（regular）細胞培養容器内に取り込まれる。他の温度、時間、圧力、及び材料は、本発明の範囲内でありうる。   The device and well geometries are manufactured by any suitable technique known in the art. In some embodiments, hot embossing, thermal deformation, and / or injection molding methods are used to generate micropatterned surfaces in plastics that are compatible with cell culture. FIG. 12 shows a schematic of the hot embossing / thermoforming manufacturing process used herein. In some embodiments, a specific thickness of polystyrene film (or another suitable polymer film) is placed on a heat resistant silicone support. The mold is then placed on the film with the downwardly facing microposts. The entire assembly is pressed under a 5N load between preheated plates at 130 ° C. for 10 minutes. After 10 minutes, the plate is cooled to below 100 ° C., the micropatterned, embossed / thermoformed film is removed from the assembly, and placed in a regular cell culture vessel as a 3D aggregation promoting surface. It is captured. Other temperatures, times, pressures, and materials can be within the scope of the present invention.

細胞付着を防ぐために、幾つかの実施形態では、マイクロパターン化された表面は、ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡ、プルロニック（Pluronic）、又は商標名ＵＬＡ（超低接着表面）処理など、細胞付着を抑制するポリマーを用いて処理される。初期のポリマーフィルムの厚さ及び処理パラメータに応じて、異なる底部厚さを有するマイクロウェルを有する表面が生成される。幾つかの実施形態では、マイクロウェル底部のポリマーの厚さは、酸素透過性に直接的影響を有する。より薄いマイクロウェル底部は、マイクロウェル内部に位置する細胞へのより良好な酸素供給を可能にする。上記作製方法は、高度に酸素透過性のマイクロウェルを有する表面をもたらす。   In order to prevent cell attachment, in some embodiments, the micropatterned surface is a polymer that inhibits cell attachment, such as poly-HEMA, Pluronic, or the trade name ULA (ultra-low adhesion surface) treatment. Processed. Depending on the initial polymer film thickness and processing parameters, surfaces with microwells with different bottom thicknesses are produced. In some embodiments, the polymer thickness at the bottom of the microwell has a direct effect on oxygen permeability. The thinner microwell bottom allows for better oxygen supply to cells located inside the microwell. The above fabrication method results in a surface having highly oxygen permeable microwells.

幾つかの実施形態では、本明細書に記載の装置及びシステムは、このような装置におけるさまざまなコンパートメント、ウェル等の内外への流体（例えば、培地）及び細胞（例えば、スフェロイド）の移動のためのマイクロ流体要素を備えている。マイクロ流体要素としては、チャネル、リザーバ、弁、ポンプ等が挙げられうる。   In some embodiments, the devices and systems described herein are for the transfer of fluid (eg, media) and cells (eg, spheroids) into and out of various compartments, wells, etc. in such devices. Of microfluidic elements. Microfluidic elements can include channels, reservoirs, valves, pumps, and the like.

インビトロ３Ｄ腫瘍細胞培養は、単純な二次元細胞単層よりも正確な複合インビボ微小環境を反映する。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のマイクロウェルパターン化表面を有する細胞培養フォーマットは、日常的なハイスループットの薬物開発及び前臨床研究と相容性の均一寸法の３Ｄ培養物（例えば、腫瘍スフェロイド）の大量の生成をもたらす。   In vitro 3D tumor cell cultures reflect a more complex in vivo microenvironment than simple two-dimensional cell monolayers. In some embodiments, a cell culture format having a microwell patterned surface as described herein is a uniform sized 3D culture compatible with routine high-throughput drug development and preclinical studies (eg, A large amount of tumor spheroids).

幾つかの実施形態では、本明細書に記載の培養容器は、均一かつ容易な大規模の凝集体形成を可能にする、誘発された多能性幹（ｉＰＳ）細胞及び胚性幹細胞（ＥＳＣ）からの胚様体（ＥＢ）の形成に用いられる。幾つかの実施形態では、培地交換は、ＥＢが連続的に数週間、増殖するように行われる。幾つかの実施形態では、寸法は、播種された細胞の数及び培養時間に応じて決まることから、各凝集体の寸法は制御される。幾つかの実施形態では、凝集体は、より大きい培地容積又はスフェロイドの解析が可能な従来のウェルプレートへと移される。幾つかの実施形態では、多数形成されたＥＢは、単一のプレート内でのトランスフェクトされた標的又は小分子のハイスループット解析に由来する統計的に重要なデータを提供する。１つの培養容器内での多数の３Ｄ細胞凝集体の形成を支援する能力は、例えば改変されたペトリ皿などのこれらの容器を、細胞の再プログラミングのためのＥＢ形成クローンの選択に適用可能にする。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の容器はまた、肝細胞及び胚性幹細胞など、毒性に関連するさまざまな細胞型の３Ｄ細胞凝集体の形成を支援する。幾つかの実施形態では、マイクロウェル表面の容器は、例えば、生体処理工学の分野におけるタンパク質生成の目的で、３Ｄ凝集体の細胞培養に用いられる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のマイクロウェルパターン化された表面を有する細胞培養フォーマットは、幹細胞ニッチ共培養、特に、クローン培養の単一の幹細胞とニッチの共培養を可能にする手段を提供する。幹細胞表面マーカー又は幹細胞分化マーカーについての確立された染色プロトコル、並びに画像処理と組み合わせて、単一の幹細胞とニッチの共培養のコンピュータによる同定が行われうる。   In some embodiments, the culture vessels described herein induce induced pluripotent stem (iPS) cells and embryonic stem cells (ESC) that allow uniform and easy large-scale aggregate formation. Used for the formation of embryoid bodies (EBs). In some embodiments, the media change is performed such that EBs are continuously growing for several weeks. In some embodiments, the size of each aggregate is controlled because the size depends on the number of cells seeded and the incubation time. In some embodiments, the aggregates are transferred to a conventional well plate capable of larger media volume or spheroid analysis. In some embodiments, a large number of formed EBs provide statistically important data derived from high-throughput analysis of transfected targets or small molecules within a single plate. The ability to support the formation of multiple 3D cell aggregates in one culture vessel makes these vessels, such as modified Petri dishes, applicable to the selection of EB-forming clones for cell reprogramming To do. In some embodiments, the containers described herein also support the formation of 3D cell aggregates of various cell types associated with toxicity, such as hepatocytes and embryonic stem cells. In some embodiments, microwell surface containers are used for cell culture of 3D aggregates, eg, for protein production purposes in the field of bioprocessing engineering. In some embodiments, a cell culture format having a microwell patterned surface as described herein enables stem cell niche co-culture, particularly co-culture of a single stem cell and niche of a clonal culture. Provide a means. In combination with established staining protocols for stem cell surface markers or stem cell differentiation markers, as well as image processing, computer identification of single stem cell and niche co-cultures can be performed.

マイクロパターン化された容器はまた、３Ｄフォーマットで細胞を保存するための細胞の保管目的でも用いられる。幾つかの実施形態では、スフェロイドがひとたび特定の寸法まで増殖されると（典型的には、安定状態以前の過渡的状態において）、それらはマイクロウェルから移され、回収されたスフェロイドは冷凍保存され、後日使用するために保管される。過渡的スフェロイドとは、スフェロイドの寸法が連続的に成長可能であることを意味し、一方、安定なスフェロイドとは、スフェロイドが、その固有の寸法の許容限界に達した時点で、寸法の成長を停止することを意味する。さまざまな凍結保存方法が本発明の範囲内にあり、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）等が挙げられるがこれらに限られない。   Micropatterned containers are also used for cell storage purposes for storing cells in 3D format. In some embodiments, once the spheroids are grown to a specific size (typically in a transient state prior to the steady state), they are removed from the microwell and the recovered spheroids are stored frozen. Stored for later use. Transient spheroids mean that spheroid dimensions can grow continuously, while stable spheroids mean that spheroids will grow when they reach their inherent dimensional tolerances. Means to stop. Various cryopreservation methods are within the scope of the present invention, including but not limited to dimethyl sulfoxide (DMSO), fetal bovine serum (FBS), and the like.

実施例１：基材の製造
実施形態に従った基材を、図１２に示されるエンボス加工法を使用して製造した。図１２は、ポリマーフィルムにおけるマイクロウェル形成の熱エンボス／熱成形法を示している。ホットプレート１を提供する。ホットプレートを１３０℃まで予備加熱した。所望のウェルプロファイルを反映する、エンボス加工の鋳型２を提供した。ポリマーフィルム３の層を提供し、シリコーンマット４をポリマーフィルムの後ろに提供した。ホットプレートを加熱し、シリコーン層で支えられたポリマーフィルムに対して押圧した。ホットプレートを取り外したときに、その内部で型押しされた所望のウェルプロファイルを有するマイクロウェルのアレイを有するポリマーフィルムを得た。 Example 1 Production of Substrate A substrate according to an embodiment was produced using the embossing method shown in FIG. FIG. 12 shows a hot embossing / thermoforming method for microwell formation in a polymer film. A hot plate 1 is provided. The hot plate was preheated to 130 ° C. An embossed mold 2 was provided that reflects the desired well profile. A layer of polymer film 3 was provided and a silicone mat 4 was provided behind the polymer film. The hot plate was heated and pressed against a polymer film supported by a silicone layer. When the hot plate was removed, a polymer film was obtained having an array of microwells with the desired well profile embossed therein.

実施例２：細胞培養
本明細書に記載の実施形態の開発中に行われた実験は、例えば、３Ｄ細胞凝集体の所望の直径の約１〜３倍の直径（Ｄ）を有する、各々が半球形の円形底部及び丸みを帯びた上部を有する、個別の空間的に離間されたマイクロウェルのアレイにおいて、均一な直径の３Ｄ細胞培養凝集体が形成及び培養されることを実証するものである。マイクロウェル高さ（Ｈ）は、円形の底部部分の直径の約０．７〜１．３倍に等しく、マイクロウェルの上部開口部の直径（Ｄ上部）は、円形の底部の直径の約１．５〜２．５倍に等しい。 Example 2: Cell Culture Experiments conducted during the development of the embodiments described herein, for example, have a diameter (D) of about 1 to 3 times the desired diameter of 3D cell aggregates, each Demonstrate that uniform diameter 3D cell culture aggregates are formed and cultured in an array of discrete spatially spaced microwells with a hemispherical circular bottom and rounded top. . The microwell height (H) is equal to about 0.7 to 1.3 times the diameter of the circular bottom portion, and the diameter of the top opening of the microwell (D top ) is about 1 of the diameter of the circular bottom portion. Equal to 5 to 2.5 times.

マイクロウェルパターン化された表面を有するＴ２５細胞培養フラスコのプロトタイプを製造し、提示された設計のスフェロイド形成の一様性、及び、保持／採取の利益について検証するために、細胞培養用途において試験される、実験を行った。図８は、円形の底部幾何学形状を有するＴ２５プロトタイプのマイクロウェル断面の逆複製（reverse replica）の画像を含む。プロトタイプのＴ２５フラスコ内でＨＴ２９細胞によって形成されたスフェロイドの画像が図１０Ａに示されている。図１０Ｂは、フラスコから採取されたスフェロイドを示しており、これは、図１１に示される、Ｎｕｎｃ Ｎｕｎｃ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社から市販される、市販のＮＵＮＣＬＯＮ ＳＰＨＥＲＡ（商標）低結合表面フラスコを用いて増殖させたものと比較可能であり、低結合表面を有するがスフェロイドの生成を画成及び制御するためのウェルを有しない市販の対照と比較して、本明細書に記載のウェルの優れた性能が、実施形態において生成されたスフェロイドの均一性に表れている。円形の底部幾何学形状は、スフェロイドを誘発する幾何学形状である。本明細書の実施形態の開発中に、細胞培養性能におけるマイクロウェルの酸素透過性の影響を実証するための実験を行った。上記実施例１に記載されるように、異なる厚さのマイクロウェルを有する、６ウェル及び１２ウェルプレートを製造した。図１３は、異なる底部厚さを有するマイクロウェルにおける、マイクロウェルのアレイを備えた基材（実施例１に記載される）を有する６ウェルプレートで細胞を増殖させた後に測定した生細胞カウント数を実証するグラフを示している。図１３に示されるように、Ａは７０μｍの厚さであり、Ｂは１２０μｍの厚さであり、Ｃは３２０μｍである。対照は、ＴＣＴ処理された１ｍｍ厚の平坦なポリスチレンであった。図１３に示される結果から分かるように、より薄い材料（よりガス透過性を示す）は、実施形態において、より力強い細胞増殖を支援した。   Prototypes of T25 cell culture flasks with microwell patterned surfaces have been tested and tested in cell culture applications to verify the uniformity of spheroid formation and retention / harvesting benefits of the proposed design. An experiment was conducted. FIG. 8 includes a reverse replica image of a microwell cross section of a T25 prototype having a circular bottom geometry. An image of spheroids formed by HT29 cells in a prototype T25 flask is shown in FIG. 10A. FIG. 10B shows spheroids harvested from the flask, which was grown using the commercially available NUNCLON SPHERA ™ low binding surface flask from Nunc Nunc / Thermo Fisher, shown in FIG. The wells described herein have superior performance compared to a commercial control that has a low binding surface but does not have wells to define and control spheroid formation. This is shown in the uniformity of the spheroids generated in the embodiment. A circular bottom geometry is a geometry that induces a spheroid. During development of the embodiments herein, experiments were conducted to demonstrate the effect of microwell oxygen permeability on cell culture performance. As described in Example 1 above, 6-well and 12-well plates with microwells of different thickness were manufactured. FIG. 13 shows live cell counts measured after growing cells in a 6-well plate with a substrate (described in Example 1) with an array of microwells in microwells with different bottom thicknesses. The graph which demonstrates is shown. As shown in FIG. 13, A is 70 μm thick, B is 120 μm thick, and C is 320 μm. The control was 1 mm thick flat polystyrene treated with TCT. As can be seen from the results shown in FIG. 13, the thinner material (more gas permeable) supported stronger cell growth in the embodiment.

図１３は、異なる底部厚さを有するマイクロウェルにおける、マイクロウェルのアレイを備えた基材（実施例１に記載される）を有する６ウェルプレート内で細胞を増殖させた後に測定した生細胞カウント数を実証するグラフを示している。図１４Ａ及びＢは、平坦な表面に対し、マイクロウェルのアレイを有する基材についての生細胞カウント数及び細胞増殖率を比較するグラフを示している。図１５は、平坦な表面に対し、マイクロウェルのアレイを有する基材上で培養されたＭＨ６７７細胞から排出されたタンパク質の全力価を示すグラフを示している。   FIG. 13 shows live cell counts measured after growing cells in 6-well plates with substrates (described in Example 1) with arrays of microwells in microwells with different bottom thicknesses. A graph demonstrating the number is shown. FIGS. 14A and B show graphs comparing the viable cell count and cell growth rate for a substrate having an array of microwells against a flat surface. FIG. 15 shows a graph showing the total titer of protein excreted from MH677 cells cultured on a substrate with an array of microwells against a flat surface.

ＭＨ６７７細胞の培養を、２日ごとに培地交換しつつ、７日間又は９日間の間、行った。図１３に提示される結果は、マイクロウェル底部の厚さに対する全生細胞カウント数の依存を実証している。酸素透過性のマイクロウェル（カラムＡ、７０μｍ厚の底部）内で培養された細胞は、より低酸素透過性のカラムＣの３２０μｍ厚の底部と比較して８２％高い生細胞カウント数を得た。全体的に、マイクロウェルパターン化された表面での培養は、標準的な平坦な非接着性の表面と比較して、より高い生細胞カウント数（図１４Ａ）及び、１細胞当たりのより高い増殖率（図１４Ｂ）を生じる（図１４）。これは、８５％高いタンパク質収率を生じる（図１５）。   MH677 cells were cultured for 7 or 9 days with medium change every 2 days. The results presented in FIG. 13 demonstrate the dependence of total viable cell count on microwell bottom thickness. Cells cultured in oxygen permeable microwells (column A, 70 μm thick bottom) gave a 82% higher viable cell count compared to the 320 μm thick bottom of the lower oxygen permeable column C. . Overall, culturing on microwell patterned surfaces resulted in higher viable cell counts (FIG. 14A) and higher proliferation per cell compared to standard flat non-adherent surfaces. Yields a rate (FIG. 14B) (FIG. 14). This results in a protein yield that is 85% higher (FIG. 15).

本明細書の実施形態の開発中に、本明細書に記載の細胞培養装置及びウェルを使用して、２Ｄ培養に対し３Ｄ培養での細胞の有利な増殖を実証するために、実験を行った。ＣＨＯ５／９アルファ細胞（図３４Ａ）及びＢＨＫ−２１細胞（図３４Ｂ）の両方において、２Ｄと比較した場合に、３Ｄ培養では１ｃｍ２あたり、はるかに多いタンパク質（図３４Ａのｈｍ−ＣＳＦ；図３４ＢのＥＰＯ）を生成した。 During development of the embodiments herein, experiments were conducted to demonstrate the advantageous growth of cells in 3D culture versus 2D culture using the cell culture devices and wells described herein. . In both CHO5 / 9 alpha cells (FIG. 34A) and BHK-21 cells (FIG. 34B), much more protein (cm-CSF in FIG. 34A; FIG. 34B) per cm 2 in 3D culture when compared to 2D. EPO).

本明細書で言及した及び／又は以下に列挙するすべての刊行物及び特許文献は、参照することによって本明細書に取り込まれる。本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に記載される特徴及び実施形態のさまざまな改質、組み換え、及びバリエーションは、当業者にとって明白であろう。特定の実施形態について記載してきたが、特許請求の範囲に記載される発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと解されたい。実際、当業者にとって自明な、記載されるモード及び実施形態のさまざまな修正は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図されている。   All publications and patent documents mentioned in the specification and / or listed below are hereby incorporated by reference. Various modifications, recombination, and variations of the features and embodiments described herein will be apparent to those skilled in the art without departing from the scope and spirit of the invention. Although specific embodiments have been described, it should be understood that the invention as claimed should not be unduly limited to such specific embodiments. Indeed, various modifications of the described modes and embodiments that are obvious to those skilled in the art are intended to be within the scope of the following claims.

以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。   Hereinafter, preferable embodiments of the present invention will be described in terms of items.

実施形態１
少なくとも１つの毛管構造と、スフェロイドを誘発する幾何学形状とを含むマイクロウェルのアレイを有する細胞培養基材。 Embodiment 1
A cell culture substrate having an array of microwells comprising at least one capillary structure and a spheroid-inducing geometry.

実施形態２
前記少なくとも１つの毛管構造が、リッジ、割れ目、ピラー、不連続な壁、波形状の壁、口部、放物面又は正弦波のウェル形状、若しくは組合せからなる群より選択されることを特徴とする、実施形態１に記載の細胞培養基材。 Embodiment 2
The at least one capillary structure is selected from the group consisting of ridges, fissures, pillars, discontinuous walls, corrugated walls, mouths, paraboloids or sinusoidal well shapes, or combinations. The cell culture substrate according to Embodiment 1.

実施形態３
前記リッジが、円形状、角形状、針状、又は六角形の形状であることを特徴とする、実施形態２に記載の細胞培養基材。 Embodiment 3
The cell culture substrate according to embodiment 2, wherein the ridge has a circular shape, a square shape, a needle shape, or a hexagonal shape.

実施形態４
前記割れ目が、円形状、角形状、針状、又は六角形の形状であることを特徴とする、実施形態２に記載の細胞培養基材。 Embodiment 4
The cell culture substrate according to embodiment 2, wherein the crack is a circular shape, a square shape, a needle shape, or a hexagonal shape.

実施形態５
前記スフェロイドを誘発する幾何学形状が、ピラー、不連続な壁、波形状の壁、丸みを帯びたセル底部、くぼみのあるウェル底部、凹み、ペン先領域、不連続な壁、又は組合せを含むことを特徴とする、実施形態１〜４のいずれかに記載の細胞培養基材。 Embodiment 5
The spheroid-inducing geometry includes pillars, discontinuous walls, wavy walls, rounded cell bottoms, recessed well bottoms, indentations, nib areas, discontinuous walls, or combinations The cell culture substrate according to any one of Embodiments 1 to 4, wherein

実施形態６
前記基材が、前記細胞培養基材の表面１平方センチメートル当たり、前記マイクロウェルを２〜１００００個含むことを特徴とする、実施形態１〜５のいずれかに記載の細胞培養基材。 Embodiment 6
The cell culture substrate according to any one of Embodiments 1 to 5, wherein the substrate includes 2 to 10,000 microwells per square centimeter of the surface of the cell culture substrate.

実施形態７
前記マイクロウェルの少なくとも前記底部が、非接着性の表面を含むことを特徴とする、実施形態１〜６のいずれかに記載の細胞培養基材。 Embodiment 7
The cell culture substrate according to any one of Embodiments 1 to 6, wherein at least the bottom of the microwell includes a non-adhesive surface.

実施形態８
前記マイクロウェルの少なくとも前記底部が、ガス透過性材料を含むことを特徴とする、実施形態１〜７のいずれかに記載の細胞培養基材。 Embodiment 8
8. The cell culture substrate according to any one of Embodiments 1 to 7, wherein at least the bottom of the microwell contains a gas permeable material.

実施形態９
前記基材が、前記細胞培養基材の表面１平方センチメートル当たり、前記マイクロウェルを２〜１００００個含むことを特徴とする、実施形態１〜８のいずれかに記載の細胞培養基材。 Embodiment 9
The cell culture substrate according to any one of Embodiments 1 to 8, wherein the substrate includes 2 to 10,000 microwells per square centimeter of the surface of the cell culture substrate.

実施形態１０
前記細胞培養基材が、細胞培養容器の少なくとも一部を含むことを特徴とする、実施形態１〜９のいずれかに記載の細胞培養基材。 Embodiment 10
The cell culture substrate according to any one of Embodiments 1 to 9, wherein the cell culture substrate includes at least a part of a cell culture container.

実施形態１１
前記細胞培養容器が、マルチウェルプレート、皿、フラスコ、管、多層フラスコ、側部軟質性のフラスコ及びバッグからなる群より選択されることを特徴とする、実施形態１０に記載の細胞培養基材。 Embodiment 11
The cell culture substrate according to embodiment 10, wherein the cell culture container is selected from the group consisting of a multiwell plate, a dish, a flask, a tube, a multi-layer flask, a side flexible flask, and a bag. .

実施形態１２
前記細胞培養容器が、透過性の膜によって互いに分離された少なくとも２つの細胞培養チャンバを備えていることを特徴とする、実施形態１０に記載の細胞培養基材。 Embodiment 12
The cell culture substrate according to embodiment 10, wherein the cell culture container comprises at least two cell culture chambers separated from each other by a permeable membrane.

実施形態１３
前記マイクロウェルが、該マイクロウェルの少なくとも１つと単一の液体貯槽との間の流体連通を可能にするように構成されることを特徴とする、実施形態１〜１２のいずれかに記載の細胞培養基材。 Embodiment 13
Embodiment 13. The cell of any of embodiments 1-12, wherein the microwell is configured to allow fluid communication between at least one of the microwells and a single liquid reservoir. Culture substrate.

実施形態１４
前記細胞培養容器が、前記マイクロウェルの上部に配置されたメッシュを備えていることを特徴とする、実施形態１〜１０のいずれかに記載の細胞培養基材。 Embodiment 14
The cell culture substrate according to any one of Embodiments 1 to 10, wherein the cell culture container includes a mesh disposed on the microwell.

実施形態１５
各マイクロウェルが、上部開口、ウェル底部、及び、１つ以上の側壁を備えており、
前記上部開口が有効直径Ｄ上部を有し、前記１つ以上の側壁が前記ウェル底部から前記上部開口まで延びる高さＨを有し、前記マイクロウェルが前記上部開口とウェル底部との間の有効直径の中間点Ｄ中間を有し、Ｄ上部：Ｄ中間の比が１．５：２．５である
ことを特徴とする、実施形態１〜１４のいずれかに記載の細胞培養基材。 Embodiment 15
Each microwell comprises a top opening, a well bottom, and one or more sidewalls;
The top opening has an effective diameter D top , the one or more sidewalls have a height H extending from the well bottom to the top opening, and the microwell is effective between the top opening and the well bottom. has a midpoint D intermediate diameter, D top: D ratio of the intermediate is 1.5: 2.5, characterized in that a cell culture substrate according to any of embodiments 1 to 14.

実施形態１６
Ｄ上部＝１．５〜２．５Ｄ中間であることを特徴とする、実施形態１５に記載の細胞培養基材。 Embodiment 16
16. The cell culture substrate according to embodiment 15, wherein D upper part = 1.5 to 2.5D intermediate .

実施形態１７
Ｈ＝０．７〜１．３Ｄ中間であることを特徴とする、実施形態１５に記載の細胞培養基材。 Embodiment 17
16. The cell culture substrate according to embodiment 15, wherein H = 0.7 to 1.3D intermediate .

実施形態１８
Ｄ中間が２００〜１０００μｍであることを特徴とする、実施形態１５に記載の細胞培養基材。 Embodiment 18
16. The cell culture substrate according to embodiment 15, wherein the D- intermediate is 200 to 1000 μm.

実施形態１９
実施形態１０〜１２のいずれかに記載の細胞培養容器に培養培地を充填する工程；及び、
スフェロイド形成細胞を前記培養培地に加える工程
を含む、スフェロイドを培養する方法。 Embodiment 19
Filling the cell culture container according to any one of Embodiments 10 to 12 with a culture medium; and
A method for culturing spheroids, comprising adding spheroid-forming cells to the culture medium.

実施形態２０
前記培養培地を置換又は交換する工程をさらに含むことを特徴とする、実施形態１９に記載の方法。 Embodiment 20.
Embodiment 20. The method of embodiment 19, further comprising replacing or replacing the culture medium.

参照文献References

1. H. Dolznig, A. Walzl, Organotypic spheroid cultures to study tumor- stroma interactions during cancer development. Drug discovery today, V 8., No 2-3, 2011, 113-118
2. J. Engelberg, G. Ropella, Essential operating principles for tumor spheroid grwth. BMC Systems Biology 2008, 2, 110
3. Y. Tung, A. Hsiao, S. Alen. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using 384 hanging drop array. Analyst, 2011, 136, 473-478
4. J. Friedrich, C. Seidel, R. Ebner. Spheroid ■based drug screen: considerations and practical approach. Nature protocols, 2009, vol4 no3, 309-323
5. F. Hirschhaeuser, H. Menne, C. Dittfeld, Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology, 2010, 148, 3-15
6. T. Bartosh, J. Ylostalo, A. Mohammadipoor. Aggregation of human mesenchymal stromal cells into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. PNAS,2010, 107, no 31, 13724-13729
7. J. Frith, M. Res, B. Thomson. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue engineering, 2010, 16, no 4, 735-749
8. S. Sart, A.Tsai, Y. Li. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties and applications. Tissue engineering, 2013, Part B, 00, no 00, 1-16 1. H. Dolznig, A. Walzl, Organotypic spheroid cultures to study tumor- stroma interactions during cancer development.Drug discovery today, V 8., No 2-3, 2011, 113-118
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１００ ウェルのアレイ
１１０ 口部
１１１ 上部開口部／口部の上部
１１２ 口部の底部
１１３ 側壁
１１５ ウェル
１１６ ウェルの底部
１７０ リッジ
２７０ 割れ目
４０１ マイクロウェル
４０２ フレーム
４０３ 側壁
５００ スフェロイド
５０１ ピラー
５０５ 空間
５１０ 上部
５１５ ウェル
８００ フラスコ
８１５ 上面
８２０ 側壁
８５０ 細胞培養チャンバ
８６０ ポート
８６１ ねじぶた
１１１０ 基材
１１１４ 基材
１３００ 細胞培養培地
１４００ 細胞培養装置
１４１０Ａ〜Ｃ 細胞培養コンパートメント
１４１５ トレイ
１４２０ 通気マニホルド
１４２２ キャップ
１４２５ 開口部
１４２６ 開口部
１４２７ フィルタ
１４２９ 通気カラム
１４３０ 充填マニホルド
１４３２ キャップ
１４３５ 開口部
１４３９ 列
１４４０ 側壁
１４４１ 上部空間
１４４２ 通気開口
１４４３ 充填開口
１４５０ 上部内面／上面
１４６０Ａ〜Ｃ 通路／導管空間
１５００ スペーサ
１５１０ プレート
１６０１ 六角形のウェル
２１００ 細胞培養装置
２１１０ 基材
２１１５ ウェル
２１２０ 側壁
２１５２ 培養チャンバ
２１５４ 第２のチャンバ
２１６２ 第１のポート
２１６４ 第２のポート
２２０２ スフェロイド細胞
３１００ 細胞培養装置
３１１０ 基材
３１１１ プレート
３１１３ フレーム
３１１５ ウェル
３１１６ ペン先領域
３１１８ 上部開口
３１２０ 側壁表面
３１２１ 変曲点
３１２２ 下部側壁表面
３１２３ 点
３１２４ 上部側壁表面
３１３０ スフェロイド
３１４０ 細胞培養容積
３１４２ 高さ
３１４４ 直径寸法
３１４５ 第２の容積
３１５０ 基材
３６００ 細胞培養組立体
３６１０ 底部プレート
３６１１ 主面
３６１５ マイクロウェル／ウェル
３６２０ 側壁
３６５０ 細胞培養装置
３６７０ メッシュ
４１００ 細胞培養装置
４１１０ 底部プレート
４１１５ マイクロウェル／ウェル
４１２０ 側壁
４１４０ 入口
４１４５ 出口
４２００ 細胞培養組立体
４５６０ フレーム
４５７０ メッシュ 100 well array 110 mouth 111 top opening / top of mouth 112 bottom of mouth 113 sidewall 115 well 116 bottom of well 170 ridge 270 split 401 microwell 402 frame 403 sidewall 500 spheroid 501 pillar 505 space 510 top 515 well 800 Flask 815 Upper surface 820 Side wall 850 Cell culture chamber 860 Port 861 Screw lid 1110 Base material 1114 Base material 1300 Cell culture medium 1400 Cell culture device 1410A-C Cell culture compartment 1415 Tray 1420 Aeration manifold 1422 Cap 1425 Opening 1426 Opening 1427 1429 Aeration column 1430 Filling manifold 1432 Cap 1435 Opening 1439 Row 1440 side Wall 1441 Upper space 1442 Ventilation opening 1443 Filling opening 1450 Upper inner surface / upper surface 1460A-C Passage / conduit space 1500 Spacer 1510 Plate 1601 Hexagonal well 2100 Cell culture device 2110 Base material 2115 Well 2120 Side wall 2152 Culture chamber 2154 Second chamber 2162 1st port 2164 2nd port 2202 Spheroid cell 3100 Cell culture device 3110 Base material 3111 Plate 3113 Frame 3115 Well 3116 Pen tip region 3118 Upper opening 3120 Side wall surface 3121 Inflection point 3122 Lower side wall surface 3123 Point 3124 Upper side wall surface 3130 Spheroid 3140 Cell culture volume 3142 Height 3144 Diameter dimension 3145 Second volume 3150 Substrate 3600 Fine Culture assembly 3610 bottom plate 3611 main surface 3615 microwells / well 3620 sidewall 3650 cell culture device 3670 mesh 4100 cell culture device 4110 bottom plate 4115 microwell / well 4120 sidewall 4140 inlet 4145 outlet 4200 cell culture assembly 4560 frames 4570 mesh

Claims (20)

マイクロウェルのアレイを含む細胞培養基材であって、各マイクロウェルが、丸みを帯びた上部ウェルエッジ、少なくとも１つのマイクロウェル側壁、及び丸みを帯びたウェル底部によって画成された前記マイクロウェル内への開口部を備えている、細胞培養基材。   A cell culture substrate comprising an array of microwells, wherein each microwell is defined by a rounded top well edge, at least one microwell sidewall, and a rounded well bottom. A cell culture substrate comprising an opening to. 各マイクロウェルの断面が、正弦波のウェル形状を有することを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養基材。   The cell culture substrate according to claim 1, wherein the cross section of each microwell has a sinusoidal well shape. １つ以上のリッジをさらに備えており、該リッジが、円形状、角形状、針状、又は六角形の形状であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞培養基材。   The cell culture substrate according to claim 1 or 2, further comprising one or more ridges, wherein the ridges have a circular shape, a square shape, a needle shape, or a hexagonal shape. １つ以上の割れ目をさらに備えており、該割れ目が、円形状、角形状、針状形状又は六角形の形状であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞培養基材。   The cell culture substrate according to claim 1 or 2, further comprising one or more cracks, wherein the cracks have a circular shape, a square shape, a needle shape, or a hexagonal shape. 前記丸みを帯びたウェル底部が１０〜１００μｍの厚さを有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞培養基材。   The cell culture substrate according to any one of claims 1 to 4, wherein the rounded well bottom has a thickness of 10 to 100 µm. 前記マイクロウェルの壁が、前記マイクロウェル内への前記開口部の最も近くで相対的により厚くなり、前記マイクロウェルの前記底部で相対的により薄くなることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞培養基材。   The wall of the microwell is relatively thicker closest to the opening into the microwell and is relatively thinner at the bottom of the microwell. The cell culture substrate according to any one of the above. 前記基材が、前記細胞培養基材の表面１平方センチメートル当たり、前記マイクロウェルを２〜１００００個含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞培養基材。   The cell culture substrate according to any one of claims 1 to 6, wherein the substrate comprises 2 to 10,000 microwells per square centimeter of the surface of the cell culture substrate. 少なくとも前記丸みを帯びたウェル底部が非接着性の表面を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞培養基材。   The cell culture substrate according to any one of claims 1 to 7, wherein at least the rounded well bottom includes a non-adhesive surface. 少なくとも前記丸みを帯びたウェル底部がガス透過性材料を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞培養基材。   The cell culture substrate according to any one of claims 1 to 8, wherein at least the rounded well bottom includes a gas permeable material. 前記マイクロウェル側壁が不連続であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞培養基材。   The cell culture substrate according to any one of claims 1 to 9, wherein the microwell side wall is discontinuous. 前記マイクロウェル側壁が波形状であることを特徴とする、請求項１０に記載の細胞培養基材。   The cell culture substrate according to claim 10, wherein the side wall of the microwell has a wave shape. 前記細胞培養基材が、細胞培養容器の少なくとも一部を含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞培養基材。   The cell culture substrate according to any one of claims 1 to 11, wherein the cell culture substrate includes at least a part of a cell culture container. 前記細胞培養容器が、マルチウェルプレート、皿、フラスコ、管、多層フラスコ、側部軟質性のフラスコ、及びバッグからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の細胞培養基材。   The cell culture medium according to claim 12, wherein the cell culture container is selected from the group consisting of a multi-well plate, a dish, a flask, a tube, a multilayer flask, a side flexible flask, and a bag. Wood. 前記マイクロウェルが、該マイクロウェルの少なくとも１つと単一の液体貯槽との間の流体連通を可能にするように構成されることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の細胞培養基材。   14. The microwell according to any one of the preceding claims, wherein the microwell is configured to allow fluid communication between at least one of the microwells and a single liquid reservoir. Cell culture substrate. 前記細胞培養容器がさらに、前記マイクロウェルのアレイの上部に配置されたメッシュを備えていることを特徴とする、請求項１２又は１３に記載の細胞培養基材。   The cell culture substrate according to claim 12 or 13, wherein the cell culture container further comprises a mesh disposed on an upper part of the array of microwells. 前記マイクロウェル内への前記開口部が有効直径Ｄ上部を有し、前記丸みを帯びたウェル底部が底を有し、各マイクロウェルが１つ以上の側壁を有しており、
前記１つ以上の側壁が、前記丸みを帯びたウェル底部の前記底から前記マイクロウェル内への前記開口部まで延びる高さＨを有し、
各マイクロウェルが、前記マイクロウェル内への前記開口部と前記丸みを帯びたウェル底部の前記底との間の有効直径の中間点Ｄ中間を有し、
Ｄ上部：Ｄ中間の比が１．５：２．５である
ことを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞培養基材。 The opening into the microwell has an effective diameter D top , the rounded well bottom has a bottom, and each microwell has one or more sidewalls;
The one or more side walls have a height H extending from the bottom of the rounded well bottom to the opening into the microwell;
Each microwell has a midpoint D midpoint of effective diameter between the opening into the microwell and the bottom of the rounded well bottom;
The cell culture substrate according to any one of claims 1 to 15, wherein a ratio of D upper part : D intermediate is 1.5: 2.5. Ｄ上部が２００μｍ〜５００μｍであることを特徴とする、請求項１６に記載の細胞培養基材。 The cell culture substrate according to claim 16, wherein the upper portion of D is 200 µm to 500 µm. 高さＨが１００μｍ〜５００μｍであることを特徴とする、請求項１６に記載の細胞培養基材。   The cell culture substrate according to claim 16, wherein the height H is 100 µm to 500 µm. Ｈ＝０．７〜１．３Ｄ中間であることを特徴とする、請求項１６に記載の細胞培養基材。 The cell culture substrate according to claim 16, wherein H = 0.7 to 1.3D intermediate . Ｄ中間が２００〜１０００μｍであることを特徴とする、請求項１６に記載の細胞培養基材。 The cell culture substrate according to claim 16, wherein the D- intermediate is 200 to 1000 µm.
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