JP2017512301A - フローサイトメータにおける光学系のためのシステム、方法、及び装置 - Google Patents

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Abstract

この一連の実施形態は、各光源に対する合焦の独立した調節を可能にするフローサイトメータにおける光学構成のための、システム、方法、及び装置に関する。そのようなシステム、方法、及び装置は、最終合焦素子が、収束光ビームに対応すると同時に、そのようなビームへの収差の導入を最小限に抑えるように構成されるために、光学縦列の開始あたりで、かつ最終合焦素子の後にくる各光学素子に対して移動させられることを必要とする。【選択図】図２

Description

本開示は概して、フローサイトメータにおける光学系に関する。
関連出願の相互参照
本願は、２０１４年８月２６日出願の米国出願第６２／０４１，８０６号及び２０１４年２月２８日の米国出願第６１／９４６９，５７９号に対する優先権を主張するものであり、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
フローサイトメトリは、主に生命科学研究及び医学における無数の用途における粒子及び細胞の解析に使用される強力なツールである。この技術の解析の強みは、最大で１秒当たり何千もの粒子の割合で、間断なく、典型的にはレーザ（複数可）からの光の合焦点を通して、単粒子（細胞、細菌、及びウイルスなどの生体粒子を含む）を連続的に通過するその能力にある。この焦点における高い光子束は、収集及び解析され得る粒子による光の散乱、もしくは粒子からの光の放出、または粒子に取り付けられるラベルを生成する。これは、粒子または細胞の集団に関する統計情報に迅速に考察され得る個々の粒子に関する豊富な情報をユーザに与える。
フローサイトメトリにおいて、多ビーム、多重波長励起は、光学レポータとして作用し得るフルオロフォアの利用可能な数を増加させるために一般的に使用される。スペクトル空間の増加により、個々の標的に対するより大きい程度のアッセイ多重化が可能になる。
多ビームフローサイトメトリは、いくつかの異なる方法で実装され得る。もっとも単純なのは、同じ光軸に沿ってビームを同じ位置に配置することである。この状況において、多重化は、同じ位置に配置されたビームの波長によって励起されたフルオロフォアのスペクトル重複によって制限される。ほとんどのシステムにおいて、ビームは、ビーム間に小さい距離を有して積層されてフローセルに送達される。これにより、各レーザまたは他の種類の光に対する空間的に分離された検査領域が可能になる。これらのシステムにおいて、隣接するレーザ間のクロストークを低減すると同時に、流体系の変動による粒子位置の不確実性を最小限に抑えるように、空間分離の大きさが選択される。空間分離が増加するにつれて、クロストークは減少するが、粒子位置の不確実性は増加する。
高い粒子解析速度及び高い照度を要求するシステム要件のため、小さいレーザスポットサイズが標的において望ましい。ほとんどのシステムにおいて、収束ビームは、標的に対するこのレベルの合焦を達成することが求められる。収束ビームは典型的には、レーザ光を拡大し（例えば、視準または部分的に視準）、次いでそれを合焦レンズを通して伝搬することによって生成される。複数のレーザを備えるシステムに関して、視準光ビームは、その順序で最終スポット分離をもたらすために、数百ミクロンの変位で積層されてもよい。次いで、視準ビームは、図１に示されるように単一合焦レンズに通され、次いで、粒子が通過する検査領域まで伝搬される。
単一レンズのアプローチは、有効であることがわかっており、何十年にもわたって主力である。その欠点は、合焦レンズがシステム内の全てのビームと同時に連結されることである。単一合焦レンズの調節、または１つのビームの合焦を改善するために他のレンズの操作を実装することは、隣接するビームの合焦を低下させる。そのようなシステムは、より低い品質のデータを生成し、合焦を調整するためのさらなる努力を必要とする可能性があり、また光源（例えば、レーザ）の互換性を極端に困難にする。
これらの欠点に対する解決法は、本明細書に示されるように、収束ビームが、収差の導入なしで、視準ビームの代わりに光学縦列を通して伝搬され得るシステムである。図２を参照されたい。そのようなシステムは、隣接するレーザビームの光路を妨げることなく、各レーザビームの調節を可能にし、かつデータ及び結果の改善を可能にする。
一態様では、フローサイトメータのための光学系が開示される。本光学系は、粒子検査領域を含むフローセルを含むことができる。本光学系は、光ビームを生成する光源と、光ビームを収束光ビームに変換するように構成される収束素子とを備える、少なくとも２つの光サブユニットを含むことができる。
一態様では、フローサイトメータ内の光ビームを組み合わせるための方法が開示される。本方法は、少なくとも２つの光ビームを提供することを含むことができる。本方法は、収束素子当たり１つの光ビームの割合で、光ビームのそれぞれを収束素子に通すことを含むことができ、収束素子を出る光ビームは、収束光ビームである。本方法は、収束光ビームのうちの少なくとも１つを少なくとも１つの２色性素子に通すことを含むことができる。本方法は、フローセル内の検査領域に入るときに、収束光ビームを互いに空間的に分離することを含むことができる。
一態様では、フローサイトメータ光学的整列方法が開示される。本方法は、少なくとも２つの収束光ビームを生成することを含むことができ、収束光ビームのそれぞれは、光源によって生成される光ビームを収束素子に通すことによって生成され、光源及び収束素子は、光機械台に取り付けられる。本方法は、収束光ビームのうちの少なくとも１つを２色性素子に通すことを含むことができる。本方法は、収束光ビームのそれぞれを、空間的に異なる第１の位置のセット中のフローセルに通すことを含むことができる。本方法は、光機械台のうちの少なくとも１つを調節して、少なくとも１つの光源及び少なくとも１つの収束素子を再配置することを含むことができる。本方法は、収束光ビームのそれぞれを、空間的に異なる第２の位置のセット中のフローセルに通すことを含むことができる。
本明細書に開示される原理及びその利点のより完全な理解のために、ここでは、添付の図面と併せて以下の説明を参照する。
従来技術に従ったフローサイトメータのための光学系の図面である。 種々の実施形態のうちの１つに従ったフローサイトメータのための光学系の図面である。 種々の実施形態のうちの１つに従ったフローサイトメータのための光学系の一部分の拡大図の例示である。 種々の実施形態のうちの１つに従ったフロー図を示す。 視準ビームを使用した、従来技術に従ったフローサイトメータのための光学系の図である。 収束ビームを使用した種々の実施形態のうちの１つに従ったフローサイトメータのための光学系の図である。
本教示は、種々の実施形態と併せて記載されるが、本教示がそのような実施形態に限定されることは意図されていない。それとは逆に、本教示は、当業者に理解されるように、様々な代替物、修正物、及び同等物を包含する。
さらに、種々の実施形態の記載において、本明細書は、方法及び／またはプロセスを特定のステップの配列として示した可能性がある。しかしながら、本方法またはプロセスが本明細書に記載される特定のステップの順序に依存しない程度まで、本方法またはプロセスは、記載される特定のステップの配列に限定されるべきではない。当業者が理解するように、他のステップの配列も可能であり得る。したがって、本明細書に記載される特定のステップの順序は、特許請求の範囲の制限と解釈されるべきではない。加えて、本方法及び／またはプロセスに関する特許請求の範囲は、記載された順序でのそれらのステップの性能に限定されるべきではなく、当業者は、配列が変更されてもよく、それでもなお種々の実施形態の精神及び範囲内にとどまり得ることを容易に理解することができる。
本開示がより容易に理解されるために、特定の用語が最初に定義される。追加の定義が、「発明を実施するための形態」の全体を通して記載される。
フローサイトメータ内の光学系のためのシステム、方法、及び装置の実施形態が、別紙１を含む添付の説明及び図面に記載される。図面中、ある特定の実施形態の十分な理解を提供するために、多くの特定の詳細が記載される。当業者は、本明細書に記載される光学系が、フローサイトメータを含むがこれに限定されない光学縦列を使用して、種々の器具で使用され得ることを理解することができるであろう。加えて、当業者は、ある特定の実施形態がこれらの特定の詳細なしで実行され得ることを理解するであろう。さらに、当業者であれば、方法が提示及び実施される特定の配列が例示的であることを容易に理解することができ、この配列が変更されてもよく、それでもなおある特定の実施形態の精神及び範囲内にとどまり得ることが企図される。
本教示は、種々の実施形態と併せて記載されるが、本教示がそのような実施形態に限定されることは意図されていない。それとは逆に、本教示は、当業者に理解されるように、様々な代替物、修正物、及び同等物を包含する。
さらに、種々の実施形態の記載において、本明細書は、方法及び／またはプロセスを特定のステップの配列として示した可能性がある。しかしながら、本方法またはプロセスが本明細書に記載される特定のステップの順序に依存しない程度まで、本方法またはプロセスは、記載される特定のステップの配列に限定されるべきではない。当業者が理解するように、他のステップの配列も可能であり得る。したがって、本明細書に記載される特定のステップの順序は、特許請求の範囲の制限と解釈されるべきではない。加えて、本方法及び／またはプロセスに関する特許請求の範囲は、記載された順序でのそれらのステップの性能に限定されるべきではなく、当業者は、配列が変更されてもよく、それでもなお種々の実施形態の精神及び範囲内にとどまり得ることを容易に理解することができる。
本開示がより容易に理解されるために、特定の用語が最初に定義される。追加の定義が、（発明を実施するための形態）の全体を通して記載される。
本明細書で使用される場合、「約」は、±２０％、より好ましくは±１０％、さらにより好ましくは±５％、最も好ましくは±２％を意味する。
本明細書で使用される場合、「２色性」は、波長選択性反射素子を意味する。
本明細書で使用される場合、「フローセル」は、矩形、正方形、楕円形、扁円形、円形、八角形、七角形、六角形、五角形、及び三角形から選択される内部形状を有するチャネル、チャンバ、またはキャピラリを意味する。
本明細書で使用される場合、「チャネル」は、矩形、正方形、楕円形、扁円形、円形、八角形、七角形、六角形、五角形、及び三角形から選択される内部形状を有する、大量の流体を含むことができる、少なくとも１つの入口と、好ましくは１つの出口を有する進路、経路、または導管を意味する。
本明細書で使用される場合、「粒子」は、真核及び原核細胞、古細菌、細菌、かび、植物細胞、酵母、原虫、アメーバ、原生生物、動物細胞などの生体細胞；細胞小器官；有機／無機成分または分子；微小球；ならびに水中油などの非混和性流体の液滴が挙げられるがこれらに限定されない、物質の小さい単位を意味する。
本明細書で使用される場合、「被分析物」は、分析される物質または材料を意味する。
本明細書で使用される場合、「プローブ」は、標識付けされるか、または別様に印付けられ、流体もしくは試料中の別の物質を検出もしくは同定するために使用される、物質を意味する。
本明細書で使用される場合、「標的」は、収束ビームと接触するいかなるものも意味する。
本明細書で使用される場合、「検査領域」は、光ビーム（例えば、レーザ）が粒子と交差する点、または光学系が光散乱及び蛍光を検出する場所である。
本明細書で使用される場合、「最終合焦レンズ」は、光学縦列内のどこかに位置する収束素子を意味する。
本明細書で使用される場合、「流体の流れ」は、粒子が光ビームを一列で通過するように、粒子を担持及び整合する流れを意味する。
種々の実施形態において、本願に開示される光学系は、フローサイトメトリに関連する種々の装置、システム、及び方法と併用され得る。米国特許出願第１２／２３９，３９０号及び同第１２／２０９，０８４号を参照されたく、それらの両方は、参照によりその全体が組み込まれる。
フローサイトメトリにおいて、多ビーム励起は、光学レポータとして使用され得るフルオロフォアの利用可能な数を増加させることが一般的である。スペクトル空間の増加により、個々の標的に対するより大きい程度のアッセイ多重化が可能になる。多ビームフローサイトメトリは、いくつかの異なる方法で実装され得る。もっとも単純なのは、同じ光軸に沿ってビームを同じ位置に配置することである。しかしながら、当業者は、干渉、スペクトル重複、及びクロストークが多重化の程度を制限することを理解するであろう。この問題を低減するために、ビームは、積層されてフローセルに送達される。
図１を参照すると、フローサイトメトリの分野の従来技術の光学系の概略図が示される。このシステムは、視準光ビーム１０４を生成する少なくとも１つの光源１０２からなる。従来技術のシステムは、視準光ビーム１０４が通過するプレート２色性素子１０６を使用する。視準光ビーム１０４は、光学縦列の端部で合焦されるために、２色性素子１０６を通過するときに視準されたままである。視準の１つの効果は、光ビームがプレート２色性素子１０６を通過するときに、それが収差の導入を最小限に抑えることである。収束ビームが使用された場合、そのような収差は、不十分なデータの品質をもたらし、フローサイトメトリで使用される光学系などの光学系においてかなりの懸念である。光ビームが検査領域内の標的または粒子に当たるとき、ビームプロファイルは、「スポットサイズ」と一般的に称される領域を有する。一般的に、光ビームがより小さい空間に収まり得る場合、そのビーム強度は増加し、背景雑音に対してより高い信号放射をもたらす。レーザのスポットサイズが高い信号：背景雑音比を有するために、収束素子１０８が光学縦列の端部で使用されて、標的の検査の前にビームのスポットサイズを減少させ、かつビーム強度を増加させる。ほとんど全ての光学系の場合と同様に、収差の低減及び適切な合焦が望ましい。フローサイトメトリにおいて、光ビームを空間的に分離（積層）し、光源１０２が互いに干渉するか、またはクロストークを伴う問題を生じさせることなく、標的が異なる時間に異なる光源１０２によって検査され得るようにすることが一般的である。図１に示されるシステムの最大の問題は、いくつかの視準光ビーム１０４が積層されて視準収束素子１０８に入ること、及び個々の光ビームを適切に合焦するために、収束素子１０８が除去される必要があり得ることである。ビームは、収束素子１０８を通して連結され、１つのビームを調節するためのレンズの移動は、隣接する光ビームの調節に悪影響を及ぼし得る。加えて、そのような光学系を適切に調整することは、いくつかの複雑なレンズ操作を伴う可能性があり、最大限の努力にもかかわらず、なおも光学系の完全ではない調整をもたらし得る。得られたデータの品質は、不十分である可能性があり、背景雑音上で検出可能ではない重要な情報をもたらし得、かつ基礎研究における見落とされたデータ及び医学的用途における不適切な診断をもたらし得る。
図１に示される問題に対する解決法の一実施形態は、図２、３、及び５Ｂに示され、各光源１０２の光路は、最終合焦素子を光路の前部に移動させることによって、他の光源１０２から独立して作製され得る。この区別は、図１及び図５Ｂの収束素子１０８の位置を比較することによって分かる。そのようなシステムは、１つの光源１０２と対になった１つの収束素子１０８を有することができる。このシステムは、各個々の光源経路内で実施されるレンズ操作の多くを切り離すことによって、製造及び本分野における光学的整列をはるかに単純にする。最終スポットサイズに合焦する収束光ビーム２０６を生成するために必要な全ての光学ハードウェアを有する完全に組み立てられた光サブユニット５０２が、器具に取り付けられ得るか、または除去及び交換され得る、モジュラー方法。次いで、光学系の整合は、光サブユニット５０２の単純な操作であり、それにより１つの光路のみが一度に調節され得る。積層されて、または同一線上で収束光ビーム２０６を組み合わせるための標準的な方法、図１は、プレート２色性素子１０６を利用して、収束光ビーム２０６を方向付ける。しかし、これは、光路の開始時に収束光ビーム２０６を生成する上記の光学設定に対しては可能ではない。収差（非点収差及びコマ収差）は、プレート２色性素子１０６によって導入され、それによりレーザ強度プロファイルの最終空間分布を低下させ、それにより器具の性能を低下させる。プレート２色性素子１０６によって収束光ビーム２０６に導入される収差は、既知の技術分野において記載される。Ｊ．Ｂｒａｔｔ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｗａｖｅ−ｆｒｏｎｔ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ ｏｆ ａ ｔｉｌｔｅｄ ｐｌａｎｅ−ｐａｒａｌｌｅｌ ｐｌａｔｅ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ ３６，８４５９−８４６７（１９９７）。Ｊ． ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｅｒｅｎｂｅｅｍｄ ａｎｄ Ｓ．Ｓｔａｌｌｉｎｇａ，Ｃｏｍｐａｃｔ ｓｙｓｔｅｍ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ａ ｔｉｌｔｅｄ ｐｌａｎｅ ｐａｒａｌｌｅｌ ｐｌａｔｅ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ ４６，３１９−３２６（２００７）。
図１に示されるように、フローサイトメータのための光学系は、フローセル１１０と、図５Ｂに示される少なくとも２つの光サブユニット５０２とを含むことができる。フローセル１１０は、粒子検査領域を含むことができる。概して、光ビームは、粒子が収束光ビームを通過することができる検査領域上で合焦され得る。光サブユニット５０２は、光源１０２と、収束素子１０８とを備えることができる。種々の実施形態において、光源１０２は、実質的に単色の光ビームを生成することができる。種々の実施形態において、光源１０２は、多色光ビームを生成することができる。収束素子１０８は、単色光または多色光のいずれかを収束光ビーム２０６に変換するように構成され得る。種々の実施形態において、収束光ビームは、約１０マイクロメートルの直径に合焦することができる。種々の実施形態において、収束光ビームは、約１マイクロメートル〜２０マイクロメートルの直径に合焦することができる。種々の実施形態において、収束光ビームは、約５マイクロメートル〜１００マイクロメートルの直径に合焦することができる。種々の実施形態において、収束素子１０８に入る光ビームは、拡大、収束、あるいは視準され得る。種々の実施形態において、光サブユニット５０２は、光機械台に取り付けられ得る。光機械台は、収束光ビーム２０６の空間分離を調節するために操作者によって操作され得るか、またはフローセル１１０内の収束光ビーム２０６の合焦を調節するために操作され得る。そのようなシステムは、隣接するレーザビームの光路を妨げることなく、各レーザビームの調節を可能にし、かつデータ及び結果の改善を可能にする。
種々の実施形態において、本光学系は、収束光ビーム２０６をフローセル１１０に方向付けるように構成される少なくとも１つの２色性素子２０４をさらに備える。２色性素子２０４は、２つの隣接するプリズム３０４、及び隣接するプリズム３０４の間に位置する波長選択膜３０２からなってもよい。種々の実施形態において、３色性またはそれ以上である素子が使用され得、任意の数のプリズム３０４及び任意の数の波長選択膜３０２を利用することができる。種々の実施形態において、使用される２色性素子２０４は、キューブの形状であってもよい。キューブの形状は、入射面が入射ビームにほぼ垂直になることを可能にすることができ、出射面は、透過された収束光ビーム２０６にほぼ垂直になり得る。種々の実施形態において、キューブ構造は、収差の導入を低減するか、またはほとんど排除することができる。種々の実施形態において、キューブは、２つの４５度プリズム３０４を結合することによって構築され得る。種々の実施形態において、波長選択膜３０２は、プリズム３０４間の隣接表面上に配置され得る。キューブを通した収束波面の伝搬が収束光ビーム２０６におけるより少ない、かつあまり顕著ではない収差を可能にするため、２色性キューブを通して視準光ビーム１０４を伝播することは必要ではない。種々の実施形態において、多レーザシステムにおける最終合焦レンズ（例えば、図５Ｂの収束素子１０８）は、それが他の光軸から切り離され得る光路内でより早くに再配置され得る。そのような実施形態では、独立した収束素子１０８を有するレンズアセンブリは、収束光ビーム２０６を照準及び合焦するための独立した機械調節を有する３軸光機械台上に載置され得る。種々の実施形態において、各ビームウエスト及び位置の位置は、他の収束光ビーム２０６の合焦に影響を及ぼすことなく、各収束光ビーム２０６に対して個々に調節され得る。そのような構成はまた、異なる波長のいくつかのビームが同じ視準収束素子１０８を通して伝搬され、かつ同一面で合焦するための要件を有するときに構成される色収差及び球面収差によって引き起こされる問題を排除する。２色性キューブ（または同様の特性を有する他の形状）を使用した種々の実施形態では、各光ビーム光路の光学構成要素の調節が切り離される、複数の光源１０２の収束光ビーム２０６の構成が構築され得る。加えて、そのような実施形態は、モジュラーフローサイトメータの生成を可能にする。光ビームラインを切り離す種々の実施形態では、追加の光ビームラインを加えることは、連結した光学構成要素を調節しなければならないということを必要としない。そのような実施形態は、本分野及び製造環境において特に有利である。
少なくとも２つの光サブユニット５０２及び少なくとも１つの２色性素子２０４の組み合わせは、これまで実施されていない。一理由は、はるかに少ない材料を含有するプレート２色性素子２０４に対する、キューブまたは他の形状の形態の２色性素子２０４の費用の増加であり得る。加えて、光サブユニット５０２は、生成するのが複雑である。
種々の実施形態において、波長選択膜３０２は、ロングパスフィルタとして作用する。他の実施形態では、波長選択膜３０２は、ショートパスフィルタとして作用する。さらなる実施形態では、ミラー素子１１２が本光学系の種々の実施形態で使用され得る。
種々の実施形態において、光機械台は、ｘ、ｙ、及びｚ座標系上で調節され得る。光機械台上の光サブユニット５０２を配置することにより、特定の用途に必要な、より少なく、かつあまり顕著ではない収差を有する適切な合焦及びスポットサイズを生成するために使用される他の光源１０２から独立した、各光源１０２の調節が可能になり得る。プレート２色性素子１０６は、低い費用で用途の大部分に対して非常にうまく機能するため、過去に使用されてきた。しかしながら、本システムの種々の実施形態は、上記の理由で視準光ビーム１０４を透過するプレート２色性システムの実施形態よりも優れている。
種々の実施形態において、粒子は、フローセル１１０を通って移動する。そのような実施形態では、粒子は、独立して収束光ビーム２０６のそれぞれによって検査され得る。
種々の実施形態において、収束素子１０８は、凸レンズであってもよい。
種々の実施形態において、空間分離は、検査領域を通過するときに約８０マイクロメートル〜約２００マイクロメートルであってもよい。種々の実施形態において、空間分離は、約１０マイクロメートル〜約１００マイクロメートルであってもよい。種々の実施形態において、空間分離は、約１５０マイクロメートルであってもよい。
種々の実施形態において、収束光ビーム２０６は、フラットトップ強度プロファイルを有することができる。種々の実施形態において、収束光ビーム２０６は、ガウス強度プロファイルを有することができる。種々の実施形態において、強度プロファイルは、用途に応じて変更され得る。
図４は、種々の実施形態に従った、フローサイトメータの光学的整列のための方法４００を示す例示的なフローチャートである。
ステップ４０２において、少なくとも２つの光ビームが提供され得る。ステップ４０４において、光ビームのそれぞれは、収束素子当たり１つの光ビームの割合で、収束素子に通され得、収束素子を出る光ビームは、収束光ビーム２０６であってもよい。ステップ４０６において、収束光ビーム２０６のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの２色性素子２０４に通され得る。ステップ４０８において、収束光ビーム２０６は、フローセル１１０内の検査領域に入るときに、互いに空間的に分離され得る。
本方法の種々の実施形態において、光ビームは、単色発光であってもよく、光源１０２によって生成され得る。種々の実施形態において、光源１０２及び収束素子１０８は、光機械台に取り付けられ得る。種々の実施形態において、光機械台は、ｘ、ｙ、及びｚ座標系上で調節され得る。種々の実施形態において、さらなるステップは、第１の波長を有する単色発光を生成するように構成される第１の光源１０２を、第２の波長を有する単色発光を生成するように構成される第２の光源１０２に置き換えることを含むことができる。
本方法の種々の実施形態において、２色性素子２０４は、収束光ビーム２０６への収差の導入を防止するように構成され得る。種々の実施形態において、２色性素子２０４は、キューブの形状であってもよい。種々の実施形態において、２色性素子２０４は、ロングパスフィルタまたはショートパスフィルタであってもよい。種々の実施形態において、さらなるステップは、第１の波長範囲を通すように構成される少なくとも１つの第１の２色性素子２０４を、少なくとも１つの第１の２色性素子２０４を通すように構成される少なくとも１つの第２の２色性素子２０４に置き換えることを含むことができる。
本方法の種々の実施形態において、光機械台の調節は、ｘ、ｙ、及びｚ軸上で生じることができる。
本方法の種々の実施形態において、さらなるステップは、粒子を検査することを含むことができ、粒子は、流体の流れの中でフローセル１１０を通過している。種々の実施形態において、流体は、液体であってもよい。種々の実施形態において、さらなるステップは、検出素子を用いて光散乱を検出することを含むことができる。種々の実施形態において、検出素子は、光電子増倍管を備えることができる。種々の実施形態において、収束光ビーム２０６が標的に衝突するときに生成される前方及び側方散乱光が存在し得る。種々の実施形態において、側方散乱光は、検出レンズを通過し、次いで、ピンホール集光ファイバアレイに入ることができ、各ピンホールは、空間的に分離してフローセル１１０に入った特定の収束光ビーム２０６に対応することができる。種々の実施形態において、空間分離は、約８０マイクロメートル〜約２００マイクロメートルに及ぶことができる。種々の実施形態において、空間分離は、約１０マイクロメートル〜約１００マイクロメートルであってもよい。種々の実施形態において、空間分離は、約１５０マイクロメートルであってもよい。種々の実施形態において、光ファイバケーブルは、各ピンホールから出てくる光を集光ブロックに接続することができる。種々の実施形態において、集光ブロックは、コリメータ、フィルタ素子、及び光電子増倍管を含むことができる。種々の実施形態において、信号は、アナログからデジタルデータに変換され得、次いで、コンピュータ上で記憶及び解析され得る。種々の実施形態において、前方散乱光は、ブロッカーバー、コンデンサレンズを通過し、アナログからデジタルデータ信号に変換され得る。種々の実施形態において、デジタルデータ信号は、次いで、コンピュータ上で記憶及び解析され得る。
種々の実施形態において、さらなるステップは、粒子への流体力学的及び／または音響学的合焦を適用することを含むことができる。
種々のシステム、装置、及び方法の実施形態において、光サブユニット５０２、２色性素子２０４、及び集光ブロックは、第１の光の波長と関連し得る。種々の実施形態において、上記の光サブユニット５０２、２色性素子２０４、及び集光ブロックは、フローサイトメータシステムの残りの部分から除去され、次いで、第２の光の波長と関連する異なる光サブユニット５０２、２色性素子２０４、及び集光ブロックと置き換えられ得る。種々の実施形態において、デジタルデータが記憶されるコンピュータは、光学構成要素のこの変化と共にプログラムされ、次いで、新しいパラメータのセットを使用してデータを解析することができる。
本方法の種々の実施形態において、２色性素子２０４は、収束光ビーム２０６への収差の導入を防止するように構成され得る。すでに考察されたように、図３に示されるプレート２色性素子１０６は、準光ビーム１０４ではなく収束光ビーム２０６に収差を導入する。種々の実施形態において、２色性素子２０４は、キューブの形態であってもよく、それにより、収束光ビーム２０６の全ての部分が同時にキューブに入ることが可能になり得、次いで、収束光ビーム２０６が、収差の導入がほとんどまたは全くなく、異なる屈折率を有する新しい媒体に入ることが可能になる。この構成において、出てくる収束光ビーム２０６は、同様に後端において収差の導入なく、空気、またはそれらが生じた別の媒体に入ることができる。
本方法の種々の実施形態において、収束光ビーム２０６は、フラットトップ強度プロファイルを有することができる。そのようなフラットトップ強度プロファイルにより、標的が粒子、細胞、ビーズ、またはその他であるかどうかにかかわらず、その標的の均一な検査が可能になり得る。
ここで、図５Ａ及び図５Ｂを参照すると、従来技術及び本開示のさらなる比較が示される。図５Ａ中、視準光ビーム１０４を生成する光源１０２が見られる。一部の光ビーム操作が生じた後（図示せず）、視準光ビーム１０４は、収束素子１０８を通過し、次いで、標的５０４に衝突する。本例示において、全てが単一収束素子１０８を通過する３つの光ビームが存在する。各光ビームは、収束素子１０８を移動させることによって合焦されなければならない。本例示において、全ての３つの光ビームが同じ収束素子１０８を通過するため、収束素子１０８の位置を変化させることによって１つの光ビームを合焦することが、他の２つの光ビームに影響を及ぼすことは明らかである。そのようなシステムは、図５Ｂに見られるシステムよりも劣る。
図５Ｂは、フローサイトメータのための光学系の１つの例示的な実施形態を示す。図５Ｂ中、各収束光ビーム２０６は、光源１０２及び収束素子１０８の両方を含む光サブユニット５０２から生成され得る。そのようなシステムにおいて、光サブユニット５０２は、光機械台（図示せず）に載置され得る。そのようなシステムにより、他の収束光ビーム２０６から独立して、各収束光ビーム２０６に対する調節、一般的には合焦またはスポットサイズが可能になり得る。そのようなシステムは、本明細書全体を通して詳述されるように、より高いデータ品質、より容易な構成、及びモジュール性を提供する。
以下の実施例は、本明細書に開示される実施形態を制限するためではなく、例示するために提供される。
実施例１
フラットトップの収束レーザビームプロファイルは、４５度の角度で設定されたフラットプレート２色性を通過するときに変化する
収束レーザビームを０〜３のフラットプレート２色性に通し、得られたビームをカメラによって撮像した。ｘ軸は、ビーム位置を表し、ｙ軸は、ビーム強度を表す。ｙ軸上の強度は、１（または１００％）に正規化されており、１は、到達した最高の強度である。ほとんどの用途に対して、ビーム幅は、９０％で約５０マイクロメートルにわたるべきである。種々の実施形態において、ビーム幅は、少なくとも約９０％のビーム強度を維持しながら、約４０マイクロメートルにわたるか、または約１０マイクロメートルにわたってもよい。種々の実施形態において、ビーム強度は、少なくとも約５０マイクロメートルにわたるビーム幅を維持しながら、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、または少なくとも約５０％であるべきである。最適なビームは、０の２色性プレートが使用されるときに見ることができるが、１のフラットプレート２色性が追加されるときでさえ、粒子の最適な検査のための条件は満たれない。
本実施例は、収束光ビーム２０６技術をプレート２色性素子１０６技術と組み合わせることが最適ではないことを示す。上記の通り、収束光ビーム２０６は、独立した光学縦列の生成を可能にする。したがって、別の技術（例えば、プリズムの形態の２色性素子）が、これらの種々の実施形態に組み込まれなければならなかった。
実施例２
フラットトップの収束レーザビームプロファイルは、キューブ形状の２色性を通過するときに変化する
収束レーザビームを０〜２のキューブ２色性に通し、得られたビームをカメラによって撮像した。ｘ軸は、ビーム位置を表し、ｙ軸は、ビーム強度を表す。ｙ軸上の強度は、１（または１００％）に正規化されており、１は、到達した最高の強度である。最適な検査条件に対して、ビーム幅は、約５０マイクロメートルにわたり、かつ少なくとも約９０％の強度レベルまたはそれ以上であるべきである。５０マイクロメートルを選択し、それは、その領域がスポットサイズを最大化すると同時に、十分に高いビーム強度が有効になることを可能にするためである。最適なビームは、０、１、または２の２色性キューブが使用されるときに見ることができる。
本実施例は、収束光ビーム２０６に適合する２色性の解決法を実証する。実施例１とは異なり、ビームプロファイルにおける劣化はほとんどなく、独立した光路の生成を可能にすることができる。
実施例３
実施例３は、収束光（例えば、レーザ）システムにおいて２色性プレートを使用することが、なぜ有意な非点収差及びコマ収差を有する許容できないビームプロファイルを生成するのかを実証する、周知の計算を示す。そのような収差は、データの品質を実質的に低下させる。Ｔ＝使用されるプレートの厚さ、ｎ＝屈折率、λ＝光の波長、瞳孔半径＝計算が生じているガラス上のスポットサイズ、傾斜＝プレートの角度、及びｒ＝光軸からの距離（瞳孔半径の出口）。
実施例４
実施例４は、２色性プレートの代わりに２色性キューブを使用することが、コマ収差または非点収差をもたらさないことを実証する、周知の計算を示す。これらの低減は、収束光（例えば、レーザ）ビームを２色性プレート光学システムに組み込む器具と比較して、はるかに高い品質のデータをもたらす。
実施例５−同一平面上の焦点
実施例５のデータは、それぞれが光源及び最終合焦レンズの使用なしで独立して合焦される収束素子を備える２つの光サブユニットの使用を示す。本実施例のサブユニットは、空間的に調節され得る光機械台を含む。より具体的には、上記の実施例の光源は、青色レーザ及び紫色レーザである。合焦は、光サブユニットの使用によって生じ、それは本開示全体を通してより詳細に考察される。
「焦点における青色レーザビーム」と題する図面は、青色レーザビームが、遮断装置で遮断されている紫色レーザビームから独立して、カメラに合焦されている、２つのレーザシステムである。フローサイトメータ内の最適な検査条件に対して、ビーム幅は、少なくとも約９０％の強度レベルまたはそれ以上にわたって、約５０マイクロメートルである。ガウス焦点は、約２マイクロメートルである。レーザビームプロファイル及び合焦は、用途に応じて異なる最適な構成を有することができる。
「焦点における紫色レーザビーム」と題する図面は、紫色レーザビームが、遮断装置で遮断されている青色レーザビームから独立して、カメラに合焦されている、同じ２つのレーザシステムである。フローサイトメータ内の最適な検査条件に対して、ビーム幅は、少なくとも約９０％の強度レベルまたはそれ以上にわたって、約５０マイクロメートルである。ガウス焦点は、約２マイクロメートルである。レーザビームプロファイル及び合焦は、用途に応じて異なる最適な構成を有することができる。
「焦点における青色及び紫色レーザビーム」と題する図面は、レーザビーム及びそれらのビーム成形光学素子の両方が、光機械台システムを含む光サブユニットを使用して独立して合焦されていることを実証する、データを示す。フラットトップレーザビームプロファイルを示す左下部分は、青色レーザビームに正規化されており、それが紫色レーザビームがグラフの高さに及ばないビーム強度を示す理由である。しかしながら、各サブユニットが独立して調節された後に、各レーザの強度の約９０％が、約５０マイクロメートルのビーム幅にわたって生じることが示されている。各レーザビームに対するガウス焦点は、約２マイクロメートルである。従来技術で使用されるような最終合焦レンズを用いたそのような調節では、独立した調節が各レーザビームを合焦することは可能にならない。最終合焦レンズを損なうものは、１つのレーザビームプロファイルを最適化すると同時に、ユーザが別のレーザビームプロファイルの最適化を低減している可能性があることである。そのような問題は、独立したビームプロファイル最適化が可能であるシステムにおいて生じない。
実施例６−収差ビーム蓄積の低減
実施例６は、レーザビームが、３ｍｍの幅を有する４５度フラットウィンドウ（例えば、２色性プレート）に通されたときの、光学系に導入される収差の量及び重大度を、２色性キューブ素子、２つの２色性キューブ、または光学素子を通さない場合と比較する。
「焦点における青色レーザビーム」と題する図面は、いかなる２色性素子も使用することなく、カメラに合焦された青色レーザビームを示す。約４７マイクロメートルのフラットトップ幅を覆う、約９０％のビーム強度を有する、フラットトップビームからのデータが、左下のグラフに示される。焦点は、ガウス軸上で約２マイクロメートルである。
「ガウス焦点における３ｍｍの４５度ウィンドウを有する青色レーザビーム」と題する図面は、レーザ源とカメラとの間でレーザビームに対して約４５度の入射で傾斜されたガラスウィンドウを有するカメラで合焦された青色レーザビームからのデータを示す。ガラスウィンドウは、厚さが約３ミリメートルであり、ガラスで構成される。焦点は、ガウス軸上で約２マイクロメートルである。左下のグラフは、もはやフラットトップビームプロファイルがないこと、及び約２．５マイクロメートルのビーム幅のみが約９０％のビーム強度を上回ることを示す。このデータと第１の図面からのデータとの間の違いは、光学素子にレーザビームを通すことからの収差の導入による。そのような光学構成は、フローサイトメトリを含む特定の光学条件を必要とする種々の器具に対しては好適ではない。ビームプロファイルがこの図面に示される特徴を有する場合、多くの雑音がデータ内に生成される。
「フラットトップ焦点における３ｍｍの４５度ウィンドウを有する青色レーザビーム」と題する図面は、レーザビームに対して約４５度の入射で傾斜されたガラスウィンドウを有するカメラで合焦された青色レーザビームからのデータを示す。ガラスウィンドウは、厚さが約３ミリメートルであり、ガラスで構成される。合焦は、最大フラットトッププロファイル強度及び幅が生じたときに決定した。逆は、図面中で最後に生じている。この場合、フラットトップビームは、約４８マイクロメートルに対して約９０％の強度である。しかしながら、ガウスは、約９０％のビーム強度で約２マイクロメートルを超えて（約１３．７マイクロメートルまで）うまくいった。このデータと第１の図面からのデータとの間の違いは、光学素子にレーザビームを通すことからの収差の導入による。取得されたデータ内の雑音もまたこのビームプロファイルと共に増加する。
「２つの２色性キューブを有する焦点における青色レーザビーム」と題する図面は、２つの光学素子（２色性キューブ）を通して、かつカメラに合焦されている青色レーザからのデータを示す。本実施例の第１の図面と比較すると、レーザビームプロファイルは非常に厳密に一致し、もしあるとしてもほんのわずかな収差が２つの２色性キューブによって導入されていることを示す。これは、フラットトップレーザビームプロファイルが２つの２色性キューブを通して伝搬されるときに維持されるためである。フラットトップ焦点は、約５１．９マイクロメートルのビーム幅を有し、ガウス焦点は、約２マイクロメートルの幅を有する。そのようなビームプロファイルは、フローサイトメトリ及び他の用途において使用できないデータを生成する可能性がある約３ミリメートルのガラスウィンドウから出るビームプロファイルとは異なる、高い品質のデータを生成する。
実施例７−パーセントの変動係数
フローサイトメトリにおいて、粒子の反復測定値が互いに一致する程度は、変動係数（ＣＶ）によって特徴付けられ得る。信号強度の変動の測度は、粒子が光源（例えば、レーザビーム）に繰り返し通されるときに生成される。変動は、平均信号強度の割合として表される。この統計的測定は、当該技術分野において周知であり、平均によって徐算される標準偏差の１００倍として定義される。概して、より低いＣＶは、反復測定値が互いと一致することを意味する。以下の図面のそれぞれは、２つのグラフプロットを表す。点線プロットはＣＶを表示し、破線プロットは強度を表示する。ｙ軸は百分率に正規化され、１．０は１００パーセントである。ｘ軸は、マイクロメートルの単位を有する。レーザビームは、これらのデータセットのそれぞれにおいて収束している。データ以下のデータは、光線ビーム’Ｒ２を使用して収集した。レーザ焦点は、ビームの高さを約１０マイクロメートルに合焦することによって最適化した。変動係数（ＣＶ）は、約５０マイクロメートルのウィンドウ幅を使用して計算した。以下のプロットは、正規化した強度ならびに移動ウィンドウＣＶを表示する。
「自由空間内のビームに対する強度及びＣＶ」と題する図面中のデータは、光路内に２色性光学素子なしで、レーザビームをカメラに合焦することによって取得した。データは、約５０マイクロメートルのレーザビームが約９０％強度レベルを超えるフラットトップレーザビームプロファイルを示す。ＣＶは、約０．５または約５％まで低下した。
「約１５ｍｍのＢＫ７ ２色性キューブを通して伝搬されるビームに対する強度及びＣＶ」と題する図面中のデータは、レーザビームをカメラに合照することによって取得され、レーザビームは、約１５ミリメートルのＢＫ ７ ２色性キューブを通して伝搬された。ＢＫ７ガラスは、その高い透過率及び透過される光の波長に応じて約１．５の屈折率を有することが既知である。データは、約５０マイクロメートルのレーザビームが約９０％強度レベルを超えるフラットトップレーザビームプロファイルを示す。ＣＶは、約０．５または５％まで低下した。より具体的には、レーザビームプロファイルは、収差がほとんどまたは全く導入されず変化していない。
「約４５度の入射角における約３ｍｍのＢＫ７プレートを通して伝搬されるビームに対する強度及びＣＶ」と題する図面中のデータは、レーザビームをカメラに合照することによって取得され、レーザビームは、約４５度の入射角で、約３ミリメートルのＢＫ７ ２色性プレートを通して伝搬された。データは、約５０マイクロメートルよりもほぼ有意に小さいレーザビームが約９０％強度レベルを超えるレーザビームプロファイルを示す。ＣＶは、ｙ軸が高いＣＶに適応するように変化させられるほど不十分な品質である。このようなレーザビームプロファイルは、導入された複数の重大な収差を有した。収集されたデータは、大量の雑音を含み、使用できなかった。
本実施例において、標準的なフラットプレート２色性プレートが本システムにおいて収束レーザビームに適応することができないことが、明確に示される。好ましいＣＶは、約１０％以下である。より好ましいＣＶは、約９％以下である。さらにより好ましいＣＶは、約８％以下である。８％よりもさらにより好ましいＣＶは、約７％以下である。７％よりもさらにより好ましいＣＶは、約６％以下である。６％よりもさらにより好ましいＣＶは、約５％以下である。５％よりもさらにより好ましいＣＶは、約４％以下である。４％よりもさらにより好ましいＣＶは、約３％以下である。３％よりもさらにより好ましいＣＶは、約２％以下である。最も好ましいＣＶは、約１％以下である。
本光学系は、光学縦列の開始時に光源を収束光ビームに独立して合焦し、次いでその収束光ビームを、多くの場合、入射光源に対して約４５度の入射角がついた２色性プレート（当該技術分野においてありふれた光学素子）の代わりに２色性キューブに通すことが可能であることによって、各個々の光源（例えば、レーザビーム）からそのようなＣＶ値を得ることができる。
最適な光ビームプロファイルは、フラットトップを有する。最適な光ビーム幅は、約３０〜約７０マイクロメートルである。より最適な光ビーム幅は、約３５〜約６５マイクロメートルである。より最適な光ビーム幅は、約４０〜約６０マイクロメートルである。より最適な光ビーム幅は、約４５〜約５５マイクロメートルである。
光学縦列は、１つ以上の２色性キューブ、１つ以上の２色性プレート、１つ以上のミラー、１つ以上のレンズ、１つ以上の回転盤、１つ以上のフィルタホイール、１つ以上の対物レンズ、反射もしくは透過が可能な素子、または任意の当該技術分野において既知の光学素子を備えることができる。加えて、光学素子は、プラスチック、ガラス、あるいは任意の他の既知の、または有用な材料もしくは材料の組み合わせを含むことができる。例えば、ガラス表面は、反射性材料でコーティングされ得、反射性材料は、ガラス以外の材料であってもよい。
本教示は、種々の実施形態と併せて記載されるが、本教示がそのような実施形態に限定されることは意図されていない。それとは逆に、本教示は、当業者に理解されるように、様々な代替物、修正物、及び同等物を包含する。
さらに、種々の実施形態の記載において、本明細書は、特定のステップの配列として方法及び／またはプロセスを示した可能性がある。しかしながら、本方法またはプロセスが本明細書に記載される特定のステップの順序に依存しない程度まで、本方法またはプロセスは、記載される特定のステップの配列に限定されるべきではない。当業者が理解するように、他のステップの配列も可能であり得る。したがって、本明細書に記載される特定のステップの順序は、特許請求の範囲の制限と解釈されるべきではない。加えて、本方法及び／またはプロセスに関する特許請求の範囲は、記載された順序でのそれらのステップの性能に限定されるべきではなく、当業者は、配列が変更されてもよく、それでもなお種々の実施形態の精神及び範囲内にとどまり得ることを容易に理解することができる。

Claims (45)

  1. フローサイトメータのための光学系であって、
    粒子検査領域を含むフローセルと、
    少なくとも２つの光サブユニットと、を備え、前記少なくとも２つの光サブユニットはそれぞれ、
    光ビームを生成する光源であって、前記光ビームは、前記粒子検査領域を通過する、光源と、
    前記光ビームを収束光ビームに変換するように構成される収束素子と、を備える前記光学系。
  2. 前記光サブユニットのそれぞれが、光機械台にそれぞれ取り付けられ、各光機械台は、前記粒子検査領域を通過する前記収束光ビームの空間分離を調節するために操作可能である、請求項１に記載の前記光学系。
  3. 前記光機械台は、前記収束ビームの前記焦点を前記粒子検査領域に位置合わせするように調節され得る、請求項２に記載の前記光学系。
  4. 前記収束光ビームを前記フローセルに方向付けるように構成される、少なくとも１つの２色性素子をさらに備える、請求項１に記載の前記光学系。
  5. 前記少なくとも１つの２色性素子は、２つの隣接するプリズムと、前記隣接するプリズムの間に位置付けられる波長選択膜とからなる、請求項４に記載の前記光学系。
  6. 前記波長選択膜は、ロングパスフィルタとして作用するように構成される、請求項５に記載の前記光学系。
  7. 前記波長選択膜は、ショートパスフィルタとして作用するように構成される、請求項５に記載の前記光学系。
  8. フローセルは、流体の流れを含むように構成され、前記フローセルは、粒子を流動させるように構成される、請求項１に記載の前記光学系。
  9. 前記粒子は、前記収束光ビームのそれぞれによって検査される、請求項８に記載の前記光学系。
  10. 前記粒子は、前記収束光ビームのそれぞれによって検査される、請求項９に記載の前記光学系。
  11. 前記収束素子は、凸レンズである、請求項１に記載の前記光学系。
  12. 前記空間分離は、約８０マイクロメートル〜約２００マイクロメートルである、請求項１に記載の前記光学系。
  13. 前記空間分離は、約１０マイクロメートル〜約１００マイクロメートルである、請求項１に記載の前記光学系。
  14. 前記収束光ビームは、フラットトップ強度プロファイルを有する、請求項１に記載の前記光学系。
  15. 前記光ビームは、実質的に単色である、請求項１に記載の前記光学系。
  16. フローサイトメータにおいて光ビームを組み合わせる方法であって、
    少なくとも２つの光ビームを提供することと、
    収束素子当たり１つの光ビームの割合で、前記光ビームのそれぞれを収束素子に通すことであって、前記収束素子を出る前記光ビームは、収束光ビームである、通すことと、
    前記収束光ビームのうちの少なくとも１つを少なくとも１つの２色性素子に通すことと、
    フローセル内の前記検査領域に入るときに、前記収束光ビームを互いに空間的に分離することと、を含む、前記方法。
  17. 前記収束光ビームは、互いから約８０マイクロメートル〜約２００マイクロメートルの距離、前記検査領域に入るときに空間的に分離される、請求項１６に記載の前記方法。
  18. 前記収束光ビームは、互いから約１０マイクロメートル〜約１００マイクロメートルの距離、前記検査領域に入るときに空間的に分離される、請求項１６に記載の前記方法。
  19. 前記２色性素子は、前記収束光ビームへの収差の導入を防止するように構成される、請求項１６に記載の前記方法。
  20. 前記収束光ビームは、フラットトップ強度プロファイルを有する、請求項１６に記載の前記方法。
  21. フローサイトメータ光学的整列方法であって、
    少なくとも２つの収束光ビームを生成することであって、前記収束光ビームのそれぞれは、光源によって生成される光ビームを収束素子に通すことによって生成され、前記光源及び前記収束素子は、光機械台に取り付けられる、生成することと、
    前記収束光ビームのうちの少なくとも１つを２色性素子に通すことと、
    前記収束光ビームのそれぞれを、空間的に異なる第１の位置のセット中のフローセルに通すことと、
    前記光機械台のうちの少なくとも１つを調節して、少なくとも１つの光源及び少なくとも１つの収束素子を再配置することと、
    前記収束光ビームのそれぞれを、空間的に異なる第２の位置のセット内のフローセルに通すことと、を含む前記方法。
  22. 前記２色性素子は、前記収束光ビームへの収差の導入を防止するように構成される、請求項２１に記載の前記方法。
  23. 前記光機械台を調節することは、ｘ、ｙ、及びｚ座標系上で生じる、請求項２１に記載の前記方法。
  24. フローセルを通過する粒子をさらに含み、前記粒子は、前記収束光ビームによって検査される、請求項２１に記載の前記方法。
  25. フローサイトメータのための光学系であって、
    粒子検査領域を含むフローセルと、
    少なくとも２つの光サブユニットと、を備え、前記少なくとも２つの光サブユニットはそれぞれ、
    光ビームを生成する光源であって、前記光ビームは、前記粒子検査領域に入るように構成される、光源と、
    前記光ビームを収束光ビームに変換するように構成される収束素子と、を備える前記光学系。
  26. 集光ブロックをさらに備え、前記集光ブロックは、少なくとも１つの粒子に衝突する前記収束光ビームによって生じる散乱光を収集して、データセットを生成するように構成される、請求項２５に記載の前記光学系。
  27. 前記データセットは、１０％未満のＣＶを有する、請求項２６に記載の前記光学系。
  28. 前記データセットは、５％未満のＣＶを有する、請求項２６に記載の前記光学系。
  29. 前記データセットは、３％未満のＣＶを有する、請求項２６に記載の前記光学系。
  30. 前記検査領域内の前記光ビームは、９０％の光ビーム強度以上で、フラットトッププロファイル及び約４０〜約６０マイクロメートルの幅を有する、請求項２５に記載の前記光学系。
  31. 前記検査領域内の前記光ビームは、９０％のビーム強度以上で、フラットトッププロファイル及び約４５〜約５５マイクロメートルの幅を有する、請求項２５に記載の前記光学系。
  32. 光ビームをフローサイトメータに組み込む方法であって、
    少なくとも２つの光ビームを提供することと、
    前記光ビームのそれぞれを収束素子に通すことであって、前記収束素子を出る前記光ビームは、収束光ビームである、通すことと、
    前記収束光ビームのうちの少なくとも１つを少なくとも１つの２色性素子に通すことと、
    フローセル内の前記検査領域に入るときに、前記収束光ビームを互いに空間的に分離することと、を含む、前記方法。
  33. 前記検査領域から散乱光を収集して、データセットを生成するステップをさらに含む、請求項３２に記載の前記方法。
  34. 前記データセットは、１０％未満のＣＶを有する、請求項３３に記載の前記方法。
  35. 前記データセットは、５％未満のＣＶを有する、請求項３３に記載の前記方法。
  36. 前記データセットは、３％未満のＣＶを有する、請求項３３に記載の前記方法。
  37. 前記検査領域内の前記光ビームは、９０％のビーム強度以上で、フラットトッププロファイル及び約４０〜約６０マイクロメートルの幅を有する、請求項３２に記載の前記方法。
  38. 前記検査領域内の前記光ビームは、９０％のビーム強度以上で、フラットトッププロファイル及び約４５〜約５５マイクロメートルの幅を有する、請求項３２に記載の前記方法。
  39. フローサイトメータ光学的整列方法であって、
    少なくとも２つの収束光ビームを生成することであって、前記収束光ビームのそれぞれは、光源によって生成される光ビームを収束素子に通すことによって生成され、前記光源及び前記収束素子は、光機械台に取り付けられる、生成することと、
    前記収束光ビームのうちの少なくとも１つを２色性素子に通すことと、
    前記収束光ビームのそれぞれを、空間的に異なる第１の位置のセット中のフローセルに通すことと、
    前記光機械台のうちの少なくとも１つを調節して、少なくとも１つの光源及び少なくとも１つの収束素子を再配置することと、
    前記収束光ビームのそれぞれを、空間的に異なる第２の位置のセット内のフローセルに通すことと、を含む前記方法。
  40. 前記検査領域から散乱光を収集して、データセットを生成するステップをさらに含む、請求項３９に記載の前記方法。
  41. 前記データセットは、１０％未満のＣＶを有する、請求項４０に記載の前記方法。
  42. 前記データセットは、５％未満のＣＶを有する、請求項４０に記載の前記方法。
  43. 前記データセットは、３％未満のＣＶを有する、請求項４０に記載の前記方法。
  44. 前記検査領域内の前記光ビームは、９０％のビーム強度以上で、フラットトッププロファイル及び約４０〜約６０マイクロメートルの幅を有する、請求項３９に記載の前記方法。
  45. 前記検査領域内の前記光ビームは、９０％のビーム強度以上で、フラットトッププロファイル及び約４５〜約５５マイクロメートルの幅を有する、請求項３９に記載の前記方法。
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