BR112015014343A2 - métodos para aumentar a massa antigênica de uma cultura de leptospira e para produzir uma vacina contra leptospirose, cultura de leptospira, vacina contra leptospirose, e, usos de uma cultura de leptospira e de um composto ou composição - Google Patents

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Abstract

1 / 1 resumo “mã‰todos para aumentar a massa antigãšnica de uma cultura de leptospira e para produzir uma vacina contra leptospirose, cultura de leptospira, vacina contra leptospirose, e, usos de uma cultura de leptospira e de um composto ou composiã‡ãƒo” a massa antigãªnica de culturas de leptospira pode ser significativamente aumentada, independente de qualquer aumento na biomassa, suplementando culturas de leptospira com um tipo especã­fico de ã¡cido graxo, um ã¡cido graxo c18 poli-insaturado. isto proporciona vantagens na produã§ã£o antã­genos de leptospira. isto tambã©m permite a produã§ã£o de vacinas melhoradas contra leptospirose, que sã£o mais seguras e mais efetivas.

Description

“MÉTODOS PARA AUMENTAR A MASSA ANTIGÊNICA DE UMA CULTURA DE LEPTOSPIRA E PARA PRODUZIR UMA VACINA CONTRA LEPTOSPIROSE, CULTURA DE LEPTOSPIRA, VACINA CONTRA LEPTOSPIROSE, E, USOS DE UMA CULTURA DE LEPTOSPIRA E DE UM COMPOSTO OU COMPOSIÇÃO” CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção no geral se refere ao campo de bacteriologia e a vacinas bacterianas. Em particular, a invenção diz respeito a um método para aumentar a massa antigênica de Leptospira, a Leptospira obtenível por este método, e a vacinas e usos de tal Leptospira.
[002] As bactérias espiroquetas do gênero Leptospira pertencem à família Leptospiraceae, e o filo Spirochaetes. Leptospira são bactérias Gram negativas, aeróbicas, móveis, com uma forma alongada, delgada e aspecto espiral. Leptospira patogênica é observada em todo o mundo em muitos tipos de animais, bem como em humanos; mamíferos, tais como roedores, animais selvagens, animais de fazenda e cães são os reservatórios naturais. As bactérias causam uma doença chamada Leptospirose, ou doença de Weil. Isto desenvolve quando Leptospira, depois de infecção e transporte por meio da corrente sanguínea, invade seus órgãos internos, e pode apresentar uma ampla faixa de sintomas de brandos a graves, mesmo a mortalidade, e é de uma natureza aguda ou crônica. Esta variabilidade é o motivo pelo qual a doença é frequentemente mal diagnosticada. Os principais sintomas são: febre, náusea, e icterícia, resultante de vasculite, levando a falência renal, hepática, ou pulmonar, ou doença cardiovascular. A Leptospira tipicamente sobrevive no trato renal ou genital de um hospedeiro e, desta maneira, causa espalhamento horizontal, que pode também dar origem a zoonose, por meio do que humanos ficam infectados pelo contato com urina de animal ou com água da superfície contaminada. A partir de uma revisão, vide: P. Levett, 2001 (Clin. Mier. Rev., vol. 14, p. 296). Leptospiras são de natureza muito estável, e podem
2/70 sobreviver por meses em condições aquosas e em temperaturas ambientes.
[003] A classificação de Leptospira pode ser confundida com diferentes sistemas que estão sendo usados: por muitos anos, a classificação foi baseada em uma diferenciação sorológica, por meio da qual todas as Leptospiras patogênicas são indicadas como serovares das espécies Leptospira interrogans (sensu lato). Neste sistema, serovares são distinguidos por teste sorológico do imunogênio principal das bactérias: o lipopolissacarídeo (LPS) em sua membrana externa. Atualmente, mais que 200 serovares foram descritos, que são combinados em cerca de 25 sorogrupos.
[004] Entretanto, perpendicular a esta classificação por sorotipagem, existe um sistema de genotipagem baseado em recursos biológicos moleculares, nos assim chamados genomoespécies. Na prática, uma genomoespécie de Leptospira pode compreender diversos serovares, e viceversa. Para o presente caso, a classificação sorológica em serovares será usada.
[005] Alguns serovares de Leptospira infectam somente uma espécie de hospedeiro específico, mas a maioria dos serovares tem uma ampla faixa de hospedeiro. Por exemplo: serovar Hardjo L. interrogans (sensu lato) é associado com infecção de bovinos e, em serovares Tarassovi de suíno, Pomona e Bratislava são mais frequentemente incriminados. Entretanto, serovares tais como Canicola, Icterohaemorrhagiae, Bratislava e Grippotyphosa podem infectar suínos, caninos e humanos.
[006] Detecção de infecção Leptospiral de um hospedeiro é possível em uma variedade de maneiras. O padrão ouro é a detecção sorológica de anticorpos específicos em um soro do hospedeiro pelo assim chamado teste de aglutinação microscópica (MAT). Neste teste, uma diluição em série de um soro do paciente é incubada com Leptospira viva de um serovar específico. Quando anticorpos específicos estão presentes no soro, esses aglutinarão as
3/ 70 bactérias do teste, que podem ser lidas, por exemplo, por microscópio (campo escuro). O teste é altamente específico, e o MAT é também decisivo para a soroclassificação de Leptospira isoladas. Testes alternativos são Elisa (ensaio imunosorbsorvente ligado a enzima), ou PCR (reação em cadeia de polimerase).
[007] Tratamento de Leptospirose pode ser feito terapeuticamente por administração de antibióticos. Entretanto, em virtude de a doença ser frequentemente mal diagnosticada, profilaxia por vacinação é preferida. Diversos tipos de vacinas contra Leptospira para uso animal ou humano estão sob investigação, mas atualmente somente vacinas veterinárias são amplamente comercialmente disponíveis. As espécies de animais que são rotineiramente vacinados são porcos, gado e cães. Vacinação então serve tanto para prevenir doença do hospedeiro, bem como para reduzir espalhamento zoonótico.
[008] Vacinas contra Leptospirose atuais são baseadas em uma suspensão de células bacterianas totalmente inativadas, uma assim chamada bacterina, de uma estirpe de um serovar relevante. Essas vacinas induzem uma imunidade efetiva do tipo humoral, por meio da qual a maioria dos anticorpos imunoprotetores é capaz de aglutinar e assim neutralizar Leptospira. O antígeno imunodominante das bactérias é o LPS, e especificamente epítopos em frações de oligossacarídeo do LPS. A imunidade induzida é basicamente específica de serovar, com alguma proteção cruzada entre sero vares relacionados, por exemplo, do mesmo soro grupo. Um exemplo de uma vacina de Leptospirose é Leptavoid® H (MSD Animal Health), para bovinos, compreendendo uma bacterina de uma estirpe de L. interrogans (sensu lato) serovar Hardjo.
[009] Entretanto, a maioria das situações de campo mostra predominância de Leptospira de mais que um sorogrupo, portanto, muitas vacinas contra Leptospirose comerciais são vacinas de combinação que
4/ 70 fornecem ampla proteção. Um exemplo é a vacina para canino Nobivac® Lepto4 (Merck Animal Health), que compreende estirpes de cada qual dos sorogrupos L. interrogans (sensu lato), Canicola, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae e Pomona. Também, vacinas contra Leptospirose são frequentemente combinadas com outros compostos de vacina bacteriana ou viral.
[0010] Atualmente, Leptospira estão rotineiramente sendo proliferadas em culturas in vitro, com propósitos de pesquisa ou diagnóstico, mas principalmente para a produção de vacinas. Métodos e procedimentos para proliferação in vitro de Leptospira foram conhecidos por mais de 50 anos, e assim são os ingredientes que são críticos pelo seu meio de cultura relativamente simples. Nos anos sessenta, estabeleceu-se que Leptospira (para proliferação in vitro) exige ácidos graxos de cadeia longa pela sua composição de nutrição e celular. Também, que esses ácidos graxos de cadeia longa são usados como a única fonte de energia e carbono, já que não existe consumo (detectável) de proteínas ou carboidratos do meio de cultura. Portanto, esses ácidos graxos precisam ser fornecidos pelo meio de cultura, já que Leptospira não pode sintetizar ácidos graxos de cadeia longa de novo, nem estender ácidos graxos em cadeia curta. Esses critérios ajudaram desenvolver um meio de cultura de Leptospira semidefinido (Johnson & Gary 1963; Stalheim & Wilson 1964), no qual o uso prévio de até 10 % v/v de soro total (coelho) foi substituído por uma combinação de uma fração de albumina e uma fonte definida de ácido graxo. Isto foi adicionalmente desenvolvido no meio sintético, que está ainda em uso atualmente como o meio de cultura padrão para proliferação in vitro em pequena ou grande escala de Leptospira: o meio EMJH, desenvolvido por Ellinghausen and McCullough (1965, Am. J. of Vet. Res., vol. 26, p. 45), e modificado por Johnson and Harris (1967, J. of Bacteriol., vol. 94, p. 27).
[0011] O meio EMJH contém praticamente todas as vitaminas, sais e
5/70 minerais essenciais, também 0,125 % v/v de polissorbato 80, e 1% em p/v de albumina de soro bovino (BSA) (Faine, S., 1994, p. 312, in: Leptospira and Leptospirosis, ed. S. Faine, Boca Raton, FL, USA, CRC Press).
[0012] Polissorbato 80, que é mais bem conhecido por um de seus nomes de produto comercial Tween® 80 (ICI Americas, Inc.), é monooleato de polioxietileno (20) sorbitano (CAS nr. 9005-65-6). Polissorbato 80 é um agente tensoativo não iônico que é usado extensivamente como um emulsificante e solubilizante em produtos farmacêuticos, cosméticos e alimentares (E 433). No meio EMJH, entretanto, ele serve como a fonte de bactérias de ácidos graxos de cadeia longa, já que ele convenientemente é solúvel em água e tem uma toxicidade relativamente baixa para a bactérias. O componente principal a cerca de 70 % v/v de polissorbato 80 é ácido oléico (Cl8:1), mas alguns outros ácidos graxos estão também presentes, principalmente ácido palmítico (Cl6:0) e ácido palmitoleico (Cl6:1), embora isto dependa do lote e do fabricante.
[0013] Com relação a isso, a designação de ácidos graxos, tal como ácido oléico como “C18:l”, é de acordo com a notação C:D, que é uma escrita padrão bem conhecida que descreve um ácido graxo pelas suas características principais: o número de átomos de carbono na cadeia acila (para ácido oléico: 18) e o número de ligações duplas (insaturadas) (para ácido oléico: 1).
[0014] Como Leptospira in vitro não consome proteína, a principal função do componente de albumina de EMJH é considerada a desintoxicação dos ácidos graxos no meio de cultura que são fornecidos pelo polissorbato 80, complexando-os reversivelmente, ao mesmo tempo mantendo-os biologicamente disponíveis.
[0015] Albumina de soro, além de fornecer pressão osmótica, é uma importante proteína transportadora no sangue para uma variedade de compostos, tais como proteínas, lipídios, vitaminas, moléculas pequenas, etc.
6/70 [0016] Lipídios ligados na albumina de soro contêm di- e triglicerídeos, e ésteres de colesterol e fosfolipídios, mas a maioria deles (> 90 %) é na forma de ácidos graxos livres, com “livre” significando não esterificado, ou não covalentemente ligado. Desses ácidos graxos livres ligados em albumina, mais que 90 % são ácidos graxos de tamanho médio e de cadeia longa na faixa de C14 - C20, principalmente ácido mirístico (C14:0), ácido palmítico (Cl6:0), ácido palmitoleico (Cl6:1), ácido esteárico (Cl8:0), ácido oléico (Cl8:1), ácido linoleico (Cl8:2) e ácido araquidônico (C20:4).
[0017] Albuminas ligam reversivelmente esses ácidos graxos nos diversos sítios de ligação com diferentes afinidades. Até que ponto e qual tipo de ácido graxo é ligado em uma amostra de albumina de um doador tem uma ampla variação fisiológica, e depende de recursos químicos do ácido graxo, tais como comprimento de cadeia e nível de insaturação, mas também dos recursos biológicos do doador da albumina, tais como espécies, raça e sexo, bem como seu estado nutricional e atividade.
[0018] Para BSA’s comerciais, a quantidade e o tipo de ácidos graxos ligados dependem do protocolo de produção usado por um fabricante, e variam para cada lote.
[0019] Preparações de albumina clássicas foram obtidas por um fracionamento a frio de etanol (Cohn et al., 1946, J. of the Amer. Chem. Soe., vol. 68, p. 459) para produzir o assim chamado produto albumina fração V de Cohn. Desde então, uma ampla variedade de tipos e qualidades de albumina de soro para uso, por exemplo, em bioquímica e cultura de tecido ficou comercialmente disponível. Uma ampla revisão da variabilidade de albumina de soro foi feita por Janatova (1974, J. of Medicine, vol. 5, p. 149).
[0020] Embora em condições experimentais mais que 10 moléculas de ácido graxo possam ser ligadas por molécula de albumina (Spector & Hoak, 1969, Anal. Biochem., vol. 32, p. 297), fisiologicamente a albumina
7/70 carregará entre cerca de 0,3 e 3 mols de ácido graxo por mol de albumina (Hennig & Watkins, 1989, Am. J. of Clin. Nutr., vol. 49, p. 301).
[0021] Albuminas de soro comerciais com baixas quantidades de ácidos graxos, isto é, abaixo de 0,1 mol de ácido graxo/mol de albumina, são também disponíveis; tais produtos de albumina foram deliberadamente deslipidados usando uma de uma variedade de técnicas disponíveis, tais como extração com um solvente orgânico e/ou adsorção em carvão vegetal. Entretanto, obter níveis de carga de lipídio muito baixas exige métodos de extração agressivos a valor de pH muito baixo, que pode resultar em desnaturação da albumina.
[0022] Grandes quantidades de albuminas de soro para uso em processos biológicos em escala industrial, efetivamente são somente comercialmente disponíveis de bovinos, como subproduto da indústria alimentícia.
[0023] Dos diferentes tipos de BSA adequados para uso em proliferação celular in vitro, alguns são recomendados para uso com um tipo de célula específico. Um exemplo é BovoLep® BSA (Bovogen, Austrália), que é recomendado para promover o crescimento de Leptospira em cultura, isto é, uma BSA padrão que foi enriquecida com inúmeros ácidos graxos vegetais.
[0024] O meio de cultura EMJH completo então fornece todos os ácidos graxos que são conhecidos por serem críticos para a proliferação de Leptospira em cultura: ácido palmítico (Cl6:0), ácido esteárico (Cl8:0) e ácido oleico (C18:l) (Johnson & Gary, 1963, supra).
[0025] Este meio EMJH permite proliferação da maior parte dos serovares relevantes de sorogrupos L. interrogas (sensu lato). Condições típicas para proliferação em escala industrial de Leptospira são a 28-30 °C, com controle de pOi e pH, em um vaso fermentador padrão com agitador. Entretanto, Leptospira prolifera de forma relativamente lenta, e tempos de
8/70 geração entre 12 e 24 horas foram reportados, dependendo da virulência e nível de adaptação para condições de proliferação in vitro. Em decorrência disso, para atingir uma alta biomassa, o processo de proliferação fica relativamente demorado, tipicamente 4-7 dias, dependendo da densidade de inoculação, e ele exige diversas preculturas para preparar o inóculo suficiente. Isto impõe uma carga pesada na capacidade do fermentador de um produtor. Também, este tempo de cultura prolongado impõe um grande risco para uma contaminação se desenvolver, por exemplo, pelas bactérias, levedura, ou fungos que têm tempos duplicação muito mais curtos.
[0026] Consequentemente, existe uma necessidade de métodos melhorados para a produção de antígenos de Leptospira em culturas in vitro.
[0027] A literatura no campo descreve alguns esforços para melhorar a proliferação de Leptospira em culturas in vitro. Algumas adaptações do meio EMJH reintroduziram soro, ou adicionaram um polissorbato adicional, e/ou um hidrolisado. Entretanto, tais meios EMJH enriquecidos no geral não são usados em proliferação in vitro em grande escala de Leptospira, mas são usados em diagnósticos, tipicamente como meios semissólidos, para detectar e proliferar ainda baixas quantidades das estirpes de Leptospira de maior demanda de espécimes clínicas.
[0028] Tipicamente, Leptospira são proliferadas in vitro para preparar uma vacina de Leptospirose inativada. Depois da fase de proliferação, o processo à jusante no geral começa pela inativação do produto de cultura final para produzir a bacterina. Isto pode ser feito de diversas maneiras, comumente por inativação química, tais como com formalina, tiomersal, betapropiolactona (BPL), ou betaetanolamina (BEA). Uma etapa seguinte frequentemente é concentrar e purificar a cultura inativada, por exemplo, por centrifugação ou filtração. A preparação de antígeno resultante é então formulada em uma vacina.
[0029] E prática comum formular vacinas contra Leptospirose
9/70 inativadas com base em biomassa, por meio das quais uma dose para animal é levada a conter um certo número de células, tipicamente cerca de 10Λ9 células/dose, de um serovar particular. Entretanto, esta contagem celular não pode ser feita no produto final formulado, uma vez que a (química) inativação danifica as células bacterianas. Portanto, o número de células é determinado a partir da cultura final, antes de sua inativação, contando todas as células intactas (vivas e mortas). Com este número, é calculado quantas doses/mL podem ser divididas no produto final depois da formulação. Como uma verificação de controle de qualidade pela liberação do produto para o mercado, a eficácia imunológica (a.k.a. a potência) da vacina final é verificada. O teste de potência do lote atualmente exigido pelas autoridades reguladoras é um ensaio in vivo empregando vacinação e desafio em hamsters (por exemplo, monografia da European Pharmacopeia 0447, para uma vacina de Leptospirose para canino).
[0030] Um teste de potência in vitro para vacina de Leptospirose é conhecido (Ruby et al., 1992, Biologicals, vol. 20, p. 259). Este é baseado na quantificação da massa antigênica da vacina final por ensaio sorológico, usando anticorpos e padrões específicos de serovar. Embora a correlação entre massa antigênica de bacterina de Leptospira e potência imunológica seja bem conhecida, a formulação de vacinas contra Leptospirose é ainda baseada em biomassa/dose.
[0031] Uma consequência de preparar vacinas de bacterina de Leptospira baseada em biomassa é que uma dose de vacina como essa compreende uma quantidade de proteína e outros componentes bacterianos que contribuem fortemente para imunização, tal como LPS, mas, ao contrário, podem levar a reações de vacinação local e/ou sistêmica adversas. Este problema é exacerbado no caso de vacinas que combinam diversos antígenos de Leptospiral. Em uma tentativa de melhorar a segurança de vacinas contra Leptospirose, etapas de purificação adicional no processo à jusante são no
10/70 geral aplicadas. Um medo de reações de vacinação adversas é também o principal motivo de nenhuma vacina de Leptospirosea base de bacterina para uso em humanos estar no geral disponível até hoje.
[0032] Para superar possíveis reações de vacinação, alguns grupos experimentaram reduzir a carga de componentes de vacina não protetores e derivados do meio de uma vacina de Leptospirose (combinada), aplicando meios adaptados para a cultura de Leptospira que são baixos em proteína ou mesmo sem proteína. Entretanto, esses meios devem ainda fornecer os ácidos graxos de cadeia longa essenciais que são exigidos para suportar proliferação de Leptospira. Isto exigiu uma solução para lidar com a toxicidade inerente desses ácidos graxos, já que agora esses não poderíam mais ser desintoxicados por um volume de proteína tal como fornecido por soro ou BSA. Uma abordagem foi desintoxicar o próprio polissorbato, por exemplo, por carga iônica, ou por extração com polivinilpirrolidona, ou carvão vegetal (Bey & Johnson, 1978, Inf. & Imm., vol. 19, p. 562). Uma abordagem alternativa é descrita em WO 2006/113.601, onde a toxicidade dos ácidos graxos é limitada suplementando um meio de cultura sem proteína com polissorbato em pequenas quantidades repetidas, um assim chamado processo de cultura de lote alimentado, com base em um aumento da biomassa a uma taxa de crescimento submáximo controlada. Até hoje, nenhuma vacina contra Leptospirose comercial baseada em Leptospira cultivada sem proteína é comercialmente disponível, e vacinas convencionais ainda se baseiam em purificação à jusante.
[0033] Entretanto, nenhum desses estudos da tecnologia anterior reportou efeitos das alterações no meio de cultura, ou nas condições para proliferação, na massa antigênica e/ou na imunogeneticidade da Leptospiras produzidas. Portanto, todos desses, em essência, são métodos alternativos para a produção de biomassa de Leptospira.
[0034] E, portanto, um objetivo da presente invenção fornecer
11/70 melhorias na produção de massa antigênica de Leptospira e fornecer vacinas melhoradas resultantes disto.
[0035] Observou-se surpreendentemente que este objetivo pode ser atendido e as desvantagens da tecnologia anterior podem ser superadas suplementando uma cultura de Leptospira com um ácido graxo insaturado de cadeia longa específico, um ácido graxo Cl8 poli-insaturado. Isto leva a um aumento rápido e forte da massa antigênica que excede qualquer aumento na biomassa até 3 vezes.
[0036] Esta descoberta abre o caminho para inúmeras utilidades vantajosas, tal como para geração de Leptospira com massa antigênica aumentada, que pode ser usada para a produção de vacinas melhoradas contra Leptospirose. Em virtude de ter-se observado que o aumento na quantidade de antígeno excede o aumento em biomassa, portanto, existe um aumento líquido da quantidade de antígeno por quantidade configurada de células bacterianas, quando se compara uma cultura de Leptospira suplementada com uma não suplementada.
[0037] Leptospiras que têm uma massa antigênica aumentada como essa podem agora ser usadas para preparar vacinas que têm o mesmo teor de antígeno das vacinas da tecnologia anterior, mas com uma menor quantidade de outros componentes bacterianos e derivados de cultura. Isto é favorável para processamento à jusante, e para o nível de efeitos colaterais de vacinação. Altemativamente, vacinas com uma massa antigênica aumentada podem agora ser aplicadas, no mesmo nível de componentes não específicos anterior. Além de ser favoráveis para a segurança do alvo vacinado, ficará aparente aos versados na técnica que todas essas melhorias também são altamente relevantes em termos econômicos.
[0038] Adicionalmente, culturas de Leptospira suplementadas com ácido graxo Cl 8 poli-insaturado agora atingem um nível da tecnologia anterior de massa antigênica diversos dias mais cedo. Portanto, tais culturas
12/70 podem agora ser produzidas mais rapidamente, de forma mais econômica e com menor risco de contaminações, já que os tempos de cultura podem agora ser consideravelmente menores. Altemativamente, se culturas de Leptospira suplementadas com ácido graxo Cl8 poli-insaturado forem deixadas proliferar como uma biomassa maximal como previamente, quantidades muito maiores de antígeno podem agora ser colhidas.
[0039] A presente invenção permite a melhoria de meios de cultura existentes para proliferação de Leptospira e produção de antígeno, e o projeto rotacional de meios (semi)sintéticos ideais.
[0040] Para suplementar uma cultura de Leptospira com um ácido graxo Cl8 poli-insaturado, podem ser usados compostos e/ou composições que são tanto relativamente puros quanto ricos em ácido graxo Cl8 poliinsaturado, um exemplo econômico sendo óleos vegetais.
[0041] Além do mais, em virtude de, em Leptospira, os processos para produção de biomassa e para geração de antígeno LPS parecerem ser separados em grande parte, um projeto de processo não acoplado é agora concebível em que, em um estágio inicial, uma alta quantidade de biomassa de Leptospira é produzida e, em um estágio separado posterior, a Leptospira é induzida a produzir antígeno LPS suplementando-a com um ácido graxo Cl8 poli-insaturado. A separação dessas duas etapas então permite que ambos processos sejam separadamente otimizados por seus diferentes parâmetros relevantes, tais como duração da incubação, temperatura da incubação, etc. Isto também proporciona diversas vantagens logísticas e de planejamento, por exemplo, permitindo armazenamento, coleta e/ou purificação intermediários.
[0042] Tudo isto foi totalmente inesperado, uma vez que ácidos graxos Cl8 poli-insaturados são raramente mencionados na tecnologia anterior com referências às condições de proliferação de Leptospira: Stem et al. (1969, Eur. J. of Biochem., vol. 8, p. 101) descreveu que Leptospira incorporam ácido linoleico (Cl8:2) do meio de cultura nos seus lipídios da
13/70 membrana celular. Johnson et al. (1970, Inf. & Imm., vol. 2, p. 286) reportou que ácido linoleico foi um de uma lista de ácidos graxos que estavam presentes em BSA que foi usado para proliferar culturas de Leptospira, mas não forneceu quantidades específicas. Dificilmente qualquer publicação menciona um ácido linolênico (C18:3) com referências à cultura de Leptospira, e nunca como benéfico. Consequentemente, nenhum item da tecnologia anterior descreve que um ácido graxo Cl8 poli-insaturado tem qualquer relevância especial para Leptospira, exceto pela sua toxicidade potencial. Nunca foi mencionado ou sugerido que ácido linoleico ou linolênico são de relevância especial para a geração de antígeno de Leptospira, especificamente de antígeno LPS.
[0043] Ao contrário, o consenso na tecnologia anterior neste campo é que os ácidos graxos para Leptospira relevantes são ácidos palmíticos, esteáricos e oleicos, e que esses são todos fornecidos em abundância em meio de cultura padrão por polissorbato 80. Desta maneira, Leptospira com uma quantidade ‘adequada’ de antígeno LPS foi produzida por muitos anos, e não foi descrita ou sugerida nenhuma tentativa para melhorar a quantidade de antígeno LPS por unidade de biomassa de Leptospira. Também, não houve incentivo para assim proceder, já que as vacinas contra Leptospirose são rotineiramente formuladas com base em biomassa, portanto, maximizar o número de células de Leptospira em uma cultura sempre foi o principal foco neste campo, não sua massa antigênica.
[0044] Não se sabe porquê Leptospira exige ácidos graxos Cl8 poliinsaturados para a produção de seu antígeno LPS, nem de que maneira um ácido graxo Cl8 poli-insaturado é usado pela Leptospira para gerar (parte de) a molécula de LPS.
[0045] Embora os inventores não queiram se ligar a nenhuma teoria ou modelo que possa explicar essas observações, os inventores agora especulam que, em Leptospira, os processos biológicos direcionados à
14/70 proliferação bacteriana, e aqueles direcionados à geração de LPS podem se basear em sistemas de enzima parcialmente separadas, exigindo diferentes nutrientes. Isto além do fato de que suplementação com um ácido graxo Cl8 poli-insaturado pode também induzir algum aumento de biomassa.
[0046] Os inventores adicionalmente especulam que os meios de cultura de Leptospira padrões atualmente em uso, tal como EMJH, contêm somente uma quantidade de ácidos graxos Cl8 poli-insaturados que é sub ideal para a geração eficiente de antígeno de Leptospira, isto é, independente do fato de que tais meios fornecem uma abundância dos ácidos graxos que são exigidos para a formação de biomassa de Leptospira. Consequentemente, neste meio de cultura de Leptospira da tecnologia anterior, o ácido graxo Cl 8 poli-insaturado é rapidamente esgotado, depois do que a produção de antígeno fica em uma longa parada antes de o número maximal de célula ser alcançado. Isto faz com que somente uma parte da capacidade da Leptospira para produzir antígeno LPS foi até então usado.
[0047] Portanto, em um aspecto, a invenção fornece um método para aumentar a massa antigênica de uma cultura de Leptospira, o método compreendendo a etapa de suplementar a dita cultura de Leptospira com um ácido graxo Cl8 poli-insaturado.
[0048] A “massa antigênica” para a invenção é a quantidade de antígeno LPS de um número fixo de células de Leptospira que pode ser determinada em um ensaio sorológico, tal como um Elisa. E expressa aqui como uma massa antigênica específica, a quantidade de epítopos antigênicos protetores imunodominantes no LPS de um número fixo de células de Leptospira, e apresentado como o número de unidades sorológicas de antígeno LPS Leptospiral por 1x10Λ9 células de Leptospira.
[0049] As células de Leptospira são contadas de acordo com procedimentos comuns, antes da inativação, e contando todas as células totais, vivas ou mortas, que é o que se entende como “biomassa” para a invenção.
15/70 [0050] Consequentemente, para a invenção, a massa antigênica de uma cultura de Leptospira aumenta quando a quantidade de antígeno para célula de Leptospira aumenta, em decorrência da aplicação de um método de acordo com a invenção.
[0051] Isto é oposto ao efeito em métodos da tecnologia para produzir antígenos de Leptospira pela proliferação de Leptospira; esses focaram no aumento da biomassa de Leptospira, mas não aumentaram a quantidade de antígeno por célula. Consequentemente, quando a biomassa aumenta e a quantidade de antígeno não aumenta, isto causa uma diminuição na razão da quantidade de antígeno/unidade de biomassa.
[0052] Massa antigênica é um termo bem conhecido no campo, e é tipicamente determinada usando um ensaio sorológico, tal como um Elisa, usando anticorpos que são específicos para antígeno medido, aqui LPS de Leptospira. A quantidade de antígeno detectada em uma amostra é então expressa em inúmeras unidades arbitrárias, por meio do qual essas unidades são definidas por referência à quantidade de antígeno em uma amostra padrão, que é, por exemplo, configurada para conter 1.000 unidades. Consequentemente, o valor absoluto da pontuação de uma quantidade de antígeno é arbitrário, uma vez que depende do teste específico aplicado e dos anticorpos e da amostra de referência que foram usados. No que diz respeito ao assunto, entretanto, é a diferença relativa entre as pontuações de amostras testadas nas mesmas condições, e contra a mesma amostra de referência. Isto pode, por exemplo, ser expresso como a diferença na quantidade de antígeno medida (por exemplo, 250 versus 500 unidades de antígeno/mL), ou pode convenientemente ser expresso como uma porcentagem. Uma porcentagem como essa da diferença entre duas amostras também se aplicará quando as mesmas duas amostras são analisadas com um anticorpo diferente ou contra uma amostra de referência diferente (mas apropriada).
[0053] O ensaio preferido para determinar a quantidade de antígeno
16/70 para uso na invenção é um Elisa, que usa anticorpos que são específicos para o antígeno LPS de um Sorogrupo ou serovar de Leptospira particular. Tais anticorpos podem aglutinar Leptospira em um MAT. Preferivelmente, os anticorpos são anticorpos monoclonais, e a amostra é de titulador suficientemente alto para permitir que ela seja usada em diluição.
[0054] Protocolos e materiais para realizar um ensaio de massa antigênica para Leptospira foram bem conhecidas pelos versados na técnica por um longo tempo, são no geral disponíveis, e são descritos e exemplificados aqui com detalhes. Por exemplo, centros de recurso biológico públicos tal como o ATCC (Manassas, VA, USA), ou o CNCM (Instituí Pasteur, Paris, França) podem fornecer bactéria Leptospira da maioria de serovares, e fornecer linhagens celulares de hibridoma de camundongo expressando anticorpos monoclonais aglutinantes e específicos de serovar, ou seus monoclonais, vide: Schoone et al. (1989, J. of Gen. Microbiol., vol. 135, p. 73).
[0055] Altemativamente, tais materiais podem rotineiramente ser produzidos em casa usando técnicas padrões, bactérias podem ser obtidas dos humanos ou animais infectados (aplicando medidas de biossegurança adequadas), e esses podem ser caracterizados usando técnicas comuns, o antígeno pode ser produzido proliferando Leptospira usando técnicas de rotina, também anticorpos específicos de serovar podem ser obtidos por imunização de animais experimentais, e métodos para produzir anticorpos monoclonais são bem conhecidos. Versados na técnica podem facilmente determinar a especificidade e titulador desses anticorpos, por exemplo, para realizar o bem conhecido MAT.
[0056] Também, diversas instituições governamentais e organizações internacionais fornecem amostras de referência de bactéria Leptospira, antígenos, e anticorpos específicos, por exemplo, para desenvolvimento do ensaio. Por exemplo, o Royal Tropical Institute (Amsterdam, Países Baixos), /70 que é um centro de referência para Leptospira para o WHO, FAO e OIE. Também, o USDA (Ames, IA, USA) fornece bacterinas de referência padrão dos principais serovares de Leptospira, e dá suporte às partes interessadas com protocolos e materiais configurando e realizando ELISA da quantidade de antígeno (potência).
[0057] De outra forma, o desenvolvimento e/ou a realização de rotina de ensaios da quantidade de antígeno de Leptospira podem ser terceirizados para uma de muitas instituições de serviço de diagnóstico (comercial).
[0058] Para a invenção, “aumento da massa antigênica” foi obtido por um método de acordo com a invenção, se uma maior massa antigênica foi observada por uma cultura de Leptospira suplementada com ácido graxo Cl8 poli-insaturado, quando comparada com a massa antigênica da mesma cultura ou uma cultura similar de Leptospira que não foi suplementada com um ácido graxo Cl8 poli-insaturado, em condições de outra forma idênticas. Um aumento na massa antigênica com 20 % pode já ser detectado com significância estatística usando técnicas de rotina, bem conhecidas pelos versados na técnica.
[0059] Portanto, em uma modalidade preferida de um método de acordo com a invenção, o aumento na massa antigênica de uma cultura de Leptospira é pelo menos 20 %, comparada com a massa antigênica de uma cultura de Leptospira similar que não foi suplementada com um ácido graxo C18 poli-insaturado.
[0060] Mais preferivelmente, o aumento na massa antigênica é pelo menos 25, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 63, 77, 90, 100, 121, 150, 175, 184, ou pelo menos 200 %, nesta ordem de preferência.
[0061] Para a invenção, “uma cultura de Leptospira similar” refere-se a uma cultura de Leptospira que, em termos biológicos, é altamente comparável com a cultura de Leptospira com a qual ela é comparada. Por exemplo, isto podería referir-se ao uso de uma cultura de Leptospira do
18/70 mesmo isolado, estirpe ou sorogrupo para fazer esta comparação.
[0062] Exemplos de um aumento da massa antigênica por biomassa unitária (comparado com culturas não suplementadas similares) para diferentes sorogrupos de Leptospira que foram observados pelos inventores com respeito a culturas não suplementadas, mas similares, após aplicação de um método de acordo com a invenção, foram por Icterohaemorrhagiae um aumento de 164 %, por Sejroe (serovar Hardjo) de 184 %, por Grippotyphosa de 63 %, por Tarassovi de 141 %, por Pomona de 73 %, por Canicola de 118 %, e por Australis (serovar Bratislava) de 62 %. Detalhes são fornecidos nos Exemplos e Figuras. As diferenças no efeito podem ser sorogrupo específico de Leptospira, ou podem estar relacionadas com as características do material de estirpe específico que foi usado daquele serovar. Entretanto, todos esses aumentos são economicamente muito relevantes.
[0063] Está bem de acordo com a capacidade de rotina dos versados na técnica otimizar o aumento na massa antigênica resultante de suplementação com um ácido graxo Cl8 poli-insaturado como em um método de acordo com a invenção, por exemplo, pela adaptação das condições da cultura, da suplementação, ou da Leptospira usadas.
[0064] Este critério agora permite a otimização adicional de culturas de Leptospira dos diferentes sorogrupos, para suplementação com um ácido graxo Cl8 poli-insaturado particular, a fim de obter um aumento relativo maximal na razão em massa antigênica/biomassa deste sorogrupo de Leptospira, serovar, tipo ou estirpe.
[0065] Portanto, em modalidades preferidas do método de acordo com a invenção:
para uma cultura de sorogrupo de Leptospira Icterohaemorrhagiae, o ácido graxo Cl8 poli-insaturado é um ácido linolênico (C18:3), e preferivelmente um ácido alfa-linolênico (C18:3 alfa),
- para uma cultura de sorogrupo de Leptospira Canicola, o
19/70 ácido graxo Cl8 poli-insaturado é um ácido linolênico (Cl8:3),
- para uma cultura de sorogrupo de Leptospira Pomona, ο ácido graxo C18 poli-insaturado é um ácido gama-linolênico (C18:3 gama), e/ou
- para uma cultura de sorogrupo de Leptospira Sejroe (serovar Hardjo), o ácido graxo Cl8 poli-insaturado é ácido linoleico (Cl8:2), por meio do que o ácido graxo pode também ser fornecido na cultura de Leptospira na forma de um derivado deste ácido graxo, ou na forma de um composto ou composição relativamente rica em ácido graxo, da maneira definida aqui.
[0066] Em princípio, qualquer ácido graxo Cl8 poli-insaturado, da maneira definida anteriormente, pode ser usado em um método de acordo com a invenção, e fornece no geral o mesmo efeito. Ainda mais dessa maneira, os inventores observaram que diferentes tipos de ácido graxo C18 poliinsaturado podem também ser fornecidos para uma cultura em uma suplementação combinada, por meio da qual seus efeitos no aumento de massa antigênica foram cumulativos.
[0067] Isto é exemplificado aqui, por exemplo, para Leptospira do sorogrupo Icterohaemorrhagiae, onde suplementação com a combinação de 50 gg/mL de cada qual dos ácidos linoleicos e dos ácidos alfa-linolênicos produziu um aumento na massa antigênica que foi muito próxima da média aritmética do aumento relativo separado na massa antigênica a partir da suplementação das culturas (no mesmo experimento) com 100 gg/mL, tanto de ácido linoleico quanto de ácido alfa-linolênico.
[0068] A suplementação combinada de ácidos graxos Cl8 poliinsaturados para o método de acordo com a invenção, pode ser suplementando com uma mistura de ácidos graxos (ou de seus derivados, ou compostos ou composições relativamente ricos em tais ácidos graxos), ou como suplementações separadas, tanto simultaneamente, consecutivamente, quanto
20/70 mais separadas no tempo.
[0069] Portanto, em uma modalidade, o ácido graxo Cl 8 poliinsaturado é suplementado com uma cultura de Leptospira usando uma composição que contém naturalmente mais que um ácido graxo Cl8 poliinsaturado. Exemplos são óleos vegetais (semente), por exemplo, óleo de semente de colza ou semente de linho, que são relativamente ricos tanto em Cl8:2 quanto em Cl8:3 alfa, ou óleo de semente de cânhamo, que é relativamente rico em C18:2, C18:3 alfa, e C18:3 gama.
[0070] “Leptospira” refere-se geral a bactérias do gênero taxonômico de bactérias espiroqueta com este nome. Isto inclui também Leptospira que são subclassificadas delas de qualquer maneira, por exemplo, como uma subespécie, estirpe, isolado, genotipo, serotipo, serovar, sorogrupo, variante, ou subtipo e similares. Tal Leptospira compartilha os recursos de caracterização de seus elementos da família taxonômica tais como as características genômicas, físicas, eletromicroscópicas e bioquímicas, bem como características biológicas tais como comportamentos fisiológicos, imunológicos ou patogênicos. Em seguida à classificação sorológica, outras determinações podem ser baseadas em sequenciamento de nucleotídeo ou ensaios de PCR, como conhecido no campo.
[0071] Ficará aparente aos versados na técnica que, embora o gênero bacteriano que é o objetivo da presente invenção, seja atualmente chamado Leptospira, isto é uma classificação taxonômica que podería ser submetida a mudança, já que novos critérios levaram a reclassificação em um novo ou diferente grupo taxonômico. Entretanto, uma vez que isto não muda o microorganismo envolvido ou seus recursos de caracterização, somente seu nome ou classificação científica, tais organismos reclassificados permanecem no escopo da invenção.
[0072] Leptospiras preferidas para uso em um método de acordo com a invenção são Leptospiras que são patogênicas para uma ou mais espécies de
21/70 animal ou para humanos; mais preferido é pelo menos um sorogrupo selecionado de sorogrupos L. interrogas (sensu lato)) Canicola, Icterohaemorrhagiae, Australis, Grippotyphosa, Pomona, Tarassovi, Sejroe e Autumnalis.
[0073] Ainda mais preferido é pelo menos um serovar selecionado de sorogrupos L. interrogas (sensu lato)) Canicola, Portland-vere, Icterohaemorrhagiae, Copenhageni, Bratislava, Australis, Grippotyphosa, Dadas, Pomona, Tarassovi, Gatuni, Hardjo, Saxkoebing e Autumnalis.
Uma “cultura” para a invenção é: uma composição compreendendo bactéria Leptospira. As bactérias em uma cultura de Leptospira para a invenção podem ser em diferentes densidades ou condições: intactas ou não, vivas ou mortas, (parcialmente) rompidas ou inativadas, etc. As bactérias podem estar em qualquer fase do ciclo da célula, tais como proliferação, repouso ou dormente. A cultura pode ser uma cultura em proliferação, onde as Leptospiras são recentemente inoculadas, fase exponencial ou log inicial, do meio, final. Ou a cultura pode ser uma cultura estática ou estacionária, onde as Leptospiras são em fase log, ou em uma cultura colhida ou armazenada.
[0074] A composição compreendendo a bactéria Leptospira pode ser líquida, sólida ou semissólida, congelada ou liofilizada. A composição pode ser um meio de cultura, ou um meio de armazenamento, e pode compreender um estabilizador, ou um outro aditivo ou carreador farmaceuticamente aceitável. Inter alia, uma cultura como essa compreende uma suspensão celular.
[0075] Em uma modalidade preferida, a cultura para uso em um método de acordo com a invenção é em forma líquida, uma vez que isto facilita a captação pela Leptospira de um ácido graxo Cl8 poli-insaturado.
[0076] Para a invenção, o termo “compreendendo” (bem como variações tais como “compreendem”, “compreende” e “compreendido”) da maneira usada aqui, refere-se a todos os elementos, e a qualquer possível
22/70 combinação concebível para a invenção, que são cobertos ou incluídos pela seção de texto, parágrafo, reivindicação, etc. nos quais este termo é usado, mesmo se tais elementos ou combinações não estiverem explicitamente citados, e não se referirem à exclusão de nenhum de tal(s) do(s) elemento(s) ou combinações. Consequentemente, qualquer seção de texto, parágrafo, reivindicação, etc. como esses, podem também relacionar como uma ou mais modalidade(s) em que o termo “compreendendo” (ou suas variações) é substituído por expressões tais como “consiste em”, “consistindo em”, ou “consiste essencialmente em”.
[0077] Para a invenção, “suplementar” tem o significando comum de adicionar para suprir uma deficiência, ou reforçar ou entender alguma coisa (de: American heritage dictionary, ed. Houghton Miflin Co., Boston, USA).
[0078] A maneira na qual a suplementação de um ácido graxo Cl8 poli-insaturado em um método de acordo com a invenção é aplicada em princípio não é limitada, desde que o efeito do dito método possa ser alcançado, um aumento relativo da massa antigênica. Assim, por um método de acordo com a invenção, suplementação de um ácido graxo Cl8 poliinsaturado pode ser feita por adição em uma cultura de Leptospira existente, tanto uma vez, repetidamente, quanto continuamente. Alternativamente, suplementação de uma cultura de Leptospira em um método de acordo com a invenção pode ser feito fornecendo uma certa concentração de um ácido graxo Cl 8 poli-insaturado no momento de estabilizar a cultura de Leptospira para a invenção. Por exemplo, fornecendo uma certa concentração de um ácido graxo Cl8 poli-insaturado em um meio de cultura no qual uma cultura de Leptospira deve ser inoculada e proliferada, ou em um meio de lavagem, armazenamento, ou incubação no qual uma cultura de Leptospira deve ser mantida ou tratada.
[0079] Também, a suplementação com um ácido graxo Cl8 poliinsaturado pode ser em diferentes pontos no tempo o ciclo de vida da
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Leptospira, tal como no estágio inicial, média ou final de uma cultura ativamente em proliferação, ou em uma amostra armazenada, e em diferentes densidades das células bacterianas.
[0080] O ácido graxo Cl8 poli-insaturado pode ser em diferentes formas, e pode ser suplementado em diferentes maneiras. Opções para variação e otimização dessas condições são descritas e exemplificadas aqui, e estão bem dentro das capacidades de rotina dos versados na técnica.
[0081] Em uma modalidade preferida, a suplementação para um método de acordo com a invenção é feita adicionando um ácido graxo Cl8 poli-insaturado em uma cultura em proliferação de Leptospira, e adicionando gradualmente com o tempo.
[0082] Para a invenção, “um ácido graxo Cl8 poli-insaturado” referese ao composto químico que é o ácido graxo, ou a um derivado deste, mas também a um ácido graxo Cl8 poli-insaturado em uma mistura ou complexo, ou um composto ou composição que é relativamente rica em um ácido graxo Cl8 poli-insaturado. Um composto ou composição é “relativamente rica” em um ácido graxo Cl8 poli-insaturado se ela compreender um ácido graxo Cl8 poli-insaturado em uma quantidade de pelo menos cerca de 5 % de sua quantidade total de ácidos graxos. Preferivelmente, pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 % de sua quantidade total de ácidos graxos, nesta ordem de preferência.
[0083] Determinação de teor de ácido graxo, bem como a diferenciação nas quantidades relativas de ácidos graxos individual, podem rotineiramente ser feitas pelos versados na técnica, por exemplo, por extração e cromatografia gasosa. Exemplos de compostos e composições que são relativamente ricos em um ácido graxo Cl 8 poli-insaturado, para uso em um método de acordo com a invenção, são descritos a seguir.
[0084] A expressão “ácido graxo Cl8 poli-insaturado” é usada no seu significando comum, com relação a um ácido graxo com uma cadeia de
24/70 hidrocarboneto contendo átomos 18 C, e cuja cadeia de hidrocarboneto contém mais que uma ligação dupla (insaturada).
[0085] Conhecidos na técnica são ácidos graxos Cl8 poli-insaturados conjugados, que são produzidos (ergo não consumidos) por bactérias tal como Lactobacilli, no rume de ruminantes.
[0086] Em uma modalidade preferida, o ácido graxo Cl 8 poliinsaturado para uso na invenção não é conjugado.
[0087] Em uma modalidade preferida adicional, o ácido graxo Cl8 poli-insaturado para uso na invenção é um polieno interrompido por metileno, não é ramificado, e/ou não é ligado em um anel cicloalcano.
[0088] Ainda em uma modalidade preferida adicional, o ácido graxo Cl8 poli-insaturado para uso na invenção é um ácido graxo Cl8 poliinsaturado de omega 3 ou um omega 6.
[0089] Ainda em uma modalidade preferida adicional, o ácido graxo Cl8 poli-insaturado para uso na invenção são um ou mais selecionados do grupo que consiste em Cl8:2, Cl8:3, e Cl8:4.
[0090] Na modalidade mais preferida, o ácido graxo Cl8 poliinsaturado para uso na invenção são um ou mais selecionados do grupo que consiste em: ácido linoleico, ácido alfa-linolênico, ácido gama-linolênico, ou ácido esteriadônico.
[0091] “Ácido linoleico” é um ácido graxo C18:2, n-6, delta 9,12, com nome científico: ácido 9, 12-octadecadienóico, e CAS nr.: 60-33-3. Preferivelmente, ambas suas ligações duplas são na forma eis.
[0092] Ácido linolênico é um ácido graxo Cl8:3, com duas formas isoméricas: ácido alfa-linolênico , e ácido gama-linolênico.
[0093] “Ácido alfa-linolênico ” é um ácido graxo C18:3, n-3, delta 9, 12, 15, com nome científico: ácido 9, 12, 15-octadecatrienóico, e CAS nr.: 463-40-1. Preferivelmente, todas as suas ligações duplas são na forma eis.
[0094] “Ácido gama-linolênico” é um ácido graxo C18:3, n-6, delta 6,
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9, 12, com nome científico: ácido 6, 9, 12-octadecatrienóico, e CAS nr.: 50626-3. Preferivelmente, todas as suas ligações duplas são na forma eis.
[0095] “Ácido esteriadônico” é um ácido graxo C18:4, n-3, delta 6, 9, 12, 15, com nome científico: ácido 6, 9, 12, 15-octadecatetraenóico, e CAS nr. 20290-75-9. Ácido esteriadônico é também conhecido como ácido moróctico. Preferivelmente, todas as suas ligações duplas são na forma eis.
[0096] O ácido graxo Cl8 poli-insaturado pode ser de origem natural ou sintética, e pode ser em estado isolado ou em qualquer grau de pureza. Também, o ácido graxo Cl8 poli-insaturado pode ser ligado, acoplado ou esterificado em outros grupos químicos. Todas essas formas são permissíveis, desde que o ácido graxo Cl8 poli-insaturado seja biologicamente disponível para a cultura de Leptospira, e o efeito de um método de acordo com a invenção possa ser obtido. Preferivelmente, o ácido graxo Cl8 poli-insaturado é em uma forma que não é muito tóxica para a cultura de Leptospira, e que pode ser usada no contexto de condições de cultura aquosa.
[0097] Versados na técnica podem facilmente determinar se um ácido graxo Cl8 poli-insaturado, um derivado, ou um composto ou composição contendo um ácido graxo Cl8 poli-insaturado, pode ser usado em um método de acordo com a invenção, ou é muito tóxico ou inconveniente, para os detalhes e exemplos fornecidos aqui. Por exemplo, testar um ácido graxo, derivado, composto ou composição deste em uma fermentação em escala pequena representativa de Leptospira, e determinar a quantidade de antígeno de LPS de Leptospira de um certo número de células, e comparar estas com a quantidade de antígeno de células de uma cultura de Leptospira similar que não foi suplementada com o um ácido graxo Cl 8 poli-insaturado contendo composto ou composição.
[0098] Exemplos de ácidos graxos Cl 8 poli-insaturados, derivados, compostos e composições para uso na invenção são um ácido graxo Cl8 poliinsaturado disponível em uma variedade de purezas de todos os principais
26/70 fornecedores de produtos bioquímicos. Também, o ácido graxo Cl8 poliinsaturado pode ser ligado em uma molécula carreadora ou complexado nela, tal como um proteína ou complexo de proteína (por exemplo, soro ou albumina, uma enzima (acil-CoA), ou esterificado em um glicerol ou colesterol, ou como uma lipoproteína, um fosfolipídio (ligado em um fosfato), ou um glicolipídio ou lipopolissacarídeo (ligado em uma fração de carboidrato). Também, o ácido graxo Cl8 poli-insaturado pode estar presente como um componente de ácido livre secundário em uma composição de outros ácidos graxos. Altemativamente, o ácido graxo Cl8 poli-insaturado pode estar presente em um composto ou composição relativamente rico em ácido graxo Cl8 poli-insaturado, tal como um óleo vegetal (semente).
[0099] Como um ácido graxo é normalmente pouco solúvel em um meio aquoso, o ácido graxo Cl8 poli-insaturado, ou um derivado, ou um composto ou composição relativamente rica em um ácido graxo Cl8 poliinsaturado, pode ser produzido em uma preparação que facilita sua suplementação em uma cultura de Leptospira, de maneira a produzir ou mantê-lo biodisponível. Por exemplo, o ácido graxo Cl 8 poli-insaturado pode ser fisicamente disperso, ou quimicamente emulsificado, ou misturado com um solvente. Ele pode ser combinado com um carreador tais como uma celulose, ciclodextrina, ou colesterol, ou usando BSA ou soro da maneira descrita anteriormente; alternativamente um ácido graxo Cl 8 poli-insaturado pode ser transferido por meio de um adsorvente particulado tal como, por exemplo, Celite® ou Amberlite® (Spector & Hoak, supra).
[00100] Uma maneira vantajosa de suplementar uma cultura de Leptospira com um ácido graxo Cl8 poli-insaturado em um método, de acordo com a invenção é suplementando a cultura com BSA que foi criada para compreender uma grande quantidade de um ácido graxo Cl8 poliinsaturado.
[00101] Portanto, em uma modalidade preferida de um método de
27/70 acordo com a invenção, o ácido graxo Cl8 poli-insaturado é suplementado na forma de um complexo na BS A.
[00102] Um ácido graxo Cl8 poli-insaturado pode ser carregado para a BSA por coincubação simples, até a BSA ser saturada com o ácido graxo Cl8 poli-insaturado. Ligação de ácido graxo em BSA depende da temperatura e pH, conforme é conhecido na técnica, e descrito, por exemplo, em: Spector & Hoak (supra), e Ashbrook et al. (1975, J. of Biol. Chem., vol. 250, p. 2333). O nível de carga de um ácido graxo Cl8 poli-insaturado na BSA pode convenientemente ser analisado por cromatografia gasosa da maneira descrita a seguir. Quanto de um ácido graxo Cl 8 poli-insaturado pode ser coletado para a BSA, depende do tipo e da qualidade da BSA, bem como da quantidade de ácido graxo que foi já ligado. Se desejar-se carregamento maximal de um ácido graxo Cl8 poli-insaturado, BSA pode primeiro ser deslipidado por extração, e então recarregado exclusivamente com um ácido graxo Cl8 poli-insaturado. Uma BSA que foi carregada com ácido graxo Cl8 poli-insaturado (adicional) pode ser usada em culturas de Leptospira, alternativa ou adicionalmente, a BSA ou soro que já é usada no meio de cultura.
[00103] Os inventores observaram que suplementação efetiva para um método de acordo com a invenção foi possível usando uma BSA que foi criada para conter pelo menos cerca de 10 % em peso/peso de seus ácidos graxos como um ácido graxo Cl8 poli-insaturado.
[00104] Portanto, uma composição preferida para suplementar um ácido graxo Cl8 poli-insaturado para um método de acordo com a invenção, é uma preparação de BSA compreendendo pelo menos cerca de 10 % em peso/peso de seu ácido graxo livre como um ácido graxo Cl8 poli-insaturado; preferivelmente compreendendo pelo menos 12, 15, 18, 20, 21, 23, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 90, 95, ou 99 % em peso/peso de seu ácido graxo livre como um ácido graxo Cl8 poli-insaturado, nesta ordem de preferência.
28/70 [00105] Versados na técnica perceberão que quando uma cultura de Leptospira é suplementada com um ácido graxo Cl8 poli-insaturado, de acordo com o método da invenção, usando uma preparação de BSA, isto pode aumentar a carga da proteína da cultura e, assim, da vacina produzida dela. Isto podería ter um efeito no nível de efeitos colaterais da vacinação. Uma cultura como essa pode, portanto, exige uma etapa de purificação para livrar de excesso de proteínas. Entretanto, uma vez que tal purificação está frequentemente sendo aplicada de qualquer maneira, portanto, a suplementação de um ácido graxo Cl8 poli-insaturado em um complexo com BSA ou soro é uma maneira altamente efetiva para aumentar a massa antigênica de uma cultura de Leptospira.
[00106] O ácido graxo Cl 8 poli-insaturado (-preparação) pode ser suplementado em uma cultura de Leptospira de acordo com o método da invenção de diferentes maneiras, por exemplo, como um pulso, ou mais gradualmente com o tempo. Uma suplementação pulsada, por exemplo, seria para suplementar todos os ácidos graxos Cl8 poli-insaturados em cerca de uma hora, e isto seria mais apropriado no caso de a cultura ser estática. Para culturas em proliferação de Leptospira, suplementações mais apropriadas são uma suplementação gradual, que significaria adicionar todos os ácidos graxos Cl8 poli-insaturados em um período de tempo de cerca de 1 a cerca de 6 horas. Uma suplementação alimentada em lote por uma cultura em proliferação, significaria que tem uma alimentação de um ácido graxo Cl8 poli-insaturado (-preparação) que dura a maior parte do tempo da cultura.
[00107] Em uma modalidade preferida de um método de acordo com a invenção uma cultura em proliferação de Leptospira é suplementada gradualmente ou em modo alimentado em lote.
[00108] A quantidade de um ácido graxo Cl8 poli-insaturado que deve ser suplementada em uma cultura de Leptospira para obter um aumento relativo na massa antigênica, como em um método de acordo com invenção,
29/70 é, em princípio, somente limitada pelo que é viável da perspectiva prática, econômica e biológica. Por exemplo, considerações práticas são que um vaso fermentador com uma cultura em proliferação não podería ser aberto múltiplas vezes para adicionar um suplemento, já que pode comprometer uma operação segura e sua esterilidade. Por outro lado, quando a cultura que deve ser suplementada não é ativamente proliferante, tal como uma cultura final, ou uma cultura armazenada, existe muito menos risco de uma contaminação sobreproliferar a cultura. Considerações econômicas são, por exemplo, os custos de material de suplementação de uma grande quantidade de um ácido graxo Cl8 poli-insaturado puro, ou um produto de combinação do ácido graxo Cl8 poli-insaturado especial. Considerações biológicas são que ácidos graxos livres podem ser tóxicos para células vivas, embora este esteja aquém de ser um problema para uma cultura estática. Portanto, quando grandes quantidades de um ácido graxo Cl8 poli-insaturado devem ser suplementadas em uma cultura em proliferação em um curto período de tempo, deve-se tomar cuidado para atenuar ou prevenir toxicidade do ácido graxo para a Leptospira, por exemplo, fornecendo o ácido graxo Cl8 poli-insaturado em um complexo para reduzir toxicidade, da maneira descrita anteriormente. Alternativamente, o ácido graxo Cl8 poli-insaturado pode ser suplementado gradualmente com o tempo.
[00109] Adicionalmente, parâmetros a considerar são as condições de cada caso específico, a quantidade, estado, e tipo da Leptospira, bem como o meio de incubação, temperatura, pH, etc. Com os detalhes e exemplos aqui, é da competência dos versados na técnica na técnica variar e otimizar a quantidade e a maneira nas quais um ácido graxo Cl8 poli-insaturado é suplementado em uma cultura de Leptospira no contexto de um método de acordo com a invenção.
[00110] A Leptospira em uma cultura parece consumir um ácido graxo Cl8 poli-insaturado o mais rápido possível. Vide, por exemplo, as figuras 2, 3
30/70 e 13, 14 que ilustram que ácido linoleico e ácido linolênico são muito rapidamente consumidos e convertidos na massa antigênica, ao contrário do ácido palmítico e ácido oleico. Isto significa que a quantidade total de massa antigênica gerada em uma cultura como essa é em decorrência da quantidade total cumulativa de ácido graxo Cl8 poli-insaturado que foi disponível para a cultura durante incubação. Para a invenção, a indicação da quantidade de um ácido graxo Cl8 poli-insaturado que é suplementada em uma cultura, portanto, refere-se à quantidade total de um ácido graxo Cl8 poli-insaturado que ficou disponível durante a proliferação ou incubação de uma cultura de Leptospira, como se todos os ácidos graxos Cl8 poli-insaturado ficassem disponíveis a um único ponto no tempo. Ela é expressa como uma concentração com base no total volume da cultura. Isto independe da forma ou volume da mistura que o ácido graxo Cl8 poli-insaturado foi compreendido em adições feitas por todos os componentes dos meios e inclui as mesmas.
[00111] Consequentemente, versados na técnica perceberão que não será frequentemente possível medir esta concentração total real de ácido graxo Cl8 poli-insaturado fornecido para a cultura de Leptospira. Por um lado, em virtude de ser um número cumulativo das contribuições do ácido graxo Cl 8 poli-insaturado feitas com o tempo e de diferentes componentes. Por outro lado, em virtude de a cultura de Leptospira já ter sido coletada e parte dela processada antes do momento de amostragem.
[00112] Por exemplo, os inventores demonstram que um aumento significativo da massa antigênica podería ser obtido quando suplementação de uma cultura de Leptospira, de acordo com o método da invenção, com ácido linoleico de maneira tal que 25 gg de ácido linoleico ficassem disponíveis por mL de cultura, comparada com uma cultura que ficou disponível somente cerca de 5 gg/mL.
[00113] O mesmo se aplica a ácido linolênico, embora o meio de
31/70 cultura EMJH padrão contenha quantidades insignificantes de Cl8:3. Consequentemente, em princípio, a suplementação de qualquer quantidade de Cl8:3 em uma cultura de Leptospira, já que será benéfico para sua razão em massa antigênica/biomassa. Na prática, quantidades de um Cl8:3 podem ser adicionadas começando de cerca de 5 gg/mL.
[00114] Em maiores quantidades de ácido graxo Cl8 poli-insaturado disponíveis, as massas antigênicas aumentaram ainda mais. No mais alto nível de disponibilidade testado, acima de 300 gg/mL de um ácido graxo C18 poliinsaturado em uma cultura de Leptospira, uma certa toxicidade foi perceptível para alguns serovares. Entretanto, este efeito foi observado quando se usou uma preparação de ácido graxo Cl 8 poli-insaturado puro para a suplementação, e pode ser superado para a desintoxicação apropriada do ácido graxo Cl8 poli-insaturado em um complexo, da maneira descrita anteriormente.
[00115] Portanto, em uma modalidade, a invenção fornece um método para aumentar a massa antigênica de uma cultura de Leptospira, o método compreendendo a etapa de incubar a dita cultura de Leptospira em condições nas quais pelo menos 15 gg/mL de ácido linoleico, e/ou pelo menos 5 gg/mL de um ácido linolênico ficaram disponíveis na dita cultura.
[00116] Da maneira descrita a seguir, a suplementação de diferentes ácidos graxos Cl8 poli-insaturados, da maneira definida anteriormente, pode também ser combinada dando um efeito cumulativo em uma cultura de Leptospira. Consequentemente, a quantidade total de ácidos graxos Cl8 poliinsaturados que fica disponível em uma cultura de Leptospira, pode assim ser com base na soma das quantidades dos diferentes ácidos graxos Cl8 poliinsaturados que são combinadas.
[00117] Portanto, em uma modalidade preferida de um método de acordo com a invenção, o método compreende a etapa de incubar uma cultura de Leptospira em condições nas quais pelo menos 15 gg de ácido graxo Cl8
32/70 poli-insaturado/mL ficaram disponíveis na dita cultura. Mais preferivelmente, pelo menos 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou pelo menos 100 gg de ácido graxo Cl8 poli-insaturado/mL ficaram disponíveis na dita cultura, nesta ordem de preferência.
[00118] Em uma modalidade preferida adicional de um método de acordo com a invenção, o método compreende a etapa de incubar uma cultura de Leptospira em condições nas quais entre cerca de 15 e 1000 pg de ácido graxo Cl8 poli-insaturado/mL ficou disponível na dita cultura. Mais preferivelmente entre cerca de 20 e 500 pg/mL, entre cerca de 20 e 300 pg/mL, ou entre cerca de 25 e 250 pg de ácido graxo Cl8 poli-insaturado/mL ficou disponível na dita cultura, nesta ordem de preferência.
[00119] Em uma modalidade, a invenção fornece um método para aumentar a massa antigênica de uma cultura de Leptospira, o método compreendendo a etapa de suplementar a dita cultura de Leptospira com um ácido graxo Cl8 poli-insaturado em condições nas quais pelo menos 15 pg de um ácido graxo Cl8 poli-insaturado/mL ficaram disponíveis na dita cultura, em que a Leptospira é pelo menos um sorogrupo selecionado de sorogrupos L. interrogas (sensu lato)) Canicola, Icterohaemorrhagiae, Australis, Grippotyphosa, Pomona, Tarassovi, Sejroe e Autumnalis; e em que o aumento da massa antigênica da dita cultura de Leptospira é com pelo menos 20%, comparada com a massa antigênica de uma cultura de Leptospira similar que não foi suplementada com um ácido graxo Cl8 poli-insaturado.
[00120] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma cultura de Leptospira obtenível para um método de acordo com a invenção, em que a dita cultura de Leptospira tem uma massa antigênica aumentada.
[00121] Uma cultura como essa de Leptospira, de acordo com a invenção, difere de uma cultura de Leptospira da tecnologia anterior, em que a cultura de Leptospira tem uma massa antigênica que é significativamente
33/70 aumentada, resultante de suplementação com um ácido graxo Cl8 poliinsaturado como em um método de acordo com a invenção. A massa antigênica aumentada é facilmente detectável e quantificável da maneira descrita, um aumento na massa antigênica por 20% ou mais é significante e detectável, da maneira descrita anteriormente.
[00122] O aumento na massa antigênica é relativo à massa antigênica de uma cultura de Leptospira similar em condição similar, mas que não foi suplementada com um ácido graxo Cl8 poli-insaturado, como em um método de acordo com a invenção, da maneira descrita anteriormente.
[00123] Portanto, uma cultura de Leptospira de acordo com a invenção é caracterizada em que a massa antigênica da dita cultura de Leptospira é aumentada com pelo menos 20 % comparada com a massa antigênica de uma cultura de Leptospira similar que não foi suplementada com um ácido graxo C18 poli-insaturado.
[00124] Mais preferivelmente, uma cultura de Leptospira de acordo com a invenção é caracterizada em que a massa antigênica da dita cultura de Leptospira é aumentada com pelo menos 22, 24, 25, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 63, 77, 90, 100, 121, 150, 175, 184, ou com pelo menos 200 %, nesta ordem de preferência, e comparada com a massa antigênica de uma cultura de Leptospira similar que não foi suplementada com um ácido graxo Cl8 poliinsaturado.
[00125] Uma cultura de Leptospira de acordo com a invenção é obtenível por um método de acordo com a invenção da maneira descrita, por exemplo, para suplementar Leptospira em uma cultura em proliferação ou estacionária, ou uma coleta de cultura, com um ácido graxo Cl8 poliinsaturado, um derivado, ou um composto ou composição que é relativamente rica em um ácido graxo Cl8 poli-insaturado. Isto tem diversas utilidades vantajosas, entre as quais em vacinas contra Leptospirose.
[00126] Em um aspecto adicional, a invenção diz respeito a uma /70 cultura de Leptospira de acordo com a invenção, ou uma preparação da dita cultura, para uso em uma vacina contra Leptospirose.
[00127] Preferivelmente, uma cultura de Leptospira para uso em uma vacina contra Leptospirose de acordo com a invenção é na forma de uma cultura de Leptospira inativada de acordo com a invenção.
[00128] Para a invenção, “uma preparação” de uma cultura de Leptospira de acordo com a invenção, pode ser um fragmento de uma cultura como essa, por exemplo, um extrato, sonicado, ou filtrado, ou uma subunidade de uma cultura de Leptospira de acordo com a invenção, tais como uma parte do envelope externo contendo LPS, um LPS purificado, ou uma parte do dito LPS.
[00129] Portanto, em um aspecto adicional, a invenção fornece uma vacina contra Leptospirose compreendendo uma cultura de Leptospira de acordo com a invenção, ou uma preparação da dita cultura.
[00130] Uma “vacina” para a invenção é uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade imunologicamente efetiva de (uma preparação de) uma cultura de Leptospira de acordo com a invenção, e um carreador farmaceuticamente aceitável. A vacina induz uma resposta imune efetiva contra Leptospirose.
[00131] Um “carreador farmaceuticamente aceitável” visa ajudar na administração efetiva de um composto farmaceuticamente ativo, sem causar efeitos adversos (graves) para a saúde do alvo no que ele é administrado. Um carreador farmaceuticamente aceitável pode, por exemplo, ser água estéril ou uma solução de sal fisiológica estéril. Em uma forma mais complexa, o carreador pode, por exemplo, ser um tampão que pode compreender aditivos adicionais tais como estabilizadores ou conservantes.
[00132] O componente Leptospiral de uma vacina contra Leptospirose de acordo com a invenção induzirá no humano ou animal alvo uma resposta imune que ajudará prevenir, melhorar, ou reduzir uma infecção com
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Leptospira, ou a intensidade de sinais clínicos de Leptospirose, causados infectando Leptospira. Isto pode ser o resultado de uma menor colonização ou de um menor taxa de infecção pela Leptospira, levando a uma redução no número ou a gravidade de lesões e efeitos que são causados pela Leptospira, ou pela resposta do alvo a isso. Além do mais, isto reduzirá a excreção (urinária) de Leptospira, e por meio disso o espalhamento no ambiente, que reduz a possibilidade de infecções zoonóticas.
[00133] O que constitui uma quantidade imunologicamente efetiva de uma vacina contra Leptospirose de acordo com a invenção depende do efeito desejado e das características específicas da vacina que está sendo usada, e o alvo em que deve ser aplicada. Para a base de vacinas bacterinas contra Leptospirose, que funciona essencialmente por uma resposta imune humoral, a correlação é bem conhecida entre uma certa massa antigênica, e a concentração imunoprotetora da vacina em um alvo. Portanto, a determinação de uma quantidade efetiva está bem na rotina dos versados na técnica, por exemplo, monitorando a resposta imunológica após vacinação, ou depois de uma infecção de desafio, por exemplo, monitorando os sinais clínicos do alvo da doença, parâmetros sorológicos, ou por reisolamento do patógeno, e comparando estes com respostas observadas em animais não vacinados.
[00134] Em uma modalidade preferida, a vacina de acordo com a invenção compreende adicionalmente um estabilizador, por exemplo, para proteger componentes propensos a degradação, e/ou para aumentar o prazo de validade da vacina. No geral, tais estabilizadores são moléculas grandes de alto peso molecular, tais como lipídios, carboidratos ou proteínas; por exemplo, leite em pó, gelatina, albumina de soro, sorbitol, trealose, espermidina, Dextrano ou polivinil pirrolidona, e tampões, tais como fosfatos de metal alcalino.
[00135] Preferivelmente, o estabilizador é livre de compostos de origem animal, ou ainda quimicamente definido da maneira revelada em WO
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2006/094.974.
[00136] Também, conservantes podem ser adicionado, tais como timerosal, compostos fenólicos e/ou gentamicina.
[00137] Técnicas e procedimentos gerais em vacinologia são bem conhecidos na tecnologia e são descritos, por exemplo, em regulamentos governamentais tal como a Farmacopéia, e em manuais bem conhecidos tais como: “Veterinary vaccionalogy” (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN: 0444819681), e: “Remington: the science and practice of pharmacy” (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472).
[00138] Sujeitos alvo para uma vacina de acordo com a invenção podem ser humanos ou uma ampla variedade de animais, que são suscetíveis a infecção com Leptospira. Alvos preferidos são um ou mais selecionados de: humano, canino, suíno, bovino, equino, caprino, ovino e cervídeo. Em princípio, o alvo pode ser saudável ou doente, e pode ser positivo ou negativo para presença de Leptospira, ou para anticorpos contra Leptospira. Também, o alvo pode ser de qualquer idade em que é suscetível a vacinação. Entretanto, é evidentemente favorável vacinar alvos saudáveis, não infectados, e vacinar tão cedo quanto possível para prevenir qualquer infecção no campo.
[00139] Uma vacina de acordo com a invenção pode servir como uma vacinação iniciadora efetiva, que pode mais tarde ser seguida e amplificada por uma vacinação de reforço.
[00140] Uma vacina de acordo com a invenção pode igualmente ser usada como tratamento profilático e como terapêutico, já que ela interfere tanto com o estabelecimento e com a progressão de uma infecção por Leptospira quanto com seus sinais clínicos de doença.
[00141] O esquema da aplicação de uma vacina de acordo com a invenção no alvo pode ser em doses únicas ou múltiplas, que podem ser dadas ao mesmo tempo ou sequencialmente, de uma maneira compatível com a dosagem e formulação, e em uma quantidade que será imunologicamente
37/70 efetiva.
[00142] O protocolo para a administração de uma vacina de acordo com a invenção idealmente é integrado nas tabelas de vacinação existentes de outras vacinas que o alvo pode exigir.
[00143] A vacina de acordo com a invenção é preferivelmente aplicada como uma dose única anual.
[00144] Uma vacina de acordo com a invenção pode conter uma quantidade de Leptospira de uma cultura de acordo com a invenção, ou da preparação destas, correspondendo entre 1x10Λ6 e 1χ10Λ10 células bacterianas por dose; preferivelmente entre 1χ10Λ7 e 5χ10Λ9 por dose.
[00145] Vacinas, de acordo com a invenção, podem ser administradas em um volume que é consistente com o alvo e podem, por exemplo, ser entre cerca de 0,1 e 10 mL em volume. Preferivelmente, uma dose é entre cerca de 0,25 e 3 mL.
[00146] Uma vacina de acordo com a invenção pode ser administrada em um alvo de acordo com métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, como uma aplicação parenteral por qualquer via de injeção na pele ou através dela: por exemplo, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, submucosal ou subcutânea. As vias alternativas de aplicação que são praticáveis são por aplicação tópica, por inalação, ou por meio da via alimentar.
[00147] A via de aplicação preferida é por injeção intramuscular ou por subcutânea.
[00148] Não é necessário dizer que a via de aplicação ideal dependerá da formulação da vacina específica que é usada, e das características particulares do alvo.
[00149] E de competência dos versados na técnica otimizar ainda mais uma vacina de acordo com a invenção. No geral, isto envolve ajuste fino da eficácia da vacina, de forma que ela forneça proteção imune suficiente. Isto
38/70 pode ser feito adaptando a dose da vacina, ou usando a vacina em uma outra forma ou formulação, ou adaptando os outros constituintes da vacina (por exemplo, o estabilizador ou o adjuvante), ou por aplicação por meio de uma via diferente.
[00150] A vacina pode compreender adicionalmente outros compostos, tais como um adjuvante, um antígeno adicional, um citocina, etc. Alternativamente, uma vacina de acordo com a invenção pode vantajosamente ser combinada com um componente farmacêutico, por exemplo, um antibiótico, um hormônio, ou um medicamento anti-inflamatório.
[00151] Em uma modalidade preferida, uma vacina de acordo com a invenção é caracterizada em que ela compreende um adjuvante.
[00152] Um “adjuvante” é um ingrediente de vacina bem conhecido, que em geral é uma substância que estimula a resposta imune do alvo de uma maneira não específica. Muitos diferentes adjuvantes sãos conhecidos na técnica. Exemplos de adjuvantes são adjuvante de Freund Completo e Incompleto, vitamina E, composições de alumínio, polímeros blocos não iônicos e poliaminas tais como dextransulfato, Carbopol® e pirano.
[00153] Além disso, peptídeos tais como muramil dipeptídeo, dimetilglicina, tuftsina, são frequentemente usados como adjuvante, e óleo mineral, por exemplo, Bayol™ ou Markol™, Montanide™ ou óleo de parafina leve, óleos vegetais ou produto de combinações tal como ISA™ da Seppic™, ou DiluvacForte™ podem vantajosamente ser usados. Uma emulsão pode ser água em óleo (a/o), óleo em água (o/a), água em óleo em água (a/o/a), emulsão de óleo duplo (DOE), etc.
[00154] Adjuvantes preferidos para uma vacina de acordo com a invenção são hidróxido de alumínio, ou Saponina, tais como Quil A®, ou Qvac®. Saponina e componentes de vacina podem ser combinados em um ISCOM® (EP 109.942, EP 180.564, EP 242.380).
[00155] Sem dizer que outras maneiras de adjuvantar, adicionar
39/70 compostos ou diluentes veículos, emulsificar ou estabilizar uma vacina estão também no escopo da invenção.
[00156] Uma vacina de acordo com a invenção pode vantajosamente ser combinada com um outro antígeno em uma combinação vacina.
[00157] Portanto, em uma modalidade mais preferida uma vacina de acordo com a invenção é caracterizada em que ela compreende um componente imunoativo adicional.
[00158] Um “componente imunoativo adicional” pode ser um antígeno, uma substância imune intensificadora, e/ou uma vacina, qualquer um dos quais pode compreender um adjuvante. O componente imunoativo adicional quando na forma de um antígeno pode consistir em qualquer componente antigênico de importância humana ou veterinária. Preferivelmente, o componente imunoativo adicional é baseado em um microorganismo adicional ou derivados dele, que é patogênico ao alvo. Ele pode, por exemplo, compreender uma molécula biológica ou sintética tais como uma proteína, um carboidrato, um lipopolissacarídeo, um ácido nucléico que codifica um antígeno proteico. Também uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucléico como esse, ou um micro-organismo carreador recombinante vivo contendo um ácido nucléico como esse, pode ser uma maneira de distribuir o ácido nucléico ou o componente imunoativo adicional. Altemativamente, ele pode compreender um micro-organismo fracionado ou morto tais como um parasita, bactéria ou vírus.
[00159] O(s) componente(s) imunoativo(s) adicional(s) pode(m) também ser uma substância imune intensificadora, por exemplo, um quimiocina, ou um ácido nucléico imunoestimulante, por exemplo, um motivo CpG. Altemativamente, a vacina de acordo com a invenção pode por si mesmo ser adicionada em uma vacina.
[00160] Uma utilidade vantajosa de uma vacina de combinação para a invenção é que ela não somente induz uma resposta imune contra Leptospira,
40/70 mas também contra outros patógenos de um alvo, embora somente uma única manipulação do alvo para a vacinação seja exigida, por meio disso reduzindo desconforto para o alvo, bem como custos de tempo e mão de obra.
[00161] Exemplos de tais componentes imunoativos adicionais são, em princípio, todos os patógenos virais, bacterianos e parasíticos sensíveis a vacinação de um alvo que é também um alvo para uma vacina contra Leptospirose de acordo com a invenção.
[00162] Por exemplo, para suínos: circovirus suíno, vírus reprodutivo e da síndrome respiratória suína, vírus da pseudoraiva, parvo vírus de suíno, vírus da febre suína clássica, hipopneumonia Mycoplasma, Lawsonia intracelular, E. coli, Streptococcus spec., Salmonella spec., Clostridia spec., Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella spec., Haemophilus spec., Erysipelothrix spec., Bordetella spec., etc.
[00163] Para bovinos: Neospora spec., Dictyocaulus spec., Cryptosporidium spec., Ostertagia spec., rotavirus bovino, vírus da diarréia viral bovina, coronavirus bovino, vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina (virus da herpes bovina), paramixovirus bovino, virus da parainfluenza bovina, vírus sincicial respiratório bovino, vírus da raiva, vírus da febre catarral, Pasteurella hemolítica, E. coli, Salmonella spec., Staphylococcus spec., Mycobacterium spec., Brucella spec., Clostridia spec., Mannheimia spec., Haemophilus spec., Fusobacterium spec., etc.
[00164] Para ovinos ou caprinos: Toxoplasma gondii, vírus da peste dos pequenos ruminantes, vírus da febre catarral, virus Schmallenberg, Mycobacterium spec., Brucella spec., Clostridia spec., Coxiella spec., E. coli, Chlamydia spec., Clostridia spec., Pasteurella spec., Mannheimia spec., etc.
[00165] Para caninos ou felinos: Ehrlichia canis, complexo de Leishmania donovani, Neospora caninum, parvovirus canino, virus da cinomose canina, adenovirus canino tipos 1 ou 2, vírus da hepatite canina, coronavirus canino, vírus da para-influenza canina, vírus da raiva, calicivírus
41/70 felino, herpesvirus felino, vírus de panleucopenia felina, Clostridium spec., Hepatozoon spec., Borrelia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica, Chlamydia spec., e espécies de Babesia on Theileria.
[00166] Para humanos: Plasmodium, Leishmania, Toxoplasma, virus zóster da varicela, HIV, papilomavirus de humano, virus do sarampo, virus da caxumba, vírus da rubéola, vírus da raiva, poliovirus, rotavirus, virus sincicial respiratório, virus da hepatite spec., virus da influenza, Haemophilus spec., Streptococcus spec., Corynebacterium spec., Bordetella spec., Neisseria spec., e Clostridium spec.
[00167] Em uma modalidade alternativa, uma vacina de combinação para a invenção pode vantajosamente combinar Leptospira de mais de um sorogrupo de L. interrogas, Por exemplo, para um alvo canino, sorogrupos L. interrogas (sensu lato)} Canicola e Icterohaemorrhagiae; ou: sorogrupos L. interrogas (sensu lato)} Canicola, Icterohaemorrhagiae, Australis, e Grippotyphosa. Desses, um ou mais podem ser (derivados de) uma cultura de Leptospira de acordo com a invenção; preferivelmente todos são (derivados das) culturas de Leptospira de acordo com a invenção.
[00168] Em uma modalidade preferida adicional de uma vacina de combinação para a invenção, a vacina de combinação compreende em seguida a um componente imunoativo adicional), uma ou mais Leptospira que correspondem a mais que um sorogrupo de L. interrogas. Por exemplo, para um alvo suíno a vacina de combinação pode compreender: sorogrupos L. interrogas (sensu lato)} Canicola, Icterohaemorrhagiae, Australis, Grippotyphosa, Pomona e Tarassovi, bem como Erysipelothrix rhusiopathiae e parvovirus suíno. Nesta combinação, uma ou mais da Leptospira podem ser uma cultura de Leptospira de acordo com a invenção; preferivelmente todas são culturas de Leptospira de acordo com a invenção.
[00169] Por motivos práticos e controle do processo, é benéfico produzir cada qual dos antígenos de Leptospira em uma vacina de
42/70 combinação como essa em culturas separadas de acordo com a invenção. Isto em virtude de cada qual pode então ser produzida com suas condições ideais específicas. Em seguida, antígenos de vacina separados serão preparados, e somente então os diferentes antígenos de Leptospira serão combinados.
[00170] Em um aspecto adicional, a invenção diz respeito ao uso de uma cultura de Leptospira de acordo com a invenção, ou à uma preparação da dita cultura de Leptospira, para a fabricação de uma vacina contra Leptospirose.
[00171] A “fabricação” de uma vacina para a invenção é realizada por meios bem conhecidos pelos versados na técnica. Tal fabricação em geral compreenderá as etapas de mistura e formulação de uma cultura de Leptospira de acordo com a invenção, ou de uma preparação destas, com excipientes farmaceuticamente aceitáveis, seguido por partilha em recipientes dimensionados apropriados. Os vários estágios do processo de fabricação precisarão ser monitorados por testes adequados, por exemplo, por testes imunológicos quanto a qualidade e quantidade dos antígenos; por testes microbiológicos quanto a esterilidade e ausência de agentes estranhos; e finalmente por experimentos in vitro ou in vivo para determinar eficácia e segurança da vacina. Todos esses são bem conhecidos pelos versados na técnica.
[00172] Uma vacina de acordo com a invenção pode ser fabricada de uma forma que seja adequada para administração em alvos humanos ou animais, e que casa com a via de aplicação desejada, e com o efeito desejado.
[00173] Formas bem conhecidas de vacinas são, por exemplo, um líquido, um gel, um unguento, um pó, um comprimido, ou uma cápsula, dependendo do método de aplicação desejado para o alvo. Preferivelmente, uma vacina de acordo com a invenção é formulada como um líquido injetável, tais como: uma suspensão, solução, dispersão ou emulsão. Comumente tais vacinas são preparadas estéreis.
43/70 [00174] Em uma modalidade, uma vacina de acordo com a invenção é com base em uma cultura de Leptospira de acordo com a invenção, que foi inativada. Uma vacina inativada como essa a base de bacterina pode agora ser fabricada para a invenção usando técnicas bem conhecidas.
[00175] Portanto, em um aspecto adicional a invenção fornece um método para produzir uma vacina contra Leptospirose, o dito método compreendendo as etapas de:
a. proliferar uma cultura de Leptospira em um sistema in vitro,
b. suplementar a dita cultura de Leptospira com um ácido graxo Cl8 poli-insaturado,
c. inativar e coletar a dita cultura de Leptospira suplementada, e
d. misturar a cultura de Leptospira inativada com um carreador farmaceuticamente aceitável.
[00176] O método é realizado de acordo com procedimentos bem conhecidos para a proliferação, inativação e formulação de vacinas contra Leptospirose. A coleta é também realizada como na tecnologia anterior, exceto que existem agora mais opções de escolha do ponto no tempo para a coleta do que na tecnologia anterior: quando um nível da tecnologia anterior de massa antigênica é exigido, a coleta pode agora ser feita, mas cedo que previamente.
[00177] Altemativamente, quando se deseja uma massa antigênica maximal, a cultura pode primeiro ser deixada proliferar na sua biomassa maximal, como foi feito previamente, somente que agora significativamente mais quantidade de antígeno é produzida quando a cultura é suplementada com um ácido graxo Cl8 poli-insaturado como em um método de acordo com a invenção.
[00178] O termo “proliferação” tem o significando comum de permitir e induzir a bactéria Leptospira a passar através de inúmeros ciclos de divisão
44/70 da célula. Proliferação para a invenção incorpora o significando de termos similares indicando um aumento nos números de célula e tamanho de célula, tais como “crescimento”, “cultura” ou “amplificação”. A fase de proliferação é precedida por inoculação, e isto por sua vez pode ser precedido por seleção, precondicionamento, e/ou preproliferação da estirpe.
[00179] Um “sistema in vitro'’'' é uma maneira bem conhecida de deliberar proliferação de bactéria Leptospira fora de um organismo de humano ou animal, em condições artificiais controladas. Isto tipicamente emprega um quimiostato ou fermentador, e um meio de cultura (semi) definido. Rotineiramente, diversos parâmetros críticos da fermentação serão monitorados e ajustados quando apropriado, e isto pode ainda ser automatizado. Técnicas, materiais e equipamento por um sistema de proliferação de célula bacteriana in vitro em qualquer escala são bem conhecidos e facilmente disponíveis de muitos fornecedores comerciais na indústria da ciência da vida.
[00180] Em uma modalidade preferida de um método para produzir uma vacina de acordo com a invenção, uma etapa de intervenção é introduzida, que permite que o processo seja realizado não continuamente. A etapa de intervenção é introduzida entre as etapas da proliferação e da suplementação, e diz respeito a uma coleta, armazenamento e/ou purificação da cultura de Leptospira que foi proliferada na primeira etapa.
[00181] Portanto, em uma modalidade preferida, um método para produzir uma vacina contra Leptospirose de acordo com a invenção compreende entre a primeira e a segunda etapa, uma etapa adicional compreendendo coleta, armazenamento e/ou purificação de uma cultura de Leptospira.
[00182] Esta etapa de intervenção permite que o desempenho e otimização separados das fases da proliferação e da suplementação de um método de acordo com a invenção. A etapa de intervenção é realizada de uma
45/70 maneira que mantém a viabilidade ou a integridade bioquímica da cultura de Leptospira, de maneira que permita seu uso efetivo nas etapas adicionais do método. Por exemplo, a coleta pode ser feita, por exemplo, por centrifugação ou diafiltração. Em decorrência da coleta, a Leptospira pode estar em uma forma mais concentrada. O armazenamento pode ser realizado a uma temperatura entre cerca de 2 e cerca de 30 °C em um ambiente aquoso. A purificação pode compreender um refresco ou uma substituição do meio de proliferação, por exemplo, para fornecer condições ideais para as etapas subsequentes. Cada qual dessas manipulações podem ser realizadas separadas, combinadas, ou subsequentemente, e em qualquer ordem lógica.
[00183] Em um método de acordo com a invenção, uma cultura de Leptospira é suplementada com um ácido graxo Cl8 poli-insaturado. Entretanto, um ácido graxo Cl 8 poli-insaturado como uma química ultrapura pode ser muito caro para uso em grande escala na produção de um produto de baixa margem tais como se aplicam a algumas vacinas veterinárias. Portanto, o ácido graxo Cl 8 poli-insaturado para uso nesses métodos pode ser suplementado em diferentes formas ou purezas, tal como em um derivado ou um composto ou composição que é relativamente rica em um ácido graxo Cl8 poli-insaturado, da maneira definida anteriormente.
[00184] Portanto, em um aspecto adicional a invenção diz respeito ao uso de um composto ou composição, que é relativamente rica em um ácido graxo Cl8 poli-insaturado para um método de acordo com a invenção.
[00185] Versados na técnica são mais que capazes de testar e selecionar compostos e composições que são relativamente ricos em um ácido graxo Cl8 poli-insaturado, e otimizar seu uso em um método de acordo com a invenção.
[00186] Uma fonte muito econômica de um ácido graxo Cl 8 poliinsaturado para uso em um método de acordo com a invenção é um óleo vegetal, em virtude de alguns desses óleos serem bem conhecidos para conter
46/70 níveis muito altos de um ácido graxo Cl8 poli-insaturado, eles são economicamente cotados e são disponíveis em uma qualidade e pureza que são aceitáveis para uso em métodos de acordo com a invenção.
[00187] Portanto, em uma modalidade preferida de um uso de acordo com a invenção, o composto ou composição que é relativamente rica em um ácido graxo Cl8 poli-insaturado é um óleo vegetal.
[00188] Um “óleo vegetal” é um óleo que é derivado de uma parte de uma planta, mais frequentemente dos frutos e sementes, tais como bagas, ervilhas, brotos, grãos e nozes, altemativamente de folha, caule, flor, botão de flor, raiz ou beterraba. O óleo vegetal pode ser isolado de seu material de fonte vegetal pressionando, extraindo, etc., métodos para obter e purificar óleos vegetais foram conhecidos desde os tempos remotos.
[00189] Exemplos de óleos vegetais que são relativamente ricos em ácido linoleico são listados na tabela 1. Os valores dados estão em % em peso/peso de teor de ácido graxo total, e são médias aproximadas, que podem variar e depender da variedade da planta e do processo de extração usado. Referência: U.S. Department of Agriculture, National Nutrient Database for Standard Reference, versão 24 de setembro de 2011.
Tabela 1: Teor aproximado (em % em peso/peso de ácido graxo total) de ácido linoleico em óleos vegetais
Óleo de cártamo (1) (2) 78%
Óleo de semente de uva 73 %
Óleo de semente de papoula 70%
Óleo de girassol (1) (2) 68%
Óleo de cânhamo (1) 60%
Óleo de milho 59%
Óleo de germe de trigo 55%
Óleo de algodão 54%
Óleo de soja 51%
Óleo de nozes 51 %
Óleo de sésamo 45%
Óleo de farelo de arroz 39%
Óleo de pistache 33 %
Óleo de amendoim 32%
Óleo de amêndoa 23 %
Óleo de semente de colza (3) 21 %
Óleo de linhaça (4) 15%
Óleo de oliva 10
(1) Nestes nomes triviais dos óleos a semente não é especificada, mesmo que o óleo seja obtido da semente.
(2) Isto não considera a variante deste óleo que é alto em ácido oleico.
/70 (3) Uma variante de óleo de semente de colza é óleo de Canola®, que tem um baixo teor de ácido erúcico.
(4) Linhaça é também conhecida como: semente de linho.
[00190] Também, alguns óleos vegetais não alimentícios mais exóticos (sementes) são relativamente ricos em ácido linoleico; por exemplo, óleos das sementes de: Firethom: 70 % em peso/peso de ácidos graxos totais; uva de Oregon: 52 %; e Sarsaparilla: 51 %, (S. Ôzgül-Yücel 2005, J.A.O.C.S, vol. 82, p. 893).
[00191] Fontes bem conhecidas de ácido alfa lenolênico são óleos das semente de: Sálvia, Fruto Kiwi, Perilla, Linho, Cânhamo, Mirtilo vermelho, Niger, Borracha, Camelina, Beldoegra, Espinheiro do mar, e semente de colza.
[00192] Fontes bem conhecidas de ácido gama lenolênico são óleos de semente de: Prímula, Borragem, Groselha, Cártamo e Cânhamo.
[00193] Fontes bem conhecidas de ácido esteriadônico são óleos das semente de: Cânhamo, Groselha, Milho Gromwell e Echium.
[00194] Portanto, para a invenção, um óleo vegetal com pelo menos 25% em peso/peso de ácidos graxos totais como um ácido graxo Cl8 poliinsaturado é preferido, mais preferivelmente um óleo vegetal com pelo menos 30, 40, 50, 60, 70, ou ainda pelo menos 75% em peso/peso de ácidos graxos totais como um ácido graxo Cl8 poli-insaturado, nesta ordem de preferência.
[00195] Uma cultura de Leptospira de acordo com a invenção pode vantajosamente também ser usada em métodos de diagnóstico. Exemplos são o uso em um teste de diagnóstico para detecção de anticorpo ou antígeno específico de Leptospira em um amostra de teste. Por exemplo, uma preparação de uma cultura de Leptospira de acordo com a invenção pode ser revestida em uma placa ou carreador, ou pode ser usada como antígeno de captura. Alternativamente, a preparação pode ser usada como antígeno de referência padrão com uma alta massa antigênica.
48/70 [00196] A invenção agora será adicionalmente descrita com referência aos exemplos seguintes não limitantes.
Exemplos
1. Materiais e métodos gerais
1.1. Proliferação de Leptospira
1.1.1 Estirpes bacterianas, meio e preproliferação [00197] Uma semente funcional de uma estirpe de L. interrogas foi inoculada no meio EMJH e incubada a 29 °C por 3 a 5 dias. Se necessário até 5 passagens de pré-cultura consecutivas poderíam ser feitas, por meio das quais as pré-culturas foram visualmente inspecionadas quanto a proliferação suficiente (turbidez) como critério para transferência para a passagem seguinte.
[00198] NB: Biossegurança e medidas de restrição apropriadas devem ser aplicadas quando se trabalha com Leptospira viva.
1.1.2 Fermentação principal [00199] Todos os experimentos foram realizados em 0,5, 2 ou 20 L volume funcional, fermentadores controlados por computador (Sartorius), que foram cheios com 0,5, 1 ou 10 L de meio EMJH filtrado estéril, respectivamente. O meio EMJH padrão continha 1 % em p/v de BSA e 0,125 % em p/v de polissorbato 80. O pH do meio foi 7,4 ± 0,1 no início. O fermentador foi inoculado com 5 % em v/v de pré-cultura do sorogrupo Icterohaemorrhagiae (passagem 5), dando uma densidade de inoculação de 2 4 χ10Λ7 células/mL no dia 0. Produções finais de biomassa de Leptospira foram tipicamente cerca de 1 - 2 χ10Λ9 células/mL no dia 5 ou 6 de incubação quando a fermentação foi interrompida.
[00200] Durante todos os experimentos de fermentação a temperatura foi controlada a cerca de 29 °C. O meio foi aerado com fluxo de ar de espaço de topo livre, e a concentração de oxigênio (pO2) dissolvida foi controlada por variação automática da taxa de agitação, para manter um ajuste da
49/70 concentração de pO2. Temperatura, pH e concentração de pO2 foram monitorados em linha, mas pH e formação de espuma não foram controlados. [00201] Em experimentos comparativos até 4 fermentadores foram realizados em paralelo, que iniciaram simultaneamente com o mesmo meio e inóculo de Leptospira. Um fermentador então normalmente continha somente meio EMJH padrão e serviu como referência, embora nas outras diferentes suplementações de ácido graxo Cl8 poli-insaturado tenha sido produzido.
1.1.3 Suplementação com ácido linoleico [00202] Suplementação foi feita tanto com ácido linoleico puro (Sigma Aldrich, > 99 % puro) como um estoque de 10 % em v/v de etanol absoluto (JT Baker). Altemativamente, ácido linoleico foi suplementado usando uma BSA que foi criada com um alto nível de ácido linoleico (BSA alto LA). Esta BSA alto LA foi usada tanto para substituir uma BSA padrão em meio EMJH, ou foi usada além da BSA no meio EMJH, em cujo caso ela foi adicionada como uma solução estoque 25 % em p/v de água estéril. O BSA alto LA ou os suplementos do ácido linoleico puro/etanol foram alimentados em um fermentador no curso de 4 horas, a 0,1 - 0,2 mL/hora, até a cultura do fermentador recebeu uma quantidade total desejada de ácido linoleico. Diferentes níveis de ácido linoleico disponíveis totais foram testados, entre cerca de 5 e 425 gg/mL no volume total. As culturas do fermentador de Leptospira foram suplementadas a diferentes densidades da célula, isto é, na cultura da fase inicial, média ou final. Densidade da célula da fase média típicas foi a cerca de 5x10Λ8 células/mL, que foi atingido durante dia 2 da incubação principal. Mediante suplementação com ácido linoleico do estoque do ácido linoleico puro em etanol, algumas vezes uma pequena diminuição no pH foi notada, que foi corrigida aplicando parte de NaOH.
1.1.4 Amostragem e análises fora de linha [00203] Amostras de 5 mL foram tiradas diariamente de forma asséptica diretamente do fermentador, para análises de pontuação de célula
50/70 total (por câmara de pontuação Petroff-Hausser), massa antigênica (por quantidade de Elisa do antígeno), células inativadas, e para perfilar tipo e quantidades relativas de ácido graxo (por cromatografia gasosa) no meio de cultura.
[00204] Amostras foram inativadas com 0,1 ou 0,2 % em v/v de BPL, a 29 °C por 16-24 horas. A Leptospira inativadas foram testadas em um Elisa do antígeno em 24 horas.
1.2. Elisa do antígeno
A massa antigênica de antígeno de LPS de Leptospira foi determinada em Elisa do antígeno, que foi com base em um conjunto de anticorpos monoclonais de camundongo (moabs), aglutinantes, específicos de sorogrupo ou de serovar, que foi obtido do: WHO/FAO/OIE and National Collaborating Centre for Reference and Research ou Leptospirose, Department of Biomedical Research, Royal Tropical Institute, Amsterdam, Países Baixos. Os moabs usados são listados na tabela 2. Para uma referência vide: R. A. Hartskeerl et al., (International course on laboratory methods for the diagnosis of Leptospirosis, 4th Edition, 1 April 2004. Royal Tropical Institute, Amsterdam).
[00205] Os Elisa foram estabelecidos como ensaios de captura, por meio do qual o mesmo moab foi usado para revestimento e para detecção.
Tabela 2: Moabs usados para o Elisa do antígeno de sorogrupos L. interrogas (sensu lato)).
Sorogrupo serovar moab
Canicola Portland-vere F152C11
Icterohaemorrhagiae Copenhagen! F12C3
Australis Bratislava F81C3
Grippotyphosa Dadas F71C9
Pomona Pomona F43C9
Tarassovi Gatuni F151C8
Sejroe Hardjo F22C6
1.2.1 Preparação de anticorpos monoclonais para revestimento [00206] Os moabs para uso no Elisa do antígeno poderíam ser derivados de ascite ou da cultura celular. Ambos os tipos foram purificados
51/70 antes do uso por um método não cromatográfico padrão. Em resumo: albumina e outras proteínas não IgG foram precipitadas com ácido caprílico. Em seguida, a fração de IgG foi precipitada com sulfato de amônio. Com este método foi possível isolar mais que 80 % do IgG com um pureza igual a IgG purificado por cromatografia de carga aniônica.
[00207] Altemativamente, os moabs poderíam ser purificados por cromatografia de coluna de proteína G.
1.2.2 Preparando anticorpos monoclonais conjugados.
[00208] Para o Elisa do antígeno conjugado Peroxidase de Rábano Silvestre (HRP)-IgG foram preparados a partir dos moabs, usando procedimentos padrões. Basicamente, a reação envolveu uma oxidação de periodato dos resíduos de carboidrato da enzima de HRP para formar grupos aldeído, que reagiram subsequentemente com grupos amino livres nas moléculas de IgG monoclonal.
1.2.3 Preparação de padrões de referência da quantidade de antígeno [00209] Um padrão de referência foi preparado para cada estirpe de Leptospira que foi testada pelo Elisa do antígeno. O padrão é um lote de antígeno de Leptospira mono valente das células inativadas. Isto foi preparado usando técnicas comuns, essencialmente proliferando uma estirpe específica de Leptospira em meio EMJH da maneira descrita anteriormente, e foi inativado da maneira descrita antes. Em seguida o padrão foi concentrado e/ou diluído em salina tamponada com fosfato, para conter cerca de 1x10Λ9 células/mL. Um número arbitrário de unidades de antígeno foi afixado na amostra, por exemplo: 1.000 Unidades/mL. Quando o padrão precisou de reposição, uma preparação subsequente do mesmo padrão foi comparada e titulada paralelamente com o padrão antigo diversas vezes, antes de substituílo.
1.3. Análise do ácido graxo [00210] Composições e quantidades de ácido graxo foram testadas a
52/70 partir das amostras de células de Leptospira, componentes do meio de cultura, e das amostras do meio de cultura EMJH completo, de acordo com procedimentos bem conhecidos. A extração de ácidos graxos foi feita conforme publicado por Bligh & Dyer (1959, Can. J. of Biochem. Physiol., vol. 37, p. 911) and Morrison & Smith (1964, J. of Lipid Res., vol. 5, p. 600). Em resumo: uma amostra de 0,5 mL foi testada, contendo tanto meio de cultura completo puro, quanto uma amostra diluída em água: de células de Leptospira (entre 1x10Λ9 e 1χ10Λ10 por 0,5 mL; as células foram inativadas com BPL), ou de 1 % em p/v de uma amostra de BS A. Este 0,5 mL foi extraído com 1 mL de metanol e 2 mL de clorofórmio, misturando por 3 minutos. Mais 0,5 mL de água foi adicionado, misturado por 30 s., e a amostra foi centrifugada por 10 minutos a 1.000 x g a 2-8 °C. Os 2 mL da fase de clorofórmio (inferior) foi transferida para um frasco de vidro, e o clorofórmio foi seco em uma corrente de gás N2. Os lipídios secos foram redissolvidos em 0,6 mL de BF3 em metanol, e aquecidos por 15 minutos a 95 °C, que metilou os ácidos graxos. Em seguida 0,3 mL de água e 0,3 mL de hexano foram adicionados, isto foi misturado agitando, depois que a fase de hexano (superior) foi transferida para uma cromatografia gasosa padrão configurada para análise do perfil, e das quantidades relativas dos ácidos graxos no extrato. Como padrão interno, uma amostra de ácido graxo C21:0 (ácido heneicosílico) de concentração conhecida foi usada. Normalmente, as amostras foram medidas in duplo, e amostras foram preparadas e medidas em recipientes de vidro.
2. Comparação de condições de proliferação da tecnologia anterior [00211] Como um exemplo comparativo, a formação de massa antigênica em uma cultura em lote de Leptospira em condições da tecnologia anterior padrão (assim sem suplementação) foi analisada. Leptospira de sorogrupo Icterohaemorrhagiae foram cultivadas em meio EMJH padrão, que
53/70 foi completado com polissorbato 80 (Croda), e uma BSA comercial padrão (Millipore). Depois de diversas rodadas de preproliferação uma cultura principal do fermentador foi inoculada e corrida por 5 ou 6 dias. Para Leptospira de sorogrupo Icterohaemorrhagiae, a massa antigênica obtida nessas condições de proliferação foi normalmente entre 500 e 700 Unidades de Antígeno (de sorogrupo Icterohaemorrhagiae) por 1x10Λ9 células, como a média por 3-5 dias, quando a cultura foi estacionária.
[00212] Quando um lote de antígeno de Leptospira como esse foi testado em um ensaio de potência in vitro em casa, ele não conseguiu atingir o nível de potência mínima exigido.
[00213] Este problema não foi resolvido usando em meio EMJH uma BSA comercial que foi especialmente recomendada para cultura de Leptospira: BovoLep® BSA (Bovogen, Austrália). Isto foi testado em seguida de BovoStar®, que é uma BSA padrão com os propósitos do mesmo fabricante, e em seguida a BSA (Millipore) que foi usada antes. Resultados estão apresentados na tabela 3. “na” é: não disponível.
[00214] Interessantemente, BovoLep® não aumentou a biomassa de Leptospira, como publicado, mas ele não teve nenhum efeito significante na sua massa antigênica. Isto exemplifica a abordagem clássica para proliferação de Leptospira até hoje: um foco nos níveis de biomassa.
Tabela 3: Resultados de uso de diferentes ingredientes de BSA em meio EMJH:
Condições do fermentador Cone, total de C18:2 pg/mL Números de célula a 3 dias Ag U / 10Λ9 células/mL, a 3 dias
BSA, Millipore 5 1,6χ10Λ9 525
BSA, BovoStar® na 1,6χ10Λ9 533
BSA, BovoLep® na 1,8χ10Λ9 498
3. Efeito de ácido graxo Cl8 poli-insaturado
3.1. Ácido línoleíco [00215] Somente quando mais ácido línoleíco (C18:2) ficou disponível para culturas de Leptospira, é que a massa antigênica aumentou.
54/70 [00216] Observou-se que o meio EMJH padrão testado e descrito anteriormente fornece cerca de 5 gg/mL de ácido linoleico (vide Tabela 3). Isto foi principalmente derivado do 0,125 % em polissorbato 80, já que o 1 % de BSA padrão forneceu menos que 1 gg/mL ácido linoleico, próximo ao limite de detecção da análise cromatográfica gasosa.
[00217] Com relação a isso, Polissorbato 80, da maneira definida para o Farmacopéia, é deixado conter ácido linoleico a um máximo de 18 % de seus ácidos graxos. Entretanto, na prática, observou-se que ele carrega muito menos, tipicamente menos que 1,5 %. A partir de um tipo comum de polissorbato 80 (tipo: Grau Vegetal, da: Croda, França) os inventores compararam o teor de ácido linoleico de 48 lotes por diversos anos, e observaram que a quantidade média de ácido linoleico foi cerca de 0,3 % em peso/peso de ácidos graxos totais. Considerando que polissorbato 80 consiste essencialmente em ácidos graxos, então o 0,125 % em v/v de polissorbato 80 que é usado em meio EMJH, fornece cerca de 4 gg/mL de ácido linoleico para a cultura.
[00218] Uma BSA foi criada que compreendeu uma maior quantidade de ácido linoleico. Uso desta BSA alto LA a 1 % em p/v em meio EMJH forneceu cerca de 21 gg/mL de ácido linoleico para uma cultura de Leptospira; com a contribuição do polissorbato um meio de cultura como esse forneceu 25 gg/mL de ácido linoleico para uma cultura do fermentador de Leptospira. Este aumento na quantidade de ácido linoleico disponível aumenta bastante a geração de antígeno de Leptospira, em uma massa antigênica de 1636 Ag U/lxlOA9 células (média de 3-5 dias).
[00219] Desta maneira, os inventores demonstraram a utilidade de sua descoberta: a massa antigênica de uma cultura de Leptospira poderia ser aumentada com 124%, quando uma cultura de Leptospira foi suplementada com 25 em vez de com 5 gg/mL de ácido linoleico.
[00220] Figuras 1 e 2 representam os resultados de análises de
55/70 amostras diárias de uma cultura em proliferação de Leptospira com suplementação de ácido linoleico, usando BSA alto LA no meio EMJH. Na figura 1 a biomassa (eixo vertical esquerdo) mostrou um aumento estacionário em todos os seis dias de proliferação. A quantidade de antígeno (eixo vertical direito) atingiu níveis muito maiores do que poderíam ser obtidos a partir do uso de BSA padrão no meio de cultura. Entretanto, a massa antigênica não aumentou muito depois de três dias. Figura 2 exibe o motivo, no perfil do ácido graxo do meio a partir desta cultura, que demonstra claramente a relevância de ácido linoleico neste contexto; resultados são em % em peso/peso de ácidos graxos totais. Favor observar que os níveis de C16:0 (ácido palmítico), C18:0 (ácido esteárico), e C18:l (ácido oleico) dizem respeito ao eixo vertical esquerdo, enquanto o nível de Cl8:2 (ácido linoleico) diz respeito ao eixo vertical direito.
[00221] Figura 2 exibe essencialmente quantidades inalteradas de ácidos graxos C16:0, C18:0, eC18:l no meio de cultura no curso da cultura, por meio do qual Cl8:1, de polissorbato 80, forma o volume da quantidade total de ácido graxo. Entretanto, o nível de C18:2 mostra uma forte queda nos primeiros três dias, e é abaixo do limite de detecção (< 0,3 %) nos dias 3-5. A exaustão do ácido linoleico coincide com a redução do aumento na geração de antígeno, da maneira mostrada na figura 1.
3.2 Ácido línolêníco [00222] Nenhuma das isoformas de ácido linolênico (Cl8:3): alfa ou gama-, poderíam ser detectadas acima do limite de detecção da cromatografia gasosa (cerca de 0,6 gg/mL de ácido graxo), em lotes de BSA ou de polissorbato 80. Consequentemente, meio de cultura EMJH padrão completo não contém nenhuma quantidade significante de Cl8:3. Em decorrência disso, em experimentos onde suplementação de um ácido linolênico em uma cultura de Leptospira foi testada, essencialmente todo o ácido linolênico que ficou disponível na cultura, derivou do ácido linolênico que foi suplementado na a
56/70 cultura por adição separada.
4. Suplementação adicional de ácido línoleíco em uma cultura de Leptospira [00223] Se ácido linoleico adicional (Cl8:2) fosse suplementado, a massa antigênica poderia ser ainda maior.
[00224] Em uma cultura similar da maneira descrita anteriormente, ácido linoleico foi suplementado na fase semiexponencial, no dia 2, com ácido linoleico puro diluído em etanol. Eoi adicionada uma quantidade de ácido linoleico que forneceu 100 gg/mL de ácido linoleico para a cultura. Conforme o perfilamento do ácido graxo da figura 3 exibe, depois do rápido aumento inicial, e o pico claro resultante da suplementação no dia 2, os níveis de ácido linoleico diminuíram estavelmente novamente mediante continuidade da cultura. Os níveis de ácidos graxos C16:0 e C18:l foram ensaiados como referências internas, mas esses foram bastante inalterados como esperado.
[00225] A massa antigênica produzida neste experimento para Leptospira a partir do sorogrupo Icterohaemorrhagiae foi 1767 Ag. U/lxlOA9 células (média de 3-5 dias).
5. Culturas comparativas com diferentes condições de suplementação [00226] Em experimentos mais elaborados, da mesma configuração dos Exemplos anteriores, culturas comparativas do fermentador de Leptospira do sorogrupo Icterohaemorrhagiae foram corridas lado a lado, em que diferentes condições de suplementação ácido linoleico (Cl8:2) foram comparadas. Para destacar o efeito da suplementação de ácido linoleico, uma BSA padrão foi usada no meio EMJH. Em alguns fermentadores, ácido linoleico foi suplementado em fase semiexponencial, tanto em forma pura em etanol quanto como um complexo para BSA, por adição de uma solução de uma BSA alto LA.
57/70 [00227] As quantidades de ácido linoleico suplementadas foram 50, 75 e 150 gg/mL. Tabela 4 lista também a quantidade total de ácido linoleico que ficaram disponíveis para as culturas.
[00228] Para todos os fermentadores, amostras diárias de células e meio foram tiradas e analisadas. Resultados estão apresentados nas figuras 4 e 5, e na tabela 4 a seguir. Os valores da massa antigênica são com base em médias por dia 3 - 5 das culturas. Também, o aumento relativo na massa antigênica para as diferentes suplementações é expresso como uma porcentagem com relação à cultura não suplementada com BSA padrão, a expressão “não suplementada” refere-se a uma cultura que emprega BSA padrão em EMJH.
Tabela 4: Efeito na massa antigênica de Leptospira de diferentes suplementações com ácido linoleico
Massa antigênica, média de dias 3-5
Condições do fermentador Cone, total de C18:2 pg/mL Ag U / 10Λ9 células/mL Massa antigênica relativa (%)
BSA padrão, não suplementada 5 729 100
C18:2 puro suplementado, 75 80 1,450 199
C18:2 puro suplementado, 150 155 1,550 213
BSA alto LA suplementado, 50 55 1,612 221
[00229] Conforme fica claro a partir da Tabela 4, e dos gráficos correspondentes nas figuras 4 (biomassa) e 5 (quantidade de antígeno), existe um aumento rápido e significativo na massa antigênica de Leptospira quando a cultura é suplementada com ácido linoleico, que não é observado em uma cultura não suplementada. Algum aumento em biomassa ocorre mediante suplementação de ácido linoleico, mas o aumento na massa antigênica excede este significativamente. O aumento na massa antigênica é um pouco maior quando a cultura é suplementada com 150 gg/mL, comparada com suplementação com 75 gg/mL. Entretanto, não houve muita diferença entre quando o ácido linoleico foi suplementado em forma pura, ou como complexo com BSA. Possivelmente isto é um equilíbrio entre aumento de massa antigênica versus alguma toxicidade.
58/70 [00230] Adicionalmente, efeitos favoráveis podem ser deduzidos da Figura 5: uma massa antigênica aumentada pode agora ser atingida muito mais rápido através de suplementação com ácido linoleico. Por exemplo, Figura 5 mostra que com suplementação de ácido linoleico, uma alta massa antigênica pode ser atingida em horas a partir da suplementação.
[00231] Também, quando níveis maximais da massa antigênica que foram finalmente obtidos são comparados, fica evidente que quando culturas suplementadas são corridas pelo mesmo período de tempo como previamente, então quantidades consideravelmente maiores de massa antigênica podem ser obtidas.
6. Confirmação do efeito de suplementação do ácido linoleico em Leptospira de diferentes sorogrupos [00232] Em um estudo seguinte confirmou-se que o aumento na massa antigênica mediante suplementação com ácido linoleico (Cl8:2) é um fenômeno geral em Leptospira. Em diversos experimentos, culturas de estirpes de Leptospira de diversos sorogrupos foram proliferadas em fermentadores em configurações similares como antes e com uma suplementação similar, em meio EMJH tanto com BSA padrão quanto com BSA alto LA; algumas culturas foram adicionalmente suplementadas com 100 gg/mL de ácido linoleico, a partir do ácido linoleico puro em etanol. Resultados de análises de biomassa e quantidade de antígeno estão apresentados nas figuras 6-7 (Sejroe), e 8 - 9 (Grippotyphosa), e são sumarizados na tabela 5.
[00233] Para Leptospira do sorogrupo Sejroe (serovar Hardjo), suplementação com 100 gg/mL de ácido linoleico de BSA alto LA meio de cultura resultou em um aumento da massa antigênica com um impressivo 184 %. Algum aumento em biomassa foi observado depois da suplementação, mas o aumento em quantidade de antígeno foi muito maior. O fermentador foi realizado por 6 dias, e foi calculada a média de contagens para esses
59/70 experimentos nos dias 5 e 6 da cultura.
[00234] Para sorogrupo Grippotyphosa foi calculada a média das contagens nos dias 4 e 5 da cultura. Um aumento com 63 % foi observado na massa antigênica, resultante da suplementação com ácido linoleico.
[00235] Similarmente, por sorogrupo Australis (serovar Bratislava), um aumento na massa antigênica com 45 % foi observado; aqui o meio de BSA baixo LA foi usado para suplementação.
Tabela 5: Confirmação do efeito na massa antigênica para suplementação com ácido linoleico para Leptospira de diferentes sorogrupos
Massa antigênica, média de 2 dias
Sorogrupo Condições do fermentador Cone, total de C18:2 pg/mL Ag U / 10Λ9 células/mL Massa antigênica relativa (%)
Sejroe não suplementada 5
BSA alto LA 25 287 100
C18:2 puro suplementado, 100 125 814 284
Grippotyphosa não suplementada 5
BSA alto LA 25 5.074 100
C18:2 puro suplementado, 100 125 8.286 163
Australis não suplementada 5 8.862 100
BSA alto LA 25
C18:2 puro suplementado, 100 105 12.822 145
6.1 Suplementação de sorogrupo de Leptospira Tarassoví [00236] Em uma suplementação similar à descrita no Exemplo 6 anterior, foi testado o efeito de suplementação com diferentes quantidades de ácido graxo Cl8:2 na biomassa e na massa antigênica de uma cultura de sorogrupo de Leptospira Tarassovi em meio EMJH com BSA padrão. Resultados estão apresentados nas figuras 11 e 12.
[00237] Enquanto suplementação com 300 pg/mL de Cl8:2 tomou tóxica para esta cultura, a suplementação com 100 ou 200 pg/mL de C18:2 produziu forte aumento na massa antigênica por unidade de biomassa: de 67 % respectivamente 99 %, comparado com a cultura de referência não suplementada.
7. Níveis máximos de suplementação [00238] Em um estudo o nível maximal de suplementação do ácido
60/70 linoleico (Cl 8:2) foi investigado: Leptospira do sorogrupo Icterohaemorrhagiae foram cultivadas em EMJH com BSA alto LA, e suplementadas com mais 100, 200 on 400 pg/mL de ácido linoleico, de ácido linoleico puro em etanol. A partir desses resultados ficou aparente que a adição de 400 pg/mL induziu toxicidade para as bactérias, já que os números de célula diminuíram rapidamente depois de suplementação. Portanto, este experimento será repetido dando um nível similarmente alto de suplementação de ácido linoleico, mas em seguida de ácido linoleico em um complexo com BSA que foi saturada com ácido linoleico. O efeito estimulante do grupo suplementado com 100 pg/mL foi conforme observado antes, embora o grupo de 200 pg/mL tenha dado aumento ligeiramente menor da massa antigênica comparado com aquele do grupo de 100 pg/mL.
[00239] Consequentemente, nessas condições suplementação com ácido linoleico puro, parece ser ideal quando entre 25 e 250 pg/mL de ácido linoleico ficam disponíveis para uma cultura de Leptospira.
8. Ponto no tempo para suplementação [00240] Em experimentos adicionais foi determinada a relevância do ponto no tempo para a suplementação de uma cultura de Leptospira. Usando Leptospira de sorogrupo Icterohaemorrhagiae, pontos no tempo da suplementação testados foram fases exponenciais iniciais, do meio e finais. Meio EMJH com BSA padrão foi suplementado com 100 pg/mL de ácido linoleico puro em etanol. A quantidade total de ácido linoleico que ficou disponível para essas culturas foi, portanto, 105 pg/mL.
[00241] Resultados estão apresentados na tabela 6 e Figura 10. Conforme a Figura 10 demonstra, um aumento agudo na massa antigênica pode ser induzido em todas as fases da cultura de Leptospira, com uma elevação muito rápida já a 2, 4, e 8 horas depois da suplementação. Com esta escala de tempo, o aumento resulta a maior parte de um processo bioquímico, e menos da proliferação.
61/70 [00242] O fato de que a quantidade de antígeno produzida parece ser menor quando a suplementação é feito posteriormente, deriva do efeito pouco positivo que a suplementação de ácido linoleico tem na biomassa. Isto é nivelado quando se expressa a massa antigênica por quantidade de célula padrão, vide Tabela 6.
Tabela 6: Efeito de suplementação de ácido linoleico em diferentes fases de proliferação de uma cultura de Leptospira.
Massa antigênica, média de dias 4-5
Condições do fermentador cone, total de C18:2 pg/mL Ag U / 10Λ9 células/mL Massa antigênica relativa (%)
BSA baixo LA, não suplementada 5 789 100
1χ10Λ8 células/mL, 100 105 1,783 226
5χ10Λ8 células/mL, 100 105 1,564 198
9x10Λ8 células/mL, 100 105 1,656 210
[00243] Testes de suplementação em pontos no tempo adicionais: depois da coleta, depois da lavagem e depois da concentração, estão em andamento. A incubação das culturas da fase final pode exigir refresco do meio; entretanto, a suplementação de uma cultura da fase final é estimada mais favorável, em virtude de neste estágio as células serem em números altos, e serem ainda capazes de formação de massa antigênica. Além disso, neste estágio é menos relevante se qualquer toxicidade residual do ácido linoleico suplementado interferiría com a capacidade de as células proliferaram já que não é mais exigido.
9. Determinação de ímunopotêncía melhorada de vacinas preparadas a partir de culturas suplementadas de Leptospira [00244] Culturas de Leptospira que foram suplementadas com ácido linoleico foram produzidas da maneira descrita anteriormente. Essas serão formuladas para vacinas contra Leptospirose adjuvantadas inativadas como é bem conhecido na técnica, e testadas em experimentos in vivo como prescrito nos monográficos da Farmacopéia. Efeitos de sororresposta, proteção de desafio, e nível de reações de vacinação adversas serão monitorados.
[00245] Em virtude de, para as vacinas contra Leptospirose a
62/70 correlação entre massa antigênica e capacidade imunoprotetora ser bem conhecida, pode-se prever com certeza que vacinas bacterinas com uma maior massa antigênica do que previamente, também induzirão maiores níveis de proteção imune.
[00246] Similarmente, em virtude da carga da proteína de vacinas de bacterina de Leptospira estar claramente implicada como o efeito causador de efeitos colaterais de vacinação, pode-se também prever que vacinas de bacterina de Leptospira com menos proteína, mas massa antigênica igual à anterior, induzirão menos efeitos colaterais, mas uma imunização igual ou provavelmente melhorada.
10. Suplementação de culturas de Leptospira com um ácido línolêníco [00247] Suplementação de culturas de Leptospira com um ácido linolênico (C18;3), tanto alfa- quanto gama-, foi feita essencialmente da maneira descrita anteriormente para suplementação com ácido linoleico (C18:2). Resultados foram também amplamente comparáveis exceto para os casos onde uma Leptospira particular exibiu uma preferência particular para uma forma de ácido graxo Cl8 poli-insaturado com relação a outros.
[00248] A massa antigênica por unidade de biomassa foi também calculada de uma maneira similar, nos dias onde a cultura de Leptospira foi estacionária, tipicamente, isto foi nos dias 3-4-5 após inoculação, ocasionalmente e para alguns sorogrupos que foi nos dias 4-5-6 depois da inoculação. Como antes, a pontuação de massa antigênica média por Elisa foi calculada por 1x10Λ9 células (pré-inativação). O aumento relativo na massa antigênica foi calculado com relação à cultura de referência, que não recebeu suplementação. A massa antigênica média/lxlOA9 células da cultura de referência foi estabelecida a 0 % de aumento.
[00249] Em todos os experimentos com suplementação de culturas de Leptospira com Cl8:3, o EMJH foi preparado usando uma BSA padrão
63/70 (Milipore), e polissorbato 80 (Croda). Da maneira descrita, tal meio EMJH por si mesmo conteve quantidades insignificantes de Cl8:3.
[00250] Tanto Cl8:3 alfa quanto gama foram adquiridos como substância química pura (> 98 %). Imediatamente antes do uso para suplementação, eles foram diluídos em etanol puro a 10 % ou 20 % em v/v, dependendo da quantidade de Cl8:3 que teve de ser adicionado em uma cultura. Esta diluição em etanol foi adicionada em uma cultura de Leptospira por adição em 5 doses, divididas por um período de 4 horas.
10.1 Consumo de ácido linolênico em culturas de Leptospira [00251] Em linha com o que é descrito por C18:2 no Exemplo 4, e Figuras 1 - 3, foi estudado o consumo de Cl8:3, com e sem suplementação. Resultados para uma cultura de sorogrupo de Leptospira Icterohaemorrhagiae em meio EMJH estão apresentados nas figuras 13 e 14. A expansão da biomassa padrão dessas culturas foi similar àquela apresentada na Figura 1. [00252] Figura 13 apresenta o perfil de quantidades relativas dos principais ácidos graxos em uma cultura não suplementada: C16:0 e C18:l, esses estão apresentados com relação ao eixo vertical do lado esquerdo, e permanecem relativamente constantes, mesmo quando a cultura é expandida. Quantidades de C18:2 e C18:3 estão apresentadas com relação ao eixo vertical do lado direito: no dia 3, os níveis de C18:2 já foram esgotados, e níveis de C18:3-alfa estão declinando estavelmente, e são esgotados do dia 5 em diante.
[00253] Figura 14 apresenta um perfil similar, mas de uma cultura que foi suplementada com 200 gg/mL de Cl8:3 alfa no dia 3 após inoculação. Nesta figura, todas as quantidades relativas de ácido graxo estão apresentadas com base no eixo vertical do lado esquerdo. Conforme pode-se observar, a suplementação de Cl8:3 alfa resultou em um nível de Cl8:3 claramente detectável para o ponto de amostragem do dia 3,3. Em dias subsequentes, esta quantidade é estavelmente consumida, e é novamente exaurida no dia 5. O
64/70 aumento correspondente na massa antigênica é exibido nas figuras 16, 18, e
20.
10.2 Efeito de suplementação de diferentes quantidades de C18:3 [00254] Comparável com o que é descrito por Cl8:2 no Exemplo 5, e Figuras 4 e 5, uma cultura de sorogrupo de Leptospira Icterohaemorrhagiae em meio EMJH foi suplementada com diferentes quantidades de Cl8:3, tanto ácido alfa-linolênico (Cl8:3 alfa) quanto ácido gama-linolênico (Cl8:3 gama). Resultados estão apresentados nas figuras 15 - 20.
[00255] Como fica claro em todos esses resultados: suplementação com um ácido linolênico induz em uma cultura de Leptospira um aumento na massa antigênica que excede bastante um aumento em biomassa, produzindo um aumento líquido na massa antigênica por unidade de biomassa.
[00256] Figuras 15 e 16 exibem os efeitos na biomassa e na massa antigênica de suplementação com 100, 200, 300 ou 400 gg/mL de Cl8:3 alfa. Claramente, a suplementação de 300 ou 400 gg/mL teve efeitos tóxicos na cultura. Para as outras quantidades, 100 gg/mL de Cl8:3 alfa deram um aumento ligeiramente melhor na massa antigênica: 122 %, com relação a 200 gg/mL de Cl8:3 alfa: 81 %.
[00257] Figuras 17 e 18 exibem os efeitos na biomassa e na massa antigênica de suplementação com 200, 300, ou 400 gg/mL de Cl8:3 gama. Aparentemente, o Cl8:3 gama foi mais bem tolerado pela cultura de Icterohaemorrhagiae do que C18:3 alfa, já que somente a quantidade de 400 gg/mL mostrou toxicidade.
[00258] A suplementação com 200 gg/mL de Cl8:3 gama deu um aumento ligeiramente menor na massa antigênica do que a suplementação com 300 gg/mL de C18:3 gama: 114 % versus 153 %.
[00259] Figuras 19 e 20 exibem uma comparação de efeitos de uma quantidade igual de Cl8:3 alfa ou gama, na biomassa e massa antigênica de
65/70 uma cultura de sorogrupo de Leptospira Icterohaemorrhagiae em meio EMJH. Uma suplementação com 100 gg/ruL de Cl8:3 alfa induziu um maior aumento em massa antigênica relativa do que em 100 pg/mL de Cl8:3 gama: 122 % versus 170 %.
[00260] Isto demonstra a preferência de sorogrupo Leptospira Icterohaemorrhagiae para o isômero alfa de Cl8:3.
10.3 Efeito de suplementação de Cl8:3 de outros sorogrupos de Leptospira [00261] Comparável ao que é descrito por C18:2 no Exemplo 6, e Figuras 6 - 9 e 11-12, o efeito na massa antigênica para suplementação com um ácido linolênico foi também testado em Leptospira de sorogrupos sem ser Icterohaemorrhagiae. Em particular, culturas de sorogrupos Australis (serovar Bratislava), Tarassovi, Grippotyphosa, Pomona, ou Canicola foram testadas, por suplementação com 100 ou 200 gg/mL de C18:3 alfa, ou com 100 gg/mL de Cl8:3 gama. Resultados estão apresentados nas figuras 21-32, e nas Tabelas 7 e 8.
Tabela 7: Efeito de suplementação de Cl8:3 nas culturas de Leptospira de vários sorogrupos
Aumento relativo na massa antigênica (%)
Sorogrupo 100 pg/mL de C18:3 alfa 200 pg/mL de C18:3 alfa 100 pg/mL de C18:3 gama Figuras
Australis (serovar Bratislava) 40 62 15 21 e22
Tarassovi 59 141 51 23 e24
Grippotyphosa 60 63 57 25e26
Pomona 0 0 73 27e28
[00262] Observou-se que Leptospira dos sorogrupos Australis, Tarassovi, e Grippotyphosa em geral não tiveram uma forte preferência para nenhum isômero de Cl8:3. Entretanto, sorogrupo Pomona teve uma forte preferência, a saber, por Cl8:3 gama; sua geração de massa antigênica foi ainda menor que a cultura de referência quando Cl8:3 alfa foi suplementado.
[00263] Leptospira de sorogrupo Canicola (estirpe WS 280503) foram testadas com diversas quantidades de Cl8:3 alfa ou gama, uma vez que Canicola pareceu exigir maiores quantidades de ácido graxo
66/70 (respectivamente: poderia tolerar) antes de exibir um aumento relativo na massa antigênica. Resultados estão apresentados nas figuras 29 - 32, e na tabela 8.
Tabela 8: Efeito de suplementação de Cl8:3 de culturas de sorogrupo de Leptospira Canicola
Sorogrupo Canicola Aumento relativo na massa antigênica (%) Figuras
200 pg/mL de C18:3 alfa 107 29 e 30
300 pg/mL de C18:3 alfa 112
400 pg/mL de C18:3 alfa 118
200 pg/mL de C18:3 gama 98 31 e 32
300 pg/mL de C18:3 gama 83
10.4. Níveis de suplementação Maximal de Cl8:3 [00264] Comparável ao que é descrito por Cl8:2 no Exemplo 7, o efeito da quantidade de Cl8:3 que é suplementada parece limitada na prática por sua citotoxicidade para Leptospira. Embora sorogrupo Canicola pareça tolerar níveis de suplementação de Cl8:3 um pouco maiores, a maioria dos outros sorogrupos mostrou citotoxicidade de 200 gg/mL de Cl8:3 e acima. Não houve nenhuma clara diferença observada para a citotoxicidade do isômero alfa ou gama de Cl8:3.
10.5. Ponto no tempo para suplementação de Cl8:3 [00265] Comparável ao que é descrito por Cl8:2 no Exemplo 8, e Figura 10, o efeito de suplementação de uma cultura de sorogrupo de Leptospira Icterohaemorrhagiae em meio EMJH foi testado com Cl8:3 alfa ou gama em diferentes pontos no tempo da cultura. Resultados estão apresentados nas figuras 33 - 36.
[00266] Figuras 33 e 34 exibem os resultados de suplementação com Cl8:3 alfa a 1, 5, ou 8 x 10Λ8 células/mL. Aumentos relativos na massa antigênica observados foram: 163,164 e 140 %, respectivamente.
[00267] Figuras 35 e 36 exibem os resultados de suplementação com C18:3 gama a 2, 5, ou 8 x 10Λ8 células/mL. Aumentos relativos na massa antigênica observados foram: 71,81 e 162 %, respectivamente.
67/70 [00268] Consequentemente, o efeito da cronometragem da suplementação com Cl8:3, em função da concentração celular no momento de suplementação, não pareceu muito crítico. Embora suplementação com Cl8:3 alfa tenha dado o aumento mais alto na massa antigênica quando aplicada a baixa concentração celular do meio, enquanto Cl8:3 gama deu o aumento mais alto quando aplicada a alta concentração celular.
10.6. Suplementação combinada de diferentes ácidos graxos Cl8 polí-ínsaturados [00269] Surpreendentemente, observou-se que ácidos graxos Cl8 poliinsaturados podem também ser combinados em suplementação, e então causar um efeito cumulativo. Isto foi testado com uma cultura de sorogrupo de Leptospira Icterohaemorrhagiae em meio EMJH, que foi suplementada tanto com 100 gg/mL de C18:2, com 100 gg/mL de C18:3 alfa, quanto com a combinação de 50 gg/mL de Cl8:2 e 50 gg/mL de Cl8:3 alfa. A combinação de ácidos graxos foi fornecida para a cultura adicionando os dois ácidos graxos como diluições 10 % separadas em etanol, praticamente simultâneas, em 5 adições no curso de 4 horas.
[00270] Aumento em massa antigênica relativa obtido foram: 77 %, 144 % e 118 % respectivamente. Resultados são exibidos nas figuras 37 e 38.
[00271] Notadamente o aumento na massa antigênica obtido suplementando com uma combinação deC18:2eC18:3 produziu um nível de aumento relativo de massa antigênica (118 %), que é muito próximo da média aritmética (111 %) dos aumentos relativos das suplementações separadas.
Legenda para as figuras
Figura 1:
[00272] Resultados de biomassa e de Elisa do antígeno com o tempo, em uma cultura de Leptospira do sorogrupo Icterohaemorrhagiae em meio EMJH contendo BSA alto LA que não foi adicionalmente suplementada.
68/70
Figura 2:
[00273] Resultados de análises do perfil do ácido graxo no meio de cultura da cultura representados na figura 1.
Figura 3:
[00274] Perfil do ácido graxo do meio de cultura de uma cultura de Leptospira do sorogrupo Icterohaemorrhagiae em EMJH com BSA alto LA, por meio do qual a cultura foi suplementada com 100 gg/mL de ácido linoleico a uma densidade da célula de 5x10Λ8 células/mL no dia 2.
Figuras 4 e 5:
[00275] Respectivamente, a biomassa e a medições de quantidade de antígeno resultaram de diferentes culturas de Leptospira do sorogrupo Icterohaemorrhagiae, proliferadas em meio EMJH com BSA padrão; as culturas foram tanto não suplementadas como cultura de referência, quanto suplementadas com ácido linoleico: um com 75 gg/mL de ácido linoleico, do ácido linoleico puro em etanol; um com 150 gg/mL, também de linoléico puro em etanol, e um com 50 gg/mL de ácido linoleico, como ácido linoleico B S A-complexado.
Figuras 6 e 7:
[00276] Respectivamente, a biomassa e as medições de quantidade de antígeno resultaram de diferentes culturas de Leptospira do sorogrupo Sejroe (serovar Hardjo), proliferadas em meio EMJH com BSA alto LA; as culturas foram tanto não suplementadas como cultura de referência, quanto suplementadas com 100 gg/mL de ácido linoleico do ácido linoleico puro em etanol.
Figuras 8 e 9:
[00277] Respectivamente, a biomassa e as medições de quantidade de antígeno resultaram de diferentes culturas de Leptospira do sorogrupo Grippotyphosa, proliferadas em meio EMJH com BSA alto LA; as culturas foram tanto não suplementadas como cultura de referência, quanto
69/70 suplementadas com 100 gg/mL de ácido linoleico do ácido linoleico puro em etanol.
Figura 10:
[00278] Efeito no aumento na massa antigênica quando uma cultura de Leptospira é suplementada em diferentes estágios de proliferação. Leptospira do sorogrupo Icterohaemorrhagiae foram cultivadas em meio EMJH padrão, e suplementadas com 100 gg/mL de ácido linoleico, no estágio inicial, do meio ou final. Amostragem inicial foi a 2, 4, e 8 horas depois da suplementação.
Figuras 11 e 12:
[00279] Efeitos de suplementação com diferentes quantidades de ácido linoleico, na biomassa e massa antigênica de uma cultura de sorogrupo de Leptospira Tarassovi, em meio EMJH padrão.
Figuras 13 e 14:
[00280] Perfil de quantidades de ácido graxo relativas em uma cultura de sorogrupo de Leptospira Icterohaemorrhagiae em meio EMJH, com o tempo.
Figura 13: Cultura não suplementada; NB: Níveis de C18:2 e C18:3 estão apresentados com relação ao eixo vertical do lado direito.
Figura 14: Cultura suplementada com 200 gg/mL de Cl8:3 alfa.
Figuras 15 - 20:
[00281] Os efeitos de suplementação com diferentes quantidades de Cl8:3 alfa ou gama, na biomassa e na massa antigênica de culturas de sorogrupo de Leptospira Icterohaemorrhagiae em meio EMJH.
Figuras 21 - 32:
[00282] Os efeitos de suplementação com diferentes quantidades de Cl8:3 alfa ou gama, na biomassa e na massa antigênica de culturas de Leptospira de diferentes sorogrupos, em meio EMJH.
Figuras 21 e 22: cultura de sorogrupo de Leptospira Australis (serovar Bratislava),
70/70
Figuras 23 e 24: cultura de sorogrupo de Leptospira Tarassovi,
Figuras 25 e 26: cultura de sorogrupo de Leptospira Grippotyphosa,
Figuras 27 e 28: cultura de sorogrupo de Leptospira Pomona, Figuras 29 a 32: cultura de sorogrupo de Leptospira Canicola.
Figuras 33 - 36:
[00283] Os efeitos de suplementação de uma cultura de sorogrupo de Leptospira Icterohaemorrhagiae em meio EMJH, com Cl8:3 alfa ou gama em diferentes pontos no tempo da cultura.
Figuras 37 e 38:
[00284] Comparação do efeito de suplementação separada versus combinada com diferentes ácidos graxos Cl8 poli-insaturados, na biomassa e na massa antigênica de uma cultura de sorogrupo de Leptospira Icterohaemorrhagiae em meio EMJH.

Claims (11)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para aumentar a massa antigênica de uma cultura de Leptospira, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de suplementar a dita cultura de Leptospira com um ácido graxo Cl8 poli-insaturado.
  2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo Cl8 poli-insaturado são um ou mais selecionados do grupo que consiste em: ácido linoleico, ácido alfa-linolênico, e ácido gama-linolênico.
  3. 3. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de incubar uma cultura de Leptospira em condições nas quais pelo menos 15 gg de um ácido graxo Cl8 poli-insaturado/mL ficaram disponíveis na dita cultura.
  4. 4. Cultura de Leptospira obtenível por um método, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a dita cultura de Leptospira tem uma massa antigênica aumentada.
  5. 5. Cultura de Leptospira de acordo com a reivindicação 4, ou uma preparação da dita cultura, caracterizada pelo fato de que é para uso em uma vacina contra Leptospirose.
  6. 6. Vacina contra Leptospirose, caracterizada pelo fato de que compreende uma cultura de Leptospira como definida na reivindicação 4, ou uma preparação da dita cultura.
  7. 7. Uso de uma cultura de Leptospira, como definido na reivindicação 4, ou de uma preparação da dita cultura, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma vacina contra Leptospirose.
  8. 8. Método para produzir uma vacina contra Leptospirose, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende as etapas de:
    a. proliferar uma cultura de Leptospira em um sistema in vitro,
    b. suplementar a dita cultura de Leptospira com um ácido graxo Cl8 poli-insaturado,
    2/2
    c. inativar e coletar a dita cultura de Leptospira suplementada, e
    d. misturar a cultura de Leptospira inativada com um carreador farmaceuticamente aceitável.
  9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que, entre as etapas a. e b., existe uma etapa adicional que compreende coleta, armazenamento e/ou purificação da cultura de Leptospira.
  10. 10. Uso de um composto ou composição, caracterizado pelo fato de que que é relativamente rico em um ácido graxo Cl8 poli-insaturado para um método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, 8, ou 9.
  11. 11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o composto ou composição que é relativamente rico em um ácido graxo Cl8 poli-insaturado é um óleo vegetal.
BR112015014343-1A 2012-12-21 2013-12-20 Métodos para aumentar a massa antigênica de uma cultura de leptospira e para produzir uma vacina contra leptospirose, cultura de leptospira, vacina contra leptospirose, e, usos de uma cultura de leptospira e de um composto ou composição BR112015014343B1 (pt)

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