JP2017500003A - システイン改変フィブロネクチンiii型ドメイン結合分子 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、システイン改変単特異性及び二重特異性EGFR/c−Met結合FN3ドメイン含有分子並びにそれらを作製及び使用する方法を提供する。
本発明は、上皮成長因子受容体(EGFR)に特異的に結合して、EGFRに対する上皮成長因子(EGF)の結合を遮断し、それにより治療応用及び診断応用において広く使用することができるフィブロネクチンIII型(FN3)ドメインを提供する。本発明は、本発明のFN3ドメインをコードするポリヌクレオチド又はその相補的核酸、ベクター、宿主細胞、並びにそれらを作製及び使用する方法を提供する。
X9がM若しくはIである、配列HNVYKDTNX9RGL(配列番号179)、又は配列LGSYVFEHDVML(配列番号180)を含むFGループ;並びに
配列X1X2X3X4X5X6X7X8(配列番号181)を含むBCループ;式中、
X1はA、T、G、又はDであり、
X2はA、D、Y、又はWであり、
X3はP、D、又はNであり、
X4はLであるか、又は存在せず、
X5はD、H、R、G、Y、又はWであり、
X6はG、D、又はAであり、
X7はA、F、G、H、又はDであり、及び
X8はY、F又はLである。
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNX9RGLPLSAEFTT(配列番号182)の配列、又は
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVLGSYVFEHDVMLPLSAEFTT(配列番号183)の配列を更に含み、
式中、
X1はA、T、G、又はDであり、
X2はA、D、Y、又はWであり、
X3はP、D、又はNであり、
X4はLであるか、又は存在せず、
X5はD、H、R、G、Y、又はWであり、
X6はG、D、又はAであり、
X7はA、F、G、H、又はDであり、
X8はY、F、又はLであり、及び
X9はM又はIである。
本発明は、肝細胞増殖因子受容体(c−Met)に特異的に結合して、c−Metに対する肝細胞増殖因子(HGF)の結合を遮断し、それにより治療応用及び診断応用において広く使用することができるフィブロネクチンIII型(FN3)ドメインを提供する。本発明は、本発明のFN3ドメインをコードするポリヌクレオチド又はその相補的核酸、ベクター、宿主細胞、並びにそれらを作製及び使用する方法を提供する。
配列DSFX10IRYX11EX12X13X14X15GX16(配列番号184)を含むC鎖及びCDループ、式中
X10はW、F、又はVであり、
X11はD、F、又はLであり、
X12はV、F、又はLであり、
X13はV、L、又はTであり、
X14はV、R、G、L、T、又はSであり、
X15はG、S、A、T、又はKであり、及び
X16は、E、又はDであり、及び
配列TEYX17VX18IX19X20VKGGX21X22SX23(配列番号185)を含むF鎖及びFGループ、式中
X17はY、W、I、V、G、又はAであり、
X18はN、T、Q、又はGであり、
X19はL、M、N、又はIであり、
X20は、G、又はSであり、
X21は、S、L、G、Y、T、R、H、又はKであり、
X22はI、V、又はLであり、及び
X23はV、T、H、I、P、Y、T、又はLである。
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX10IRYX11EX12X13X14X15GX16AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX17VX18IX19X20VKGGX21X22SX23PLSAEFTT(配列番号186)を更に含み、
式中、
X10はW、F、又はVであり、及び
X11はD、F、又はLであり、
X12はV、F、又はLであり、
X13はV、L、又はTであり、
X14はV、R、G、L、T、又はSであり、
X15はG、S、A、T、又はKであり、
X16はE、又はDであり、
X17はY、W、I、V、G、又はAであり、
X18はN、T、Q、又はGであり、
X19はL、M、N、又はIであり、
X20はG、又はSであり、
X21は、S、L、G、Y、T、R、H、又はKであり、
X22はI、V、又はLであり、及び
X23はV、T、H、I、P、Y、T、又はLである。
Tencon(配列番号1)は、ヒトテナシン−Cからの15個のFN3ドメインのコンセンサス配列から設計された天然に存在しないフィブロネクチンIII型(FN3)ドメインである(Jacobs et al.,Protein Engineering,Design,and Selection,25:107〜117,2012;米国特許出願公開第2010/0216708号)。Tenconの結晶構造は、FN3ドメインの特徴である7個のβ鎖をつなぐ6回表面露出ループを示し、β鎖は、A、B、C、D、E、F、及びGと呼ばれ、ループは、AB、BC、CD、DE、EF、及びFGループと呼ばれる(Bork and Doolittle,Proc Natl Acad Sci USA 89:8990〜8992,1992;米国特許第6,673,901号)。これらのループ又は各ループ内の選択された残基を、フィブロネクチンIII型(FN3)ドメインのライブラリを構築するために無作為化することができ、これらを用いてEGFRに結合する新規分子を選択することができる。表1は、Tencon(配列番号1)における各ループ及びβ鎖の位置及び配列を示す。
本発明の分子を含む二重特異性EGFR/c−Met FN3ドメインは、低分子EGFR阻害剤と比較して、特異性及び低減されたオフターゲット毒性の点で、通並びに常の抗体治療薬と比較して改善された組織浸透の点で恩典を提供し得る。本発明は、少なくとも部分的に、本発明の分子を含む二重特異性EGFR/c−Met FN3ドメインが、EGFR結合及びc−Met結合FN3ドメインの混合物と比較すると、有意に改善された相乗的阻害効果を提供するという意外な発見に基づいている。分子は、腫瘍への浸透及び保持を最大にするためにEGFR及びc−Metの両方に対して特異的親和性となるように適合され得る。
第1のFN3ドメインは、
X9がM若しくはIである、配列HNVYKDTNX9RGL(配列番号179)、又は配列LGSYVFEHDVML(配列番号180)を含むFGループ;及び
配列X1X2X3X4X5X6X7X8(配列番号181)を含むBCループであって;
X1はA、T、G、又はDであり、
X2はA、D、Y、又はWであり、
X3はP、D、又はNであり、
X4はLであるか、又は存在せず、
X5はD、H、R、G、Y、又はWであり、
X6はG、D、又はAであり、
X7はA、F、G、H、又はDであり、及び
X8はY、F、又はLであるBCループとを含み、並びに
第2のFN3ドメインは、
配列DSFX10IRYX11EX12X13X14X15GX16(配列番号184)を含むC鎖及びCDループ、式中
X10はW、F、又はVであり、
X11はD、F、又はLであり、
X12はV、F、又はLであり、
X13はV、L、又はTであり、
X14はV、R、G、L、T、又はSであり、
X15はG、S、A、T、又はKであり、及び
X16はE、又はDであり、及び
配列TEYX17VX18IX19X20VKGGX21X22SX23(配列番号185)を含むF鎖及びFGループ、式中
X17はY、W、I、V、G、又はAであり、
X18はN、T、Q、又はGであり、
X19はL、M、N、又はIであり、
X20はG、又はSであり、
X21は、S、L、G、Y、T、R、H、又はKであり、
X22はI、V、又はLであり、及び
X23はV、T、H、I、P、Y、T、又はLである。
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNX9RGLPLSAEFTT(配列番号182)の配列、又は
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVLGSYVFEHDVMLPLSAEFTT(配列番号183)の配列であって
式中、配列番号X及びXにおいて、
X1はA、T、G、又はDであり、
X2はA、D、Y、又はWであり、
X3はP、D、又はNであり、
X4はLであるか、又は存在せず、
X5はD、H、R、G、Y、又はWであり、
X6はG、D、又はAであり、
X7はA、F、G、H、又はDであり、
X8はY、F、又はLであり、及び
X9はM又はIである。
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX10IRYX11EX12X13X14X15GX16AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX17VX18IX19X20VKGGX21X22SX23PLSAEFTT(配列番号186)であって、
式中、
X10はW、F、又はVであり、及び
X11はD、F、又はLであり、
X12はV、F、又はLであり、
X13はV、L、又はTであり、
X14はV、R、G、L、T、又はSであり、
X15はG、S、A、T、又はKであり、
X16はE、又はDであり、
X17はY、W、I、V、G、又はAであり、
X18はN、T、Q、又はGであり、
X19はL、M、N、又はIであり、
X20はG、又はSであり、
X21は、S、L、G、Y、T、R、H、又はKであり、
X22はI、V、又はLであり、及び
X23はV、T、H、I、P、Y、T、又はLである。
50ng/mLヒトEGFを用いてA431細胞において測定されるとき、約8×10-7Mより低いIC50値でEGFRの1173番目のチロシン残基でEGFによって誘発されるEGFRのリン酸化を阻害し、
100ng/mLヒトHGFを用いてNCI−H441細胞において測定されるとき、約8.4×10-7Mより低いIC50値でc−Metの1349番目のチロシン残基でHGFによって誘発されるc−Metのリン酸化を阻害し、
7.5ng HGFを含む10%FBSによって細胞増殖が誘導される、HGFによって誘発されるNCI−H292細胞増殖を、約9.5×10-6Mより低いIC50値で阻害し、
約2.0×10-8Mより低いKDでEGFRに結合し、
約2.0×10-8Mより低いKDでc−Metに結合する。
50ng/mLヒトEGFを用いてA431細胞において測定されるとき、約4.2×10-9M〜8×10-7MのIC50値でEGFRの1173番目のチロシン残基でEGFによって誘発されるEGFRのリン酸化を阻害し、
100ng/mLヒトEGFを用いてNCI−H441細胞において測定されるとき、約2.4×10-8M〜約8.4×10-7MのIC50値でc−Metの1349番目のチロシン残基でHGFによって誘発されるc−Metのリン酸化を阻害し、
7.5ng HGFを含む10%FBSによって細胞増殖が誘導される、HGFによって誘発されるNCI−H292細胞増殖を、約2.3×10-8M〜約9.5×10-8MのIC50値で阻害し、
約2×10-10M〜約2.0×10-8MのKDでEGFRに結合し、
約1×10-9M〜約2.0×10-8MのKDでc−Metに結合する。
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNX9RGLPLSAEFTT(配列番号182)であって、式中
X1は、Dであり、
X2は、Dであり、
X3は、Pであり、
X4は、存在せず、
X5は、H、又はWであり、
X6は、Aであり、
X7は、Fであり、
X8は、Yであり、及び
X9はM又はIである、と、
以下の配列を含むc−Met結合FN3ドメイン、
PAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX10IRYX11EX12X13X14X15GX16AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX17VX18IX19X20VKGGX21X22SX23PLSAEFTT(配列番号186)であって
式中、
X10は、Wであり、
X11は、Fであり、
X12は、Fであり、
X13は、V、又はLであり、
X14は、G、又はSであり、
X15は、S、又はKであり、
X16は、E、又はDであり、
X17は、Vであり、
X18は、Nであり、
X19は、L、又はMであり、
X20は、G、又はSであり、
X21は、S、又はKであり、
X22は、Iであり、及び
X23が、Pである、とを含む。
LPAPKNLVVSX24VTX25DSX26RLSWDDPX27AFYX28SFLIQYQX29SEKVGEAIX30LTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYX31VHNVYKDTNX32RGLPLSAX33FTT(配列番号187)であって、式中
X24は、E、N、又はRであり、
X25は、E、又はPであり、
X26は、L、又はAであり、
X27は、H、又はWであり、
X28は、E、又はDであり、
X29は、E、又はPであり、
X30は、N、又はVであり、
X31はG、又はYであり、
X32は、M、又はIであり、及び
X33は、E、又はIである、配列を含み、
及び第2のFN3ドメインは、配列
LPAPKNLVVSX34VTX35DSX36RLSWTAPDAAFDSFWIRYFX37FX38X39X40GX41AIX42LTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNIX43X44VKGGX45ISPPLSAX46FTT(配列番号188)であって、式中、
X34は、E、N、又はRであり、
X35は、E、又はPであり、
X36は、L、又はAであり、
X37は、E、又はPであり、
X38は、V、又はLであり、
X39は、G、又はSであり、
X40は、S、又はKであり、
X41は、E、又はDであり、
X42は、N、又はVであり、
X43は、L、又はMであり、
X44は、G、又はSであり、
X45は、S、又はKであり、及び
X46は、E、又はIである、配列を含む。
本発明の二重特異性EGFR/c−Met FN3ドメイン含有分子又は単特異性EGFR/c−Met FN3ドメインは、例えば共有的相互作用を介して、他のサブユニットを組み入れてもよい。本発明の1つの態様において、二重特異性EGFR/c−Met FN3ドメイン含有分子は、半減期延長部分を更に含む。例示的な半減期延長部分は、アルブミン、アルブミン結合タンパク質及び/又はドメイン、トランスフェリン及びその断片及び類似体、並びにFc領域である。例示的なアルブミン結合ドメインは、配列番号117に示される。
本発明は、インビトロ転写/翻訳のために使用される直鎖DNA配列、その組成物の真核、原核、又はフィラメントファージ発現、分泌及び/又はディスプレイと適合するベクター、又はその定方向変異原を含む、単離ポリヌクレオチドとして、又は発現ベクターの一部として、又は直鎖DNA配列の一部として、本発明のEGFR結合若しくはc−Met結合FN3ドメイン又は二重特異性EGFR/c−Met FN3ドメイン含有分子をコードする核酸を提供する。.特定の例示ポリヌクレオチドが本明細書で開示されるが、しかしながら、所与の発現システム中の遺伝コードの縮重又はコドン選択性を考えたときに、本発明の結合タンパク質をコードする他のポリヌクレオチド、及び本発明のタンパク質足場のライブラリも、また本発明の範囲内である。
本発明の二重特異性EGFR/c−Met FN3ドメイン含有分子、EGFR結合FN3ドメイン、若しくはc−Met結合FN3ドメインは、ヒト疾患又は細胞、組織、臓器、体液、若しくは一般的に宿主における特定の病態を診断、モニター、調節、処置、軽減、発生を予防するために役立つ、又は症状を低減するために用いられ得る。本発明の方法を用いて任意の分類に属する動物患者を治療することができる。このような動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。
治療的用途に関して、本発明の二重特異性EGFR/c−Met FN3ドメイン含有分子、EGFR結合FN3ドメイン又はc−Met結合FN3ドメインは、医薬的に許容される担体中で活性成分としてドメイン又は分子の有効量を含む医薬組成物として調製され得る。用語「担体」は、それと共に活性化合物が投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのようなビヒクルは、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等の、石油、動物、植物、又は合成起源のものを含む、水及び油などの液体であってよい。例えば、0.4%生理食塩水及び0.3%グリシンを用いることができる。これらの溶液は滅菌され、一般には粒子状物質を含まない。これらは、通常の周知の滅菌技術(例えば、濾過)によって滅菌することができる。組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされる製薬上許容される補助物質、例えばpH調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、滑剤及び着色剤等を含むことができる。そのような医薬製剤中の本発明の分子の濃度は幅広く変化してよく、すなわち約0.5重量%未満、通常は約1重量%又は少なくとも約1重量%から最大で15又は20重量%まで変化してもよく、また、選択される特定の投与様式に従って、主として必要とされる用量、液体の体積、粘度等に基づいて選択される。好適なビヒクル、及び他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む製剤は、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,Troy,D.B.ed.,Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA 2006,Part 5,Pharmaceutical Manufacturing pp 691〜1092に記載され、特にpp.958〜989を参照されたい。
Tencon(配列番号1)は、ヒトテナシン−Cからの15個のFN3ドメインのコンセンサス配列から設計された、免疫グロブリン様足場構造のフィブロネクチンIII型(FN3)ドメインである(Jacobs et al.,Protein Engineering,Design,and Selection,25:107〜117,2012;米国特許出願公開第2010/0216708号)。Tenconの結晶構造は、7個のβ鎖をつなぐ6回表面露出ループを示す。これらのループ又は各ループ内の選択された残基を無作為化して、フィブロネクチンIII型(FN3)ドメインのライブラリを構築することができ、このライブラリを用いて特異的標的に結合する新規分子を選択することができる。
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT(配列番号1)
Tencon(配列番号1)のFGループのみを無作為化するように設計されたライブラリTCL1を、cisディスプレイシステムで用いるために構築した(Jacobs et al.,Protein Engineering,Design,and Selection,25:107〜117,2012)。このシステムにおいて、Tacプロモーター、Tenconライブラリコード配列、RepAコード配列、cisエレメント、及びoriエレメントの配列を組み入れる一本鎖DNAを作製する。インビトロ転写/翻訳系で発現させると、それがコードされるDNAに対してcisで結合したTencon−RepA融合タンパク質の複合体が産生される。次に、標的分子に結合する複合体を単離して、以下に記述されるようにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅する。
TenconのBC及びFGループの両方が無作為化されて、それぞれの位置でのアミノ酸の分布が厳密に制御されているTCL2ライブラリを構築した。表3は、TCL2ライブラリにおける所望のループ位置でのアミノ酸分布を示す。設計されたアミノ酸分布は2つの目的を有した。第一に、ライブラリを、Tencon結晶構造の解析及び/又はホモロジーモデリングに基づいて、Tenconのフィールディング及び安定性にとって構造的に重要となると予測される残基に向けて偏らせた。例えば、29番目の位置は、Tenconが折り畳まれた際に疎水性コアの中に埋もれることから、疎水性アミノ酸のサブセットのみとなるように固定した。第二の設計は、高親和性結合体を効率よく産生するために、抗体の重鎖HCDR3に選択的に認められる残基の分布となるようにアミノ酸分布を偏らせることを含んだ((Birtalan et al.,J Mol Biol 377:1518〜28,2008;Olson et al.,Protein Sci 16:476〜84,2007)。この目標に向かって、表3の「設計された分布」は、以下の分布を指す:6%アラニン、6%アルギニン、3.9%アスパラギン、7.5%アスパラギン酸、2.5%グルタミン酸、1.5%グルタミン、15%グリシン、2.3%ヒスチジン、2.5%イソロイシン、5%ロイシン、1.5%リジン、2.5%フェニルアラニン、4%プロリン、10%セリン、4.5%トレオニン、4%トリプトファン、17.3%チロシン、及び4%バリン。この分布には、メチオニン、システイン、及び終止コドンが含まれない。
上部(BC、DE、及びFG)及び下部(AB、CD、及びEF)ループ、例えば、FN3ドメインにおける報告された結合表面は、FN3構造の中心を形成するβ鎖によって分離される。ループのみによって形成された表面とは異なる形状を有するFN3ドメインの2つの「側面」に存在する代替表面を、FN3ドメインの1つの側面で2つの逆平行β鎖、すなわちC鎖とFβ鎖、及びCDループとFGループによって形成して、本明細書において以降C−CD−F−FG表面と呼ぶ。
ライブラリのスクリーニング
cisディスプレイを用いて、TCL1及びTCL2ライブラリからEGFR結合ドメインを選択した。IgG1 Fcに融合したEGFRの組み換え型ヒト細胞外ドメイン(R&D Systems)を、標準的な方法を用いてビオチニル化して、これをパニングのために用いた(配列番号73の完全長EGFRの25〜645番目の残基)。インビトロ転写及び翻訳(ITT)に関して、ライブラリDNA 2〜6μgを0.1mM completeアミノ酸、1×S30プレミクス成分、及びS30抽出物(Promega)30μLと共に全量100μL中で30℃でインキュベートした。1時間後、ブロッキング溶液(2%ウシ血清アルブミン、100μg/mLニシン***DNA、及び1mg/mLヘパリンを添加したPBS、pH7.4)を添加して、反応を氷中で15分間インキュベートした。EGFR−Fc:EGF複合体は、ブロッキング溶液中で組み換え型ヒトEGF(R&D Systems)とビオチニル化組み換え型EGFR−Fcとを、室温で1時間混合することによって、EGFR対EGFのモル比1:1及び10:1でアセンブルされた。結合に関して、ブロックされたITT反応物500μLをEGFR−Fc:EGF複合体100μLと混合して、室温で1時間インキュベートした後、結合した複合体をニュートラアビジン又はストレプトアビジン磁気ビーズによって吸引した。非結合ライブラリメンバーを、PBST及びPBSで連続的に洗浄することによって除去した。洗浄後、65℃に10分間加熱することによって、結合した複合体からDNAを溶出させ、PCRによって増幅し、更なるパニングラウンドのために制限酵素消化及びライゲーションによってRepAをコードするDNA断片に結合させた。各ラウンドにおいて、標的EGFR−Fcの濃度を200nMから50nMへと連続的に低下させて、洗浄のストリンジェンシーを増加させることによって、高親和性結合体を単離した。ラウンド4及び5において、非結合及び弱く結合したFN3ドメインを、PBS中で10倍モル過剰量の非ビオチニル化EGFR−Fcの存在下で終夜洗浄することによって除去した。
より生理的な意味で異なるFN3ドメインのEGFR結合能を評価するために、そのA431細胞結合能を測定した。A431細胞(American Type Culture Collection,カタログ番号CRL−1555)は、約2×106個の受容体/細胞でEGFRを過剰発現する。細胞を不透明な黒色96ウェルプレートに5,000個/ウェルで播種して、37℃の湿潤5% CO2環境で終夜接着させた。FN3ドメイン発現細菌溶解物をFACS染色緩衝液(Becton Dickinson)中で1,000倍希釈して、同じプレートを3枚作製して室温で1時間インキュベートした。溶解物を除去して、細胞を、150μL/ウェルのFACS染色緩衝液によって3回洗浄した。細胞を、FACS染色緩衝液中で1:100に希釈した抗ペンタHis−Alexa 488抗体コンジュゲート(Qiagen)50μL/ウェルと共に室温で20分間インキュベートした。細胞を150μL/ウェルのFACS染色緩衝液によって3回洗浄した後、ウェルにFACS染色緩衝液100μLを満たし、Acumen eX3リーダーを用いて488nmで蛍光を読み取った。FN3ドメインを含む細菌溶解物を、そのA431細胞結合能に関してスクリーニングし(TCL1及びTCL2ライブラリに関して1320個の粗細菌溶解物)、結合がバックグラウンドシグナルより10倍以上高い陽性クローンが516個同定された。TCL14ライブラリからの溶解物300個を、結合に関してスクリーニングし、EGFRに結合する独自のFN3ドメイン配列58個が得られた。
EGFR結合の作用機序の特徴をよりよく調べるために、同定された様々なFN3ドメインクローンのEGFR結合能を、A431細胞を用いてEGF競合的に測定し、A431結合アッセイスクリーニングと同時に行った。A431細胞を不透明な黒色96ウェルプレートに5,000個/ウェルで播種して、37℃の湿潤5% CO2環境で終夜接着させた。細胞を、50μL/ウェルの1:1,000倍希釈した細菌溶解物と共に、同じプレートを3枚作製して室温で1時間インキュベートした。ビオチニル化EGF(Invitrogen、カタログ番号E−3477)を、最終濃度30ng/mLとなるように各ウェルに添加して、室温で10分間インキュベートした。細胞を、150μL/ウェルのFACS染色緩衝液によって3回洗浄した。細胞を、FACS染色緩衝液中で1:100に希釈したストレプトアビジン−フィコエリスリンコンジュゲート(Invitrogen)50μL/ウェルと共に室温で20分間インキュベートした。細胞を150μL/ウェルのFACS染色緩衝液によって3回洗浄した後、ウェルにFACS染色緩衝液100μLを満たし、Acumen eX3リーダーを用いて600nmで蛍光を読み取った。
HisタグFN3ドメインを His MultiTrap(商標)HPプレート(GE Healthcare)によって澄明化大腸菌溶解物から精製して、20mMリン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、及び250mMイミダゾールを含むpH7.4の緩衝液で溶出した。精製試料を、PD MultiTrap(商標)G−25プレート(GE Healthcare)を用いる分析のために、pH7.4のPBSに交換した。
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、EGFRに結合するFN3ドメインの凝集状態を決定した。各精製FN3ドメインのアリコート(10μL)をSuperdex 75 5/150カラム(GE Healthcare)に流速0.3mL/分でpH7.4のPBSを移動相として注入した。カラムからの溶出を、280nmの吸光度によってモニターした。SECによって高レベルの凝集を示したセンチリンを更なる分析から除外した。
選択したEGFR結合FN3ドメインをスクリーニングして、高親和性結合体の選択を容易にするために、ProteOn XPR−36機器(BioRad)においてEGFR−Fcに対する結合の遅いオフレート(koff)を示すドメインを同定した。ヤギ抗ヒトFc IgG(R&D Systems)を、チップ上の水平方向の6本全てのリガンド流路において5μg/mLの濃度で、0.005% Tween−20を含むPBS中で流速30μL/分でアミンカップリング(pH5.0)によって直接固定した。固定密度は、平均で約1500応答単位(RU)であり、異なる流路間の変動は5%未満であった。EGFR−Fcは、垂直のリガンド方向で、密度およそ600RUで抗ヒトFc IgG表面上で捕捉された。試験したFN3ドメインを全て、1μMの濃度に標準化して、その水平方向の結合に関して試験した。スクリーニングの処理能力を最大にするために、FN3ドメインに関して6本全てのアナライト流路を用いた。解離相を、100μL/分の流速で10分間モニターした。スポット間結合シグナルを、アナライトと固定されたIgG表面との間の非特異的結合をモニターするための参照として用いて、すべての結合反応から差し引いた。処理された結合データを1:1の単純なラングミュア結合モデルに局所的にフィットさせて、捕捉されたEGFR−Fcに対するそれぞれのFN3ドメインの結合のkoffを引き出した。
精製EGFR結合FN3ドメインを、A431細胞におけるEGFRのEGF刺激リン酸化の阻害能に関して1つの濃度で試験した。EGFRのリン酸化を、EGFR phospho(Tyr1173)キット(Meso Scale Discovery)を用いてモニターした。細胞を、透明な96ウェル組織培養処置プレート(Nunc)において10%ウシ胎児血清(FBS)(Gibco)と共にGlutamax(商標)を含むRPMI培地(Gibco)100μL/ウェル中で20,000個/ウェルで播種し、37℃の湿潤5% CO2環境で終夜接着させた。培養培地を完全に除去して、細胞を37℃の湿潤5% CO2環境で、FBSを含まない培地100μL/ウェル中で終夜枯渇させた。次に、細胞を、湿潤5% CO2環境で、濃度2μMのEGFR結合FN3ドメインを含む予め加温した(37℃)枯渇培地100μL/ウェルによって37℃で1時間処置した。対照は、枯渇培地のみで処置した。最終濃度が50ng/mL EGFとなるように100ng/mL組み換え型ヒトEGF(R&D Systems、カタログ番号236−EG)及び1μM EGFR結合FN3ドメインを含む予め加温した(37℃)枯渇培地100μL/ウェルを添加して軽く混合し、37℃、5% CO2で15分間インキュベートすることにより、細胞を刺激した。一組の対照ウェルは、陰性対照として刺激しないままであった。培地を完全に除去して、細胞を、Complete溶解緩衝液(Meso Scale Discovery)100μL/ウェルによって、製造元の指示に従って、室温で振とうさせながら10分間溶解した。1173番目のチロシンでリン酸化されたEGFRを測定するように構成されたアッセイプレート(Meso Scale Discovery)を、製造元の指示に従って提供されたブロッキング溶液によって室温で1.5〜2時間ブロックした。プレートを、1X Tris洗浄緩衝液(Meso Scale Discovery)200μL/ウェルによって4回洗浄した。細胞溶解物のアリコート(30μL/ウェル)をアッセイプレートに移し、これをプレート密封フィルム(VWR)で覆い、振とうさせながら室温で1時間インキュベートした。アッセイプレートをTris洗浄緩衝液200μL/ウェルで4回洗浄した後、氷冷検出抗体溶液(Meso Scale Discovery)25μLを、気泡を入れないように注意して各ウェルに添加した。プレートを振とうさせながら室温で1時間インキュベートした後、Tris洗浄緩衝液200μL/ウェルによって4回洗浄した。読み取り緩衝液(Meso Scale Discovery)150μL/ウェルを添加して、製造元がインストールしたアッセイ特異的デフォルト設定を用いてSECTOR(登録商標)Imager 6000機器(Meso Scale Discovery)で読み取ることにより、シグナルを検出した。EGF刺激陽性対照シグナルの%阻害を、各EGFR結合FN3ドメインに関して計算した。
大規模発現、精製、及びエンドトキシンの除去
表4に示された9個のFN3ドメインを、詳細な特徴づけのためにより多くの材料を提供するよう規模を拡大した。各EGFR結合FN3ドメイン変種を含む終夜培養物を用いて、終夜培養物を1/80希釈して100μg/mLアンピシリンを添加したTerrificブロス培地0.8Lを新しい培地に接種して、振とうさせながら37℃でインキュベートした。600nmでの吸光度が約1.2〜1.5に達すると、IPTGを最終濃度1mMとなるように添加することによって培養物を誘導し、温度を30℃に低下した。4時間後、遠心沈降によって細胞を回収して、細胞沈降物を必要となるまで−80℃で保存した。
組み換え型EGFR細胞外ドメインに対する選択されたEGFR結合FN3ドメインの結合親和性を、Proteon Instrument(BioRad)を用いて表面プラズモン共鳴法によって更に特徴を調べた。アッセイの設定(チップの調製、EGFR−Fc捕捉)は、オフレート分析に関して先に記述したものと類似であった。選択されたEGFR結合FN3ドメインを、1μM濃度で水平方向に3倍連続希釈で試験した。緩衝液試料もまた、ベースラインでの安定性をモニターするために注入した。各EGFR結合FN3ドメインの全ての濃度に関する解離相を、流速100μL/分で30分間(オフレートスクリーニングから約10-2s-1のkoffを有するドメインに関して)、又は1時間(約10-3s-1又はそれより遅いkoffを有するドメインに関して)モニターした。2組の参照データを、反応データから差し引いた:1)EGFR結合FN3ドメインと固定したIgG表面との非特異的相互作用を修正するためのスポット間シグナル;2)捕捉されたEGFR−Fc表面の経時的な解離によるベースラインの揺れを補正するための緩衝液チャネルシグナル。各FN3ドメインに関してすべての濃度での処理された結合データを1:1の単純なラングミュア結合モデルに全体的にフィットさせて、速度論(kon、koff)及び親和性(KD)定数の推定値を引き出した。表5は構築物のそれぞれに関する速度論定数を示し、親和性は200pMから9.6nMまで変化する。
A431細胞を不透明な黒色96ウェルプレートに5,000個/ウェルで播種して、37℃の湿潤5% CO2環境で終夜接着させた。精製EGFR結合FN3ドメイン(1.5nM〜30μM)を、同じプレートを3枚ずつ作製して、細胞(50μL)に室温で1時間添加した。上清を除去して、細胞を、150μL/ウェルのFACS染色緩衝液によって3回洗浄した。細胞を、FACS染色緩衝液中で1:100に希釈した抗ペンタHis−Alexa 488抗体コンジュゲート(Qiagen)50μL/ウェルと共に室温で20分間インキュベートした。細胞を150μL/ウェルのFACS染色緩衝液によって3回洗浄した後、ウェルにFACS染色緩衝液100μLを満たし、Acumen eX3リーダーを用いて488nmで蛍光を読み取った。データを、FN3ドメインモル濃度の対数に対して未加工の蛍光シグナルとしてプロットして、EC50値を計算するためにGraphPad Prism 4(GraphPad Software)を用いて、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲線にフィットさせた。表5は、構築物のそれぞれに関して、2.2〜20μMを超える範囲のEC50を報告する。
A431細胞を不透明な黒色96ウェルプレートに5,000個/ウェルで播種して、37℃の湿潤5% CO2環境で終夜接着させた。精製EGFR結合FN3ドメイン(1.5nM〜30μM)を、同じプレートを3枚ずつ作製して、細胞(50μL/ウェル)に室温で1時間添加した。ビオチニル化EGF(Invitrogen、カタログ番号E−3477)を、最終濃度30ng/mLとなるように各ウェルに添加して、室温で10分間インキュベートした。細胞を、150μL/ウェルのFACS染色緩衝液によって3回洗浄した。細胞を、FACS染色緩衝液中で1:100に希釈したストレプトアビジン−フィコエリスリンコンジュゲート(Invitrogen)50μL/ウェルと共に室温で20分間インキュベートした。細胞を150μL/ウェルのFACS染色緩衝液によって3回洗浄した後、ウェルにFACS染色緩衝液100μLを満たし、Acumen eX3リーダーを用いて600nmで蛍光を読み取った。データを、FN3ドメインモル濃度の対数に対して未加工の蛍光シグナルとしてプロットして、IC50値を計算するためにGraphPad Prism 4(GraphPad Software)を用いて、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲線にフィットさせた。表5は、1.8〜121nMの範囲のIC50値を報告する。
EGF刺激EGFRリン酸化を有意に阻害した選択されたFN3ドメインを、阻害に関するIC50値を測定することによってより完全に評価した。EGF刺激EGFRリン酸化の阻害を、「EGF刺激EGFRリン酸化の阻害」において先に記述したように、FN3ドメイン濃度を変化させて(0.5nM〜10μM)評価した。データを、FN3ドメインモル濃度の対数に対してエレクトロケミルミネッセンスシグナルとしてプロットして、GraphPad Prism 4(GraphPad Software)を用いて、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲線にデータをフィットさせることによって、IC50値を決定した。表5は、18nM〜>2.5μMの範囲のIC50値を報告する。
EGFR依存的細胞増殖の阻害を、EGFR結合FN3ドメインに対する暴露後のEGFR過剰発現ヒト腫瘍細胞株NCI−H292及びNCI−H322(American Type Culture Collection、それぞれカタログ番号CRL−1848及びCRL−5806)の生存率を測定することによって評価した。細胞を、不透明な白色96ウェル組織培養処置プレート(Nunc)において、Glutamax(商標)、並びに10%熱不活化ウシ胎児血清(Gibco)及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco)を添加した10mM HEPESを含むRPMI培地(Gibco)100μL/ウェル中で500個/ウェル(NCI−H292)又は1,000個/ウェル(NCI−H322)で播種し、37℃の湿潤5% CO2環境で終夜接着させた。細胞を、EGFR結合FN3ドメインの濃度範囲を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を5μL/ウェル添加することによって処置した。対照を5μL/ウェルのPBSのみ、又は25mMエチレンジアミン四酢酸のPBS溶液によって処置した。細胞を、37℃、5% CO2で120時間インキュベートした。CellTiter−Glo(登録商標)試薬(Promega)75μL/ウェルを添加した後、プレートシェーカー上で2分間混合し、室温の暗所で更に10分間インキュベートすることによって生存細胞を検出した。プレートを、ルミネッセンスモードに設定したSpectraMax M5プレートリーダー(Molecular Devices)で読み取り、読み取り時間は、溶媒のみのブランクに対して0.5秒/ウェルであった。データをFN3ドメインモル濃度の対数に対するPBS処置細胞増殖の百分率としてプロットした。GraphPad Prism 4(GraphPad Software)を用いて、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲線の等式にデータをフィットさせることによって、IC50値を決定した。表5は、NCI−H292及びNCI−H322細胞をそれぞれ用いて、5.9nM〜1.15μN及び9.2nM〜3.1μM超の範囲のIC50値を示す。
EGFR結合FN3ドメインのサブセットを、各分子の立体構造の安定性を増加させるように、改変した。変異体L17A、N46V、及びE86I(米国特許出願公開第2011/0274623号に記述)をDNA合成によって、クローンP54AR4−83、P54CR4−31、及びP54AR4−37に組み入れた。新規変異体P54AR4−83v2、P54CR431−v2、及びP54AR4−37v2を、上記のように発現させて精製した。PBS中での示差走査熱量測定を用いて、対応する親分子の安定性と比較するために、各変異体の安定性を評価した。表6は、各クローンが有意に安定化され、Tmの平均値は18.5℃増加することを示す。
FN3ドメインのシステイン変異体を、基礎となるTencon分子及びシステイン残基を有しないその変種から作製する。これらの変異は、低分子薬、蛍光タグ、ポリエチレングリコール、又は他の任意の数の化学実体を化学コンジュゲートするための部位として役立つように、独自のシステイン残基を、基礎となるTencon配列(配列番号1)又は他のFN3ドメインに組み入れるために、当技術分野で公知の標準的な分子生物学技術を用いて作製され得る。選択される変異部位は、特定の基準を満たさなければならない。例えば、遊離のシステインを含むように変異させたTencon配列は、(i)大腸菌において高度に発現され、(ii)高レベルの溶解度及び熱安定性を維持し、並びに(iii)コンジュゲーションの際に標的抗原に対する結合を維持しなければならない。Tencon足場は、わずか約90〜95個のアミノ酸であることから、化学コンジュゲーションのための理想的な位置を厳密に決定するために、1システイン変種を、足場のあらゆる位置で容易に構築することができる。
P54AR4−83v2の各個々のシステイン変種のアミノ酸配列を、大腸菌発現のための選択的コドンを用いてタンパク質をコードする核酸配列に逆転写して、合成遺伝子を作製した(DNA 2.0)。これらの遺伝子を、T5プロモーター配列によって駆動される発現のために、pJexpress401ベクター(DNA2.0)にクローニングし、大腸菌株BL21(Agilent)に形質転換した。P54AR4−83v2「システインスキャン」ライブラリは、96ウェルプレート上にアレイにしたグリセロールストックとして提供され、それぞれの発現及び精製は、実施例2に記述される同じ技法に従った。
P54AR4−83v2「システインスキャン」ライブラリに関して、コンジュゲーションを精製プロセスに組み入れた、澄明化した溶解物中のシステイン変種は、溶解物をウェルに添加して、100×gで5分間遠心沈降させることにより、His−trap HPプレート(カタログ番号28−4008−29、GE Healthcare)を用いて96ウェルフォーマットでNi−NTA樹脂に結合させた。樹脂を緩衝液Aで3回洗浄した後、N−エチルマレイミド(NEM)を1.5mM溶液の500μLとして添加した。ロティサリーシェーカーで室温で1時インキュベートした後、過剰量のNEMを遠心沈降によって除去して、緩衝液Aによって3回洗浄した。コンジュゲートされたシステイン変種を150μLの緩衝液Bによって2回溶出し、Ultracel−10メンブレン(カタログ番号MAUF1010、Millipore)を有するMultiScreen Filter Plates又は96−ウェルPD MultiTrapプレート(カタログ番号28−9180−06、GE Healthcare)によってPBSに交換した。コンジュゲートを質量分析によって特徴を調べた(表7)。発現が不良であるか(5mL培養物から得られたタンパク質が0.1mg未満、又は質量分析によって検出してタンパク質が得られない)又はNEMに対するコンジュゲーションが不良である(質量分析によって測定してコンジュゲーションが80%未満)システイン変種を、更なる分析から除外した。これによって、発現が不良であるためにL1C、W21C、Q36C、E37C、A44C、D57C、L61C、Y67C、及びF92Cが除外され、コンジュゲーション効率が低いためにA17C、L19C、I33C、Y35C、Y56C、L58C、T65C、V69C、I71C、及びT94Cが除外された。
P54AR4−83v2の各NEMコンジュゲートシステイン変種のサイズ排除クロマトグラフィーを、実施例2に記述されるように行った。表8は、結果を要約する。Abs280シグナルを積分して、単量体領域のピーク(5.5〜6分)を、オリゴマー領域のピーク(4〜5.3分)と比較することにより、各タンパク質の%単量体を決定した。
P54AR4−83v2のNEMコンジュゲートシステイン変種のEGFRに対する相対的結合親和性を、実施例2に記述されるように評価した。表9は、P54AR4−83v2親タンパク質と比較した各システイン変種のEGFR結合親和性の比率を示すデータを要約する。ELISAアッセイによって決定した場合に、EGFRに対する結合が減少した(10nMタンパク質によって処置したとき、P54AR4−83v2親に関して観察されたシグナルの65%未満)システインコンジュゲートを更なる分析から除外した:P2C、A3C、P4C、K5C、L7C、D23C、W25C、F27C、Y28C、F31C、S55C、G73C、H75C、V77C、Y78C、T81C、N82C、M83C、及びG85C。
システイン−NEMコンジュゲートの熱安定性を、示差走査熱量測定(DSC)によって評価した。試験したコンジュゲートは、高レベルでコンジュゲートを効率よく発現し、EGFR結合を保持することが決定されたコンジュゲートであった。加えて、BC及びFGループ内のシステイン変種は除外した。安定性データは、VP−DSC機器(MicroCal)で毎分1℃の走査速度で、変種のアリコート400μLを25℃から100℃まで加熱することによって得られた。その試料に関して、熱によるフォールディング/アンフォールディングの可逆性を評価するために、第2の同一の走査を行った。融解温度を計算するために、データを2状態アンフォールディングモデルにフィットさせた(表10)。融解温度が低下した(63℃以下又はP54AR4−83v2の親より8℃超下)、又は非可逆的アンフォールディングを示したシステイン変種を更なる分析から除外した:V9C、V12C、T13C、R18C、E29C、E39C、G42C、V49C、P50C、G51C、P63C。
P54AR4−83v2システイン変種を、NEMコンジュゲーションに関して記述される方法論を用いて、酵素切断可能なVal−Citリンカー又は非切断型PEG4リンカー(VC−MMAF7;図2を参照されたい)を介して、細胞障害性チューブリン阻害剤であるモノメチルアウリスタチンF(MMAF)にコンジュゲートした。先の段階で除外後に残っている32個の変種を、P54AR4−83v2親(配列番号217及び255)、及び陰性対照としてのTencon(配列番号265)と共にコンジュゲートした。
試験した96個の位置の中で、システイン変種28個が、大腸菌における高い発現レベルの保持、チオール−マレイミド化学を介した効率的なコンジュゲーション、標的抗原EGFRに対する結合の保持、熱安定性の保持、及び可逆的アンフォールディング特性、並びにシステイン変種を細胞障害剤にコンジュゲートしたときに高いEGFR発現を有する細胞の障害性の保持に関する基準を満たすことが判明した。これらの位置は、N6C(配列番号210及び248)、V8C(配列番号189及び227)、S10C(配列番号190及び228)、E11C(配列番号191及び229)、E14C(配列番号192及び230)、D15C(配列番号193及び231)、S16C(配列番号194及び232)、S20C(配列番号195及び233)、S30C(配列番号196及び234)、Q34C(配列番号197及び235)、S38C(配列番号198及び236)、K40C(配列番号199及び237)、V41C(配列番号200及び238)、I45C(配列番号201及び239)、L47C(配列番号202及び240)、T48C(配列番号203及び241)、E53C(配列番号204及び242)、R54C(配列番号205及び243)、T59C(配列番号206及び244)、G60C(配列番号207及び245)、K62C(配列番号208及び246)、G64C(配列番号209及び247)、T68C(配列番号210及び248)、S70C(配列番号211及び249)、L88C(配列番号212及び250)、S89C(配列番号213及び251)、A90C(配列番号214及び252)、I91C(配列番号215及び253)、並びにT93C(配列番号216及び254)である。83v2タンパク質の構造におけるこれらの28の位置の場所を図3に示す。
ヒトc−Metに関するパニング
c−Metに特異的に結合することができるFN3ドメインを同定するために、TCL14ライブラリを、ビオチニル化ヒトc−Met細胞外ドメイン(bt−c−Met)に対してスクリーニングした。選択するために、TCL14ライブラリ3μgを、大腸菌S30 Linear Extract(Promega,Madison,WI)中でインビトロで転写及び翻訳し、発現させたライブラリをCisブロック(2% BSA(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)、100μg/mlニシン***DNA(Promega)、1 mg/mLヘパリン(Sigma−Aldrich))によってブロックした。選択するために、bt−c−Metを400nM(ラウンド1)、200nM(ラウンド2及び3)、及び100nM(ラウンド4及び5)の濃度で添加した。結合したライブラリメンバーを、ニュートラアビジン磁気ビーズ(Thermo Fisher,Rockford,IL)(ラウンド1、3及び5)、又はストレプトアビジン磁気ビーズ(Promega)(ラウンド2及び4)を用いて回収し、ビーズを500μLのPBS−Tで5〜14回洗浄した後、500μLのPBSで2回洗浄することによって、非結合ライブラリメンバーを除去した。
大腸菌溶解物に存在するFN3ドメインを、生化学フォーマットで精製c−Met細胞外ドメインに対するHGF結合の阻害能に関してスクリーニングした。組み換え型ヒトc−Met Fcキメラ(PBS中で0.5μg/mL、100μL/ウェル)を96ウェル白色Maxisorpプレート(Nunc)にコーティングして、4℃で終夜インキュベートした。プレートを、Biotekプレート洗浄器において、0.05% Tween 20(TBS−T,Sigma−Aldrich)を含むTris緩衝生理食塩水300μL/ウェルによって2回洗浄した。アッセイプレートを、StartingBlock T20(200μL/ウェル、Thermo Fisher Scientific,Rockland,IL)によって振とうさせながら室温(RT)で1時間ブロックして、TBS−T 300μLによって2回洗浄した。FN3ドメイン溶解物を、Hamilton STARplusロボットシステムを用いて、StartingBlock T20(1:10〜1:100,000)中で希釈した。溶解物(50μL/ウェル)を、アッセイプレートにおいてRTで振とうさせながら1時間インキュベートした。プレートを洗浄せずに、bt−HGF(StartingBlock T20中で1μg/mL、50μL/ウェル、ビオチニル化)を、振とうさせながらRTで30分間プレートに添加した。Tencon27溶解物を含む対照ウェルに、StartingBlock T20又は希釈したbt−HGFのいずれかを添加した。プレートを300μL/ウェルのTBS−Tによって4回洗浄して、100μL/ウェルのストレプトアビジン−HRP(TBS−T中で1:2000、Jackson Immunoresearch、West Grove,PA)と共に、RTで振とうさせながら30〜40分間インキュベートした。再度、プレートをTBS−Tで4回洗浄した。シグナルを発生させるために、製造元の指示に従って調製したPODケミルミネッセンス基質(50μL/ウェル、Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)をプレートに添加して、およそ3分以内に、SoftMax Proを用いてMolecular Devices M5において発光を読み取った。%阻害は、以下の計算式を用いて決定した:100−((RLUsample−RLU平均値No bt-HGF control)/(RLU平均値bt-HGF control−RLU平均値No bt-HGF control)*100)50%又はそれより高い%阻害の値は、ヒットであると考えられた。
HisタグFN3ドメインを His MultiTrap(商標)HPプレート(GE Healthcare)によって澄明化大腸菌溶解物から精製して、20mMリン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、及び250mMイミダゾールを含むpH7.4の緩衝液で溶出した。精製試料を、PD MultiTrap(商標)G−25プレート(GE Healthcare)を用いる分析のために、pH7.4のPBSに交換した。
選択されたFN3ドメインを、HGF競合アッセイにおいて更に特徴を調べた。精製FN3ドメインの用量反応曲線を、上記のアッセイを利用して作製した(開始濃度5μM)。%阻害の値を計算した。データを、FN3ドメインモル濃度の対数に対する%阻害としてプロットして、GraphPad Prism 4を用いて、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲線にデータをフィットさせることによって、IC50値を決定した。
FN3ドメインを、実施例2において先に記述したように発現及び精製した。サイズ排除クロマトグラフィー及び速度論分析をそれぞれ、実施例1及び2において先に記述したように行った。表12は、C鎖、CDループ、F鎖、及びFGループの配列、並びに各ドメインに関する完全なアミノ酸配列の配列番号を示す。
CD鎖残基は、表記の配列番号の38〜43番目の残基に対応する。
Fループ残基は、表記の配列番号の65〜74番目の残基に対応する。
FG鎖残基は、表記の配列番号の75〜81番目の残基に対応する。
NCI−H441細胞(カタログ番号HTB−174,American Type Culture Collection,Manassas,VA)を、20,000個/ウェルでポリ−D−リジンコーティングした黒色透明底の96ウェルプレート(BD Biosciences,San Jose,CA)に播種して、37℃、5% CO2で終夜接着させた。精製FN3ドメイン(50μL/ウェル;0〜1000nM)を、同じプレートを2枚ずつ作製して、4℃で1時間細胞に添加した。上清を除去して、細胞を、FACS染色緩衝液(150μL/ウェル、BD Biosciences,カタログ番号554657)によって3回洗浄した。細胞を、ビオチニル化抗HIS抗体(FACS染色緩衝液中で1:160倍希釈、50μL/ウェル、R&D Systems、カタログ番号BAM050)と共に4℃で30分間インキュベートした。細胞をFACS染色緩衝液(150μL/ウェル)で3回洗浄後、ウェルを抗マウスIgG1−Alexa488コンジュゲート抗体(FACS染色緩衝液中で1:80倍希釈、50μL/ウェル、Life Technologies,カタログ番号A21121)と共に4℃で30分間インキュベートした。細胞をFACS染色緩衝液(150μL/ウェル)によって3回洗浄し、FACS染色緩衝液(50μL/ウェル)中で放置した。総蛍光を、Acumen eX3リーダーを用いて決定した。データを、FN3ドメインモル濃度の対数に対して未加工の蛍光シグナルとしてプロットして、GraphPad Prism 4(GraphPad Software)を用いて、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲線にフィットさせて、EC50値を計算した。FN3ドメインは、結合活性の範囲を示すことが見いだされ、表13に示されるようにEC50値は、1.4〜22.0であった。
精製FN3ドメインを、Meso Scale Discovery(Gaithersburg,MD)のc−Met phospho(Tyr1349)キットを用いて、NCI−H441におけるc−MetのHGF刺激リン酸化の阻害能に関して試験した。細胞を、透明な96ウェル組織培養処置プレートにおいて、10%ウシ胎児血清(FBS,Life Technologies)を添加したRPMI培地100μL/ウェル中で20,000個/ウェルで播種し、37℃、5% CO2で終夜接着させた。培養培地を完全に除去して、細胞を37℃、5% CO2で、無血清RPMI培地(100μL/ウェル)中で終夜枯渇させた。次に、細胞に、濃度20μM以下のFN3ドメインを含む無血清RPMI培地(100μL/ウェル)を、37℃、5% CO2で添加した。対照は、培地のみで処置した。細胞を、100ng/mL組み換え型ヒトHGF(100μL/ウェル、R&D Systems、カタログ番号294−HGN)によって刺激して、37℃、5% CO2で15分間インキュベートした。一組の対照ウェルは、陰性対照として刺激しないままであった。培地を完全に除去して、細胞を、製造元の指示に従って、RTで振とうさせながらComplete溶解緩衝液(50μL/ウェル、Meso Scale Discovery)によって10分間溶解した。リン酸化c−Metを測定するように構成されたアッセイプレートを、製造元の指示に従って、提供されたブロッキング溶液によって室温で1時間ブロックした。次に、プレートを、Tris洗浄緩衝液(200μL/ウェル、Meso Scale Discovery)によって3回洗浄した。細胞溶解物(30μL/ウェル)をアッセイプレートに移して、振とうさせながらRTで1時間インキュベートした。次に、アッセイプレートをTris洗浄緩衝液によって4回洗浄した後、氷冷の検出抗体溶液(25μL/ウェル、Meso Scale Discovery)を、振とうさせながらRTで各ウェルに1時間添加した。プレートをTris洗浄緩衝液によって4回すすいだ。150読み取り緩衝液(150μL/ウェル、Meso Scale Discovery)を添加して、製造元のインストールしたアッセイ特異的デフォルト設定を用いて、SECTOR(登録商標)Imager 6000機器(Meso Scale Discovery)において読み取ることにより、シグナルを検出した。データを、FN3ドメインモル濃度の対数に対するエレクトロケミルミネッセンスシグナルとしてプロットして、GraphPad Prism 4を用いて、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲線にデータをフィットさせることによって、IC50値を決定した。FN3ドメインは、表13に示されるように、4.6〜1415nMの範囲のIC50値でリン酸化c−Metを阻害することが見いだされた。
c−Met依存的細胞増殖の阻害を、c−Met結合FN3ドメインに対する暴露後のU87−MG細胞(American Type Culture Collection、カタログ番号HTB−14)の生存率を測定することによって評価した。細胞を、不透明な白色96ウェル組織培養処置プレート(Nunc)において10% FBSを添加したRPMI培地100μL/ウェル中で8000個/ウェルで播種し、37℃、5% CO2で終夜接着させた。播種後24時間で、培地を吸引して、細胞に無血清RPMI培地を添加した。血清枯渇の24時間後、c−Met結合FN3ドメインを含む無血清培地(30μL/ウェル)を添加することによって、細胞を処置した。細胞を、37℃、5% CO2で72時間インキュベートした。生存細胞を、CellTiter−Glo(登録商標)試薬(Promega)100μL/ウェルを添加した後、プレートシェーカーにおいて10分間混合することによって検出した。プレートを、ルミネッセンスモードに設定したSpectraMax M5プレートリーダー(Molecular Devices)で読み取り、読み取り時間は、0.5秒/ウェルであった。データをFN3ドメインモル濃度の対数に対する未加工発光単位(RLU)としてプロットした。GraphPad Prism 4を用いて、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲線の等式にデータをフィットさせることによって、IC50値を決定した。表13は、1nM〜1000nM超の範囲のIC50値を報告する。
二重特異性EGFR/c−Met分子の作製
実施例1〜6に記述したEGFRとc−Met結合FN3ドメインの多数の組み合わせを合わせて、EGFRとc−Metの両方に結合することができる二重特異性分子を作製した。更に、配列番号107〜110に示されるアミノ酸配列を有するEGFR結合FN3ドメイン、及び配列番号111〜114に示されるアミノ酸配列を有するc−Met結合FN3ドメインを作製して、二重特異性分子に結合した。以下のフォーマットが維持されるように配列番号50〜72、及び106(表15)に記載のアミノ酸配列をコードするように、合成遺伝子を作製した:EGFR結合FN3ドメインの後にペプチドリンカー、その後にc−Met結合FN3ドメイン。精製を助けるために、C−末端にポリヒスチジンタグを組み入れた。表15に記述される分子に加えて、2つのFN3ドメイン間のリンカーを、表16に記載の内容に従って、長さ、配列組成、及び構造に従って変化させた。そのようなFN3ドメインを連結させるために、多数の他のリンカーを用いることができると予想される。二重特異性EGFR/c−Met分子を発現させて、単特異性EGFR又はc−MetFN3ドメインに関して記述したように、IMAC及びゲル濾過クロマトグラフィー工程を用いて、大腸菌から精製した。
NCI−H292細胞を、96ウェルプレートにおいて、10% FBSを含むRPMI培地中で播種した。24時間後、培地を無血清RPMIに交換した。血清枯渇の24時間後、細胞を多様な濃度のFN3ドメインによって処置した:高親和性単特異性EGFR FN3ドメイン(P54AR4−83v2)、弱親和性単特異性c−Met FN3ドメイン(P114AR5P74−A5)、2つの単特異性EGFR及びc−Met FN3ドメインの混合物、又は高親和性EGFR FN3ドメインに連結させた低親和性c−Met FN3ドメインからなる二重特異性EGFR/c−Met分子(ECB1)。細胞を、単特異性又は二重特異性分子によって1時間処置した後、EGF、HGF、又はEGFとHGFの組み合わせによって37℃、5% CO2で15分間刺激した。細胞をMSD溶解緩衝液によって溶解して、適当なMSDアッセイプレートを用いて、上記のように製造元の指示に従って、細胞のシグナリングを評価した。
単特異性及び二重特異性FN3ドメイン分子のインビボでの効能を決定するために、腫瘍細胞を、ヒトHGFを分泌するように改変した(マウスHGFはヒトHGFに結合しない)。ヒトHGFを、レンチウイルス感染を用いてNCI−H292細胞において安定に発現させた(ヒトHGFを発現するレンチウイルスDNAベクター(受託番号X16322)及びGenecopoeiaからのレンチウイルスパッケージングキット)。感染後、HGF発現細胞を4μg/mLピューロマイシン(Invitrogen)によって選択した。ヒトHGFタンパク質を、Meso Scale Discoveryのアッセイプレートを用いてプールした細胞の条件培地で検出した。
SCID Beigeマウスに、ヒトHGFを発現するNCI−H292細胞(200μLのCultrex(Trevigen)中で2.0×106個)を各動物の背側脇腹に皮下接種した。植え込みの1週間後、マウスを同等の腫瘍体積(平均腫瘍体積=77.9±1.7mm3)を有する群に分けた。マウスに、二重特異性分子を週に3回投与して、腫瘍の体積を週に2回記録した。腫瘍の増殖阻害(TGI)を、c−Met及びEGFRに対して様々な親和性を有する4つの異なる二重特異性分子について観察した。図10は、c−Met結合FN3ドメインが中等度親和性を有するとき、中等度親和性EGFR結合FN3ドメインと比較して高親和性EGFR結合FN3ドメインを含む分子で処置したマウスでは腫瘍増殖の遅れが観察されたことから、c−Met及びEGFRの両方を阻害する恩典を示す(△対▲、P54AR4−83v2−P114AR5P74−A5をP53A1R5−17−P114AR5P74−A5と比較)。加えて、データは、高又は中等度親和性EGFR結合FN3ドメインのいずれかを含む二重特異性分子として高親和性c−Met結合FN3ドメインを有する重要性を示しているが、高親和性c−Met結合FN3ドメインは、最も高い効能を示した(灰色の点線と黒色の実線、P54AR4−83v2−P114AR7P94−A3とP53A1R5−17v2−P114AR7P94−A3)。
二重特異性EGFR/c−Met分子(ECB38)及び低分子阻害剤クリゾチニブ(c−Met阻害剤)及びエルロチニブ(EGFR阻害剤)、セツキシマブ(抗EGFR抗体)のそれぞれ単剤としての、並びにクリゾチニブとエルロチニブの併用のインビボ治療効能を、SCID/BeigeマウスにおけるH292−HGFヒト肺がん皮下異種移植片モデルの処置において評価した(図11)。
QD:1日1回。Q4d:4日ごとに1回クリゾチニブとエルロチニブの併用の間隔は0.5時間であった。投与体積は、体重に基づいて調節した(10l/g)。a:群分け後の14日目には投与を行わなかった。
タンパク質の腎臓での濾過を低減させ、このようにタンパク質の血清半減期を増加させるために様々な方法が記述されており、これには、ポリエチレングリコール(PEG)又は他のポリマーによる修飾、アルブミンとの結合、アルブミン又は他の血清タンパク質に結合するタンパク質ドメインとの融合、アルブミンとの遺伝的融合、IgG fcドメインとの融合、及び長い非構造アミノ酸配列との融合が挙げられる。
選択したEGFR/c−Met分子を、EGFR及びc−Metの両方に対するその親和性、EGFR及びc−Met自己リン酸化のその阻害能、並びにHGF細胞の増殖に及ぼすその効果に関して特徴を調べた。組み換え型EGFR及び/又はc−Met細胞外ドメインに対する二重特異性EGFR/c−Met分子の結合親和性を、実施例3に記述されるプロトコルに従ってProteon Instrument(BioRad)を用いる表面プラズモン共鳴法によって調べた。特徴づけの結果を表21に示す。
二重特異性EGFR/c−Met分子の作製
P54AR4−83v2変異体(実施例5)のシステインスキャニングから得られたデータに基づき、二重特異性EGFR/c−Met分子において、P54AR4−83v2(配列番号27)、cMet結合体P114AR7P95−C5v2(配列番号114)、及び半減期延長のためのアルブミン結合ドメインからなるECB147(配列番号218及び256)と表示されるシステイン変異体も設計した。これらの3つのドメインは、(Ala−Pro)5リンカー(配列番号81)によって接続される。1個、2個、又は4個のシステインを有する変種を、FN3ドメインの1つのC−末端、リンカー領域、又はLys−62位置での置換によって設計した(配列番号219〜225及び257〜263)。別の二重特異性変種ECB82cys(配列番号226及び264)は、3つ全てのドメインがAPリンカーによって接続されたP54AR4−83v2(配列番号27)、P114AR7P94−A3v22(配列番号111)、及びアルブミン結合ドメインの変種、並びに1つのC−末端システインからなる。非標的化Tencon足場構造(配列番号265)の追加のシステイン変種もまた、対照コンジュゲートの構築のために用いた。変種は全て、先の実施例に記述されるように構築して、発現させ、精製した。純度はSDS−PAGE分析によって評価した。Superdex 75 5/150カラム(GE Healthcare)を用いる分析的サイズ排除クロマトグラフィーは、FN3ドメイン調製物が凝集物を含まず、単量体タンパク質と一貫する時間で溶出することを示している。質量分析により、理論的質量と一致した質量が決定された(表22)。
精製二重特異性システイン変種をマレイミド含有分子に化学的にコンジュゲートするために、タンパク質を最初にTCEPで還元して遊離のチオールを生成した。各二重特異性システイン変種1〜2mgを、中性pHで過剰量のTCEP(Sigma、カタログ番号646547)と混合して、RTで30〜60分間インキュベートした。3倍量の飽和硫酸アンモニウム溶液(4.02M)を添加して、システイン変種を沈殿させることによって、TCEPを除去した16000〜20000×gで4℃で20分間遠心沈降して上清を除去後、タンパク質沈降物をPBS又はリン酸ナトリウム緩衝液に溶解して、マレイミド含有分子の5〜10倍過剰量と直ちに混合した。反応を室温で30〜60分間インキュベートした後、過剰量のマレイミドを除去するために、システイン又はβ−メルカプトエタノールなどの過剰量の遊離のチオールによって停止させた。非結合マレイミドを、Zeba脱塩カラム(Thermo、カタログ番号89890)で、Tosoh G3000SWxlカラム(#P4619−14N;7.8mm×30cm;5μm)を備えた分取用SECによって、又はシステイン変種をNi−NTA樹脂に結合させて、洗浄して、本質的に上記のように溶出させることによって除去した。コンジュゲートの特徴を、SDS−PAGE及び質量分析によって調べた。この一般法を用いて、二重特異性システイン変種を、蛍光マレイミド(Thermo、カタログ番号62245)、PEG24−マレイミド(Quanta Biodesign、カタログ番号10319)、及びマレイミド−細胞毒素分子に、様々なリンカー(図2の構造を参照)によってコンジュゲートした。
精製二重特異性PEG24−マレイミドコンジュゲートを、ヒト腫瘍細胞株NCI−H292(American Type Culture Collection、カタログ番号CRL−1848)において、Meso Scale Discovery(Gaithersburg,MD)のEGFR phospho(Tyr1173)キットを用いて、実施例3に記述されるように、EGFRのEGF刺激リン酸化の阻害能に関して試験した。コンジュゲートを、ECB147とはアミノ酸2個が異なる非修飾ECB38(配列番号109)と比較した。コンジュゲート及びECB38は、表23に示されるように、類似のIC50値でEGFRを阻害し、設計された部位での修飾が標的の結合に有意に影響を及ぼさないことを証明した。
精製二重特異性PEG24−マレイミドコンジュゲートをまた、Meso Scale Discovery(Gaithersburg,MD)のc−Met phosphor(Tyr1349)キットを用いて、NCI−H292細胞におけるc−MetのHGF刺激リン酸化の阻害能に関して、実施例7に記述されるように試験した。コンジュゲート及びECB38は、表24に示されるように、類似のIC50でcMetを阻害し、これらの部位での修飾が標的の結合に有意に影響を及ぼさないことを証明した。
ECB147システイン変種、83v2−cys、又はアウリスタチンファミリーの細胞障害性チューブリン阻害剤に連結されたTencon−cysからなるコンジュゲートを、がん細胞における標的依存的細胞障害性に関して試験した。阻害剤を、非切断型PEG4リンカー、又は酵素切断型バリン−シトルリン又はバリン−リジンリンカーを介してシステイン含有タンパク質に連結させた。殺細胞を、実施例4に記述される技法を用いて、タンパク質−細胞毒素コンジュゲートに暴露後のEGFR過剰発現ヒト腫瘍細胞株H1573及びA431並びにEGFR陰性腫瘍細胞株MDA−MB−435の生存率を測定することによって評価した。表25は、66、72、又は90時間の時点で、CellTiterGlo又はIncuCyteオブジェクトカウントデータの分析から得られたIC50を報告する。タンパク質−薬物コンジュゲートは、標的抗原EGFRを発現する細胞の強力な殺細胞を示した。多数の薬物のコンジュゲートもまた、調べた多くの細胞株において細胞障害性の増加を示した。
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361 cvcdegfagv dcsekrcpad chnrgrcvdg rcecddgftg adcgelkcpn gcsghgrcvn
421 gqcvcdegyt gedcsqlrcp ndchsrgrcv egkcvceqgf kgydcsdmsc pndchqhgrc
481 vngmcvcddg ytgedcrdrq cprdcsnrgl cvdgqcvced gftgpdcael scpndchgqg
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601 lgqcvsgrci cnegysgedc sevsppkdlv vtevteetvn lawdnemrvt eylvvytpth
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721 ksiketsvev ewdpldiafe tweiifrnmn kedegeitks lrrpetsyrq tglapgqeye
781 islhivknnt rgpglkrvtt trldapsqie vkdvtdttal itwfkplaei dgieltygik
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901 rvsqtdnsit lewrngkaai dsyrikyapi sggdhaevdv pksqqattkt tltglrpgte
961 ygigvsavke dkesnpatin aateldtpkd lqvsetaets ltllwktpla kfdryrlnys
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PRT
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PRT
人工
EGFR結合FN3ドメインのFGループ
HNVYKDTNX9RGL;
式中X9は、M又はIである
>配列番号180
PRT
人工
EGFR結合FN3ドメインのFGループ
LGSYVFEHDVML(配列番号180),
>配列番号181
PRT
人工
EGFR結合FN3ドメインのBCループ
X1X2X3X4X5X6X7X8(配列番号181);式中、
X1はA、T、G、又はDであり、
X2はA、D、Y、又はWであり、
X3はP、D、又はNであり、
X4はLであるか、又は存在せず、
X5はD、H、R、G、Y、又はWであり、
X6はG、D、又はAであり、
X7はA、F、G、H、又はDであり、及び
X8はY、F、又はLである。
>配列番号182
PRT
人工
EGFR結合FN3ドメイン
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNX9RGLPLSAEFTT(配列番号182),
X1はA、T、G、又はDであり、
X2はA、D、Y、又はWであり、
X3はP、D、又はNであり、
X4はLであるか、又は存在せず、
X5はD、H、R、G、Y、又はWであり、
X6はG、D、又はAであり、
X7はA、F、G、H、又はDであり、
X8はY、F、又はLであり、及び
X9はM又はIである。
>配列番号183
PRT
人工
EGFR結合FN3ドメイン
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVLGSYVFEHDVMLPLSAEFTT(配列番号183)の配列を更に含み、
式中、
X1はA、T、G、又はDであり、
X2はA、D、Y、又はWであり、
X3はP、D、又はNであり、
X4はLであるか、又は存在せず、
X5はD、H、R、G、Y、又はWであり、
X6はG、D、又はAであり、
X7はA、F、G、H、又はDであり、及び
X8はY、F、又はLである。
>配列番号184
PRT
人工
C−met結合FN3ドメインC鎖及びCDループ配列
DSFX10IRYX11EX12X13X14X15GX16(配列番号184)、式中
X10はW、F、又はVであり、
X11はD、F、又はLであり、
X12はV、F、又はLであり、
X13はV、L、又はTであり、
X14はV、R、G、L、T、又はSであり、
X15はG、S、A、T、又はKであり、及び
X16は、E、又はDである。及び
>配列番号185
PRT
人工
c−Met結合FN3ドメインF鎖及びFGループ
TEYX17VX18IX19X20VKGGX21X22SX23(配列番号185)、式中
X17はY、W、I、V、G、又はAであり、
X18はN、T、Q、又はGであり、
X19はL、M、N、又はIであり、
X20は、G、又はSであり、
X21は、S、L、G、Y、T、R、H、又はKであり、
X22はI、V、又はLであり、及び
X23はV、T、H、I、P、Y、T、又はLである。
>配列番号186
PRT
人工
c−Met結合FN3ドメイン
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX10IRYX11EX12X13X14X15GX16AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX17VX18IX19X20VKGGX21X22SX23PLSAEFTT(配列番号186)を更に含み、
式中
X10はW、F、又はVであり、及び
X11はD、F、又はLであり、
X12はV、F、又はLであり、
X13はV、L、又はTであり、
X14はV、R、G、L、T、又はSであり、
X15はG、S、A、T、又はKであり、
X16は、E、又はDであり、
X17はY、W、I、V、G、又はAであり、
X18はN、T、Q、又はGであり、
X19はL、M、N、又はIであり、
X20は、G、又はSであり、
X21は、S、L、G、Y、T、R、H、又はKであり、
X22はI、V、又はLであり、及び
X23はV、T、H、I、P、Y、T、又はLである。
>配列番号187
PRT
人工
二重特異性EGFR/c−Met FN3ドメイン含有分子のEGFR FN3ドメイン
LPAPKNLVVSX24VTX25DSX26RLSWDDPX27AFYX28SFLIQYQX29SEKVGEAIX30LTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYX31VHNVYKDTNX32RGLPLSAX33FTT(配列番号187)であって、式中
X24は、E、N、又はRであり、
X25は、E、又はPであり、
X26は、L、又はAであり、
X27は、H、又はWであり、
X28は、E、又はDであり、
X29は、E、又はPであり、
X30は、N、又はVであり、
X31はG、又はYであり、
X32は、M、又はIであり、及び
X33は、E、又はIである
>配列番号188
二重特異性EGFR/c−Met FN3ドメイン含有分子のc−Met FN3ドメイン
LPAPKNLVVSX34VTX35DSX36RLSWTAPDAAFDSFWIRYFX37FX38X39X40GX41AIX42LTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNIX43X44VKGGX45ISPPLSAX46FTT(配列番号188)であって、式中、
X34は、E、N、又はRであり、
X35は、E、又はPであり、
X36は、L、又はAであり、
X37は、E、又はPであり、
X38は、V、又はLであり、
X39は、G、又はSであり、
X40は、S、又はKであり、
X41は、E、又はDであり、
X42は、N、又はVであり、
X43は、L、又はMであり、
X44は、G、又はSであり、
X45は、S、又はKであり、及び
X46は、E、又はIである。
Claims (34)
- 配列番号1に基づくFN3ドメインの6、8、10、11、14、15、16、20、30、34、38、40、41、45、47、48、53、54、59、60、62、64、70、88、89、90、91、及び93番目の残基からなる群より選択される位置で少なくとも1つのシステイン置換を含む、単離されたシステイン改変フィブロネクチンIII型(FN3)ドメイン。
- システイン置換が、配列番号111〜114又は122〜137の6、8、10、11、14、15、16、20、30、34、38、40、41、45、47、48、53、54、59、60、62、64、70、88、89、90、91、及び93番目の残基からなる群より選択される位置にある、請求項1に記載のシステイン改変フィブロネクチンIII型(FN3)ドメイン。
- 配列番号27のアミノ酸配列から少なくとも1つのシステイン置換を有する配列番号27のアミノ酸配列を含む単離システイン改変フィブロネクチンIII型(FN3)ドメインであって、上皮成長因子受容体(EGFR)に特異的に結合して、EGFRに対する上皮成長因子(EGF)の結合を遮断する、単離システイン改変FN3ドメイン。
- 配列番号114のアミノ酸配列から少なくとも1つのシステイン置換を有する配列番号114のアミノ酸配列を含む単離システイン改変フィブロネクチンIII型(FN3)ドメインであって、肝細胞増殖因子受容体(c−Met)に特異的に結合して、c−Metに対する肝細胞増殖因子(HGF)の結合を遮断する、単離システイン改変FN3ドメイン。
- 半減期延長部分を更に含む、請求項1に記載のシステイン改変フィブロネクチンIII型(FN3)ドメイン。
- 前記半減期延長部分が、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール(PEG)、又は免疫グロブリンのFc領域の少なくとも一部である、請求項6に記載のシステイン改変フィブロネクチンIII型(FN3)ドメイン。
- (i)1つ又は2つ以上のヌクレオチド残基を、システイン改変FN3ドメインをコードするようにシステインアミノ酸残基をコードするヌクレオチド残基に交換することによって、親FN3ドメインの核酸配列を変異させることと、
(ii)前記システイン改変FN3ドメインを発現させることと、
(iii)前記システイン改変FN3ドメインを回収することと、
を含む、システイン改変FN3ドメインを調製する方法。 - 前記FN3ドメインが配列番号1に基づくものであり、前記変異させる工程が部位特異的変異誘発を行うことを含む、請求項7に記載の方法。
- 前記システイン改変FN3ドメインを大腸菌(E.coli)において発現させることを含む、請求項8に記載の方法。
- 前記回収する工程の後に、前記システイン改変FN3ドメインを、チオール反応性化学試薬と反応させて、化学的にコンジュゲートされたシステイン改変FN3ドメインを生成することを更に含む、請求項8に記載の方法。
- 前記反応させる工程の後に、前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変FN3ドメインのEGFR結合を測定することを更に含む、請求項10に記載の方法。
- 前記反応させる工程の後に、前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変FN3ドメインの付加後のEGFR過剰発現腫瘍細胞株の細胞増殖阻害を測定することを更に含む、請求項11に記載の方法。
- 前記反応させる工程の後に、前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変FN3ドメインのc−Met結合を測定することを更に含む、請求項11に記載の方法。
- 前記反応させる工程の後に、前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変FN3ドメインの付加後のc−Met発現腫瘍細胞株の細胞増殖阻害を測定することを更に含む、請求項11に記載の方法。
- 前記チオール反応性試薬がマレイミド部分を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記マレイミド部分を含むチオール反応性試薬が、NEM、MMAE、及びMMAFからなる群より選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変FN3ドメインが、EGFR過剰発現H1573細胞において測定されるとき、約1.7×10-10M〜約1.3×10-9Mの細胞増殖IC50を有する、請求項16に記載の方法。
- 配列番号189〜216、及び227〜254からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離システイン改変フィブロネクチンIII型(FN3)ドメイン。
- 第1のフィブロネクチンIII型(FN3)ドメインと第2のFN3ドメインとを含む、単離システイン改変二重特異性FN3分子であって、前記第1のFN3ドメインが、前記第1のFN3ドメインの6、8、10、11、14、15、16、20、30、34、38、40、41、45、47、48、53、54、59、60、62、64、70、88、89、90、91、及び93番目の残基からなる群から選択される位置でシステイン置換を含み、上皮成長因子受容体(EGFR)に特異的に結合して、EGFRに対する上皮成長因子(EGF)の結合を遮断し、前記第2のFN3ドメインが肝細胞増殖因子受容体(c−Met)に特異的に結合して、c−Metに対する肝細胞増殖因子(HGF)の結合を遮断する、単離システイン改変二重特異性FN3分子。
- 前記第2のFN3ドメインが、前記第2のFN3ドメインの6、8、10、11、14、15、16、20、30、34、38、40、41、45、47、48、53、54、59、60、62、64、70、88、89、90、91、及び93番目の残基からなる群より選択される位置でシステイン置換を含む、請求項20に記載の単離システイン改変二重特異性FN3分子。
- 配列番号219〜226、及び257〜264からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項20に記載の単離システイン改変二重特異性FN3分子。
- 前記分子がチオール反応性試薬に化学的にコンジュゲートされている、請求項20に記載の単離システイン改変二重特異性分子。
- 前記チオール反応性試薬がマレイミド部分である、請求項22に記載の単離システイン改変二重特異性分子。
- 前記マレイミド部分が、NEM、PEG24−マレイミド、フルオレセインマレイミド、MMAE、及びMMAFからなる群より選択される、請求項23に記載の単離システイン改変二重特異性分子。
- 前記第1のFN3ドメインが、50ng/mLヒトEGFを用いてNCI−H292細胞において測定されるとき、約0.9×10-9M〜約2.3×10-9MのIC50値でEGFRの1173番目のチロシン残基でEGFによって誘発されるEGFRのリン酸化を阻害し、前記第2のFN3ドメインが、100ng/mLヒトHGFを用いてNCI−H292細胞において測定されるとき、約4×10-10M〜約1.3×10-9MのIC50値でc−Metの1349番目のチロシン残基でHGFによって誘発されるc−Metのリン酸化を阻害する、請求項24に記載のシステイン改変二重特異性分子。
- 前記システイン改変二重特異性分子が、
(i)EGFR過剰発現H1573細胞において測定されるとき、約5.0×10-11M〜約5.8×10-10Mと、
(ii)EGFR過剰発現A731細胞において測定されるとき、約7.8×10-12M〜約1.1×10-9Mと、
からなる群より選択される細胞増殖IC50値を有する、請求項25に記載のシステイン改変二重特異性分子。 - 半減期延長部分を更に含む、請求項26に記載のシステイン改変二重特異性分子。
- 前記半減期延長部分が、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール(PEG)、又は免疫グロブリンのFc領域の少なくとも一部である、請求項27に記載のシステイン改変二重特異性分子。
- (i)1つ又は2つ以上のヌクレオチド残基を、システイン改変二重特異性分子をコードするようにシステイン残基をコードするヌクレオチド残基に交換することによって、親二重特異性分子の核酸配列を変異させることと、
(ii)前記システイン改変二重特異性分子を発現させることと、
(iii)前記システイン改変二重特異性分子を回収することと、
を含む、単離システイン改変二重特異性分子を調製する方法。 - 前記変異させる工程が、部位特異的変異誘発を行うことを含む、請求項29に記載の方法。
- 前記システイン改変二重特異性分子を大腸菌において発現させることを含む、請求項30に記載の方法。
- 前記回収する工程の後に、前記システイン改変二重特異性分子を、チオール反応性化学試薬と反応させて、化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子を生成することを更に含む、請求項30に記載の方法。
- (i)前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子のEGFR結合を測定することと、
(ii)前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子による、細胞株におけるEGF刺激EGFRリン酸化の阻害を測定することと、
(iii)前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子による、細胞株におけるHGF刺激c−Metリン酸化の阻害を測定することと、
(iv)前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子の添加後のEGFR過剰発現腫瘍細胞株の増殖阻害を測定することと、
からなる群より選択される工程を更に含む、請求項32に記載の方法。 - 本明細書に記載されたいずれかの発明。
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