JP2008089540A - 光計測方法および光計測装置 - Google Patents

Abstract

【課題】サンプル流に対してサンプル流の流れ方向に対して直交する方向に沿って均一な光強度で照射することで、サンプル流のサンプルの光情報をバラツキが生じないように効率良く得ることができる。
【解決手段】光計測装置１０のキャピラリー３０内を流れる液体４０に分散させた被測定対象であるサンプルＳに対して照射光Ｌを照射することで、サンプルＳの光情報を測定する際に、光源１１が発生する光１３から照射光Ｌを整形して、サンプルＳがキャピラリー３０内を流れる方向に対して交差する方向にそって均一な光強度を有する照射光Ｌを、サンプルＳに照射する。
【選択図】図１

Description

本発明は、光計測方法および光計測装置に関し、特に流路内を流れる液体に分散させたサンプルの光情報を測定するための照射光をサンプルに照射する光計測方法および光計測装置に関する。

液体にサンプル（被検微小物）を分散させたサンプル流がフローセル内を流れるようにして、光源からの光がこのサンプル流に照射されることで、サンプル流中のサンプルの光情報（蛍光情報）を測定することが提案されている。このレーザ光は、結像レンズにより集光されてサンプル流に向けて照射されるようになっている（例えば、特許文献１参照）。
特開平７−９２０７７号公報

ところが、特許文献１に開示されているサンプルを測定する方法では、レーザ光は、結像レンズを用いて、単にフローセル中のサンプル流の中心にスポット光として集光しているだけであり、レーザ光はフローセル中のサンプル流に対して不均一の光強度で照射されてしまう。このため、レーザ光はサンプル流中の各サンプルに対して確実に照射できず、各サンプルの光情報の取得にバラツキが生じてしまう。サンプル流中の各サンプルの光情報をバラツキが生じないように効率良く得るためには、照射光は、サンプル流に対して、サンプル流の流れ方向に対して交差する方向に沿って均一な光強度で照射することが求められる。

そこで、本発明は上記課題を解消するために、サンプル流に対してサンプル流の流れ方向に対して交差する方向に沿って均一な光強度で照射することで、サンプル流の各サンプルの光情報をバラツキが生じないように効率良く得ることができる光計測方法および光計測装置を提供することを目的とする。

上記課題を解消するために、本発明の光計測方法は、流路内を流れる液体に分散させた被測定対象であるサンプルに対して照射光を照射することで、前記サンプルの光情報を測定するための光計測方法であり、
光源が発生する光から前記照射光を整形して、前記サンプルが前記流路内を流れる方向に対して交差する方向にそって均一な光強度を有する前記照射光を、前記サンプルに照射することを特徴とする。

本発明の光計測方法は、好ましくは前記光源が発生する光は回折光学素子を用いて整形することを特徴とする。

本発明の光計測方法は、好ましくは前記光はマイクロアレイレンズを用いて整形することを特徴とする。

本発明の光計測方法は、好ましくは整形された前記照射光は、長軸と前記長軸とは直交する短軸を有する形状を有しており、前記長軸と前記サンプルが前記流路を流れる方向とは交差していることを特徴とする。

本発明の光計測方法は、好ましくは前記照射光の前記長軸方向の長さは、サンプル流の長さより大きく設定されていることを特徴とする。

本発明の光計測方法は、好ましくは前記流路は、フローサイトメータの流路であることを特徴とする。

本発明の光計測装置は、流路内を流れる液体に分散させた被測定対象であるサンプルに対して照射光を照射することで、前記サンプルの光情報を測定するための光計測装置であり、
光源と、
前記光源が発生する光から前記照射光を整形して、前記サンプルが前記流路内を流れる方向に対して交差する方向にそって均一な光強度を有する前記照射光を、前記サンプルに照射するための照射光整形部と、
を備えることを特徴とする。

本発明の光計測方法によれば、サンプル流に対してサンプル流の流れ方向に対して交差する方向に沿って均一な光強度で照射することで、サンプル流の各サンプルの光情報をバラツキが生じないように効率良く得ることができる。

本発明の光計測装置によれば、サンプル流に対してサンプル流の流れ方向に対して交差する方向に沿って均一な光強度で照射することで、サンプル流の各サンプルの光情報をバラツキが生じないように効率良く得ることができる。

以下、図面を参照して、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明する。

図１は、本発明の光計測方法を実施するための光計測装置の好ましい実施形態を示している。

図１に示す光計測装置１の構成例について説明する。

光計測装置１０は、一例としてフローサイトメータ（フローサイトメトリともいう）１として用いられている。光計測装置１０は、光源としてのレーザ光源１１と、照射光整形部としての回折光学素子（ＤＯＥ：Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｖｅ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｅｌｅｍｅｎｔ）２０と、サンプル流を流すための流路としてのキャピラリー３０と、受光部７０と、制御部１００を有している。受光部７０は、例えばホトダイオードである。

図１に示すキャピラリー３０の下部３２には、液体収容部３１が配置されている。この液体収容部３１内には、液体４０が収容されている。この液体４０には被測定対象である複数のサンプルＳが分散されている。このサンプルＳが分散された液体４０は、サンプル流５０という。

図２は、図１におけるＪ方向から見たキャピラリー３０、回折光学素子２０等を示している平面図である。

図１と図２に示すように、キャピラリー３０は例えば断面正方形を有する中空部材である。キャピラリー３０内では、キャピラリー３０の長手方向Ｔに沿って、サンプル流５０が、シース流５１により案内されて流れる。サンプル流５０はサンプル懸濁液ともいう。

図１に示すキャピラリー３０の大きさとしては、上部３３の各辺の幅Ｄが例えば５００μｍである。シース流５１の幅Ｃは例えば３００μｍである。また、サンプル流５１の直径Ｈは例えば５０μｍである。サンプル流５０は、液体収容部３１からキャピラリー３０の長手方向Ｔに沿って上昇して流れ、シース流５１は別の図示しないシース液供給部からキャピラリー３０内に供給される。

図１と図２に示すサンプルＳとしては、例えば大きさが５μｍの細胞であり、サンプル流５０はシース流５１で包み込むような形で、光計測部位７７を通過させるようにして流すようになっている。このシース流５１を用いたシースフロー技術は、サンプル流５０とシース流５１の圧力差によりサンプル流５０の幅を任意に制御して、サンプル流の圧損の低減と詰まりの防止を図っている。

図１と図２に示すレーザ光源１１は、レーザ光１３を発生し、図示例では光ファイバ（光導波路の一例）１２を通じて回折光学素子２０に照射される。１波長分の回折光学素子２０は、レーザ光１３を、図３に示すような長方形状の照射光Ｌに整形する。すなわち、回折光学素子２０は、レーザ光１３の空間パターンをいわゆるフラットトップ形状にして、均一光強度を有する照射光Ｌを整形する。これにより、照射光Ｌは、均一な光強度の測定光としてサンプル流５０とその中に含まれる各サンプルＳに対して、測定位置７７において確実に照射でき、各サンプルＳの光情報をバラツキが生じないようにして、サンプルＳの光情報は図１の受光部７０により受光して効率良く得ることができる。

図１に示すように、照射光Ｌと回折光学素子２０の間隔Ｒは、例えば１〜４ｍｍである。照射光Ｌの長軸方向Ｆは、キャピラリー３０の長手方向Ｔと直交しており、照射光Ｌの短軸方向Ｇは、キャピラリー３０の長手方向Ｔと平行である。キャピラリー３０の長手方向Ｔはサンプル流５０の流れ方向でもある。

照射光Ｌがサンプル流５０に照射されると、サンプル流５０の各サンプルＳから得られる例えば蛍光情報は、図１の受光部７０Ｐにより受光される。受光部７０Ｐにより受光された蛍光情報は、制御部１００において信号処理される。この受光部７０は、キャピラリー３０の横側の位置Ｒ１、すなわちレーザ光源１１のレーザ光１３の射出方向Ｊと平行な方向に配置されている。また制御部１００はレーザ光源１１の動作を制御する。

図３は、図１と図２に示す照射光Ｌの形状例を示している。

図１と図２に示すように、レーザ光１３は回折光学素子２０に通すことで、レーザ光１３は、図３に例示するような光強度のフラットトップ形状部分４４，４５を有する均一光強度の照射光Ｌとして整形される。

図１と図３に示す長方形状の照射光Ｌの寸法例としては、長軸方向Ｆの長さＭが６０μｍであり、短軸方向Ｇの長さＮが３０μｍである。長軸方向Ｆの長さＭは、好ましくはサンプル流５０の直径Ｈに比べて大きく設定されている。

しかも、図３に示すように照射光Ｌの長軸方向Ｆに沿った光強度分布９８の空間パターンは、光強度をフラットトップ形状４４にして均一光強度になるようにした整形されている。また、同様にして、図３に示すように照射光Ｌの短軸方向Ｇに沿った光強度分布９９の空間パターンは、光強度をフラットトップ形状４５にして均一光強度になるようにした整形されている。

これにより、均一な光強度を有する照射光Ｌが、キャピラリー３０内を流れるサンプル流５０とその中に含まれる各サンプルＳに対して確実に照射することができる。この際、サンプルＳがサンプル流５０のＦ方向（サンプル流５０の直径Ｈ方向）に関してどの位置で、キャピラリー３０の長手方向Ｔに沿って流れていったとしても、照射光Ｌが、キャピラリー３０内を流れるサンプル流５０とその中に含まれる各サンプルＳに対して確実に照射することができる。しかも、各サンプルＳに対しては、同じ光強度の照射光Ｌを照射できるので、サンプル流５０の各サンプルＳの光情報をバラツキが生じないように効率良く得ることができる。

図４は、サンプル流５０と整形済みの照射光Ｌの位置関係の例を示している。

図４に示すように、長方形の実線で示す照射光Ｌが、破線で示す照射光Ｌのようにサンプル流５０の流れる方向（キャピラリー３０の長手方向Ｔ）に対して多少傾いて照射されてもかまわない。図４に示すように、照射光Ｌがサンプル流５０の流れる方向（キャピラリー３０の長手方向Ｔ）に対して多少傾いて照射されたとしても、サンプルＳの光情報をバラツキが生じないように、効率良く得ることができる。この場合であっても、図３においてサンプルＳがサンプル流５０とともに長手方向Ｔに沿って流れる際に、サンプルＳがサンプル流５０の直径Ｈのどの位置において長手方向Ｔに沿って流れたとしても、サンプルＳは、図３のようにフラットトップ形状４４，４５を有する照射光Ｌにより均一な光強度により照射される。このため、各サンプルＳの光計測の際の計測値のバラツキを低減でき、サンプルＳを効率よく光計測することができる。

ここで、図１を参照してサンプルＳの光計測方法の一例を説明する。

図１では、液体４０は、液体収容部３１からキャピラリー３０内に供給され、シース流５１によりキャピラリー３０の長手方向Ｔに沿って送られる。制御部１１はレーザ光源１１を駆動してレーザ光源１１からレーザ光１３を発生させると、レーザ光１３は光ファイバ１２を通って回折光学素子２０に照射される。このレーザ光１３は回折光学素子２０により照射光Ｌに整形されてサンプル流５０とその中に含まれている各サンプルＳに対して、測定位置７７において照射される。

この照射の時には、均一な光強度を有する照射光Ｌが、キャピラリー３０内を流れるサンプル流５０とその中に含まれる各サンプルＳに対して確実に照射することができる。サンプルＳは照射光Ｓにより蛍光情報を発生して受光部７０Ｐにより受光される。受光された蛍光情報は制御部１００に送られて処理が施される。

図５は、本発明の実施形態における照射光Ｌと比較するために、比較例としてレーザ光３００をスポット光としてサンプル流５０に対して照射する例を示している。

例えばレーザ光３００のガウス分布（光強度分布）の頂点部分３０３における光強度の値と、途中部分３０４における光強度の値との間には光強度差３０１が生じており、途中部分３０４における光強度の値は、頂点部分３０３における光強度の値に対して８０％程度しかない。このため、スポット状のレーザ光３００がサンプル流５０に照射されると、サンプル流５０とともに流れる各サンプルＳがサンプル流５０の径方向Ｈに関してどの位置で流れるかによって、各サンプルＳに照射されるレーザ光３００の光強度にバラツキが生じてしまい、各サンプルＳの光情報を取得する時に光情報にバラツキが生じてしまう。

また、レーザ光３００がサンプル流５０以外の外側部分５１Ｐに照射されるので、その外側部分５１Ｐに照射されたレーザ光３００はエネルギーの無駄になり、そのエネルギー損失は例えばレーザ光３００の全体のエネルギーの５１％に達する。

しかし、本発明の実施形態では、図１と図３に示すような光強度を有する照射光Ｌのエネルギーのほとんどは、サンプル流５０に対して照射しており、サンプル流５０とサンプルＳに対して照射光Ｌを照射する際のエネルギー損失を減少させることができる。例えば照射光Ｌをサンプル流５０に照射した例では、照射光Ｌの９０％以上のエネルギーをサンプル流５０に対して使用でき、各サンプルＳの光情報を取得する際のエネルギー損失を減少させて、サンプルＳの光計測時の感度と分解能を向上できる。

次に、図６と図７を参照して、本発明の好ましい別の実施形態を説明する。

図６は、本発明の光計測方法を実施するための光計測装置の好ましい別の実施形態を示す斜視図であり、図７は、図６の光計測装置に用いられる照射光Ｌの形状例を示す図である。

図６に示す光計測装置１０Ａは、図１に示す光計測装置１０に比べてほとんど同じ構造を有しているので、異なる要素について説明することにして、同様の箇所には同じ符号を記載してその説明を用いる。

図６に示す回折光学素子２０Ａは、図１に示す回折光学素子２０とは異なるものが用いられており、この回折光学素子２０Ａは、図６と図７に示すように、レーザ光１３を正方形状の照射光Ｌに整形してサンプル流５０に照射することができる。

図７に示す正方形状の照射光Ｌは、長軸方向Ｆの長さＭが例えば６０μｍであり、短軸方向Ｇの長さＮが同様にして６０μｍである。長軸方向Ｆの長さＭはサンプル流５０の直径Ｈに比べて大きく設定されている。

図７に示すように、照射光Ｌの長軸方向Ｆに沿った光強度分布９８Ａの空間パターンは、フラットトップ形状４４Ａにして均一光強度になるようにした整形されている。また、同様にして、図７に示すように照射光Ｌの短軸方向Ｇに沿った光強度分布９９Ａの空間パターンは、フラットトップ形状４５Ａにして均一光強度になるようにした整形されている。 これにより、サンプルＳの光計測を行う際には、照射光Ｌの形状は任意に選択できる。ただし、照射光Ｌの短軸方向Ｇの長さＮが小さいほど、サンプルＳを光計測してサンプルＳの光情報を取得する際に分解能を上げることができる。

次に、図８を参照して、本発明のさらに別の実施形態を説明する。

図１と図６に示す実施形態の光計測装置１０，１０Ａでは、ともにキャピラリー３０は正方形状の断面空間を有する中空体である。これに対して、図８に示す実施形態の光計測装置１０Ｂでは、ともにキャピラリー３０Ａは円形状の断面空間を有する中空体である。キャピラリー３０Ａ内は、シース流５１とサンプル流５０を流すようになっている。光計測装置１０Ｂのその他の構成要素は、光計測装置１０，１０Ａの対応する構成要素と同じであるので、同様の箇所には同じ符号を記載して説明を用いる。

図９は、本発明のさらに別の実施形態を示している。

図９では、光源１１Ａは例えば発光ダイオードを用いており、光源１１Ａが発生する光１３Ａは、照射光整形部としてのマイクロアレイレンズ２０Ｇにより照射光ＬＡに整形される。照射光ＬＡは、サンプルＳとサンプル流５０に対して均一な光強度で照射される。

図１などに示すフローサイトメータ（ＦＣＭ）１では、照射光Ｌがサンプル流５０に対して一様に照射され、受光部７０ＰはサンプルＳから得られる例えば蛍光情報である蛍光計測値を受光して、制御部１００はその蛍光計測値を解析する。励起光源であるレーザ光源１１が発生するレーザ光１３から得られる照射光Ｌは、サンプルＳの計測能力を確保するために励起光強度と光強度分布が重要である。

各サンプルＳは、サンプル流５０内をある範囲内で自由に流れていることから、励起光としての照射光Ｌ内の光強度の差は、各サンプルＳの光情報を得る際にはバラツキが生じることになる。本発明の実施形態では、照射光Ｌはサンプル流５０の幅の範囲に一様な光強度で照射できる。

本発明の実施形態では、光計測装置のキャピラリー（流路）内を流れる液体に分散させた被測定対象であるサンプルＳに対して照射光Ｌを照射することで、サンプルＳの光情報を測定する。この際に、光源が発生する光から照射光を整形して、サンプルが流路内を流れる方向に対して交差する方向にそって均一な光強度を有する照射光を、サンプルに照射する。これにより、サンプル流に対してサンプル流の流れ方向に対して直交する方向に沿って均一な光強度で照射することで、サンプル流のサンプルの光情報をバラツキが生じないように効率良く得ることができる。

本発明の実施形態では、光源はレーザ光源であり、照射光はレーザ光源から発生するレーザ光であり、レーザ光は回折光学素子（ＤＯＥ）を用いて照射光に整形する。これにより、回折光学素子を用いることで、レーザ光は均一な光強度を有する照射光に確実に整形できる。

本発明の実施形態では、光はマイクロアレイレンズを用いて整形する。これにより、マイクロアレイレンズを用いることで、レーザ光は均一な光強度を有する照射光に確実に整形できる。

本発明の実施形態では、整形された照射光は、長軸と長軸とは直交する短軸を有する形状を有しており、長軸とサンプルが流路を流れる方向とは交差している。これにより、均一な光強度を有する照射光Ｌが、キャピラリー内を流れるサンプル流とその中に含まれるサンプルに対して確実に照射することができる。この際、サンプルがサンプル流の直径方向に関してどの位置で、キャピラリーの長手方向Ｔに沿って流れていったとしても、照射光が、キャピラリー内を流れるサンプル流とその中に含まれるサンプルに対して確実に照射することができる。しかも、各サンプルに対しては、同じ光強度の照射光Ｌを照射できるので、サンプル流の各サンプルの光情報をバラツキが生じないように効率良く得ることができる。

本発明の実施形態では、照射光の長軸方向の長さは、サンプル流の長さより大きく設定されていることを特徴とする。これにより、照射光がサンプル流の流れる方向（キャピラリーの長手方向Ｔ）に対して多少傾いて照射されたとしても、サンプルの光情報をバラツキが生じないように、効率良く得ることができる。

ところで、本発明は、上記実施形態に限定されず種々の変形例を採用できる。

例えば、図１，図６、図８に示す受光部７０Ｐは、好ましくはキャピラリー３０の横側の位置Ｒ１に配置されているが、これに限らず図１，図６、図８に示す受光部７０は、回折光学素子２０に対してキャピラリー３０を挟んで対面する位置Ｒ２に配置することも可能である。

図１に示すキャピラリー３０は例えば断面正方形を有する中空部材であるが、例えば断面長方形やその他の断面形状であっても良い。図１などに示す光ファイバ１１は省略しても良い。

また、サンプルＳである例えば細胞から得られる散乱光、透過光、そして蛍光情報といった信号を受光部７０を用いて取得することができる。照射光Ｌの長軸方向の長さＭは、サンプル流５０の幅（直径）Ｈと同じであるか、少し大きく設定することができる。

例えば図３に示す照射光Ｌの形状は、長方形形状や、正方形形状に限らず、楕円形状であってもよく、照射光Ｌの形状は長軸と短軸を有する形状である。

本発明の光計測方法と光計測装置は、遺伝子、免疫系、タンパク質、アミノ酸、糖類の生体高分子に関する検査、解析、分析が要求される分野、例えば工学分野、食品、農産、水産加工等の農学全般、薬学分野、衛生、保健、免疫、疫病、遺伝等の医学分野、化学もしくは生物学等の理学分野等、あらゆる分野に適用できる。

本発明の光計測方法を実施するための光計測装置の好ましい実施形態を示す斜視図である。 図１のＪ方向から見たキャピラリー等を示している平面図である。 図１と図２に示す照射光Ｌの形状例を示す図である。 サンプル流と整形済みの照射光Ｌの位置関係の例を示す図である。 比較例のスポット型のレーザ光を示す図である。 本発明の光計測方法を実施するための光計測装置の好ましい別の実施形態を示す斜視図である。 図６の光計測装置に用いられる照射光Ｌの形状例を示す図である。 本発明の光計測方法を実施するための光計測装置の好ましい別の実施形態を示す斜視図である。 本発明のさらに別の実施形態を示す図である。

符号の説明

１ フローサイトメータ
１０ 光計測装置
１１ レーザ光源
２０ 回折光学素子（ＤＯＥ：Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｖｅ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｅｌｅｍｅｎｔ）
３０ キャピラリー
４０ 液体
５０ サンプル流
５１ シース流
７０、７０Ｐ 受光部
１００ 制御部
Ｓ サンプル
Ｌ 照射光

Claims (7)

1. 流路内を流れる液体に分散させた被測定対象であるサンプルに対して照射光を照射することで、前記サンプルの光情報を測定するための光計測方法であり、
   光源が発生する光から前記照射光を整形して、前記サンプルが前記流路内を流れる方向に対して交差する方向にそって均一な光強度を有する前記照射光を、前記サンプルに照射することを特徴とする光計測方法。
2. 前記光源が発生する光は回折光学素子を用いて整形することを特徴とする請求項１に記載の光計測方法。
3. 前記光はマイクロアレイレンズを用いて整形することを特徴とする請求項１に記載の光計測方法。
4. 整形された前記照射光は、長軸と前記長軸とは直交する短軸を有する形状を有しており、前記長軸と前記サンプルが前記流路を流れる方向とは交差していることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の光計測方法。
5. 前記照射光の前記長軸方向の長さは、サンプル流の長さより大きく設定されていることを特徴とする請求項４項に記載の光計測方法。
6. 前記流路は、フローサイトメータの流路であることを特徴とする請求項１〜5のいずれか１項に記載の光計測方法。
7. 流路内を流れる液体に分散させた被測定対象であるサンプルに対して照射光を照射することで、前記サンプルの光情報を測定するための光計測装置であり、
   光源と、
   前記光源が発生する光から前記照射光を整形して、前記サンプルが前記流路内を流れる方向に対して交差する方向にそって均一な光強度を有する前記照射光を、前記サンプルに照射するための照射光整形部と、
   を備えることを特徴とする光計測装置。
   

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