KR101582008B1

KR101582008B1 - 생물막 형성 억제 활성을 가지는 유전자 및 이 유전자가 불활성화된 균주를 이용한 l-라이신 생산 방법

Info

Publication number: KR101582008B1
Application number: KR1020130122443A
Authority: KR
Inventors: 하운환; 김용재; 이정훈; 신희성; 문준옥; 김형준; 이광호
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2013-10-15
Filing date: 2013-10-15
Publication date: 2015-12-31
Also published as: EP2862932A2; BR102014025736B1; CN104561050B; EP2862932A3; CN107099469A; BR102014025736A2; CN104561050A; HUE047215T2; US20150104837A1; EP2930242A1; US9556463B2; EP2930242B1; KR20150043717A; EP2862932B1; CN107099469B; HUE047331T2

Abstract

본 발명은 생물막 형성 억제 활성이 있는 코리네형 박테리아 유래의 신규 분리한 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 불활성화 시킨 L-라이신 생산 균주와 이를 이용한 L-라이신 생산방법에 관한 것으로, 본 발명의 균주를 이용하여 L-라이신 생산 시 균체량의 증가에도 불구하고 L-라이신 생산수율이 전혀 감소하지 않아 짧은 시간에 L-라이신을 고수율로 얻을 수 있는 효과가 있다.

Description

생물막 형성 억제 활성을 가지는 유전자 및 이 유전자가 불활성화된 균주를 이용한 L-라이신 생산 방법{The genes for biofilm inhibition and the method for producing L-Lysine using inactivating mutants of these genes}

본 발명은 생물막 형성 억제 활성을 가지는 신규 분리된 유전자 및 이 유전자가 불활성화된 균주를 이용하여 L-라이신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

박테리아는 다양한 생장환경에서 다른 미생물과 영양분 이용을 경쟁하며 생존한다. 박테리아의 생장환경이 생존을 위협하는 비우호적인 생장환경으로 변화되는 경우를 위해 박테리아는 다양한 생존기전을 가지고 있는데, 그 중 하나가 생물막(biofilm)을 형성하는 것이다.

생물막은 박테리아가 분비한 세포 외 중합체 기질로 둘러싸여 협력 공동체(coopearive consortium)로서의 기능을 하는 미생물들의 집합체(assemblages of microorganisms)를 의미하는 것으로, 생물막은 박테리아에게 보호막으로 작용하여 항생제, 숙주 면역 반응 및 항균제 처리 같은 적대적인 환경에서도 생물막 내의 군집으로서 박테리아를 지속적으로 생존 가능하게 한다.

한편 현재까지 보고된 바에 의하면 균체량이 증가할수록 L-라이신 생산수율이 감소하여, 균체량의 변화에 따라 L-라이신 생산수율이 일정치 않는 문제점이 있었다.

본 발명자는 다양한 실험 끝에 L-라이신 생산 균주에서 생물막 형성 억제와 관련된 유전자를 찾아내었고, 이 유전자를 불활성화시킨 결과 균주의 증식 속도가 빨라지고, 그로 인해 균체량이 증가하였음을 확인하였다. 또한 예상치 않게, 균체량의 증가에도 불구하고 L-라이신 생산 수율이 전혀 감소하지 않음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 L-라이신 생산균주에서의 생물막 형성 억제 활성을 가지는 신규 분리한 유전자를 제공하고, 이 유전자가 불활성화된 L-라이신 생산균주를 제공하며, 이 유전자가 불활성화된 L-라이신 생산균주를 이용해 L-라이신 생산능을 증가시키는 L-라이신 생산방법을 제공하고자 한다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 박테리아의 생물막 형성 억제 활성을 가지는 신규 분리한 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 폴리뉴클레오티드(NCgl2909) 또는 이와 동일한 활성을 나타내는 상기 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드(NCgl2909)는 코리네형 박테리아에서 D-amino acid dehydrogenase subunit을 코딩하는 유전자로 서열번호 2의 염기서열을 가지는 아실트랜스퍼라제 유전자(acyltransferase, NCgl0350)의 상단부에 위치하여, 아실트랜스퍼라제 유전자(NCgl0350) 및 이의 프로모터(promoter)의 발현을 조절하는 유전자이다. 특히, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드(NCgl2909)는 정체기까지 배양된 박테리아의 무세포 배양액의 존재 하에서 상기 아실트랜스퍼라제 유전자를 발현시켜 생물막 형성 저해하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 용어 "생물막 형성 억제 활성을 가지는 유전자"란 생물막의 형성을 저해하는 기전에 관여된 것으로, 상기 유전자의 발현에 의해, 생물막 형성에 필요한 물질을 코딩하는 유전자의 발현이 저해되도록 조절하거나, 상기 유전자가 생물막으로부터 세포가 분산하는데 필요한 물질을 코딩하는 유전자이거나, 또는 이 유전자의 발현이 유도되도록 조절하거나 또는 생물막 형성에 수반되는 것으로써 세포 외부로부터 유입된 또는 세포 내 대사물질을 변형시키는데 관여하는 유전자를 포함한다.

본 발명에서 용어 "폴리뉴클레오티드와 동일한 활성을 나타내는"이란 상기 폴리뉴클레오티드의 활성을 유지하는 한, 이의 작용성 등가물을 포함하는 것으로서, 인위적인 변형에 의해 폴리뉴클레오티드의 일부 염기서열의 결실(deletion), 치환(substitution), 삽입(insertion) 또는 이들의 조합(combination)에 의해 변형된 변이체(variants) 또는 동일한 작용을 수행하는 상기 폴리뉴클레오티드의 작용성 단편(fragments)을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "코리네형 박테리아"는 코리네박테리움(Corynebacterium) 또는 브레비박테리움(Brevibacterium) 속의 미생물을 포함하는 개념이다. 이러한 코리네형 박테리아는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 외에도, 코리네박테리움 속의 적당한 균주로서 공지된 야생형 균주, 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 써모아미노게네스(C.thermoaminogenes), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) 및 브레비박테리움 락토페르멘툼(B.lactofermentum) 등을 들 수 있으며, 또한 이들로부터 제작된 L-아미노산 생산 돌연변이체 또는 균주, 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P와 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는 코리네형 박테리아 중에서 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 암모니아게네스 및 코리네박테리움 써모아미노게네스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이다.

더욱 바람직하게는 상기 코리네형 박테리아 중 L-라이신 생산능이 향상된 박테리아로서, 라이신 생합성 관련 유전자가 강화된 박테리아이다.

본 발명의 용어 '무세포 배양액'이란 박테리아를 정체기까지 배양한 후, 그 배양액을 원심분리하고, 그 상등액을 셀룰로오스 아세테이트 필터 등의 필터에 통과시켜 박테리아가 제거된 배양액을 의미한다.

상기 무세포 배양액은 그람 양성균과 그람 음성균의 무세포 배양액을 포함하며, 바람직하게는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 코리네박테리움 암모니아게네스, 코리네박테리움 글루타미쿰, 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 마이코박테리움 스피시스 스트레인 JC1(Mycobacterium sp. strain JC1), 스테필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 중 선택된 어느 하나의 박테리아의 무세포 배양액인 것이 바람직하다.

본 발명의 용어 '정체기'란 stationary phase를 의미하는 것으로 박테리아의 성장이 일정수준까지 증가한 후에 더 이상 성장하지 않는 시점을 의미한다.

상기 정체기까지 배양된 박테리아의 무세포 배양액에는 쿼럼 센싱을 매개하는 물질로서, 자가유도체(autoinducer)를 포함한다.

본 발명에서 용어 '자가유도체'란 박테리아가 환경의 변화에 반응하여 세포 간 시그널링을 위해 특정한 분자를 합성하여 세포 밖으로 배출하거나 유입하는 방법을 사용하여 서로 소통하는, 즉 쿼럼 센싱을 매개하는 물질이다. 상기 자가유도체는 아실호모세린 락톤(acylhomoserine lactone)계, 펩타이드계 및 퓨라논(furanone)계의 자가유도체(autoinducer)를 포함한다.

또한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 박테리아의 생물막 형성 억제 활성을 가지는 NCgl2909 (서열번호 1) 또는 NCgl0350(서열번호 2), 또는 NCgl2909 및 NCgl0350 유전자가 불활성화된 코리네형 박테리아를 제공한다.

상기 코리네형 박테리아는 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 암모니아게네스 및 코리네박테리움 써모아미노게네스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이다.

라이신 생합성 관련 유전자는 lysA(디아미노디피멜레이트 디카르복실라제를 코딩하는 유전자), lysC(아스파테이트 키나제를 코딩하는 유전자), lysE(라이신 배출 캐리어를 코딩하는 유전자), dapA(디히드로디피콜리네이트 신타제를 코딩하는 유전자), dapB(디히드로디피콜리네이트 리덕타제를 코딩하는 유전자), pyc(파이루베이트 카르복실라제를 코딩하는 유전자), asd(아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나제를 코딩하는 유전자), aspB(아스파테이트 아미노트란스퍼라제를 코딩하는 유전자) 등을 포함하며, 상기 라이신 생합성 관련 유전자가 강화된 박테리아란 상기 라이신 생합성 관련 유전자들 중 선택된 하나 이상의 유전자들이 암호화하는 효소의 활성이 강화되어 L-라이신 생산능이 향상된 코리네형 박테리아이다.

상기 유전자들이 암호화하는 효소의 활성 강화 방법은 유전자 카피(copy) 수의 증가, 발현 조절 서열의 교체 또는 변형 및 ORF 내의 돌연변이 도입일 수 있다. 상기 유전자의 카피 수의 증가는, 내재적 유전자의 추가 도입뿐만 아니라 외래 유전자의 도입에 의한 카피 수의 증가도 포함된다. 상기 유전자의 발현 조절 서열의 교체 또는 변형은, 외래의 강력한 프로모터를 상기 유전자들의 개시코돈 상위에 삽입하거나 프로모터 활성이 강화되도록 변이가 도입되거나 SD서열이 효율적으로 작동할 수 있도록 변이가 도입된 것일 수 있다. 상기 유전자의 ORF 내의 돌연변이 도입은, 염기서열 일부의 결실, 치환 또는 삽입으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 돌연변이 시킴으로써 이루어진 것일 수 있다. 상기 유전자의 염색체 내로의 염기서열 삽입, 결실 및 치환 등은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합에 의하여 이루어질 수 있다.

상기 유전자들이 암호화하는 효소의 활성을 강화시켜 L-라이신 생산능이 향상된 코리네형 박테리아의 일 예로, 야생주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 모균주로 하여 인공변이법에 의해 제작된 라이신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 각각 2개 카피의 aspB, lysC, asd, dapA, dapB 및 lysA 유전자가 삽입된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P 균주 또는 각각 2개 카피의 aspB, lysC, asd, dapA, dapB, lysA 및 pyc 유전자가 삽입된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P-CJ5 균주가 있으며, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P는 상기 라이신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 비해 L-라이신 생산이 약 7% 증가하였고, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P-CJ5는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 비해 L-라이신 생산이 약 8% 증가함이 확인된 균주이다(대한민국 등록특허 제10-0924065호).

또한, L-라이신 생산능이 향상된 코리네형 박테리아로서 ATCC13032를 모균주로 하여 인공변이법에 의해 제작된 라이신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10750(대한민국 등록특허 제10-0073610)(국제기탁 KCCM11347) 및 ATCC13032를 모균주로 하여 3종의 유전자에 기공지된 변이 pyc(P458S), hom(V59A), lysC(T311I)를 도입하여 L-라이신 생산능을 갖게 된 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P 일 수 있으며(Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40), 글루코네이트 키나아제의 활성 약화를 통해 오탄당 인산화 경로에서 NADPH 생산을 증가시켜 L-라이신 생산능이 향상된 코리네형 박테리아로서, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM 11085P일 수 있다(대한민국 공개특허 제10-2012-0007965호).

본 발명의 용어 '유전자의 불활성화'란 해당 유전자의 전체 또는 일부의 결실, 염기서열의 일부의 치환 또는 상기 염기서열 내로 하나 이상의 염기쌍의 삽입으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 돌연변이시켜 유전자의 발현이 저하 또는 파괴됨으로써 해당 유전자가 코딩하는 단백질의 활성이 저하되거나 파괴된 것을 의미한다.

본 발명에서는 NCgl2909(서열번호 1) 또는 NCgl0350(서열번호 2), 또는 NCgl2909 및 NCgl0350 유전자의 일부를 포함하는 재조합 벡터를 미생물에 도입하여 내재적 유전자의 불활성화를 유도함으로써 생물막 합성 저해기작이 해제된 미생물을 제조할 수 있다.

구체적으로 상기 미생물은 1) 상기 유전자의 양쪽 말단의 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 수득하는 단계; 2) 숙주세포에 도입되어 염색체상에서 상동 재조합을 수행할 수 있는 벡터에 상기 수득한 폴리뉴클레오티드 단편을 도입하여 재조합 벡터를 수득하는 단계; 3) 상기 수득한 재조합 벡터를 L-라이신을 생산할 수 있는 숙주세포에 도입하여 상동 재조합체를 수득하는 단계; 및 4) 상기 상동 재조합체 중에서 NCgl2909 또는 NCgl0350, 또는 NCgl2909 및 NCgl0350 유전자가 불활성화된 균주를 선발하는 단계를 통해 제조할 수 있다.

상기에서 활용할 수 있는 벡터로는 pDZ 벡터, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등이 있으며, 바람직하게, 코리네박테리움 글루타미쿰 세포 내에서 스스로 복제되지 않는 pDZ 벡터(대한민국 등록특허 제10-0924065호)를 이용함으로써 상기 유전자들을 불활성화할 수 있다.

본 발명에서는 pDZ 벡터를 기초로 NCgl2909를 암호화하는 유전자의 일부를 포함하는 pDZ 유도체를 제조하여 pDZ-ΔNCgl2909로 명명하였으며, 이를 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 형질전환시켜 NCgl2909 유전자가 불활성화된 재조합 균주를 제작하고 이를 ATCC13032::ΔNCgl2909 또는 KCCM11016P::ΔNCgl2909로 명명하였다. 또한, 이와 동일하게 NCgl0350 유전자의 일부를 포함하는 pDZ 유도체를 제조하여 pDZ-ΔNCgl0350으로 명명하였으며, 이를 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 형질전환시켜 NCg10350 유전자가 파괴된 재조합 균주를 제작하고 이를 KCCM11016P::ΔNCgl0350으로 명명하였다. 나아가, 상기 KCCM11016P::ΔNCgl2909를 대상으로 재조합 플라스미드 pDZ-ΔNCgl0350을 형질전환시켜 NCgl2909 및 NCgl0350을 암호화하는 유전자가 동시에 불활성화된 균주를 제작하고, 이를 CA01-2270(KCCM11016P::ΔNCgl2909ΔNCgl0350)라 명명하였다.

본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032::ΔNCgl2909는 생물막 형성능이 야생형에 비해 4~5배 정도 증가하였다. 또한, NCgl2909 또는 NCgl0350, 또는 NCgl2909 및 NCgl0350의 유전자가 불활성화된 코리네형 박테리아는 종래의 L-라이신을 생산하는 코리네형 박테리아와 비교할 때 균체량이 증가하여도 L-라이신 생산이 감소하지 않는 차별된 특징을 나타내었다.

또한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 NCgl2909 또는 NCgl0350, 또는 NCgl2909 및 NCgl0350의 유전자가 불활성화된 코리네형 박테리아를 사용하여 L-라이신 생산방법을 제공한다.

상기 L-라이신 생산방법은 NCgl2909 또는 NCgl0350, 또는 NCgl2909 및 NCgl0350의 유전자가 불활성화된 코리네형 박테리아를 배양하는 단계; 상기 배양된 박테리아 또는 배양액으로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함한다.

상기 NCgl2909 또는 NCgl0350, 또는 NCgl2909 및 NCgl0350의 유전자가 불활성화된 코리네형 박테리아를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정, 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속적으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리아 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Microbiology, Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 원하는 L-아미노산의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다. L-라이신은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.

세포 또는 배양액으로부터 L-라이신을 회수하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 상기 L-라이신 회수방법에는 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 생물막 형성 억제 활성을 가지는 NCgl2909 유전자는 특정 박테리아에만 존재하는 특이한 유전자가 아닌 것으로, 다양한 그람 음성균 및 그람 양성균의 정체기까지 배양된 박테리아의 무세포 배양액에 의해 발현이 유도되고, 그 발현 유도에 의해 생물막 형성을 억제하는 효과가 있다.

또한, 본 발명의 생물막 형성 억제 활성을 가지는 NCgl2909의 유전자를 불활성화 시킨 L-라이신 생산 균주는 균체량의 증가에도 불구하고 L-라이신 생산능이 전혀 감소하지 않는 효과가 있다.

따라서, 생물막 형성 억제 활성을 가지는 NCgl2909 또는 NCgl0350, 또는 NCgl2909 및 NCgl0350의 유전자를 불활성화 시킨 L-라이신 생산 균주를 이용하여 L-라이신 생산시 짧은 시간에 L-라이신을 고수율로 얻을 수 있는 효과가 있다.

도 1은 다양한 그람 음성균과 그람 양성균의 정체기 배양액에서 얻은 무세포 배양액의 처리에 따른 NCgl0350 유전자(서열번호 2)의 프로모터의 발현량을 growth permissive assay를 통해 확인한 도이다. 그람 음성균으로는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens (At)), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli (Ec)), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa (Pa)), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium (St)) 및 비브리오 하베이(Vibvrio harveyi (Vh))를 사용하였고, 그람 양성균으로는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis (Bs)), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes (Ca)), 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis (Ms)), 마이코박테리움 스피시스 스트레인 JC1 (Mycobacterium sp. strain JC1 (MJC1)), 스테필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus (Sa))와 스트렙토마이시스 나타렌시스(Streptomyces natalensis (Sn))을 사용하였다.
도 2(a)는 NCgl0350 유전자와 유사한 녹농균의 뉴클레오티드인 PA5238의 프로모터의 발현 정도를 측정하기 위해 pDN19lacΩ 벡터의 프로모터가 결실된 lacZ 유전자의 상단부에 PA5238의 프로모터를 연결하여 pHS1004 벡터를 제작하는 과정을 나타낸 도이고,
도 2(b)는 상기 pHS1004 벡터를 슈도모나스 애루기노사에 형질도입(transduction)하여 슈도모나스 애루기노사의 정체기 배양액에서 얻은 무세포 배양액의 농도에 비례하여 PA5238의 프로모터 발현이 유도된 것을 확인한 도이다.
도 2(c)는 pHS1004 벡터가 형질도입된 슈도모나스 애루기노사에서 PA5238 유전자 발현을 측정하는데 필요한 무세포 배양액 처리시간을 확인하는 도이다.
도 3은 도 1에서 사용된 박테리아 중 NCgl0350 유전자의 프로모터의 발현을 유도한 박테리아의 정체기 배양액에서 얻은 무세포 배양액을 이용하여 pHS1004 벡터가 형질도입된 슈도모나스 애루기노사에서 PA5238 유전자의 프로모터의 발현이 유도된 것을 확인한 도이다. 그람 음성균으로는 에스케리키아 콜라이(Ec), 살모넬라 티피뮤리움(St)를 사용하였고, 그람 양성균으로는 바실러스 서브틸리스(Bs), 코리네박테리움 글루타미쿰(Cg), 마이코박테리움 스메그마티스(Ms), 마이코박테리움 스피시스 스트레인 JC1(MJC1)과 스테필로코커스 아우레우스(Sa)를 사용하였다.
도 4는 코리네박테리움 글루타미쿰(Cg) 야생형 균주로부터 NCgl2909 유전자가 불활성화된 균주를 제작하여 야생형과 돌연변이 균주에서 NCgl0350 유전자의 프로모터의 발현을 growth permissive assay로 확인한 도이다.
도 5는 코리네박테리움 글루타미쿰의 NCgl2909 돌연변이 균주와 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 생물막 형성 정도를 확인한 도이다.
도 6은 코리네박테리움 글루타미쿰의 NCgl2909에 상동성이 있는 슈도모나스 애루기노사의 PA5309와 코리네박테리움 글루타미쿰의 NCgl0350 유전자에 상동성이 있는 슈도모나스 애루기노사의 PA5238 유전자 돌연변이 균주의 생물막 형성 정도를 야생형 균주 및 음성대조군(pilA 돌연변이 균주)와 비교한 도이다.
도 7은 슈도모나스 애루기노사의 PA5238의 프로모터 영역으로 클로닝을 위해 사용한 프라이머들과 개시코돈이 표시되어 있다.

본 발명자들은 본 발명자들이 선출원한 특허출원 제10-1134700호에서 제시한 코리네형 박테리아에서 분비되는 자가유도체(autoinducer)의 조절을 받는 폴리뉴클레오티드인 NCgl0350을 기반으로 하여 슈도모나스 애루기노사에서 유사한 폴리뉴클레오티드인 PA5238(서열번호 3)을 선별하였다. 또한 상기 PA5238을 이용하여 이 유전자의 상위에서 조절 역할을 하는 폴리뉴클레오티드를 탐색한 결과 PA5309(서열번호 4)라는 폴리뉴클레오티드를 선별하였다. 또한 상기 PA5309를 기반으로 코리네형 박테리아에서 유사 폴리뉴클레오티드인 NCgl2909(서열번호 1)를 선별하였다.

그 후 상기 선별된 서열번호 1 내지 4의 유전자를 가지는 야생형 균주와 이들이 불활성화된 돌연변이 균주를 각각 제작하여 생물막 형성에 미치는 효과를 실험한 결과 상기 서열번호 1 내지 4의 유전자를 갖는 야생형 균주에 비해 이들의 돌연변이 균주가 약 4배 정도 더 많은 생물막을 형성시키는 것을 확인하였다.

따라서 이를 통해 서열번호 1 내지 4의 유전자는 생물막 형성 억제 유전자 내지 억지 기전에 관여하는 유전자임을 확인할 수 있는 것이다.

또한, 본 발명자들은 상기 서열번호 1 또는 2, 또는 서열번호 1 및 2의 유전자를 불활성화시킨 L-라이신 생산균주의 균체증식에 따른 L-라이신 생산능을 살펴본 결과, 통상적으로 균체량이 증가할수록 L-라이신 생산효율이 감소하는 것과는 반대로, L-라이신 생산수율이 전혀 감소하지 않음을 발견하여, 이 균주를 통해 L-라이신 생산 시 종전에 비해 짧은 시간내에 많은 양의 L-라이신을 생산할 수 있음을 확인하였다.

이하에서는 본 발명을 실시예를 통해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 다양한 박테리아에서 얻은 무세포 배양액의 처리에 따른 코리네형 박테리아의 아실트랜스퍼라아제 유전자 (NCgl0350) 프로모터의 발현 유도 확인

<1-1> 세포 배양 및 무세포 배양액 처리

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032와 코리네박테리움 암모니아게네스는 MB 배지(yeast extract, 0.4%; trytone, 1%; soytone, 0.4%; and NaCl, 0.5%; all w/v)에서 30℃, 36시간 동안 교반하면서 배양하였다.

아그로박테리움 투메파시엔스, 에스케리키아 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 스피시스 스트레인 JC1, 슈도모나스 애루기노사, 스테필로로커스 아우레우스, 스트렙토마이시스 나타렌시스및 살모넬라 티피뮤리움은 LB 배지(yeast extract, 0.5%; trytone, 1%; and NaCl, 1%; all w/v)에서 37℃, 36시간 동안 교반하면서 배양하였다.

비브리오 하베이는 3% NaCl이 포함된 LB 배지에서 37℃, 36시간 동안 교반하면서 배양하였다.

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 배양액을 제외한 11 종류의 균주의 배양액을 각각 10,000×g에서 10분동안 원심분리한 후, 상등액을 셀룰로오스 아세테이트 필터(0.2 ㎛)에 통과시켜서 각 균주의 무세포 배양액을 제조하였다.

그리고 상기와 동일한 방법으로 OD₆₀₀에서 1.8이 될 때까지 배양한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 배양액으로부터 균주를 회수한 후, 위의 각 무세포 배양액과 새 배지를 1:1로 혼합한 MB 배지에 현탁하였으며, 추가로 24시간 동안 30℃에서 배양하였다.

<1-2> 무세포 배양액 처리에 따른 아실트랜스퍼라아제 유전자 프로모터의 발현 유도 확인

무세포 배양액에 의한 NCgl0350 유전자의 프로모터 발현을 측정하기 위해 본 발명자들의 선행특허출원 제10-1134700호에서 제시한 방법(본 발명에서는 이를 'growth permissive assay'이라 명명한다)을 이용하였다.

이를 더욱 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 NCgl0350 유전자의 프로모터 영역(선행특허출원 제10-1134700호의 서열번호 1)을 증폭하였다. 이 증폭된 프로모터 영역을 T&A 벡터(Real Biotech Corporation)에 삽입한 후, PstⅠ으로 절단하여 동일 효소로 절단된 pSK1CAT 벡터에 다시 클로닝하여, NCg10350의 프로모터 영역이 삽입된 pHS09004 벡터를 제조하였다.

pHS09004 벡터 제조에 사용된 상기 pSK1CAT 벡터는 그람 양성 균에서 클로람페니콜 저항성을 부여하는 클로람페니콜 아실트랜스퍼라아제를 암호화하는 cat 유전자가 포함된 프로모터가 없는 벡터이다.

위 pSK1CAT 벡터와 pHS09004 벡터를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 형질도입하여 C3와 C6(P0350:CAT) 형질전환체 균주를 각각 제작하였다.

상기 C3, C6 형질전환체 균주들을 30 ㎍/㎖의 카나마이신을 포함하는 MB 배지에서 30℃에서 밤새 배양하였다.

무세포 배양액과 MB 배지를 클로람페니콜을 포함한 상태로 1:1(v/v)의 비율로 혼합하여 제조한 분석배지 2 ml에, 상기 균주 배양액을 1:2,000의 비율로 희석하였다. 대조군으로는 클로람페니콜을 포함한 상태로 MB 배지만 단독으로 2 ml가 사용되었다. 상기 형질전환체 균주들은 24시간 동안 분석배지 및 대조군 배지에서 30℃에서 밤새 배양하였다. 스펙트로포토미터(SmartSpec 3000 spectrophotometer, Bio-Rad Laboratories, USA)로 OD₆₀₀의 값을 측정하면서, 균주의 성장을 관찰하였다.

그 결과 도 1에서 나타난 바와 같이 클로람페니콜을 포함하는 MB 배지에서 형질전환체 균주들은 전혀 생장하지 못하였으나, 무세포 배양액이 MB 배지에 1:1의 비율로 혼합된 클로람페니콜을 포함하는 배지에서 C6(P0350:CAT) 균주만 유일하게 성장하였다.

이로부터 아그로박테리움 투메파시엔스, 비브리오 하베이, 및 스트렙토마이시스 나타렌시스의 일부 박테리아의 무세포 배양액을 제외하고 아실트랜스퍼라아제 유전자의 프로모터가 다양한 박테리아에서 얻은 무세포 배양액에 의해 발현이 유도되는 것을 확인하였다.

실시예 2 : 무세포 배양액 처리에 따른 슈도모나스 애루기노사의 probable O-antigen acetylase (PA5238) 유전자 프로모터의 발현 유도 확인

<2-1> 프로모터를 포함하는 발현 벡터의 제조

상기 실시예 1에서 NCgl0350 유전자의 프로모터가 슈도모나스 애루기노사의 무세포 배양액에 의해서도 발현량이 증가함을 확인하여, 이를 바탕으로 슈도모나스 애루기노사를 이용하여 스크리닝 시스템을 구축하기 위하여 NCgl0350와 아미노산 서열 수준에서 유사한 유전자를 슈도모나스 애루기노사에서 검색하였다. 그 결과 36%의 상동성과 51%의 유사성을 보이는 서열번호 3의 probable O-antigen acetylase (PA5238) 유전자를 선별하였다.

무세포 배양액에 의한 상기 PA5238 유전자의 발현을 조사하기 위하여 PA5238 유전자의 프로모터의 발현 벡터를 도 2(a)와 같이 제조하였다.

구체적으로는 슈도모나스 애루기노사 PAK에서 게놈 DNA를 분리한 후, 표 1의 클로닝용 PCR 프라이머쌍(5238F/5238R)을 이용하여, 서열번호 7의 PA5238의 프로모터 영역을 증폭하였다.(도 7 참조)

프라이머	염기서열	서열번호
PA5238F	5’-GTGGTCATCCTGCTCGACTCCATCACC-3’	5
PA5238R	5’-CGAGGCGAACATCGTCTGGTAACGCAC-3’	6

상기 증폭된 프로모터 영역을 T&A 벡터(Real Biotech Corporation)에 삽입한 후, KpnⅠ으로 절단하여 동일 효소로 절단된 pDN19lacΩ벡터에 다시 클로닝하여 PA5238의 프로모터가 삽입된 pHS1004 벡터를 제조하였다(도 2(a) 참조).

pHS1004 벡터 제조에 사용된 상기 pDN19lacΩ 벡터는 슈도모나스 애루기노사 PAK에서 x-gal이나 ONPG를 이용한 발색반응에 관여하는 β-galactosidase를 암호화하는 lacZ 유전자가 포함된 프로모터가 없는 벡터이다.

<2-2> 무세포 배양액 처리에 따른 probable O-antigen acetylase(PA5238) 유전자 프로모터의 발현 유도 확인

상기 pDN19lacΩ벡터 및 pHS1004 벡터를 각각 야생형 슈도모나스 애루기노사 PAK에 형질 도입하여, 형질전환주 P19와 P18 (P5238:lacZ)을 제작하였다.

상기 형질전환주 P19와 P18을 각각 100 ㎍/㎖의 스펙티노마이신과 스트렙토마이신을 포함하는 LB 배지에서 37℃에서 밤새 배양하였다.

슈도모나스 애루기노사의 무세포 배양액과 LB 배지를 도 2(b)와 같이 다양한 비율(v/v)로 혼합하여 분석배지 2 ml를 제조하였으며 6시간동안 처리하였다. 상세하게는 무세포 배양액과 LB 배지의 혼합 비율을 각각 0.25 ml : 1.75 ml, 0.5 ml : 1.5 ml , 0.75 ml : 1.25 ml, 1.0 ml : 1.0 ml로 혼합하여 각 2 ml의 분석 배지들을 제조하였다. 대조군으로는 LB 배지만 단독으로 2 ml이 사용되었다.

상기 형질전환체 균주들을 도 2(c)와 같이 1.0 ml : 1.0 ml 혼합하여 총 2 ml의 분석 배지를 제조하여 다양한 처리시간 동안 분석배지에서 37℃에서 배양하였다.

β-galactosidase assay를 통해 스펙트로포토미터(SmartSpec 3000 spectrophotometer, Bio-Rad Laboratories, USA)를 이용하여 측정하여, β-galactosidase의 발현 정도를 관찰하였다.

그 결과 도 2(b)에서 나타난 바와 같이 대조군에서는 전혀 발현증가를 볼 수 없었으나, P18(P5238 : lacZ) 균주는 슈도모나스 애루기노사의 무세포 배양액의 농도에 의존하여 β-galactosidase의 발현이 증가함을 확인하였다.

또한 무세포 배양액 처리시간에 비례하여 β-galactosidase의 발현이 증가함을 확인하였고, 특히 최소한 6시간의 처리가 요구됨을 확인하였다.

이로부터 probable O-antigen acetylase (PA5238) 유전자의 프로모터가 슈도모나스 애루기노사의 무세포 배양액에 의해 발현 유도되는 것을 확인하였다.

실시예 3 : 다양한 박테리아에서 얻은 무세포 배양액 처리에 따른 슈도모나스 애루기노사의 probable O-antigen acetylase (PA5238) 유전자 프로모터의 발현 유도 확인

실시예 1의 <1-1>에서 기술한 방법과 동일한 방법으로 다양한 박테리아로부터 무세포 배양액을 제조하여 실시예 2의 <2-2>에서 기술한 β-galactosidase assay를 통해 무세포 배양액에 의한 β-galactosidase 발현정도를 조사하였다.

간략히 설명하면, 실시예 1의 <1-1>에서 기술한 방법으로 코리네박테리움 글루타미쿰, 에스케리키아 콜라이, 살모넬라 티피뮤리움, 바실러스 서브틸리스, 스테필로로커스 아우레우스, 마이코박테리움 스메그마티스 및 마이코박테리움 스피시스 스트레인 JC1의 무세포 배양액을 제조하여 β-galactosidase 발현정도를 조사한 결과, 도 1에서와 같이 코리네형 박테리아의 NCgl0350 유전자의 프로모터의 발현을 유도한 다양한 박테리아의 무세포 배양액은 슈도모나스 애루기노사의 PA5238 유전자의 프로모터의 발현 또한 증가시킴을 도 3과 같이 확인하였다.

실시예 4 : 상위 조절유전자 검출을 위한 스크리닝 실시와 검출된 유전자의 검증

<4-1> 상위 조절유전자 검출을 위한 스크리닝

실시예 3에서 확인된 슈도모나스 애루기노사의 PA5238(서열번호 3) 및 이의 프로모터(서열번호 7)를 이용하여 이의 조절에 관련된 상위 유전자를 스크리닝하였다. 스크리닝을 위하여 Mariner transposon을 가지는 pBT20 (Molecular Microbiology 55(2): 368-380, 2005)를 접합(conjugation)을 통해 pHS1004를 가지는 슈도모나스 애루기노사에 형질 도입시켰다.

Transposon이 삽입된 돌연변이 풀(mutant pool) 중에서 무세포 배양액의 처리에 대해서도 발현증가가 일어나지 않아 x-gal이 들어있는 배지에서 흰색 콜로니를 띄는 돌연변이를 검출하였으며, arbitrary PCR (Molecular Microbiology 55(2): 368-380, 2005)을 이용하여 transposon이 삽입된 유전자를 염기서열 분석방법으로 조사하였다.

조사된 유전자 중 슈도모나스 애루기노사의 PA5309(서열번호 4) 유전자가 코리네형 박테리아의 NCgl2909(서열번호 1)와 아미노산 상동성 분석에서 22% 상동성 및 39% 유사성을 가지는 것으로 나타났다.

<4-2> 검출된 상위 조절유전자 불활성화 균주 제작

상기 NCgl2909(서열번호 1) 유전자의 불활성화 균주를 제작하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ를 사용하여 NCgl2909의 ORF가 내부적으로 결실된 pDZ 유도체를 만들었다.

구체적으로는 미국 국립보건원의 유전자은행(NIH Genbank)을 근거로 하여 NCgl2909(서열번호 1) 의 서열을 확보하였으며, 이를 바탕으로 각각 프라이머 2909F1, 2909R1, 2909F2, 2909R2 를 제작하였다. 표 2는 본 발명에 사용된 프라이머들의 염기서열 및 서열번호를 나타낸다. 밑줄 친 서열은 제한효소에 대한 인식부위를 나타낸다.

프라이머	염기서열	서열번호
2909F1	5’- gctctagactctagcccaagcactc -3’	8
2909R1	5’- acggccctcatacgg cacacgaagtggcatat -3’	9
2909F2	5’- atgccacttcgtgtg ccgtatgagggccgttt -3’	10
2909R2	5’- gctctagaaccttgtactgcgccga -3’	11

pDZ-ΔNCgl2909는 NCgl2909의 상단의 250 bp의 염기서열과 하단의 140 bp의 염기서열을 포함하는 것으로, 각각 말단에 제한효소 XbaI 인식부위를 포함하도록 프라이머를 제작하였다. 또한 pDZ-ΔNCgl2909 는 NCgl2909의 내부적 유전자 소실을 포함하는 것으로, NCgl2909 내부적 유전자 소실은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 2909F1-2909R1 프라이머(서열번호 8 및 9)와 2909F2-2909R2 프라이머(서열번호 10 및 11) 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 것이다.

상기 재조합 플라스미드를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 전기천공법으로 형질전환시키고(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999), 상기 플라스미드는 1차 재조합(교차)에 의해 염색체에 도입되었다. 그 후, 10%의 수크로오스를 포함하는 고체평판배지에서 2차 재조합(교차)을 통해 염색체로부터 플라스미드를 절제(excision)하였다.

상기 2차 재조합이 완료된 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환주들을 대상으로 각 유전자 특이적 프라이머(gene-specific primer) 쌍인 2909F1-2909R2(서열번호 8 및 11) PCR을 통해 NCgl2909 유전자의 결실을 확인하였고, 본 재조합 균주를 ATCC13032::ΔNCgl2909라 명명하였다.

<4-3> 검출된 상위 조절유전자의 효과 검증

상기 제작된 균주를 이용하여 NCgl0350의 프로모터의 발현 유도에 미치는 영향을 실시예 1의 <1-2>에 기재한 growth permissive assay를 이용하여 확인하고자 하였다. pSK1CAT 벡터와 pHS09004 벡터를 각각 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 형질도입한 균주 C3와 C6(P0350:CAT), pHS09004 벡터를 ATCC13032::ΔNCgl2909에 형질도입한 균주 ATCC13032::ΔNCgl2909(P0350:CAT)를 비교하였다.

코리네박테리움 글루타미쿰에서 얻은 무세포 배양액을 이용하여 NCgl0350 유전자의 프로모터의 발현이 유도되는지 확인한 결과 도 4와 같이 C6(P0350:CAT) 형질전환체 균주에서는 프로모터의 발현이 유도되어 클로람페니콜이 들어있는 배지에서도 생장하는 반면, ATCC13032::ΔNCgl2909(P0350:CAT) 균주에서는 전혀 생장을 확인할 수 없었다. 이를 통해 NCgl2909 폴리뉴클레오티드는 무세포 배양액이 존재하는 상태에서 NCgl0350 유전자의 발현 유도 조절에 관여하는 것으로 확인하였다.

실시예 5 : NCgl2909가 생물막 형성에 미치는 효과 확인

야생형 코리네박테리움 글루타미쿰과 실시예 4에서 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032::ΔNCgl2909의 생물막 형성 정도를 비교하였다. Fletcher (Can. J. Microbiol. 23:1-6, 1977)의 방법을 이용하여, PVC(polyvinylchloride plastics) 재질로 만들어진 96 well microtiter plate에 형성되는 생물막을 조사하였다. 이를 더욱 구체적으로 설명하면, 대상 균주를 MB 배지를 이용하여 30℃에서 밤새 배양하였고, 배양균을 1 : 100으로 희석하여 각 희석된 균주 200㎕를 96 well microtiter plate의 각 well에 접종하였다. 접종된 plate를 30℃에서 1~2일 배양한 후, 200㎕의 증류수로 3회씩 헹궈주고, 0.3% 크리스탈 바이올렛 200㎕를 각 well에 넣어주었다. 그 후 plate를 상온에서 30분간 배양 후, 200㎕의 증류수로 3회씩 헹궈주었다. 상온에서 10분간 건조시킨 후, 정량적인 분석을 위해 200㎕의 95% ethanol을 크리스탈 바이올렛으로 염색된 각 well에 넣어주고 상온에서 20분간 배양 후, 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 도 5와 같이 야생형에 비해 ATCC13032::ΔNCgl2909가 약 4~5배 정도 더 많은 생물막을 형성시키는 것을 확인하였다.

실시예 6 : 생물막 억제 유전자 불활성화가 L-라이신 생산능에 미치는 효과 확인

<6-1> 라이신 생산균주 유래 생물막 억제 유전자 불활성화 균주 제작

라이신 생산 균주로부터 NCgl2909 또는 NCgl0350, 또는 NCgl2909 및 NCgl0350가 불활성화된 균주를 제작하고 이들 균주로부터 생물막 억제 유전자의 불활성화가 L-라이신 생산능에 미치는 효과를 확인하였다.

NCgl2909 유전자가 결손된 재조합 균주를 제작하기 위하여 실시예 4의 <4-2>에 기재된 재조합 플라스미드 pDZ-ΔNCgl2909를 이용하였다. pDZ-ΔNCgl2909를 라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 도입하고 형질 전환된 균주를 선별하였으며 이 재조합 균주를 KCCM11016P::ΔNCgl2909로 명명하였다.

NCgl0350(서열번호 2) 유전자의 불활성화 균주를 제작하기 위해 실시예 4의 <4-2>에 기재된 방법을 이용하여 NCgl0350의 ORF가 내부적으로 결실된 pDZ 유도체를 만들었다. 상기 유도체는 pDZ- ΔNCgl0350(도 9)이다. 표3은 본 발명에 사용된 프라이머들의 염기서열 및 서열번호를 나타낸다.

프라이머	염기서열	서열번호
0350F1	5’- cgactctagattaggtcttagttgccatgatcggt -3’	12
0350R1	5’- tgcacctaatgttgg ccatcgccagcatgaaat -3’	13
0350F2	5’- tcatgctggcgatgg ccaacattaggtgcagca -3’	14
0350R2	5’- atctctagagcagcttggcttctatttggagat -3’	15

재조합 플라스미드 pDZ-ΔNCgl0350을 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 도입하고 형질 전환된 균주를 선별하였으며 이 재조합 균주를 KCCM11016P::ΔNCgl0350으로 명명하였다.

또한 NCgl2909 및 NCgl0350가 불활성화된 균주를 제작하기 위하여 상기와 동일한 방법으로 재조합 플라스미드 pDZ-ΔNCgl0350을 NCgl2909가 불활성화된 KCCM11016P::ΔNCgl2909에 도입하여 NCgl2909 및 NCgl0350이 모두 불활성화된 균주를 선별하였으며 이 균주를 CA01-2270(KCCM11016P::ΔNCgl2909ΔNCgl0350) 으로 명명하하고 한국미생물보존센터에 2013년 6월12일 KCCM11431P로 국제기탁하였다

<6-2> 생물막 억제 유전자 불활성화 균주 L-라이신 생산능 관찰

상기와 같이 제작된 L-라이신 생산 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P::ΔNCgl2909, KCCM11016P::ΔNCgl0350 및 CA01-2270를 L-라이신 생산을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다.

하기의 종 배지 25 ㎖를 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주 KCCM11016P와 상기 3종의 재조합 균주들을 각각 접종하고, 30℃에서 20시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그 후, 하기의 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 상기 배양된 1 ㎖의 종 배양액을 각각 접종하고, 30℃에서 120시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.

<종배지 (pH 7.0)>

포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8 g, MgSO₄ 7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)

<생산배지 (pH 7.0)>

포도당 100 g, (NH₄)₂SO₄ 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH₂PO₄ 1 g, MgSO₄ 7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO₃ 30 g (증류수 1리터 기준).

배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 L-라이신의 생산량을 측정하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P과 KCCM11016P::ΔNCgl2909, KCCM11016P::ΔNCgl0350 및 CA01-2270에 대한 배양액 중의 균체량 및 L-라이신 농도를 표4에 나타내었다.

균주	균체량(OD562)			L-라이신 (g/ℓ)
균주	배치 1	배치 2	배치 3	배치 1	배치 2	배치 3
KCCM11016P	45.5	50.6	51.3	42.9	41.2	42.3
KCCM11016P::ΔNCgl2909	61.4	62.4	59.8	43.2	42.3	40.2
KCCM11016P::ΔNCgl0350	57.2	59.6	58.7	42.7	41.5	42.5
CA01-2270	64.2	66.0	65.4	43.0	41.6	42.0

표 4에서 나타낸 바와 같이, 모균주 KCCM11016P로부터 ΔNCgl2909 유전자 또는 ?Cgl0350 유전자가 불활성화된 경우 균체량이 모균주 대비 각각 24% 및 19% 가량 증가하였다. NCgl2909 유전자와 ΔNCgl0350 유전자가 동시에 불활성화된 CA01-2270 균주의 경우에는 균체량이 33% 가량 증가하였다. 반면 L-라이신 생산능은 세 균주 모두 모균주 대비 동등한 수준으로 나타내었다(표 4). 상기의 결과는 NCgl2909 및 NCgl0350 유전자의 활성이 비활성화됨으로써 균체량이 증가할 수 있으며, L-라이신 생산 균주에서 균체량 증가에 수반되는 L-라이신 수율의 하락 현상이 상기 균주에서는 나타나지 않았으므로 결과적으로 증가한 균체량에 따른 고효율 L-라이신 생산이 가능함을 의미한다.

<6-3> 다양한 L-라이신 생산균주에서의 효과 확인

상기 결과를 바탕으로 L-라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P 외의 3종의 균주로부터 NCgl2909 및 NCgl0350 유전자의 불활성화된 균주를 제작하여 동일한 효과를 나타내는지 확인하였다.

NCgl2909 및 NCgl0350 유전자가 불활성화된 균주를 제작하고 위하여 <6-1>에 제시한 방법을 사용하였다. 3종의 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P, KFCC10750(국제기탁번KCCM1137P) 및 CJ3P 균주로부터 두 유전자가 순차적으로 불활성화된 균주 3종을 제작하였고 각각의 균주를 KCCM10770P::ΔNCgl2909ΔNCgl0350, KFCC10750::ΔNCgl2909ΔNCgl0350 및 CJ3P::ΔNCgl2909ΔNCgl0350로 명명하였다.

3종의 균주와 각각의 모균주를 상기 <6-2>에서와 동일한 방법으로 배양하였고 배양액으로부터 균체량 및 L-라이신 농도를 측정하여 표 5에 나타내었다.

균주	균체량(OD562)			L-라이신 (g/ℓ)
균주	배치 1	배치 2	배치 3	배치 1	배치 2	배치 3
KCCM10770P	50.1	55.7	48.4	47.5	46.9	46.5
KCCM10770P::ΔNCgl2909ΔNCgl0350	63.0	62.0	57.3	45.6	46.6	46.8
KFCC10750	55.5	57.0	58.4	37.5	38.2	37.4
KFCC10750::ΔNCgl2909ΔNCgl0350	66.9	63.8	65.8	38.9	38.4	37.5
CJ3P	75.5	80.4	78.5	7.8	8.2	8.1
CJ3P::ΔNCgl2909ΔNCgl0350	85.5	90.1	92.1	7.5	7.9	8.0

표 5에서 나타낸 바와 같이, 각각의 모균주로부터 형질전환된 3종의 균주의 배양액 내 균체량이 증가하였다. KCCM10770P::ΔNCgl2909ΔNCgl0350 는 18%, KFCC10750::ΔNCgl2909ΔNCgl0350는 15% 그리고 CJ3P::ΔNCgl2909ΔNCgl0350 는 14%의 균체량 증가폭을 나타내었으나 L-라이신 생산량에 있어서는 모균주와 비교시 동등한 수준으로 생산되는 것을 확인하였다.

서로 다른 형질을 가지는 3종의 모균주로부터 제작된 NCgl2909 및 NCgl0350의 유전자가 불활성화된 균주로부터 균체량과 L-라이신 생산능에서 동일한 표현형이 나타나는 것을 확인함으로써 NCgl2909 및 NCgl0350 유전자의 L-라이신 생산능에 미치는 효과를 확증하였다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11431P

20130612

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> The genes for biofilm inhibition and the method for producing L-Lysine using inactivating mutants of these genes <130> PA12-0296 <160> 15 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1233 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 atgagttcgt ctggaaaagt cattgttgtt ggagccggca tagtgggtct tgccaccgcc 60 tggcatttac aggagcacgg gttcgaggtg agcgtccttg atcgggatgg tgtcgctgca 120 ggttcttcgt ggggtaatgc tggttggtta gcgccggcga aaactattcc gttgtcggag 180 ccggggctgt ggacgtatgg tccgaaagag ctgttcaatc cggtgtcgcc gatgcatatg 240 ccacttcgtg tggatcccaa actgtggctt ttcttggcgc aatttatggc gcaggctttt 300 caacgcaagt gggattccac gatggcggac ctcacggaga tcgataaggt cgcgctcgaa 360 gcttttgatg aactgtcgat cggtggcgtg gaaggcctca cccatgaagg tccatttgtt 420 attggttttg aggaagagcg ccaatcggcg ggtttccgta aggaaattga tggcgtgagc 480 aggcacggcc agaaagtgga gatgtctcga ctggagaatc cacaagagtt ggcgccgatg 540 ctgaatgagc aaattcaggt ggcttaccgt ttggaaggcc agcgtttcat cgagccgggt 600 ccatacgtgc agtcattggc ggatgctgtg gtgaagcgtg gtggcgtgat ccgcgccggg 660 gcagaagttg tgcatgtggc gaagggtgat cgtcccgcgg tcattttggc ggatggtagc 720 cgtgaagaag cggacaaggt ggttgtggca acgggtgcct ggctgccggg tctaacgcgt 780 gaatacggtg tgaaaactct tgttcaggct ggtcgtggct attccttctc tgtggcaacg 840 gatattcctg ccaagcattc tgtgtacctt ccccaccacc gcatggcctg cacgccgtat 900 gagggccgtt tccgcattgc gggcaccatg gagttccgcg gtccggatga gccgttccag 960 cagggccggg tggatgcgat tgtttcgcag gcgaagaagg ttatgagagg tattgatttc 1020 aacgatcgtc aggatgagtg ggtgggttcc cgcccggtca ctccggatgg gcgtccgttg 1080 attgggcaga ccaaggcgga gaacatttac gttgccggtg gtcacggcat gtggggtgtg 1140 gtgctgggcc ctgccaccgg taagtatttg gcggagctga tggctacggg caacaccaac 1200 ccgatcatca agccgttcga tccgctgcgt taa 1233 <210> 2 <211> 996 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 atgactacat cgacggcaac tgctaaacaa caagcttcga aaagtcattt ccgtcccgac 60 attcaaggac tgcgagccgt cgcggtactt ttagtattga tatttcatgc tggcgatggc 120 tccgtgcttt ccggaggttt tacgggtgtt gatattttct ttgtaatttc tggctacttg 180 attactggac acttgatcag gtcttgtcta gaaaagggaa aaattagttt aattaacttt 240 tatgcgggcc ggattaggag aattctgcca gcagccacag ccgttttggt attcacggcc 300 ctaattacga ttttagtgtt gcctgatacc cggtggatgc ttatcggtgc tgagatcatt 360 gcaagttcag tgtatttggt aaactggctt tttgcctcaa atacgaatta tttgaatgca 420 gaagctgctg ccagtccagt tcagcattat tggaccttat ctgtggagga gcagttctat 480 atcctctggc cagcgctact tattgggttg ttgtatttca gtcggcatcg ttttacactg 540 gactcagagg aaactagtgg cacgaaacta aacaaagttc gttggctgca gcgttatatc 600 gctttagcag ctgtacttat aacgttagtt tctctttgct tttccattta tttttcatac 660 accaatccgg cacccgcata tttcattacc tcgacacgcc tgtgggagct tggaataggc 720 gcgattctcg cctctttttc attccaatta gaacgaattt cagctccgat aggatatgcg 780 cttggtgtaa tgggattagc aagcatcgta gcagctggag tgacttttga ttctcagaca 840 gtttttcccg gctatgccgc gctggtgcca acattaggtg cagcagctgt aattattggt 900 ggcatgggag gtcgtgcgga aaaaggtgta ggtgtacttc taaaagttaa acctatgcgt 960 tggatcggag atctttccta ttcgctttat ctatag 996 <210> 3 <211> 1989 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 3 atgtcgagcc tgccttatcg aagagatatc gatggattgc gcgcactggc catcttgtcg 60 gtggtgttct atcacttggg cttgggcggt ttcaccggcg ggtatgtcgg cgtcgatgtc 120 tttctggtga tttccggcta cctgatcact tcgatcatcc ggcgcgatcg gcaggccggg 180 cgtttcagct tcgtcgattt ctgggctcgc cgggcgcgac gcatcctccc cgctttgttc 240 gttatgatgg ccgtcagcct ggcggccggc tggttcctga tggagccgcg ggactacgag 300 caattgggtc gttcggtgcg ttaccagacg atgttcgcct cgaacatcct gttctggaag 360 caggatggct atttcgacgc cgcgtccgaa ttcaagccgc tattgcatac ctggtcgttg 420 tcggtggaag agcagttcta cattctcttc ccgctactgc tggccgcgat ctccgggcgc 480 ctgctgcgct ggcggctcgc catcctcctc gcggtcctgg cgctatcgct ggcggccagc 540 gtctgggcgg tgagccagcg acctggcagt gcattcttcc tcctgccgat gcgcgcctgg 600 gaactcctgg cgggtgccgc gctggcgttg ctgccgggcg ctagccgcgg tcattcgcag 660 tggtccctgc aactggcggc caccctcggc atagcggcga ttctcctgcc ggtgttcttc 720 tacgacagcg acactccttt ccccggcctc gcggcgctgc cggcggtgct tggcaccgcc 780 ctgctgatct gggccaacgg cgccggcgac acctgggttc gccgcctgct gggctggcaa 840 ccgctggtct ggttcggtct gatctcctat tcgctgtacc tctggcactg gccgctgtac 900 gtcttcgtcc agtaccacgc actggaaacc ctgggcctgc cggcacgcct ggggttgctg 960 gcggcgagca tcggcctggc ggcactgtcg ctgtactacg tcgaggcacc gttccgcgag 1020 cgcaagctgt tcgccgggcg ccggcagatg cttggcgcgg cgctgtgcag cttgctgctg 1080 ctgggagtca tcggccagtt ggtgcggcat tacgacggcg tgccgtcgcg tctttccgag 1140 gaagccttgc gttatgccaa ggcgtccaaa tggcgcgatg ggcagaccga ctgcatgttc 1200 gacaagaagg cgctcagtca ggaaagcatc tgccgcttcc cggcggaact ggctgccgaa 1260 cgaccgctgc tggtcagttg gggcgacagc cattccgcgg cgttgagccc gctgctgcgc 1320 gaactggcta ccagtcgccg actgccgatc tggcaggctt cgctggcggg ctgtccgccg 1380 ttgctgggga tgctggaaaa ggacacttgc ctgcgtttca accagcagat gctcgagttc 1440 gtcgaacagc agcggccggg cggggtgatc ctcgccgggc gctgggacat gtatatatac 1500 ggcgactcgc aggacggtac ccgcaacatt ctccgcgagc cggacgacac gccggacagc 1560 tcgatcgccg aggcgctgct gcggcaacgc ctgagcggga tgatcgaaag gctgaacgcg 1620 gccgacgtac atgtctggct ggtcaaggac gtaccgctgc tgccattcaa ggcaccggcg 1680 cggctggtgc ggctgagtct gagcggggag gatgtcgggc gcgcacgttt tcccttcgct 1740 gagcacgctg cgcgcgtcgc ctacgtgaat gcgctgttcg atgcgttggc cgaaggcaac 1800 ccgcgggtga gcgtgctcga cccctccagc gtgctctgcg atggcctgga ttgtttcgcc 1860 gaacgtgatg gctggtcact gtacatggat aacaaccacc tttcgaccca gggggcccat 1920 gaactcgggc ctttgttcga gccgatgcta cagagcctcg acgactcgag gatcgccagc 1980 cagcagtga 1989 <210> 4 <211> 1320 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 4 atgaacgccc gcgttcacca gccggtgcat accgcccaac acgccccctc ctactacgcc 60 gccacgctca accgacgcat cgagtgccct cccctggccg gcgaagaaca ggccgacgtg 120 tgcgtcgtcg gcggcggctt ctcgggagtg aacacggcgt tggaactggc ccagcgcggc 180 ttctccgtgg tcctgctgga agcgcaccag atcggctggg gcgccagtgg acgcaatggc 240 ggccagttga tccgcggcgt cggccatgac gtcgagcagt tcctcccggt gatcggcgcc 300 gacggcgtga aggcactcaa gctgatgggc ctggaggcgg tggagatcgt ccgtcgccgg 360 gtcgagcagt acgccatcga ctgcgatctg cgctggggct actgcgacct ggcgaacaag 420 cccggcgact accagggctt ccgcgaggac atggaggaac tccaggccct cggctatcgc 480 cacgagatgc gcctggtgcc ggccgcggag atgcgcagcg tgatcggctc cgatcgctac 540 gtcggcggcc tggtggacat gggctctggc cacctgcacc cgctcaacct ggtcctcggc 600 gaagccgccg ctgcccagtc gctgggcgtc cgcctgttcg agcgctcgac ggtgatgcgg 660 atcgactacg gcacggaagt ccaggtgcat accgccaccg gcaaagtgcg ggcgaagacc 720 ctggtgctgg gctgcaacgc ctacatgaac gacctcaacc cgctgctcgg cggcaaggta 780 ctgccggccg gcagctacgt gatcgccacc gaaccgctgg acgagaaact ggcccgccaa 840 ctgctgccgc agaacatggc ggtgtgcgac cagcgcgtgg ccctcgacta ctaccggctc 900 tccgccgaca accgcctgct gttcggtggc gcctgccatt attccggccg cgaccccagc 960 gacatcgccg cctacatgcg gccgaagatg ctggaggtat tcccgcaact ggcgaacgtc 1020 cgcatcgact accaatgggg cggcatgatc ggcatcggcg ccaatcgcct gccacagatc 1080 ggccgcctgc cggggcagcc caacgtgtac ttcgcccagg cctattccgg acacggggtg 1140 aacgccacgc acctcgccgg gcagttgctc gccgaagcca tcggcggcca gcagagcgac 1200 ggcttcgacc tgttcgccaa ggtgccgcac atcaccttcc ccggcggcaa gctgctgcgc 1260 tcgccactgc tggcgctggg catggcctgg taccggctga aggaaaaact cggtagctga 1320 1320 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(PA5238F) <400> 5 gtggtcatcc tgctcgactc catcacc 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(PA5238R) <400> 6 cgaggcgaac atcgtctggt aacgcac 27 <210> 7 <211> 895 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 7 gtggtcatcc tgctcgactc catcacccgt ctggcgcggg cctacaacac cgtgatcccc 60 agctccggca aggtgctcac cggcggtgtc gacgcccatg ccctggagaa gccgaagcgc 120 ttcttcggcg ccgcgcggaa catcgaagag ggcggttctc ttacgattct cgccacggcg 180 ttggtggaaa ccggctcgaa gatggacgag gtgatctacg aggaattcaa gggtaccggc 240 aacatggaac tcccattgga tcgcaagatc gccgagaagc gcgtgttccc ggccatcaac 300 atcaaccgtt cgggtacccg ccgcgaagag ctgctgacca gcgaggacga gctccagcgc 360 atgtggatcc tgcgcaagat cctgcacccg atggacgaga tctccgcgat cgaattcctc 420 atcgacaagc tcaagcagac caagaccaac gatgagttct tcgattcgat gaaacggaag 480 tagtcttcca gggaattgaa gaaggcgctc cggtttgacc ggagcgcctt ttttcatgcc 540 tggagaaaaa tagatgtcga gcctgcctta tcgaagagat atcgatggat tgcgcgcact 600 ggccatcttg tcggtggtgt tctatcactt gggcttgggc ggtttcaccg gcgggtatgt 660 cggcgtcgat gtctttctgg tgatttccgg ctacctgatc acttcgatca tccggcgcga 720 tcggcaggcc gggcgtttca gcttcgtcga tttctgggct cgccgggcgc gacgcatcct 780 ccccgctttg ttcgttatga tggccgtcag cctggcggcc ggctggttcc tgatggagcc 840 gcgggactac gagcaattgg gtcgttcggt gcgttaccag acgatgttcg cctcg 895 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(2909F1) <400> 8 gctctagact ctagcccaag cactc 25 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(2909R1) <400> 9 acggccctca tacggcacac gaagtggcat at 32 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(2909F2) <400> 10 atgccacttc gtgtgccgta tgagggccgt tt 32 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(2909R2) <400> 11 gctctagaac cttgtactgc gccga 25 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(0350F1) <400> 12 cgactctaga ttaggtctta gttgccatga tcggt 35 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(0350R1) <400> 13 tgcacctaat gttggccatc gccagcatga aat 33 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(0350F2) <400> 14 tcatgctggc gatggccaac attaggtgca gca 33 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(0350R2) <400> 15 atctctagag cagcttggct tctatttgga gat 33

Claims

삭제
서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열의 유전자들로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 불활성화된 L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰.
삭제
제2항에 있어서,
서열번호 1 및 2의 염기서열의 유전자가 모두 불활성화된 L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰.
제2항의 코리네박테리움 글루타미쿰을 배양하는 단계 및 상기 배양된 박테리아 또는 배양액으로부터 라이신을 회수하는 단계를 포함하는 L-라이신 생산방법.
삭제
제5항에 있어서,
서열번호 1 및 2의 염기서열의 유전자가 모두 불활성화된 코리네박테리움 글루타미쿰을 배양하는 단계; 및 상기 배양된 박테리아 또는 배양액으로부터 라이신을 회수하는 단계를 포함하는 L-라이신 생산방법.