JP2017202976A - Lipid monolayer coated nanoparticles for drug delivery - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、生分解性ポリマー及び薬剤を含むコア、及び当該コアを被覆する脂質単分子層を含む、単層被覆型ナノ粒子複合体に関する。当該複合体は、その表面にターゲッティング分子を結合しているものであってもよい。あるいは、当該複合体は、その表面にプラスミドＤＮＡが吸着または結合しているものであってもよい。本出願はさらに、当該複合体を含む医薬組成物に関する。 The present application relates to a monolayer-coated nanoparticle composite comprising a core comprising a biodegradable polymer and a drug, and a lipid monolayer covering the core. The complex may have a targeting molecule bound to its surface. Alternatively, the complex may have a plasmid DNA adsorbed or bound to the surface thereof. The application further relates to a pharmaceutical composition comprising the complex.
中枢神経系疾患の発病原因の１つとして、脳の神経細胞内で活性酸素種が増加することにより細胞の変性やアポトーシスが誘導される事象が指摘されている。脳神経細胞内に抗酸化剤を送達させ、脳内で抗酸化を行うことでこれら神経変性疾患の治療へのアプローチとなることが期待される。しかし、脳内に抗酸化剤を送達させるにあたり、血液脳関門（ＢＢＢ）と呼ばれる障壁が存在する。ＢＢＢは脳血管内皮細胞がタイトジャンクションによって密に結合した構造をしており、脳毛細血管から神経細胞へのあらゆる物質の侵入を物理的に阻害している。脳神経細胞内に抗酸化剤を送達するにあたっては、ＢＢＢを通過するためのドラッグデザインが必須であるが、この目的を達成可能なキャリアは少なく、さらなる研究開発が臨まれている。 As one of the causes of central nervous system diseases, it has been pointed out that cell degeneration and apoptosis are induced by the increase of reactive oxygen species in brain neurons. It is expected that an antioxidant will be delivered into the brain neurons and the antioxidant in the brain will be an approach to the treatment of these neurodegenerative diseases. However, there is a barrier called the blood brain barrier (BBB) in delivering antioxidants into the brain. BBB has a structure in which cerebral vascular endothelial cells are tightly connected by tight junctions, and physically inhibits the entry of all substances from brain capillaries into nerve cells. In order to deliver an antioxidant to brain neurons, a drug design for passing through the BBB is essential, but there are few carriers that can achieve this purpose, and further research and development are underway.
ところで、１９６０年代以降、ヒストンのアセチル化と緊密なクロマチン構造のリモデリングが、遺伝子誘導と関係していることが認識されてきたが、遺伝子が転写因子とヒストンアセチル化によって転写活性化される分子機序がよく理解されるようになったのは、つい最近のことである。遺伝子発現制御にはクロマチン構造の変化が重要であり、このようにクロマチンの構造変化により遺伝子発現の制御を行う機構はエピジェネティクス機構と呼ばれている。クロマチン構造は前述したヒストンアセチル化やＤＮＡ／ヒストンのメチル化などの後天的な化学修飾により変化し、この後天的修飾は様々な要因で起こり得るものである。また、近年ではエピジェネティクな異常が疾患の発症、病理の悪化に関係することが報告されており、疾患治療においてはエピジェネティクな異常を正常化することを考慮に入れる必要がある。 By the way, since the 1960s, it has been recognized that histone acetylation and close remodeling of chromatin structure are related to gene induction. However, molecules whose transcription is activated by transcription factors and histone acetylation. It is only recently that the mechanism is well understood. Changes in chromatin structure are important for gene expression control, and such a mechanism for controlling gene expression by structural change of chromatin is called an epigenetic mechanism. The chromatin structure is changed by an acquired chemical modification such as histone acetylation or DNA / histone methylation as described above, and this acquired modification can be caused by various factors. In recent years, it has been reported that epigenetic abnormalities are related to the onset of disease and pathological deterioration, and it is necessary to take into account normalizing epigenetic abnormalities in the treatment of diseases.
生分解性ポリマーおよび脂質を含む粒子を用いて薬剤または遺伝子を送達する試みが当該技術分野においてなされてきた（特許文献１及び２、非特許文献１及び２）。また、生分解性ポリマーおよび脂質を含む粒子を用いて薬剤を送達する試みにおいて、特定の細胞や組織への送達を意図して脂質に細胞表面レセプターのリガンドを結合させる試みがなされている（非特許文献３〜６）。 Attempts to deliver drugs or genes using particles containing biodegradable polymers and lipids have been made in the art (Patent Documents 1 and 2, Non-Patent Documents 1 and 2). In addition, in an attempt to deliver a drug using particles containing a biodegradable polymer and a lipid, an attempt has been made to bind a ligand of a cell surface receptor to a lipid with the intention of delivery to a specific cell or tissue. Patent documents 3 to 6).
しかし、経鼻投与のために最適化された粒子の構成は検討されておらず、また、薬剤および遺伝子の両方を送達して、エピジェネティクス制御による遺伝子発現制御を行う試みもなされていない。 However, the composition of particles optimized for nasal administration has not been studied, and no attempt has been made to control gene expression by epigenetic control by delivering both drugs and genes.
上述のように、脳神経細胞内への薬剤の送達や、エピジェネティックな異常に対する治療のための、新しいドラッグデザインの開発が求められている。本出願は、生分解性ポリマーおよび脂質を含むナノ粒子について、これらのドラッグデザイン開発の観点から適したキャリアを提供する。すなわち、本出願は、生分解性ポリマー及び薬剤を含むコア、及び当該コアを被覆する脂質単分子層を含む、単層被覆型ナノ粒子複合体を提供する。当該複合体は、その表面にターゲッティング分子を結合しているものであってもよい。あるいは、当該複合体は、その表面にプラスミドＤＮＡが吸着または結合しているものであってもよい。本出願はさらに、当該複合体を含む医薬組成物を提供する。 As described above, there is a need for the development of new drug designs for the delivery of drugs into brain neurons and the treatment of epigenetic abnormalities. The present application provides carriers suitable for these drug design development viewpoints for nanoparticles comprising biodegradable polymers and lipids. That is, the present application provides a monolayer-coated nanoparticle composite comprising a core comprising a biodegradable polymer and a drug, and a lipid monolayer that coats the core. The complex may have a targeting molecule bound to its surface. Alternatively, the complex may have a plasmid DNA adsorbed or bound to the surface thereof. The application further provides a pharmaceutical composition comprising the complex.
以上に鑑み、本件の発明者は、生分解性ポリマーおよび脂質を含むナノ粒子キャリアに注目し、研究を開始した。鋭意検討の結果、経鼻投与による神経保護のための複合体およびエピジェネティクス制御するための複合体として適したキャリアの構成を見いだした。当該知見に基づいて、本発明は完成された。 In view of the above, the inventor of the present case has paid attention to a nanoparticle carrier containing a biodegradable polymer and a lipid, and has started research. As a result of intensive studies, we found a carrier composition suitable as a complex for neuroprotection by nasal administration and a complex for controlling epigenetics. Based on this finding, the present invention has been completed.
すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。 That is, in one aspect, the present invention may be as follows.
［１］経鼻投与による神経保護のための複合体であって、単層被覆型ナノ粒子、薬剤、およびターゲッティング分子を含み、
ここで、当該脂質単層被覆型ナノ粒子は、生分解性ポリマーを含むコア及び当該コアをコートする脂質単分子層を含み、
当該薬剤は、生分解性ポリマーを含むコア中に存在し、そして
当該ターゲッティング分子は、当該脂質単層被覆型ナノ粒子の表面に結合している、前記複合体。
[1] A complex for neuroprotection by nasal administration, comprising a monolayer-coated nanoparticle, a drug, and a targeting molecule,
Here, the lipid monolayer-coated nanoparticles include a core containing a biodegradable polymer and a lipid monolayer that coats the core,
The complex wherein the agent is present in a core comprising a biodegradable polymer, and the targeting molecule is bound to the surface of the lipid monolayer-coated nanoparticle.
［２］生分解性ポリマーが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）共重合体、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、およびキトサン、からなる群より選択される、上記［１］に記載の複合体。 [2] The biodegradable polymer described in [1] above, wherein the biodegradable polymer is selected from the group consisting of polylactic acid, polyglycolic acid, poly (lactide-co-glycolide) copolymer, polycaprolactone, polydioxanone, and chitosan. Complex.
［３］脂質が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾されたジアシルホスファチジルエタノールアミンである、
ここで、当該アシル基は、炭素数が１２〜２０の飽和または不飽和アシル基であり；そして、
当該ポリエチレングリコールは、分子量２，０００〜１００，０００であり、一方の末端はジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に連結しており、および、他方の末端においてタンパク質と連結可能な基を有するものである；
上記［１］又は［２］に記載の複合体。
[3] The lipid is diacylphosphatidylethanolamine modified with polyethylene glycol (PEG).
Wherein the acyl group is a saturated or unsaturated acyl group having 12 to 20 carbon atoms; and
The polyethylene glycol has a molecular weight of 2,000 to 100,000, one end is linked to the amino group of diacylphosphatidylethanolamine, and the other end has a group that can be linked to a protein. ;
The complex according to [1] or [2] above.
［４］ターゲッティング分子が、ラクトフェリンまたはコムギ胚芽凝集素であり、そして当該ターゲッティング分子は、当該脂質と共有結合することにより、当該脂質単層被覆型ナノ粒子の表面に結合している、上記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の複合体。 [4] The targeting molecule is lactoferrin or wheat germ agglutinin, and the targeting molecule is bound to the surface of the lipid monolayer-coated nanoparticle by covalently binding to the lipid. ] The complex of any one of [3].
［５］薬剤が、抗酸化剤であり、当該抗酸化剤は以下：ポルフィリン系抗酸化剤、フタロシアニン系抗酸化剤、アスコルビン酸、グルタチオン、尿酸、メラトニン、ウロビリノーゲン、トコフェロール類、トコトリエノール類、カロテノイド、キサントフィル類、ポリフェノール、フラボノイド類、からなる群より選択される、上記［１］〜［４］のいずれか１項に記載の複合体。 [5] The drug is an antioxidant, and the antioxidant is as follows: porphyrin antioxidant, phthalocyanine antioxidant, ascorbic acid, glutathione, uric acid, melatonin, urobilinogen, tocopherols, tocotrienols, carotenoids, The complex according to any one of [1] to [4] above, which is selected from the group consisting of xanthophylls, polyphenols, and flavonoids.
［６］抗酸化剤が、ポルフィリン系抗酸化剤であり、当該ポルフィリン系抗酸化剤は、
下記式（Ｉ）で表されるカチオン性金属ポルフィリン錯体：
[6] The antioxidant is a porphyrin antioxidant, and the porphyrin antioxidant is
Cationic metalloporphyrin complex represented by the following formula (I):
（式中、
Ｍは錯体を形成するための金属原子を示し、
Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、およびＡｒ４、はそれぞれ独立して無置換のまたは置換基を有してもよい炭素環式または複素環式芳香族基を示し、そしてＡｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、およびＡｒ４、の少なくとも１つはカチオン性の基を有する芳香族基である）；および
下記式（ＩＩ）で表されるカチオン性金属ポルフィリンダイマー：
(Where
M represents a metal atom for forming a complex;
Ar 1 , Ar 2 , Ar 3 , and Ar 4 each independently represent an unsubstituted or optionally substituted carbocyclic or heterocyclic aromatic group, and Ar 1 , Ar 2 , At least one of Ar 3 and Ar 4 is an aromatic group having a cationic group); and a cationic metalloporphyrin dimer represented by the following formula (II):
（式中、
Ｍは錯体を形成するための金属原子を示し、
Ａｒ１およびＡｒ１’はピリジンを示し、ここでピリジンの１位はＸに、４位がポルフィリンにそれぞれ結合しており、
Ａｒ２、Ａｒ３、およびＡｒ４、並びに、Ａｒ２’、Ａｒ３’、およびＡｒ４’、はそれぞれ独立して無置換のまたは置換基を有してもよい炭素環式または複素環式芳香族基を示し、
Ｘは、−ＣＨ２−フェニル−ＣＨ２−であるか、下記式（ＩＩＩ）ないし（Ｖ）のいずれかで表される：
−Ｃ２Ｈ４−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２）ａ− ・・・・ （ＩＩＩ）
（式中、ａは、１〜１０の整数を示す）
−Ｃ２Ｈ４−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２− ・・・ （ＩＶ）
−Ｃ３Ｈ６−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２− ・・・（Ｖ）
（式中、ｂは３〜５の整数を示す））
からなる群より選択される、上記［５］に記載の複合体。
(Where
M represents a metal atom for forming a complex;
Ar 1 and Ar 1 ′ represent pyridine, wherein 1-position of pyridine is bonded to X and 4-position is bonded to porphyrin,
Ar 2 , Ar 3 , and Ar 4 , and Ar 2 ′, Ar 3 ′, and Ar 4 ′ are each independently an unsubstituted or optionally substituted carbocyclic or heterocyclic fragrance Indicates a group,
X is —CH 2 -phenyl-CH 2 — or represented by any of the following formulas (III) to (V):
-C 2 H 4 - (NH- CH 2 CH 2) a - ···· (III)
(Wherein, a represents an integer of 1 to 10)
-C 2 H 4 - (NH- CH 2 CH 2 CH 2) b-NH-CH 2 CH 2 - ··· (IV)
-C 3 H 6 - (NH- CH 2 CH 2 CH 2) b-NH-CH 2 CH 2 CH 2 - ··· (V)
(In the formula, b represents an integer of 3 to 5))
The complex according to [5] above, which is selected from the group consisting of:
［７］上記［１］ないし［６］のいずれか１項に記載の複合体を含む、医薬組成物。 [7] A pharmaceutical composition comprising the complex according to any one of [1] to [6] above.
［８］脳疾患を治療するための、上記［１］ないし［６］のいずれか１項に記載の複合体を含む、医薬組成物。 [8] A pharmaceutical composition comprising the complex according to any one of the above [1] to [6] for treating a brain disease.
［９］薬剤と遺伝子を対象に共送達することによりエピジェネティクス制御するための複合体であって、当該複合体は脂質単層被覆型ナノ粒子、薬剤、およびプラスミドＤＮＡを含み、
ここで、当該脂質単層被覆型ナノ粒子は、生分解性ポリマーを含むコア及び当該コアをコートする脂質単分子層を含み、
当該薬剤は生分解性ポリマーを含むコア中に存在し、そして、
当該プラスミドＤＮＡは、当該脂質単層被覆型ナノ粒子の表面に吸着または結合している、前記複合体。
[9] A complex for controlling epigenetics by co-delivery of a drug and a gene to a subject, the complex including lipid monolayer-coated nanoparticles, a drug, and plasmid DNA,
Here, the lipid monolayer-coated nanoparticles include a core containing a biodegradable polymer and a lipid monolayer that coats the core,
The agent is present in a core comprising a biodegradable polymer, and
The complex, wherein the plasmid DNA is adsorbed or bound to the surface of the lipid monolayer-coated nanoparticle.
［１０］生分解性ポリマーが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）共重合体、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、およびキトサン、からなる群より選択される、上記［９］に記載の複合体。 [10] The above-mentioned [9], wherein the biodegradable polymer is selected from the group consisting of polylactic acid, polyglycolic acid, poly (lactide-co-glycolide) copolymer, polycaprolactone, polydioxanone, and chitosan. Complex.
［１１］脂質が、以下：
ステアリルアミン；
１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；
ジアシルホスファチジルエタノールアミン；
Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；
１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
オレイルアミン；および
１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）；
からなる群より選択される、上記［９］又は［１０］に記載の複合体。
[11] The lipid is:
Stearylamine;
1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammoniumpropane (DOTAP);
Diacylphosphatidylethanolamine;
N- (2,3-dioleoyloxy) propyl-N, N, N-trimethylammonium (DOTMA);
1,2-dioleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE);
Oleylamine; and 1,2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylammonium (DMRIE);
The complex according to [9] or [10] above, selected from the group consisting of:
［１２］ジアシルホスファチジルエタノールアミンが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾されたジアシルホスファチジルエタノールアミンであり、
ここで、当該アシル基は、炭素数が１２〜２０の飽和または不飽和アシル基であり；そして、
当該ポリエチレングリコールは、分子量２，０００〜１００，０００であり、一方の末端はジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に連結しており、および、他方の末端においてリガンドと結合している；
上記［１１］に記載の複合体。
[12] diacylphosphatidylethanolamine is diacylphosphatidylethanolamine modified with polyethylene glycol (PEG);
Wherein the acyl group is a saturated or unsaturated acyl group having 12 to 20 carbon atoms; and
The polyethylene glycol has a molecular weight of 2,000-100,000, one end linked to the amino group of diacylphosphatidylethanolamine, and the other end bound to a ligand;
The complex according to [11] above.
［１３］薬剤が、以下：
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤；
ヒストンメチル化酵素阻害剤；および
ヒストン脱メチル化酵素阻害剤；からなる群より選択される、上記［９］〜［１２］のいずれか１項に記載の複合体。
[13] The drug is:
Histone deacetylase inhibitors;
The complex according to any one of [9] to [12], selected from the group consisting of: a histone methylase inhibitor; and a histone demethylase inhibitor.
［１４］プラスミドＤＮＡが、以下：
エピジェネティクスの制御に関わる酵素またはタンパク質をコードするＤＮＡ；
エピジェネティクスの制御に関わる酵素またはタンパク質の発現を抑制するアンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ；および
エピジェネティクスの制御に関わる酵素またはタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ；
からなる群より選択されるＤＮＡを含む、上記［９］〜［１３］のいずれか１項に記載の複合体。
[14] Plasmid DNA is as follows:
DNA encoding an enzyme or protein involved in the control of epigenetics;
DNA encoding an antisense nucleic acid or double-stranded RNA that suppresses the expression of an enzyme or protein involved in epigenetic control; and DNA encoding an antibody or fragment thereof that binds to the enzyme or protein involved in epigenetic control ;
The complex according to any one of [9] to [13] above, which comprises DNA selected from the group consisting of:
［１５］上記［９］〜［１５］のいずれか１項に記載の複合体を含む、医薬組成物。 [15] A pharmaceutical composition comprising the complex according to any one of [9] to [15] above.
本発明の複合体は、生分解性ポリマーのコアを脂質単層で被覆した構造を有することにより、安定性が向上しており、薬剤および／またはプラスミドＤＮＡを目的の組織に送達するためのキャリアとして有用である。 The complex of the present invention has a structure in which a core of a biodegradable polymer is coated with a lipid monolayer, so that stability is improved, and a carrier for delivering a drug and / or plasmid DNA to a target tissue Useful as.
以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。 The present invention will be specifically described below, but the present invention is not limited thereto. Unless defined otherwise herein, scientific and technical terms used in connection with the present invention shall have the meanings that are commonly understood by those of ordinary skill in the art.
経鼻投与による神経保護のための複合体
一態様において、本出願は、経鼻投与による神経保護のための複合体であって、脂質単層被覆型ナノ粒子、薬剤、およびターゲッティング分子を含む、前記複合体に関する。当該脂質単層被覆型ナノ粒子は生分解性ポリマーを含むコア及び当該コアをコートする脂質単分子層を含み、当該薬剤は生分解性ポリマーを含むコア中に存在し、そして、当該ターゲッティング分子は当該脂質単層被覆型ナノ粒子の表面に結合している。
Complexes for neuroprotection by nasal administration In one embodiment, the application is a complex for neuroprotection by nasal administration, comprising a lipid monolayer-coated nanoparticle, a drug, and a targeting molecule. It relates to the complex. The lipid monolayer-coated nanoparticles comprise a core comprising a biodegradable polymer and a lipid monolayer that coats the core, the drug is present in the core comprising the biodegradable polymer, and the targeting molecule is It binds to the surface of the lipid monolayer-coated nanoparticle.
脂質単層被覆型ナノ粒子、薬剤、およびターゲッティング分子で構成される複合体を調製する手順は、図１の模式図に示される構造が調製される限りにおいて特に制限はない。例えば、生分解性ポリマーおよび薬剤の溶液を、脂質溶液中に滴下し、合わせた溶液を超音波処理により粒子を形成することで、薬剤を含む脂質単層被覆型ナノ粒子を形成することができる。ターゲッティング分子を、当該脂質単層被覆型ナノ粒子の表面に共有結合させることで、脂質単層被覆型ナノ粒子をターゲティング分子で修飾することができる。複合体を形成する条件は、当業者が適宜選択することができる。 The procedure for preparing a complex composed of lipid monolayer-coated nanoparticles, a drug, and a targeting molecule is not particularly limited as long as the structure shown in the schematic diagram of FIG. 1 is prepared. For example, a lipid monolayer-coated nanoparticle containing a drug can be formed by dropping a solution of a biodegradable polymer and a drug into a lipid solution and forming particles by sonication of the combined solution. . By covalently binding the targeting molecule to the surface of the lipid monolayer-coated nanoparticle, the lipid monolayer-coated nanoparticle can be modified with a targeting molecule. Conditions for forming the complex can be appropriately selected by those skilled in the art.
単層被覆型ナノ粒子のコアとなる生分解性ポリマー、単層被覆型ナノ粒子のコアをコートする脂質、薬剤、およびターゲッティング分子としては、以下に詳述するものを用いることができる。 As the biodegradable polymer serving as the core of the monolayer-coated nanoparticle, the lipid, the drug, and the targeting molecule that coat the core of the monolayer-coated nanoparticle, those described in detail below can be used.
生分解性ポリマーは、特に限定されないが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）共重合体、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、およびキトサン、からなる群より選択される生分解性ポリマーである。 The biodegradable polymer is not particularly limited, and is a biodegradable polymer selected from the group consisting of polylactic acid, polyglycolic acid, poly (lactide-co-glycolide) copolymer, polycaprolactone, polydioxanone, and chitosan. is there.
経鼻投与による神経保護のための複合体について用いられる脂質は、ポリエチレングリコールで修飾されたジアシルホスファチジルエタノールアミンであり、当該アシル基は、炭素数が１２〜２０、好ましくは炭素数が１６〜２０、さらに好ましくは炭素数が１８の飽和または不飽和アシル基であり、そして、当該ポリエチレングリコールは分子量（Ｍｗ）２，０００〜１００，０００、好ましくは５，０００〜８０，０００、５，０００〜５０，０００、または８，０００〜３０，０００、であり、一方の末端はジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に連結しており、および、他方の末端においてタンパク質と連結可能な基を有する。 The lipid used for the complex for neuroprotection by nasal administration is diacylphosphatidylethanolamine modified with polyethylene glycol, and the acyl group has 12 to 20 carbon atoms, preferably 16 to 20 carbon atoms. More preferably, it is a saturated or unsaturated acyl group having 18 carbon atoms, and the polyethylene glycol has a molecular weight (Mw) of 2,000 to 100,000, preferably 5,000 to 80,000, 5,000 to 50,000, or 8,000 to 30,000, one end is linked to the amino group of diacylphosphatidylethanolamine, and the other end has a group that can be linked to the protein.
上記のような脂質の具体例としては、以下の構造を有する脂質が挙げられる。 Specific examples of the lipid as described above include lipids having the following structure.
［式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１３−１９アルキルまたはＣ１３−１９アルケニル、好ましくはＣ１５−１９アルキルまたはＣ１５−１９アルケニル、さらに好ましくはＣ１７アルキルであり；
Ｒ３は、タンパク質と連結可能な基であり；
ｎは、５０〜２２００の間の整数、好ましくは１００〜１８００、１００〜１０００、１５０〜７００、または１５０〜４００の間の整数である］
「タンパク質と連結可能な基」は、タンパク質のアミノ基、カルボキシル基またはチオール基と共有結合可能な基であれば特に限定されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、マレイミド基、アルデヒド基、が挙げられる。
[Where:
R 1 and R 2 are each independently C 13-19 alkyl or C 13-19 alkenyl, preferably C 15-19 alkyl or C 15-19 alkenyl, more preferably C 17 alkyl;
R 3 is a group that can be linked to a protein;
n is an integer between 50 and 2200, preferably between 100 and 1800, between 100 and 1000, between 150 and 700, or between 150 and 400]
The “group that can be linked to protein” is not particularly limited as long as it is a group that can be covalently bonded to the amino group, carboxyl group, or thiol group of the protein, and examples thereof include amino group, carboxyl group, maleimide group, and aldehyde group. It is done.
経鼻投与による神経保護のための複合体について用いられるターゲッティング分子は、鼻腔内の細胞に存在するレセプターに対するリガンドであれば特に限定されないが、例えば、ラクトフェリン、コムギ胚芽凝集素が挙げられる。ターゲッティング分子は、上記脂質におけるタンパク質と連結可能な基と共有結合を形成することで、脂質単層被覆型ナノ粒子の表面に提示される。 The targeting molecule used for the complex for neuroprotection by nasal administration is not particularly limited as long as it is a ligand for a receptor present in cells in the nasal cavity, and examples thereof include lactoferrin and wheat germ agglutinin. The targeting molecule is presented on the surface of the lipid monolayer-coated nanoparticle by forming a covalent bond with a group that can be linked to the protein in the lipid.
経鼻投与による神経保護のための複合体について用いられる薬剤は、特に限定されないが、抗酸化剤がこれに含まれる。抗酸化剤の例として、例えば、ポルフィリン系抗酸化剤、フタロシアニン系抗酸化剤、アスコルビン酸、グルタチオン、尿酸、メラトニン、ウロビリノーゲン、トコフェロール類、トコトリエノール類、カロテノイド、キサントフィル類、ポリフェノール、フラボノイド類、が挙げられる。 Agents used for the complex for neuroprotection by nasal administration are not particularly limited, but include antioxidants. Examples of antioxidants include, for example, porphyrin antioxidants, phthalocyanine antioxidants, ascorbic acid, glutathione, uric acid, melatonin, urobilinogen, tocopherols, tocotrienols, carotenoids, xanthophylls, polyphenols, flavonoids It is done.
ポルフィリン系抗酸化剤として、例えば、カチオン性金属ポルフィリン錯体またはカチオン性金属ポルフィリンダイマーが挙げられる。 Examples of the porphyrin antioxidant include a cationic metal porphyrin complex or a cationic metal porphyrin dimer.
カチオン性金属ポルフィリン錯体は、下記の式（Ｉ）： The cationic metalloporphyrin complex has the following formula (I):
で表される化合物であってもよい。 The compound represented by these may be sufficient.
前記式（Ｉ）における中心金属Ｍは、特に制限はないが、好ましくは遷移金属である。例えば、中心金属Ｍは、マンガン原子、ニッケル原子、鉄原子、銅原子、コバルト原子、および亜鉛原子からなる群より選択することができる。さらに好ましい中心金属はマンガン原子である。 The central metal M in the formula (I) is not particularly limited, but is preferably a transition metal. For example, the central metal M can be selected from the group consisting of manganese atoms, nickel atoms, iron atoms, copper atoms, cobalt atoms, and zinc atoms. A more preferred central metal is a manganese atom.
前記式（Ｉ）におけるＡｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、およびＡｒ４、はそれぞれ独立して無置換のまたは置換基を有してもよい炭素環式または複素環式芳香族基である。当該芳香族基は、単環式のものでも、多環式のものでも、あるいは、縮合環式のものであってもよい。炭素環式の芳香族基としては例えば、炭素数６〜３６、好ましくは６〜２０の単環式、多環式、または縮合環式の炭素環式芳香族基が挙げられる。これには例えば、ベンゼン環、ナフタレン環などから誘導される基が挙げられる。複素環式の芳香族基としては、１個または２個異常の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を有する５〜１０員の単環式、多環式、または縮合環式の複素環から誘導される基である。これには例えば、イミダゾール環、ピリジン環、ピリミジン環、アゾール環などから誘導される基である。好ましい芳香族基としては、フェニル基や２−イミダゾリル基などが挙げられる。 Ar 1 , Ar 2 , Ar 3 , and Ar 4 in the formula (I) are each independently an unsubstituted or optionally substituted carbocyclic or heterocyclic aromatic group. The aromatic group may be monocyclic, polycyclic, or condensed cyclic. Examples of the carbocyclic aromatic group include monocyclic, polycyclic, or condensed cyclic carbocyclic aromatic groups having 6 to 36 carbon atoms, preferably 6 to 20 carbon atoms. This includes, for example, groups derived from benzene rings, naphthalene rings and the like. Heterocyclic aromatic groups are derived from 5- to 10-membered monocyclic, polycyclic, or condensed heterocyclic rings having one or two abnormal nitrogen, oxygen or sulfur atoms. It is a group. This is, for example, a group derived from an imidazole ring, a pyridine ring, a pyrimidine ring, an azole ring or the like. Preferable aromatic groups include a phenyl group and a 2-imidazolyl group.
前記式（Ｉ）のＡｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、およびＡｒ４の少なくとも１つはカチオン性の基を有する芳香族基である。芳香族基が有するカチオン性の基としては、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１０、さらに好ましくは炭素数１〜５程度の直鎖状または分枝状のアルキル基などによりカチオン化されたアンモニウム基やスルホニウム基などが挙げられるが、第四級アンモニウム基が好ましい。これらのカチオン性の基は芳香族基に直接結合していてもよいが、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１０、さらに好ましくは炭素数１〜５程度の直鎖状または分枝状のアルキレン基を解して結合していてもよい、また、カチオン性の基は芳香族基の置換基として有していてもよいが、芳香族基の異種原子、好ましくは窒素原子が炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１０、さらに好ましくは１〜５程度の直鎖状または分枝状のアルキル基などによりカチオン化されたものであってもよい。このような芳香族基としては、例えば、４−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノフェニル基、４−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアミノフェニル基などの４−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリ低級アルキルアミノフェニル基、Ｎ−メチル−４−ピリジル基、Ｎ−エチル−４−ピリジル基などのＮ−低級アルキル−４−ピジリル基、Ｎ，Ｎ’−ジ置換イミダゾール基などが挙げられる。また、これらのカチオン性の基を有する芳香族基が、フェニル基やナフチル基などの炭素環式芳香族基に直接またはアルキレン基、アミド基、またはエステル基などを解して結合した基となっていてもよい。 At least one of Ar 1 , Ar 2 , Ar 3 , and Ar 4 in the formula (I) is an aromatic group having a cationic group. The cationic group of the aromatic group is cationized with a linear or branched alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, preferably 1 to 10 carbon atoms, and more preferably about 1 to 5 carbon atoms. And quaternary ammonium groups are preferred. These cationic groups may be directly bonded to an aromatic group, but are linear or branched having 1 to 20 carbon atoms, preferably 1 to 10 carbon atoms, more preferably about 1 to 5 carbon atoms. Or a cationic group may be substituted as a substituent of the aromatic group, but a hetero atom of the aromatic group, preferably a nitrogen atom is a carbon atom. It may be cationized by a linear or branched alkyl group having 1 to 20, preferably 1 to 10 carbon atoms, more preferably about 1 to 5 carbon atoms. Examples of such aromatic groups include 4-N, N, N-tri-lower alkylamino such as 4-N, N, N-trimethylaminophenyl group and 4-N, N, N-triethylaminophenyl group. Examples thereof include N-lower alkyl-4-pyridyl groups such as phenyl group, N-methyl-4-pyridyl group, and N-ethyl-4-pyridyl group, and N, N′-disubstituted imidazole group. In addition, the aromatic group having such a cationic group is a group bonded directly to a carbocyclic aromatic group such as a phenyl group or a naphthyl group or through an alkylene group, an amide group, or an ester group. It may be.
これらの芳香族基は、置換基を有していてもよい。芳香族基が有していてもよい置換基としては、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１０、さらに好ましくは１〜５の直鎖状または分枝状のアルキル基、アミノ基、前記したアルキル基で置換されているアミノ基、前記したアルキル基を含むアルコキシ基などが挙げられる。 These aromatic groups may have a substituent. As the substituent that the aromatic group may have, a linear or branched alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, preferably 1 to 10 carbon atoms, more preferably 1 to 5 carbon atoms, an amino group, Examples thereof include an amino group substituted with the aforementioned alkyl group, an alkoxy group containing the aforementioned alkyl group, and the like.
カチオン性金属ポルフィリンダイマーは、下記の式（ＩＩ）： The cationic metalloporphyrin dimer has the following formula (II):
で表される化合物であってもよい。 The compound represented by these may be sufficient.
前記式（ＩＩ）における中心金属Ｍは、特に制限はないが、好ましくは遷移金属である。例えば、中心金属Ｍは、マンガン原子、ニッケル原子、鉄原子、銅原子、コバルト原子、および亜鉛原子からなる群より選択することができる。さらに好ましい中心金属はマンガン原子である。 The central metal M in the formula (II) is not particularly limited but is preferably a transition metal. For example, the central metal M can be selected from the group consisting of manganese atoms, nickel atoms, iron atoms, copper atoms, cobalt atoms, and zinc atoms. A more preferred central metal is a manganese atom.
前記式（ＩＩ）におけるＡｒ１およびＡｒ１’はピリジンを示し、ここでピリジンの１位はＸに、４位がポルフィリンにそれぞれ結合している。 Ar 1 and Ar 1 ′ in the formula (II) represent pyridine, where the 1-position of pyridine is bonded to X and the 4-position is bonded to porphyrin.
前記式（ＩＩ）におけるｒ２、Ａｒ３、およびＡｒ４、並びに、Ａｒ２’、Ａｒ３’、およびＡｒ４’、はそれぞれ独立して無置換のまたは置換基を有してもよい炭素環式または複素環式芳香族基である。当該芳香族基は、単環式のものでも、多環式のものでも、あるいは、縮合環式のものであってもよい。炭素環式の芳香族基としては例えば、炭素数６〜３６、好ましくは６〜２０の単環式、多環式、または縮合環式の炭素環式芳香族基が挙げられる。これには例えば、ベンゼン環、ナフタレン環などから誘導される基が挙げられる。複素環式の芳香族基としては、１個または２個異常の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を有する５〜１０員の単環式、多環式、または縮合環式の複素環から誘導される基である。これには例えば、ピリジン環、ピリミジン環、アゾール環などおから誘導される基である。好ましい芳香族基としては、フェニル基や４−ピリジル基などが挙げられる。 In the formula (II), r 2 , Ar 3 , and Ar 4 and Ar 2 ′, Ar 3 ′, and Ar 4 ′ are each independently an unsubstituted or optionally substituted carbocycle. Is a formula or heterocyclic aromatic group. The aromatic group may be monocyclic, polycyclic, or condensed cyclic. Examples of the carbocyclic aromatic group include monocyclic, polycyclic, or condensed cyclic carbocyclic aromatic groups having 6 to 36 carbon atoms, preferably 6 to 20 carbon atoms. This includes, for example, groups derived from benzene rings, naphthalene rings and the like. Heterocyclic aromatic groups are derived from 5- to 10-membered monocyclic, polycyclic, or condensed heterocyclic rings having one or two abnormal nitrogen, oxygen or sulfur atoms. It is a group. Examples thereof include groups derived from pyridine ring, pyrimidine ring, azole ring and the like. Preferable aromatic groups include a phenyl group and a 4-pyridyl group.
これらの芳香族基は、置換基を有していてもよい。芳香族基が有していてもよい置換基としては、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１０、さらに好ましくは１〜５の直鎖状または分枝状のアルキル基、アミノ基、前記したアルキル基で置換されているアミノ基、前記したアルキル基を含むアルコキシ基などが挙げられる。 These aromatic groups may have a substituent. As the substituent that the aromatic group may have, a linear or branched alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, preferably 1 to 10 carbon atoms, more preferably 1 to 5 carbon atoms, an amino group, Examples thereof include an amino group substituted with the aforementioned alkyl group, an alkoxy group containing the aforementioned alkyl group, and the like.
前記式（ＩＩ）において、Ｘは、−ＣＨ２−フェニル−ＣＨ２−であるか、下記式（ＩＩＩ）ないし（Ｖ）のいずれかで表される：
−Ｃ２Ｈ４−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２）ａ− ・・・・ （ＩＩＩ）
（式中、ａは、１〜１０の整数を示す）
−Ｃ２Ｈ４−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２− ・・・ （ＩＶ）
−Ｃ３Ｈ６−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２− ・・・（Ｖ）
（式中、ｂは３〜５の整数を示す）
好ましくは、Ｘは−ＣＨ２−フェニル−ＣＨ２−である。
In the formula (II), X is —CH 2 -phenyl-CH 2 — or represented by any one of the following formulas (III) to (V):
-C 2 H 4 - (NH- CH 2 CH 2) a - ···· (III)
(Wherein, a represents an integer of 1 to 10)
-C 2 H 4 - (NH- CH 2 CH 2 CH 2) b-NH-CH 2 CH 2 - ··· (IV)
-C 3 H 6 - (NH- CH 2 CH 2 CH 2) b-NH-CH 2 CH 2 CH 2 - ··· (V)
(Wherein b represents an integer of 3 to 5)
Preferably X is —CH 2 -phenyl-CH 2 —.
経鼻投与による神経保護のための複合体を含む医薬組成物
別の態様において、本出願は、上記の経鼻投与による神経保護のための複合体を含む医薬組成物に関する。
Pharmaceutical Composition Containing Complex for Neuroprotection by Nasal Administration In another aspect, the present application relates to a pharmaceutical composition comprising the complex for neuroprotection by nasal administration as described above.
経鼻投与は、鼻腔内への噴霧または吸引により行うことができる。鼻腔内への噴霧は、所定の容量の複合体を、空気又は人体に悪影響のないガス（窒素ガス、アルゴンガス、二酸化炭素ガス、代替フロンガス等）とともに鼻腔内へ噴霧することにより達成できる。噴霧は、当該技術分野において通常用いられている経鼻投与用器具を使用することができる。吸引による経鼻投与は、本発明の組成物の一定量をカプセルまたはブリスターパック等に充填し、これを吸引器具に装着して吸引することにより行うことができる。 Nasal administration can be performed by spraying or aspiration into the nasal cavity. Nebulization into the nasal cavity can be achieved by spraying a predetermined volume of the complex into the nasal cavity together with air or a gas that does not adversely affect the human body (nitrogen gas, argon gas, carbon dioxide gas, alternative chlorofluorocarbon gas, etc.). For spraying, a nasal administration device usually used in the art can be used. Nasal administration by suction can be carried out by filling a certain amount of the composition of the present invention into a capsule or blister pack and attaching it to a suction device for suction.
経鼻投与のための医薬組成物は、本発明の複合体の他、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、保存剤、防腐剤等を含んでいてもよい。 The pharmaceutical composition for nasal administration may contain a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, preservative, preservative and the like in addition to the complex of the present invention.
経鼻投与による神経保護のための複合体を含む医薬組成物の有効投与量は病態や患者により相違するが、一般には、薬剤がポルフィリン系抗酸化剤である場合、１日あたり抗酸化剤が１μｇ〜１ｇになるように投与することができる。本発明の医薬組成物は、１回で投与する、１日数回にわけて投与する、あるいは、連続的に投与する。医師をはじめとする医療従事者は、患者の属性および／または病態等に応じて、本発明の医薬組成物の投与量、投与間隔、投与時間、投与手順、投与部位等の用法または用量を適宜決定することができる。そのようにして適宜決定される用法または用量で投与される本発明の医薬組成物もまた、本発明の範囲内である。 The effective dosage of the pharmaceutical composition containing the complex for neuroprotection by nasal administration varies depending on the pathological condition and the patient. Generally, when the drug is a porphyrin antioxidant, It can administer so that it may become 1 microgram-1g. The pharmaceutical composition of the present invention is administered once, divided into several times a day, or continuously. Doctors and other medical personnel appropriately determine the dosage or administration interval, administration time, administration procedure, administration site, etc. of the pharmaceutical composition of the present invention according to the patient's attributes and / or pathological conditions. Can be determined. Also within the scope of the invention are pharmaceutical compositions of the invention that are administered in such a manner or dosage determined accordingly.
本発明の、経鼻投与による神経保護のための複合体を含む医薬組成物による予防や治療に適する疾患としては、脳への薬剤送達が治療のために好ましい疾患が挙げられる。このような疾患の例としては、特に限定されるものではないが、アルツハイマー型認知症やパーキンソン病などの脳疾患が挙げられる。 Examples of the disease suitable for prevention and treatment by the pharmaceutical composition containing the complex for neuroprotection by nasal administration of the present invention include those for which drug delivery to the brain is preferable for treatment. Examples of such diseases include, but are not limited to, brain diseases such as Alzheimer's dementia and Parkinson's disease.
エピジェネティクス制御するための複合体
一態様において、本出願は、薬剤と遺伝子を対象に共送達することによりエピジェネティクス制御するための複合体であって、脂質単層被覆型ナノ粒子、薬剤、およびプラスミドＤＮＡを含む、前記複合体に関する。当該脂質単層被覆型ナノ粒子は生分解性ポリマーを含むコア及び当該コアをコートする脂質単分子層を含み、当該薬剤は生分解性ポリマーを含むコア中に存在し、そして、当該プラスミドＤＮＡは当該脂質単層被覆型ナノ粒子の表面に吸着または結合している。
Complexes for Epigenetics Control In one aspect, the present application provides a complex for epigenetics control by co-delivering a drug and a gene to a subject, the lipid monolayer-coated nanoparticle, the drug And the complex comprising plasmid DNA. The lipid monolayer-coated nanoparticles comprise a core comprising a biodegradable polymer and a lipid monolayer that coats the core, the agent is present in the core comprising the biodegradable polymer, and the plasmid DNA is Adsorbed or bound to the surface of the lipid monolayer-coated nanoparticles.
脂質単層被覆型ナノ粒子、薬剤、およびプラスミドＤＮＡで構成される複合体を調製する手順は、図２の模式図に示される構造が調製される限りにおいて特に制限はない。例えば、生分解性ポリマー、薬剤および脂質の溶液に貧溶媒を添加した後、撹拌して粒子を形成することで、薬剤を含む脂質単層被覆型ナノ粒子を形成することができる。プラスミドＤＮＡと脂質単層被覆型ナノ粒子とを混合して、当該脂質単層被覆型ナノ粒子の表面に吸着または結合させることで、プラスミドＤＮＡと脂質単層被覆型ナノ粒子を複合化することができる。複合体を形成する条件は、当業者が適宜選択することができる。 The procedure for preparing a complex composed of lipid monolayer-coated nanoparticles, a drug, and plasmid DNA is not particularly limited as long as the structure shown in the schematic diagram of FIG. 2 is prepared. For example, a lipid monolayer-coated nanoparticle containing a drug can be formed by adding a poor solvent to a biodegradable polymer, drug and lipid solution and then stirring to form particles. The plasmid DNA and the lipid monolayer-coated nanoparticles can be mixed and adsorbed or bound to the surface of the lipid monolayer-coated nanoparticles, thereby combining the plasmid DNA and the lipid monolayer-coated nanoparticles. it can. Conditions for forming the complex can be appropriately selected by those skilled in the art.
単層被覆型ナノ粒子のコアとなる生分解性ポリマー、単層被覆型ナノ粒子のコアをコートする脂質、薬剤、およびターゲッティング分子としては、以下に詳述するものを用いることができる。 As the biodegradable polymer serving as the core of the monolayer-coated nanoparticle, the lipid, the drug, and the targeting molecule that coat the core of the monolayer-coated nanoparticle, those described in detail below can be used.
生分解性ポリマーは、特に限定されないが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）共重合体、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、およびキトサン、からなる群より選択される生分解性ポリマーである。 The biodegradable polymer is not particularly limited, and is a biodegradable polymer selected from the group consisting of polylactic acid, polyglycolic acid, poly (lactide-co-glycolide) copolymer, polycaprolactone, polydioxanone, and chitosan. is there.
エピジェネティクス制御するための複合体について用いられる脂質は、生分解性ポリマー粒子の表面上で単分子層を形成可能な脂質であれば、特に限定されないが、例えば、以下：
ステアリルアミン；
１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；
ジアシルホスファチジルエタノールアミン；
Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；
１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
オレイルアミン；
１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）；
が挙げられる。
The lipid used for the complex for controlling epigenetics is not particularly limited as long as it is a lipid capable of forming a monomolecular layer on the surface of the biodegradable polymer particle.
Stearylamine;
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane (DOTAP);
Diacylphosphatidylethanolamine;
N- (2,3-dioleoyloxy) propyl-N, N, N-trimethylammonium (DOTMA);
1,2-dioleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE);
Oleylamine;
1,2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylammonium (DMRIE);
Is mentioned.
ジアシルホスファチジルエタノールアミンは、上記「経鼻投与による神経保護のための複合体」の項目において記載した、ポリエチレングリコールで修飾されたジアシルホスファチジルエタノールアミンであってもよい。この場合において、ポリエチレングリコールの一方の末端はジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に連結しており、および、他方の末端においてリガンドと結合している。リガンドは、特に限定されないが、本発明の複合体を送達することが好ましい細胞、組織等に存在するリガンドであってよい。一態様において、リガンドと結合しているポリエチレングリコールで修飾されたジアシルホスファチジルエタノールアミンは、以下の構造を有する脂質であってよい。 The diacylphosphatidylethanolamine may be a diacylphosphatidylethanolamine modified with polyethylene glycol as described above in the section “Complex for neuroprotection by nasal administration”. In this case, one end of polyethylene glycol is linked to the amino group of diacylphosphatidylethanolamine and is linked to the ligand at the other end. The ligand is not particularly limited, and may be a ligand present in cells, tissues, etc., for which it is preferable to deliver the complex of the present invention. In one embodiment, the polyethylene glycol modified diacylphosphatidylethanolamine conjugated to the ligand may be a lipid having the following structure:
［式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１３−１９アルキルまたはＣ１３−１９アルケニル、好ましくはＣ１５−１９アルキルまたはＣ１５−１９アルケニル、さらに好ましくはＣ１７アルキルであり；
Ｒ３は、リガンドである；
ｎは、５０〜２２００の間の整数、好ましくは１００〜１８００、１００〜１０００、１５０〜７００、または１５０〜４００の間の整数である］
エピジェネティクス制御するための複合体について用いられる薬剤は、特に限定されないが、例えば、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（例えば、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、スラミン（Suramin））、ヒストンメチル化酵素阻害剤（例えば、ＥＺＨ２の阻害剤であるEPZ005687（１−シクロペンチル−Ｎ−［（１，２−ジヒドロ−４，６−ジメチル−２−オキソ−３−ピリジニル）メチル］−６−[４−（４−モルホリニルメチル）フェニル］−１Ｈ−インダゾール−４−カルボキサミド））、ヒストン脱メチル化酵素阻害剤（例えば、アデノシン−２’，３’−ジアルデヒド（Adox））が挙げられる。
[Where:
R 1 and R 2 are each independently C 13-19 alkyl or C 13-19 alkenyl, preferably C 15-19 alkyl or C 15-19 alkenyl, more preferably C 17 alkyl;
R 3 is a ligand;
n is an integer between 50 and 2200, preferably between 100 and 1800, between 100 and 1000, between 150 and 700, or between 150 and 400]
Agents used for the complex for controlling epigenetics are not particularly limited, and examples thereof include histone deacetylase inhibitors (eg, trichostatin A (TSA), suramin), histone methylase inhibition Agents (eg, EPZ005687 (1-cyclopentyl-N-[(1,2-dihydro-4,6-dimethyl-2-oxo-3-pyridinyl) methyl] -6- [4- (4 -Morpholinylmethyl) phenyl] -1H-indazole-4-carboxamide)), histone demethylase inhibitors (eg adenosine-2 ′, 3′-dialdehyde (Adox)).
プラスミドＤＮＡは、本願の複合体に含まれるプラスミドＤＮＡは、特に限定されないが、本願の複合体を適用する対象において、酵素またはタンパク質の発現量または活性を変調することができるものである。このようなプラスミドＤＮＡとして、例えば、酵素またはタンパク質をコードするＤＮＡ；対象において酵素またはタンパク質の発現を抑制するアンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ；あるいは、酵素またはタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ；を含むプラスミドＤＮＡが挙げられる。 The plasmid DNA contained in the complex of the present application is not particularly limited, but is capable of modulating the expression level or activity of an enzyme or protein in a subject to which the complex of the present application is applied. Examples of such plasmid DNA include DNA encoding an enzyme or protein; DNA encoding an antisense nucleic acid or double-stranded RNA that suppresses expression of the enzyme or protein in a subject; or an antibody that binds to the enzyme or protein or Plasmid DNA containing the DNA encoding the fragment.
酵素またはタンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡは、本願の複合体が適用された対象において当該酵素またはタンパク質を発現する。それにより、当該酵素またはタンパク質の発現量を増加させることができる。 Plasmid DNA containing DNA encoding an enzyme or protein expresses the enzyme or protein in a subject to which the complex of the present application is applied. Thereby, the expression level of the enzyme or protein can be increased.
対象において酵素またはタンパク質の発現を抑制するアンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡは、本願の複合体が適用された対象においてアンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡを発現する。それにより、アンチセンス核酸の作用またはＲＮＡ干渉の作用に基づいて、当該酵素またはタンパク質の発現を抑制することができる。 Plasmid DNA containing an antisense nucleic acid or DNA encoding a double-stranded RNA that suppresses the expression of an enzyme or protein in the subject expresses the antisense nucleic acid or double-stranded RNA in the subject to which the complex of the present application is applied. Thereby, the expression of the enzyme or protein can be suppressed based on the action of the antisense nucleic acid or the action of RNA interference.
酵素またはタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントをコードするＤＮＡは、本願の複合体が適用された対象において当該酵素またはタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントを発現する。それにより、当該酵素またはタンパク質の活性が抑制または亢進する。特定の酵素またはタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントは当業者に周知の方法により作製することができ、またそれらをコードするＤＮＡも当業者は適宜同定することができる。抗体のフラグメントは、特に限定されないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖが含まれる。 DNA encoding an antibody or fragment thereof that binds to an enzyme or protein expresses an antibody or fragment thereof that binds to the enzyme or protein in a subject to which the complex of the present application has been applied. Thereby, the activity of the enzyme or protein is suppressed or enhanced. Antibodies or fragments thereof that bind to specific enzymes or proteins can be produced by methods well known to those skilled in the art, and DNAs that encode them can be appropriately identified by those skilled in the art. Antibody fragments include, but are not limited to, Fab, F (ab ′) 2 , Fab ′, Fv, scFv.
エピジェネティクス制御するための複合体を含む医薬組成物
別の態様において、本出願は、上記のエピジェネティクス制御するための複合体を含む医薬組成物に関する。
Pharmaceutical composition comprising a complex for controlling epigenetics In another aspect, the present application relates to a pharmaceutical composition comprising a complex for controlling epigenetics as described above.
本発明の医薬組成物は、経口投与、または、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、もしくは経直腸投与などの非経口投与により投与することができる。経口投与に適した製剤には、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、溶液剤、シロップ剤などが挙げられる。非経口投与に適した製剤として、本発明の医薬組成物を無菌溶液または坐剤として調製してもよい。本発明の医薬組成物は公知の方法により製剤化することができ、投与方法や患者により適宜製剤することができる。例えば、本発明の医薬組成物は、本発明の抗酸化剤と遺伝子を対象に共送達するための複合体を有効成分として含有し、これに製薬上許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着香料、着色剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などと共に公知の方法により製剤化することができる。 The pharmaceutical composition of the present invention can be administered by oral administration or parenteral administration such as intravenous administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, or rectal administration. Formulations suitable for oral administration include tablets, capsules, powders, granules, solutions, syrups and the like. As a formulation suitable for parenteral administration, the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared as a sterile solution or suppository. The pharmaceutical composition of the present invention can be formulated by a known method, and can be appropriately formulated depending on the administration method and patient. For example, the pharmaceutical composition of the present invention contains, as an active ingredient, a complex for co-delivering the antioxidant of the present invention and a gene to a subject, and a pharmaceutically acceptable carrier such as an excipient, It can be formulated by a known method together with a binder, a disintegrant, a lubricant, a flavoring agent, a coloring agent, a solubilizing agent, a suspending agent, a coating agent and the like.
本発明の医薬組成物の有効投与量は、病態や患者により相違するが、一般的には、１日あたり抗酸化剤が１μｇ〜１ｇ、プラスミドＤＮＡが０．６ｍｇ〜６００ｍｇになるように投与することができる。本発明の医薬組成物は、１回で投与する、１日数回にわけて投与する。あるいは、連続的に投与する。医師をはじめとする医療従事者は、患者の属性および／または病態等に応じて、本発明の医薬組成物の投与量、投与間隔、投与時間、投与手順、投与部位等の用法または用量を適宜決定することができる。そのようにして適宜決定される用法または用量で投与される本発明の医薬組成物もまた、本発明の範囲内である。 The effective dose of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the disease state and patient, but in general, it is administered so that the antioxidant is 1 μg to 1 g and the plasmid DNA is 0.6 mg to 600 mg per day. be able to. The pharmaceutical composition of the present invention is administered once, divided into several times a day. Alternatively, it is administered continuously. Doctors and other medical personnel appropriately determine the dosage or administration interval, administration time, administration procedure, administration site, etc. of the pharmaceutical composition of the present invention according to the patient's attributes and / or pathological conditions. Can be determined. Also within the scope of the invention are pharmaceutical compositions of the invention that are administered in such a manner or dosage determined accordingly.
本発明の抗酸化剤と遺伝子を対象に共送達するための複合体を有効成分とする医薬組成物による予防や治療に適する疾患としては、エピジェネティクスの異常で引き起こされる疾患が挙げられる。このような疾患の例としては、特に限定されるものではないが、例えば炎症性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの炎症性疾患、大腸がん、乳がん、糖尿病、アルツハイマー型認知症等が挙げられる。 Diseases suitable for prevention and treatment with a pharmaceutical composition comprising a complex for co-delivery of an antioxidant of the present invention and a gene to a subject as an active ingredient include diseases caused by abnormal epigenetics. Examples of such diseases include, but are not limited to, inflammatory diseases such as inflammatory lung disease (COPD), colon cancer, breast cancer, diabetes, Alzheimer's dementia and the like.
以下に本発明の具体例を示す。これらの具体例は、本発明を理解するための説明を提供することを目的とするものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。 Specific examples of the present invention are shown below. These examples are intended to provide an illustration for understanding the invention and are not intended to limit the scope of the invention.
実施例１：ＭｎｄＭＩｍＰ ３ Ｐの製造
（１）Ｈ ２ ＭＩｍＰ ３ Ｐ（５−（１−メチルイミダゾール−２−イル）−１０，１５，２０−トリフェニル−２１Ｈ,２３Ｈ−ポルフィリン）の合成
５００ｍｌの三つ口フラスコにプロピオン酸３００ｍｌを加え、１７０℃にて３０分間攪拌・還流した。温度一定後、ベンズアルデヒド７．８６ｍｌ、１−メチル−２−イミダゾールカルボキシアルデヒド４．０ｇを加え、続いて精製したピロールを８ｍｌ加えた。１時間加熱攪拌後、９０℃まで放冷し、エチレングリコール２００ｍｌを滴下した。室温まで放冷した後、冷蔵庫で一晩静置した。冷却後の溶液を吸引濾過し、冷やしたメタノール洗浄した後に紫粉末の６種類のポルフィリンからなる混合物を回収した。得られたポルフィリンの混合物を、シリカゲルクロマトグラフィーによりメタノール：クロロホルム＝１：２０の溶媒で溶出させ、２番目に溶出してきたＨ２ＭＩｍＰ３Ｐを回収した。ロータリーエバポレーターで分画の溶媒を留去し、目的のポルフィリンを得た。
（２）Ｈ ２ ｄＭＩｍＰ ３ Ｐ（５−（１，３−ジメチルイミダゾリウム−２−イル）−１０，１５，２０−トリフェニル−２１Ｈ,２３Ｈ−ポルフィリン）の合成
前記（１）で得たポルフィリンＨ２ＭＩｍＰ３Ｐをクロロホルム１０ｍｌに溶解させ、１００ｍｌ三つ口フラスコに加え、続いてヨードメタン１０ｍｌを加え、４０℃で１８時間還流した。ロータリーエバポレーターにより、反応混合物の溶媒を留去し、目的物となるＨ２ｄＭＩｍＰ３Ｐを回収した。合成の確認は、１Ｈ−ＮＭＲとＵＶ−ｖｉｓスペクトルで行った。
Example 1: MndMImP 3 P of manufacture (1) H 2 MImP 3 P (5- (1- methyl-imidazol-2-yl) -10,15,20 triphenyl-21H, 23H-porphyrin) synthesis 500ml of To the three-necked flask, 300 ml of propionic acid was added and stirred and refluxed at 170 ° C. for 30 minutes. After the temperature was fixed, 7.86 ml of benzaldehyde and 4.0 g of 1-methyl-2-imidazolecarboxaldehyde were added, followed by 8 ml of purified pyrrole. After heating and stirring for 1 hour, the mixture was allowed to cool to 90 ° C., and 200 ml of ethylene glycol was added dropwise. After cooling to room temperature, it was left overnight in a refrigerator. The solution after cooling was subjected to suction filtration, and after washing with cooled methanol, a mixture composed of six types of porphyrins of purple powder was recovered. The obtained porphyrin mixture was eluted with a solvent of methanol: chloroform = 1: 20 by silica gel chromatography, and H 2 MImP 3 P eluted second was collected. The solvent of the fraction was distilled off with a rotary evaporator to obtain the desired porphyrin.
(2) Synthesis of H 2 dMImP 3 P (5- (1,3-dimethylimidazolium-2-yl) -10,15,20-triphenyl-21H, 23H-porphyrin) Porphyrin obtained in (1) above H 2 MImP 3 P was dissolved in 10 ml of chloroform, added to a 100 ml three-necked flask, followed by 10 ml of iodomethane, and refluxed at 40 ° C. for 18 hours. The solvent of the reaction mixture was distilled off by a rotary evaporator, and H 2 dMimP 3 P as a target product was recovered. The synthesis was confirmed by 1 H-NMR and UV-vis spectrum.
Ｈ２ｄＭＩｍＰ３Ｐの極大吸収波長：λｍａｘ ４６３ｎｍ（ｓｏｒｅｔ帯）
Ｈ２ｄＭＩｍＰ３Ｐの１Ｈ−ＮＭＲ：９．１０（２Ｈ）（ジメチルイミダゾリウムの４，５位の水素原子）８．９０（４Ｈ）（ピロールのβ位の水素原子）８．７６（４Ｈ）（ピロールのβ位水素原子）８．２１（６Ｈ）（フェニル基のオルト位の水素原子）７．８１（９Ｈ）（フェニル基のメタ、パラ位の水素原子）−２．６３（２Ｈ）（環内部の水素原子）
（３）Ｈ ２ ｄＭＩｍＰ ３ ＰへのＭｎ導入
１００ｍｌの三つ口フラスコに前記（２）で得られたＨ２ｄＭＩｍＰ３Ｐを加えて、メタノールに溶解させた後、１０当量の酢酸マンガン４水和物を加え、５０℃で加熱還流し、ＵＶ−可視スペクトルを用いてポルフィリンのソーレー帯のシフトおよび吸光度変化から金属導入の確認ができるまで反応を行った。反応終了後、エバポレートすることで溶媒を留去した。得られた固体を水に再溶解させ、ヘキサフルオロリン酸アンモニウムを適量加え、吸引濾過し、濾紙上の緑色固体を回収した。ろ物を適量のメタノールに溶解させ、イオン交換樹脂（Ｃｌ−）を用いたカラムを行い、ＭｎポルフィリンのカウンターイオンをＣｌ−に交換した。合成の確認はＵＶスペクトル測定およびＦＡＢ−ＭＡＳＳで行った。結果を次に示す。
Maximum absorption wavelength of H 2 dMimP 3 P: λmax 463 nm (soret band)
1 H-NMR of H 2 dMimP 3 P: 9.10 (2H) (hydrogen atom at positions 4 and 5 of dimethylimidazolium) 8.90 (4H) (hydrogen atom at β position of pyrrole) 8.76 (4H ) (Β-position hydrogen atom of pyrrole) 8.21 (6H) (hydrogen atom in the ortho position of the phenyl group) 7.81 (9H) (meta of the phenyl group, hydrogen atom in the para position) -2.63 (2H) (Hydrogen atom in the ring)
(3) Introducing Mn into H 2 dMImP 3 P To a 100 ml three-necked flask, H 2 dMImP3P obtained in (2) above was added and dissolved in methanol, then 10 equivalents of manganese acetate tetrahydrate The mixture was heated to reflux at 50 ° C., and the reaction was performed using a UV-visible spectrum until the introduction of metal was confirmed from the shift of the porphyrin's Soret band and the change in absorbance. After completion of the reaction, the solvent was distilled off by evaporation. The obtained solid was redissolved in water, an appropriate amount of ammonium hexafluorophosphate was added, and suction filtration was performed to collect a green solid on the filter paper. The filtrate was dissolved in an appropriate amount of methanol and subjected to a column using an ion exchange resin (Cl − ) to exchange the counter ion of Mn porphyrin with Cl − . The synthesis was confirmed by UV spectrum measurement and FAB-MASS. The results are shown below.
Ｈ２ｄＭＩｍＰ３Ｐの極大吸収波長：４６７ｎｍ（ｓｏｒｅｔ帯）ＦＡＢ−ＭＡＳＳ測定において、目的物の分子量である６８６にピークが観測された。 Maximum absorption wavelength of H 2 dMImP 3 P: 467 nm (soret band) In FAB-MASS measurement, a peak was observed at 686 which is the molecular weight of the target product.
ＭｎｄＭＩｍＰ３Ｐの構造式： Structural formula of MndMImP 3 P:
なお、実施例２以降は、“ＭｎｄＭＩｍＰ３Ｐ”を単に“ＭｎＰ”と記載することがある。 In the second and subsequent examples, “MndMImP 3 P” may be simply referred to as “MnP”.
実施例２：ラクトフェリン（Ｌｆ）修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の合成
（１）ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の調製
次式：
Example 2: Synthesis of lactoferrin (Lf) modified MnP-containing lipid monolayer-coated particles (1) Preparation of MnP-containing lipid monolayer-coated particles The following formula:
で表されるＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ ３．７５ｍｇと、４ｗｔ％エタノール３．７５ｍｌを１０ｍｌバイアル瓶に加え、６５℃で加熱することで完全に溶解させた。溶解後、１００ｍｌビーカー中で、蒸留水（ＤＷ）で１００ｍｌまでメスアップした（ａ）。ＰＬＧＡ（ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）共重合体／Mw 10000） ２５ｍｇとＭｎＰ ０．５ｍｇをアセトニトリル１０ｍｌに加え、スターラー攪拌している上記（ａ）にピペッターで滴下した。滴下後、５分間超音波処理し、粒子を形成した。形成した粒子の含まれる溶液を５０ｍｌ遠沈管２本に移し入れ、遠心分離（１２５００ｒｐｍ，２０分×２回）により粒子の精製を行うことでＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子分散液を得た。粒径は１１１±２５ｎｍ、ゼータ電位は−６４ｍＶの値を示した。
（２）Ｌｆのチオール化
Ｌｆ ３１．２ｍｇをホウ酸バッファー（ＢＢ：０．１Ｍ，ｐＨ８．５）１ｍｌに加え、冷蔵庫内で３時間攪拌した。２−イミノチオラン１ｍｇをＢＢ ２ｍｌに溶解し、上記のＬｆを含む溶液に１００μｌ添加し、Ｎ２フロー下で１時間反応させた。反応終了後、ＢＢ ４ｍｌを追加し、１００μｌサンプリングした。その後、リン酸バッファー（ＰＢ：５０ｍＭ，ｐＨ７．４）１００ｍｌを加えた２００ｍｌビーカーで分画分子量１０ｋＤａの透析膜を用い、３日間透析を行った。反応後溶液を遠心分離（１４５００ｒｐｍ，４℃，２０分×２回）し、上澄を回収することで凝集体を除去した。また、反応後溶液として１００μｌサンプリングした。
DSPE-PEG2000-Mal 3.75 mg and 4.75% ethanol 3.75 ml were added to a 10 ml vial and heated at 65 ° C. to completely dissolve. After dissolution, the solution was made up to 100 ml with distilled water (DW) in a 100 ml beaker (a). 25 mg of PLGA (poly (lactide-co-glycolide) copolymer / Mw 10000) and 0.5 mg of MnP were added to 10 ml of acetonitrile, and the mixture was added dropwise to the above-mentioned (a) under stirring with a pipetter. After dripping, the particles were sonicated for 5 minutes to form particles. The solution containing the formed particles was transferred to two 50 ml centrifuge tubes and purified by centrifugation (12500 rpm, 20 minutes × 2 times) to obtain a MnP-containing lipid monolayer-coated particle dispersion. The particle diameter was 111 ± 25 nm, and the zeta potential was −64 mV.
(2) 31.2 mg of Lf thiolated Lf was added to 1 ml of borate buffer (BB: 0.1 M, pH 8.5), and the mixture was stirred in a refrigerator for 3 hours. 1 mg of 2-iminothiolane was dissolved in 2 ml of BB, 100 μl was added to the above solution containing Lf, and the mixture was reacted for 1 hour under N 2 flow. After completion of the reaction, 4 ml of BB was added and 100 μl was sampled. Thereafter, dialysis was carried out for 3 days using a dialysis membrane having a fractional molecular weight of 10 kDa in a 200 ml beaker to which 100 ml of phosphate buffer (PB: 50 mM, pH 7.4) was added. After the reaction, the solution was centrifuged (14500 rpm, 4 ° C., 20 minutes × 2 times), and aggregates were removed by collecting the supernatant. In addition, 100 μl was sampled as a solution after the reaction.
反応前後のサンプリングした溶液でアミノ基定量及びチオール基定量を行い、チオール化率を次式： Amino group quantification and thiol group quantification are performed on the sampled solution before and after the reaction, and the thiolation rate is expressed by
により算出した。反応後のＬｆのチオール化率は５６％と算出された。
（３）Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の合成
チオール化したＬｆとＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の表面に存在するマレイミド基のモル比が２：１になるように、チオール化したＬｆ溶液３０μｌとＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子分散液１．８ｍｌを１０ｍｌバイアル瓶中で、室温で１０時間攪拌させた。反応後、フリーのＬｆを除くために遠心分離（１２５００ｒｐｍ，２０分間，４℃×２回）で精製を行うことでＬｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子分散液を得た。上澄溶液を分注しておき、上澄溶液中に含まれるタンパク量を定量することで、ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子へのＬｆ修飾量を算出した。粒子１つあたり、１４４個のＬｆが修飾されている結果となった。粒径は１７１±４８ｎｍ、ゼータ電位は−１５ｍＶの値を示した。
Calculated by The thiolation rate of Lf after the reaction was calculated to be 56%.
(3) Synthesis of Lf-modified MnP-containing lipid monolayer-coated particles: Thiolated so that the molar ratio of thiolated Lf and maleimide groups present on the surface of MnP-containing lipid monolayer-coated particles was 2: 1. 30 μl of Lf solution and 1.8 ml of MnP-containing lipid monolayer-coated particle dispersion were stirred in a 10 ml vial at room temperature for 10 hours. After the reaction, in order to remove free Lf, purification was performed by centrifugation (12500 rpm, 20 minutes, 4 ° C. × 2 times) to obtain an Lf-modified MnP-containing lipid monolayer-coated particle dispersion. The supernatant solution was dispensed, and the amount of Lf modification to the MnP-containing lipid monolayer-coated particles was calculated by quantifying the amount of protein contained in the supernatant solution. As a result, 144 Lf were modified per particle. The particle diameter was 171 ± 48 nm, and the zeta potential was −15 mV.
実施例３：Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の細胞表面への結合評価
細胞表面への結合評価は、ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来細胞）を用いて行った。ＰＣ１２細胞の培養は、１０％ＨＳ、５％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて５％ＣＯ２、４℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、２×１０４細胞／ウェルの細胞密度で４８ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子、Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子を各種濃度が１０μＭになるように添加し、４時間培養後、培地を除去し、３度の培地洗浄により細胞膜にリガンドとレセプターの相互作用以外で付着している各種粒子を除去した。洗浄後、１００μｌ／ウェルのcell lysisで細胞を溶解させ、細胞溶解液をサンプル管に回収した。細胞溶解液の上清をサンプルとし、細胞表面に結合した金属ポルフィリンを、ＵＶ−ｖｉｓスペクトルによって定量した。
Example 3: Evaluation of binding of Lf-modified MnP-containing lipid monolayer-coated particles to the cell surface Evaluation of binding to the cell surface was performed using PC12 cells (rat adrenal medulla-derived cells). PC12 cells were cultured in DMEM medium containing 10% HS, 5% FBS, and 1% antibiotics under conditions of 5% CO 2 and 4 ° C. Confluent cells were counted and seeded on a 48-well plate at a cell density of 2 × 10 4 cells / well and cultured in an incubator for 24 hours. MnP-containing lipid monolayer-coated particles and Lf-modified MnP-containing lipid monolayer-coated particles are added to various concentrations of 10 μM, cultured for 4 hours, the medium is removed, and the medium is washed with the medium three times to ligand the cell membrane. Various particles adhering except for the interaction between and the receptor were removed. After washing, the cells were lysed with 100 μl / well cell lysis, and the cell lysate was collected in a sample tube. Using the supernatant of the cell lysate as a sample, metal porphyrin bound to the cell surface was quantified by UV-vis spectrum.
Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の細胞膜表面への結合量は、０．１６±０．０４μｇ／ｍｇタンパク質となった。これは、ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の０．０３±０．００５μｇ／ｍｇタンパク質と比較して５倍程度増加した。 The amount of Lf-modified MnP-containing lipid monolayer-coated particles bound to the cell membrane surface was 0.16 ± 0.04 μg / mg protein. This increased by about 5 times compared with 0.03 ± 0.005 μg / mg protein of MnP-containing lipid monolayer-coated particles.
実施例４：Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の細胞膜内への取り込み評価
細胞膜内への取り込み評価は、ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来細胞）を用いて行った。ＰＣ１２細胞の培養は１０％ＨＳ、５％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて５％ＣＯ２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、２×１０４細胞／ウェルの細胞密度で４８ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子、Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子を各種濃度が１０μＭになるように添加し、４時間培養後、培地を除去し、ＰＢＳ（−）洗浄により細胞膜に付着している各種粒子を除去した。洗浄後、１００μｌ／ウェルのcell lysisで細胞を溶解させ、細胞溶解液をサンプル管に回収した。細胞溶解液の上清をサンプルとし、細胞内に取り込まれている金属ポルフィリンを、ＵＶ−ｖｉｓスペクトルによって定量した。
Example 4: Evaluation of incorporation of Lf-modified MnP-containing lipid monolayer-coated particles into cell membranes Evaluation of incorporation into cell membranes was performed using PC12 cells (rat adrenal medulla-derived cells). PC12 cells were cultured in DMEM medium containing 10% HS, 5% FBS, and 1% antibiotics under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. Confluent cells were counted and seeded on a 48-well plate at a cell density of 2 × 10 4 cells / well and cultured in an incubator for 24 hours. Add MnP-containing lipid monolayer-coated particles and Lf-modified MnP-containing lipid monolayer-coated particles to various concentrations of 10 μM, culture for 4 hours, remove the medium, and adhere to the cell membrane by washing with PBS (-) Various particles are removed. After washing, the cells were lysed with 100 μl / well cell lysis, and the cell lysate was collected in a sample tube. Using the supernatant of the cell lysate as a sample, the metal porphyrin incorporated into the cells was quantified by UV-vis spectrum.
Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の細胞膜内への取り込み量は、０．２６±０．０７μｇ／ｍｇタンパク質となった。これは、ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の０．０４±０．０２μｇ／ｍｇタンパク質と比較して、７倍程度増加した。 The amount of Lf-modified MnP-containing lipid monolayer-coated particles incorporated into the cell membrane was 0.26 ± 0.07 μg / mg protein. This increased by about 7 times compared with 0.04 ± 0.02 μg / mg protein of MnP-containing lipid monolayer-coated particles.
実施例５：Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子のトランスサイトーシス評価
トランスサイトーシス評価は、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞（ヒト気道上皮細胞）を用いて行った。ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞の培養は５％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて５％ＣＯ２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、２×１０４ｃ細胞／ウェルの細胞密度でトランスウェルプレートの上層に播種し、下層には、蒸留水を１００μｌ添加し、２４時間インキュベーター内で培養した。ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子、Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子を各種濃度が１０μＭになるように添加し、４時間培養後、上層に播種した細胞内をトランスサイトーシスし、下層に送達された各種粒子中に含まれる金属ポルフィリンを、ＵＶ−ｖｉｓスペクトルによって定量した。
Example 5: Transcytosis evaluation of Lf-modified MnP-containing lipid monolayer-coated particles Transcytosis evaluation was performed using BEAS-2B cells (human airway epithelial cells). BEAS-2B cells were cultured in DMEM medium containing 5% FBS and 1% antibiotics under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. Confluent cells were counted and seeded on the upper layer of the transwell plate at a cell density of 2 × 10 4 c cells / well, and 100 μl of distilled water was added to the lower layer and cultured in an incubator for 24 hours. MnP-containing lipid monolayer-coated particles and Lf-modified MnP-containing lipid monolayer-coated particles are added at various concentrations of 10 μM, cultured for 4 hours, and then transcytosed in the cells seeded in the upper layer. The metalloporphyrin contained in the various delivered particles was quantified by UV-vis spectrum.
Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子のトランスサイトーシスにより、下層に送達された粒子中のＭｎＰ量は、０．４±０．０３μｇ／ｍｇタンパク質となった。これは、ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の０．０７±０．０１μｇ／ｍｇタンパク質と比較して、６倍程度増加した。 Due to transcytosis of the Lf-modified MnP-containing lipid monolayer-coated particles, the amount of MnP in the particles delivered to the lower layer was 0.4 ± 0.03 μg / mg protein. This increased about 6 times compared to 0.07 ± 0.01 μg / mg protein of MnP-containing lipid monolayer-coated particles.
実施例６：Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の神経細胞保護効果
神経細胞保護効果の評価は、ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来細胞）を用いて行った。ＰＣ１２細胞の培養は１０％ＨＳ、５％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて５％ＣＯ２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、１×１０４細胞／ウェルの細胞密度で９６ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子、Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子を各種濃度が１０μＭになるように添加し、４時間培養後、培地を除去し、パラコート（１，１’−ジメチル−４，４’−ジピリジニウムジクロリド）を培地中濃度が３００μＭになるように添加した。２４時間インキュベート後、培地を交換し、アラマーブルーを１０μｌ／ウェルで加え、４時間インキュベートした。インキュベート後、プレートリーダーを用いて、波長５７０ｎｍ及び５９０ｎｍの吸光度を測定することで細胞生存率を算出した。
パラコートを添加した細胞群では、細胞生存率は、８９±３％まで低下し、Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子を前添加した細胞群においては、細胞生存率が１０３±１％まで向上し、神経細胞保護効果が示された。
Example 6: Neuronal cell protective effect of Lf-modified MnP-containing lipid monolayer-coated particles Evaluation of the neuronal cell protective effect was performed using PC12 cells (rat adrenal medulla-derived cells). PC12 cells were cultured in DMEM medium containing 10% HS, 5% FBS, and 1% antibiotics under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. Confluent cells were counted and seeded on a 96-well plate at a cell density of 1 × 10 4 cells / well and cultured in an incubator for 24 hours. MnP-containing lipid monolayer-coated particles and Lf-modified MnP-containing lipid monolayer-coated particles were added to various concentrations of 10 μM, and after culturing for 4 hours, the medium was removed and paraquat (1,1′-dimethyl- 4,4′-dipyridinium dichloride) was added to a concentration of 300 μM in the medium. After incubation for 24 hours, the medium was changed and Alamar Blue was added at 10 μl / well and incubated for 4 hours. After incubation, the cell viability was calculated by measuring absorbance at wavelengths of 570 nm and 590 nm using a plate reader.
In the cell group to which paraquat was added, the cell viability decreased to 89 ± 3%, and in the cell group to which Lf-modified MnP-containing lipid monolayer-coated particles were pre-added, the cell viability improved to 103 ± 1%. The effect of protecting nerve cells was demonstrated.
実施例７：脂質単層被覆型粒子の調製
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）（２．５ｍｇ）、ＰＬＧＡ（２５ｍｇ）及びステアリルアミン（３．７５ｍｇ）はアセトン（２５００μＬ）に溶解し、１５分静置した。この溶液に対し、エタノール／蒸留水（５０／５０％，ｖ／ｖ）混合溶媒１２００μＬを２ｍＬ／分で滴下し、４００ｒｐｍで５分間撹拌した。本溶液は蒸留水１０ｍＬに滴下し、目的の粒子懸濁液を得、粒子懸濁液は１３０００ｒｐｍ／２０ｍｉｎの遠心分離により精製した。脂質単層被覆型粒子へのＴＳＡ封入はＵＶ−ｖｉｓスペクトルにより評価し、３．５μｇ／１ｍｇ ＮＰｓの封入量となった。最後に、脂質単層被覆型粒子はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）と複合化した。脂質単層被覆型粒子へのｐＤＮＡの複合化は、アガロースゲル電気泳動により評価し、電荷比（＋／−）が２以降でｐＤＮＡのバンドの完全な消失が認められ、脂質単層被覆型粒子との複合化が確認された。
Example 7: Preparation of lipid monolayer-coated particles Trichostatin A (TSA) (2.5 mg), PLGA (25 mg) and stearylamine (3.75 mg), which are histone deacetylase inhibitors, are acetone (2500 μL). And was allowed to stand for 15 minutes. To this solution, 1200 μL of a mixed solvent of ethanol / distilled water (50/50%, v / v) was added dropwise at 2 mL / min and stirred at 400 rpm for 5 minutes. This solution was dropped into 10 mL of distilled water to obtain a target particle suspension, and the particle suspension was purified by centrifugation at 13000 rpm / 20 min. TSA encapsulation in lipid monolayer-coated particles was evaluated by UV-vis spectrum, resulting in an encapsulation amount of 3.5 μg / 1 mg NPs. Finally, lipid monolayer-coated particles were complexed with plasmid DNA (pDNA). The complexation of pDNA into lipid monolayer-coated particles was evaluated by agarose gel electrophoresis, and complete disappearance of the pDNA band was observed when the charge ratio (+/−) was 2 or later. Was confirmed to be combined.
実施例８：脂質単層被覆型粒子の機能評価
実施例７において調製した脂質単層被覆型粒子及びｐＤＮＡと複合化した脂質単層被覆型粒子の粒径・ゼータ電位を、動的光散乱法（ＤＬＳ）により測定した。また、ｐＤＮＡと複合化していない脂質単層被覆型粒子単体の粒径の経時変化もＤＬＳにより評価した。脂質単層被覆型粒子の粒径は８３．４±２０．８ｎｍ、ゼータ電位は５４．７０ｍＶの値を示した。ｐＤＮＡと複合化した脂質単層被覆型粒子の粒径は１１５．９±２２．０ｎｍ、ゼータ電位は１８．０８ｍＶの値を示した。調製から一か月経過した粒子の粒径は８５．６±２２．５ｎｍ、ゼータ電位は５２．３４ｍＶの値を示した。
Example 8: Functional evaluation of lipid monolayer-coated particles The particle size and zeta potential of the lipid monolayer-coated particles prepared in Example 7 and lipid monolayer-coated particles complexed with pDNA were determined by a dynamic light scattering method. Measured by (DLS). Moreover, the time-dependent change of the particle size of the lipid monolayer-coated single particles not complexed with pDNA was also evaluated by DLS. The particle size of the lipid monolayer-coated particles was 83.4 ± 20.8 nm, and the zeta potential was 54.70 mV. The particle size of the lipid monolayer-coated particles complexed with pDNA was 115.9 ± 22.0 nm, and the zeta potential was 18.08 mV. The particle diameter after one month from the preparation was 85.6 ± 22.5 nm, and the zeta potential was 52.34 mV.
実施例９：脂質単層被覆型粒子の遺伝子発現
脂質単層被覆型粒子を、ｐＤＮＡとしてｐＧＬ３（プロメガ）を用いて、実施例７と同様の方法で調製した。
Example 9 Gene Expression of Lipid Monolayer Coated Particles Lipid monolayer coated particles were prepared in the same manner as in Example 7 using pGL3 (Promega) as pDNA.
ＨｅＬａ細胞は１×１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。一晩のインキュベート後、培地交換を行い、ルシフェラーゼをコードしたｐＤＮＡであるｐＧＬ３（プロメガ）と複合化した脂質単層被覆型粒子を添加した。サンプル添加から２４時間後、培地除去後にＰＢＳ（＋）により細胞を洗浄し、新鮮な培地を添加し、４８時間インキュベートした。インキュベート後、培地を除去し、細胞はＰＢＳ（＋）により洗浄した。その後、細胞は５×cell lysis（２０μＬ）を添加することにより溶解させた。各種サンプルの化学発光は、ルシフェラーゼ基質（１００μＬ）を各ｗｅｌｌに添加し、ルミノメーターにより測定した。ｐＧＬ３と複合化した脂質単層被覆型粒子を添加した細胞において遺伝子発現が示された。 HeLa cells were seeded in 96 well plates at 1 × 10 4 cells / well. After overnight incubation, the medium was changed, and lipid monolayer-coated particles complexed with pGL3 (Promega), a pDNA encoding luciferase, were added. Twenty-four hours after sample addition, the cells were washed with PBS (+) after removing the medium, fresh medium was added and incubated for 48 hours. After incubation, the medium was removed and the cells were washed with PBS (+). Thereafter, the cells were lysed by adding 5 × cell lysis (20 μL). Chemiluminescence of various samples was measured by adding a luciferase substrate (100 μL) to each well and using a luminometer. Gene expression was shown in cells to which lipid monolayer-coated particles complexed with pGL3 were added.
実施例１０：脂質単層被覆型粒子の細胞毒性評価
脂質単層被覆型粒子を、ｐＤＮＡとしてヒストンアセチル化酵素をコードしたｐＤＮＡを用い、ＴＳＡを含めずに、実施例７と同様の方法で調製した。
Example 10: Cytotoxicity evaluation of lipid monolayer-coated particles Lipid monolayer-coated particles were prepared in the same manner as in Example 7 using pDNA encoding histone acetylase as pDNA and not including TSA. did.
ＨｅＬａ細胞は１×１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。一晩のインキュベート後、培地交換を行い、ヒストンアセチル化酵素をコードしたｐＤＮＡと複合化した薬剤を含まない脂質単層被覆型粒子を添加した。サンプル添加から２４時間後、培地除去後にＰＢＳ（＋）により細胞を洗浄し、新鮮な培地を添加し、４８時間インキュベートした。インキュベート後、培地交換を行い、各ウェルにアラマーブルー（１０μＬ）を添加し添加し４時間インキュベートした。インキュベート後、吸光度（５７０ｎｍ／６００ｎｍ）はプレートリーダーにより測定し、細胞生存率は未処理の細胞の吸光度（５７０ｎｍ／６００ｎｍ）の相対比として算出した。ｐＤＮＡと複合化した薬剤を含まない脂質単層被覆型粒子を添加した細胞において、電荷比（＋／−）が４まで全くの毒性を示さなかった。 HeLa cells were seeded in 96 well plates at 1 × 10 4 cells / well. After overnight incubation, the medium was changed, and lipid monolayer-coated particles containing no drug complexed with pDNA encoding histone acetylase were added. Twenty-four hours after sample addition, the cells were washed with PBS (+) after removing the medium, fresh medium was added and incubated for 48 hours. After incubation, the medium was changed, and Alamar Blue (10 μL) was added to each well and incubated for 4 hours. After incubation, the absorbance (570 nm / 600 nm) was measured with a plate reader, and the cell viability was calculated as the relative ratio of the absorbance of untreated cells (570 nm / 600 nm). In cells to which lipid monolayer-coated particles containing no drug complexed with pDNA were added, the charge ratio (+/−) did not show any toxicity up to 4.
実施例１１：細胞内エピジェネティクス評価
脂質単層被覆型粒子を、ｐＤＮＡとしてヒストンアセチル化酵素をコードしたｐＤＮＡを用いて、実施例７と同様の方法で調製した。
Example 11: Evaluation of intracellular epigenetics Lipid monolayer-coated particles were prepared in the same manner as in Example 7 using pDNA encoding histone acetylase as pDNA.
ＨｅＬａ細胞は１×１０５細胞／ウェルで１２ウェルプレートに播種した。一晩のインキュベート後、培地交換を行い、ヒストンアセチル化酵素をコードしたｐＤＮＡと複合化したＴＳＡ脂質単層被覆型粒子を添加した。サンプル添加から２４時間後、培地除去後にＰＢＳ（＋）により細胞を洗浄し、新鮮な培地を添加し、４８時間インキュベートした。インキュベート後、細胞は５×cell lysis（２００μＬ）を添加することにより溶解させた。２×サンプルバッファー（メルカプトエタノールを含まない）は各ウェルに等量添加し、最終濃度が１０％となる様にメルカプトエタノールを添加した。その後、ウェスタンブロットに用いるサンプルは、９５℃で５分間、熱処理することにより得た。脂質単層被覆型粒子を添加した細胞におけるヒストンアセチル化量はウェスタンブロット法により評価した。ヒストンアセチル化（Ａｃ−Ｈ３Ｋ９）量はヒストンアセチル化酵素をコードしたｐＤＮＡと複合化したＴＳＡ含有脂質単層被覆型粒子を添加した細胞において、未処理の細胞と比較して１．７５倍となった。 HeLa cells were seeded in 12-well plates at 1 × 10 5 cells / well. After overnight incubation, the medium was changed and TSA lipid monolayer-coated particles complexed with pDNA encoding histone acetylase were added. Twenty-four hours after sample addition, the cells were washed with PBS (+) after removing the medium, fresh medium was added and incubated for 48 hours. After incubation, the cells were lysed by adding 5 × cell lysis (200 μL). An equal amount of 2 × sample buffer (without mercaptoethanol) was added to each well, and mercaptoethanol was added to a final concentration of 10%. Then, the sample used for a Western blot was obtained by heat-processing at 95 degreeC for 5 minute (s). The amount of histone acetylation in cells to which lipid monolayer-coated particles were added was evaluated by Western blotting. The amount of histone acetylation (Ac-H3K9) is 1.75 times higher in cells to which TSA-containing lipid monolayer-coated particles complexed with pDNA encoding histone acetylase are added compared to untreated cells. It was.
本発明の複合体は、生分解性ポリマーのコアを脂質単層で被覆した構造を有することにより、安定性が向上しており、薬剤および／またはプラスミドＤＮＡを目的の組織に送達するためのキャリアとして有用である。特に、血液脳関門の作用により、これまで薬剤の送達が難しかった脳内への薬剤送達や、持続的な効果の発現が必要なエピジェネティクス制御による治療のための医薬組成物として利用できる点で有用である。 The complex of the present invention has a structure in which a core of a biodegradable polymer is coated with a lipid monolayer, so that stability is improved, and a carrier for delivering a drug and / or plasmid DNA to a target tissue Useful as. In particular, it can be used as a pharmaceutical composition for drug delivery into the brain, where it has been difficult to deliver drugs due to the action of the blood-brain barrier, and for treatment by epigenetics that requires sustained effects. It is useful in.
Claims (15)
ここで、当該脂質単層被覆型ナノ粒子は、生分解性ポリマーを含むコア及び当該コアをコートする脂質単分子層を含み、
当該薬剤は、生分解性ポリマーを含むコア中に存在し、そして
当該ターゲッティング分子は、当該脂質単層被覆型ナノ粒子の表面に結合している、前記複合体。 A complex for neuroprotection by nasal administration, comprising a monolayer-coated nanoparticle, a drug, and a targeting molecule,
Here, the lipid monolayer-coated nanoparticles include a core containing a biodegradable polymer and a lipid monolayer that coats the core,
The complex wherein the agent is present in a core comprising a biodegradable polymer, and the targeting molecule is bound to the surface of the lipid monolayer-coated nanoparticle.
ここで、当該アシル基は、炭素数が１２〜２０の飽和または不飽和アシル基であり；そして、
当該ポリエチレングリコールは、分子量２，０００〜１００，０００であり、一方の末端はジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に連結しており、および、他方の末端においてタンパク質と連結可能な基を有するものである；
請求項１又は２に記載の複合体。 The lipid is diacylphosphatidylethanolamine modified with polyethylene glycol (PEG),
Wherein the acyl group is a saturated or unsaturated acyl group having 12 to 20 carbon atoms; and
The polyethylene glycol has a molecular weight of 2,000 to 100,000, one end is linked to the amino group of diacylphosphatidylethanolamine, and the other end has a group that can be linked to a protein. ;
The complex according to claim 1 or 2.
下記式（Ｉ）で表されるカチオン性金属ポルフィリン錯体：
Ｍは錯体を形成するための金属原子を示し、
Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、およびＡｒ４、はそれぞれ独立して無置換のまたは置換基を有してもよい炭素環式または複素環式芳香族基を示し、そしてＡｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、およびＡｒ４、の少なくとも１つはカチオン性の基を有する芳香族基である）；および
下記式（ＩＩ）で表されるカチオン性金属ポルフィリンダイマー：
Ｍは錯体を形成するための金属原子を示し、
Ａｒ１およびＡｒ１’はピリジンを示し、ここでピリジンの１位はＸに、４位がポルフィリンにそれぞれ結合しており、
Ａｒ２、Ａｒ３、およびＡｒ４、並びに、Ａｒ２’、Ａｒ３’、およびＡｒ４’、はそれぞれ独立して無置換のまたは置換基を有してもよい炭素環式または複素環式芳香族基を示し、
Ｘは、−ＣＨ２−フェニル−ＣＨ２−であるか、下記式（ＩＩＩ）ないし（Ｖ）のいずれかで表される：
−Ｃ２Ｈ４−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２）ａ− ・・・・ （ＩＩＩ）
（式中、ａは、１〜１０の整数を示す）
−Ｃ２Ｈ４−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２− ・・・ （ＩＶ）
−Ｃ３Ｈ６−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２− ・・・（Ｖ）
（式中、ｂは３〜５の整数を示す））
からなる群より選択される、請求項５に記載の複合体。 The antioxidant is a porphyrin antioxidant, and the porphyrin antioxidant is
Cationic metalloporphyrin complex represented by the following formula (I):
M represents a metal atom for forming a complex;
Ar 1 , Ar 2 , Ar 3 , and Ar 4 each independently represent an unsubstituted or optionally substituted carbocyclic or heterocyclic aromatic group, and Ar 1 , Ar 2 , At least one of Ar 3 and Ar 4 is an aromatic group having a cationic group); and a cationic metalloporphyrin dimer represented by the following formula (II):
M represents a metal atom for forming a complex;
Ar 1 and Ar 1 ′ represent pyridine, wherein 1-position of pyridine is bonded to X and 4-position is bonded to porphyrin,
Ar 2 , Ar 3 , and Ar 4 , and Ar 2 ′, Ar 3 ′, and Ar 4 ′ are each independently an unsubstituted or optionally substituted carbocyclic or heterocyclic fragrance Indicates a group,
X is —CH 2 -phenyl-CH 2 — or represented by any of the following formulas (III) to (V):
-C 2 H 4 - (NH- CH 2 CH 2) a - ···· (III)
(Wherein, a represents an integer of 1 to 10)
-C 2 H 4 - (NH- CH 2 CH 2 CH 2) b-NH-CH 2 CH 2 - ··· (IV)
-C 3 H 6 - (NH- CH 2 CH 2 CH 2) b-NH-CH 2 CH 2 CH 2 - ··· (V)
(In the formula, b represents an integer of 3 to 5))
6. The complex according to claim 5, wherein the complex is selected from the group consisting of:
ここで、当該脂質単層被覆型ナノ粒子は、生分解性ポリマーを含むコア及び当該コアをコートする脂質単分子層を含み、
当該薬剤は生分解性ポリマーを含むコア中に存在し、そして、
当該プラスミドＤＮＡは、当該脂質単層被覆型ナノ粒子の表面に吸着または結合している、前記複合体。 A complex for epigenetic control by co-delivery of a drug and a gene to a subject, the complex comprising lipid monolayer-coated nanoparticles, a drug, and plasmid DNA,
Here, the lipid monolayer-coated nanoparticles include a core containing a biodegradable polymer and a lipid monolayer that coats the core,
The agent is present in a core comprising a biodegradable polymer, and
The complex, wherein the plasmid DNA is adsorbed or bound to the surface of the lipid monolayer-coated nanoparticle.
ステアリルアミン；
１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；
ジアシルホスファチジルエタノールアミン；
Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；
１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
オレイルアミン；および
１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）；
からなる群より選択される、請求項９又は１０に記載の複合体。 Lipids are the following:
Stearylamine;
1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammoniumpropane (DOTAP);
Diacylphosphatidylethanolamine;
N- (2,3-dioleoyloxy) propyl-N, N, N-trimethylammonium (DOTMA);
1,2-dioleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE);
Oleylamine; and 1,2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylammonium (DMRIE);
11. A complex according to claim 9 or 10 selected from the group consisting of.
ここで、当該アシル基は、炭素数が１２〜２０の飽和または不飽和アシル基であり；そして、
当該ポリエチレングリコールは、分子量２，０００〜１００，０００であり、一方の末端はジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に連結しており、および、他方の末端においてリガンドと結合している；
請求項１１に記載の複合体。 Diacylphosphatidylethanolamine is diacylphosphatidylethanolamine modified with polyethylene glycol (PEG),
Wherein the acyl group is a saturated or unsaturated acyl group having 12 to 20 carbon atoms; and
The polyethylene glycol has a molecular weight of 2,000-100,000, one end linked to the amino group of diacylphosphatidylethanolamine, and the other end bound to a ligand;
The composite according to claim 11.
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤；
ヒストンメチル化酵素阻害剤；および
ヒストン脱メチル化酵素阻害剤；からなる群より選択される、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の複合体。 The drug is:
Histone deacetylase inhibitors;
The complex according to any one of claims 9 to 12, selected from the group consisting of: a histone methylase inhibitor; and a histone demethylase inhibitor.
エピジェネティクスの制御に関わる酵素またはタンパク質をコードするＤＮＡ；
エピジェネティクスの制御に関わる酵素またはタンパク質の発現を抑制するアンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ；および
エピジェネティクスの制御に関わる酵素またはタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ；
からなる群より選択されるＤＮＡを含む、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の複合体。 Plasmid DNA is as follows:
DNA encoding an enzyme or protein involved in the control of epigenetics;
DNA encoding an antisense nucleic acid or double-stranded RNA that suppresses the expression of an enzyme or protein involved in epigenetic control; and DNA encoding an antibody or fragment thereof that binds to the enzyme or protein involved in epigenetic control ;
The complex according to any one of claims 9 to 13, comprising DNA selected from the group consisting of:
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