JP2017221202A - L−リジン生産能の向上したコリネバクテリウム属およびそれを用いたl−リジン生産方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロピコリン酸リダクターゼ、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの酵素活性が内在性活性より増加し、さらにピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性が内在性活性より増加しているコリネバクテリウム属微生物の変異体、およびそれを用いてL−リジンを生産する方法。
【選択図】なし
Description
パラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒド
ロピコリン酸リダクターゼ、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(diaminopim
elate dicarboxylase)の活性が内在性活性より増加し、さらにピルビン酸カルボキシラ
ーゼの活性が内在性活性より増加しているコリネバクテリウム属の変異体、並びにそれを
用いてL−リジンを生産する方法に関する。
nebacterium glutamicum)は、L−アミノ酸の生産に多用されているグラム陽性の微生物
である。L−アミノ酸、特にL−リジンは、動物飼料、医薬品および化粧品産業を含む種
々の産業に適用できる。これらの産業での使用に対して、L−リジンは、典型的にはコリ
ネバクテリウム属株を用いた発酵によって生成されている。
生産方法が当該分野で周知である。例えば、米国特許第6,746,855号には、ly
sE遺伝子(リジン排出キャリア遺伝子)が強化され、dapA遺伝子、lysC遺伝子
、pyc遺伝子およびdapB遺伝子を含む群から選ばれた遺伝子がさらに導入されたコ
リネバクテリウム属株と、この株を培養してL−リジンを生産する方法が開示されている
。また、米国特許第6,221,636号には、L−リジンおよびL−トレオニンにより
フィードバックの阻害に実質的に脱感作されたアスパルトキナーゼをコードするDNA配
列、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするDNA配列を含む組み換
えDNAを有するコリネ型細菌群が開示されている。
ランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲ
ナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロピコリン酸リダクターゼ、およびジ
アミノピメリン酸デカルボキシラーゼの活性が内在性活性より増加しているコリネバクテ
リウム属種(Corynebacterium spp.)については、開示されたことがない。また、これら
の6種酵素に加えて、さらにピルビン酸カルボキシラーゼの活性が内在性活性より増加し
ているコリネバクテリウム属種についても開示されたことがない。
技術的課題
本発明の目的は、リジン生合成経路に関与する6種の酵素、すなわちアスパラギン酸ア
ミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒ
ドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロピコリン酸リダクターゼ、お
よびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの活性が内在性活性より増加しているコリネ
バクテリウム属の株を提供することにある。
活性が内在性活性より増加しているコリネバクテリウム属の株を提供することにある。
ある。
上記目的を達成するために、本発明は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ア
スパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピ
コリン酸シンターゼ、ジヒドロピコリン酸リダクターゼ、およびジアミノピメリン酸デカ
ルボキシラーゼの活性がそれぞれの内在性活性より増加しているコリネバクテリウム属の
株を提供する。
ーゼの活性が内在性活性より増加しているコリネバクテリウム属の株を提供する。
。
より高いレベルの活性を示す。本発明に係る前記増加した酵素の活性は、遺伝子コピー数
の増加、固有のプロモーターのより強力なプロモーターへの置換および人為的な変異によ
る酵素活性の増加を含む様々な要因に基づいている。より詳しくは、前記遺伝子コピー数
は、外来対立遺伝子の導入により、および/または内在性遺伝子の増幅によって増加でき
る。前記遺伝子プロモーターの置換の例には、下流の構造遺伝子を発現する強力な活性を
有する外来プロモーターの導入、および、内在遺伝子プロモーターでの置換によるものも
含まれる。遺伝子の増幅は、当該分野で周知の方法、例えば適切な条件の下で培養するな
どによって容易になされ得る。
aspB(アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子)、lysC(
アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子)、asd(アスパラギン酸セミアルデヒド
デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子)、dapA(ジヒドロジピコリン酸シンターゼを
コードする遺伝子)、dapB(ジヒドロジピコリン酸リダクターゼをコードする遺伝子
)、およびlysA(ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子)に加
えて、少なくとも1コピーのaspB、lysC、asd、dapA、dapBおよびl
ysA遺伝子が存在することによって特徴付けられる。この様相の変形において、外来の
強力なプロモーターを、それぞれの構造遺伝子の開始コドンの上流に位置させることもで
きる。
spB、lysC、asd、dapA、dapBおよびlysA遺伝子と共に、その核D
NAの内在性pyc(ピルビン酸カルボキシラーゼ)遺伝子に加えて、少なくとも1コピ
ーのpyc遺伝子が存在することによって特徴付けられる。この様相の変形において、前
記6個それぞれの遺伝子の内在性プロモーターがそれぞれ外来の強力なプロモーターに取
り替えられると同時に、pyc遺伝子の開始コドンの上流に外来の強力なプロモーターを
挿入する。
ain)として任意のコリネ型細菌群を使用することができる。本発明に有用なコリネバク
テリウム属微生物の例には、コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutami
cum)ATCC13032、コリネバクテリウムグルタミカム、コリネバクテリウムテルモ
アミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)FERM BP−1539、ブレビバ
クテリウムフラバム(Brevibacterium flavum)ATCC14067、ブレビバクテリウム
ラクトフェルメンタム(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869、およびこ
れらに由来するL−アミノ酸生産の変異体または菌株、例えばコリネバクテリウムグルタ
ミカム KFCC10881、コリネバクテリウムグルタミカム KFCC11001が
含まれる。好ましくは、コリネバクテリウムグルタミカム KFCC10881である。
A、dapB、lysAおよびpycは、それぞれ配列番号25、26、27、28、2
9、30および37のヌクレオチド配列を有し、各々が固有のプロモーターおよび終止コ
ドンを含む。
ターpDZ−2aspB、pDZ−2lysC/asd、pDZ−2dapA/dapB
、pDZ−2lysAおよびpDZ−2pycがコリネ型細菌群に形質転換されたもので
あってもよい。これらのベクターは、所定の順番で、または同時に導入することができる
。上述したように、外来プロモーターが前記遺伝子の開始コドンの上流にそれぞれ挿入さ
れたものであってもよい。前記微生物は、好ましくは、aspB、lysC、asd、d
apA、dapB、lysAおよびpycの追加のそれぞれのコピーを少なくとも1つそ
のゲノムDNA内に有している。別の実施形態或いはより好適な実施形態では、各遺伝子
の内在性プロモーターと開始コドンとの間に強力な外来プロモーターが挿入されている。
外来遺伝子のゲノムDNA内への挿入は、当該分野で周知の方法、例えば相同組み換えに
よって行われ得る。
8−CJ5が、本発明において特に有用である。本菌株は、コリネバクテリウムグルタミ
カム KFCC−10881に、それぞれ図2〜図5の切断地図を有するpDZ−2as
pB、pDZ−2lysC/asd、pDZ−2dapA/dapBおよびpDZ−2l
ysAを導入し、選択培地でその形質転換体を培養して、外来遺伝子のaspB、lys
C、asd、dapA、dapBおよびlysAをそれぞれの内因性対立遺伝子と相同組
み換えすることによって得ることができ、この株は、結果として2コピーのaspB、l
ysC、asd、dapA、dapBおよびlysAをゲノムDNA内に有している。前
記菌株は、母菌株より高い効率でL−リジンを生産することができる。また、前記菌株に
、図6の切断地図を有するベクターpDZ−2pycをさらに導入し、ゲノムDNA内に
2コピーのpycを有するようにすることによって、L−リジンの生産効率をより高める
ことができる。
コドンとの間に外来プロモーターを挿入することを含む、高収率でL−リジンを産生する
方法を提供する。
強力なCJ7プロモーターに置換される。本発明において有用なCJ7プロモーターは、
コリネバクテリウムアンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)由来の配列番号
44に示されるヌクレオチド配列を有する強力なプロモーターであって、本出願人によっ
て以前に開発されたものである(韓国特許第KR−0620092号)。コリネバクテリ
ウムグルタミカム KFCC−10881のlysCを発現させる場合、CJ7プロモー
ターが内在性プロモーターを用いるときよりアスパラギン酸キナーゼの活性が約2倍増加
することを確認した。本明細書においては、CJ7プロモーターを用いた実施例のみが提
供されているが、韓国特許第KR−0620092号に開示された、コリネバクテリウム
アンモニアゲネス由来のそれぞれ配列番号45〜50に示されるヌクレオチド配列を有す
るCJ1〜CJ6プロモーターが、CJ7プロモーターと同一の方式でリジン生産菌株の
調製のために使用できることが理解されるべきである。よって、CJ1〜CJ6プロモー
ターは、CJ7プロモーターと同様に、本発明に係る目的遺伝子の発現レベルを増加させ
るために有用な外来プロモーターの範囲に含まれる。
ジンを発現させるか、あるいは培地中にL−リジンを放出する工程と、前記細胞または培
地からL−リジンを回収する工程とを含む、L−リジンの生産方法を提供する。
コリネバクテリア属株は、例えば流加回分工程(fed batch process)または繰り返し流
加回分工程(repeated fed batch process)など、回分工程または連続工程で培養するこ
とができる。
テリア属種に対する培養培地は周知である(例えば、Manual of Methods for General Ba
cteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981)。培
養に有用な炭素源の例としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース
、マルトース、澱粉、セルロースなどの糖類および炭水化物;大豆油、ひまわり油、ヒマ
シ油、ココナッツ油などの油および脂質;パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸など
の脂肪酸;グリセロール、エタノールなどのアルコール;および酢酸などの有機酸が含ま
れる。これらの物質は単独でまたは組み合わせて使用できる。本発明のバクテリアの培養
培地に有用な窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、コーンスティ
ープソリッド(corn steep solid)、大豆粉、尿素、ならびに例えば硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなど
の無機化合物が含まれ得る。このような窒素源は、単独でまたは組み合わせて使用するこ
とができる。培地中の窒素源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素ニカリウム、
またはこれらのナトリウム含有塩を使用することができる。また、培養培地は、微生物の
成長に必要な成分として、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などの金属塩を必要とする。ま
た、アミノ酸およびビタミンなどの他の必要成分が培養培地に含まれる。また、これらの
成分それ自体の代わりに、その前駆体を使用することもできる。前述した成分は、培養過
程で培養物に回分式または連続式で微生物の培養物に添加できる。
化合物、またはたとえばリン酸もしくは硫酸などの酸性化合物を用いて調整することがで
きる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を添加して気泡の生成を抑制す
ることができる。好気状態は、培養物内に酸素または酸素含有気体(例えば、空気)を注
入することによって維持することができる。有機体を培養する間、培養培地は、20℃〜
45℃、好ましくは25℃〜40℃の範囲で維持される。培養は、L−アミノ酸の生成量
が最大に得られるまで行い続ける。この点に関し、L−リジンの最大量を得るには、10
〜160時間かかる。このアミノ酸は培養培地中に放出される場合もあるし、あるいは細
胞中にとどまる場合もある。
方法は、当該分野で周知である。L−リジン回収方法の例としては、濾過、陰イオン交換
クロマトグラフィー、結晶化およびHPLCが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のコリネバクテリウム属微生物は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、
アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジ
ピコリン酸シンターゼ、ジヒドロピコリン酸リダクターゼおよびジアミノピメリン酸デカ
ルボキシラーゼ、そしてさらにピルビン酸カルボキシラーゼの内在性活性よりも高い酵素
活性を有するので、L−リジン生産能を高収率で産生することができる。
を高効率で生産するために使用することができる。
示的に説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでは
ない。
用いた遺伝子の挿入]
本実施例では、大腸菌(E. coli)クローニング用ベクターpACYC177(New
England biolab、GenBank accetion # X06402)を
基本ベクターとして使用し、コリネバクテリウム属の染色体を運ぶための組み換えベクタ
ーpDZを構築した。その製作過程は次のとおりである。
素処理によって平滑末端化した。選別マーカーとして用いられる大腸菌由来のlacZ遺
伝子は、大腸菌K12 W3110の核DNAからPCRによって自身のプロモーターを
含むように遺伝子増幅した後、T4 DNAポリメラーゼおよびポリヌクレオチドキナー
ゼ処理によって5’末端のリン酸化および平滑化を行うことにより調製した。これらの2
種のDNA断片を互いにライゲーションして環状DNA分子を得、この環状DNA分子の
制限酵素部位BamHIに人為的に合成した多数の制限酵素認識部位を含んでいるアダプ
ター配列を挿入し、コリネバクテリウム属内に核標的化遺伝子を挿入するためのベクター
pDZを構築した。図1はコリネバクテリウム属内に核標的化遺伝子を挿入するためのベ
クターpDZのマップを示す図である。
的遺伝子を連続的に2コピー含有しているpDZベクターをL−リジン生産菌株としての
コリネバクテリウムグルタミカム KFCC10881にエレクトロポレーションによっ
て形質転換し(Appl. Microbiol. Biotechnol.(1999) 52:541-545による電気パルス法を
用いる)、25mg/Lのカナマイシンを含有した選別培地で、染色体上に目的の遺伝子
が挿入された形質転換体を相同性によってスクリーニングした。ベクターを用いた核DN
Aへの成功的な遺伝子の挿入は、X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル
−β−D−ガラクトシド)を含んだ固体培地で青色が出現することで示された。核に挿入
された1次菌株を栄養培地で振とう培養(30℃、8時間)した後、それぞれ10−4か
ら10−10まで連続的に希釈し、X−galを含んでいる固体培地に塗抹した。増殖し
た大部分のコロニーが青色を帯びた。低い割合の白色のコロニーを選別した。交叉(cross
over)によってゲノム内に挿入されたベクター配列がゲノムから除去されるで、これらの
2次選別された菌株はベクター配列を有していない。これらの菌株は、最終的にカナマイ
シンに対する感受性について試験し、PCRによる遺伝子構造確認過程を経て最終選定さ
れた。
881)の調製]
リジン生合成経路に関係する複数の遺伝子が挿入された菌株は、S−(2−アミノエチ
ル)システイン(以下「AEC」という)に対する耐性およびホモセリン漏れ(homoserin
e leaky)の特徴を有するコリネバクテリウムグルタミカム(KFCC−10881)をベ
ースとした。
C13032)から調製した。突然変異誘発源であるN−メチル−N’−ニトロ−N−ニ
トロソグアニジン(以下、「NTG」という)を細胞107〜108/mLの濃度で母株
を含む培地に対して30℃で500μg/mLで30分間処理し、AECを5g/Lの濃
度で含有した複合プレートで成長するコロニーを選択した。前記1次変異株に対するAE
C耐性度とリジン生産能を分析した後、NTGによる2次変異を誘導した。その後、形成
された複数のコロニーを、ホモセリンを添加した最小培地とホモセリンが添加されていな
い最小培地に接種(tooth picking)することにより、ホモセリンが添加されていない最小
培地で成長できないホモセリン要求性菌株(2次変異株)を分離した。このホモセリン要
求性菌株からさらにホモセリン漏れ型菌株を作製するために3次変異を誘導した。この株
は、ホモセリン10mg/Lが含有された最小培地に接種することによって同定した。培
地中で成長する菌株を、リジン生産能について試験した(表1)。最終的にAEC耐性お
よびホモセリン漏れ型の特徴を有するリジン生産菌株を獲得し、これを社団法人韓国種菌
協会(Korean Federation of Culture Collection)に寄託し、寄託番号第KFCC−1
0881号を与えられた。この実施例で使用した前記最小培地と前記生産培地は下記のと
おりである。
[最小培地(pH7.0)]
ブドウ糖 100g、(NH4)2SO4 40g、大豆タンパク質 2.5g、コー
ンスティープソリッド(Corn Steep Solids) 5g、尿素 3g、KH2PO4 1g、
MgSO47H2O 0.5g、ビオチン 100μg、チアミン塩酸塩 1000μg
、パントテン酸カルシウム 2000μg、ニコチンアミド 3000μg、CaCO3
30g(蒸留水1L基準)
[生産培地(pH7.0)]
ブドウ糖 100g、(NH4)2SO4 40g、大豆タンパク質 2.5g、コー
ンスティープソリッド(Corn Steep Solids) 5g、尿素 3g、KH2PO4 1g、
MgSO47H2O 0.5g、ビオチン 100μg、チアミン塩酸塩 1000μg
、CaCO3 30g(蒸留水1L基準)。
のaspB遺伝子のクローニング、組み換えベクター(pDZ−2aspB)の構築、お
よびaspB挿入菌株の調製]
本実施例では、実施例2で調製したリジン生産コリネバクテリウムグルタミカム KF
CC−10881の核DNAを鋳型として用い、リジン生合成経路に関与するaspB遺
伝子に対してPCRを行った。米国国立保健院の遺伝子銀行(NIH GenBank)
のデータからaspB遺伝子の塩基配列情報(NCBI登録番号 NC_003450、
Ncgl0237)を得て、これを使用して2組のプライマーを設計し、プロモーター領
域から終止コドンにわたるaspB遺伝子を増幅させた(表2)。
列番号1と2のオリゴヌクレオチドまたは前記配列番号3と4のオリゴヌクレオチドのセ
ットをプライマーとして、PfuUltraTM高信頼DNAポリメラーゼ(Strata
gene)の存在下でPCRを行った。PCRは、変性96℃、30秒;アニーリング5
3℃、30秒;および伸長反応72℃、2分を1サイクルとして30サイクル繰り返し行
った。このようにして得たPCR産物は、1,493bpのプロモーター領域をそれぞれ
含んだ2種のaspB遺伝子(aspB−AおよびaspB−B)であった。aspB−
Aは配列番号1と2のセットにより、aspB−Bは配列番号3と4のセットにより産生
された。このPCR産物をTOPO Cloning Kit(Invitrogen)を
用いて大腸菌ベクターpCR2.1にクローニングし、組換えベクターpCR−aspB
−AおよびpCR−aspB−Bを得た。これらのpCRベクターを、aspB−Aとa
spB−Bの反対の末端(opposite end)に特異的な制限酵素(aspB−A:SamI
+HindIII、aspB−B:HindIII+NheI)でそれぞれ処理し、前記
pCRベクターからaspB遺伝子を分離した。これらのフラグメントを、pDZベクタ
ーのEcoRV−NheI部位に3ピースライゲーション(3-piece ligation)によってク
ローニングし、aspBの2コピーが連続的にクローニングされた組換えベクターpDZ
−2aspBを製作した。図2は、コリネバクテリウム属に核標的化遺伝子を挿入するた
めのpDZ−2aspBベクターのマップである。
ウムグルタミカム KFCC−10881に形質転換し、交叉過程を経て核DNA上でa
spB遺伝子のすぐ隣に1コピーのaspB遺伝子をさらに挿入して、2コピーのasp
B遺伝子を有するリジン生産菌株を作製し、これをコリネバクテリウムグルタミカム K
FCC10881−CJ1と名づけた。2コピーのaspB遺伝子が隣接して位置するこ
とは、この2コピーのaspB遺伝子の間の連結領域を増幅することが可能な配列番号1
7と18(表3)のプライマーセットを用いたPCRによって最終確認した。
のlysC/asd遺伝子の構築、組み換えベクター(pDZ−2lysC/asd)の
製作、およびlysC/asd挿入菌株の調製]
実施例3と同様の方法で、lysC/asd遺伝子の塩基配列の情報(NCBI登録番
号 NC_003450、Ncgl0247〜0248)をNIH GenBankのデ
ータから得て、これを用いて2組のプライマーを設計し、aspB遺伝子をプロモーター
領域から終止コドンの範囲まで増幅した(表4)。
号1と2のオリゴヌクレオチドまたは配列番号3と4のオリゴヌクレオチドのセットをプ
ライマーとして、PfuUltraTM高信頼DNAポリメラーゼ(Stratagene
)の存在下でPCRを行った。PCRは、変性96℃、30秒;アニーリング52℃、3
0秒;および伸長反応72℃、3分を1サイクルとして30サイクル繰り返し行った。
のlysC/asd遺伝子(lysC/asd−AおよびlysC/asd−B)であっ
た。lysC/asd−Aは配列番号5と6のセットによって、lysC/asd−Bは
配列番号7と8のセットによってそれぞれ産生された。前記PCR産物を、TOPO C
loning Kit(Invitrogen)を用いて大腸菌ベクターpCR2.1に
クローニングして、組換えベタターpCR−lysC/asd−AとpCR−lysC/
asd−Bを得た。
対の末端に特異的な制限酵素(lysC/asd−A:BamHI+SamI、lysC
/asd−B:SamI+PvuI)でそれぞれ処理し、前記pCRベクターからlys
C/asd遺伝子を分離した。これらのフラグメントを、pDZベクターのBamHI−
とPvuI部位に3ピースライゲーション(3-piece ligation)によってクローニングし、
2コピーのlysC/asdが連続的にクローニングされた組換えベクターpDZ−2l
ysC/asdを得た。図3は、コリネバクテリウム属に核標的化遺伝子を挿入するため
のpDZ−2lysC/asdベクターのマップである。
バクテリウムグルタミカム KFCC10881−CJ1に形質転換し、交叉過程を経て
核DNA上でlysC/asd遺伝子のすぐ隣に1コピーのlysC/asd遺伝子をさ
らに挿入し、2コピーのlysC/asd遺伝子を有するリジン生産菌株を産生し、この
株をコリネバクテリウムグルタミカム KFCC10881−CJ2と名付けた。2コピ
ーのaspB遺伝子が隣接して位置することは、この2コピーのaspB遺伝子の間の連
結領域を増幅することが可能なプライマーのセット(図5)を用いたPCRによって最終
確認した。
のdapA/dapB遺伝子のクローニング、組み換えベクター(pDZ−2dapA/
dapB)の構築、およびdapA/dapB挿入菌株の調製]
dapA/dapB遺伝子の塩基配列情報(NCBI登録番号 NC_003450、
Ncgl1896〜1898)をNIH GenBankのデータから得た。dapA遺
伝子は、dapB遺伝子とオペロンを含み、それらの間には機能が解明されていないOR
F(Ncgl1987)があることが確認された。この情報を用いて2組のプライマーを
設計し、dapBプロモーターから終止コドンにおよぶdapB−ORF(Ncgl18
97)−dapA遺伝子全体を増幅した(表6)。
号9と10のオリゴヌクレオチドまたは配列番号11と12のオリゴヌクレオチドのセッ
トをプライマーとして、PfuUltraTM高信頼DNAポリメラーゼ(Strata
gene)の存在下でPCRを行った。PCRは、変性96℃、30秒;アニーリング5
2℃、30秒;および伸長反応72℃、3分を1サイクルとして30サイクル繰り返し行
った。
種のdapA/dapB遺伝子(dapA/dapB−A、dapA/dapB−B)で
あった。dapA/dapB−Aは配列番号9と10のセットによって、dapA/da
pB−Bは配列番号11と12のセットによってそれぞれ産生された。前記PCR産物を
TOPO Cloning Kit(Invitrogen)を用いて大腸菌ベクターpC
R2.1にクローニングして、組換えベクターpCR−dapA/dapB−AとpCR
−dapA/dapB−Bを得た。
反対の末端に特異的である対応する制限酵素(dapA/dapB−A:EcoRI+S
acI、dpaA/dapB−B:SacI+XhoI)で処理し、前記pCRベクター
からdapA/dapB遺伝子を分離した。これらのフラグメントを、pDZベクターの
EcoRI−XhoI部位に3ピースライゲーション(3-piece ligation)によってクロー
ニングし、2コピーのdapA/dapBが連続的にクローニングされた組換えベクター
pDZ−2dapA/dapBを構築した。図4は、pDZ−2dapA/dapBベク
ターのマップである。
ネバクテリウムグルタミカム KFCC10881−CJ2に形質転換し、交叉過程を経
て核DNA上でdapA/dapB遺伝子のすぐ隣に1コピーのdapA/dapB遺伝
子をさらに挿入して、2コピーのdapA/dapB遺伝子を有するリジン生産菌株を作
製し、この株をコリネバクテリウムグルタミカム KFCC10881−CJ3と名付け
た。2コピーのdapA/dapB遺伝子が隣接して位置することは、2コピーのdap
A/dapB遺伝子の間の連結領域を増幅することが可能なプライマーのセット(表7)
を用いたPCRによって最終確認した。
のlysA遺伝子のクローニング、組み換えベクター(pDZ−2lysA)の構築、お
よびlysA挿入菌株の調製]
lysA遺伝子の塩基配列情報(NCBI登録番号 NC_003450、Ncgl1
132〜1133)をNIH GenBankのデータから得た。lysA遺伝子を分析
すると、argS遺伝子(arginyl−tRNAシンテターゼ)とオペロンを含んで
いた。この情報を使用して、argSのプロモーターから終止コドンにおよびargS−
lysA遺伝子全体を増幅するための2組のプライマーを設計した(表8)。
号13と14のオリゴヌクレオチドまたは配列番号15と16のオリゴヌクレオチドのセ
ットをプライマーとして、PfuUltraTM高信頼DNAポリメラーゼ(Strat
agene)の存在下でPCRを行った。PCRは、変性96℃、30秒;アニーリング
52℃、30秒;および伸長反応72℃、4分を1サイクルとして30サイクル繰り返し
行った。
のargS/lysA遺伝子(argS/lysA−AおよびargS/lysA−B)
であった。argS/lysA−Aは配列番号13と14のセットによって、argS/
lysA−Bは配列番号15と16のセットによって、それぞれ産生された。前記PCR
産物をTOPO Cloning Kit(Invitrogen)を用いて大腸菌ベクタ
ーpCR2.1にクローニングして、組換えベクターpCR−argS/lysA−Aと
pCR−argS/lysA−Bを得た。
反対の末端に特異的な対応する制限酵素(argS/lysA−A:HindIII+N
otI、argS/lysA−B:NotI+XbaI)で処理し、前記pCRベクター
からargS/lysA遺伝子を分離した。これらのフラグメントを、pDZベクターの
HindIII−XbaI部位に3ピースライゲーションでクローニングし、2コピーの
argS/lysA2コピーが連続的にクローニングされた組換えベクターpDZ−2l
ysAを構築した。図5は、pDZ−2lysAベクターのマップである。
ウムグルタミカム KFCC10881−CJ3に形質転換し、交叉過程を経て核DNA
上でlysA遺伝子のすぐ隣に1コピーのlysA遺伝子をさらに挿入して、2コピーの
lysA遺伝子を含むリジン生産菌株を作製し、この株をコリネバクテリウムグルタミカ
ム KFCC10881−CJ4と名付けた。2コピーのlysA遺伝子が隣接して位置
することは、2コピーのlysA遺伝子の間の連結領域を増幅することが可能なプライマ
ーのセット(表9)を用いたPCRによって最終確認した。
テリウムグルタミカム KFCC10881−CJ4を2006年8月21日付けで韓国
微生物保存センターに寄託し、受託番号KCCM10770Pを与えられた。
のpyc遺伝子のクローニング、組み換えベクター(pDZ−2pyc)の構築、および
pyc挿入菌株の調製]
実施例3と同様一の方法で、pyc遺伝子の塩基配列情報(NCBI登録番号NC_0
03450、Ncgl0659)をNIH GenBankのデータから得て、これを用
いて2組のプライマーを設計し、プロモーター領域から終止コドンにおよぶpyc遺伝子
を増幅した(表10)。
号31と32のオリゴヌクレオチドまたは配列番号33と34のオリゴヌクレオチドのセ
ットをプライマーとして、PfuUltraTM高信頼DNAポリメラーゼ(Strat
agene)の存在下でPCRを行った。PCRは、変性96℃、30秒;アニーリング
52℃、30秒;および伸長反応72℃、4分を1サイクルとして30サイクル繰り返し
行った。こうして得たPCR産物は、3925bpのプロモーター領域をそれぞれ含んだ
2種のpyc遺伝子(pyc−Aおよびpyc−B)であった。pyc−Aは配列番号3
1と32のセットによって、pyc−Bは配列番号33と34のセットによって、それぞ
れ産生された。前記PCR産物をTOPO Cloning Kit(Invitroge
n)を用いて大腸菌ベクターpCR2.1にクローニングして、組換えベクターpCR−
pyc−AおよびpCR−pyc−Bを得た。
る制限酵素(pyc−A:XbaI+EcoRV、pyc−B:EcoRV+HindI
II)で処理し、前記pCRベクターからpyc遺伝子を分離した。これらのフラグメン
トを、pDZベクターのXbaI−HindIII部位に3ピースライゲーションでクロ
ーニングし、2コピーのpycが連続的にクローニングされた組換えベクターpDZ−2
pycを構築した。図6は、pDZ−2pycベクターのマップである。
ムグルタミカム KFCC10881−CJ4に形質転換し、交叉過程を経て核DNA上
でpyc遺伝子のすぐ隣に1コピーのpyc遺伝子をさらに挿入して、2コピーのpyc
遺伝子を有するリジン生産菌株を作製し、この株をコリネバクテリウムグルタミカム K
FCC10881−CJ5と名付けた。2コピーのpyc遺伝子が隣接して位置すること
は、2コピーのpyc遺伝子の間の連結領域を増幅することが可能なプライマーのセット
(表11)を用いたPCRによって最終確認した。
リウムグルタミカム KFCC10881−CJ5を獲得した。
それぞれ実施例6と実施例7で調製した、L−リジン生産菌株であるコリネバクテリア
グルタミカム KFCC−10881−CJ4とKFCC−10881−CJ5を、L−
リジンの生産のために、下記の方法で培養した。
テリウムグルタミカム KFCC−10881、KFCC−10881−CJ4およびK
FCC−10881−CJ5を接種し、30℃で20時間200rpmにて振とう培養し
た。その後、下記の生産培地24mLを含有する250mLのコーナーバッフルフラスコ
に、前記培養された1mLの種培養液をそれぞれ接種し、30℃で120時間200rp
mにて振とう培養した。前記種培地と前記生産培地の組成はそれぞれ下記のとおりである
。
[種培地(pH7.0)]
グルコース 20g、ペプトン 10g、酵母抽出物 5g、尿素 1.5g、KH2
PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO47H2O 0.5g、ビオチン 100
μg、チアミンHCl 1000μg、パントテン酸カルシウム 2000μg、ニコチ
ンアミド 2000μg(蒸留水1L基準)
[生産培地(pH7.0)]
ブドウ糖 100g、(NH4)2SO4 40g、大豆タンパク質 2.5g、コー
ンスティープソリッド 5g、尿素 3g、KH2PO4 1g、MgSO47H2O
0.5g、ビオチン 100μg、チアミン塩酸塩 1000μg、パントテン酸カルシ
ウム 2000μg、ニコチンアミド 3000μg、CaCO3 30g(蒸留水1L
基準)。
を測定した。コリネバクテリウムグルタミカム KFCC−10881、KFCC108
81−CJ4およびKFCC10881−CJ5の培養物中のL−リジンの濃度は、以下
の表12のとおりである。
ムグルタミカム KFCC−10881−CJ4は、母菌株KFCC−10881に比べ
てリジンの生産が約7%程度増加したことを確認した。また、6個のリジン生合成遺伝子
に加えてpyc遺伝子も有するコリネバクテリウムグルタミカム KFCC−10881
−CJ5は、母菌株KFCC−10881に比べてリジンの生産が約8%程度増加したこ
とを確認した。
の3コピーのlysC/asd挿入菌株の調製]
実施例4で調製した組換えベクターpDZ−2lysC/asdを、実施例6で調製し
たリジン生産コリネバクテリウムグルタミカムKFCC10881−CJ4に形質転換し
、交叉過程を経て核DNA上で隣接する2コピーのlysC/asd遺伝子のすぐ隣に1
コピーのlysC/asd遺伝子をさらに挿入して、3コピーのlysC/asd遺伝子
を有するリジン生産菌株を作製し、この株をコリネバクテリウムグルタミカム KFCC
10881−CJ6と名付けた。3コピーのlysC/asd遺伝子が連続して整列して
いることは、3コピーのlysC/asd遺伝子のなかの連結領域を増幅することが可能
なプライマーのセット(表13)を用いたPCRによって最終確認した。
スパラギン酸キナーゼの活性を、Pechere J−FとCapony J−Pのアスパ
ラギン酸ヒドロキサメートを用いた測定法(Anal Biochem 22 : 536-539, 1968)によって
測定した結果、KFCC10881−CJ6がKFCC10881−CJ4より2.1倍
程度高い活性を持つことを確認した。
来の3コピーのdapA/dapB遺伝子挿入菌株の調製]
実施例5で調製した組換えベクターpDZ−2dapA/dapBを、実施例9で調製
したリジン生産コリネバクテリウムグルタミカム KFCC10881−CJ6に形質転
換し、交差過程を経て核DNA上で隣接する2コピーのdapA/dapB遺伝子のすぐ
隣に1コピーのdapA/dapB遺伝子をさらに挿入して、3コピーのdapA/da
pB遺伝子を有するリジン生産菌株を作製し、この株をコリネバクテリウムグルタミカム
KFCC10881−CJ7と名付けた。3コピーのdapA/dapB遺伝子が連続
して整列していることは、3コピーのdapA/dapB遺伝子のなかの連結領域を増幅
することが可能なプライマーのセット(表15)を用いたPCRによって最終確認した。
実施例10で調製したL−リジン生産菌株としてのコリネバクテリウムグルタミカム
KFCC−10881−CJ7を、L−リジンの生産のために、下記の方法で培養した。
テリウムグルタミカム KFCC−10881−CJ4とKFCC−10881−CJ7
を接種し、30℃で20時間200rpmで振とう培養した。その後、下記の生産培地2
4mLを含有する250mLのコーナーバッフルフラスコに、各々の培養物1mLを接種
し、30℃で120時間(200rpm)で振とう培養した。前記種培地および前記生産
培地の組成はそれぞれ下記のとおりである。
[種培地(pH7.0)]
グルコース 20g、ペプトン 10g、酵母抽出物 5g、尿素 1.5g、KH2
PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO47H2O 0.5g、ビオチン 100
μg、チアミンHCl 1000μg、パントテン酸カルシウム 2000μg、ニコチ
ンアミド 2000μg(蒸留水1L基準)
[生産培地(pH7.0)]
ブドウ糖 100g、(NH4)2SO4 40g、大豆タンパク質 2.5g、コー
ンスティープソリッド 5g、尿素 3g、KH2PO4 1g、MgSO47H2O
0.5g、ビオチン 100μg、チアミン塩酸塩 1000μg、パントテン酸カルシ
ウム 2000μg、ニコチンアミド 3000μg、CaCO3 30g(蒸留水1L
基準)。
を測定した。コリネバクテリウムグルタミカム KFCC−10881−CJ4とKFC
C−10881−CJ7の培養物中のL−リジンの濃度は、以下の表16のとおりである
。
テリウムグルタミカム KFCC−10881−CJ7は、母菌株KFCC−10881
−CJ4に比べてリジンの生産が約11%程度増加したことを確認することができた。
よび外来プロモーター置換の菌株の調製]
本実施例では、pDZを基本ベクターとして使用し、リジン生合成遺伝子の固有のプロ
モーターを外来の強力なCJ7プロモーターで置換した。CJ7プロモーターは、配列番
号44〜50に示される塩基配列を有するコリネバクテリウムアンモニアゲネス由来の強
力なプロモーターであって、本出願人に対して許可された韓国特許第0620092号に
おいて開示されている。コリネバクテリウムグルタミカム KFCC−10881の核l
ysCをCJ7プロモーターの存在下で発現させた場合、固有プロモーターを用いたとき
よりアスパラギン酸キナーゼの活性が約2倍程度増加することを確認した。
のとおり調製した。
アンモニアゲネスの核DNAのCJ7プロモーターから増幅するPCR産物の5’末端お
よび3’末端に、それぞれXbaI部位とNdeI部位とを挿入するように設計したプラ
イマーとして、配列番号42および43(表17)を用いてPCRを行った。CJ7プロ
モーターPCR増幅産物をXbaIとNdeIで処理した後、切断型(truncated)pD
Zベクターに連結することにより、菌株の核DNA上にCJプロモーターを導入するため
の1次プラスミドとして機能するpDZ−PCJ7を製作した(図7)。
881の核DNAを鋳型としたPCRを行い、核DNA上に導入される遺伝子のそれぞれ
の固有のプロモーターをCJ7プロモーターで置換するために必要な2種のDNAフラグ
メント、すなわち固有プロモーターの部分フラグメント(約300bp)と+2コドンか
ら下流側へ約300bp程度のORFの一部を得た。このPCRに使用したプライマーは
、固有プロモーターの部分フラグメントのPCR産物の反対の末端にXbaI部位を挿入
し、そして部分ORFのPCR産物の反対の末端にNdeI部位が挿入されるように設計
した。これらのPCR産物をそれぞれの制限酵素で処理した。pDZ−PCJ7は、固有
プロモーターの部分フラグメントの切断型PCR産物にライゲーションするためにXba
Iで消化し、次いで、部分ORFの切断型PCR産物にライゲーションするためにNde
Iで消化して、組換えプラスミドを構築した。これらはそれぞれpDZ−PCJ7−as
pB、pDZ−PCJ7−lysCasd、pDZ−PCJ7−dapA、pDZ−PC
J7−dapB、pDZ−PCJ7−argSlysAおよびpDZ−PCJ7−pyc
と命名した。これらはそれぞれ2つのPCR DNAフラグメントの間に位置するCJ7
プロモーターを含んでいた(図8〜図13)。
ターpDZ−PCJ7−aspBをリジン生産コリネバクテリウムグルタミカム KFC
C10881に形質転換した後、交叉過程を経て、核DNA上でaspB遺伝子のプロモ
ーター領域にCJ7プロモーターが挿入された菌株を獲得した。これと同一の方法で、C
J7プロモーターがaspB、lysCasd、dapA、dapBおよびargSly
sA遺伝子のプロモーター領域に位置する新規株KFCC−10881−PJ7−5を作
製するために、他の組み換えプラスミドを形質転換した。これらのプロモーターに加えて
、pyc遺伝子のプロモーターまでCJ7プロモーターで置換して、KFCC−1088
1−PCJ7−6も製作した。
ジン生産]
L−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミカム KFCC−10881−
PCJ7−5とKFCC−10881−PCJ7−6を、L−リジンの生産のために、下
記の方法によって培養した。
テリウムグルタミカム KFCC−10881、KFCC−10881PCJ7−5およ
びKFCC−10881−PCJ7−6をそれぞれ接種し、30℃で20時間200rp
mで振とう培養した。その後、各々の培養物1mLを下記の生産培地24mLを含有する
250mLのコーナーバッフルフラスコに接種し、30℃で120時間(200rpm)
で振とう培養した。前記種培地および前記生産培地の組成はそれぞれ下記のとおりである
。
[種培地(pH7.0)]
グルコース 20g、ペプトン 10g、酵母抽出物 5g、尿素 1.5g、KH2
PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO47H2O 0.5g、ビオチン 100
μg、チアミンHCl 1000μg、パントテン酸カルシウム 2000μg、ニコチ
ンアミド 2000μg(蒸留水1L基準)
[生産培地(pH7.0)]
ブドウ糖 100g、(NH4)2SO4 40g、大豆タンパク質 2.5g、コー
ンスティープソリッド 5g、尿素 3g、KH2PO4 1g、MgSO47H2O
0.5g、ビオチン 100μg、チアミン塩酸塩 1000μg、パントテン酸カルシ
ウム 2000μg、ニコチンアミド 3000μg、CaCO3 30g(蒸留水1L
基準)。
を測定した。コリネバクテリウムグルタミカム KFCC−10881、KFCC−10
881−PCJ7−5およびKFCC−10881−PCJ7−6の培養物中のL−リジ
ンの濃度は、以下の表18のとおりである。
モーターを有するコリネバクテリウムグルタミカム KFCC−10881−PCJ7−
5と、前記6個の遺伝子とプロモーターに加えて、さらにpyc遺伝子とそのCJ7プロ
モーターを有するコリネバクテリウムグルタミカム KFCC−10881−PCJ7−
6は、母菌株KFCC−10881に比べてリジンの生産がそれぞれ約17.4%と18
.6%増加したことを確認することができた。
ーを有する菌株におけるリジン生合成酵素の活性]
実施例6、実施例10および実施例12でそれぞれ調製した、L−リジン生産菌株であ
るコリネバクテリウムグルタミカム KFCC10881−CJ4、KFCC10881
−CJ7およびKFCC−10881−PCJ7−5を、リジン生合成酵素の代表として
、酵素活性の測定が比較的容易なアスパラギン酸キナーゼとジアミノピメリン酸デカルボ
キシラーゼの活性についてアッセイした。この改変されたリジン産生菌株は、アスパラギ
ン酸キナーゼの活性はPechere J−FとCapony J−Pの測定法(Anal Bioc
hem 22:536-539, 1968)によって測定し、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの活性
はJ.Cremerなどの測定法によって測定した結果、最初の母菌株であるKFCC1
0881に比べて酵素活性が増加したことを確認した(表19)。
実施例6、実施例10および実施例12でそれぞれ調製した、L−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミカム KFCC10881−CJ4、KFCC10881−CJ7およびKFCC−10881−PCJ7−5を、リジン生合成酵素の代表として、酵素活性の測定が比較的容易なアスパラギン酸キナーゼとジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの活性についてアッセイした。この改変されたリジン産生菌株は、アスパラギン酸キナーゼの活性はPechere J−FとCapony J−Pの測定法(Anal Biochem 22:536-539, 1968)によって測定し、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの活性はJ.Cremerなどの測定法によって測定した結果、最初の母菌株であるKFCC10881に比べて酵素活性が増加したことを確認した(表19)。
[1]
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸リダクターゼ、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの酵素活性がそれぞれの内在性活性と比較して増加した、コリネバクテリウム属微生物。
[2]
前記微生物は、さらにピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性が内在性活性と比較して増加している、上記[1]に記載のコリネバクテリウム属微生物。
[3]
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸リダクターゼ、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの酵素活性の増加は、コリネ型細菌群のaspB遺伝子、lysC遺伝子、asd遺伝子、dapA遺伝子、dapB遺伝子およびlysA遺伝子の発現の増加によるものである、上記[1]に記載のコリネバクテリウム属微生物。
[4]
前記ピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性の増加は、コリネ型細菌群のpyc遺伝子の発現の増加によるものである、上記[2]に記載のコリネバクテリウム属微生物。
[5]
前記発現の増加は、前記微生物の内在性遺伝子に対応する外来対立遺伝子の1つ以上のコピーを導入されることによるものである、上記[3]または[4]に記載のコリネバクテリウム属微生物。
[6]
前記微生物は、受託番号KFCC10881のコリネ型細菌群である、上記[5]に記載のコリネバクテリウム属微生物。
[7]
前記aspB遺伝子、lysC遺伝子、asd遺伝子、dapA遺伝子、dapB遺伝子、lysA遺伝子およびpyc遺伝子は、それぞれ配列番号25、26、27、28、29、30および37のヌクレオチド配列を有する、上記[5]に記載のコリネバクテリウム属微生物。
[8]
前記導入は、それぞれ図2〜図6の切断地図を有するベクターをコリネ型細菌群に形質転換することにより行われる、上記[5]に記載のコリネバクテリウム属微生物。
[9]
前記外来の対立遺伝子は、前記微生物の核DNAに挿入される、上記[5]に記載のコリネバクテリウム属微生物。
[10]
前記微生物は、受託番号KCCM10770Pのコリネバクテリウムグルタミカム KFCC10881−CJ4である、上記[5]に記載のコリネバクテリウム属微生物。
[11]
前記発現の増加は、各遺伝子に対する外来プロモーターの導入によってなされる、上記[3]〜[10]のいずれか1項に記載のコリネバクテリウム属微生物。
[12]
前記外来プロモーターは、配列番号44〜50のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有する、上記[11]に記載のコリネバクテリウム属微生物。
[13]
前記外来プロモーターは、配列番号44に示されるヌクレオチド配列である、上記[12]に記載のコリネバクテリウム属微生物。
[14]
前記外来プロモーターの導入は、図8〜図13に示されるベクターの少なくとも一つをコリネ型細菌群に導入することにより行われる、上記[11]に記載のコリネバクテリウム属微生物。
[15]
上記[1]〜[14]のいずれか1項に記載の微生物を培養する工程と、
前記微生物の細胞または細胞培養物からリジンを回収する工程とを含む、L−リジンの生産方法。
Claims (15)
- アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸
セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロピコリン
酸リダクターゼ、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの酵素活性がそれぞれの
内在性活性と比較して増加した、コリネバクテリウム属微生物。 - 前記微生物は、さらにピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性が内在性活性と比較して
増加している、請求項1に記載のコリネバクテリウム属微生物。 - アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸
セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロピコリン
酸リダクターゼ、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの酵素活性の増加は、コ
リネ型細菌群のaspB遺伝子、lysC遺伝子、asd遺伝子、dapA遺伝子、da
pB遺伝子およびlysA遺伝子の発現の増加によるものである、請求項1に記載のコリ
ネバクテリウム属微生物。 - 前記ピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性の増加は、コリネ型細菌群のpyc遺伝子
の発現の増加によるものである、請求項2に記載のコリネバクテリウム属微生物。 - 前記発現の増加は、前記微生物の内在性遺伝子に対応する外来対立遺伝子の1つ以上の
コピーを導入されることによるものである、請求項3または4に記載のコリネバクテリウ
ム属微生物。 - 前記微生物は、受託番号KFCC10881のコリネ型細菌群である、請求項5に記載
のコリネバクテリウム属微生物。 - 前記aspB遺伝子、lysC遺伝子、asd遺伝子、dapA遺伝子、dapB遺伝
子、lysA遺伝子およびpyc遺伝子は、それぞれ配列番号25、26、27、28、
29、30および37のヌクレオチド配列を有する、請求項5に記載のコリネバクテリウ
ム属微生物。 - 前記導入は、それぞれ図2〜図6の切断地図を有するベクターをコリネ型細菌群に形質
転換することにより行われる、請求項5に記載のコリネバクテリウム属微生物。 - 前記外来の対立遺伝子は、前記微生物の核DNAに挿入される、請求項5に記載のコリ
ネバクテリウム属微生物。 - 前記微生物は、受託番号KCCM10770Pのコリネバクテリウムグルタミカム K
FCC10881−CJ4である、請求項5に記載のコリネバクテリウム属微生物。 - 前記発現の増加は、各遺伝子に対する外来プロモーターの導入によってなされる、請求
項3〜10のいずれか1項に記載のコリネバクテリウム属微生物。 - 前記外来プロモーターは、配列番号44〜50のいずれかに示されるヌクレオチド配列
を有する、請求項11に記載のコリネバクテリウム属微生物。 - 前記外来プロモーターは、配列番号44に示されるヌクレオチド配列である、請求項1
2に記載のコリネバクテリウム属微生物。 - 前記外来プロモーターの導入は、図8〜図13に示されるベクターの少なくとも一つを
コリネ型細菌群に導入することにより行われる、請求項11に記載のコリネバクテリウム
属微生物。 - 請求項1〜14のいずれか1項に記載の微生物を培養する工程と、
前記微生物の細胞または細胞培養物からリジンを回収する工程段階とを含む、L−リジ
ンの生産方法。
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