JP2017200935A - 増加した抗原マスを含むレプトスピラ(Leptospira) - Google Patents
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Abstract
【課題】レプトスピラに対するワクチン製造法の提供。【解決手段】レプトスピラ培養物の抗原マスは、レプトスピラ培養物をリノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸から選択される1以上の多価不飽和C18脂肪酸により補給することによって、バイオマスにおけるいかなる増加とも独立して顕著に増加され得り、これは、レプトスピラ抗原産生における優位さを示し、より安全でかつより効果的な改良されたレプトスピラ症ワクチンの産生する方法。【選択図】なし
Description
本発明は、一般的に微生物学の分野、および微生物のワクチンに関する。特に本発明は
、レプトスピラ(Leptospira)の抗原マスを増加させる方法、該方法によって
得られるレプトスピラ(Leptospira)および当該レプトスピラのワクチンおよ
び使用に関する。
、レプトスピラ(Leptospira)の抗原マスを増加させる方法、該方法によって
得られるレプトスピラ(Leptospira)および当該レプトスピラのワクチンおよ
び使用に関する。
レプトスピラ(Leptospira)属の細菌スピロヘータは、レプトスピラ科およ
びスピロヘータ門に属する。レプトスピラ(Leptospira)は、細長く、薄くさ
らにらせん状形を有する、グラム陰性、好気性、運動性の細菌である。病原性レプトスピ
ラ(Leptospira)は、多様な種類の動物およびヒトにおいて世界中で見出され
る;哺乳動物、例えば、げっ歯類、野生動物、家畜およびイヌは天然の保菌宿主である。
該細菌は、レプトスピラ症、またはワイル病と呼ばれる疾病を引き起こす。該疾病は、レ
プトスピラ(Leptospira)が‐感染および血流による輸送後に‐すべての内臓
に侵入するとき、症状が現れ、軽度ないし重度、致死的にいたるまでの広い範囲の症状を
示し得て、急性または慢性である。この変動性が、しばしば該疾病が誤診される理由であ
る。主な症状は:熱、悪心および黄疸、脈肝炎に起因してもたらされる腎不全、肝不全ま
たは肺不全または心血管疾患である。レプトスピラ(Leptospira)は、典型的
に宿主の腎臓または生殖器官において生存し、この方法が人獣共通感染症も起こし得る水
平伝播を引き起こし、それによってヒトが、動物の尿との接触または汚染された地表水に
より感染する。総説については、P.Levett,2011(Clin.Micr.R
ev.,vol.14,p.296)を参照されたい。レプトスピラ(Leptospi
ra)は自然界において極めて安定しており、水性条件下、雰囲気温度で数か月間、生存
可能である。
びスピロヘータ門に属する。レプトスピラ(Leptospira)は、細長く、薄くさ
らにらせん状形を有する、グラム陰性、好気性、運動性の細菌である。病原性レプトスピ
ラ(Leptospira)は、多様な種類の動物およびヒトにおいて世界中で見出され
る;哺乳動物、例えば、げっ歯類、野生動物、家畜およびイヌは天然の保菌宿主である。
該細菌は、レプトスピラ症、またはワイル病と呼ばれる疾病を引き起こす。該疾病は、レ
プトスピラ(Leptospira)が‐感染および血流による輸送後に‐すべての内臓
に侵入するとき、症状が現れ、軽度ないし重度、致死的にいたるまでの広い範囲の症状を
示し得て、急性または慢性である。この変動性が、しばしば該疾病が誤診される理由であ
る。主な症状は:熱、悪心および黄疸、脈肝炎に起因してもたらされる腎不全、肝不全ま
たは肺不全または心血管疾患である。レプトスピラ(Leptospira)は、典型的
に宿主の腎臓または生殖器官において生存し、この方法が人獣共通感染症も起こし得る水
平伝播を引き起こし、それによってヒトが、動物の尿との接触または汚染された地表水に
より感染する。総説については、P.Levett,2011(Clin.Micr.R
ev.,vol.14,p.296)を参照されたい。レプトスピラ(Leptospi
ra)は自然界において極めて安定しており、水性条件下、雰囲気温度で数か月間、生存
可能である。
レプトスピラ(Leptospira)の分類は、使用されている異なる系により混乱
している:多年にわたって分類は、血清学的な識別に基づいていて、それによってすべて
の病原性レプトスピラ(Leptospira)は、菌種レプトスピラ・インターロガン
ス(Leptospira interrogans)(広義)の血清型として示されて
いる。この系において血清型は、細菌の主免疫原:その外膜上のリポ多糖(LPS)の血
清学的試験によって識別される。現在200以上の血清型が記載されており、それらは約
25の血清群にまとめられる。
している:多年にわたって分類は、血清学的な識別に基づいていて、それによってすべて
の病原性レプトスピラ(Leptospira)は、菌種レプトスピラ・インターロガン
ス(Leptospira interrogans)(広義)の血清型として示されて
いる。この系において血清型は、細菌の主免疫原:その外膜上のリポ多糖(LPS)の血
清学的試験によって識別される。現在200以上の血清型が記載されており、それらは約
25の血清群にまとめられる。
しかしながらこの血清型判定による分類と直角に、分子生物学的性質、いわゆる:遺伝
種(geomospecies)に基づく遺伝子型判定の系が存在する。実際には、一つ
のレプトスピラ遺伝種が数個の血清型を含み得て、逆もまた同様である。本発明に関して
は、血清型の血清学的分類を使用する。
種(geomospecies)に基づく遺伝子型判定の系が存在する。実際には、一つ
のレプトスピラ遺伝種が数個の血清型を含み得て、逆もまた同様である。本発明に関して
は、血清型の血清学的分類を使用する。
いくつかのレプトスピラ血清型は、特定の宿主種にのみ感染するが、ほとんどの血清型
は広い宿主範囲を有する。例えば:L.インターロガンス(L.interrogans
)(広義)血清型Hardjoはウシの感染に関連し、ブタにおいては血清型Taras
sovi、PomonaおよびBratislavaがほとんどの場合原因とみなされる
。しかしながら、Canicola、Icterohaemorrhagiae、Bra
tislavaおよびGrippotyphosa等の血清型は、ブタ、イヌおよびヒト
に感染し得る。
は広い宿主範囲を有する。例えば:L.インターロガンス(L.interrogans
)(広義)血清型Hardjoはウシの感染に関連し、ブタにおいては血清型Taras
sovi、PomonaおよびBratislavaがほとんどの場合原因とみなされる
。しかしながら、Canicola、Icterohaemorrhagiae、Bra
tislavaおよびGrippotyphosa等の血清型は、ブタ、イヌおよびヒト
に感染し得る。
宿主のレプトスピラ感染の検出は、種々の方法で可能である。最適基準は、いわゆる:
顕微鏡下凝集試験(MAT)による宿主血清における特異的抗体の血清学的検出である。
この試験において、患者血清の段階希釈液が、特定の血清型の生きたレプトスピラ(Le
ptospira)とインキュベートされる。血清中に特定の抗体が存在する場合、この
抗体は試験細菌を凝集し、それは例えば、(暗視野)顕微鏡によって読み取られ得る。該
試験は高度に特異的であり、MATはまたレプトスピラ(Leptospira)単離株
の血清分類にとって決定的である。代わりの試験は、Elisa(酵素結合免疫吸着測定
法)またはPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)である。
顕微鏡下凝集試験(MAT)による宿主血清における特異的抗体の血清学的検出である。
この試験において、患者血清の段階希釈液が、特定の血清型の生きたレプトスピラ(Le
ptospira)とインキュベートされる。血清中に特定の抗体が存在する場合、この
抗体は試験細菌を凝集し、それは例えば、(暗視野)顕微鏡によって読み取られ得る。該
試験は高度に特異的であり、MATはまたレプトスピラ(Leptospira)単離株
の血清分類にとって決定的である。代わりの試験は、Elisa(酵素結合免疫吸着測定
法)またはPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)である。
レプトスピラ症の治療は、抗生物質の投与によって治療的に成され得る。しかしながら
、疾病はしばしば誤診されるので、ワクチンによる予防が好ましい。レプトスピラ(Le
ptospira)に対する動物用またはヒト用の数種類のワクチンが研究されているが
、しかし獣医学的ワクチンのみが広く市販されている。日常的にワクチン接種されている
動物の種は、ブタ、ウシおよびイヌである。そのうえワクチン接種は、宿主の疾病を予防
するため、ならびに人獣共通感染症の伝播を低減するために役立つ。
、疾病はしばしば誤診されるので、ワクチンによる予防が好ましい。レプトスピラ(Le
ptospira)に対する動物用またはヒト用の数種類のワクチンが研究されているが
、しかし獣医学的ワクチンのみが広く市販されている。日常的にワクチン接種されている
動物の種は、ブタ、ウシおよびイヌである。そのうえワクチン接種は、宿主の疾病を予防
するため、ならびに人獣共通感染症の伝播を低減するために役立つ。
現在のレプトスピラ症ワクチンは、関連する血清型由来の菌株の不活化細菌細胞全体の
懸濁液、いわゆるバクテリンに基づいている。これらのワクチンは、液性型の効果的な免
疫を誘導し、それによって大多数の抗体がレプトスピラ(Leptospira)を凝集
し、それ故に中和することができる。細菌の免疫優勢な抗原は、LPS、および特にLP
Sのオリゴ糖部分のエピトープである。誘導される免疫は、主として血清型特異的である
が、例えば、同一の血清群内由来の関連血清型の間でいくらかの交差防御を有する。レプ
トスピラ症ワクチンの例は:L.インターロガンス(L.interrogans)(広
義)血清型Hardjoの菌株由来のバクテリンを含む、ウシ用のLeptavoid(
登録商標)H(MSD Animal Health)である。
懸濁液、いわゆるバクテリンに基づいている。これらのワクチンは、液性型の効果的な免
疫を誘導し、それによって大多数の抗体がレプトスピラ(Leptospira)を凝集
し、それ故に中和することができる。細菌の免疫優勢な抗原は、LPS、および特にLP
Sのオリゴ糖部分のエピトープである。誘導される免疫は、主として血清型特異的である
が、例えば、同一の血清群内由来の関連血清型の間でいくらかの交差防御を有する。レプ
トスピラ症ワクチンの例は:L.インターロガンス(L.interrogans)(広
義)血清型Hardjoの菌株由来のバクテリンを含む、ウシ用のLeptavoid(
登録商標)H(MSD Animal Health)である。
しかしながら、大部分の野外状況では、二以上の血清群由来のレプトスピラ(Lept
ospira)が蔓延しているので、それ故に多数の市販レプトスピラ症ワクチンは、広
い防御を提供する混合ワクチンである。例は、イヌ用ワクチン:Nobivac(登録商
標)Lepto4(Merck Animal Health)であり、それはL.イン
ターロガンス(L.interrogans)(広義)血清群:Canicola、Gr
ippotyphosa、IcterohaemorrhagiaeおよびPomona
の各々由来の菌株を含む。また、レプトスピラ症ワクチンは、しばしば他の細菌またはウ
イルスワクチン化合物と併用される。
ospira)が蔓延しているので、それ故に多数の市販レプトスピラ症ワクチンは、広
い防御を提供する混合ワクチンである。例は、イヌ用ワクチン:Nobivac(登録商
標)Lepto4(Merck Animal Health)であり、それはL.イン
ターロガンス(L.interrogans)(広義)血清群:Canicola、Gr
ippotyphosa、IcterohaemorrhagiaeおよびPomona
の各々由来の菌株を含む。また、レプトスピラ症ワクチンは、しばしば他の細菌またはウ
イルスワクチン化合物と併用される。
今日、レプトスピラ(Leptospira)は、研究または診断目的用に日常的に増
殖されているが、しかし主にワクチン製造用に増殖されている。レプトスピラ(Lept
ospira)のインビトロでの増殖用の方法および手順は、50年にわたり知られてお
り、そのかなり単純な培養培地にとって重要な原料についても知られている。1960年
代に、レプトスピラ(Leptospira)は、(インビトロでの増殖のために)その
栄養および細胞成分に長鎖脂肪酸を要求することが立証された。また同様に、培養培地の
タンパク質または炭水化物の(検出可能な)消費がないので、これらの長鎖脂肪酸が、唯
一のエネルギーおよび炭素源として使用されることも立証された。それ故に、レプトスピ
ラ(Leptospira)は、長鎖脂肪酸をデノボ合成することも短鎖脂肪酸を伸長す
ることもできないので、これらの脂肪酸は培養培地によって供給される必要がある。これ
らの洞察は、レプトスピラ(Leptospira)用半規定合成培養培地の発達に役立
ち(Johson & Gary 1963;Stalheim & Wilson 1
964)、当該培地中において、従前の10%(v/v)までの全(ウサギ)血清の使用
は、アルブミン画分および規定脂肪酸源の組み合せによって代替された。これは、さらに
レプトスピラ(Leptospira)のインビトロでの小または大規模増殖用の標準培
養培地:EllinghausenおよびMcCullough(1965、Am.J.
of Vet.Res.,vol.26,p.45)により開発され、Johnson
およびHarris(1967、J.of Bacteriol.,vol.94,p.
27)によって改変されたEMJH培地として、今日もまだ使用されている合成培地に発
展した。
殖されているが、しかし主にワクチン製造用に増殖されている。レプトスピラ(Lept
ospira)のインビトロでの増殖用の方法および手順は、50年にわたり知られてお
り、そのかなり単純な培養培地にとって重要な原料についても知られている。1960年
代に、レプトスピラ(Leptospira)は、(インビトロでの増殖のために)その
栄養および細胞成分に長鎖脂肪酸を要求することが立証された。また同様に、培養培地の
タンパク質または炭水化物の(検出可能な)消費がないので、これらの長鎖脂肪酸が、唯
一のエネルギーおよび炭素源として使用されることも立証された。それ故に、レプトスピ
ラ(Leptospira)は、長鎖脂肪酸をデノボ合成することも短鎖脂肪酸を伸長す
ることもできないので、これらの脂肪酸は培養培地によって供給される必要がある。これ
らの洞察は、レプトスピラ(Leptospira)用半規定合成培養培地の発達に役立
ち(Johson & Gary 1963;Stalheim & Wilson 1
964)、当該培地中において、従前の10%(v/v)までの全(ウサギ)血清の使用
は、アルブミン画分および規定脂肪酸源の組み合せによって代替された。これは、さらに
レプトスピラ(Leptospira)のインビトロでの小または大規模増殖用の標準培
養培地:EllinghausenおよびMcCullough(1965、Am.J.
of Vet.Res.,vol.26,p.45)により開発され、Johnson
およびHarris(1967、J.of Bacteriol.,vol.94,p.
27)によって改変されたEMJH培地として、今日もまだ使用されている合成培地に発
展した。
EMJH培地は、必須ビタミン、塩およびミネラルは別にして、同様にポリソルベート
80 0.125%(v/v)およびウシ血清アルブミン(BSA)1%(w/v)を含
む(Faine,S.,1994,p.312:「Leptospira and Le
ptospirosis(レプトスピラ(Leptospira)およびレプトスピラ症
)」,ed(編).S.Faine,Boca Raton,FL,USA,CRC P
ress)。
80 0.125%(v/v)およびウシ血清アルブミン(BSA)1%(w/v)を含
む(Faine,S.,1994,p.312:「Leptospira and Le
ptospirosis(レプトスピラ(Leptospira)およびレプトスピラ症
)」,ed(編).S.Faine,Boca Raton,FL,USA,CRC P
ress)。
ポリソルベート80は、その商品名の一つである:ツイーン(登録商標)80(ICI
Americas,Inc)によって最も知られており、モノオレイン酸ポリオキシエ
チレン(20)ソルビタン(CAS番号9005‐65‐6)である。ポリソルベート8
0は、医薬品、化粧品および食品において乳化剤および可溶化剤として広範に使用されて
いる非イオン性界面活性剤である(E433)。EMJH培地においてはしかしながら、
ポリソルベート80は、都合のいいことには水溶性でありかつ細菌に対し低い毒性しか有
さないので、細菌の長鎖脂肪酸源として役立つ。ポリソルベート80の約70%(v/v
)の主成分はオレイン酸(C18:1)であるが、しかし他の脂肪酸、主に:パルミチン
酸(C16:0)およびパルミトオレイン酸(C16:1)も存在し、これはバッチおよ
び製造者による左右される。
Americas,Inc)によって最も知られており、モノオレイン酸ポリオキシエ
チレン(20)ソルビタン(CAS番号9005‐65‐6)である。ポリソルベート8
0は、医薬品、化粧品および食品において乳化剤および可溶化剤として広範に使用されて
いる非イオン性界面活性剤である(E433)。EMJH培地においてはしかしながら、
ポリソルベート80は、都合のいいことには水溶性でありかつ細菌に対し低い毒性しか有
さないので、細菌の長鎖脂肪酸源として役立つ。ポリソルベート80の約70%(v/v
)の主成分はオレイン酸(C18:1)であるが、しかし他の脂肪酸、主に:パルミチン
酸(C16:0)およびパルミトオレイン酸(C16:1)も存在し、これはバッチおよ
び製造者による左右される。
ここにおいて:オレイン酸を:「C18:1」とする等の脂肪酸の命名は、C:D表示
法に従っており、当該表示法は、その主な特性:アシル鎖の炭素原子数(オレイン酸につ
いて:18)、および二重(不飽和)結合数(オレイン酸について:1)によって脂肪酸
を記載する周知の標準的な簡略標記法である。
法に従っており、当該表示法は、その主な特性:アシル鎖の炭素原子数(オレイン酸につ
いて:18)、および二重(不飽和)結合数(オレイン酸について:1)によって脂肪酸
を記載する周知の標準的な簡略標記法である。
レプトスピラ(Leptospira)は、インビトロではタンパク質を消費しないの
で、EMJHのアルブミン成分の主機能は、一方でそれらを生物学的に利用可能としつつ
、可逆的にそれらを複合体に形成することによる、培養培地中の脂肪酸の解毒であると考
えられる。
で、EMJHのアルブミン成分の主機能は、一方でそれらを生物学的に利用可能としつつ
、可逆的にそれらを複合体に形成することによる、培養培地中の脂肪酸の解毒であると考
えられる。
血清アルブミンは、浸透圧を与えることは別にして、種々の化合物、例えば、タンパク
質、脂質、ビタミン、小分子等のための、血中の重要な輸送タンパク質である。
質、脂質、ビタミン、小分子等のための、血中の重要な輸送タンパク質である。
血清アルブミンに結合した脂質は、ジおよびトリグリセリド、およびコレステロールの
エステルおよびリン脂質を含むが、しかしその大部分(>90%)は遊離脂肪酸の形態で
ある;「遊離」とは:エステル化されていないことまたは共有結合的に結合していないこ
とを意味する。アルブミンに結合したこれら遊離脂肪酸の中で、90%以上はC14〜C
20の範囲の中鎖‐および長鎖脂肪酸であり、主として:ミリスチン酸(C14:0)、
パルミチン酸(C16:0)、パルミトオレイン酸(C16:1)、ステアリン酸(C1
8:0)、オレイン酸(C18:1)、リノール酸(C18:2)およびアラキドン酸(
C20:4)である。
エステルおよびリン脂質を含むが、しかしその大部分(>90%)は遊離脂肪酸の形態で
ある;「遊離」とは:エステル化されていないことまたは共有結合的に結合していないこ
とを意味する。アルブミンに結合したこれら遊離脂肪酸の中で、90%以上はC14〜C
20の範囲の中鎖‐および長鎖脂肪酸であり、主として:ミリスチン酸(C14:0)、
パルミチン酸(C16:0)、パルミトオレイン酸(C16:1)、ステアリン酸(C1
8:0)、オレイン酸(C18:1)、リノール酸(C18:2)およびアラキドン酸(
C20:4)である。
アルブミンは、異なる親和性により、いくつかの結合部位でこれらの脂肪酸に可逆的に
結合する。脂肪酸のどれだけが、およびどのタイプがドナー由来のアルブミン試料に結合
するかは、生理学的に広い変動を有し、脂肪酸の鎖長および不飽和度等の化学的特徴に左
右されるが、しかし同様にアルブミンのドナー由来の生物学的特徴、例えば:種、品種お
よび性、ならびに栄養状態および活動状態等、にも左右される。
結合する。脂肪酸のどれだけが、およびどのタイプがドナー由来のアルブミン試料に結合
するかは、生理学的に広い変動を有し、脂肪酸の鎖長および不飽和度等の化学的特徴に左
右されるが、しかし同様にアルブミンのドナー由来の生物学的特徴、例えば:種、品種お
よび性、ならびに栄養状態および活動状態等、にも左右される。
市販のBSAが結合される脂肪酸の量および種類は、製造者によって使用される製造プ
ロトコルに左右され、各バッチで変動する。
ロトコルに左右され、各バッチで変動する。
古典的なアルブミン調製品は、いわゆる:Cohn画分Vアルブミン製品をもたらす、
冷エタノール分画(Cohn et al.,1946,J.of the Amer.
Chem.Soc.,vol.68,p459)によって得られた。それ以来、例えば、
生化学および組織培養における使用のための、多種多様の血清アルブミンの種類および品
質が市販されてきた。血清アルブミンの変動性に関する広範囲な総説が、Janatov
aによってなされた(1974、J.of Medicine,vol.5,p.149
)。
冷エタノール分画(Cohn et al.,1946,J.of the Amer.
Chem.Soc.,vol.68,p459)によって得られた。それ以来、例えば、
生化学および組織培養における使用のための、多種多様の血清アルブミンの種類および品
質が市販されてきた。血清アルブミンの変動性に関する広範囲な総説が、Janatov
aによってなされた(1974、J.of Medicine,vol.5,p.149
)。
実験条件下において、アルブミンの分子当たり10個を超える脂肪酸が結合され得たが
(Spector & Hoak,1969,Anal.Biochem.,vol32
,p.297)、生理的にアルブミンは、アルブミンのモル当たり約0.3ないし3モル
の間の脂肪酸を保有し得る(Hennig & Watkins,1989,Am.J.
of Clin.Nutr.,vol.49,p.301)。
(Spector & Hoak,1969,Anal.Biochem.,vol32
,p.297)、生理的にアルブミンは、アルブミンのモル当たり約0.3ないし3モル
の間の脂肪酸を保有し得る(Hennig & Watkins,1989,Am.J.
of Clin.Nutr.,vol.49,p.301)。
低含量の脂肪酸を有する、すなわち0.1モルの脂肪酸/1モルのアルブミン未満の市
販の血清アルブミンもまた利用可能である;当該アルブミン製品は、種々の利用可能な技
術、例えば、有機溶媒による抽出および/または活性炭への吸着等の一つを使用して、慎
重に脱脂されている。しかしながら非常に低い脂質の負荷レベルを得るためには、非常に
低いpH値での積極的な抽出方法が必要とされ、当該方法はアルブミンの変性をもたらし
得る。
販の血清アルブミンもまた利用可能である;当該アルブミン製品は、種々の利用可能な技
術、例えば、有機溶媒による抽出および/または活性炭への吸着等の一つを使用して、慎
重に脱脂されている。しかしながら非常に低い脂質の負荷レベルを得るためには、非常に
低いpH値での積極的な抽出方法が必要とされ、当該方法はアルブミンの変性をもたらし
得る。
産業規模の生物学的プロセスにおける使用のための大量の血清アルブミンは、実際上、
食肉産業の副産物として、商業的にウシからのみ効率的に入手が可能である。
食肉産業の副産物として、商業的にウシからのみ効率的に入手が可能である。
インビトロでの細胞増殖における使用のために適した種々の種類のBSAの中で、いく
つかが特定の細胞タイプについての使用に推奨される。一例はBovoLep(登録商標
)BSA(Bovogen,Australia)であり、これは培養におけるレプトス
ピラ(Leptospira)の成長を促進するために推奨される;これは、いくつかの
植物性脂肪酸により強化された標準的なBSAである。
つかが特定の細胞タイプについての使用に推奨される。一例はBovoLep(登録商標
)BSA(Bovogen,Australia)であり、これは培養におけるレプトス
ピラ(Leptospira)の成長を促進するために推奨される;これは、いくつかの
植物性脂肪酸により強化された標準的なBSAである。
完全EMJH培養培地は、次に培養においてレプトスピラ(Leptospira)の
増殖に重要であると知られる、すべての脂肪酸:パルミチン酸(C16:0)、ステアリ
ン酸(C18:0)およびオレイン酸(C18:1)を供給する(Johnson &
Gary,1963,前掲)。
増殖に重要であると知られる、すべての脂肪酸:パルミチン酸(C16:0)、ステアリ
ン酸(C18:0)およびオレイン酸(C18:1)を供給する(Johnson &
Gary,1963,前掲)。
このEMJH培地は、L.インターロガンス(L.interrogans)(広義)
の関連する血清型のほとんどの増殖を可能とする。レプトスピラ(Leptospira
)の工業的規模の増殖のための典型的な条件は、28〜30℃、pO2およびpH制御下
での撹拌装置を装備した標準的ファーメンター槽においてである。それにもかかわらず、
レプトスピラ(Leptospira)の増殖は、比較的に緩やかである:ビルレンスお
よびインビトロでの増殖条件への適応レベルに依存して、12ないし24時間の間の世代
時間が報告されている。結果として:高いバイオマスに達するために、増殖プロセスは、
接種菌液密度に依存して比較的に長く、典型的には4〜7日を要し、十分な接種菌液を調
製するために数回の前培養を要する。これが生産者のファーメンター能力に大きな負荷を
提起する。同様に、この長期にわたる培養時間は、例えば、より短い倍加時間を有する細
菌、酵母または糸状菌による汚染が発生する大きなリスクを提起する。
の関連する血清型のほとんどの増殖を可能とする。レプトスピラ(Leptospira
)の工業的規模の増殖のための典型的な条件は、28〜30℃、pO2およびpH制御下
での撹拌装置を装備した標準的ファーメンター槽においてである。それにもかかわらず、
レプトスピラ(Leptospira)の増殖は、比較的に緩やかである:ビルレンスお
よびインビトロでの増殖条件への適応レベルに依存して、12ないし24時間の間の世代
時間が報告されている。結果として:高いバイオマスに達するために、増殖プロセスは、
接種菌液密度に依存して比較的に長く、典型的には4〜7日を要し、十分な接種菌液を調
製するために数回の前培養を要する。これが生産者のファーメンター能力に大きな負荷を
提起する。同様に、この長期にわたる培養時間は、例えば、より短い倍加時間を有する細
菌、酵母または糸状菌による汚染が発生する大きなリスクを提起する。
その結果として、インビトロでの培養におけるレプトスピラ(Leptospira)
抗原の生産のための改良された方法に対する必要性が存在する。
抗原の生産のための改良された方法に対する必要性が存在する。
当該技術分野における文献は、インビトロでの培養におけるレプトスピラ(Lepto
spira)の増殖を改良するためのいくつかの試みを記載している。EMJH培地のい
くつかの改変は、血清を再導入し、またはさらなるポリソルベート、および/または加水
分解物を添加したものであった。しかしながら当該の強化EMJH培地は、大規模なレプ
トスピラ(Leptospira)のインビトロでの増殖においては一般的に使用されず
、しかし診断において、臨床検体からの最も要求の厳しいレプトスピラ(Leptosp
ira)の低い含量でさえも検出し増殖するために、典型的には半流動培地として使用さ
れる。
spira)の増殖を改良するためのいくつかの試みを記載している。EMJH培地のい
くつかの改変は、血清を再導入し、またはさらなるポリソルベート、および/または加水
分解物を添加したものであった。しかしながら当該の強化EMJH培地は、大規模なレプ
トスピラ(Leptospira)のインビトロでの増殖においては一般的に使用されず
、しかし診断において、臨床検体からの最も要求の厳しいレプトスピラ(Leptosp
ira)の低い含量でさえも検出し増殖するために、典型的には半流動培地として使用さ
れる。
典型的にレプトスピラ(Leptospira)は、不活化レプトスピラ症ワクチンを
調製するためにインビトロで増殖される。増殖期の後、一般的に下流加工工程は、バクテ
リンを生産するために、最終培養産物の不活性化によって開始する。不活性化は、いくつ
かの方法、通常は化学的不活性化、例えばホルマリン、チオメルサール、ベータプロピオ
ラクトン(BPL)またはベータ‐エタノールアミン(BEA)等によって実施され得る
。次の段階は、不活性化された培養物を、例えば遠心分離または濾過によってしばしば濃
縮し、精製することである。生じた抗原調製品は、次にワクチンに製剤化される。
調製するためにインビトロで増殖される。増殖期の後、一般的に下流加工工程は、バクテ
リンを生産するために、最終培養産物の不活性化によって開始する。不活性化は、いくつ
かの方法、通常は化学的不活性化、例えばホルマリン、チオメルサール、ベータプロピオ
ラクトン(BPL)またはベータ‐エタノールアミン(BEA)等によって実施され得る
。次の段階は、不活性化された培養物を、例えば遠心分離または濾過によってしばしば濃
縮し、精製することである。生じた抗原調製品は、次にワクチンに製剤化される。
バイオマスに基づいて不活化レプトスピラ症ワクチンを製剤化することは、常法であり
、それによって動物の一用量が、一定数の細胞、典型的には個々の血清型の約10^9細
胞/用量を含むように作成される。しかしながら、(化学的な)不活性化が細菌細胞に損
傷を与えるので、この細胞数は、製剤化された最終製品に基づいては成され得ない。それ
故に細胞数は、その不活性化の前に全細胞(生菌および死菌)を計数することによって、
最終培養物から決定される。この細胞数により、どれだけの用量/mlが製剤化後に最終
製品に割り当てられ得るか計算される。製品の市場への出荷のための品質管理チェックと
して、最終ワクチンの免疫学的有効性(efficacy)(別名、効力(potenc
y))が検証される。規制当局により現在要求されるバッチ効力試験は、ハムスターにお
けるワクチン接種および攻撃感染を用いるインビボでの試験においてである(欧州薬局方
モノグラフ0447、イヌ用レプトスピラ(Leptospira)ワクチン)。
、それによって動物の一用量が、一定数の細胞、典型的には個々の血清型の約10^9細
胞/用量を含むように作成される。しかしながら、(化学的な)不活性化が細菌細胞に損
傷を与えるので、この細胞数は、製剤化された最終製品に基づいては成され得ない。それ
故に細胞数は、その不活性化の前に全細胞(生菌および死菌)を計数することによって、
最終培養物から決定される。この細胞数により、どれだけの用量/mlが製剤化後に最終
製品に割り当てられ得るか計算される。製品の市場への出荷のための品質管理チェックと
して、最終ワクチンの免疫学的有効性(efficacy)(別名、効力(potenc
y))が検証される。規制当局により現在要求されるバッチ効力試験は、ハムスターにお
けるワクチン接種および攻撃感染を用いるインビボでの試験においてである(欧州薬局方
モノグラフ0447、イヌ用レプトスピラ(Leptospira)ワクチン)。
レプトスピラ(Leptospira)ワクチン用のインビトロでの効力試験法が知ら
れている(Ruby et al.,1992、Biologicals,vol.20
,p.259)。この試験法は、血清型特異的抗体および標準品を使用して、血清学的試
験法によって、最終ワクチンの抗原マスを定量することに基づいている。レプトスピラ(
Leptospira)バクテリンの抗原マスと免疫学的効力の間の相互関係は周知であ
るが、レプトスピラ症ワクチンの製剤化は、いまだにバイオマス/用量に基づいている。
れている(Ruby et al.,1992、Biologicals,vol.20
,p.259)。この試験法は、血清型特異的抗体および標準品を使用して、血清学的試
験法によって、最終ワクチンの抗原マスを定量することに基づいている。レプトスピラ(
Leptospira)バクテリンの抗原マスと免疫学的効力の間の相互関係は周知であ
るが、レプトスピラ症ワクチンの製剤化は、いまだにバイオマス/用量に基づいている。
バイオマスに基づくレプトスピラ(Leptospira)バクテリンワクチンの調製
の結果は、当該ワクチンがLPSのようには免疫化にほとんど寄与せず、それどころか局
所および/または全身の有害なワクチン接種反応をもたらし得る、タンパク質および細菌
の他の成分のある量を含むというものである。この問題は、数種のレプトスピラの抗原を
組み合わせるワクチンの場合に悪化する。レプトスピラ症ワクチンの安全性を改良するた
めの試みにおいて、下流加工工程における追加の精製段階が一般的に適用される。有害な
ワクチン接種反応の恐れはまた、ヒトの使用のためのバクテリンを含むレプトスピラ症ワ
クチンが、今日一般的に市販されていないことの主な理由でもある。
の結果は、当該ワクチンがLPSのようには免疫化にほとんど寄与せず、それどころか局
所および/または全身の有害なワクチン接種反応をもたらし得る、タンパク質および細菌
の他の成分のある量を含むというものである。この問題は、数種のレプトスピラの抗原を
組み合わせるワクチンの場合に悪化する。レプトスピラ症ワクチンの安全性を改良するた
めの試みにおいて、下流加工工程における追加の精製段階が一般的に適用される。有害な
ワクチン接種反応の恐れはまた、ヒトの使用のためのバクテリンを含むレプトスピラ症ワ
クチンが、今日一般的に市販されていないことの主な理由でもある。
起こりうるワクチン接種反応を克服するために、いくつかのグループが、レプトスピラ
(Leptospira)培養用の適応培地を適用することによって、(混合)レプトス
ピラ症ワクチンの非防御および培地由来のワクチン成分の重荷を低減することを試みた。
しかしながら、これらの培地は、さらにレプトスピラ(Leptospira)増殖を支
持するために要求される必須長鎖脂肪酸をなお供給しなければならない。この事が、これ
らの脂肪酸の固有の毒性に対処するための解決法を要求したのは、現在のところ、これら
の脂肪酸が血清またはBSAによって提供される等の多量のタンパク質によって解毒され
得なかったからである。一つのアプローチ法は、ポリソルベートそれ自体を、イオン交換
によってまたはポリビニルピロリドンまたは活性炭による抽出によって、解毒することで
あった(Bey & Johnson,1978,Inf.& Imm.,vol.19
,p.562)。別のアプローチ法がWO 2006/113601に記載されており、
そこで脂肪酸の毒性は、無タンパク質培養培地を、繰り返し少量のポリソルベートにより
補給することによって、いわゆる、制御された準最大な増殖速度におけるバイオマスの増
加に基づく、流加培養法によって制限される。今日まで、無タンパク質で培養されたレプ
トスピラ(Leptospira)に基づく商業的なレプトスピラ症ワクチンは市販され
ておらず、伝統的なワクチンは未だに下流加工工程の精製に頼っている。
(Leptospira)培養用の適応培地を適用することによって、(混合)レプトス
ピラ症ワクチンの非防御および培地由来のワクチン成分の重荷を低減することを試みた。
しかしながら、これらの培地は、さらにレプトスピラ(Leptospira)増殖を支
持するために要求される必須長鎖脂肪酸をなお供給しなければならない。この事が、これ
らの脂肪酸の固有の毒性に対処するための解決法を要求したのは、現在のところ、これら
の脂肪酸が血清またはBSAによって提供される等の多量のタンパク質によって解毒され
得なかったからである。一つのアプローチ法は、ポリソルベートそれ自体を、イオン交換
によってまたはポリビニルピロリドンまたは活性炭による抽出によって、解毒することで
あった(Bey & Johnson,1978,Inf.& Imm.,vol.19
,p.562)。別のアプローチ法がWO 2006/113601に記載されており、
そこで脂肪酸の毒性は、無タンパク質培養培地を、繰り返し少量のポリソルベートにより
補給することによって、いわゆる、制御された準最大な増殖速度におけるバイオマスの増
加に基づく、流加培養法によって制限される。今日まで、無タンパク質で培養されたレプ
トスピラ(Leptospira)に基づく商業的なレプトスピラ症ワクチンは市販され
ておらず、伝統的なワクチンは未だに下流加工工程の精製に頼っている。
それにもかかわらず、これらの先行技術の研究のどれも、産生されたレプトスピラ(L
eptospira)の抗原マスおよび/または免疫原性に関する、培養培地に対する、
または増殖条件に対する変更のいかなる効果も報告しなかった。それ故にこれらのすべて
は、レプトスピラ(Leptospira)バイオマスの産生のための本質的に別の方法
である。
eptospira)の抗原マスおよび/または免疫原性に関する、培養培地に対する、
または増殖条件に対する変更のいかなる効果も報告しなかった。それ故にこれらのすべて
は、レプトスピラ(Leptospira)バイオマスの産生のための本質的に別の方法
である。
それ故に本発明の目的は、レプトスピラ(Leptospira)抗原マスの生産の改
良を提供すること、およびそこから生じる改良されたワクチンを提供することである。
良を提供すること、およびそこから生じる改良されたワクチンを提供することである。
驚いたことに、この目的が期待できること、ならびに先行技術の不利な点が、レプトス
ピラ(Leptospira)の培養物を特定の長鎖不飽和脂肪酸:多価不飽和C18脂
肪酸により補給することによって克服され得ること、が見出だされた。これは、バイオマ
スにおける3倍までのいかなる増加をも超える、抗原マスの迅速でかつ強力な増加をもた
らす。
ピラ(Leptospira)の培養物を特定の長鎖不飽和脂肪酸:多価不飽和C18脂
肪酸により補給することによって克服され得ること、が見出だされた。これは、バイオマ
スにおける3倍までのいかなる増加をも超える、抗原マスの迅速でかつ強力な増加をもた
らす。
この発見は、いくつかの有利な利用法、例えば、レプトスピラ(Leptospira
)に対する改良されたワクチンの生産のために使用され得る、増加した抗原マスを有する
レプトスピラ(Leptospira)の産生等への道を開く。抗原量の増加がバイオマ
スの増加を超えることが見出だされたので、補給されたレプトスピラ(Leptospi
ra)培養物を補給されなかった培養物と比較すると、それ故に一定の細菌細胞当たりの
正味の抗原量の増加が存在する。
)に対する改良されたワクチンの生産のために使用され得る、増加した抗原マスを有する
レプトスピラ(Leptospira)の産生等への道を開く。抗原量の増加がバイオマ
スの増加を超えることが見出だされたので、補給されたレプトスピラ(Leptospi
ra)培養物を補給されなかった培養物と比較すると、それ故に一定の細菌細胞当たりの
正味の抗原量の増加が存在する。
当該増加された抗原マスを有するレプトスピラ(Leptospira)は、減少した
量の他の細菌成分および培養物由来成分を有し、先行技術のワクチンと同じ抗原含量を有
するワクチンを調製するために、今や使用され得る。これは、下流プロセシングにとって
、およびワクチンの副作用のレベルにとって好ましい。代わりに:増加した抗原マスを有
するワクチンは、非特異的成分に関し従前と同じレベルで今や適用され得る。ワクチン接
種される標的の安全性にとって好ましいのは別にして、当業者にとってこれらすべての改
良がまた、高度に経済的観点に関連することは明らかであろう。
量の他の細菌成分および培養物由来成分を有し、先行技術のワクチンと同じ抗原含量を有
するワクチンを調製するために、今や使用され得る。これは、下流プロセシングにとって
、およびワクチンの副作用のレベルにとって好ましい。代わりに:増加した抗原マスを有
するワクチンは、非特異的成分に関し従前と同じレベルで今や適用され得る。ワクチン接
種される標的の安全性にとって好ましいのは別にして、当業者にとってこれらすべての改
良がまた、高度に経済的観点に関連することは明らかであろう。
さらに、多価不飽和C18脂肪酸を補給されたレプトスピラ(Leptospira)
培養物は、今や従来よりも数日早く先行技術の抗原マスレベルに達する。それ故に培養時
間が今や大幅に短縮され得るので、当該培養物は、今やより迅速に、より経済的に、なら
びに汚染の機会が少なくて生産され得る。代わりに:もし多価不飽和C18脂肪酸を補給
されたレプトスピラ(Leptospira)培養物が、従来と同様に最大のバイオマス
まで増殖することが許されるならば、今や増加された量の抗原を収集することができる。
培養物は、今や従来よりも数日早く先行技術の抗原マスレベルに達する。それ故に培養時
間が今や大幅に短縮され得るので、当該培養物は、今やより迅速に、より経済的に、なら
びに汚染の機会が少なくて生産され得る。代わりに:もし多価不飽和C18脂肪酸を補給
されたレプトスピラ(Leptospira)培養物が、従来と同様に最大のバイオマス
まで増殖することが許されるならば、今や増加された量の抗原を収集することができる。
本発明は、現在のレプトスピラ(Leptospira)の増殖および抗原産生用の現
在の培養培地の改良、ならびに最適(半‐)合成培地の合理的な設計を可能とする。
在の培養培地の改良、ならびに最適(半‐)合成培地の合理的な設計を可能とする。
レプトスピラ(Leptospira)培養物を多価不飽和C18脂肪酸により補給す
るために、多価不飽和C18脂肪酸が純粋であるかまたは富んでいる化合物および/また
は組成物が使用され得る;経済的な例は植物油である。
るために、多価不飽和C18脂肪酸が純粋であるかまたは富んでいる化合物および/また
は組成物が使用され得る;経済的な例は植物油である。
さらに、レプトスピラ(Leptospira)において、バイオマス産生のためのプ
ロセスおよびLPS抗原の産生のためのプロセスは、大いに分離していると思われるので
、分離したプロセス設計が今や考えられ、そこでは初期の段階において、高含量のレプト
スピラ(Leptospira)バイオマスが産生され、分離した後の段階において、そ
れらを多価不飽和C18脂肪酸により補給することによってLPS抗原が産生されるよう
に誘導される。これら二段階の分離は、次に両プロセスにとって、それらの異なる関連パ
ラメータ、例えば、培養時間、培養温度、等に関して分離して最適化されることを可能と
する。これはまた、例えば、中間の貯蔵、収集および/または精製を可能とすることによ
って、いくつかの物流上および設計上の優位さも提供する。
ロセスおよびLPS抗原の産生のためのプロセスは、大いに分離していると思われるので
、分離したプロセス設計が今や考えられ、そこでは初期の段階において、高含量のレプト
スピラ(Leptospira)バイオマスが産生され、分離した後の段階において、そ
れらを多価不飽和C18脂肪酸により補給することによってLPS抗原が産生されるよう
に誘導される。これら二段階の分離は、次に両プロセスにとって、それらの異なる関連パ
ラメータ、例えば、培養時間、培養温度、等に関して分離して最適化されることを可能と
する。これはまた、例えば、中間の貯蔵、収集および/または精製を可能とすることによ
って、いくつかの物流上および設計上の優位さも提供する。
このすべては、多価不飽和C18脂肪酸が先行技術において、レプトスピラ(Lept
ospira)増殖条件に関連してほとんど述べられていないので、全く予想されていな
かった:Stern et al.(1969,Eur.J.of Biochem.,
vol.8,p.101)は、レプトスピラ(Leptospira)がリノール酸(C
18:2)を培養培地から細胞膜脂質に取り込むことを記載した。Johnson et
al.(1970,Inf.&Imm.,vol.2,p.286)は、リノール酸が
レプトスピラ(Leptospira)培養物を増殖するために使用されたBSAに存在
した脂肪酸のリストの一つであったと報告したが、しかし具体的な含量を与えなかった。
ほとんどどの刊行物も、レプトスピラ(Leptospira)培養に関連してリノレン
酸(C18:3)について述べておらず、しかもその利益については皆無である。結局、
先行技術のいかなる記事も、その潜在的な毒性を除いて、多価不飽和C18脂肪酸がレプ
トスピラ(Leptospira)との特別な関連にあることを全く述べていない。リノ
ール酸またはリノレン酸は、レプトスピラ(Leptospira)抗原、特にLPS抗
原の産生について特別の関連があるとは決して述べられなかったかまたは決して示唆され
なかった。
ospira)増殖条件に関連してほとんど述べられていないので、全く予想されていな
かった:Stern et al.(1969,Eur.J.of Biochem.,
vol.8,p.101)は、レプトスピラ(Leptospira)がリノール酸(C
18:2)を培養培地から細胞膜脂質に取り込むことを記載した。Johnson et
al.(1970,Inf.&Imm.,vol.2,p.286)は、リノール酸が
レプトスピラ(Leptospira)培養物を増殖するために使用されたBSAに存在
した脂肪酸のリストの一つであったと報告したが、しかし具体的な含量を与えなかった。
ほとんどどの刊行物も、レプトスピラ(Leptospira)培養に関連してリノレン
酸(C18:3)について述べておらず、しかもその利益については皆無である。結局、
先行技術のいかなる記事も、その潜在的な毒性を除いて、多価不飽和C18脂肪酸がレプ
トスピラ(Leptospira)との特別な関連にあることを全く述べていない。リノ
ール酸またはリノレン酸は、レプトスピラ(Leptospira)抗原、特にLPS抗
原の産生について特別の関連があるとは決して述べられなかったかまたは決して示唆され
なかった。
それどころか、当該分野における先行技術の総意は、レプトスピラ(Leptospi
ra)に関連する脂肪酸はパルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸であり、しかも
これらはすべてポリソルベート80によって標準的な培養培地中に豊富に供給されている
というものである。このように、「適切な(adequate)」量のLPS抗原を有す
るレプトスピラ(Leptospira)が長年にわたり生産されてきて、どの試みも、
レプトスピラ(Leptospira)バイオマス単位当たりのLPS抗原量を改良する
ことを記述または示唆してこなかった。また、そうしようとする意欲も存在しなかったの
は、レプトスピラ(Leptospira)ワクチンがバイオマスに基づいて日常的に製
剤化され、それ故に培養物中のレプトスピラ(Leptospira)細胞数を最大化す
ることが、常に当該技術分野における主な焦点であり、それらの抗原マスではなかったか
らである。
ra)に関連する脂肪酸はパルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸であり、しかも
これらはすべてポリソルベート80によって標準的な培養培地中に豊富に供給されている
というものである。このように、「適切な(adequate)」量のLPS抗原を有す
るレプトスピラ(Leptospira)が長年にわたり生産されてきて、どの試みも、
レプトスピラ(Leptospira)バイオマス単位当たりのLPS抗原量を改良する
ことを記述または示唆してこなかった。また、そうしようとする意欲も存在しなかったの
は、レプトスピラ(Leptospira)ワクチンがバイオマスに基づいて日常的に製
剤化され、それ故に培養物中のレプトスピラ(Leptospira)細胞数を最大化す
ることが、常に当該技術分野における主な焦点であり、それらの抗原マスではなかったか
らである。
なぜレプトスピラ(Leptospira)が、そのLPS抗原の産生のために不飽和
C18脂肪酸を要求するのか、またはどのようにして不飽和C18脂肪酸が、LPS分子
(の一部)を産生するためにレプトスピラ(Leptospira)によって使用される
のかは、知られていない。
C18脂肪酸を要求するのか、またはどのようにして不飽和C18脂肪酸が、LPS分子
(の一部)を産生するためにレプトスピラ(Leptospira)によって使用される
のかは、知られていない。
発明者らは、これらの知見を説明し得る理論またはモデルによって縛られることを欲す
るものではないが、発明者らは今、レプトスピラ(Leptospira)における細菌
の増殖を対象とする生物学的プロセス、およびLPSの産生を対象とする生物学的プロセ
スが、異なる栄養を要求する部分的に別々の酵素系に頼っているのかもしれないと推測し
ている。これは、多価不飽和C18脂肪酸による補給がまたバイオマスのいくらかの増加
を生じ得るという事実とは別である。
るものではないが、発明者らは今、レプトスピラ(Leptospira)における細菌
の増殖を対象とする生物学的プロセス、およびLPSの産生を対象とする生物学的プロセ
スが、異なる栄養を要求する部分的に別々の酵素系に頼っているのかもしれないと推測し
ている。これは、多価不飽和C18脂肪酸による補給がまたバイオマスのいくらかの増加
を生じ得るという事実とは別である。
発明者らはさらに、現在使用されているEMJH等の標準的なレプトスピラ(Lept
ospira)培養培地が、レプトスピラ(Leptospira)抗原の十分な産生の
ために最適下限である量の多価不飽和C18脂肪酸しか含んでいないと推測している;こ
れは、当該培地がレプトスピラ(Leptospira)バイオマスの形成のために必要
とされる豊富な脂肪酸を供給すると言う事実には依存しない。結果として、これらの先行
技術のレプトスピラ(Leptospira)培養培地において、多価不飽和C18脂肪
酸は迅速に枯渇され、抗原産生は、その後最大細胞数に達するかなり前に停止する。これ
が、LPS抗原を産生するレプトスピラ(Leptospira)の一部の能力しかこれ
まで使用されてこなかった原因である。
ospira)培養培地が、レプトスピラ(Leptospira)抗原の十分な産生の
ために最適下限である量の多価不飽和C18脂肪酸しか含んでいないと推測している;こ
れは、当該培地がレプトスピラ(Leptospira)バイオマスの形成のために必要
とされる豊富な脂肪酸を供給すると言う事実には依存しない。結果として、これらの先行
技術のレプトスピラ(Leptospira)培養培地において、多価不飽和C18脂肪
酸は迅速に枯渇され、抗原産生は、その後最大細胞数に達するかなり前に停止する。これ
が、LPS抗原を産生するレプトスピラ(Leptospira)の一部の能力しかこれ
まで使用されてこなかった原因である。
それ故に一態様において、本発明は、レプトスピラ(Leptospira)培養物の
抗原マスを増加するための方法を提供し、該方法は前記のレプトスピラ(Leptosp
ira)培養物を多価不飽和C18脂肪酸により補給する段階を含む。
抗原マスを増加するための方法を提供し、該方法は前記のレプトスピラ(Leptosp
ira)培養物を多価不飽和C18脂肪酸により補給する段階を含む。
本発明に関する「抗原マス(antigenic mass)」とは、一定数のレプト
スピラ(Leptospira)細胞のLPS抗原量であり、それはElisa等の血清
学的アッセイで測定され得る。本明細書において特定の抗原マスと表現されるのは:一定
数のレプトスピラ(Leptospira)細胞のLPS上の免疫優性な防御抗原エピト
ープの量であり、1×10^9レプトスピラ(Leptospira)細胞当たりのレプ
トスピラ(Leptospira)LPS抗原の血清学的単位数として表現される。
スピラ(Leptospira)細胞のLPS抗原量であり、それはElisa等の血清
学的アッセイで測定され得る。本明細書において特定の抗原マスと表現されるのは:一定
数のレプトスピラ(Leptospira)細胞のLPS上の免疫優性な防御抗原エピト
ープの量であり、1×10^9レプトスピラ(Leptospira)細胞当たりのレプ
トスピラ(Leptospira)LPS抗原の血清学的単位数として表現される。
レプトスピラ(Leptospira)細胞は、生菌または死菌の全対の細胞が不活性
化の前に通常の手順に従って計数される;これが本発明の「バイオマス」として理解され
るものである。
化の前に通常の手順に従って計数される;これが本発明の「バイオマス」として理解され
るものである。
従って本発明にとって、本発明の方法を適用する結果として、レプトスピラ(Lept
ospira)細胞当たりの抗原量が増加する場合に、レプトスピラ(Leptospi
ra)培養物の抗原マスは増加する。
ospira)細胞当たりの抗原量が増加する場合に、レプトスピラ(Leptospi
ra)培養物の抗原マスは増加する。
これは、レプトスピラ(Leptospira)を増殖することによる、レプトスピラ
(Leptospira)抗原を産生するための先行技術の方法における効果とは反対で
ある;該方法はレプトスピラ(Leptospira)バイオマスを増加することに集中
していたが、しかし細胞当たりの抗原量を改良しなかった。結果として、バイオマスが増
加しかつ抗原量が増加しない場合、それは抗原量/バイオマス単位の比率の減少を引き起
こす。
(Leptospira)抗原を産生するための先行技術の方法における効果とは反対で
ある;該方法はレプトスピラ(Leptospira)バイオマスを増加することに集中
していたが、しかし細胞当たりの抗原量を改良しなかった。結果として、バイオマスが増
加しかつ抗原量が増加しない場合、それは抗原量/バイオマス単位の比率の減少を引き起
こす。
抗原マスは、当該技術分野において周知の用語であり、典型的には測定される抗原:本
明細書ではレプトスピラ(Leptospira)LPSに特異的である抗体を使用する
、Elisa等の血清学的分析法を使用して測定される。試料中に検出される抗原量は、
その時、任意単位数で表現され、ここでこれらの単位は、例えば、1000単位を含むと
設定されている標準試料中の抗原量を参照して定義される。結果として、抗原量スコアの
絶対値は任意であり、それが適用される個別の試験、および抗体および使用された標準試
料に左右されるからである。しかしながら重要であるのは、同じ標準試料に対する同じ条
件下で試験した試料スコア間の相対的な差である。これは、例えば、測定された抗原量に
おける差として表現され得るか(例えば、250対500抗原単位/ml)、または便宜
上パーセンテージとして表現され得る。二つの試料間の差の当該パーセンテージは、同じ
試料が、異なる抗体または異なる(が適切な)標準試料により分析されるときに、同様に
あてはまるであろう。
明細書ではレプトスピラ(Leptospira)LPSに特異的である抗体を使用する
、Elisa等の血清学的分析法を使用して測定される。試料中に検出される抗原量は、
その時、任意単位数で表現され、ここでこれらの単位は、例えば、1000単位を含むと
設定されている標準試料中の抗原量を参照して定義される。結果として、抗原量スコアの
絶対値は任意であり、それが適用される個別の試験、および抗体および使用された標準試
料に左右されるからである。しかしながら重要であるのは、同じ標準試料に対する同じ条
件下で試験した試料スコア間の相対的な差である。これは、例えば、測定された抗原量に
おける差として表現され得るか(例えば、250対500抗原単位/ml)、または便宜
上パーセンテージとして表現され得る。二つの試料間の差の当該パーセンテージは、同じ
試料が、異なる抗体または異なる(が適切な)標準試料により分析されるときに、同様に
あてはまるであろう。
本発明における使用のために抗原量を決定するための好ましい試験法は、Elisaで
あり、該Elisaは特定のレプトスピラ(Leptospira)血清群または血清型
のLPS抗原に特異的である抗体を使用する。当該抗体は、MATにおいてレプトスピラ
(Leptospira)を凝集し得る。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体であり
、試料は希釈して使用し得るように十分に高力価である。
あり、該Elisaは特定のレプトスピラ(Leptospira)血清群または血清型
のLPS抗原に特異的である抗体を使用する。当該抗体は、MATにおいてレプトスピラ
(Leptospira)を凝集し得る。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体であり
、試料は希釈して使用し得るように十分に高力価である。
当業者に長年にわたり周知されてきた、レプトスピラ(Leptospira)用の抗
原量分析を実施するためのプロトコルおよび材料は、一般的に利用可能であり、本明細書
で詳細に記載および例示される。例えば、ATCC(Manassas、VA,USA)
またはCNCM(Institut Pasteur,Paris,France)等の
公的生物資源センターは、ほとんどの血清型のレプトスピラ(Leptospira)属
の細菌を提供することができ、ならびに血清型特異的かつ凝集性モノクローナル抗体、ま
たはそのモノクローナルを発現するマウスハイブリドーマ細胞系を提供することができる
(1989、J.of Gen.Microbiol.,vol.135,p.73)。
原量分析を実施するためのプロトコルおよび材料は、一般的に利用可能であり、本明細書
で詳細に記載および例示される。例えば、ATCC(Manassas、VA,USA)
またはCNCM(Institut Pasteur,Paris,France)等の
公的生物資源センターは、ほとんどの血清型のレプトスピラ(Leptospira)属
の細菌を提供することができ、ならびに血清型特異的かつ凝集性モノクローナル抗体、ま
たはそのモノクローナルを発現するマウスハイブリドーマ細胞系を提供することができる
(1989、J.of Gen.Microbiol.,vol.135,p.73)。
代わりに、当該材料は、標準的な方法を使用して日常的に内製で産生し得る:細菌を、
感染したヒトまたは動物から獲得し得て(適正なバイオセイフティー対策を適用の下)、
これらを通常の技術を使用して特性化し得る;抗原を、日常的な技術を使用してレプトス
ピラ(Leptospira)を増殖することによって産生し得る;同様に血清型特異的
抗体を、実験動物の免疫化によって獲得し得て、ならびにモノクローナル抗体を産生する
方法は周知である。当業者は、これらの抗体の特異性および力価を、周知のMATを実施
することによって容易に測定し得る。
感染したヒトまたは動物から獲得し得て(適正なバイオセイフティー対策を適用の下)、
これらを通常の技術を使用して特性化し得る;抗原を、日常的な技術を使用してレプトス
ピラ(Leptospira)を増殖することによって産生し得る;同様に血清型特異的
抗体を、実験動物の免疫化によって獲得し得て、ならびにモノクローナル抗体を産生する
方法は周知である。当業者は、これらの抗体の特異性および力価を、周知のMATを実施
することによって容易に測定し得る。
同様に、いくつかの公的研究所および国際機関が、例えば、試験法開発のために、レプ
トスピラ(Leptospira)細菌、‐抗原、および特異的抗体の標準試料を提供す
る。例えば、王立熱帯研究所(Amsterdam,the Netherlands)
であり、ここは、WHO、FAOおよびOIEにとってレプトスピラ(Leptospi
ra)に関する標準センターである。同様に、USDA(Ames,IA,USA)は、
主要なレプトスピラ(Leptospira)血清型の標準的な基準バクテリンを提供し
、ならびに抗原量(能力)ELISAを設定し実施するために、関係者をプロトコルおよ
び材料により支える。
トスピラ(Leptospira)細菌、‐抗原、および特異的抗体の標準試料を提供す
る。例えば、王立熱帯研究所(Amsterdam,the Netherlands)
であり、ここは、WHO、FAOおよびOIEにとってレプトスピラ(Leptospi
ra)に関する標準センターである。同様に、USDA(Ames,IA,USA)は、
主要なレプトスピラ(Leptospira)血清型の標準的な基準バクテリンを提供し
、ならびに抗原量(能力)ELISAを設定し実施するために、関係者をプロトコルおよ
び材料により支える。
さもなければ、レプトスピラ(Leptospira)抗原量試験法の開発および/ま
たは日常的実行を、多数の(商業的)診断サービル研究所の一つに外部委託し得る。
たは日常的実行を、多数の(商業的)診断サービル研究所の一つに外部委託し得る。
多価不飽和C18脂肪酸を補給されなかった、その他は同一の条件下において、同一ま
たは同様のレプトスピラ(Leptospira)培養物の抗原量と比較するときに、よ
り高い抗原量が多価不飽和18脂肪酸を補給されたレプトスピラ(Leptospira
)培養物に見出されるならば、本発明にとって「抗原マスを増加すること」は、本発明の
方法によって達成されていた。抗原マスにおける20%の増加を、当業者に周知の日常的
な技術を使用して、有意差をもって既に検出し得る。
たは同様のレプトスピラ(Leptospira)培養物の抗原量と比較するときに、よ
り高い抗原量が多価不飽和18脂肪酸を補給されたレプトスピラ(Leptospira
)培養物に見出されるならば、本発明にとって「抗原マスを増加すること」は、本発明の
方法によって達成されていた。抗原マスにおける20%の増加を、当業者に周知の日常的
な技術を使用して、有意差をもって既に検出し得る。
それ故に本発明の方法の好ましい実施形態において、レプトスピラ(Leptospi
ra)培養物の抗原マスの増加は、多価不飽和C18脂肪酸による補給をうけなかった同
様のレプトスピラ(Leptospira)培養物の抗原マスと比較して、少なくとも2
0%である。
ra)培養物の抗原マスの増加は、多価不飽和C18脂肪酸による補給をうけなかった同
様のレプトスピラ(Leptospira)培養物の抗原マスと比較して、少なくとも2
0%である。
より好ましくは抗原マスの増加は、好ましさの順に少なくとも25、28、30、35
、40、45、50、63、77、90、100、121、150、175、184また
は少なくとも200%である。
、40、45、50、63、77、90、100、121、150、175、184また
は少なくとも200%である。
本発明にとって、「同様のレプトスピラ(Leptospira)培養物」とは、生物
学的用語において、比較されているレプトスピラ(Leptospira)の培養物と高
度に匹敵する、レプトスピラ(Leptospira)の培養物を表す。例えば、これは
、同じ単離株、菌株または血清型由来のレプトスピラ(Leptospira)培養物の
、この比較を行うための使用を示し得る。
学的用語において、比較されているレプトスピラ(Leptospira)の培養物と高
度に匹敵する、レプトスピラ(Leptospira)の培養物を表す。例えば、これは
、同じ単離株、菌株または血清型由来のレプトスピラ(Leptospira)培養物の
、この比較を行うための使用を示し得る。
本発明の方法の適用後に、発明者らによって観察された、同様であるが非補給の培養物
と比較して異なるレプトスピラ(Leptospira)血清群についての単位バイオマ
ス当たりの抗原マスの増加(同様の非補給培養物と比較しての)の例は:Icteroh
aemorrhagiaeについての増加:164%、Sejroe(血清型Hardj
o)について:184%、Grippotyphosaについて:63%、Tarass
oviについて:141%、Pomonaについて:73%、Canicolaについて
:118%およびAustralis(血清型Bratislava)について:62%
であった。詳細を実施例および図に提供する。効果の差は、レプトスピラ(Leptos
pira)血清群に特異的、または血清型から使用された特異的な菌株材料に関連するの
かもしれない。それにもかかわらず、これらのすべての増加は、高度に経済性に関係する
。
と比較して異なるレプトスピラ(Leptospira)血清群についての単位バイオマ
ス当たりの抗原マスの増加(同様の非補給培養物と比較しての)の例は:Icteroh
aemorrhagiaeについての増加:164%、Sejroe(血清型Hardj
o)について:184%、Grippotyphosaについて:63%、Tarass
oviについて:141%、Pomonaについて:73%、Canicolaについて
:118%およびAustralis(血清型Bratislava)について:62%
であった。詳細を実施例および図に提供する。効果の差は、レプトスピラ(Leptos
pira)血清群に特異的、または血清型から使用された特異的な菌株材料に関連するの
かもしれない。それにもかかわらず、これらのすべての増加は、高度に経済性に関係する
。
例えば、培養、補給、または使用するレプトスピラ(Leptospira)の条件の
適応によって、本発明の方法における多価不飽和C18脂肪酸による補給から生じる、抗
原マスの増加を最適化することは、十分に当業者の日常的になし得ることである。
適応によって、本発明の方法における多価不飽和C18脂肪酸による補給から生じる、抗
原マスの増加を最適化することは、十分に当業者の日常的になし得ることである。
この洞察が、特定の多価不飽和C18脂肪酸による補給によって、レプトスピラ(Le
ptospira)の血清群、血清型、型または菌株の抗原マス/バイオマスの比率にお
ける最大の相対増加を獲得するために、異なる血清群由来のレプトスピラ(Leptos
pira)の培養物のさらなる最適化を可能とする。
ptospira)の血清群、血清型、型または菌株の抗原マス/バイオマスの比率にお
ける最大の相対増加を獲得するために、異なる血清群由来のレプトスピラ(Leptos
pira)の培養物のさらなる最適化を可能とする。
それ故に本発明の方法の好ましい実施例において:
‐レプトスピラ(Leptospira)血清群Icterohaemorrhagia
eの培養物にとって、多価不飽和C18脂肪酸は、リノレン酸(C18:3)であり、好
ましくはアルファ‐リノレン酸(アルファC18:3)であり、
‐レプトスピラ(Leptospira)血清群Canicolaの培養物にとって、多
価不飽和C18脂肪酸はリノレン酸であり、
‐レプトスピラ(Leptospira)血清群Pomonaにとって、多価不飽和C1
8脂肪酸はガンマ‐リノレン酸(ガンマC18:3)であり、および/または
‐レプトスピラ(Leptospira)血清群Sejroe(血清型Hardjo)に
とって、多価不飽和C18脂肪酸はリノール酸(C18:2)であり、
ここで該脂肪酸は、本明細書で定義する通り該脂肪酸の誘導体の形態、または該脂肪酸に
比較的富んだ化合物または組成物の形態で、レプトスピラ(Leptospira)培養
物に同様に供給し得る。
‐レプトスピラ(Leptospira)血清群Icterohaemorrhagia
eの培養物にとって、多価不飽和C18脂肪酸は、リノレン酸(C18:3)であり、好
ましくはアルファ‐リノレン酸(アルファC18:3)であり、
‐レプトスピラ(Leptospira)血清群Canicolaの培養物にとって、多
価不飽和C18脂肪酸はリノレン酸であり、
‐レプトスピラ(Leptospira)血清群Pomonaにとって、多価不飽和C1
8脂肪酸はガンマ‐リノレン酸(ガンマC18:3)であり、および/または
‐レプトスピラ(Leptospira)血清群Sejroe(血清型Hardjo)に
とって、多価不飽和C18脂肪酸はリノール酸(C18:2)であり、
ここで該脂肪酸は、本明細書で定義する通り該脂肪酸の誘導体の形態、または該脂肪酸に
比較的富んだ化合物または組成物の形態で、レプトスピラ(Leptospira)培養
物に同様に供給し得る。
原則的に上で定義したどの多価不飽和C18脂肪酸も、本発明の方法において使用され
得て、一般的に同じ効果を提供した。さらに:発明者らは、異なる種類の多価不飽和C1
8脂肪酸が、組み合わされた補給において同様に培養物に供給され得ることを見出したが
、ここで抗原マスの増加に関するその効果は累積的であった。
得て、一般的に同じ効果を提供した。さらに:発明者らは、異なる種類の多価不飽和C1
8脂肪酸が、組み合わされた補給において同様に培養物に供給され得ることを見出したが
、ここで抗原マスの増加に関するその効果は累積的であった。
このことは、本明細書で、例えば、血清群Icterohaemorrhagiae由
来のレプトスピラ(Leptospira)について例証されるが、ここでリノール酸お
よびアルファ‐リノレン酸の各々の50μg/mlの併用による補給は、リノール酸また
はアルファ‐リノレン酸の100μg/mlによる培養物の補給からの抗原マスにおける
別々の相対的な増加の算術平均と極めて近い、抗原マスにおける増加を生み出した。
来のレプトスピラ(Leptospira)について例証されるが、ここでリノール酸お
よびアルファ‐リノレン酸の各々の50μg/mlの併用による補給は、リノール酸また
はアルファ‐リノレン酸の100μg/mlによる培養物の補給からの抗原マスにおける
別々の相対的な増加の算術平均と極めて近い、抗原マスにおける増加を生み出した。
本発明の方法のための多価不飽和C18脂肪酸の併用補給は、脂肪酸(またはその誘導
体、または比較的に該脂肪酸に富む化合物または組成物)の混合物により補給することに
よって、または同時、連続または時間的により分離した別々の補給として成し得る。
体、または比較的に該脂肪酸に富む化合物または組成物)の混合物により補給することに
よって、または同時、連続または時間的により分離した別々の補給として成し得る。
従って一の実施形態において、多価不飽和C18脂肪酸は、二種以上の多価不飽和C1
8脂肪酸を天然に含む組成物を使用することによって、レプトスピラ(Leptospi
ra)培養物に補給される。例は、植物(種子)油、例えばナタネ油またはアマニ油であ
り、それらは比較的にC18:2およびアルファC18:3に富んでおり、または麻実油
であり、それは比較的にC18:2、アルファC18:3およびガンマC18:3に富ん
でいる。
8脂肪酸を天然に含む組成物を使用することによって、レプトスピラ(Leptospi
ra)培養物に補給される。例は、植物(種子)油、例えばナタネ油またはアマニ油であ
り、それらは比較的にC18:2およびアルファC18:3に富んでおり、または麻実油
であり、それは比較的にC18:2、アルファC18:3およびガンマC18:3に富ん
でいる。
「レプトスピラ(Leptospira)」とは、一般的にスピロヘータという名の細
菌の分類学的な属由来の細菌を表す。これには、同様にそれから、例えば、亜種、菌株、
単離株、遺伝子型、血清型、血清群、変異株または亜型、等に多少なりとも細分類された
レプトスピラ(Leptospira)が含まれる。当該レプトスピラ(Leptosp
ira)は、それらの分類学的な科のメンバーを特徴づける特性、例えば、ゲノム的な、
物理的な、電子顕微鏡的なおよび生化学的な特性、等ならびに生物学的特性、例えば、生
理学的、免疫学的または病原体的な挙動、等を共有する。血清学的分類とは別に、他の決
定法は、当該分野において周知の通り、ヌクレオチド配列決定法またはPCR法に基づか
れ得る。
菌の分類学的な属由来の細菌を表す。これには、同様にそれから、例えば、亜種、菌株、
単離株、遺伝子型、血清型、血清群、変異株または亜型、等に多少なりとも細分類された
レプトスピラ(Leptospira)が含まれる。当該レプトスピラ(Leptosp
ira)は、それらの分類学的な科のメンバーを特徴づける特性、例えば、ゲノム的な、
物理的な、電子顕微鏡的なおよび生化学的な特性、等ならびに生物学的特性、例えば、生
理学的、免疫学的または病原体的な挙動、等を共有する。血清学的分類とは別に、他の決
定法は、当該分野において周知の通り、ヌクレオチド配列決定法またはPCR法に基づか
れ得る。
当業者にとって、本発明の主題である細菌の属が現在のところレプトスピラ(Lept
ospira)と命名されている一方で、新たな識見が新しいまたは異なる分類学上のグ
ループへの再分類をもたらすので、これが変更を受け得る分類学上の分類であることは、
明らかである。しかしながら、これは関連する微生物またはその特徴づける特性を変えず
、その科学名または分類だけを変えるので、当該再分類された微生物は、本発明の範囲内
にとどまる。
ospira)と命名されている一方で、新たな識見が新しいまたは異なる分類学上のグ
ループへの再分類をもたらすので、これが変更を受け得る分類学上の分類であることは、
明らかである。しかしながら、これは関連する微生物またはその特徴づける特性を変えず
、その科学名または分類だけを変えるので、当該再分類された微生物は、本発明の範囲内
にとどまる。
本発明の方法における使用のための好ましいレプトスピラ(Leptospira)は
、一または複数の動物種またはヒトに対し病原性であるレプトスピラ(Leptospi
ra)である;より好ましくは、L.interrogans(sensu lato(
広義))Canicola、Icterohaemorrhagiae、Austral
is、Grippotyphosa、Pomona、Tarassovi、Sejroe
およびAutumnalisから選択される少なくとも一つの血清型である。
、一または複数の動物種またはヒトに対し病原性であるレプトスピラ(Leptospi
ra)である;より好ましくは、L.interrogans(sensu lato(
広義))Canicola、Icterohaemorrhagiae、Austral
is、Grippotyphosa、Pomona、Tarassovi、Sejroe
およびAutumnalisから選択される少なくとも一つの血清型である。
より一層好ましいのは、L.interrogans(sensu lato(広義)
)Canicola、Portlandvere、Icterohaemorrhagi
ae、CopenhageniBratislava、Australis、Gripp
otyphosa、Dadas、Pomona、Tarassovi、Gatuni、H
ardjo、SaxkoebingおよびAutumnalisから選択される少なくと
も一つの血清型である。
)Canicola、Portlandvere、Icterohaemorrhagi
ae、CopenhageniBratislava、Australis、Gripp
otyphosa、Dadas、Pomona、Tarassovi、Gatuni、H
ardjo、SaxkoebingおよびAutumnalisから選択される少なくと
も一つの血清型である。
本発明にとって「培養物(culture)」とは:レプトスピラ(Leptospi
ra)属の細菌を含んでいる組成物である。本発明のためのレプトスピラ(Leptos
pira)培養物中の細菌は、種々の密度または状態:インタクトまたは非インタクト、
生菌または死菌、(部分的)破裂または不活化、等であり得る。細菌は、例えば、増殖、
休止または休眠等のどの細胞周期相でもあり得る。培養物は、レプトスピラ(Lepto
spira)が直近に接種された、初期、中期、後期の指数または対数増殖期である、増
殖している培養物であり得る。または培養物は、レプトスピラ(Leptospira)
が誘導期または回収または保存培養物である、休止期または定常期の培養物であり得る。
ra)属の細菌を含んでいる組成物である。本発明のためのレプトスピラ(Leptos
pira)培養物中の細菌は、種々の密度または状態:インタクトまたは非インタクト、
生菌または死菌、(部分的)破裂または不活化、等であり得る。細菌は、例えば、増殖、
休止または休眠等のどの細胞周期相でもあり得る。培養物は、レプトスピラ(Lepto
spira)が直近に接種された、初期、中期、後期の指数または対数増殖期である、増
殖している培養物であり得る。または培養物は、レプトスピラ(Leptospira)
が誘導期または回収または保存培養物である、休止期または定常期の培養物であり得る。
レプトスピラ(Leptospira)属の細菌を含む組成物は、液体、固体または半
固体、凍結、または凍結乾燥であり得る。組成物は、培養培地または保存培地であり得て
、ならびに安定剤または他の薬剤的に許容可能な添加物または担体を含み得る。特に当該
培養物は、細胞懸濁液を含む。
固体、凍結、または凍結乾燥であり得る。組成物は、培養培地または保存培地であり得て
、ならびに安定剤または他の薬剤的に許容可能な添加物または担体を含み得る。特に当該
培養物は、細胞懸濁液を含む。
好ましい実施形態において、本発明の方法における使用のための培養物は、液体形態で
あるのは、当該形態がレプトスピラ(Leptospira)による多価不飽和C18脂
肪酸の摂取を促進するからである。
あるのは、当該形態がレプトスピラ(Leptospira)による多価不飽和C18脂
肪酸の摂取を促進するからである。
本発明にとって本明細書で用いる場合、用語「含んでいる(comprising)」
(ならびに「含む(comprise)」、「含む(comprises)」)および「
含んだ(comprised)」等の変化形)とは、当該要素または組み合せが明示的に
列挙されていないとしても、この用語が使用される本出願の部分、段落、請求項、等によ
ってカバーされるかまたは含まれる、本発明のために考えうるすべての要素、および任意
の可能な組み合せへの言及である;当該要素または組み合せのいかなる排除へ言及ではな
い。結果として、任意の本出願の部分、段落、請求項、等はまた、用語「含んでいる(ま
たは変化形)」が「から成る(consit of)」、「から成っている(consi
sting of)」または「本質的にから成る(consist essential
ly of)」等の用語によって置き換えられる、一または複数の実施形態とも関連する
。
(ならびに「含む(comprise)」、「含む(comprises)」)および「
含んだ(comprised)」等の変化形)とは、当該要素または組み合せが明示的に
列挙されていないとしても、この用語が使用される本出願の部分、段落、請求項、等によ
ってカバーされるかまたは含まれる、本発明のために考えうるすべての要素、および任意
の可能な組み合せへの言及である;当該要素または組み合せのいかなる排除へ言及ではな
い。結果として、任意の本出願の部分、段落、請求項、等はまた、用語「含んでいる(ま
たは変化形)」が「から成る(consit of)」、「から成っている(consi
sting of)」または「本質的にから成る(consist essential
ly of)」等の用語によって置き換えられる、一または複数の実施形態とも関連する
。
本発明にとって、「補給している(supplementing)」は:不足を補うた
めに、またはあるものを強化または拡張するために添加することという普通の意味を有す
る(出典:American heritge dictonary(アメリカンヘリテ
ージ辞典),ed(編).Houghton Miflin Co.,Boston,U
SA)。
めに、またはあるものを強化または拡張するために添加することという普通の意味を有す
る(出典:American heritge dictonary(アメリカンヘリテ
ージ辞典),ed(編).Houghton Miflin Co.,Boston,U
SA)。
本発明の方法において多価不飽和C18脂肪酸の補給が適用される方法は、前記の方法
の効果が:抗原マスの相対的な増加に達し得る限り、原則として制限されない。従って本
発明の方法にとって、多価不飽和C18脂肪酸の補給は、現存するレプトスピラ(Lep
tospira)培養物への1回の、反復のまたは連続する添加によって成され得る。そ
の代わりに、本発明の方法におけるレプトスピラ(Leptospira)培養物の補給
は、本発明のレプトスピラ(Leptospira)の培養を確立するときに、一定濃度
の多価不飽和C18脂肪酸を供給することによって成し得る。例えば、レプトスピラ(L
eptospira)培養物が接種され増殖される予定である培養培地中に、またはレプ
トスピラ(Leptospira)培養物が維持または処理されている、洗浄‐、貯蔵‐
または培養培地中に、一定濃度の多価不飽和C18脂肪酸を提供することによってである
。
の効果が:抗原マスの相対的な増加に達し得る限り、原則として制限されない。従って本
発明の方法にとって、多価不飽和C18脂肪酸の補給は、現存するレプトスピラ(Lep
tospira)培養物への1回の、反復のまたは連続する添加によって成され得る。そ
の代わりに、本発明の方法におけるレプトスピラ(Leptospira)培養物の補給
は、本発明のレプトスピラ(Leptospira)の培養を確立するときに、一定濃度
の多価不飽和C18脂肪酸を供給することによって成し得る。例えば、レプトスピラ(L
eptospira)培養物が接種され増殖される予定である培養培地中に、またはレプ
トスピラ(Leptospira)培養物が維持または処理されている、洗浄‐、貯蔵‐
または培養培地中に、一定濃度の多価不飽和C18脂肪酸を提供することによってである
。
同様に、多価不飽和C18脂肪酸による補給は、レプトスピラ(Lepto
spira)の生活環の異なる時点、例えば、活発に増殖している培養物の初期、中期ま
たは後期、または貯蔵試料中、等において、ならびに細菌細胞の異なる密度で成し得る。
spira)の生活環の異なる時点、例えば、活発に増殖している培養物の初期、中期ま
たは後期、または貯蔵試料中、等において、ならびに細菌細胞の異なる密度で成し得る。
多価不飽和C18脂肪酸は、異なる形態であり得て、ならびに異なる方法で補給され得
る。これらの条件の変動および最適化のための選択肢は、本明細書に記載され例示される
が、十分に当業者の日常的な能力の範囲内である。
る。これらの条件の変動および最適化のための選択肢は、本明細書に記載され例示される
が、十分に当業者の日常的な能力の範囲内である。
好ましい実施形態において、本発明の方法のための補給は、増殖するレプトスピラ(L
eptospira)培養物に多価不飽和C18脂肪酸を添加することによって、かつ経
時的に徐々に添加することによってなされる。
eptospira)培養物に多価不飽和C18脂肪酸を添加することによって、かつ経
時的に徐々に添加することによってなされる。
本発明にとって「多価不飽和C18脂肪酸」とは、脂肪酸である化学化合物、またはそ
の誘導体、なおまた混合物または複合体中の多価不飽和C18脂肪酸、または多価不飽和
C18脂肪酸に比較的に富んでいる化合物または組成物を表す。化合物または組成物は、
もしそれが多価不飽和C18脂肪酸をその総脂肪酸量の少なくとも約5%の量で含んでい
るならば、多価不飽和C18脂肪酸に「比較的に富んで」いる。好ましくは、好ましい順
で、その総脂肪酸量の少なくとも10、15、20、25、30、40、50%である。
の誘導体、なおまた混合物または複合体中の多価不飽和C18脂肪酸、または多価不飽和
C18脂肪酸に比較的に富んでいる化合物または組成物を表す。化合物または組成物は、
もしそれが多価不飽和C18脂肪酸をその総脂肪酸量の少なくとも約5%の量で含んでい
るならば、多価不飽和C18脂肪酸に「比較的に富んで」いる。好ましくは、好ましい順
で、その総脂肪酸量の少なくとも10、15、20、25、30、40、50%である。
脂肪酸含量の測定、ならびに個別の脂肪酸の相対含量への分化は、例えば抽出およびガ
スクロマトグラフィーによって、当業者によって日常的に成され得る。本発明の方法にお
ける使用のために、比較的に多価不飽和C18脂肪酸に富んでいる化合物および組成物の
例を、以下に記載する。
スクロマトグラフィーによって、当業者によって日常的に成され得る。本発明の方法にお
ける使用のために、比較的に多価不飽和C18脂肪酸に富んでいる化合物および組成物の
例を、以下に記載する。
用語「多価不飽和C18脂肪酸」は、18個のC原子を含む炭化水素鎖を有し、該炭化
水素鎖が二以上の二重(不飽和)結合を含む脂肪酸に関して、普通の意味で使用される。
水素鎖が二以上の二重(不飽和)結合を含む脂肪酸に関して、普通の意味で使用される。
当該技術分野において知られているのは、共役多価不飽和C18脂肪酸であり、それは
乳酸桿菌(Lactobacilli)等の細菌よって、反芻動物の反芻胃において産生
される(それ故に吸収されない)。
乳酸桿菌(Lactobacilli)等の細菌よって、反芻動物の反芻胃において産生
される(それ故に吸収されない)。
好ましい実施形態において、本発明における使用のための多価不飽和C18脂肪酸は非
共役である。
共役である。
より好ましい実施形態において、本発明における使用のための多価不飽和C18脂肪酸
は、メチレン中断型ポリエンであり、非分岐であり、および/またはシクロアルカン環に
結合していない。
は、メチレン中断型ポリエンであり、非分岐であり、および/またはシクロアルカン環に
結合していない。
より一層好ましい実施形態において、本発明における使用のための多価不飽和C18脂
肪酸は、オメガ3‐またはオメガ6多価不飽和C18脂肪酸である。
肪酸は、オメガ3‐またはオメガ6多価不飽和C18脂肪酸である。
より一層好ましい実施形態において、本発明における使用のための多価不飽和C18脂
肪酸は、C18:2、C18:3およびC18:4から成る群より選択される一または複
数である。
肪酸は、C18:2、C18:3およびC18:4から成る群より選択される一または複
数である。
最も好ましい実施形態において、本発明における使用のための多価不飽和C18脂肪酸
は:リノール酸、アルファ‐リノレン酸、ガンマ‐リノレン酸またはステアリドン酸から
成る群から選択される一または複数である。
は:リノール酸、アルファ‐リノレン酸、ガンマ‐リノレン酸またはステアリドン酸から
成る群から選択される一または複数である。
「リノール酸」は、学名:9,12‐オクタデカジエン酸およびCAS番号:60‐3
3‐3を有する、C18:2、n‐6、デルタ9、12脂肪酸である。好ましくはその二
重結合の双方は、シス型である。
3‐3を有する、C18:2、n‐6、デルタ9、12脂肪酸である。好ましくはその二
重結合の双方は、シス型である。
リノレン酸は、二つの異性体:アルファ‐リノレン酸およびガンマ‐リノレン酸を有す
るC18:3脂肪酸である。
るC18:3脂肪酸である。
「アルファ‐リノレン酸」は、学名:9,12,5‐オクタデカトリエン酸およびCA
S番号:463‐40‐1を有する、C18:3、n‐3、デルタ9,12,15脂肪酸
である。好ましくはそのすべての二重結合は、シス型である。
S番号:463‐40‐1を有する、C18:3、n‐3、デルタ9,12,15脂肪酸
である。好ましくはそのすべての二重結合は、シス型である。
「ガンマ‐リノレン酸」は、学名:6,9,12‐オクタデカトリエン酸およびCAS
番号:506‐26‐3を有する、C18:3、n‐6、デルタ6,9,12脂肪酸であ
る。好ましくはそのすべての二重結合は、シス型である。
番号:506‐26‐3を有する、C18:3、n‐6、デルタ6,9,12脂肪酸であ
る。好ましくはそのすべての二重結合は、シス型である。
「ステアリドン酸」は、学名:6,9,12,5‐オクタデカテトラエン酸およびCA
S番号:20290‐75‐9を有する、C18:4、n‐3、デルタ6,9,12,1
5脂肪酸である。ステアリドン酸はまた、モロクチン酸としても知られる。好ましくはそ
のすべての二重結合は、シス型である。
S番号:20290‐75‐9を有する、C18:4、n‐3、デルタ6,9,12,1
5脂肪酸である。ステアリドン酸はまた、モロクチン酸としても知られる。好ましくはそ
のすべての二重結合は、シス型である。
多価不飽和C18脂肪酸は、天然または合成起源であり得て、単離状態またはさまざま
な純度であり得る。また多価不飽和C18脂肪酸は、他の化学基に結合、共役またはエス
テル化され得る。多価不飽和C18脂肪酸がレプトスピラ(Leptospira)培養
物に生物学的に利用可能であり、ならびに本発明の方法の効果が得られる限り、これらの
すべての形態は許容可能である。好ましくは、多価不飽和C18脂肪酸は、レプトスピラ
(Leptospira)培養物に対しあまり毒性がなく、ならびに水性培養物の状態で
使用し得る形態である。
な純度であり得る。また多価不飽和C18脂肪酸は、他の化学基に結合、共役またはエス
テル化され得る。多価不飽和C18脂肪酸がレプトスピラ(Leptospira)培養
物に生物学的に利用可能であり、ならびに本発明の方法の効果が得られる限り、これらの
すべての形態は許容可能である。好ましくは、多価不飽和C18脂肪酸は、レプトスピラ
(Leptospira)培養物に対しあまり毒性がなく、ならびに水性培養物の状態で
使用し得る形態である。
当業者は、多価不飽和C18脂肪酸、誘導体、または多価不飽和C18脂肪酸を含む化
合物または組成物が、本発明の方法において使用し得るか、または毒性が高すぎるかまた
は不都合であるかを、本明細書に記載の詳細および実施例によって容易に決定し得る。例
えば、該脂肪酸、誘導体、化合物または組成物を代表的な小規模のレプトスピラ(Lep
tospira)の発酵において試験し、ならびに一定数の細胞のレプトスピラ(Lep
tospira)LPS抗原量を測定し、その量を化合物または組成物を含む多価不飽和
C18脂肪酸により補給されなかった同様のレプトスピラ(Leptospira)培養
物由来の細胞の抗原量と比較することによって決定し得る。
合物または組成物が、本発明の方法において使用し得るか、または毒性が高すぎるかまた
は不都合であるかを、本明細書に記載の詳細および実施例によって容易に決定し得る。例
えば、該脂肪酸、誘導体、化合物または組成物を代表的な小規模のレプトスピラ(Lep
tospira)の発酵において試験し、ならびに一定数の細胞のレプトスピラ(Lep
tospira)LPS抗原量を測定し、その量を化合物または組成物を含む多価不飽和
C18脂肪酸により補給されなかった同様のレプトスピラ(Leptospira)培養
物由来の細胞の抗原量と比較することによって決定し得る。
本発明における使用のための、多価不飽和C18脂肪酸、誘導体、化合物および組成物
の例は:生化学製品の主な供給業者から種々の純度で入手可能な多価不飽和C18脂肪酸
である。また多価不飽和C18脂肪酸は、担体分子、例えば、タンパク質またはタンパク
質複合体(例えば、血清またはアルブミン、酵素(アシル‐CoA))等に結合または複
合されており、またはグリセリンまたはコレステロールにエステル化されており、または
リポタンパク質、リン脂質(リン酸との結合)または糖脂質またはリポ多糖(糖鎖との結
合)としてである。また多価不飽和C18脂肪酸は、他の脂肪酸組成物における遊離酸の
微量成分として存在し得る。代わりに、多価不飽和C18脂肪酸は、例えば植物(種子)
油等の多価不飽和C18脂肪酸に比較的富んだ化合物または組成物に含まれ得る。
の例は:生化学製品の主な供給業者から種々の純度で入手可能な多価不飽和C18脂肪酸
である。また多価不飽和C18脂肪酸は、担体分子、例えば、タンパク質またはタンパク
質複合体(例えば、血清またはアルブミン、酵素(アシル‐CoA))等に結合または複
合されており、またはグリセリンまたはコレステロールにエステル化されており、または
リポタンパク質、リン脂質(リン酸との結合)または糖脂質またはリポ多糖(糖鎖との結
合)としてである。また多価不飽和C18脂肪酸は、他の脂肪酸組成物における遊離酸の
微量成分として存在し得る。代わりに、多価不飽和C18脂肪酸は、例えば植物(種子)
油等の多価不飽和C18脂肪酸に比較的富んだ化合物または組成物に含まれ得る。
脂肪酸は、水性培地において通常は溶解性が乏しいので、多価不飽和C18脂肪酸、ま
たは誘導体、また多価不飽和C18脂肪酸に比較的に富んでいる化合物または組成物は、
それが生物利用可能であるようにするためまたは維持するために、レプトスピラ(Lep
tospira)培養物へのその補給を促進する調製品に作成し得る。例えば、多価不飽
和C18脂肪酸は、物理的に分散、または化学的に乳化、または溶媒と混合され得る。そ
れは、セルロース、シクロデキストリンまたはコレステロール等の担体と、または上記の
通りBSAまたは血清を使用することによって担体と組み合わせ得る;その代りに、多価
不飽和C18脂肪酸は、例えば、Celite(登録商標)またはAmberlite(
登録商標)(Spector & Hoak、前掲)等の粒状吸着剤により移行し得る。
たは誘導体、また多価不飽和C18脂肪酸に比較的に富んでいる化合物または組成物は、
それが生物利用可能であるようにするためまたは維持するために、レプトスピラ(Lep
tospira)培養物へのその補給を促進する調製品に作成し得る。例えば、多価不飽
和C18脂肪酸は、物理的に分散、または化学的に乳化、または溶媒と混合され得る。そ
れは、セルロース、シクロデキストリンまたはコレステロール等の担体と、または上記の
通りBSAまたは血清を使用することによって担体と組み合わせ得る;その代りに、多価
不飽和C18脂肪酸は、例えば、Celite(登録商標)またはAmberlite(
登録商標)(Spector & Hoak、前掲)等の粒状吸着剤により移行し得る。
本発明の方法において、多価不飽和C18脂肪酸によりレプトスピラ(Leptosp
ira)の培養物を補給するための有利な方法は、高含量の多価不飽和C18脂肪酸を含
むように作成されたBSAにより該培養物を補給することである。
ira)の培養物を補給するための有利な方法は、高含量の多価不飽和C18脂肪酸を含
むように作成されたBSAにより該培養物を補給することである。
それ故に本発明の方法の好ましい実施形態において、多価不飽和C18脂肪酸は、BS
Aとの複合体の形態で補給される。
Aとの複合体の形態で補給される。
多価不飽和C18脂肪酸は、単純なコ‐インキュベーションによって、BSAが多価不
飽和C18脂肪酸により飽和されるまで、BSAに負荷され得る。BSAへの脂肪酸の結
合は、当該技術分野において知られている通り、温度およびpH依存性であり、例えば、
Spector & Hoak(前掲)、およびAshbrook et al.(19
75,J.of Biol.Chem.,vol.250,p.2333)に記載されて
いる。多価不飽和C18脂肪酸のBSAへの負荷レベルは、下記の通りガスクロマトグラ
フィーによって適宜分析され得る。どれほどの多価不飽和C18脂肪酸がBSAによって
吸収され得るかは、BSAの種類および品質、ならびに既に結合した脂肪酸量に依存する
。もし多価不飽和C18脂肪酸を最大限に負荷することが望まれるならば、BSAを最初
に抽出によって脱脂し、それからもっぱら多価不飽和C18脂肪酸で再負荷し得る。(追
加の)多価不飽和C18脂肪酸により負荷されたBSAが、既に培養培地において使用さ
れているBSAまたは血清の代わりに、または追加して、レプトスピラ(Leptosp
ira)培養物において使用し得る。
飽和C18脂肪酸により飽和されるまで、BSAに負荷され得る。BSAへの脂肪酸の結
合は、当該技術分野において知られている通り、温度およびpH依存性であり、例えば、
Spector & Hoak(前掲)、およびAshbrook et al.(19
75,J.of Biol.Chem.,vol.250,p.2333)に記載されて
いる。多価不飽和C18脂肪酸のBSAへの負荷レベルは、下記の通りガスクロマトグラ
フィーによって適宜分析され得る。どれほどの多価不飽和C18脂肪酸がBSAによって
吸収され得るかは、BSAの種類および品質、ならびに既に結合した脂肪酸量に依存する
。もし多価不飽和C18脂肪酸を最大限に負荷することが望まれるならば、BSAを最初
に抽出によって脱脂し、それからもっぱら多価不飽和C18脂肪酸で再負荷し得る。(追
加の)多価不飽和C18脂肪酸により負荷されたBSAが、既に培養培地において使用さ
れているBSAまたは血清の代わりに、または追加して、レプトスピラ(Leptosp
ira)培養物において使用し得る。
発明者らは、本発明の方法のための効率的な補給が、その脂肪酸の少なくとも約10%
を多価不飽和C18脂肪酸として含むように作成された、BSAを使用することによって
可能であることを見出した。
を多価不飽和C18脂肪酸として含むように作成された、BSAを使用することによって
可能であることを見出した。
それ故に本発明の方法のための、多価不飽和C18脂肪酸を補給するための好ましい組
成物は、その遊離脂肪酸の少なくとも約10%を多価不飽和C18脂肪酸として含む;好
ましくはその遊離脂肪酸の少なくとも好ましい順に、12、15、18、20、21、2
3、25、30、35、40、50、60、70、75、80、90、95または99%
(w/w)を含む、BSA調製品である。
成物は、その遊離脂肪酸の少なくとも約10%を多価不飽和C18脂肪酸として含む;好
ましくはその遊離脂肪酸の少なくとも好ましい順に、12、15、18、20、21、2
3、25、30、35、40、50、60、70、75、80、90、95または99%
(w/w)を含む、BSA調製品である。
当業者は、BSA調製品を使用して本発明の方法に従って、レプトスピラ(Lepto
spira)培養物を多価不飽和C18脂肪酸により補給するとき、これが培養物のタン
パク質の負荷を、従ってそれから産生されるワクチンの負荷を増加し得ることを、理解す
るであろう。これは、ワクチン接種の副作用のレベルに影響を及ぼすかもしれない。当該
培養物は、それ故に過剰なタンパク質を取り除くための精製段階を必要とするかもしれな
い。しかしながら、当該精製はしばしば適用されているので、それ故にBSAまたは血清
との複合体での多価不飽和C18脂肪酸の補給は、レプトスピラ(Leptospira
)培養物の抗原マスを増加するための高度に効率的な方法である。
spira)培養物を多価不飽和C18脂肪酸により補給するとき、これが培養物のタン
パク質の負荷を、従ってそれから産生されるワクチンの負荷を増加し得ることを、理解す
るであろう。これは、ワクチン接種の副作用のレベルに影響を及ぼすかもしれない。当該
培養物は、それ故に過剰なタンパク質を取り除くための精製段階を必要とするかもしれな
い。しかしながら、当該精製はしばしば適用されているので、それ故にBSAまたは血清
との複合体での多価不飽和C18脂肪酸の補給は、レプトスピラ(Leptospira
)培養物の抗原マスを増加するための高度に効率的な方法である。
多価不飽和C18脂肪酸(‐調製品)は、種々の方法、例えばパルスとして、または経
時的により緩やかに、本発明の方法に従ってレプトスピラ(Leptospira)培養
物に補給され得る。パルス補給は、例えば、すべての多価不飽和C18脂肪酸を約1時間
以内に補給することであろうが、これは培養が静置である場合に最も適切であろう。レプ
トスピラ(Leptospira)培養物の増殖にとって、最も適切な補給は、緩やかな
補給であり、それはすべての多価不飽和C18脂肪酸を約1ないし約6時間の期間に添加
することを意味するであろう。増殖している培養物への流加補給は、多価不飽和C18脂
肪酸(‐調製品)という餌をほとんどの培養期間の間与えることを意味するであろう。
時的により緩やかに、本発明の方法に従ってレプトスピラ(Leptospira)培養
物に補給され得る。パルス補給は、例えば、すべての多価不飽和C18脂肪酸を約1時間
以内に補給することであろうが、これは培養が静置である場合に最も適切であろう。レプ
トスピラ(Leptospira)培養物の増殖にとって、最も適切な補給は、緩やかな
補給であり、それはすべての多価不飽和C18脂肪酸を約1ないし約6時間の期間に添加
することを意味するであろう。増殖している培養物への流加補給は、多価不飽和C18脂
肪酸(‐調製品)という餌をほとんどの培養期間の間与えることを意味するであろう。
本発明の方法の好ましい実施形態において、レプトスピラ(Leptospira)の
増殖している培養物は、緩やかにまたは流加方式で補給される。
増殖している培養物は、緩やかにまたは流加方式で補給される。
本発明の方法において、抗原マスの相対的な増加を達成するために、レプトスピラ(L
eptospira)培養物に補給されるべき多価不飽和C18脂肪酸の量は、原則とし
て実際的、経済的および生物学的視点から実行可能なことによってのみ制限される。例え
ば、実際的な考慮事項には、培養物を増殖するファーメンターを、安全な作業およびその
無菌性を損ない得るので、補給を添加するために何度も開放してはならないということが
ある。これに反して、補給されるべき培養物が、最終培養物または貯蔵培養物等の活発に
増殖していない培養物であるとき、培養物を過剰増殖させる汚染のリスクは非常に低い。
経済的な考慮事項は、例えば、大量の純粋な多価不飽和C18脂肪酸、または特別な多価
不飽和C18脂肪酸‐の併用製品を補給するための材料費である。生物学的考慮事項は、
脂肪酸が生きた細胞にとって毒であり得ることであるが、それは静置培養にとって大した
問題ではない。それ故に大量の多価不飽和C18脂肪酸が、増殖している培養物に短時間
に補給されるべき時は、例えば、上記の通り毒性を低下させるために複合体の多価不飽和
C18脂肪酸を与えることによって、レプトスピラ(Leptospira)に対する脂
肪酸の毒性を軽減するまたは防止するように注意が払わなければならない。その代わりに
、多価不飽和C18脂肪酸は、経時的に緩やかに補給され得る。
eptospira)培養物に補給されるべき多価不飽和C18脂肪酸の量は、原則とし
て実際的、経済的および生物学的視点から実行可能なことによってのみ制限される。例え
ば、実際的な考慮事項には、培養物を増殖するファーメンターを、安全な作業およびその
無菌性を損ない得るので、補給を添加するために何度も開放してはならないということが
ある。これに反して、補給されるべき培養物が、最終培養物または貯蔵培養物等の活発に
増殖していない培養物であるとき、培養物を過剰増殖させる汚染のリスクは非常に低い。
経済的な考慮事項は、例えば、大量の純粋な多価不飽和C18脂肪酸、または特別な多価
不飽和C18脂肪酸‐の併用製品を補給するための材料費である。生物学的考慮事項は、
脂肪酸が生きた細胞にとって毒であり得ることであるが、それは静置培養にとって大した
問題ではない。それ故に大量の多価不飽和C18脂肪酸が、増殖している培養物に短時間
に補給されるべき時は、例えば、上記の通り毒性を低下させるために複合体の多価不飽和
C18脂肪酸を与えることによって、レプトスピラ(Leptospira)に対する脂
肪酸の毒性を軽減するまたは防止するように注意が払わなければならない。その代わりに
、多価不飽和C18脂肪酸は、経時的に緩やかに補給され得る。
考慮されるべきさらなるパラメータは、それぞれの特定の場合の条件:レプトスピラ(
Leptospira)の量、状態および種類、ならびに培養時間、温度、pH、等であ
る。本明細書の詳細および実施例に関して、本発明の方法に関連して多価不飽和C18脂
肪酸がレプトスピラ(Leptospira)培養物に補給される量および方法を変更し
および最適化することは、当業者の手が届くところである。
Leptospira)の量、状態および種類、ならびに培養時間、温度、pH、等であ
る。本明細書の詳細および実施例に関して、本発明の方法に関連して多価不飽和C18脂
肪酸がレプトスピラ(Leptospira)培養物に補給される量および方法を変更し
および最適化することは、当業者の手が届くところである。
培養物中のレプトスピラ(Leptospira)は、多価不飽和C18脂肪酸をでき
るだけ速く消費するように思われる。参照されたいが、例えば、図2、3および13、1
4は、リノール酸およびリノレン酸が、パルミチン酸およびオレイン酸とは対照的に、非
常に急速に消費され、抗原マスに変換されることを説明する。これは、当該培養物中で産
生される抗原マスの総量が、培養の間の培養物に利用可能である累積的な多価不飽和C1
8脂肪酸の総量の結果であることを意味する。本発明にとって、培養物に補給される多価
不飽和C18脂肪酸の量に関する指標は、それ故に、あたかも多価不飽和C18脂肪酸が
一つの時点において利用可能であったかのように、レプトスピラ(Leptospira
)培養物の増殖または培養の間に利用可能であった、多価不飽和C18脂肪酸の総量を表
す。該量は、培養物の総容量に基づく濃度として表現される。該濃度は、多価不飽和C1
8脂肪酸が含まれていた混合物の形態または用量と無関係であり、該濃度にはすべての培
地成分によってなされる添加が含まれる。
るだけ速く消費するように思われる。参照されたいが、例えば、図2、3および13、1
4は、リノール酸およびリノレン酸が、パルミチン酸およびオレイン酸とは対照的に、非
常に急速に消費され、抗原マスに変換されることを説明する。これは、当該培養物中で産
生される抗原マスの総量が、培養の間の培養物に利用可能である累積的な多価不飽和C1
8脂肪酸の総量の結果であることを意味する。本発明にとって、培養物に補給される多価
不飽和C18脂肪酸の量に関する指標は、それ故に、あたかも多価不飽和C18脂肪酸が
一つの時点において利用可能であったかのように、レプトスピラ(Leptospira
)培養物の増殖または培養の間に利用可能であった、多価不飽和C18脂肪酸の総量を表
す。該量は、培養物の総容量に基づく濃度として表現される。該濃度は、多価不飽和C1
8脂肪酸が含まれていた混合物の形態または用量と無関係であり、該濃度にはすべての培
地成分によってなされる添加が含まれる。
その結果として、当業者は、レプトスピラ(Leptospira)培養物に供給され
た多価不飽和C18脂肪酸のこの総濃度を測定することが、しばしば実際には可能でない
ことを理解するであろう。一方では、当該濃度が、経時的におよび異なる成分からなされ
た、多価不飽和C18脂肪酸貢献物由来の累積的数であるからである。他方では、レプト
スピラ(Leptospira)培養物が、当該濃度の一部を試料採取時の前に既に摂取
し、処理してしまっているだろうからである。
た多価不飽和C18脂肪酸のこの総濃度を測定することが、しばしば実際には可能でない
ことを理解するであろう。一方では、当該濃度が、経時的におよび異なる成分からなされ
た、多価不飽和C18脂肪酸貢献物由来の累積的数であるからである。他方では、レプト
スピラ(Leptospira)培養物が、当該濃度の一部を試料採取時の前に既に摂取
し、処理してしまっているだろうからである。
例えば、発明者らは、わずか約5μg/mlしか利用可能でなかった培養物と比較して
、25μgのリノール酸が培養物ml当たりに利用可能になされるように、レプトスピラ
(Leptospira)の培養物を本発明の方法に従ってリノール酸により補給したと
きに、抗原マスの顕著な増加が獲得され得ることを証明した。
、25μgのリノール酸が培養物ml当たりに利用可能になされるように、レプトスピラ
(Leptospira)の培養物を本発明の方法に従ってリノール酸により補給したと
きに、抗原マスの顕著な増加が獲得され得ることを証明した。
標準的なEMJH培養培地は、ごく少量のC18:3しか含まないが、同じことがリノ
レン酸に対して当てはまる。それ故に原則としてレプトスピラ(Leptospira)
培養物へのいかなる量のC18:3の補給も、その抗原マス/バイオマス比率にとってす
でに有益であろう。実用的には、約5μg/mlから始まる量のC18:3が添加され得
る。
レン酸に対して当てはまる。それ故に原則としてレプトスピラ(Leptospira)
培養物へのいかなる量のC18:3の補給も、その抗原マス/バイオマス比率にとってす
でに有益であろう。実用的には、約5μg/mlから始まる量のC18:3が添加され得
る。
利用可能な多価不飽和C18脂肪酸のより高い含量において、抗原マスはより増加した
。試験した利用可能な最も高いレベル、レプトスピラ(Leptospira)培養物に
おける300μg/mlを超える多価不飽和C18脂肪酸において、多少の毒性がいくつ
かの血清型に対して注目された。しかしながら、この影響は純粋な多価不飽和C18脂肪
酸の調製品を使用したとき見られたので、上記の通り複合体中での多価不飽和C18脂肪
酸の適切な解毒によって打ち勝ち得る。
。試験した利用可能な最も高いレベル、レプトスピラ(Leptospira)培養物に
おける300μg/mlを超える多価不飽和C18脂肪酸において、多少の毒性がいくつ
かの血清型に対して注目された。しかしながら、この影響は純粋な多価不飽和C18脂肪
酸の調製品を使用したとき見られたので、上記の通り複合体中での多価不飽和C18脂肪
酸の適切な解毒によって打ち勝ち得る。
それ故に一実施形態において、本発明は、レプトスピラ(Leptospira)培養
物の抗原マスを増加させるための方法を提供し、ここで該方法は、
少なくともリノール酸15μg/ml、および/または少なくともリノレン酸5μg/m
lが前記の培養物に利用可能となされた条件下において、前記のレプトスピラ(Lept
ospira)培養物を培養する段階を含む。
物の抗原マスを増加させるための方法を提供し、ここで該方法は、
少なくともリノール酸15μg/ml、および/または少なくともリノレン酸5μg/m
lが前記の培養物に利用可能となされた条件下において、前記のレプトスピラ(Lept
ospira)培養物を培養する段階を含む。
下記の通り、種々の多価不飽和C18脂肪酸‐上に定義した通り‐の補給はまた、レプ
トスピラ(Leptospira)培養物において累積的効果を与えながら、併用され得
る。結果として、レプトスピラ(Leptospira)培養物に利用可能となされてい
る多価不飽和C18脂肪酸の総量は、従って併用される種々の多価不飽和C18脂肪酸の
合計量に基づき得る。
トスピラ(Leptospira)培養物において累積的効果を与えながら、併用され得
る。結果として、レプトスピラ(Leptospira)培養物に利用可能となされてい
る多価不飽和C18脂肪酸の総量は、従って併用される種々の多価不飽和C18脂肪酸の
合計量に基づき得る。
それ故に本発明の方法の好ましい実施形態において、該方法は、少なくとも15μgの
多価不飽和C18脂肪酸が前記の培養物に利用可能となされた条件下において、レプトス
ピラ(Leptospira)培養物を培養する段階を含む。より好ましくは、好ましい
順に少なくとも16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、
27、28、29、30、32、35、37、40、45、50、55、60、65、7
0、75、80、85、90、95または少なくとも100μgの多価不飽和C18脂肪
酸/mlが、前記の培養物に利用可能になされていた。
多価不飽和C18脂肪酸が前記の培養物に利用可能となされた条件下において、レプトス
ピラ(Leptospira)培養物を培養する段階を含む。より好ましくは、好ましい
順に少なくとも16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、
27、28、29、30、32、35、37、40、45、50、55、60、65、7
0、75、80、85、90、95または少なくとも100μgの多価不飽和C18脂肪
酸/mlが、前記の培養物に利用可能になされていた。
本発明の方法のさらに好ましい実施形態において、該方法は、約15と1000μgの
間の多価不飽和C18脂肪酸/mlが前記の培養物に利用可能となされた条件下において
、レプトスピラ(Leptospira)培養物を培養する段階を含む。より好ましくは
、好ましい順に、約20と500μg/mlの間、約20と300μg/mlの間、また
は約25と250μgの間の多価不飽和C18脂肪酸/mlが前記の培養物に利用可能と
なされていた。
間の多価不飽和C18脂肪酸/mlが前記の培養物に利用可能となされた条件下において
、レプトスピラ(Leptospira)培養物を培養する段階を含む。より好ましくは
、好ましい順に、約20と500μg/mlの間、約20と300μg/mlの間、また
は約25と250μgの間の多価不飽和C18脂肪酸/mlが前記の培養物に利用可能と
なされていた。
一実施形態において、本発明は、レプトスピラ(Leptospira)培養物の抗原
マスを増加させる方法を提供し、該方法は、少なくとも15μgの多価不飽和C18脂肪
酸が前記の培養物に利用可能となされた条件下において、前記のレプトスピラ(Lept
ospira)培養物を多価不飽和C18脂肪酸により補給する段階を含み;ここでレプ
トスピラ(Leptospira)は、L.インターロガンス(L.interroga
ns(sensu lato)(広義))Canicola、Icterohaemor
rhagiae、Australis、Grippotyphosa、Pomona、T
arassovi、SejroeおよびAutumnalisから選択される少なくとも
一つの血清群であり;およびここで前記のレプトスピラ(Leptospira)培養物
の抗原マスの増加は、多価不飽和C18脂肪酸によって補給されなかった同様のレプトス
ピラ(Leptospira)培養物の抗原マスと比較して、少なくとも20%である。
マスを増加させる方法を提供し、該方法は、少なくとも15μgの多価不飽和C18脂肪
酸が前記の培養物に利用可能となされた条件下において、前記のレプトスピラ(Lept
ospira)培養物を多価不飽和C18脂肪酸により補給する段階を含み;ここでレプ
トスピラ(Leptospira)は、L.インターロガンス(L.interroga
ns(sensu lato)(広義))Canicola、Icterohaemor
rhagiae、Australis、Grippotyphosa、Pomona、T
arassovi、SejroeおよびAutumnalisから選択される少なくとも
一つの血清群であり;およびここで前記のレプトスピラ(Leptospira)培養物
の抗原マスの増加は、多価不飽和C18脂肪酸によって補給されなかった同様のレプトス
ピラ(Leptospira)培養物の抗原マスと比較して、少なくとも20%である。
さらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって獲得可能なレプトスピラ(L
eptospira)培養物を提供し、ここで前記のレプトスピラ(Leptospir
a)培養物は、増加した抗原マスを有する。
eptospira)培養物を提供し、ここで前記のレプトスピラ(Leptospir
a)培養物は、増加した抗原マスを有する。
本発明の当該レプトスピラ(Leptospira)培養物は、該レプトスピラ(Le
ptospira)培養物が、本発明の方法における多価不飽和C18脂肪酸による補給
から生じる顕著に増加された抗原マスを有することにおいて、先行技術のレプトスピラ(
Leptospira)培養物と異なる。増加された抗原マスは、記載の通り容易に検出
可能であり定量可能であり:上記の通り20%以上の抗原マスの増加が重要であり検出可
能である。
ptospira)培養物が、本発明の方法における多価不飽和C18脂肪酸による補給
から生じる顕著に増加された抗原マスを有することにおいて、先行技術のレプトスピラ(
Leptospira)培養物と異なる。増加された抗原マスは、記載の通り容易に検出
可能であり定量可能であり:上記の通り20%以上の抗原マスの増加が重要であり検出可
能である。
抗原マスの増加は、上記の本発明の方法において多価不飽和C18脂肪酸により補給し
なかった以外は、同様の条件下における同様のレプトスピラ(Leptospira)培
養物の抗原マスと比較してである。
なかった以外は、同様の条件下における同様のレプトスピラ(Leptospira)培
養物の抗原マスと比較してである。
それ故に本発明のレプトスピラ(Leptospira)培養物は、前記のレプトスピ
ラ(Leptospira)培養物の抗原マスが、多価不飽和C18脂肪酸により補給さ
れなかった、同様のレプトスピラ(Leptospira)培養物の抗原マスと比較して
少なくとも20%増加されることを特徴とする。
ラ(Leptospira)培養物の抗原マスが、多価不飽和C18脂肪酸により補給さ
れなかった、同様のレプトスピラ(Leptospira)培養物の抗原マスと比較して
少なくとも20%増加されることを特徴とする。
より好ましくは本発明のレプトスピラ(Leptospira)培養物は、前記のレプ
トスピラ(Leptospira)培養物の抗原マスが、多価不飽和C18脂肪酸により
補給されなかった、同様のレプトスピラ(Leptospira)培養物の抗原マスと比
較して、好ましい順に少なくとも22、24、25、28、30、35、40、45、5
0、63、77、90、100、121、150、175、184または少なくとも20
0%増加されることを特徴とする。
トスピラ(Leptospira)培養物の抗原マスが、多価不飽和C18脂肪酸により
補給されなかった、同様のレプトスピラ(Leptospira)培養物の抗原マスと比
較して、好ましい順に少なくとも22、24、25、28、30、35、40、45、5
0、63、77、90、100、121、150、175、184または少なくとも20
0%増加されることを特徴とする。
本発明のレプトスピラ(Leptospira)培養物は、記載の本発明の方法、例え
ば、増殖期‐、または定常期の培養物または収集した培養物のレプトスピラ(Lepto
spira)を、多価不飽和C18脂肪酸、誘導体または多価不飽和C18脂肪酸に比較
的富んでいる化合物または組成物により補給することによって得られる。これは、レプト
スピラ(Leptospira)に対するワクチンにおける、いくつかの有利な有用性を
有する。
ば、増殖期‐、または定常期の培養物または収集した培養物のレプトスピラ(Lepto
spira)を、多価不飽和C18脂肪酸、誘導体または多価不飽和C18脂肪酸に比較
的富んでいる化合物または組成物により補給することによって得られる。これは、レプト
スピラ(Leptospira)に対するワクチンにおける、いくつかの有利な有用性を
有する。
さらなる態様において本発明は、レプトスピラ(Leptospira)に対するワク
チンにおける使用のための、本発明のレプトスピラ(Leptospira)培養物、ま
たは前記の培養物の調製品に関する。
チンにおける使用のための、本発明のレプトスピラ(Leptospira)培養物、ま
たは前記の培養物の調製品に関する。
好ましくは、本発明のレプトスピラ(Leptospira)に対するワクチンにおけ
る使用のためのレプトスピラ(Leptospira)培養物は、本発明の不活化したレ
プトスピラ(Leptospira)培養物の形態である。
る使用のためのレプトスピラ(Leptospira)培養物は、本発明の不活化したレ
プトスピラ(Leptospira)培養物の形態である。
本発明にとって、本発明のレプトスピラ(Leptospira)培養物の「調製品」
は、当該培養物のフラグメント、例えば、本発明のレプトスピラ(Leptospira
)培養物由来の抽出物、超音波処理物、または濾過物、またはサブユニット、例えば、L
PSを含む外層膜の一部、精製LPS、または前記のLPSの一部、等であり得る。
は、当該培養物のフラグメント、例えば、本発明のレプトスピラ(Leptospira
)培養物由来の抽出物、超音波処理物、または濾過物、またはサブユニット、例えば、L
PSを含む外層膜の一部、精製LPS、または前記のLPSの一部、等であり得る。
それ故にさらなる態様において、本発明は、本発明のレプトスピラ(Leptospi
ra)培養物、または前記の培養物の調製品を含むレプトスピラ(Leptospira
)に対するワクチンを提供する。
ra)培養物、または前記の培養物の調製品を含むレプトスピラ(Leptospira
)に対するワクチンを提供する。
本発明の「ワクチン」は、本発明のレプトスピラ(Leptospira)培養物の(
調製品の)免疫学的有効量、および薬剤的に許容可能な担体を含む医薬組成物である。ワ
クチンは、レプトスピラ(Leptospira)に対する有効な免疫応答を誘導する。
調製品の)免疫学的有効量、および薬剤的に許容可能な担体を含む医薬組成物である。ワ
クチンは、レプトスピラ(Leptospira)に対する有効な免疫応答を誘導する。
「薬剤的に許容可能な担体」は、それが投与される標的の健康に(重篤な)有害な影響
を引き起こすことなく、医薬活性化合物の効果的な投与において援助することを意図する
。薬剤的に許容可能な担体は、例えば、滅菌水または滅菌生理食塩水であり得る。より複
雑な形態において担体は、例えば、安定剤または保存料等のさらなる添加物を含み得る緩
衝液であり得る。
を引き起こすことなく、医薬活性化合物の効果的な投与において援助することを意図する
。薬剤的に許容可能な担体は、例えば、滅菌水または滅菌生理食塩水であり得る。より複
雑な形態において担体は、例えば、安定剤または保存料等のさらなる添加物を含み得る緩
衝液であり得る。
本発明のレプトスピラ(Leptospira)に対するワクチンのレプトスピラの成
分は、レプトスピラ(Leptospira)感染、またはレプトスピラ(Leptos
pira)感染で引き起こされるレプトスピラ症の臨床徴候の強度を予防、改善または低
減するための助けとなる、標的のヒトまたは動物における免疫応答を誘導する。これは、
レプトスピラ(Leptospira)に起因する病変および影響、またはそれに対する
標的の反応に起因する数または重症度の低減をもたらすレプトスピラ(Leptospi
ra)によるコロニー形成または感染率の減少の結果であり得る。さらに、これはレプト
スピラ(Leptospira)の(尿)***の低減、およびそれによる環境への拡散を
低減するであろうし、それは人獣共通感染症の機会を低減する。
分は、レプトスピラ(Leptospira)感染、またはレプトスピラ(Leptos
pira)感染で引き起こされるレプトスピラ症の臨床徴候の強度を予防、改善または低
減するための助けとなる、標的のヒトまたは動物における免疫応答を誘導する。これは、
レプトスピラ(Leptospira)に起因する病変および影響、またはそれに対する
標的の反応に起因する数または重症度の低減をもたらすレプトスピラ(Leptospi
ra)によるコロニー形成または感染率の減少の結果であり得る。さらに、これはレプト
スピラ(Leptospira)の(尿)***の低減、およびそれによる環境への拡散を
低減するであろうし、それは人獣共通感染症の機会を低減する。
何が本発明のレプトスピラ(Leptospira)に対するワクチンの免疫学的有効
量を規定するかは、使用されるワクチンの所望の効果および特定の性質、およびワクチン
が適用される標的に依存する。本質的に液性免疫応答によって機能するバクテリンに基づ
くレプトスピラ(Leptospira)ワクチンに対して、特定の抗原マスと標的中に
おけるワクチンの免疫防御力の間の相関関係が良く知られている。それ故に有効量の決定
は、例えば、ワクチン接種後の免疫応答をモニターすることによって、または攻撃感染後
に、例えば、疾病の臨床徴候、血清学的パラメータをモニターすることによって、または
病原菌を再単離することによって、ならびにこれらを未接種の動物に観察される応答と比
較することによって、十分に日常的な実務家の技術の範囲にある。
量を規定するかは、使用されるワクチンの所望の効果および特定の性質、およびワクチン
が適用される標的に依存する。本質的に液性免疫応答によって機能するバクテリンに基づ
くレプトスピラ(Leptospira)ワクチンに対して、特定の抗原マスと標的中に
おけるワクチンの免疫防御力の間の相関関係が良く知られている。それ故に有効量の決定
は、例えば、ワクチン接種後の免疫応答をモニターすることによって、または攻撃感染後
に、例えば、疾病の臨床徴候、血清学的パラメータをモニターすることによって、または
病原菌を再単離することによって、ならびにこれらを未接種の動物に観察される応答と比
較することによって、十分に日常的な実務家の技術の範囲にある。
好ましい実施形態において、本発明のワクチンは、例えば、分解し易い成分を保護する
ために、および/またはワクチンのシェルフライフを高めるために、安定剤をさらに含む
。一般的に当該安定剤は、高分子量の大分子、例えば、脂質、炭水化物またはタンパク質
;例えば、粉乳、ゼラチン、血清アルブミン、ソルビトール、トレハロース、スペルミジ
ン、デキストランまたはポリビニルピロリドン、およびアルカリ金属リン酸塩等の緩衝液
、等である。
ために、および/またはワクチンのシェルフライフを高めるために、安定剤をさらに含む
。一般的に当該安定剤は、高分子量の大分子、例えば、脂質、炭水化物またはタンパク質
;例えば、粉乳、ゼラチン、血清アルブミン、ソルビトール、トレハロース、スペルミジ
ン、デキストランまたはポリビニルピロリドン、およびアルカリ金属リン酸塩等の緩衝液
、等である。
安定剤は、好ましくは動物起源の化合物を含まないか、または:WO 2006/09
4,974に開示される通り化学的に定義される。
4,974に開示される通り化学的に定義される。
同様に、チメロサール、フェノール性化合物および/またはゲンタマイシン等の保存料
が添加され得る。
が添加され得る。
ワクチン学における一般的な技術および手順は、当該技術分野において周知であり、例
えば、薬局方等の政府規制において、ならびに「Veterinary vaccino
logy(獣医学のワクチン学)」(P.Pastoret et al.ed(編).
,1997,Elsevier,Amsterdam,ISBN:0444819681
)および「Remington:the science and practice
of pharmacy(レミントン:薬学の科学と実践)」(2000,Lippin
cot,USA,ISBN:683306472)等の周知のハンドブックに記載されて
いる。
えば、薬局方等の政府規制において、ならびに「Veterinary vaccino
logy(獣医学のワクチン学)」(P.Pastoret et al.ed(編).
,1997,Elsevier,Amsterdam,ISBN:0444819681
)および「Remington:the science and practice
of pharmacy(レミントン:薬学の科学と実践)」(2000,Lippin
cot,USA,ISBN:683306472)等の周知のハンドブックに記載されて
いる。
本発明のワクチンに対する標的の被験者は、レプトスピラ(Leptospira)感
染に感受性であるヒトまたは多種多様な動物である。好ましい標的は:ヒト、イヌ、ブタ
、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジおよびシカから選択される一または複数である。原則として
標的は、健康または病気であり得て、しかもレプトスピラ(Leptospira)の存
在に関して、またはレプトスピラ(Leptospira)に対する抗体に関して正また
は負であり得る。同様に標的は、ワクチン接種に感受性のあるいかなる年齢でもあり得る
。しかしながら、健康で感染していない標的にワクチン接種すること、およびいかなる圃
場感染をも防ぐためにできるだけ早くワクチン接種することが明らかに好ましい。
染に感受性であるヒトまたは多種多様な動物である。好ましい標的は:ヒト、イヌ、ブタ
、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジおよびシカから選択される一または複数である。原則として
標的は、健康または病気であり得て、しかもレプトスピラ(Leptospira)の存
在に関して、またはレプトスピラ(Leptospira)に対する抗体に関して正また
は負であり得る。同様に標的は、ワクチン接種に感受性のあるいかなる年齢でもあり得る
。しかしながら、健康で感染していない標的にワクチン接種すること、およびいかなる圃
場感染をも防ぐためにできるだけ早くワクチン接種することが明らかに好ましい。
本発明のワクチンは、効果的な初回抗原刺激として役立ち得て、それはその後追加免疫
接種に引き継がれ、増幅される。
接種に引き継がれ、増幅される。
本発明のワクチンは、レプトスピラ(Leptospira)感染の確立および進行の
双方、または病気の臨床徴候を防ぐので、予防的処置にも治療的処置にも等しく使用され
得る。
双方、または病気の臨床徴候を防ぐので、予防的処置にも治療的処置にも等しく使用され
得る。
標的に対する本発明のワクチンの適用計画は、単回投与または反復投与であり得て、投
与量および製剤に適合するように、ならびに免疫学的に有効である量で、同時にまたは連
続的に投与され得る。
与量および製剤に適合するように、ならびに免疫学的に有効である量で、同時にまたは連
続的に投与され得る。
本発明のワクチン投与のプロトコルは、理想的には標的が必要とし得る既存の他のワク
チンの既存の接種計画と統合される。
チンの既存の接種計画と統合される。
本発明のワクチンは、好ましくは年1回の単回投与として適用される。
本発明のワクチンは、本発明の培養物由来のレプトスピラ(Leptospira)、
またはその調製品の、用量当たり1x10^6と1x10^10の間;好ましくは用量当た
り1x10^7と5x10^9の間の細菌細胞量を含み得る。
またはその調製品の、用量当たり1x10^6と1x10^10の間;好ましくは用量当た
り1x10^7と5x10^9の間の細菌細胞量を含み得る。
本発明のワクチンは、標的に適う容量で投与され得て、例えば、容量で約0.1と10
mlの間であり得る。好ましくは、一用量は約0.25と3mlの間である。
mlの間であり得る。好ましくは、一用量は約0.25と3mlの間である。
本発明のワクチンは、当該技術分野で既知の方法に従って標的に投与され得る。例えば
、皮膚の中へのまたは皮膚を貫く注射の任意の経路、例えば:筋肉内、静脈内、腹腔内、
皮内、粘膜下または皮下による非経口適用としてである。実行可能な代わりの適用経路は
、局所適用、吸入または食餌性経路である。
、皮膚の中へのまたは皮膚を貫く注射の任意の経路、例えば:筋肉内、静脈内、腹腔内、
皮内、粘膜下または皮下による非経口適用としてである。実行可能な代わりの適用経路は
、局所適用、吸入または食餌性経路である。
好ましい適用経路は、筋肉内または皮下注射によってである。最適の適用経路が、使用
される具体的なワクチン製剤、および標的の個々の特性に依存するであろうことは言うま
でもない。
される具体的なワクチン製剤、および標的の個々の特性に依存するであろうことは言うま
でもない。
本発明のワクチンをさらに最適化することは、十分に当業者の手が届くところである。
一般的にこれには、ワクチンが十分な免疫応答を提供するために、ワクチンの効果の微調
整細が関与する。これは、ワクチン用量を適応させることによって、またはワクチンの他
の形態または製剤で使用することによって、またはワクチンの他の成分(例えば、安定剤
またはアジュバント)を適応させることによって、または異なる経路による適用によって
、成され得る。
一般的にこれには、ワクチンが十分な免疫応答を提供するために、ワクチンの効果の微調
整細が関与する。これは、ワクチン用量を適応させることによって、またはワクチンの他
の形態または製剤で使用することによって、またはワクチンの他の成分(例えば、安定剤
またはアジュバント)を適応させることによって、または異なる経路による適用によって
、成され得る。
ワクチンは、他の化合物、例えば、アジュバント、追加の抗原、サイトカイン、等をさ
らに含み得る。もう一つの方法として、本発明のワクチンは、医薬成分、例えば、抗生物
質、ホルモンまたは抗炎症薬と有利に併用され得る。
らに含み得る。もう一つの方法として、本発明のワクチンは、医薬成分、例えば、抗生物
質、ホルモンまたは抗炎症薬と有利に併用され得る。
好ましい実施形態において、本発明のワクチンは、それがアジュバントを含むことによ
って特徴づけられる。
って特徴づけられる。
「アジュバント」は、周知のワクチン成分であり、一般的にそれは、標的の免疫応答を
非特異的に刺激する物質である。様々なアジュバントが当該技術分野において知られてい
る。アジュバントの例は、完全フロイントおよび不完全フロイントアジュバント、ビタミ
ンE、アルミニウム組成物、非イオン性ブロック重合体および硫酸デキストラン等のポリ
アミン、Carbopol(登録商標)およびピランである。
非特異的に刺激する物質である。様々なアジュバントが当該技術分野において知られてい
る。アジュバントの例は、完全フロイントおよび不完全フロイントアジュバント、ビタミ
ンE、アルミニウム組成物、非イオン性ブロック重合体および硫酸デキストラン等のポリ
アミン、Carbopol(登録商標)およびピランである。
さらに、ペプチド類、例えば、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシン等
がしばしばアジュバントとして使用され、ならびにミネラルオイル、例えば、Bayol
(登録商標)またはMarkol(登録商標)、Montanide(登録商標)または
軽パラフィンオイル、植物油または併用製品、例えば、Seppic(登録商標)社のI
SA(登録商標)、またはDiluvacForte(登録商標))が有利に使用され得
る。エマルジョンは、油中水型(w/o)、水中油型(o/w)、水中油中水型(w/o
/w)、二重オイルエマルジョン(DOE)、等であり得る。
がしばしばアジュバントとして使用され、ならびにミネラルオイル、例えば、Bayol
(登録商標)またはMarkol(登録商標)、Montanide(登録商標)または
軽パラフィンオイル、植物油または併用製品、例えば、Seppic(登録商標)社のI
SA(登録商標)、またはDiluvacForte(登録商標))が有利に使用され得
る。エマルジョンは、油中水型(w/o)、水中油型(o/w)、水中油中水型(w/o
/w)、二重オイルエマルジョン(DOE)、等であり得る。
本発明のワクチンのための好ましいアジュバントは、水酸化アルミニウムまたはサポニ
ン、例えば:Quil A(登録商標)、またはQ‐vac(登録商標)等である。サポ
ニンおよびワクチン成分は、ISCOM(登録商標)(EP 109.942、EP 1
80.564、EP 242.380)に組み込まれ得る。
ン、例えば:Quil A(登録商標)、またはQ‐vac(登録商標)等である。サポ
ニンおよびワクチン成分は、ISCOM(登録商標)(EP 109.942、EP 1
80.564、EP 242.380)に組み込まれ得る。
言うまでもないが、アジュバント化する、ビヒクル化合物または希釈剤を添加する、ワ
クチンを乳化するまたは安定化する他の方法も、本発明の範囲内である。
クチンを乳化するまたは安定化する他の方法も、本発明の範囲内である。
本発明のワクチンは、他の抗原と共に混合ワクチンに有利に組み込まれ得る。
それ故により好ましい実施形態において、本発明のワクチンは、それが追加の免疫活性
成分を含むことで特徴づけられる。
成分を含むことで特徴づけられる。
「追加の免疫活性成分」は、抗原、免疫亢進物質および/またはワクチンであり得て、
それらのいずれもアジュバントを含み得る。追加の免疫活性成分は、抗原の形態である場
合、ヒトまたは獣医学的に重要ないかなる抗原成分からも成りたち得る。好ましくは追加
の免疫活性成分は、標的に対し病原性であるさらなる微生物に基づくか、または由来する
。それは、例えば、生体分子または合成分子、例えば、タンパク質、炭水化物、リポ多糖
、タンパク質性の抗原をコードする核酸、等を含み得る。また、当該核酸、または当該核
酸を含むキャリアー・生きた組換え微生物を含む宿主は、該核酸または追加の免疫活性成
分を送達するための一つの方法であり得る。代わりに、それは、分画または殺菌された微
生物、例えば、寄生生物、細菌またはウイルス等を含み得る。
それらのいずれもアジュバントを含み得る。追加の免疫活性成分は、抗原の形態である場
合、ヒトまたは獣医学的に重要ないかなる抗原成分からも成りたち得る。好ましくは追加
の免疫活性成分は、標的に対し病原性であるさらなる微生物に基づくか、または由来する
。それは、例えば、生体分子または合成分子、例えば、タンパク質、炭水化物、リポ多糖
、タンパク質性の抗原をコードする核酸、等を含み得る。また、当該核酸、または当該核
酸を含むキャリアー・生きた組換え微生物を含む宿主は、該核酸または追加の免疫活性成
分を送達するための一つの方法であり得る。代わりに、それは、分画または殺菌された微
生物、例えば、寄生生物、細菌またはウイルス等を含み得る。
追加の免疫活性成分はまた、免疫亢進物質、例えば、ケモカイン、または免疫刺激性核
酸、例えば、CpGモチーフでもあり得る。代わりに、本発明のワクチンは、それ自体が
一つのワクチンに添加され得る。
酸、例えば、CpGモチーフでもあり得る。代わりに、本発明のワクチンは、それ自体が
一つのワクチンに添加され得る。
本発明の混合ワクチンの有利な有用性は、それがレプトスピラ(Leptospira
)に対する免疫応答を誘導するだけでなく、また標的の他の病原菌にたいしても誘導し、
一方でワクチン接種のために標的の単回処理だけが必要とされ、そのために標的への不快
感、ならびに時間および労働費が低減される。
)に対する免疫応答を誘導するだけでなく、また標的の他の病原菌にたいしても誘導し、
一方でワクチン接種のために標的の単回処理だけが必要とされ、そのために標的への不快
感、ならびに時間および労働費が低減される。
当該追加の免疫活性成分の例は、原則として、本発明のレプトスピラ症に対するワクチ
ンにとっての標的でもある、標的のワクチン接種を受け入れられる、すべてのウイルス、
細菌および寄生性病原体である。
ンにとっての標的でもある、標的のワクチン接種を受け入れられる、すべてのウイルス、
細菌および寄生性病原体である。
例えば、ブタ用:ブタサーコウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス、仮性狂犬病
ウイルス、ブタパルボウイルス、ブタコレラウイルス、マイコプラズマ・ハイオニューモ
ニエ(Mycoplasma hyopneumoniae)、ローソニア・イントラセ
ルラリス(Lawsonia intracellularis)、大腸菌(E.col
i)、ストレプトコッカス属菌(Streptococcus spec.)、サルモネ
ラ属菌(Salmonella spec.)、クロストリジウム属菌(Clostri
dai spec.)、アクチノバチルス・プルロニューモニア(Actinobaci
llus pleuropneumoniae)、パスツレラ属菌(Pasteurel
la spec.)、ヘモフィルス属菌(Haemophilus spec.)、エリ
シペロスリクス属菌(Erysipelothrix spe.)、ボルデテラ属菌(B
ordetella spec.)、等。
ウイルス、ブタパルボウイルス、ブタコレラウイルス、マイコプラズマ・ハイオニューモ
ニエ(Mycoplasma hyopneumoniae)、ローソニア・イントラセ
ルラリス(Lawsonia intracellularis)、大腸菌(E.col
i)、ストレプトコッカス属菌(Streptococcus spec.)、サルモネ
ラ属菌(Salmonella spec.)、クロストリジウム属菌(Clostri
dai spec.)、アクチノバチルス・プルロニューモニア(Actinobaci
llus pleuropneumoniae)、パスツレラ属菌(Pasteurel
la spec.)、ヘモフィルス属菌(Haemophilus spec.)、エリ
シペロスリクス属菌(Erysipelothrix spe.)、ボルデテラ属菌(B
ordetella spec.)、等。
ウシ用:ネオスポラ属菌(Neospora spec.)、ディクチオカウルス属菌
(Dictyocaulus spec.)、クリプトスオポリジウム属菌(Crypt
osporidium spec.)、オステルタギア属菌(Ostertagia s
pec.)、ウシロタウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス、ウシコロナウイルス、
ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス(ウシヘルペスウイルス)、ウシパラミクソウイルス、ウシ
パラインフルエンザウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、ブルータン
グウイルス、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasterurella heamolyti
ca)、大腸菌(E.coli)、サルモネラ属菌(Salmonella spec.
)、スタフィロコッカス属菌(Staphylococcus spec.)、マイコバ
クテリウム属菌(Mycobacterium spec.):、ブルセラ属菌(Bru
cella spec.)、クロストリジウム属菌(Clostridia spec.
)、マンヘニア属菌(Mannheimia spec.)、ヘモフィルス属菌(Hae
mophilus spec.)、フソバクテリウム属菌(Fusobacterium
u spec.)、等。
(Dictyocaulus spec.)、クリプトスオポリジウム属菌(Crypt
osporidium spec.)、オステルタギア属菌(Ostertagia s
pec.)、ウシロタウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス、ウシコロナウイルス、
ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス(ウシヘルペスウイルス)、ウシパラミクソウイルス、ウシ
パラインフルエンザウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、ブルータン
グウイルス、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasterurella heamolyti
ca)、大腸菌(E.coli)、サルモネラ属菌(Salmonella spec.
)、スタフィロコッカス属菌(Staphylococcus spec.)、マイコバ
クテリウム属菌(Mycobacterium spec.):、ブルセラ属菌(Bru
cella spec.)、クロストリジウム属菌(Clostridia spec.
)、マンヘニア属菌(Mannheimia spec.)、ヘモフィルス属菌(Hae
mophilus spec.)、フソバクテリウム属菌(Fusobacterium
u spec.)、等。
ヒツジまたはヤギ用:トキソプラズマ・ゴンディ(Toxoplasma gondi
i)、小反芻獣症ウイルス、ブルータングウイルス、シュマレンベルクウイルス、マイコ
バクテリウム属菌(Mycobacterium spe.)、ブルセラ属菌(Bruc
ella spec.)、クロストリジウム属菌(Clostridia spe.)、
コクシエラ属菌(Coxiella spec.)、大腸菌(E.coli)、クラミジ
ア属菌(Chlamydia spec.)、クロストリジウム属菌(Clostrid
ia spec.)、パスツレラ属菌(Pasteurella spec.)、マンヘ
ミア属菌(Mannheimia spec.)、等。
i)、小反芻獣症ウイルス、ブルータングウイルス、シュマレンベルクウイルス、マイコ
バクテリウム属菌(Mycobacterium spe.)、ブルセラ属菌(Bruc
ella spec.)、クロストリジウム属菌(Clostridia spe.)、
コクシエラ属菌(Coxiella spec.)、大腸菌(E.coli)、クラミジ
ア属菌(Chlamydia spec.)、クロストリジウム属菌(Clostrid
ia spec.)、パスツレラ属菌(Pasteurella spec.)、マンヘ
ミア属菌(Mannheimia spec.)、等。
イヌまたはネコ用:エーリキア・カニス(ehrlichia canis)、ドノバ
ンリーシュマニア(Leishmania donovani−complex)、ネオ
スポラ・カニナム(Neospora caninum)、イヌパルボウイルス、イヌジ
ステンパーウイルス、イヌアデノウイルス1型または2型、イヌ肝炎ウイルス、イヌコロ
ナウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ネコカリシウイルス、
ネコヘルペスウイルス、ネコ汎血球減少症ウイルス、クロストリジウム属菌(Clost
ridiumu spe.)、ヘパトゾーン属菌(Hepatozoon spec.)
、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、ボルデ
テラ・ブロンキセプチカ(Bordetella bronchiseptica)、ク
ラミジア属菌(Chlamydia spec.)、およびバベシア(Babesia)
属菌またはタイレリア(Theileria)属菌。
ンリーシュマニア(Leishmania donovani−complex)、ネオ
スポラ・カニナム(Neospora caninum)、イヌパルボウイルス、イヌジ
ステンパーウイルス、イヌアデノウイルス1型または2型、イヌ肝炎ウイルス、イヌコロ
ナウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ネコカリシウイルス、
ネコヘルペスウイルス、ネコ汎血球減少症ウイルス、クロストリジウム属菌(Clost
ridiumu spe.)、ヘパトゾーン属菌(Hepatozoon spec.)
、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、ボルデ
テラ・ブロンキセプチカ(Bordetella bronchiseptica)、ク
ラミジア属菌(Chlamydia spec.)、およびバベシア(Babesia)
属菌またはタイレリア(Theileria)属菌。
ヒト用:マラリア原虫属(Plasmodium)、リーシュマニア属(Leishm
ania)、トキソプラズマ属(Toxoplasma)、水痘帯状疱疹ウイルス、HI
V、ヒトパピローマウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、
狂犬病ウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、肝炎ウイルス
種、インフルエンザウイルス、ヘモフィルス属菌(Haemophilus spec.
)、ストレプトコッカス属菌(Streptococcus spec.)、コリネバク
テリウム属菌(Corynebacterium spec.)、ボルデテラ属菌(Bo
rdetella spec.)、ナイセリア属菌(Neisseria spec.)
、およびクロストリジウム属菌(Clostridium spe.)。
ania)、トキソプラズマ属(Toxoplasma)、水痘帯状疱疹ウイルス、HI
V、ヒトパピローマウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、
狂犬病ウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、肝炎ウイルス
種、インフルエンザウイルス、ヘモフィルス属菌(Haemophilus spec.
)、ストレプトコッカス属菌(Streptococcus spec.)、コリネバク
テリウム属菌(Corynebacterium spec.)、ボルデテラ属菌(Bo
rdetella spec.)、ナイセリア属菌(Neisseria spec.)
、およびクロストリジウム属菌(Clostridium spe.)。
別の実施形態において、本発明の混合ワクチンは、L.インターロガンス(L.int
errogans)の二以上の血清群由来のレプトスピラ(Leptospira)を含
み得る。例えば、イヌ標的用は:L.インターロガンス(L.interrogans(
sensu lato(広義)))血清群CanicolaおよびIcterohaem
orrhagia;または:L.インターロガンス(L.interrogans(se
nsu lato(広義)))血清群Canicola、Icterohaemorrh
agiae、AustralisおよびGrippotyphosaである。これらのう
ち一または複数は、本発明のレプトスピラ(Leptospira)培養物(由来)であ
り得て;好ましくはすべてが、本発明のレプトスピラ(Leptospira)培養物(
由来)である。
errogans)の二以上の血清群由来のレプトスピラ(Leptospira)を含
み得る。例えば、イヌ標的用は:L.インターロガンス(L.interrogans(
sensu lato(広義)))血清群CanicolaおよびIcterohaem
orrhagia;または:L.インターロガンス(L.interrogans(se
nsu lato(広義)))血清群Canicola、Icterohaemorrh
agiae、AustralisおよびGrippotyphosaである。これらのう
ち一または複数は、本発明のレプトスピラ(Leptospira)培養物(由来)であ
り得て;好ましくはすべてが、本発明のレプトスピラ(Leptospira)培養物(
由来)である。
本発明の混合ワクチンのさらに好ましい実施形態において、混合ワクチンは(追加の免
疫活性成分は別にして)、L.インターロガンス(L.interrogans)の二以
上の血清群に相当する一または複数のレプトスピラ(Leptospira)を含む。例
えば、ブタの標的に対する混合ワクチンは:L.インターロガンス(L.interro
gans)(広義)血清群Canicola、Icterohaemorrhagiae
、Australis、Grippotyphosa、PomonaおよびTarass
ovi、ならびにブタ丹毒菌(Erysipelothrix rhusiopathi
ae)およびブタパルボウイルス、を含み得る。本混合ワクチンにおいて、一または複数
のレプトスピラ(Leptospira)は、本発明のレプトスピラ(Leptospi
ra)培養物であり得る;好ましくはすべてが本発明のレプトスピラ(Leptospi
ra)培養物である。
疫活性成分は別にして)、L.インターロガンス(L.interrogans)の二以
上の血清群に相当する一または複数のレプトスピラ(Leptospira)を含む。例
えば、ブタの標的に対する混合ワクチンは:L.インターロガンス(L.interro
gans)(広義)血清群Canicola、Icterohaemorrhagiae
、Australis、Grippotyphosa、PomonaおよびTarass
ovi、ならびにブタ丹毒菌(Erysipelothrix rhusiopathi
ae)およびブタパルボウイルス、を含み得る。本混合ワクチンにおいて、一または複数
のレプトスピラ(Leptospira)は、本発明のレプトスピラ(Leptospi
ra)培養物であり得る;好ましくはすべてが本発明のレプトスピラ(Leptospi
ra)培養物である。
実用的およびプロセス制御の理由から、当該混合ワクチンにおける各々のレプトスピラ
(Leptospira)抗原を、本発明の分離した培養物において産生することが有益
である。これは、その時に各々がその特別な最適な条件により産生され得るからである。
次に別のワクチン抗原が調製され、その時初めて異なるレプトスピラ(Leptospi
ra)抗原が混合され得る。
(Leptospira)抗原を、本発明の分離した培養物において産生することが有益
である。これは、その時に各々がその特別な最適な条件により産生され得るからである。
次に別のワクチン抗原が調製され、その時初めて異なるレプトスピラ(Leptospi
ra)抗原が混合され得る。
さらなる態様において、本発明は、レプトスピラ(Leptospira)に対するワ
クチン製造のための、本発明のレプトスピラ(Leptospira)培養物、または前
記のレプトスピラ(Leptospira)培養物の調製品の使用に関する。
クチン製造のための、本発明のレプトスピラ(Leptospira)培養物、または前
記のレプトスピラ(Leptospira)培養物の調製品の使用に関する。
本発明のワクチンの「製造」は、当業者に周知の方法によって実施される。当該製造は
、一般的に本発明のレプトスピラ(Leptospira)培養物、またはその調製品の
薬剤的に混合可能な賦形剤との混合および製剤化、その後に適切なサイズの容器への割り
当てが続く段階を含む。該製造プロセスの種々の段階は、適切な試験によって、例えば、
抗原の品質および量については免疫学的試験によって;無菌性および外来病原体の存在に
ついては微生物学的試験によって;および最終的にワクチンの効力および安全性を決定す
るためにはインビトロおよびインビボでの試験によって、モニターされる必要があり得る
。これらのすべては、当業者に周知である。
、一般的に本発明のレプトスピラ(Leptospira)培養物、またはその調製品の
薬剤的に混合可能な賦形剤との混合および製剤化、その後に適切なサイズの容器への割り
当てが続く段階を含む。該製造プロセスの種々の段階は、適切な試験によって、例えば、
抗原の品質および量については免疫学的試験によって;無菌性および外来病原体の存在に
ついては微生物学的試験によって;および最終的にワクチンの効力および安全性を決定す
るためにはインビトロおよびインビボでの試験によって、モニターされる必要があり得る
。これらのすべては、当業者に周知である。
本発明のワクチンは、ヒトまたは動物標的への投与に適する、ならびに所望の投与経路
および所望の効果に調和する形態に製造され得る。
および所望の効果に調和する形態に製造され得る。
周知のワクチン形態は、標的への所望の適用方法に依存して、例えば:液剤、ゲル剤、
軟膏剤、粉剤、錠剤またはカプセルである。好ましくは本発明のワクチンは、注射用液体
、例えば:懸濁液、溶液、分散剤またはエマルジョン、等として製剤化される。通常、当
該ワクチンは無菌的に調製される。
軟膏剤、粉剤、錠剤またはカプセルである。好ましくは本発明のワクチンは、注射用液体
、例えば:懸濁液、溶液、分散剤またはエマルジョン、等として製剤化される。通常、当
該ワクチンは無菌的に調製される。
一実施形態において、本発明のワクチンは、不活性化された本発明のレプトスピラ(L
eptospira)培養物に基づく。当該のバクテリンに基づく不活化ワクチンは、周
知の技術を使用して今や本発明用に製造され得る。
eptospira)培養物に基づく。当該のバクテリンに基づく不活化ワクチンは、周
知の技術を使用して今や本発明用に製造され得る。
それ故にさらなる態様において、本発明は、レプトスピラ(Leptospira)に
対するワクチンを生産するための方法を提供し、前記の方法は:
a.インビトロ系においてレプトスピラ(Leptospira)培養物を増殖し、
b.前記のレプトスピラ(Leptospira)培養物を多価不飽和C18脂肪酸に
より補給し、
c.前記の補給レプトスピラ(Leptospira)培養物を不活性化し収集し、お
よび
d.不活化レプトスピラ(Leptospira)培養物を薬剤的に許容可能な担体と
混合する、
段階を含む。
対するワクチンを生産するための方法を提供し、前記の方法は:
a.インビトロ系においてレプトスピラ(Leptospira)培養物を増殖し、
b.前記のレプトスピラ(Leptospira)培養物を多価不飽和C18脂肪酸に
より補給し、
c.前記の補給レプトスピラ(Leptospira)培養物を不活性化し収集し、お
よび
d.不活化レプトスピラ(Leptospira)培養物を薬剤的に許容可能な担体と
混合する、
段階を含む。
該方法は、レプトスピラ症ワクチンの増殖、不活性化および製剤化に関する周知の手順
に従って実施される。収集は、先行技術におけるよりも収集の時点を選択するためのより
多くの選択肢がある以外には、先行技術におけると同様に実施される:先行技術の場合、
抗原マスのレベルが要求されるのに、収集は今や以前よりも早期に成され得る。
に従って実施される。収集は、先行技術におけるよりも収集の時点を選択するためのより
多くの選択肢がある以外には、先行技術におけると同様に実施される:先行技術の場合、
抗原マスのレベルが要求されるのに、収集は今や以前よりも早期に成され得る。
代わりに、最大限の抗原マスが望まれる場合には、従前実施されていた通り培養物は、
最初にその最大のバイオマスまで増殖され得て、培養物が本発明の方法において多価不飽
和C18脂肪酸により補給されるときになって初めて、顕著に多い抗原量が産生される。
最初にその最大のバイオマスまで増殖され得て、培養物が本発明の方法において多価不飽
和C18脂肪酸により補給されるときになって初めて、顕著に多い抗原量が産生される。
用語「増殖(proliferating)」とはレプトスピラ(Leptospir
a)細菌を多数の細胞***サイクルを繰り返し行い得るように、およびそのように誘導す
るという通常の意味を有する。本発明にとっての増殖は、「成長(growing)」、
「培養(culturing)」または「増幅(amplifying)」等の、細胞数
および細胞サイズの増加を表す同様の用語の意味を包含する。増殖期は、接種によりはじ
まり、これは順番に菌株選択、前処理および/またはさらに前増殖により始まる。
a)細菌を多数の細胞***サイクルを繰り返し行い得るように、およびそのように誘導す
るという通常の意味を有する。本発明にとっての増殖は、「成長(growing)」、
「培養(culturing)」または「増幅(amplifying)」等の、細胞数
および細胞サイズの増加を表す同様の用語の意味を包含する。増殖期は、接種によりはじ
まり、これは順番に菌株選択、前処理および/またはさらに前増殖により始まる。
「インビトロ系」とは、制御された人工的な条件下における、人体または動物体の外側
でのレプトスピラ(Leptospira)細菌の計画的な増殖の周知の方法である。こ
れには、典型的にはケモスタットまたはファーメンター、ならびに(半)合成培養培地を
用いる。日常的に、重要ないくつかの発酵パラメータがモニターされ、適切な場合に調整
され、しかもこれは自動化さえされ得る。いかなる規模におけるインビトロでの細菌細胞
増殖系のための技術、材料および装置も、周知であり、生命科学産業の多数の民間供給業
者から容易に入手可能である。
でのレプトスピラ(Leptospira)細菌の計画的な増殖の周知の方法である。こ
れには、典型的にはケモスタットまたはファーメンター、ならびに(半)合成培養培地を
用いる。日常的に、重要ないくつかの発酵パラメータがモニターされ、適切な場合に調整
され、しかもこれは自動化さえされ得る。いかなる規模におけるインビトロでの細菌細胞
増殖系のための技術、材料および装置も、周知であり、生命科学産業の多数の民間供給業
者から容易に入手可能である。
本発明のワクチンを製造するための方法の好ましい実施形態において、プロセスが非連
続的に作業され得る介在段階が導入される。介在段階は、増殖段階および補給段階の間に
導入され、最初の段階において増殖されたレプトスピラ(Leptospira)培養物
の収集、貯蔵および/または精製に関連する。
続的に作業され得る介在段階が導入される。介在段階は、増殖段階および補給段階の間に
導入され、最初の段階において増殖されたレプトスピラ(Leptospira)培養物
の収集、貯蔵および/または精製に関連する。
それ故に好ましい実施形態において、本発明のレプトスピラ(Leptospira)
に対するワクチンを生産するための方法は、第一の段階と第二の段階の間に、レプトスピ
ラ(Leptospira)培養物の収集、貯蔵および/または精製を含む、追加の段階
を含む。
に対するワクチンを生産するための方法は、第一の段階と第二の段階の間に、レプトスピ
ラ(Leptospira)培養物の収集、貯蔵および/または精製を含む、追加の段階
を含む。
この介在段階は、本発明の方法の増殖期および補給期の別個の実施および最適化を可能
とする。介在段階は、本法の更なる段階におけるその効果的な使用を可能とするように、
レプトスピラ(Leptospira)培養物の生存能または生化学的完全性を維持する
方法で、実施される。例えば、収集は、例えば、遠心分離またはダイアフィルトレーショ
ンによって行われ得る。収集の結果として、レプトスピラはより濃縮された形態となり得
る。保存は、水性環境下において約2ないし約30℃の間の温度で実施され得る。精製は
、例えば、その後の段階に対し最適条件を提供するために、増殖培地の回復または置換を
含み得る。これらの各々の操作は、別箇に、統合してまたは連続して、ならびにいかなる
論理的順序でも行われ得る。
とする。介在段階は、本法の更なる段階におけるその効果的な使用を可能とするように、
レプトスピラ(Leptospira)培養物の生存能または生化学的完全性を維持する
方法で、実施される。例えば、収集は、例えば、遠心分離またはダイアフィルトレーショ
ンによって行われ得る。収集の結果として、レプトスピラはより濃縮された形態となり得
る。保存は、水性環境下において約2ないし約30℃の間の温度で実施され得る。精製は
、例えば、その後の段階に対し最適条件を提供するために、増殖培地の回復または置換を
含み得る。これらの各々の操作は、別箇に、統合してまたは連続して、ならびにいかなる
論理的順序でも行われ得る。
本発明の方法において、レプトスピラ(Leptospira)培養物は、多価不飽和
C18脂肪酸により補給される。しかしながら、超高純度化学品としての多価不飽和C1
8脂肪酸は、例えば、いくつかの獣医用ワクチンに適用される等、薄利の製品の生産にお
ける大規模な使用にとって、余りにも高価であり得る。それ故にこれらの方法における使
用のための多価不飽和C18脂肪酸は、上で定義した通り、誘導体または多価不飽和C1
8脂肪酸に比較的に富んでいる化合物または組成物、等の異なる形態または純度で補給さ
れ得る。
C18脂肪酸により補給される。しかしながら、超高純度化学品としての多価不飽和C1
8脂肪酸は、例えば、いくつかの獣医用ワクチンに適用される等、薄利の製品の生産にお
ける大規模な使用にとって、余りにも高価であり得る。それ故にこれらの方法における使
用のための多価不飽和C18脂肪酸は、上で定義した通り、誘導体または多価不飽和C1
8脂肪酸に比較的に富んでいる化合物または組成物、等の異なる形態または純度で補給さ
れ得る。
それ故にさらなる態様において、本発明は、本発明の方法のための、多価不飽和C18
脂肪酸に比較的に富んでいる化合物または組成物の使用に関する。
脂肪酸に比較的に富んでいる化合物または組成物の使用に関する。
当業者は、多価不飽和C18脂肪酸に比較的に富んでいる化合物および組成物を試験し
うるだけでなく、さらに本発明の方法におけるそれらの使用を最適化し得る。
うるだけでなく、さらに本発明の方法におけるそれらの使用を最適化し得る。
本発明の方法における使用のための多価不飽和C18脂肪酸の非常に経済的な供給源は
、植物油であり、何故ならばこれらの油のいくつかが、非常に高いレベルの多価不飽和C
18脂肪酸を含むことが良く知られており、それらが経済的な価格であり、本発明の方法
における使用のために許容可能である品質および純度で利用可能であるからである。
、植物油であり、何故ならばこれらの油のいくつかが、非常に高いレベルの多価不飽和C
18脂肪酸を含むことが良く知られており、それらが経済的な価格であり、本発明の方法
における使用のために許容可能である品質および純度で利用可能であるからである。
それ故に本発明の使用の好ましい実施形態において、多価不飽和C18脂肪酸に比較的
に富んでいる化合物または組成物は、植物油である。
に富んでいる化合物または組成物は、植物油である。
「植物油」は、植物の一部由来、ほとんどの場合、果実および種子:ベリー類、エンド
ウ類、豆類、穀類およびナッツ類等由来;あるいは:葉、茎、花、花芽、根またはテンサ
イ由来である。植物油は、その植物源材料から圧縮、抽出、等によって単離され得る;植
物油を獲得し精製するための方法は、古来知られてきた。
ウ類、豆類、穀類およびナッツ類等由来;あるいは:葉、茎、花、花芽、根またはテンサ
イ由来である。植物油は、その植物源材料から圧縮、抽出、等によって単離され得る;植
物油を獲得し精製するための方法は、古来知られてきた。
リノール酸に比較的に富んでいる植物油の例を、表1に記載する。示した値は、総脂肪
酸含量の%(w/w)であり、ならびにおおよその平均であり、植物品種および使用され
る抽出プロセスにより変動しかつ依存し得る。参考文献:U.S.Department
of Agriculture(米国農務省),National Nutrient
Database for Standard Reference(標準的基準とし
ての国立栄養データベース),release(発行)24,September 20
11。
酸含量の%(w/w)であり、ならびにおおよその平均であり、植物品種および使用され
る抽出プロセスにより変動しかつ依存し得る。参考文献:U.S.Department
of Agriculture(米国農務省),National Nutrient
Database for Standard Reference(標準的基準とし
ての国立栄養データベース),release(発行)24,September 20
11。
(2)これは、高オレイン酸であるこの油の変異体を考慮していない。
(3)ナタネ油の変異体はCanola(登録商標)油であり、それは低減されたエル
カ酸含量を有する。
カ酸含量を有する。
(4)亜麻仁(Linseed)はまた:亜麻の種子(flax seed)として知
られる。
られる。
同様に、より外来性の非食料品の植物(種子)油がリノール酸に比較的に富んでいる;
例えば、:ピラカンサ(Firethorn)の種子由来の油:総脂肪酸の70%(w/
w);オレゴングレープ(Oregon grape):52%;ならびにサルサパリラ
(Sarsaparilla):51%(S.Oezguel‐Yuecel 2005
,J.A.O.C.S,vol.82,p.893)。
例えば、:ピラカンサ(Firethorn)の種子由来の油:総脂肪酸の70%(w/
w);オレゴングレープ(Oregon grape):52%;ならびにサルサパリラ
(Sarsaparilla):51%(S.Oezguel‐Yuecel 2005
,J.A.O.C.S,vol.82,p.893)。
アルファリノレン酸の周知の供給源は:チアセージ(Shia sage)、キーウィ
フルーツ、シソ属(Perilla)、亜麻(Flax)、***、コケモモ(Lingo
nberry)、ニガー(Niger)、ゴム、カメリナ(Camelina)、スベリ
ヒユ(Purslane)、シーバックソーン(Sea buckthorne)および
ナタネ(Rapeseed)、由来の種子油である。
フルーツ、シソ属(Perilla)、亜麻(Flax)、***、コケモモ(Lingo
nberry)、ニガー(Niger)、ゴム、カメリナ(Camelina)、スベリ
ヒユ(Purslane)、シーバックソーン(Sea buckthorne)および
ナタネ(Rapeseed)、由来の種子油である。
ガンマリノレン酸の周知の供給源は:マツヨイグサ、ルリジサ(Borage)、クロ
スグリ(Blackcurrant)、ベニバナ(Safflower)およびアサ(H
emp)、由来の種子油である。
スグリ(Blackcurrant)、ベニバナ(Safflower)およびアサ(H
emp)、由来の種子油である。
ステアリドン酸の周知の供給源は:アサ(Hemp)、クロスグリ(Blackcur
rant)、ムラサキ(Corn gromwell)およびシャゼンムラサキ属(Ec
hium)、由来の種子油である。
rant)、ムラサキ(Corn gromwell)およびシャゼンムラサキ属(Ec
hium)、由来の種子油である。
それ故に本発明にとって、多価不飽和C18脂肪酸として、総脂肪酸の少なくとも25
%(w/w)を有する植物油が好ましく、より好ましくは多価不飽和C18脂肪酸として
、総脂肪酸の好ましい順に少なくとも30、40、50、60、70または少なくとも7
5%(w/w)を有する植物油である。
%(w/w)を有する植物油が好ましく、より好ましくは多価不飽和C18脂肪酸として
、総脂肪酸の好ましい順に少なくとも30、40、50、60、70または少なくとも7
5%(w/w)を有する植物油である。
本発明のレプトスピラ(Leptospira)培養物はまた、診断方法においても有
利に使用しうる。例は、被験試料中のレプトスピラ(Leptospira)の特異的抗
体または抗原の検出のための診断試験における使用である。例えば、本発明のレプトスピ
ラ(Leptospira)培養物由来の調製品は、プレートまたは担体上に被覆され得
て、すなわち抗原検出として使用され得る。代わりに、調製品は、高い抗原マスを有する
標準的な基準抗原として使用され得る。
利に使用しうる。例は、被験試料中のレプトスピラ(Leptospira)の特異的抗
体または抗原の検出のための診断試験における使用である。例えば、本発明のレプトスピ
ラ(Leptospira)培養物由来の調製品は、プレートまたは担体上に被覆され得
て、すなわち抗原検出として使用され得る。代わりに、調製品は、高い抗原マスを有する
標準的な基準抗原として使用され得る。
本発明は、今や以下の非限定的な実施例を参照してさらに記載される。
実施例
1. 全般的な材料および方法
1.1 レプトスピラ(Leptospira)の増殖
1.1.1 細菌株、培地および前増殖(pre−proliferation)
L.インターロガンス(L.interrogans)の菌株の作業用の種菌をEMJ
H培地に接種し、29℃で3ないし5日間培養した。もし必要であれば、5回連続の前培
養の継代を実施することができて、その際前培養を次の継代に移す基準として十分な増殖
(濁度)を肉眼的に検査した。
1. 全般的な材料および方法
1.1 レプトスピラ(Leptospira)の増殖
1.1.1 細菌株、培地および前増殖(pre−proliferation)
L.インターロガンス(L.interrogans)の菌株の作業用の種菌をEMJ
H培地に接種し、29℃で3ないし5日間培養した。もし必要であれば、5回連続の前培
養の継代を実施することができて、その際前培養を次の継代に移す基準として十分な増殖
(濁度)を肉眼的に検査した。
備考:生きたレプトスピラ(Leptospira)を扱うときは、適切なバイオセキ
ュリティーおよび封じ込め措置を適用しなければならない。
ュリティーおよび封じ込め措置を適用しなければならない。
1.1.2 主醗酵
全実験を、作業体積が0.5、2または20Lの、コンピュータ制御のファーメンター
(Sartorius)中で行ったが、それぞれを0.5、1または10Lの濾過滅菌し
たEMJH培地により充填した。標準EMJH培地は、BSA1%(w/v)およびポリ
ソルベート80 0.125%(w/v)を含んだ。培地のpHは、最初は7.4±0.
1であった。ファーメンターを、0日において2〜4x10^7細胞/mlの接種密度を
与えるように、5%(v/v)の血清群Icterohaemorrhagiaeの前培
養(継代5回)により接種した。レプトスピラ(Leptospira)バイオマスの最
終収量は、発酵を停止したとき培養の5ないし6日目において、典型的には約1〜2x1
0^9細胞/mlであった。
全実験を、作業体積が0.5、2または20Lの、コンピュータ制御のファーメンター
(Sartorius)中で行ったが、それぞれを0.5、1または10Lの濾過滅菌し
たEMJH培地により充填した。標準EMJH培地は、BSA1%(w/v)およびポリ
ソルベート80 0.125%(w/v)を含んだ。培地のpHは、最初は7.4±0.
1であった。ファーメンターを、0日において2〜4x10^7細胞/mlの接種密度を
与えるように、5%(v/v)の血清群Icterohaemorrhagiaeの前培
養(継代5回)により接種した。レプトスピラ(Leptospira)バイオマスの最
終収量は、発酵を停止したとき培養の5ないし6日目において、典型的には約1〜2x1
0^9細胞/mlであった。
すべての醗酵実験の間、温度を約29℃に制御した。培地をヘッドスペースの気流によ
り通気し、設定pO2濃度を維持するために、溶存酸素(pO2)濃度を撹拌速度の自動
変化によって制御した。温度、pHおよびpO2濃度をオンラインで制御したが、pHお
よび起泡は制御しなかった。
り通気し、設定pO2濃度を維持するために、溶存酸素(pO2)濃度を撹拌速度の自動
変化によって制御した。温度、pHおよびpO2濃度をオンラインで制御したが、pHお
よび起泡は制御しなかった。
比較実験において、4基までのファーメンターを平衡して稼働したが、同じ培地および
レプトスピラ(Leptospira)の接種菌液により開始した。そのとき通常は、一
つのファーメンターが標準EMJH培地を含み対照として役立ち、一方で他のファーメン
ター中では多価不飽和C18脂肪酸の種々の補給を実施した。
レプトスピラ(Leptospira)の接種菌液により開始した。そのとき通常は、一
つのファーメンターが標準EMJH培地を含み対照として役立ち、一方で他のファーメン
ター中では多価不飽和C18脂肪酸の種々の補給を実施した。
1.1.3 リノール酸による補給
無水アルコール(JT Baker)中の10%(v/v)ストックとして、純粋なリ
ノール酸(Sigma Aldrich、純度>99%)により補給を行った。代わりに
、高レベルのリノレン酸により作成されたBSA(高LA BSA)を使用することによ
って、リノレン酸を補給した。EMJH培地中の標準的なBSAを代替するために、また
はEMJH培地中のBSAに添加するために、高LA BSAを使用したが、その場合そ
れは滅菌水中の25%(w/v)ストック溶液として添加した。高LA BSAまたは純
粋なリノール酸/エタノールの補給剤を、ファーメンターの培養物が所望の総リノール酸
を受け取るまで、0.1〜0.2ml/時間で4時間の過程にわたりファーメンターに供
給した。リノール酸の、総量における5ないし425μg/mlの間の、種々の総利用可
能レベルを試験した。レプトスピラ(Leptospira)のファーメンターの培養物
を、異なる細胞密度、すなわち初期‐、中期‐、後期培養において補給した。典型的な中
期の細胞密度は、約5x10^8細胞/mlであり、主培養の2日の間に達せられた。エ
タノールストック中の純粋なリノール酸由来のリノール酸による補給の際に、時々わずか
なpHの低下が認められたが、NaOHを適用することによって修正した。
無水アルコール(JT Baker)中の10%(v/v)ストックとして、純粋なリ
ノール酸(Sigma Aldrich、純度>99%)により補給を行った。代わりに
、高レベルのリノレン酸により作成されたBSA(高LA BSA)を使用することによ
って、リノレン酸を補給した。EMJH培地中の標準的なBSAを代替するために、また
はEMJH培地中のBSAに添加するために、高LA BSAを使用したが、その場合そ
れは滅菌水中の25%(w/v)ストック溶液として添加した。高LA BSAまたは純
粋なリノール酸/エタノールの補給剤を、ファーメンターの培養物が所望の総リノール酸
を受け取るまで、0.1〜0.2ml/時間で4時間の過程にわたりファーメンターに供
給した。リノール酸の、総量における5ないし425μg/mlの間の、種々の総利用可
能レベルを試験した。レプトスピラ(Leptospira)のファーメンターの培養物
を、異なる細胞密度、すなわち初期‐、中期‐、後期培養において補給した。典型的な中
期の細胞密度は、約5x10^8細胞/mlであり、主培養の2日の間に達せられた。エ
タノールストック中の純粋なリノール酸由来のリノール酸による補給の際に、時々わずか
なpHの低下が認められたが、NaOHを適用することによって修正した。
1.1.4 試料採取およびオフライン分析
培養培地中の総細胞数(血球計算盤による);抗原マス(抗原量(検出)Elisaに
よる);不活化細胞;および脂肪酸型のプロファイリングおよび脂肪酸型の相対含量(ガ
スクロマトグラフィーによる)の分析のために、試料5mlを毎日ファーメンターから直
接無菌的に取り出した。
培養培地中の総細胞数(血球計算盤による);抗原マス(抗原量(検出)Elisaに
よる);不活化細胞;および脂肪酸型のプロファイリングおよび脂肪酸型の相対含量(ガ
スクロマトグラフィーによる)の分析のために、試料5mlを毎日ファーメンターから直
接無菌的に取り出した。
試料を、0.1または0.2%のBPLにより、29℃で16〜24時間不活性化した
。不活化レプトスピラ(Leptospira)を24時間以内に抗原(検出)Elis
aにおいて試験した。
。不活化レプトスピラ(Leptospira)を24時間以内に抗原(検出)Elis
aにおいて試験した。
1.2 抗原(検出)Elisa
レプトスピラ(Leptospira)LPS抗原の抗原マスを、血清群または血清型
特異的、凝集性、マウスモノクローナル抗体(moabs)のセットに基づく抗原(検出
)Elisaにおいて測定したが、当該抗体は:WHO/FAO/OIE and Na
tional Collaborating Centre for Referenc
e and Research on Leptospirosis(レプトスピラ症に
関する基準・研究のWHO/FAO/OIEおよび国の基準・研究共同センター),De
partment of Biomedical Research,Royal Tr
opical Institute(王立熱帯研究所生物医学部門),Amsterda
m,The Netherlandsから入手した。使用したmoabsを表2に記載し
た。参考として:R.A.Hartskeerl et al.,(Internati
onal course on laboatory methods for the
diagnosis of Leptospirosis(レプトスピラ症診断のため
の実験方法に関する国際課程),4th Edition(第4版),1 April
2004.Royal Tropical Institute(国立熱帯研究所),A
msterdam)を参照されたい。
レプトスピラ(Leptospira)LPS抗原の抗原マスを、血清群または血清型
特異的、凝集性、マウスモノクローナル抗体(moabs)のセットに基づく抗原(検出
)Elisaにおいて測定したが、当該抗体は:WHO/FAO/OIE and Na
tional Collaborating Centre for Referenc
e and Research on Leptospirosis(レプトスピラ症に
関する基準・研究のWHO/FAO/OIEおよび国の基準・研究共同センター),De
partment of Biomedical Research,Royal Tr
opical Institute(王立熱帯研究所生物医学部門),Amsterda
m,The Netherlandsから入手した。使用したmoabsを表2に記載し
た。参考として:R.A.Hartskeerl et al.,(Internati
onal course on laboatory methods for the
diagnosis of Leptospirosis(レプトスピラ症診断のため
の実験方法に関する国際課程),4th Edition(第4版),1 April
2004.Royal Tropical Institute(国立熱帯研究所),A
msterdam)を参照されたい。
Elisaを捕捉アッセイとして準備し、被覆および検出用に同じmoabを使用した
。
。
1.2.1 被覆のためのモノクローナル抗体の調製
抗原(検出)Elisaにおける使用のためのmoabは、腹水または細胞培養物由来
であり得た。双方の型を、標準的な非クロマトグラフィー法によって使用前に精製した。
つまり:アルブミンおよび他の非‐IgGタンパク質を、カプリル酸により沈殿させた。
次にIgG画分を硫酸アンモニウムにより沈殿させた。この方法により、陰イオン交換ク
ロマトグラフィーによって精製されるIgGと同等の純度を有する、IgGの80%以上
を単離することが可能であった。
代わりにmoabを、プロテインGカラムクロマトグラフィーによって精製し得た。
1.2.2 標識モノクローナル抗体の調製
抗原(検出)Elisaのホースラディッシュペルオキダーゼ(HRP)‐IgGのた
めに、標準的手順を使用して、標識体をmoabから調製した。基本的に反応は、アルデ
ヒド基を形成するHRP酵素による炭水化物残基の過ヨウ素酸酸化を含み、その後アルデ
ヒド基はモノクローナルIgG分子上の遊離アミノ基と反応した。
抗原(検出)Elisaのホースラディッシュペルオキダーゼ(HRP)‐IgGのた
めに、標準的手順を使用して、標識体をmoabから調製した。基本的に反応は、アルデ
ヒド基を形成するHRP酵素による炭水化物残基の過ヨウ素酸酸化を含み、その後アルデ
ヒド基はモノクローナルIgG分子上の遊離アミノ基と反応した。
1.2.3 抗原量標準試料の調製
標準試料を、抗原(検出)Elisaによって試験された各々のレプトスピラ(Lep
tospira)株に対して調製した。標準は、不活化細胞由来の一価のレプトスピラ(
Leptospira)抗原のバッチである。これは、慣用技術を使用して、本質的に上
記の通りレプトスピラ(Leptospira)の特定の菌株をEMJH培地にいて増殖
することによって、および以前述べた通り不活性化することによって調製される。次に標
準を、約1x10^9細胞/ml含むように、濃縮および/または希釈する。任意の抗原
単位数、例えば:1000単位/mlを試料に添付した。標準品が補充を必要としたとき
、同じ標準品のその後の調製品は、置き換える前に古い標準品と一緒に数回比較し滴定し
た。
標準試料を、抗原(検出)Elisaによって試験された各々のレプトスピラ(Lep
tospira)株に対して調製した。標準は、不活化細胞由来の一価のレプトスピラ(
Leptospira)抗原のバッチである。これは、慣用技術を使用して、本質的に上
記の通りレプトスピラ(Leptospira)の特定の菌株をEMJH培地にいて増殖
することによって、および以前述べた通り不活性化することによって調製される。次に標
準を、約1x10^9細胞/ml含むように、濃縮および/または希釈する。任意の抗原
単位数、例えば:1000単位/mlを試料に添付した。標準品が補充を必要としたとき
、同じ標準品のその後の調製品は、置き換える前に古い標準品と一緒に数回比較し滴定し
た。
1.3 脂肪酸分析
脂肪酸組成および含量を、レプトスピラ(Leptospira)細胞、培養培地成分
の試料、および完全EMJH培養培地試料によって、周知の手順に従って分析した。脂肪
酸の抽出を、Bligh & Dyer(1959,Can.J.of Biochem
.Physiol.,vol.37,p.911)およびMorrison & Smi
th(1964,J.of Lipid Res.,vol.5,p.600)によって
公表された通りに行った。要するに:純粋な完全培養培地、またはレプトスピラ(Lep
tospira)細胞(0.5ml当たり1x10^9と1x101^0の間;細胞をBP
Lで不活性化した)、または1%(w/v)のBSA水希釈試料の水希釈試料を含む、0
.5mlの試料を分析した。この0.5mlを、メタノール1mlおよびクロロホルム2
mlにより3分間混合することによって抽出した。水0.5mlを別に添加し、30秒間
混合し、試料を1,000×g、2〜8℃で10分間遠心分離した。2mlのクロロホル
ム(下)相をガラス製バイアルに移し、クロロホルムをN2ガス気流下で蒸散した。乾燥
脂質をBF3メタノール溶液の0.6mlに再溶解し、95℃で15分間加熱して、脂肪
酸をメチル化した。次に水0.3mlおよびヘキサン0.3mlを添加し、これを振盪に
より混合し、その後ヘキサン(上)相を、抽出物中の脂肪酸のプロファイルおよび相対含
量の分析のために、標準的なガスクロマトグラフィー装置に移行した。内部標準として、
既知濃度のC21:0脂肪酸(ヘンイコシル酸)の試料を使用した。通常、試料を繰り返
し測定し、試料をガラス容器の中で調整し測定した。
脂肪酸組成および含量を、レプトスピラ(Leptospira)細胞、培養培地成分
の試料、および完全EMJH培養培地試料によって、周知の手順に従って分析した。脂肪
酸の抽出を、Bligh & Dyer(1959,Can.J.of Biochem
.Physiol.,vol.37,p.911)およびMorrison & Smi
th(1964,J.of Lipid Res.,vol.5,p.600)によって
公表された通りに行った。要するに:純粋な完全培養培地、またはレプトスピラ(Lep
tospira)細胞(0.5ml当たり1x10^9と1x101^0の間;細胞をBP
Lで不活性化した)、または1%(w/v)のBSA水希釈試料の水希釈試料を含む、0
.5mlの試料を分析した。この0.5mlを、メタノール1mlおよびクロロホルム2
mlにより3分間混合することによって抽出した。水0.5mlを別に添加し、30秒間
混合し、試料を1,000×g、2〜8℃で10分間遠心分離した。2mlのクロロホル
ム(下)相をガラス製バイアルに移し、クロロホルムをN2ガス気流下で蒸散した。乾燥
脂質をBF3メタノール溶液の0.6mlに再溶解し、95℃で15分間加熱して、脂肪
酸をメチル化した。次に水0.3mlおよびヘキサン0.3mlを添加し、これを振盪に
より混合し、その後ヘキサン(上)相を、抽出物中の脂肪酸のプロファイルおよび相対含
量の分析のために、標準的なガスクロマトグラフィー装置に移行した。内部標準として、
既知濃度のC21:0脂肪酸(ヘンイコシル酸)の試料を使用した。通常、試料を繰り返
し測定し、試料をガラス容器の中で調整し測定した。
2.先行技術の増殖条件の比較
比較例として、標準的な先行技術の条件下(従って無補給)でのレプトスピラ(Lep
tospira)の回分培養における抗原マスの形成を分析した。血清群Icteroh
aemorrhagiaeのレプトスピラ(Leptospira)を、ポリソルベート8
0(Croda)および標準的な市販BSA(Millipore)を含む、標準的なE
MJH培地において培養した。数回の前培養後に、主ファーメンターの培養液に接種し、
5ないし6日間培養した。血清群Icterohaemorrhagiaeのレプトスピ
ラ(Leptospira)にとって、これらの増殖条件において得られる抗原マスは、培
養が定常期であったときの3〜5日の平均として、通常1×10^9細胞当たり500な
いし700(血清群Icterohaemorrhagiaeの)抗原単位の間であった
。
比較例として、標準的な先行技術の条件下(従って無補給)でのレプトスピラ(Lep
tospira)の回分培養における抗原マスの形成を分析した。血清群Icteroh
aemorrhagiaeのレプトスピラ(Leptospira)を、ポリソルベート8
0(Croda)および標準的な市販BSA(Millipore)を含む、標準的なE
MJH培地において培養した。数回の前培養後に、主ファーメンターの培養液に接種し、
5ないし6日間培養した。血清群Icterohaemorrhagiaeのレプトスピ
ラ(Leptospira)にとって、これらの増殖条件において得られる抗原マスは、培
養が定常期であったときの3〜5日の平均として、通常1×10^9細胞当たり500な
いし700(血清群Icterohaemorrhagiaeの)抗原単位の間であった
。
レプトスピラ(Leptospira)抗原の当該バッチを内製のインビトロでの効力試
験において試験したとき、必要とされる最小限の効力レベルに達しえなかった。
験において試験したとき、必要とされる最小限の効力レベルに達しえなかった。
この問題は、EMJH培地中で、レプトスピラ(Leptospira)培養のために特
に推奨された市販BSA:BovoLep(登録商標)BSA(Bovogen,Aus
tralia)を使用することによっては解決されなかった。次いでこれを、同じ製造者
製の標準的な汎用BSAであるBovoStar(登録商標)で試験し、次いで、以前使
用したBSA(Millipore)で試験した。結果を表3に示す。「na」は:該当
なしを示す。
に推奨された市販BSA:BovoLep(登録商標)BSA(Bovogen,Aus
tralia)を使用することによっては解決されなかった。次いでこれを、同じ製造者
製の標準的な汎用BSAであるBovoStar(登録商標)で試験し、次いで、以前使
用したBSA(Millipore)で試験した。結果を表3に示す。「na」は:該当
なしを示す。
興味深いことには、宣伝通りにBovoLep(登録商標)は、レプトスピラ(Lep
tospira)のバイオマスを増加させたが、しかしその抗原マスに関しては顕著な効
果を有さなかった。これは、今日までのレプトスピラ(Leptospira)増殖に対す
る古典的なアプローチ法:バイオマスレベルに対する集中を象徴する。
tospira)のバイオマスを増加させたが、しかしその抗原マスに関しては顕著な効
果を有さなかった。これは、今日までのレプトスピラ(Leptospira)増殖に対す
る古典的なアプローチ法:バイオマスレベルに対する集中を象徴する。
標準的なEMJH培地は、上の試験および記載の通り、約5μg/mlのリノール酸を
提供することが見出だされた(表3を参照されたい)。標準的な1%のBSAは、ガスク
ロマトグラフィーの検出限界に近い1μg/ml未満のリノール酸しか供給しなかったの
で、これは、主に0.125%のポリソルベート80に由来した。
提供することが見出だされた(表3を参照されたい)。標準的な1%のBSAは、ガスク
ロマトグラフィーの検出限界に近い1μg/ml未満のリノール酸しか供給しなかったの
で、これは、主に0.125%のポリソルベート80に由来した。
この点においてポリソルベート80は、薬局方が定義するように、リノール酸をその脂
肪酸の最大限18%まで含むことが許される。しかしながら実際には、はるかに少なく典
型的には1.5%未満しか保有しないことが見出だされた。一つの普通の種類のポリソル
ベート80(種類:植物グレード、販売元:Croda,France)に基づき、発明
者らは、数年にわたる48バッチ由来のリノール酸含量を比較し、リノール酸の平均含量
が総脂肪酸の約0.3%(w/w)であることを見出した。ポリソルベート80が基本的
に脂肪酸から構成されると仮定すれば、EMJH培地において使用される0.125%の
ポリソルベート80は、約4μg/mlのリノール酸を培地に供給する。
肪酸の最大限18%まで含むことが許される。しかしながら実際には、はるかに少なく典
型的には1.5%未満しか保有しないことが見出だされた。一つの普通の種類のポリソル
ベート80(種類:植物グレード、販売元:Croda,France)に基づき、発明
者らは、数年にわたる48バッチ由来のリノール酸含量を比較し、リノール酸の平均含量
が総脂肪酸の約0.3%(w/w)であることを見出した。ポリソルベート80が基本的
に脂肪酸から構成されると仮定すれば、EMJH培地において使用される0.125%の
ポリソルベート80は、約4μg/mlのリノール酸を培地に供給する。
増加された量のリノール酸を含むBSAを作成した。EMJH培地におけるこの高LA
BSAの1%での使用は、レプトスピラ(Leptospira)培養物に約21μg/
mlのリノール酸を供給した;ポリソルベートの寄与により、当該培養培地はレプトスピ
ラ(Leptospira)のファーメンターの培養物に25μg/mlのリノール酸を供
給した。この利用可能なリノール酸量の増加は、レプトスピラ(Leptospira)抗
原の産生を、1636抗原単位/1×10^9細胞(3〜5日目の平均)へと強力に増加
させた。
BSAの1%での使用は、レプトスピラ(Leptospira)培養物に約21μg/
mlのリノール酸を供給した;ポリソルベートの寄与により、当該培養培地はレプトスピ
ラ(Leptospira)のファーメンターの培養物に25μg/mlのリノール酸を供
給した。この利用可能なリノール酸量の増加は、レプトスピラ(Leptospira)抗
原の産生を、1636抗原単位/1×10^9細胞(3〜5日目の平均)へと強力に増加
させた。
次のように発明者らは、発明者らの発見の有用性を証明した:5μg/mlの代わりに
25のリノール酸によりレプトスピラ(Leptospira)培養物を補給したとき、レ
プトスピラ(Leptospira)培養物の抗原マスは、124%増加させることができ
た。
25のリノール酸によりレプトスピラ(Leptospira)培養物を補給したとき、レ
プトスピラ(Leptospira)培養物の抗原マスは、124%増加させることができ
た。
図1および2は、EMJH培地で高LA BSAを使用するリノール酸補給により増殖
しているレプトスピラ(Leptospira)培養物からの毎日の試料の分析結果を表す
。図1においてバイオマス(左の縦軸)は、増殖の全六日にわたり安定した増加を示した
。抗原量(右の縦軸)は、培養培地において標準的なBSAを使用して得られたよりも高
いレベルに達した。それにも関わらず抗原マスは、三日目以降はあまり増加しなかった。
図2は、これについてリノール酸の関連性を明確に証明する、この培養物由来の培地の脂
肪酸プロファイルにおける、理由を示す;結果は総脂肪酸の%(w/w)である。C16
:0(パルミチン酸)、C18:0(ステアリン酸)およびC18:1(リノール酸)の
レベルは左の縦軸、一方でC18:2(リノール酸)のレベルは右の縦軸に関係づけられ
ることに留意されたい。
しているレプトスピラ(Leptospira)培養物からの毎日の試料の分析結果を表す
。図1においてバイオマス(左の縦軸)は、増殖の全六日にわたり安定した増加を示した
。抗原量(右の縦軸)は、培養培地において標準的なBSAを使用して得られたよりも高
いレベルに達した。それにも関わらず抗原マスは、三日目以降はあまり増加しなかった。
図2は、これについてリノール酸の関連性を明確に証明する、この培養物由来の培地の脂
肪酸プロファイルにおける、理由を示す;結果は総脂肪酸の%(w/w)である。C16
:0(パルミチン酸)、C18:0(ステアリン酸)およびC18:1(リノール酸)の
レベルは左の縦軸、一方でC18:2(リノール酸)のレベルは右の縦軸に関係づけられ
ることに留意されたい。
図2は、ポリソルベート80由来のC18:1が総脂肪酸量の大部分となる、培養の過
程にわたる培養培地において本質的に変化しなかった、C16:0、C18:0およびC
18:1の脂肪酸量を示す。しかしながら、C18:2のレベルは、最初の3日にわたり
急激に降下し、3〜5日目には検出限界(0.3%以下)未満である。リノール酸の枯渇
は、図1に示す通り抗原産生における増加の減少と一致する。
程にわたる培養培地において本質的に変化しなかった、C16:0、C18:0およびC
18:1の脂肪酸量を示す。しかしながら、C18:2のレベルは、最初の3日にわたり
急激に降下し、3〜5日目には検出限界(0.3%以下)未満である。リノール酸の枯渇
は、図1に示す通り抗原産生における増加の減少と一致する。
3.2リノレン酸
リノレン酸(C18:3)のアイソフォーム:アルファ‐またはガンマ‐のどちらも、
BSAまたはポリソルベート80のバッチにおいて、ガスクロマトグラフィーの検出限界
(脂肪酸約0.6μg/mLg/ml)を超えて検出され得なかった。従って標準的な完
全EMJH培養培地は、意味あるいかなる量のC18:3も含まない。結果として、レプ
トスピラ(Leptospira)培養物へのリノレン酸の補給を試験した実験において、
培養物で利用されたリノレン酸のすべては、基本的に別個の添加によって培養物に補給さ
れたリノレン酸に由来した。
リノレン酸(C18:3)のアイソフォーム:アルファ‐またはガンマ‐のどちらも、
BSAまたはポリソルベート80のバッチにおいて、ガスクロマトグラフィーの検出限界
(脂肪酸約0.6μg/mLg/ml)を超えて検出され得なかった。従って標準的な完
全EMJH培養培地は、意味あるいかなる量のC18:3も含まない。結果として、レプ
トスピラ(Leptospira)培養物へのリノレン酸の補給を試験した実験において、
培養物で利用されたリノレン酸のすべては、基本的に別個の添加によって培養物に補給さ
れたリノレン酸に由来した。
4.レプトスピラ(Leptospira)培養物へのリール酸のさらなる補給
もしリノール酸をさらに補給するならば、抗原マスはさらに増加するであろう。
もしリノール酸をさらに補給するならば、抗原マスはさらに増加するであろう。
上記と同様の培養物においてリノール酸を、エタノールに希釈した純粋なリノール酸に
より、2日目、指数増殖中期において補給した。培養物において100μg/mlのリノ
ール酸を供給するリノール酸量を添加した。図3の脂肪酸プロファイリングが示す通り、
最初の急速な減少および2日目の補給から生じる明確な急上昇の後に、リノール酸レベル
は、培養の継続につれて再度着実に減少した。C16:0およびC18:1脂肪酸のレベ
ルを内部標準として分析したが、これらは予想通り大部分変化しなかった。
より、2日目、指数増殖中期において補給した。培養物において100μg/mlのリノ
ール酸を供給するリノール酸量を添加した。図3の脂肪酸プロファイリングが示す通り、
最初の急速な減少および2日目の補給から生じる明確な急上昇の後に、リノール酸レベル
は、培養の継続につれて再度着実に減少した。C16:0およびC18:1脂肪酸のレベ
ルを内部標準として分析したが、これらは予想通り大部分変化しなかった。
血清群Icterohaemorrhagiae由来のレプトスピラ(Leptosp
ira)に対する本実験において産生された抗原マスは、1767抗原単位/1×10^9
細胞(3〜5日の平均)であった。
ira)に対する本実験において産生された抗原マスは、1767抗原単位/1×10^9
細胞(3〜5日の平均)であった。
5.異なる補給条件による比較培養
以前の実施例での同じ装置のより精巧な実験において、血清群Icterohaemo
rrhagiae由来のレプトスピラ(Leptospira)と比較してのファーメンタ
ー培養を並列して行ったが、ここでリノール酸(C18:2)補給の異なる条件を比較し
た。リノール酸補給の効果を強調するために、EMJH培地において標準的なBSAを使
用した。いくつかのファーメンターにおいてリノール酸を、エタノール中の純粋形態で、
または高LA BSAの溶液の添加によるBSAの複合体として、指数増殖中期に補給し
た。
以前の実施例での同じ装置のより精巧な実験において、血清群Icterohaemo
rrhagiae由来のレプトスピラ(Leptospira)と比較してのファーメンタ
ー培養を並列して行ったが、ここでリノール酸(C18:2)補給の異なる条件を比較し
た。リノール酸補給の効果を強調するために、EMJH培地において標準的なBSAを使
用した。いくつかのファーメンターにおいてリノール酸を、エタノール中の純粋形態で、
または高LA BSAの溶液の添加によるBSAの複合体として、指数増殖中期に補給し
た。
補給したリノール酸量は、50、75および150μg/mlであった。表4はまた、
培養物に利用できる総リノール酸量を記載する。
培養物に利用できる総リノール酸量を記載する。
全ファーメンターについて、細胞および培地の試料を毎日採取し、分析した。結果を図
4および5、および下の表4に示す。抗原量は、培養物の3〜5日に対する平均に基づく
。同様に、異なる補給に対する抗原マスにおける相対増加を、標準的なBSAを有する非
補給培養物に対するパーセンテージとして表した。用語「非補給」とは、EMJH中で標
準的なBSAを用いた培養物を表す。
4および5、および下の表4に示す。抗原量は、培養物の3〜5日に対する平均に基づく
。同様に、異なる補給に対する抗原マスにおける相対増加を、標準的なBSAを有する非
補給培養物に対するパーセンテージとして表した。用語「非補給」とは、EMJH中で標
準的なBSAを用いた培養物を表す。
表4、および対応する図4(バイオマス)および5(抗原量)のグラフから明らかな通
り、培養物をリノール酸により補給すると、非補給培養においては観察されない、レプト
スピラ(Leptospira)における抗原マスの急激かつ顕著な増加がある。リノール
酸の補給に際してバイオマスにおけるある程度の増加が生ずるが、しかし抗原マスにおけ
る増加は、それを顕著に上回っている。抗原マスにおける増加は、培養物が150μg/
mlにより補給されるとき、75μg/mlによる補給と比較して若干高い。しかしなが
ら、リノール酸を純粋形態で補給したとき、またはBSAとの複合体として補給したとき
の間に大きな差はなかった。おそらく、これは抗原マスの増加と毒性の間のトレードオフ
(取引)である。
さらなる好ましい効果が、図5より推定され得る:増加された抗原マスが、リノール酸
の補給により今や非常に迅速に達し得る。例えば、図5は、リノール酸の補給により高い
抗原マスが、補給から数時間以内に達せられることを示す。
の補給により今や非常に迅速に達し得る。例えば、図5は、リノール酸の補給により高い
抗原マスが、補給から数時間以内に達せられることを示す。
同様に、最終的に得られた最大抗原マスレベルを比較するとき、補給培養物を以前と同
じ期間培養する場合、そのときはかなり増加された量の抗原マスを得ることができるであ
ろう。
じ期間培養する場合、そのときはかなり増加された量の抗原マスを得ることができるであ
ろう。
6.異なる血清群のレプトスピラ(Leptospira)におけるリノール酸の補給効果
の比較
次の研究において、リノール酸(C18:2)による補給の際の抗原マスにおける増加
は、レプトスピラ(Leptospira)における一般的な現象であることが確認された
。いくつかの実験において、いくつかの血清群由来のレプトスピラ(Leptospir
a)株の培養物を、以前と同様の装置のファーメンターにおいてかつ同様の補給により増
殖した:EMJH培地においては、標準的BSAまたは高LA BSAによる補給である
;いくつかの培養物を、エタノール中の純リノール酸由来の100μg/mlのリノール
酸によりさらに補給した。バイオマスおよび抗原量の分析結果を、図6〜7(Sejro
e)、および8〜9(Grippotyphosa)に示し、表5に要約する。
の比較
次の研究において、リノール酸(C18:2)による補給の際の抗原マスにおける増加
は、レプトスピラ(Leptospira)における一般的な現象であることが確認された
。いくつかの実験において、いくつかの血清群由来のレプトスピラ(Leptospir
a)株の培養物を、以前と同様の装置のファーメンターにおいてかつ同様の補給により増
殖した:EMJH培地においては、標準的BSAまたは高LA BSAによる補給である
;いくつかの培養物を、エタノール中の純リノール酸由来の100μg/mlのリノール
酸によりさらに補給した。バイオマスおよび抗原量の分析結果を、図6〜7(Sejro
e)、および8〜9(Grippotyphosa)に示し、表5に要約する。
血清群Sejroe(血清型Hardjo)由来のレプトスピラ(Leptospir
a)にとって、高LA BSA培養培地の100μg/mlのリノール酸による補給は、
目覚ましい184%の抗原マスの増加をもたらした。補給後にバイオマスのいくらかの増
加が観察されたが、抗原量における増加は、はるかに高かった。ファーメンターを6日間
稼働し、これらの実験のスコアを培養の5および6日にわたり平均した。
a)にとって、高LA BSA培養培地の100μg/mlのリノール酸による補給は、
目覚ましい184%の抗原マスの増加をもたらした。補給後にバイオマスのいくらかの増
加が観察されたが、抗原量における増加は、はるかに高かった。ファーメンターを6日間
稼働し、これらの実験のスコアを培養の5および6日にわたり平均した。
血清群Grippotyphsaに対し、スコアを培養の4および5日にわたり平均し
た。リノール酸による補給の結果として生じた63%の増加が、抗原マスにおいて観察さ
れた。
た。リノール酸による補給の結果として生じた63%の増加が、抗原マスにおいて観察さ
れた。
同様に血清群Australis(血清型Bratislava)に対し、45%の抗
原マスにおける増加が観察された;ここで補給には低LA BSAを使用した。
原マスにおける増加が観察された;ここで補給には低LA BSAを使用した。
6.1.レプトスピラ(Leptospira)血清群Tarassoviの補給
上の実施例6に記載の補給と同様の補給において、標準的なBSAを含むEMJH培地
におけるレプトスピラ(Leptospira)血清群Tarassoviの培養物のバイ
オマスおよび抗原マスへの異なる量のC18:2脂肪酸による補給の効果を試験した。結
果を、図11および12に示す。
300μg/mlのC18:2による補給が本培養に対して毒性のあることが判明した
のに対して、100または200μg/mlのC18:2による補給は、抗原マスにおい
てバイオマス単位当たり強力な増加:非補給の対照の培養物と比較してそれぞれ67%、
99%を生じさせた。
のに対して、100または200μg/mlのC18:2による補給は、抗原マスにおい
てバイオマス単位当たり強力な増加:非補給の対照の培養物と比較してそれぞれ67%、
99%を生じさせた。
7.最大補給レベル
一つの研究において、リノール酸(C18:2)補給の最大レベルを検討した:血清群
Icterohaemorrhagiae由来のレプトスピラ(Leptospira)を
、高LA BSAを含むEMJHにおいて培養し、リノール酸エタノール中の純リノール
酸由来の追加のリノール酸100、200または400μg/mlにより補給した。結果
より、400μg/mlの添加は、補給後に細胞数が急激に減少したので、細菌に対し毒
性を誘発したことが明らかであった。それ故に、同様に高レベルのリノール酸、ただしリ
ノール酸により飽和しておいたBSAとの複合体でのリノール酸由来を補給することによ
って、この実験を繰り返すであろう。100μg/ml補給群の刺激効果は、前に観察さ
れた通りであったが、一方で200μg/ml群は、100μg/ml群の抗原マスの増
加と比較して、やや少ない増加であった。
一つの研究において、リノール酸(C18:2)補給の最大レベルを検討した:血清群
Icterohaemorrhagiae由来のレプトスピラ(Leptospira)を
、高LA BSAを含むEMJHにおいて培養し、リノール酸エタノール中の純リノール
酸由来の追加のリノール酸100、200または400μg/mlにより補給した。結果
より、400μg/mlの添加は、補給後に細胞数が急激に減少したので、細菌に対し毒
性を誘発したことが明らかであった。それ故に、同様に高レベルのリノール酸、ただしリ
ノール酸により飽和しておいたBSAとの複合体でのリノール酸由来を補給することによ
って、この実験を繰り返すであろう。100μg/ml補給群の刺激効果は、前に観察さ
れた通りであったが、一方で200μg/ml群は、100μg/ml群の抗原マスの増
加と比較して、やや少ない増加であった。
従って、これらの条件において純粋なリノール酸による補給は、25ないし250μg
/mlの間のリノール酸がレプトスピラ(Leptospira)の培養物に利用できると
き、最適であると思われる。
/mlの間のリノール酸がレプトスピラ(Leptospira)の培養物に利用できると
き、最適であると思われる。
8.補給時点
更なる実験において、レプトスピラ(Leptospira)培養物の補給の時点の妥当
性を究明した。血清群Icterohaemorrhagiaeのレプトスピラ(Lep
tospira)を使用して試験した補給時点は、初期‐、中期‐および後期指数増殖期
であった。標準的なBSAを含むEMJH培地を、エタノール中の純リノール酸100μ
g/mlにより補給した。これらの培養物に利用できる総リノール酸量は、それ故に10
5μg/mlであった。
更なる実験において、レプトスピラ(Leptospira)培養物の補給の時点の妥当
性を究明した。血清群Icterohaemorrhagiaeのレプトスピラ(Lep
tospira)を使用して試験した補給時点は、初期‐、中期‐および後期指数増殖期
であった。標準的なBSAを含むEMJH培地を、エタノール中の純リノール酸100μ
g/mlにより補給した。これらの培養物に利用できる総リノール酸量は、それ故に10
5μg/mlであった。
結果を表6および図10に示した。図10が明示する通り、補給の2,4および8時間
後に既に急激な上昇を伴って、抗原マスにおける激しい増加が、レプトスピラ(Lept
ospira)培養物のすべての期間において誘導され得る。この時間の尺度ゆえに、増
加という結果は、主に生化学的プロセスに起因し、増殖にはあまり起因しない。
後に既に急激な上昇を伴って、抗原マスにおける激しい増加が、レプトスピラ(Lept
ospira)培養物のすべての期間において誘導され得る。この時間の尺度ゆえに、増
加という結果は、主に生化学的プロセスに起因し、増殖にはあまり起因しない。
産生される抗原の量が、補給をより遅く行うときにより少ないと見える事実は、リノー
ル酸補給がバイオマスに関して有するやや正の効果に由来する。これは、抗原マスを標準
細胞量当たりで表すとき、平均化される。表6を参照されたい。
ル酸補給がバイオマスに関して有するやや正の効果に由来する。これは、抗原マスを標準
細胞量当たりで表すとき、平均化される。表6を参照されたい。
さらなる時点:収集後、洗浄後および濃縮後、における補給試験を継続して検討してい
る。終期の培養物の培養は、培地の回復調製を必要とするかもしれない;終期の培養物の
補給が最も好ましいと推定されるにしても、その段階において細胞は多数であり、未だ抗
原マスの形成が可能だからである。さらにこの段階において、補給リノール酸の任意の残
存毒性が細胞の増殖能を妨げるかどうかは、増殖能がもはや要求されないので、あまり関
係しない。
9.補給レプトスピラ(Leptospira)培養物から調製されたワクチンの改良され
た免疫能の究明
リノール酸により補給したレプトスピラ(Leptospira)培養物を、上記の通り
産生した。これらを、当該技術分野において周知の通り、不活性化、アジュバント化した
レプトスピラ(Leptospira)ワクチンに製剤化し、薬局方モノグラフに規定され
る通りインビボでの実験において試験する。血清応答、攻撃感染防御およびワクチン接種
の副反応のレベルの影響をモニターする。
た免疫能の究明
リノール酸により補給したレプトスピラ(Leptospira)培養物を、上記の通り
産生した。これらを、当該技術分野において周知の通り、不活性化、アジュバント化した
レプトスピラ(Leptospira)ワクチンに製剤化し、薬局方モノグラフに規定され
る通りインビボでの実験において試験する。血清応答、攻撃感染防御およびワクチン接種
の副反応のレベルの影響をモニターする。
レプトスピラ症ワクチンに対して、抗原マスと免疫防御能の相互関係が周知であるので
、従前よりも高い抗原マスを有するバクテリンワクチンはまた、より高いレベルの免疫防
御を誘導し得ることを、確信を持って予測し得る。
、従前よりも高い抗原マスを有するバクテリンワクチンはまた、より高いレベルの免疫防
御を誘導し得ることを、確信を持って予測し得る。
同様に、レプトスピラ(Leptospira)バクテリンワクチンのタンパク質負荷は
、ワクチン接種の副作用の原因作用として明確に関係しているので、レプトスピラ(Le
ptospira)バクテリンワクチンが、副作用を誘発することは少ないが、同等また
は改良された免疫化を誘導することも予測し得る。
、ワクチン接種の副作用の原因作用として明確に関係しているので、レプトスピラ(Le
ptospira)バクテリンワクチンが、副作用を誘発することは少ないが、同等また
は改良された免疫化を誘導することも予測し得る。
10 リノレン酸によるレプトスピラ(Leptospira)培養物の補給
アルファ‐またはガンマ‐リノール酸(C18:3)によるレプトスピラ(Lepto
spira)培養物の補給を、基本的にリノール酸(C18:2)による補給に対し上記
した通り行った。実施例が、他に優って多価不飽和C18脂肪酸の一形態に対する特別の
好みを示す、特別のレプトスピラ(Leptospira)であった以外は、結果はまた大
部分は同等である。
アルファ‐またはガンマ‐リノール酸(C18:3)によるレプトスピラ(Lepto
spira)培養物の補給を、基本的にリノール酸(C18:2)による補給に対し上記
した通り行った。実施例が、他に優って多価不飽和C18脂肪酸の一形態に対する特別の
好みを示す、特別のレプトスピラ(Leptospira)であった以外は、結果はまた大
部分は同等である。
単位バイオマス当たりの抗原マスを、レプトスピラ(Leptospira)の培養物が
定常期にあった日々にわたり、また同様の方法で計算した;典型的にこれは接種の3‐4
‐5日後においてであり、時折およびある血清群に対しては、培養の4‐5‐6日後であ
った。以前の通り、Elisaによる平均抗原マススコアを、1×10^9細胞当たりで
計算した(前‐不活性化)。抗原マスにおける相対増加を、補給を受けなかった対照培養
物と比較して計算した。対照培養物の平均抗原マス/1×10^9細胞を、0%増加と設
定した。
定常期にあった日々にわたり、また同様の方法で計算した;典型的にこれは接種の3‐4
‐5日後においてであり、時折およびある血清群に対しては、培養の4‐5‐6日後であ
った。以前の通り、Elisaによる平均抗原マススコアを、1×10^9細胞当たりで
計算した(前‐不活性化)。抗原マスにおける相対増加を、補給を受けなかった対照培養
物と比較して計算した。対照培養物の平均抗原マス/1×10^9細胞を、0%増加と設
定した。
C18:3によるレプトスピラ(Leptospira)培養物の補給に関する全実験に
おいて、標準的なBSA(Milipore)およびポリソルベート80(Croda)
を使用してEMJHを調製した。述べた通り、当該EMJH培地それ自身、無視できる量
のC18:3を含んでいた。
おいて、標準的なBSA(Milipore)およびポリソルベート80(Croda)
を使用してEMJHを調製した。述べた通り、当該EMJH培地それ自身、無視できる量
のC18:3を含んでいた。
アルファ‐およびガンマC18:3の双方は、純粋な化学品(>98%)を購入した。
補給直前に、培養物に添加される予定であったC18:3量に依存して、C18:3を無
水エタノール中で10%ないし20%(v/v)に希釈した。このエタノール希釈液を、
4時間の期間にわたり分割して、5回分の添加によりレプトスピラ(Leptospir
a)培養物に添加した。
補給直前に、培養物に添加される予定であったC18:3量に依存して、C18:3を無
水エタノール中で10%ないし20%(v/v)に希釈した。このエタノール希釈液を、
4時間の期間にわたり分割して、5回分の添加によりレプトスピラ(Leptospir
a)培養物に添加した。
10.1 レプトスピラ(Leptospira)培養物におけるリノレン酸の消費
実施例4および図1〜3においてC18:2に対し記載することに即して、補給の有無
によるC18:3の消費を検討した。EMJH培地におけるレプトスピラ(Leptos
pira)血清群Icterohaemorrhagiaeの培養物に対する結果を、図
13および14に示す。これらの培養物の標準的なバイオマスの増殖は、図1に示した増
殖と類似した。
実施例4および図1〜3においてC18:2に対し記載することに即して、補給の有無
によるC18:3の消費を検討した。EMJH培地におけるレプトスピラ(Leptos
pira)血清群Icterohaemorrhagiaeの培養物に対する結果を、図
13および14に示す。これらの培養物の標準的なバイオマスの増殖は、図1に示した増
殖と類似した。
図13は、非補給培養物中の主な脂肪酸の相対量のプロファイルを示す:C16:0お
よびC18:1、これらは左側の縦軸に対して示すが、培養物が増殖しているときでさえ
、比較的に一定のままである。C18:2およびC18:3の量は右側の縦軸に対し示す
:3日目に、C18:2のレベルは既に消尽されて、C18:3‐アルファは着実に低下
し、5日目から消尽される。
よびC18:1、これらは左側の縦軸に対して示すが、培養物が増殖しているときでさえ
、比較的に一定のままである。C18:2およびC18:3の量は右側の縦軸に対し示す
:3日目に、C18:2のレベルは既に消尽されて、C18:3‐アルファは着実に低下
し、5日目から消尽される。
図14は同様のプロファイルを示すが、しかし200μg/mlアルファC18:3に
より接種3日後に補給した培養物に関するものである。この図においてすべての脂肪酸相
対量を、左側の縦軸に基づいて示す。図に示すように、アルファC18:3の補給は、試
料採取時点の3.3日におけるC18:3の明確に検出可能なレベルをもたらす。その後
の日々に、この量は着実に消費され、再度5日において消尽される。抗原マスの相当する
増加を、図16、18および20に示す。
より接種3日後に補給した培養物に関するものである。この図においてすべての脂肪酸相
対量を、左側の縦軸に基づいて示す。図に示すように、アルファC18:3の補給は、試
料採取時点の3.3日におけるC18:3の明確に検出可能なレベルをもたらす。その後
の日々に、この量は着実に消費され、再度5日において消尽される。抗原マスの相当する
増加を、図16、18および20に示す。
10.2 異なる量のC18:3の補給の効果
実施例5、および図4および5においてC18:2に対し記載するものとの比較で、E
MJH培地中のレプトスピラ(Leptospira)血清群Icterohaemorr
hagiaeの培養物を、異なる量のC18:3、アルファ‐リノレン酸(アルファC1
8:3)またはガンマ‐リノレン酸(ガンマC18:3)、により補給した。結果を図1
5〜20に示す。
実施例5、および図4および5においてC18:2に対し記載するものとの比較で、E
MJH培地中のレプトスピラ(Leptospira)血清群Icterohaemorr
hagiaeの培養物を、異なる量のC18:3、アルファ‐リノレン酸(アルファC1
8:3)またはガンマ‐リノレン酸(ガンマC18:3)、により補給した。結果を図1
5〜20に示す。
これらのすべての結果において明らかな通り:リノレン酸による補給は、レプトスピラ
(Leptospira)培養物における、バイオマス単位当たりの抗原マスにおける正味
の増加を生じながら、バイオマスの増加を遥かに超える抗原マスの増加を誘発する。
(Leptospira)培養物における、バイオマス単位当たりの抗原マスにおける正味
の増加を生じながら、バイオマスの増加を遥かに超える抗原マスの増加を誘発する。
図15および16は、100、200、300または400μg/mlのアルファC1
8:3による補給の、バイオマスおよび抗原マスに関する効果を示す。300または40
0μg/mlの補給は、明らかに培養に関し毒性のある効果を有した。他の量については
、100μg/mlのアルファC18:3は、200μg/mlのアルファC18:3:
81%よりも、抗原マスにおけるやや良好な増加:122%を与えた。
8:3による補給の、バイオマスおよび抗原マスに関する効果を示す。300または40
0μg/mlの補給は、明らかに培養に関し毒性のある効果を有した。他の量については
、100μg/mlのアルファC18:3は、200μg/mlのアルファC18:3:
81%よりも、抗原マスにおけるやや良好な増加:122%を与えた。
図17および18は、200、300または400μg/mlのガンマC18:3によ
る補給の、バイオマスおよび抗原マスに関する効果を示す。400μg/mlの量だけが
毒性を示したので、明らかにガンマC18:3は、アルファC18:3よりもIcter
ohaemorrhagiae培養物によってより許容された。
る補給の、バイオマスおよび抗原マスに関する効果を示す。400μg/mlの量だけが
毒性を示したので、明らかにガンマC18:3は、アルファC18:3よりもIcter
ohaemorrhagiae培養物によってより許容された。
200μg/mlのガンマC18:3による補給は、300μg/mlのガンマC13
:3による補給よりも抗原マスにおいてやや低い増加:114%対153%を与えた。
:3による補給よりも抗原マスにおいてやや低い増加:114%対153%を与えた。
図19および20は、等量のアルファ‐またはガンマC18:3の、EMJH培地にお
けるレプトスピラ(Leptospira)血清型Icterohaemorrhagia
eの培養物の、バイオマスおよび抗原マスに対する効果の比較を示す。100μg/ml
のアルファC18:3による補給は、相対抗原マスにおいて、100μg/mlのガンマ
C18:3が誘発したよりも大きな増加:122%対170%を誘発した。
けるレプトスピラ(Leptospira)血清型Icterohaemorrhagia
eの培養物の、バイオマスおよび抗原マスに対する効果の比較を示す。100μg/ml
のアルファC18:3による補給は、相対抗原マスにおいて、100μg/mlのガンマ
C18:3が誘発したよりも大きな増加:122%対170%を誘発した。
このことは、血清群Icterohaemorrhagiaeレプトスピラ(Lept
ospira)のアルファ異性体C18:3に対する嗜好性を示す。
ospira)のアルファ異性体C18:3に対する嗜好性を示す。
10.3 他のレプトスピラ(Leptospira)血清群のC18:3補給の効果
実施例6、および図6〜9および11〜12においてC18:2に対し記載するものと
の比較で、リノレン酸による補給による抗原マスに関する効果を、Icterohaem
orrhagiae以外の血清群のレプトスピラ(Leptospira)についても試
験した。血清群Australis(血清型Bratislava)、Tarassov
i、Grippotyphosa、PomonaまたはCanicolaの特定の培養物
において、100または200μg/mlのアルファC18:3、または100μg/m
lのガンマC18:3による補給によって試験した。結果を、図21〜32、および表7
および8に示す。
実施例6、および図6〜9および11〜12においてC18:2に対し記載するものと
の比較で、リノレン酸による補給による抗原マスに関する効果を、Icterohaem
orrhagiae以外の血清群のレプトスピラ(Leptospira)についても試
験した。血清群Australis(血清型Bratislava)、Tarassov
i、Grippotyphosa、PomonaまたはCanicolaの特定の培養物
において、100または200μg/mlのアルファC18:3、または100μg/m
lのガンマC18:3による補給によって試験した。結果を、図21〜32、および表7
および8に示す。
血清群Australis、TarassoviおよびGrippotyphosaの
レプトスピラ(Leptospira)は、一般的にC18:3のどちらの異性体にも強
い嗜好性を有さないことが特筆された。しかしながら血清群Pomonaは、強い嗜好性
、つまりガンマC18:3に対する嗜好性を有した;その抗原マス産生は、アルファC1
8:3が補給されたとき、対照培養物さえよりも少なかった。
Conicolaは、抗原マスにおける相対増加を示す前に、高含量の脂肪酸を要求す
るように(それぞれに対し:許容可能であった)思われたので、血清群Canicola
のレプトスピラ(Leptospira)(菌株 280503)を、若干量のアルファ
‐およびガンマC18:3により試験した。結果を、図29〜32、および表8に示す。
るように(それぞれに対し:許容可能であった)思われたので、血清群Canicola
のレプトスピラ(Leptospira)(菌株 280503)を、若干量のアルファ
‐およびガンマC18:3により試験した。結果を、図29〜32、および表8に示す。
10.4 C18:3の最大補給レベル
実施例7においてC18:2に対し記載するものとの比較で、補給されるC18:3の
量の効果は、実際問題としてそのレプトスピラ(Leptospira)にたいする細胞
毒性によって制限されるようにみえる。血清群Canicolaは、いくぶん高いレベル
のC18:3補給を許容するように思われたが、他のほとんどの血清群は、C18:3の
200μg/ml以上で細胞毒性を示した。C18:3のアルファ‐またはガンマ異性体
由来の細胞毒性に関して、明確な差異は認められなかった。
10.5 C18:3の補給時点
実施例8、および図10おいてC18:2に対し記載するものとの比較で、EMJH培
地のレプトスピラ(Leptospira)血清群Icterohaemorrhagi
aeの培養物の補給の効果を、アルファ‐またはガンマC18:3により培養の異なる時
点において試験した。結果を図33〜36に示す。
実施例8、および図10おいてC18:2に対し記載するものとの比較で、EMJH培
地のレプトスピラ(Leptospira)血清群Icterohaemorrhagi
aeの培養物の補給の効果を、アルファ‐またはガンマC18:3により培養の異なる時
点において試験した。結果を図33〜36に示す。
図33および34は、アルファC18:3による、1、5または8×10^8細胞/m
lにおける補給の結果を示す。認められた抗原マスの相対増加は:それぞれ163、16
4および140%であった。
lにおける補給の結果を示す。認められた抗原マスの相対増加は:それぞれ163、16
4および140%であった。
図35および36は、ガンマC18:3による、2、5または8×10^8細胞/ml
における補給の結果を示す。認められた抗原マスの相対増加は:それぞれ71、81およ
び162%であった。
における補給の結果を示す。認められた抗原マスの相対増加は:それぞれ71、81およ
び162%であった。
結果として、C18:3による補給のタイミングの効果は、補給の時の細胞濃度の関数
としてそれほど重要ではないと思われる。低い培地細胞濃度で適用したとき、アルファC
18:3による補給は抗原マスの最も高い増加を与えたが、一方で高い細胞濃度で適用し
たときに、ガンマC18:3は最も高い増加を与えた。
としてそれほど重要ではないと思われる。低い培地細胞濃度で適用したとき、アルファC
18:3による補給は抗原マスの最も高い増加を与えたが、一方で高い細胞濃度で適用し
たときに、ガンマC18:3は最も高い増加を与えた。
10.6 異なる多価不飽和C18脂肪酸の併用補給
驚いたことに、多価不飽和C18脂肪酸はまた、補給において併用され得て、それから
累積的な効果を引き起こすことが認められた。これを、EMJH培地中のレプトスピラ(
Leptospira)血清群Icterohaemorrhagiaeの培養物に関し
て試験したが、当該培地を、100μg/mlのC18:2により、または100μg/
mlのアルファC18:3により、または50μg/mlのC18:2および50μg/
mlのアルファC18:3の併用により補給した。併用の脂肪酸を、4時間の過程にわた
る5回の添加において、別々の10%エタノール希釈液として、二つの脂肪酸を実用的に
同時に添加することによって、培養物に供給した。
驚いたことに、多価不飽和C18脂肪酸はまた、補給において併用され得て、それから
累積的な効果を引き起こすことが認められた。これを、EMJH培地中のレプトスピラ(
Leptospira)血清群Icterohaemorrhagiaeの培養物に関し
て試験したが、当該培地を、100μg/mlのC18:2により、または100μg/
mlのアルファC18:3により、または50μg/mlのC18:2および50μg/
mlのアルファC18:3の併用により補給した。併用の脂肪酸を、4時間の過程にわた
る5回の添加において、別々の10%エタノール希釈液として、二つの脂肪酸を実用的に
同時に添加することによって、培養物に供給した。
得られた相対抗原マスの増加は:それぞれ77%、144%および118%であった。
結果を図37および38に示す。
結果を図37および38に示す。
驚くべきことに、C18:2とC18:3の併用による補給によって得られた抗原マス
の増加は、個々の補給の相対増加の算術平均(111%)に極めて近い、
抗原マスの相対増加のレベル(118%)を引き起こした。
の増加は、個々の補給の相対増加の算術平均(111%)に極めて近い、
抗原マスの相対増加のレベル(118%)を引き起こした。
Claims (11)
- レプトスピラ(Leptospira)培養物の抗原マスを増加させる方法であって、
前記レプトスピラ(Leptospira)培養物を多価不飽和C18脂肪酸により補給
する段階を含む前記の方法。 - 該多価不飽和C18脂肪酸が:リノール酸、アルファ‐リノレン酸およびガンマ‐リノ
レン酸から成る群より選択される一または複数である、請求項1の方法。 - 少なくとも15μgの多価不飽和C18脂肪酸/mlが前記培養物に利用可能とされる
条件下において、該方法がレプトスピラ(Leptospira)培養物を培養する段階
を含む、請求項1または2の方法。 - 前記レプトスピラ(Leptospira)培養物が増加した抗原マスを有する、請求
項1〜3のいずれか一項の方法によって得ることが可能なレプトスピラ(Leptosp
ira)培養物。 - レプトスピラ(Leptospira)に対するワクチンにおける使用のための、請求
項4のレプトスピラ(Leptospira)培養物、または前記培養物の調製品。 - 請求項4のレプトスピラ(Leptospira)培養物、または前記培養物の調製品
を含むレプトスピラ症に対するワクチン。 - レプトスピラ症に対するワクチンの製造のための、請求項4のレプトスピラ(Lept
ospira)培養物、または前記培養物の調製品の使用。 - レプトスピラ症に対するワクチンを産生するための方法であって:
a.インビトロ系においてレプトスピラ(Leptospira)培養物を増殖し、
b.前記レプトスピラ(Leptospira)培養物を多価不飽和C18脂肪酸によ
り補給し、
c.前記補給されたレプトスピラ(Leptospira)培養物を不活性化しかつ収
集し、および
d.不活性化したレプトスピラ(Leptospira)培養物を薬剤的に許容可能な
担体と混合する、
段階を含む前記の方法。 - 段階a.とb.の間に、レプトスピラ(Leptospira)培養物の収集、貯蔵お
よび/または精製を含む、追加の段階がある、請求項8の方法。 - 請求項1〜3、8または9のいずれか一項の方法のための、比較的に多価不飽和C18
脂肪酸に富んでいる化合物または組成物の使用。 - 比較的に多価不飽和C18脂肪酸に富んでいる化合物または組成物が植物油である、請
求項10の使用。
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