CN104854234B - 具有增加的抗原量的钩端螺旋体 - Google Patents

Abstract

通过向钩端螺旋体培养物补充特定类型的脂肪酸：多不饱和C18脂肪酸，可以独立于生物量的任何提高，而显著提高钩端螺旋体培养物的抗原量。这提供了钩端螺旋体抗原生产中的优势。这还能够更安全且更有效地生产改进的钩端螺旋体病疫苗。

Description

具有增加的抗原量的钩端螺旋体

本发明主要涉及细菌学领域，并涉及细菌疫苗。具体地，本发明涉及提高钩端螺旋体的抗原量的方法、可由该方法获得的钩端螺旋体、以及疫苗和此类钩端螺旋体的应用。

钩端螺旋体属(Leptospira)的螺旋体细菌属于钩端螺旋体科(Leptospiraceae)，和螺旋体门(Spirochaetes)。钩端螺旋体是革兰氏阴性、好氧、能动型细菌，具有长、细、和螺旋状的形式。致病钩端螺旋体见于全世界许多类型的动物以及人之中；哺乳动物，例如啮齿动物、野生动物、家畜、和狗是天然的储主。这种细菌引起被称为钩端螺旋体病，或：韦尔氏病(Weil's disease)的疾病。这在钩端螺旋体感染并通过血液运送，随后侵入所有内脏时发生，并且可能显示出从温和到严重，甚至死亡的广泛症状，并且具有急性或慢性的性质。这种差异性是这种疾病常常被误诊的原因。主要症状是：发热、恶心、和血管炎引起的黄疸，导致肾、肝、或肺衰竭或心血管疾病。钩端螺旋体通常存活于宿主的肾或生殖道中，且这种方式导致水平传播，其也可能引起人畜共患病，由此人通过与动物尿液接触或与被污染的地表水接触而被感染。综述参见P. Levett, 2001 (Clin. Micr. Rev., vol. 14, p.296)。钩端螺旋体在自然中十分稳定，在含水条件下和环境温度中可以存活数月。

钩端螺旋体的分类可因所使用的不同***而被混淆：多年来，分类是基于血清学差异，据此所有的致病钩端螺旋体均表示为问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)(广义)种的血清型。在这种***中，通过对细菌的主要免疫原：位于其外膜上的脂多糖(LPS)进行血清学测试来区分血清型。目前已描述了超过200种血清型，它们合并为大约25个血清群。

然而，与这种血清分型的分类相垂直，还存在基于分子生物学特征进行基因型分型，分为所谓的基因种(genomospecies)的***。事实上，一种钩端螺旋体基因种可以包含几种血清型，反之亦然。在本文的情况中，使用血清学分类分为血清型。

一些钩端螺旋体血清型仅感染特定的宿主物种，但是大部分血清型具有广泛的宿主范围。例如问号钩端螺旋体(广义)哈德焦血清型(serovar Hardjo)与牛的感染有关，而在猪中，最常归咎于塔拉索夫型(Tarassovi)、波摩那型(Pomona)和布拉迪斯拉发型(Bratislava)血清型。但是，血清型如犬型(Canicola)、黄疸出血型(Icterohaemorrhagiae)、布拉迪斯拉发型(Bratislava)和感冒伤寒型(Grippotyphosa)可以感染猪、犬、和人。

可以通过多种方法检测宿主的钩端螺旋体感染。金标准是通过所谓的：显微镜凝集测试(MAT)对宿主血清中特定抗体进行血清学检测。在这种测试中，患者血清的连续稀释物与特定血清型的活钩端螺旋体一起温育。当血清中存在特定抗体的时候，它们会使测试的细菌凝集，其可以例如通过(暗视野)显微镜读出。这种测试是高度特异性的，并且MAT还对钩端螺旋体分离物的血清分类具有决定作用。可选择的测试是ELISA (酶联免疫吸附测定)、或PCR (聚合酶链式反应)。

在治疗上，钩端螺旋体病的治疗可以通过施用抗生素进行。但是，由于该疾病常常被误诊，优选通过接种进行预防。几种类型的动物或人用的钩端螺旋体疫苗正在研究，但是目前只有兽用疫苗广泛商业可得的。进行常规接种的动物物种是猪、牛、和狗。这样，接种不仅用于预防宿主疾病，还用于减少人畜共患病的传播。

目前的钩端螺旋体病疫苗是基于来自相关血清型菌株的灭活全细菌细胞的混悬液，即所谓的菌苗。这些疫苗诱导有效的体液型的免疫，由此大部分免疫保护性抗体能够凝集并由此中和钩端螺旋体。细菌的免疫显性抗原是LPS，尤其是：位于LPS的寡糖部分上的表位。诱导的免疫主要是血清型特异的，并在相关的血清型，例如来自相同血清群的血清型之间有一些交叉保护。钩端螺旋体病疫苗的实例是牛用的Leptavoid® H (MSD AnimalHealth)，其包含来自问号钩端螺旋体(广义)哈德焦血清型(serovar Hardjo)菌株的菌苗。

然而，由于大部分现实情况显示流行的钩端螺旋体来自超过一个血清群，因此许多市售的钩端螺旋体病疫苗是组合疫苗，提供宽泛的保护。一个实例是犬疫苗：Nobivac®Lepto4 (Merck Animal Health)，其包含来自问号钩端螺旋体(广义)血清群：犬群(Canicola)、感冒伤寒群(Grippotyphosa)、黄疸出血群(Icterohaemorrhagiae)和波摩那群(Pomona)的每一个的菌株。而且，钩端螺旋体病疫苗常常与其它细菌或与病毒疫苗化合物组合。

目前，为研究或诊断目的，钩端螺旋体常规地在体外培养物中增殖，但主要是为了疫苗生产。钩端螺旋体体外增殖的方法和程序已为人所知超过50年，并且对其相对简单培养基关键的成分也是如此。在1960年代，确定了钩端螺旋体(为体外增殖)需要长链脂肪酸用于其营养和细胞组分。此外，这些长链脂肪酸被用作唯一的能量来源和碳源，因为没有(可检测到地)消耗培养基中的蛋白质或碳水化合物。因此，这些脂肪酸需要由培养基提供，因为钩端螺旋体不能从头合成长链脂肪酸，也不能使短链脂肪酸延伸。这些发现帮助开发了半合成的钩端螺旋体培养基(Johnson & Gary 1963; Stalheim & Wilson 1964)，其中将以前使用的高达10 % v/v的全(兔)血清，替换为白蛋白级分和确定脂肪酸源的组合。它进一步发展为合成培养基，其现在仍用作钩端螺旋体小规模或大规模体外增殖的标准培养基：EMJH培养基，由Ellinghausen和McCullough开发(1965, Am. J. of Vet. Res., vol.26, p. 45)，并由Johnson和Harris改良(1967, J. of Bacteriol., vol. 94, p. 27)。

EMJH培养基除了必要的维生素、盐和矿物质之外，还包含0.125 % v/v的聚山梨醇酯80、和1% w/v的牛血清白蛋白(BSA) (Faine, S., 1994, p. 312, in: Leptospira andLeptospirosis, ed. S. Faine, Boca Raton, FL, USA, CRC Press)。

聚山梨醇酯80是聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯(CAS nr. 9005-65-6)，其最著名的是它的一个商品名：Tween® 80 (ICI Americas, Inc.)。聚山梨醇酯80是非离子表面活性剂，其在药物、化妆品和食品中广泛用作乳化剂和增溶剂(E 433)。但是，在EMJH培养基中，它充当细菌的长链脂肪酸来源，因为它方便地溶于水，并且对细菌具有相对较低的毒性。聚山梨醇酯80的大约70% v/v的主要组分是油酸(C18:1)，但还存在其它一些脂肪酸，主要是：棕榈酸(C16:0)、和棕榈油酸(C16:1)，虽然这取决于批次和制造商。

在这一方面，脂肪酸的命名，例如油酸称为“C18:1”，是根据C:D表示法，这是一种众所周知的标准速记法，其通过其主要特征对脂肪酸进行描述：酰基链中的碳原子数目(对于油酸来说是18)，和双(不饱和)键的数目(对于油酸来说是1)。

由于钩端螺旋体在体外不消耗蛋白质，认为EMJH中白蛋白组分的主要作用是通过可逆地与培养基中聚山梨醇酯80提供的脂肪酸复合而对其进行脱毒，同时保持它们在生物学上是可用的。

血清白蛋白，除了提供渗透压之外，是血液中重要的运输蛋白，用于多种化合物，例如蛋白质、脂类、维生素、小分子等。

与血清白蛋白结合的脂类包括二-和三-甘油酯，和胆固醇酯以及磷脂，但是其大部分(> 90%)是游离脂肪酸的形式；“游离”的含义是：没有酯化，或者没有共价连接。在这些与白蛋白结合的游离脂肪酸中，90%以上是C14-C20范围的中等大小的和长链的脂肪酸，主要是：肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、棕榈油酸(C16:1)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)，和花生四烯酸(C20:4)。

白蛋白可逆地与这些脂肪酸在几个结合位点上以不同的亲和力结合。有多少脂肪酸、以及哪种类型的脂肪酸与来自供者的白蛋白样品结合，具有很大的生理学差异，并且依赖于脂肪酸的化学特征，例如链长和不饱和水平，还依赖于白蛋白供者的生物学特征，例如物种、品种、和性别、以及营养和活动状况。

对于市售的BSA，结合的脂肪酸的量和类型依赖于制造商使用的生产方案，并且随每一批次而变化。

传统的白蛋白制备物通过冷-乙醇分级获得(Cohn等人，1946, J. of the Amer.Chem. Soc., vol. 68, p. 459)，产生所谓的：Cohn级分V白蛋白产品。从那以后，用于例如生物化学和组织培养中的多种类型和品质的血清白蛋白已成为商购可得的。Janatova对血清白蛋白的多样性进行了广泛的综述(1974, J. of Medicine, vol. 5, p. 149)。

虽然在实验条件下每分子白蛋白可以结合超过10个分子的脂肪酸(Spector &Hoak, 1969, Anal. Biochem., vol. 32, p. 297)，在生理条件下，白蛋白会携带大约0.3和3摩尔之间的脂肪酸/摩尔白蛋白(Hennig & Watkins, 1989, Am. J. of Clin. Nutr.,vol. 49, p. 301)。

具有少量脂肪酸，即低于0.1摩尔脂肪酸/摩尔白蛋白的商业血清白蛋白也是可得的；这种白蛋白产品已特意用多种可用技术中的一种，例如用有机溶剂提取和/或木炭吸附，进行脱脂。但是，为了获得非常低的脂质负荷水平，需要在非常低的pH值条件下的侵略性的提取方法(aggressive extraction methods)，这可能导致白蛋白变性。

用于工业规模生物过程的大量血清白蛋白，仅有效地商购可得自牛科动物，其是作为肉类工业的副产品。

在适用于体外细胞增殖的不同类型的BSA中，其中一些被推荐与特定细胞类型一起使用。一个实例是BovoLep® BSA (Bovogen, Australia)，推荐将其用于提高培养物中钩端螺旋体的生长；这是富含大量植物脂肪酸的标准BSA。

这样，完全EMJH培养基提供已知对培养物中钩端螺旋体的增殖重要的所有脂肪酸：棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)和油酸(C18:1) (Johnson & Gary, 1963, supra)。

这种EMJH培养基允许问号钩端螺旋体(广义)的大部分相关血清型增殖。工业规模的钩端螺旋体增殖的典型条件是28-30℃，控制pO₂和pH，在带有搅拌器的标准发酵罐容器中。尽管如此，钩端螺旋体的增殖相对缓慢：已报道的增代时间在12和24小时之间，依赖于毒力、和对体外增殖条件的适应水平。因此：为了达到高生物量，增殖过程花费相对较长的时间，典型地是4-7天，这取决于接种密度，并且要进行几次预培养以制备足够的接种物。这给生产者造成了沉重的发酵罐容量负担。而且，这种延长的培养时间带来了极大的发生污染的风险，例如，被具有短得多的倍增时间的细菌、酵母或真菌污染。

因此，需要在体外培养物中生产钩端螺旋体抗原的改良方法。

本领域的文献描述了一些提高体外培养物中钩端螺旋体增殖的尝试。一些对EMJH培养基的调整重新引入了血清，或者加入其它聚山梨醇酯、和/或水解产物。但是，这种富集EMJH培养基通常不用于钩端螺旋体的大规模体外增殖中，而是用于诊断中，典型地是作为半固体培养基，以检测和增殖甚至是少量的来自临床样本的最需要的钩端螺旋体。

通常使钩端螺旋体在体外增殖以制备灭活的钩端螺旋体病疫苗。在增殖阶段之后，下游过程通常从最终培养产物的灭活开始，以生产菌苗。这可以以几种方式实现，通常是通过化学灭活，例如用***、硫柳汞、β丙内酯(BPL)、或β乙醇胺(BEA)。下一步通常是浓缩和纯化灭活培养物，例如通过离心或过滤。然后将得到的抗原制备物配制成疫苗。

惯常的做法是基于生物量配制灭活的钩端螺旋体病疫苗，由此制造包含特定血清型的特定数量的细胞，通常是大约10⁹个细胞/剂量的一个动物剂量。但是不能对配制的最终产品进行这种细胞计数，因为(化学)灭活破坏细菌细胞。因此，在其灭活前，通过对所有完整细胞(活的和死的)进行计数，由最终培养物来确定细胞数量。利用该数量，计算可在配制后向最终产品中分配多少剂量/ml。作为将产品投放市场的质控检查，验证最终疫苗的免疫功效(又称为效价)。目前监管机构需要的批次效价测试是使用仓鼠中的接种和攻毒的体内测定(例如欧洲药典专题0447，犬钩端螺旋体病疫苗)。

对钩端螺旋体病疫苗的体外效价测试是已知的(Ruby等人，1992, Biologicals,vol. 20, p. 259)。它的基础是使用血清型特异性抗体和-标准，通过血清测定对最终疫苗的抗原量进行定量。虽然钩端螺旋体菌苗的抗原量与免疫效价之间的关联是众所周知的，钩端螺旋体病疫苗的配制仍然是基于生物量/剂量。

基于生物量制备钩端螺旋体菌苗疫苗的结果，是这种疫苗剂量包含一定量的蛋白质和其它细菌组分，与LPS对免疫的贡献不同，它们对免疫几乎没有贡献，但是相反却可导致不良的局部和/或全身接种反应。在将几种钩端螺旋体抗原的组合疫苗的情况下，这个问题被加剧。在提高钩端螺旋体病疫苗安全性的尝试中，通常在下游过程中应用额外的纯化步骤。对不良接种反应的担忧也是迄今为止通常没有可得的人用的基于菌苗的钩端螺旋体病疫苗的原因。

为了克服可能的接种反应，一些团队试图通过对钩端螺旋体培养物使用低蛋白或者甚至不含蛋白的调整的培养基，来减少(组合的)钩端螺旋体病疫苗的非保护性和培养基来源疫苗组分的载量。然而，这些培养基仍然必须提供支持钩端螺旋体增殖所需的必要长链脂肪酸。这需要有用于处理这些脂肪酸的固有毒性的解决方案，因为现在它们不能再由大量蛋白例如由血清或BSA提供的大量蛋白进行脱毒。一种方法是对聚山梨醇酯本身进行脱毒，例如通过离子交换，或者通过用聚乙烯吡咯烷酮或木炭提取(Bey & Johnson, 1978,Inf. & Imm., vol. 19, p. 562)。另一种方法在WO 2006/113.601中描述，其中通过向不含蛋白质的培养基中重复小量地补充聚山梨醇酯来限制脂肪酸的毒性，即所谓的分批补充培养过程，其基于以受控的、次最大的生长速度提高生物量。迄今为止，没有商购可得的基于无蛋白质培养的钩端螺旋体的商业钩端螺旋体病疫苗，而传统的疫苗仍然依赖于下游纯化。

尽管如此，这些现有技术都没有报道对培养基所做的改变，或者对增殖条件所做的改变对所产生的钩端螺旋体的抗原量和/或免疫原性的影响。因此，所有这些本质上是钩端螺旋体生物量生产的替代方法。

因此，本发明的目的是提供对钩端螺旋体抗原量生产的改进，并提供由此获得的改进的疫苗。

令人惊讶地发现，通过向钩端螺旋体培养物补充特定的长链不饱和脂肪酸：多不饱和C18脂肪酸，可以实现该目的，并且可以克服现有技术的缺点。这导致抗原量快速并极大地提高，比生物量的任何提高超出达3倍。

这一发现开启了通向多种有利应用的途径，例如产生具有提高的抗原量的钩端螺旋体，其可以用于生产改进的钩端螺旋体病疫苗。因为你发现抗原量的提高超过生物量的提高，所以当对补充-和未补充的钩端螺旋体培养物进行比较时，有抗原量/固定量细菌细胞的净提高。

具有这种提高的抗原量的钩端螺旋体，现在可用于制备疫苗，所述疫苗与现有技术的疫苗具有相同的抗原含量，但是其它细菌-和培养基来源的组分的量减少。这有利于下游处理，并且对接种副作用的水平有利。或者：现在可以应用具有提高抗原量的疫苗，其非特异性组分的水平与之前的疫苗相同。除了对接种目标的安全性有利之外，对于技术人员来说显而易见的是，所有这些改进在经济方面也是高度相关的。

进一步地，现在，补充多不饱和C18脂肪酸的钩端螺旋体培养物比之前更早几天地达到现有技术的抗原量水平。因此现在能更快、更经济、并且污染机会更少地生产这些培养物，因为现在培养时间可以显著减少。或者，如果允许补充多不饱和C18脂肪酸的钩端螺旋体培养物增殖到与之前一样的最大生物量，现在可以获得大大提高的抗原量。

本发明使得能够改良现有的钩端螺旋体增殖和抗原生产培养基，并对优化的(半)合成培养基进行合理设计。

对于在钩端螺旋体培养基中补充多不饱和C18脂肪酸来说，可以使用纯的或是相对富含多不饱和C18脂肪酸的化合物和/或组合物；一种经济的实例是植物油。

此外，由于在钩端螺旋体中，产生生物量的过程和产生LPS抗原的过程看起来在很大程度上是分离的，现在可以设想解偶联的工艺-设计，其中在初始阶段，产生大量的钩端螺旋体生物量，并且在单独的、稍后的阶段，通过向其补充多不饱和C18脂肪酸诱导钩端螺旋体产生LPS抗原。因此，这两个步骤的分离使得可以对这两种过程就其不同相关参数，例如温育时长、温育时间等进行单独优化。这也提供了几种运筹的-和设计的优点，例如允许中间存储、收获和/或纯化。

所有这些都完全是出人意料的，因为在现有技术中几乎从未提及多不饱和C18脂肪酸与钩端螺旋体的增殖条件有关：Stern等人(1969, Eur. J. of Biochem., vol. 8,p. 101)描述了钩端螺旋体将培养基中的亚油酸(C18:2)引入到其细胞膜脂质中。Johnson等人(1970, Inf. & Imm., vol. 2, p. 286)报道了亚油酸是存在于BSA中的一系列脂肪酸中的一种，其用于使钩端螺旋体培养物增殖，但是从未提供具体的量。几乎没有任何出版物提到亚麻酸(C18:3)与钩端螺旋体培养物的关系，也没有提到其是有利的。因此，现有技术没有描述多不饱和C18脂肪酸与钩端螺旋体有任何特殊相关性，除了它潜在的毒性。亚油酸或亚麻酸从未被提及或暗示与钩端螺旋体抗原，特别是LPS抗原的产生具有特殊的相关性。

相反，本领域中现有技术的共识是与钩端螺旋体相关的脂肪酸是棕榈酸、硬脂酸和油酸，并且这些都在标准培养基中由聚山梨醇酯80大量提供。这样生产具有“足够”量LPS抗原的钩端螺旋体已有多年，并且没有描述或暗示对提高每单位钩端螺旋体生物量中LPS抗原量的尝试。也没有任何动机去这么做，因为按常规钩端螺旋体病疫苗是基于生物量配制的，因此使培养物中钩端螺旋体细胞的数量最大化一直是本领域中的主要目标，而不是它们的抗原量。

尚不清楚为何钩端螺旋体需要多不饱和C18脂肪酸来产生它们的LPS抗原，也不知道钩端螺旋体通过什么方式利用多不饱和C18脂肪酸来产生(部分) LPS分子。

虽然本发明人不希望受到任何可以解释这些观察结果的理论或模型的束缚，现在发明人推测在钩端螺旋体中，涉及细菌增殖的生物过程，和涉及LPS产生的那些生物过程可能部分地依赖于分离的酶***，其需要不同的营养物质。这脱离了补充多不饱和C18脂肪酸还可以诱导生物量增加一些的事实。

发明人进一步推测目前使用的标准钩端螺旋体培养基，例如EMJH，仅含有一定量的多不饱和C18脂肪酸，其对于钩端螺旋体抗原的有效产生是次优的；这与这种培养基确实提供了钩端螺旋体生物量形成所需要的大量脂肪酸的事实无关。因此，在这些现有技术的钩端螺旋体培养基中，多不饱和C18脂肪酸被快速耗尽，在此之后，在达到最大的细胞数量之前很久，抗原产生陷入停滞。这使得目前仅仅利用钩端螺旋体产生LPS抗原的能力的一部分。

因此，在一个方面，本发明提供用于提高钩端螺旋体培养物的抗原量的方法，所述方法包括向所述钩端螺旋体培养物补充多不饱和C18脂肪酸的步骤。

本发明的“抗原量”是指固定数量的钩端螺旋体细胞的LPS抗原的量，其可以通过血清学测定方法，例如ELISA来确定。本文中其表示为比抗原量(specific antigen mass)：固定数量的钩端螺旋体细胞的LPS上免疫显性保护性抗原表位的数量，并表示为钩端螺旋体LPS抗原的血清学单位数值/1x10⁹个钩端螺旋体细胞。

在灭活之前根据一般程序对钩端螺旋体细胞进行计数，并且对所有完整细胞，活的或死的细胞进行计数；这是本发明所理解的“生物量”。

因此，对本发明来说，作为应用根据本发明方法的结果，当每个钩端螺旋体细胞的抗原量提高时，钩端螺旋体培养物的抗原量提高。

这与现有技术的通过使钩端螺旋体增殖来生产钩端螺旋体抗原的方法的效果相反；这些方法的重点在于提高钩端螺旋体生物量，而并没有提高每个细胞的抗原量。因此，当生物量提高而抗原量不提高时，其导致抗原量/单位生物量的比率的降低。

抗原量是本领域众所周知的术语，并且通常使用血清学测定方法，例如ELISA，使用对所测量的抗原特异性的抗体来确定，所述抗原在此是钩端螺旋体LPS。然后将样品中检测到的抗原量表示为任意单位数值，由此通过参照标准样品中的抗原量来定义这些单位，所述标准样品例如设定为含有1000单位。因此，抗原量分值的绝对值是任意的，因为它依赖于所用的具体测试，以及所使用的抗体和参考样品。但是，重要的是在相同条件下测试样品分值的相对差异，以及相对于同一个参考样品的相对差异。这例如可以表示为所测量抗原量的差异(例如250相对于500抗原单位/ml)，或者可以方便地表示为百分比。当用不同抗体或者相对于不同(但是合适的)参考样品分析相同的两个样品时，也可以使用这种两个样品之间的差异百分比。

用于确定本发明所用抗原量的优选测定方法是ELISA，其使用对特定钩端螺旋体血清群或血清型的LPS抗原特异的抗体。这种抗体在MAT中可以使钩端螺旋体凝集。优选抗体是单克隆抗体，并且样品具有足够高的滴度，以允许其稀释使用。

用于对钩端螺旋体进行抗原量测定的方案和材料是技术人员长期熟知的，是普遍可用的，并且在本文中详细描述并举例说明。例如公共生物资源中心例如ATCC (Manassas,VA, USA)、或CNCM (Institut Pasteur, Paris, France)可以提供大部分血清型的钩端螺旋体细菌，并提供表达血清型特异且凝集性的单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞系，或者它们的单克隆抗体，参见：Schoone等人(1989, J. of Gen. Microbiol., vol. 135, p. 73)。

或者，这种材料可以常规地使用标准技术自行生产：可以从感染的人或动物获得细菌(使用适当的生物安全措施)，并且可以使用通用技术对它们进行表征；可以通过常规技术使钩端螺旋体增殖来产生抗原；还可以通过对实验动物进行免疫获得血清型特异的抗体，并且生产单克隆抗体的方法是众所周知的。技术人员可以容易地确定这些抗体的特异性和滴度，例如通过进行众所周知的MAT。

而且，几家政府机构和国际组织提供钩端螺旋体细菌、-抗原、和特异性抗体的参考样品，例如用于测定开发。例如Royal Tropical Institute (Amsterdam, theNetherlands)，是WHO、FAO和OIE的钩端螺旋体参照中心。还有，USDA (Ames, IA, USA)提供主要钩端螺旋体血清型的标准参考菌苗，并为有关各方提供用于构建和进行抗原量(效价)ELISA的方案和材料。

此外，钩端螺旋体抗原量测定的研究和/或常规操作可以外包给多个(商业)诊断服务机构之一。

对本发明来说，如果在其它条件相同的情况下，与没有补充多不饱和C18脂肪酸的相同或类似钩端螺旋体培养物的抗原量相比，在补充多不饱和C18脂肪酸的钩端螺旋体培养物中发现有更高的抗原量，则通过根据本发明的方法实现了“提高抗原量”。使用用技术人员众所周知的常规技术，已经检测到抗原量提高了20%并具有统计学意义。

因此，在根据本发明方法的优选实施方案中，与没有补充多不饱和C18脂肪酸的类似钩端螺旋体培养物的抗原量相比，钩端螺旋体培养物的抗原量的提高为至少20%。

更优选，抗原量的提高为至少25、28、30、35、40、45、50、63、77、90、100、121、150、175、184、或至少200 %，按优先顺序排列。

对本发明来说，“类似的钩端螺旋体培养物”指钩端螺旋体培养物在生物学方面与所比较的钩端螺旋体培养物高度相似。例如这可以指使用来自同一个分离物、菌株或血清群的钩端螺旋体培养物进行比较。

对于不同的钩端螺旋体血清群来说，发明人所观察到的，在应用了根据本发明方法之后，相对于类似的但未补充的培养物，每单位生物量的抗原量提高(与类似的未补充培养物相比)的实例是：对于黄疸出血群提高：164%，赛卓群(Sejroe)(哈德焦血清型)：184%，感冒伤寒群：63%，塔拉索夫群：141%，波摩那群：73%，犬群：118%，以及澳洲群(Australis)(布拉迪斯拉发血清型)：62%。详情提供在实施例和附图中。效果之间的差异可能是钩端螺旋体血清群特异的，或者可能与所使用的来自于该血清型的具体菌株材料的特性有关。尽管如此，所有这些提高在经济学上是高度相关的。

对如根据本发明方法补充多不饱和C18脂肪酸导致的抗原量提高进行优化完全在技术人员的常规能力范围内，例如通过对培养条件、补充、或所使用的钩端螺旋体进行调整。

现在，该发现允许通过补充特定的多不饱和C18脂肪酸，对来自不同血清群的钩端螺旋体的培养进行进一步的优化，以达到该钩端螺旋体血清群、血清型、类型或菌株的抗原量/生物量比率的最大相对提高。

因此，在根据本发明方法的优选实施方案中：

- 对于钩端螺旋体血清群黄疸出血群的培养，多不饱和C18脂肪酸是亚麻酸(C18:3)，优选α-亚麻酸(α C18:3)，

- 对于钩端螺旋体血清群犬群的培养，多不饱和C18脂肪酸是亚麻酸(C18:3)，

- 对于钩端螺旋体血清群波摩那群的培养，多不饱和C18脂肪酸是γ亚麻酸(γC18:3)，和/或

- 对于钩端螺旋体血清群赛卓群(哈德焦血清型)的培养，多不饱和C18脂肪酸是亚油酸(C18:2)，

其中脂肪酸还可以以该脂肪酸的衍生物的形式，或者以相对富含该脂肪酸的化合物或组合物的形式提供给钩端螺旋体培养物，如本文所定义的。

原则上，在根据本发明的方法中可以使用如上所定义的任何多不饱和C18脂肪酸，并提供基本相同的效果。更甚者：本发明人已发现可以以组合补充的方式向培养物提供不同类型的多不饱和C18脂肪酸，其中它们对于抗原量提高的效果是累积的。

本发明中对此进行了例证，例如对于血清群黄疸出血群的钩端螺旋体，当补充亚油酸和α-亚麻酸各50 µg/ml的组合时，抗原量的提高非常接近于向培养物补充(在同一个实验中) 100 µg/ml 亚油酸或α-亚麻酸的单独相对提高量的算术平均值。

根据本发明方法，多不饱和C18脂肪酸的组合补充，可以是补充脂肪酸(或其衍生物，或者相对富含这种脂肪酸的化合物或组合物)的混合物，或者可以单独补充，同时补充或连续补充或在时间上更加分散地补充。

因此，在一个实施方案中，通过使用天然含有多于一种多不饱和C18脂肪酸的组合物向钩端螺旋体培养物中补充多不饱和C18脂肪酸。实例是植物(种籽)油，例如油菜籽或亚麻籽油，其相对富含C18:2和α C18:3二者，或***籽油，其相对富含C18:2、α C18:3、和γC18:3。

“钩端螺旋体”通常指来自于螺旋体细菌分类属的具有该名称的细菌。它还包括其任何方式的亚分类的钩端螺旋体，例如亚种、菌株、基因型、血清型(serotype)、血清型(serovar)、血清群、变体、或亚型等。这些钩端螺旋体都具有其分类家族成员的特征性特点，例如基因组、物理、电镜、和生物化学特征，以及生物学特征例如生理、免疫或病理行为。除了血清学分类之外，其它测定可以基于核苷酸测序或PCR测定，如本领域已知的。

对技术人员显而易见的是，虽然作为本发明主题的细菌属目前称为钩端螺旋体，这是分类学上的分类，其可随着导致重新分类为新的或是不同的分类组的新发现而被改变。但是，由于这不改变所涉及的微生物或它的特征性特点，改变的仅是其学名或分类，这种重新分类的微生物仍然在本发明的范围之内。

用于本发明方法的优选钩端螺旋体是对一种或多种动物物种或人致病的钩端螺旋体；更优选的是选自问号钩端螺旋体(广义)犬群、黄疸出血群、澳洲群、感冒伤寒群、波摩那群、塔拉索夫群、赛卓群和秋季群(Autumnalis)的至少一种血清群。

甚至更优选的是选自问号钩端螺旋体(广义)犬型、Portland-vere型、黄疸出血型、哥本哈根型、布拉迪斯拉发型、澳洲型、感冒伤寒型、Dadas型、波摩那型、塔拉索夫型、Gatuni型、哈德焦型、赛克斯科比型(Saxkoebing)和秋季型的至少一种血清型。

本发明的“培养物”是：包含钩端螺旋体细菌的组合物。本发明的钩端螺旋体培养物中的细菌可以处于不同的密度或条件：完整或不完整，活的或死的，(部分)破裂的或灭活的等。细菌可以处于任何细胞周期阶段，例如增殖期、静止期(resting)、或休眠期(dormant)。培养物可以是增殖培养物，其中钩端螺旋体最近接种的、处于指数或对数期的早期、中期、或晚期。或者培养物可以是静置(static)培养物或静止(stationary)培养物，其中钩端螺旋体处于停滞期，或者处于收获的或储存的培养物中。

包含钩端螺旋体细菌的组合物可以是液态的、固态的或半固态的、冷冻的、或冻干的。组合物可以是培养基、或储存培养基，并且可以包含稳定剂、或另一种药学可接受的添加剂或载体。这种培养物尤其包含细胞悬液。

在优选的实施方案中，用于根据本发明方法的培养物是液态形式，因为这便于钩端螺旋体吸收多不饱和C18脂肪酸。

对本发明来说，本文使用的术语“包含(comprising)”(以及变形形式例如comprise, comprises和comprised)指使用该术语的文字章节、段落、权利要求等所覆盖或包括的所有要素，且是以本发明能想到的任何可能的组合方式，即使并没有明确列举这些要素或组合；并且不排除任何这种要素或组合。因此，任何这种文字章节、段落、权利要求等也可以涉及一个或多个实施方式，其中术语“包含”(或其变形形式)被替换为术语例如“由……组成(consist of, consisting of)”或“基本上由……组成(consistessentially of)”。

对于本发明，“补充”具有其一般含义：加入以补缺，或强化或扩充某些物质(来自：American heritage dictionary, ed. Houghton Miflin Co., Boston, USA)。

在根据本发明方法中，补充多不饱和C18脂肪酸的方式，原则上没有限制，只要能达到所述方法的效果：抗原量的相对提高。因此，对于根据本发明的方法，可以通过向钩端螺旋体的已有培养物单次地、重复地、或连续地加入来补充多不饱和C18脂肪酸。或者，可以通过在建立本发明的钩端螺旋体培养物的时候提供特定浓度的多不饱和C18脂肪酸，从而实现根据本发明方法中向钩端螺旋体培养物的补充。例如向接种并增殖钩端螺旋体培养物的培养基中，或者向保存或处理钩端螺旋体培养物的洗涤、储存、或温育培养基中提供特定浓度的多不饱和C18脂肪酸。

而且，多不饱和C18脂肪酸的补充可以是在钩端螺旋体的生命周期的不同时间点，例如在活跃增殖培养物的早期、中期或晚期，或者在储存样品中；以及在不同的细菌细胞密度下。

多不饱和C18脂肪酸可以是不同的形式，并且可以以不同的方式补充。这些条件的变化和优化的选择在本文中进行描述和例示，并且完全在技术人员的常规能力范围之内。

在优选的实施方案中，通过向增殖的钩端螺旋体培养物中加入多不饱和C18脂肪酸，并且是随时间逐渐加入来实现根据本发明方法的补充。

对本发明来说，“多不饱和C18脂肪酸”指化合物，其是脂肪酸或其衍生物，还可以是混合物或复合物中的多不饱和C18脂肪酸，或者相对富含多不饱和C18脂肪酸的化合物或组合物。如果化合物或组合物包含的多不饱和C18脂肪酸的量为其脂肪酸总量的至少约5%，则该化合物或组合物“相对富含”多不饱和C18脂肪酸。优选为其脂肪酸总量的至少约10、15、20、 25、30、40、50%，按优先顺序排列。

脂肪酸含量，以及单独脂肪酸相对量的差异的确定，可以由技术人员按常规实现，例如通过提取和气相色谱。用于根据本发明方法的，富含多不饱和C18脂肪酸的化合物和组合物的实例，在下面描述。

术语“多不饱和C18脂肪酸”以其一般含义使用，涉及具有含18个C原子的烃链的脂肪酸，其中烃链含有超过一个双(不饱和)键。

本领域已知的是共轭多不饱和C18脂肪酸，其由细菌如反刍动物瘤胃中的乳酸杆菌生产(因此不消耗)。

在优选的实施方案中，用于本发明的多不饱和C18脂肪酸是非共轭的。

在进一步优选的实施方案中，用于本发明的多不饱和C18脂肪酸是亚甲基中断多烯(methylene interrupted polyene)，不是分枝的，和/或不限于环烷环。

在更进一步优选的实施方案中，用于本发明的多不饱和C18脂肪酸是ω3- 或ω6多不饱和C18脂肪酸。

在仍进一步优选的实施方案中，用于本发明的多不饱和C18脂肪酸是选自C18:2、C18:3、和C18:4组成的组的一种或多种。

在最优选的实施方案中，用于本发明的多不饱和C18脂肪酸是选自亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、或亚麻油酸组成的组的一种或多种。

“亚油酸”是C18:2, n-6, δ 9,12-脂肪酸，其学名：9, 12-十八碳二烯酸，以及CASnr.: 60-33-3。优选它的两个双键都是顺式的。

亚麻酸是C18:3脂肪酸，有两种同分异构形式：α-亚麻酸，和γ-亚麻酸。

“α-亚麻酸”是C18:3, n-3, δ 9, 12, 15-脂肪酸，其学名：9, 12, 15-十八碳三烯酸，以及CAS nr.: 463-40-1。优选它的所有双键都是顺式的。

“γ-亚麻酸”是C18:3, n-6, δ 6, 9, 12-脂肪酸，其学名：6, 9, 12-十八碳三烯酸，以及CAS nr.: 506-26-3。优选它的所有双键都是顺式的。

“亚麻油酸”是C18:4, n-3, δ 6, 9, 12, 15-脂肪酸，其学名：6, 9, 12, 15-十八碳四烯酸，以及CAS nr. 20290-75-9。亚麻油酸也称为4,8,12,15-十八碳四烯酸(moroctic acid)。优选它的所有双键都是顺式的。

多不饱和C18脂肪酸可以是天然来源或合成来源的，并且可以是分离状态的或具有任何纯度。多不饱和C18脂肪酸还可以与其它化学基团结合、偶联或酯化。所有这些形式都是可以的，只要多不饱和C18脂肪酸对于钩端螺旋体培养物来说是生物可利用的，并且可以获得根据本发明方法的效果。优选地，多不饱和C18脂肪酸是对钩端螺旋体培养物没有过大的毒性，并且可以用于含水培养物条件的背景下。

通过本文提供的细节和实施例，技术人员可以容易地确定多不饱和C18脂肪酸、衍生物、或者含有多不饱和C18脂肪酸的化合物或组合物是可用于根据本发明的方法中，还是有很大的毒性或不便利。例如通过对代表性小规模钩端螺旋体发酵中的这种脂肪酸、衍生物、化合物或组合物进行测试，并确定特定细胞数量的钩端螺旋体LPS抗原量，并将其与没有补充含多不饱和C18脂肪酸的化合物或组合物的类似钩端螺旋体培养物的细胞的抗原量相比较。

用于本发明的多不饱和C18脂肪酸、衍生物、化合物和组合物的实例是：来自所有主要生化供应商的可获得的各种纯度的多不饱和C18脂肪酸。多不饱和C18脂肪酸还可以与载体分子结合或复合，例如蛋白质或蛋白质复合物(例如血清或白蛋白，酶(乙酰-CoA)，或者与甘油或胆固醇酯化，或者作为脂蛋白、磷脂(与磷酸盐结合)，或者糖脂、或脂多糖(与碳水化合物部分结合))。多不饱和C18脂肪酸还可以在其它脂肪酸的组合物中作为较少的游离酸成分存在。或者多不饱和C18脂肪酸可以存在于相对富含多不饱和C18脂肪酸的化合物或组合物，例如植物(种籽)油中。

由于脂肪酸在含水介质中通常是难溶的，可以将多不饱和C18脂肪酸、衍生物、相对富含多不饱和C18脂肪酸的化合物或组合物制成制剂，以便于将其补充到钩端螺旋体培养物中，以使其是生物可利用的或保持其生物可利用性。例如多不饱和C18脂肪酸可以是物理分散的、或化学乳化的、或与溶剂混合。它可以与载体例如纤维素、环糊精、或胆固醇组合，或者使用上述的BSA或血清；或者多不饱和C18脂肪酸可以通过颗粒吸附剂如Celite®or Amberlite® (Spector & Hoak, supra)递送。

在根据本发明的方法中，向钩端螺旋体培养物补充多不饱和C18脂肪酸的有利方式，是向培养物补充BSA，其经生产而包含大量的多不饱和C18脂肪酸。

因此，在根据本发明方法的优选实施方案中，以与BSA的复合物的形式补充多不饱和C18脂肪酸。

可以通过简单的共温育将多不饱和C18脂肪酸装载到BSA上，直到BSA中的多不饱和C18脂肪酸达到饱和。脂肪酸与BSA的结合依赖于温度和pH，如本领域所知，并描述在Spector & Hoak (如上)，和Ashbrook等人(1975, J. of Biol. Chem., vol. 250, p.2333)中。BSA上多不饱和C18脂肪酸的装载水平可以方便地通过气相色谱来分析，如下所述。BSA可以承载多少多不饱和C18脂肪酸取决于BSA的类型和质量，以及已经结合的脂肪酸的数量。如果希望达到多不饱和C18脂肪酸的最大载量，可以首先通过提取使BSA去脂，然后仅用多不饱和C18脂肪酸重新装载。在钩端螺旋体培养物中，可以使用装载有(额外的)多不饱和C18脂肪酸的BSA，来代替培养基中已经使用的BSA或血清，或者除了培养基中已经使用的BSA或血清之外，额外使用装载有(额外的)多不饱和C18脂肪酸的BSA。

发明人已发现对于根据本发明的方法，使用所生产的含有至少约10% w/w的脂肪酸为多不饱和C18脂肪酸的BSA，可以实现有效的补充。

因此，对根据本发明的方法，用于补充多不饱和C18脂肪酸的优选组合物是包含至少约10% w/w游离脂肪酸为多不饱和C18脂肪酸的BSA制备物；优选包含至少12、15、18、20、21、23、25、30、35、40、50、60、70、75、80、90、95、或99% w/w的游离脂肪酸为多不饱和C18脂肪酸，按优先顺序排列。

技术人员将会理解，当根据本发明方法，使用BSA制备物向钩端螺旋体培养物补充多不饱和C18脂肪酸时，这会增加培养物的蛋白质载量，并因此而增加所产生的疫苗的蛋白质载量。这可能对疫苗副作用的水平有影响。因此，这种培养物可能需要纯化步骤以除去过量的蛋白质。但是，由于无论如何通常都应用这种纯化，因此，补充与BSA或血清的复合物中的多不饱和C18脂肪酸是提高钩端螺旋体培养物的抗原量的非常有效方式。

根据本发明的方法，可以以不同的方式向钩端螺旋体培养物补充多不饱和C18脂肪酸(-制备物)，例如作为分次(pulse)，或者随时间逐渐加入。分次补充例如可以是在约1小时内补充所有多不饱和C18脂肪酸，并且在培养物是静置的情况下，这可能是最适合的。对于增殖的钩端螺旋体培养物，最适合的补充是逐渐补充，其意味着在大约1至大约6个小时之间的时间段加入所有多不饱和C18脂肪酸。增殖培养物的分批补充式补充，意味着在培养的大部分时间中一直在进行多不饱和C18脂肪酸(-制备物)的补充。

在根据本发明方法的优选实施方案中，以逐渐地或分批补充的模式对钩端螺旋体增殖培养物进行补充。

如根据本发明的方法，要被补充到培养物中以获得抗原量的相对提高的多不饱和C18脂肪酸的量，大体上仅仅受到实用角度、经济角度、生物学角度可行性的限制。例如从实用角度的是，具有增殖培养物的发酵罐容器不应多次打开以加入补充物质，因为这会危及安全运行和其无菌性。另一方面，当要进行补充的培养物不是正在活跃增殖时，例如终点培养物、或储存培养物，则污染的风险比在增殖培养物小得多。从经济角度的考虑是例如补充大量纯多不饱和C18脂肪酸，或专门的多不饱和C18脂肪酸-组合产品的物质成本。生物角度的考虑是游离脂肪酸可能对活细胞有毒性，虽然这对于静置培养物来说问题不大。因此，当要在短时间内向增殖培养物中补充大量的多不饱和C18脂肪酸时，必须注意减轻或防止脂肪酸对钩端螺旋体的毒性，例如提供复合物形式的多不饱和C18脂肪酸以减少毒性，如上所述。或者，可以随时间逐渐补充多不饱和C18脂肪酸。

要考虑的其它参数是每个具体实例的条件：量、状态、和钩端螺旋体的类型，以及温育介质、时间、pH等。在本发明的方法中，根据本文的详细说明和实施例，改变并优化向钩端螺旋体培养物中补充多不饱和C18脂肪酸的量和方式在技术人员力所能及的范围内。

培养物中的钩端螺旋体似乎会尽快消耗多不饱和C18脂肪酸。参见例如图2、3和13、14，其说明亚油酸和亚麻酸非常快地被消耗掉并转化为抗原量，这与棕榈酸和油酸相反。这意味着在这种培养物中产生的抗原量总量是温育过程中培养物可利用的多不饱和C18脂肪酸的累积总量的结果。对本发明来说，因此，所指出的补充到培养物中的多不饱和C18脂肪酸的量是指在钩端螺旋体培养物增殖或温育期间可利用的多不饱和C18脂肪酸的总量，犹如所有多不饱和C18脂肪酸在单个时间点都是可利用的那样。其以基于培养物总体积的浓度表示。这与包含多不饱和C18脂肪酸的混合物的形式或体积无关，并且包括由所有培养基组分制造的附加物。

因此，技术人员应当理解，通常不可能实际测量向钩端螺旋体培养物提供的多不饱和C18脂肪酸的总浓度。一方面因为它是随着时间并且由不同组分制造的多不饱和C18脂肪酸贡献的累积数量。另一方面因为在取样时刻之前钩端螺旋体培养物已经吸收并处理了它的一部分。

例如，发明人证明当根据本发明方法向钩端螺旋体培养物补充亚油酸，例如使每ml培养物中有25 µg亚油酸可利用时，与仅有约5 µg/ml可利用的培养物相比，可以实现抗原量的显著提高。

对于亚麻酸同样适用，虽然标准EMJH培养基含有可忽略不计的量的C18:3。因此，基本上，向钩端螺旋体培养物补充任何量的C18:3已经对其抗原量/生物量比率是有利的。在实践中，加入的C18:3的量可以从约5 µg/ml开始。

可利用的多不饱和C18脂肪酸的量越大，越能提高抗原量。在钩端螺旋体培养物中多不饱和C18脂肪酸为所测试的最大可利用水平，即超过300 µg/ml的情况下，对于某些血清型来说有一些显著的毒性。但是，这种效果是在使用纯多不饱和C18脂肪酸的制备物进行补充的时候观察到的，且可以通过以复合物的形式对多不饱和C18脂肪酸进行适当的脱毒来克服，如上所述。

因此，在一个实施方案中，本发明提供提高钩端螺旋体培养物的抗原量的方法，所述方法包括在至少有15 µg/ml亚油酸、和/或至少5 µg/ml亚麻酸为所述培养物可利用的条件下温育所述钩端螺旋体培养物的步骤。

如下所述，还可以组合补充不同的多不饱和C18脂肪酸 -如上所定义的- 在钩端螺旋体培养物中产生累积效果。因此，为钩端螺旋体培养物可利用的多不饱和C18脂肪酸的总量，可以是基于组合的不同多不饱和C18脂肪酸的量的总和。

因此，在根据本发明方法的优选实施方案中，所述方法包括在至少有15 µg多不饱和C18脂肪酸/ml为所述培养物可利用的条件下温育钩端螺旋体培养物的步骤。更优选的是有至少16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、35、37、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或至少100 µg多不饱和C18脂肪酸/ml为所述培养物可利用，按优先顺序排列。

在根据本发明方法的进一步优选的实施方案中，所述方法包括在有大约15和1000µg 之间的多不饱和C18脂肪酸/ml为所述培养物可利用的条件下，温育钩端螺旋体培养物的步骤。更优选的是有大约20和500 µg/ml之间的、大约20和300 µg/ml之间的、或大约25和250 µg多不饱和C18脂肪酸之间/ml为所述培养物可利用，按该优先顺序排列。

在本发明的一个实施方案中，提供提高钩端螺旋体培养物的抗原量的方法，所述方法包括在有至少15 µg多不饱和C18脂肪酸/ml为所述培养物可利用的条件下，向所述钩端螺旋体培养物补充多不饱和C18脂肪酸的步骤；其中所述钩端螺旋体是选自问号钩端螺旋体(广义)犬群、黄疸出血群、澳洲群、感冒伤寒群、波摩那群、塔拉索夫群、赛卓群和秋季群的至少一种血清群；并且其中所述钩端螺旋体培养物的抗原量与没有补充多不饱和C18脂肪酸的类似钩端螺旋体培养物的抗原量相比，提高至少20%。

在进一步的方面，本发明提供根据本发明方法可获得的钩端螺旋体培养物，其中所述钩端螺旋体培养物具有提高的抗原量。

根据本发明的这种钩端螺旋体培养物与现有技术的钩端螺旋体培养物的区别在于该钩端螺旋体培养物的抗原量显著提高，这是由于补充了多不饱和C18脂肪酸导致的，如根据本发明的方法中的。如所述的，提高的抗原量可以容易地检测和定量：20%或更多的抗原量的提高是显著的，并且是可检测到的，如上所述。

抗原量的增加是相对于类似条件下的、但没有补充多不饱和C18脂肪酸的类似钩端螺旋体培养物的抗原量而言的，如根据本发明的方法中的，如上所述。

因此，根据本发明的钩端螺旋体培养物的特征在于所述钩端螺旋体培养物的抗原量与没有补充多不饱和C18脂肪酸的相似钩端螺旋体培养物的抗原量相比，提高至少20%。

更优选根据本发明的钩端螺旋体培养物的特征在于所述钩端螺旋体培养物的抗原量与没有补充多不饱和C18脂肪酸的类似钩端螺旋体培养物的抗原量相比，提高至少22、24、25、28、30、35、40、45、50、63、77、90、100、121、150、175、184、或至少200%，按优先顺序排列。

根据本发明的钩端螺旋体培养物可由根据本发明的方法获得，如所述，例如通过向钩端螺旋体的增殖-或静止培养物、或收获的培养物补充多不饱和C18脂肪酸、衍生物、或者相对富含多不饱和C18脂肪酸的化合物或组合物。这具有几种有利的实用性，其中包括在钩端螺旋体病疫苗中的有利实用性。

在进一步的方面，本发明涉及根据本发明的钩端螺旋体培养物、或所述培养物的制备物、用于钩端螺旋体病疫苗。

根据本发明，用于钩端螺旋体病疫苗的优选钩端螺旋体培养物是根据本发明的钩端螺旋体培养物的灭活形式。

对于本发明来说，根据本发明的钩端螺旋体培养物的“制备物”，可以是这种培养物的一部分，例如提取物、超声波降解物、或滤液、或来自根据本发明的钩端螺旋体培养物的亚基，例如含有LPS的外膜的一部分、纯化的LPS、或所述LPS的一部分。

因此，在本发明的进一步的方面提供钩端螺旋体病的疫苗，其包含根据本发明的钩端螺旋体培养物、或所述培养物的制备物。

本发明的“疫苗”是一种药物组合物，其包含免疫有效量的根据本发明的钩端螺旋体培养物(的制备物)，和药学可接受的载体。疫苗诱导对钩端螺旋体病的有效免疫应答。

“药学可接受的载体”是要有助于药学活性化合物的有效施用，对施用目标的健康又不引起(严重的)不良反应。药学可接受的载体可以例如是无菌水或无菌生理盐水。在更复杂的形式中，载体可以是例如缓冲液，其可以包含其他助剂，例如稳定剂或防腐剂。

根据本发明的钩端螺旋体病疫苗的钩端螺旋体组分，将会在目标人或动物中诱导免疫应答，该免疫应答会辅助预防、改善、或减少钩端螺旋体感染，或者由于感染钩端螺旋体引起的钩端螺旋体病的临床症状的强度。这可能是减少钩端螺旋体定植或减少钩端螺旋体感染率的结果，导致由钩端螺旋体引起的或由目标对其的反应引起的损伤和效果的数量或严重程度的降低。此外，这还将减少钩端螺旋体的(尿)***，以及由此向环境的传播，这减少了人畜共患感染传染的机会。

根据本发明的钩端螺旋体病疫苗的免疫有效量依赖于所期望的效果和所使用的疫苗的具体特性，以及要应用的目标。对于基于菌苗的钩端螺旋体病疫苗来说，基本上是由体液免疫应答发挥作用，比抗原量和疫苗在目标中的免疫保护强度之间的关系是众所周知的。因此，有效量的确定完全在常规工作人员的技能范围内，例如通过监测接种后的免疫应答，或者在攻毒感染之后，例如通过监测目标的疾病临床症状、血清学参数，或者通过重新分离病原体，以及将这些与在未经接种的动物中观察到的应答相比较。

在优选的实施方案中，根据本发明的疫苗另外包含稳定剂，例如以保护易于降解的组分，和/或增加疫苗的保质期。通常这种稳定剂是高分子量的大分子，例如脂类、碳水化合物、或蛋白质；例如奶粉、明胶、血清白蛋白、山梨醇、海藻糖、亚精胺、右旋糖苷或聚乙烯吡咯烷酮、以及缓冲剂，例如碱金属磷酸盐。

优选稳定剂不含动物来源的化合物，或者甚至是：以化学方法定义的，如WO 2006/094,974中所公开的。

还可以加入防腐剂，例如硫柳汞、酚类化合物、和/或庆大霉素。

疫苗学中的一般技术和程序在本领域中是众所周知的，并且在例如政府规定如药典、和公知的手册如：“Veterinary vaccinology” (P. Pastoret等人ed., 1997,Elsevier, Amsterdam, ISBN: 0444819681)和“Remington: the science and practiceof pharmacy” (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472)中描述。

根据本发明的疫苗的目标受试者可以是易受钩端螺旋体感染的人或多种动物。优选的目标是选自下列的一种或多种：人、犬、猪、牛、马、山羊、绵羊和鹿。原则上，目标可以是健康的或患病的，并且对于钩端螺旋体或钩端螺旋体抗体的存在来说可以是阳性的或阴性的。目标还可以是对接种敏感的任何年龄的。但是，显然有利的是给健康的、未感染的目标接种，并且尽可能早地接种以预防任何方面的感染。

根据本发明的疫苗可以作为有效的初免接种，其随后可以进行加强接种并通过加强接种而增强。

根据本发明的疫苗可以等同地用作预防用药和用作治疗用药，因为它能干扰钩端螺旋体感染或其疾病临床症状的发生和发展。

根据本发明的疫苗应用于目标的方案可以是单次剂量或多剂量，多剂量可以同时给予或顺序给予，以与剂量或制剂相容的方式，并且以免疫有效量给予。

根据本发明疫苗的施用方案理想地是统一到目标可能需要的其它疫苗的现有接种时间安排中。

根据本发明的疫苗优选以每年一次的剂量应用。

根据本发明的疫苗可以含有一定量的来自根据本发明培养物的钩端螺旋体、或一定量的其制剂，其相应于每剂量1x10⁶和1x10¹⁰个细菌细胞之间；优选每剂量1x10⁷和5x10⁹之间。

根据本发明的疫苗可以以符合目标的体积施用，且可以是例如按体积计算大约0.1和10ml之间。优选一剂量在大约0.25和3 ml之间。

可以根据本领域已知的方法将根据本发明的疫苗给目标施用。例如通过任何方式注射到皮肤中或者注射穿过皮肤的肠胃外应用：例如肌肉内、静脉内、腹膜内、皮内、粘膜下、或皮下。可供选择的可行的应用方式是局部施用、吸入、或通过食物的方式。

优选的应用方式是肌内或皮下注射。

不言而喻，最佳的应用方式将依赖于所使用的具体疫苗制剂、和目标的特定性质。

对根据本发明的疫苗的进一步优化完全在技术人员能力所及的范围内。通常这涉及疫苗效力的微调，以使其能提供足够的免疫保护。这可以通过调整疫苗剂量、或者通过使用另一种形式或制剂的疫苗、或者通过调整疫苗的其它成分(例如稳定剂或佐剂)、或者通过以不同的方式应用来实现。

疫苗可以另外包含其他化合物，例如佐剂、其它抗原、细胞因子等。或者，根据本发明的疫苗可以有利地与药物组分进行组合，例如抗生素、激素、或抗炎药物。

在优选的实施方案中，根据本发明的疫苗的特征在于它包含佐剂。

“佐剂”是众所周知的疫苗成分，其通常是以非特异方式刺激目标的免疫应答的物质。本领域已知许多不同的佐剂。佐剂的实例是弗氏完全和不完全佐剂、维生素E、铝组合物、非离子嵌段聚合物和聚胺如硫酸葡聚糖、Carbopol®和吡喃。

而且，肽例如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸、促吞噬素常用作佐剂，并且可以有利地使用矿物油例如Bayol™或Markol™、Montanide™或轻质石蜡油、植物油或组合产物例如Seppic™的ISA™、或DiluvacForte™。乳液可以是油包水(w/o)、水包油(o/w)、水包油包水(w/o/w)、双油乳液(DOE)等。

根据本发明的疫苗的优选佐剂是氢氧化铝、或皂苷(Saponin)，例如：Quil A®、或Q-vac®。皂苷和疫苗组分可以组合为ISCOM®中 (EP 109.942、EP 180.564、EP 242.380)。

不言而喻，加入佐剂、加入载体化合物或稀释剂、乳化或稳定疫苗的其它方式也在本发明的范围内。

根据本发明的疫苗可以有利地与另一个抗原组合成为组合疫苗。

因此，在更优选的实施方案中，根据本发明的疫苗的特征在于其包含其他的免疫活性组分。

“其他的免疫活性组分”可以是抗原、免疫增强物质、和/或疫苗，其每一个都可以包含佐剂。当其是抗原的形式时，免疫活性组分可以由人的或在兽医上重要的任何抗原性组分组成。优选其他的免疫活性组分是基于，或来自于对目标致病的其它微生物。例如其可以包含生物或合成分子如蛋白质、碳水化合物、脂多糖、编码蛋白性抗原的核酸。包含这种核酸的宿主细胞、含有这种核酸的活的重组载体微生物也可以作为递送核酸或其它免疫活性组分的途径。或者，其可以包含微生物级分或灭活的微生物，所述微生物例如寄生虫、细菌或病毒。

其它的免疫活性组分还可以是免疫增强物质，例如趋化因子、或免疫刺激核酸，例如CpG基序。或者，可以将根据本发明的疫苗本身加入到疫苗中。

对本发明来说，组合疫苗的一个有利的应用是它不仅诱导针对钩端螺旋体的免疫应答，而且还诱导针对目标的其它病原体的免疫应答，而仅需要对目标进行一次接种处理，由此减少了目标的不适，还减少了时间和劳动力成本。

这种其它免疫活性组分的实例基本上都是适合于给目标接种的病毒、细菌和寄生虫病原体，所述目标也是根据本发明的钩端螺旋体疫苗的目标。

例如，对于猪：猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪肺炎支原体、胞内劳森氏菌、大肠杆菌、链球菌、沙门氏菌、梭状芽孢杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、巴斯德菌、嗜血杆菌、丹毒丝菌、博德特菌等。

对于牛：新孢子虫、网尾线虫、隐孢子虫、奥斯特线虫、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒(牛疱疹病毒)、牛副粘病毒、牛副流感病毒、牛呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、蓝舌病病毒、溶血巴斯德菌、大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、分枝杆菌、布鲁氏菌、梭状芽孢杆菌、曼氏杆菌、嗜血杆菌、梭菌等。

对于绵羊和山羊：刚地弓形虫、小反刍动物瘟病毒、蓝舌病病毒、施马伦贝格病毒、分枝杆菌、布鲁氏菌、梭状芽孢杆菌、柯克斯氏体、大肠杆菌、衣原体、梭状芽孢杆菌、巴斯德菌、曼氏杆菌等。

对于犬或猫：埃立克体、杜氏利什曼原虫复合体、犬新孢子虫、犬瘟热病毒、1型或2型犬腺病毒、犬肝炎病毒、犬冠状病毒、犬副流感病毒、狂犬病毒、猫杯状病毒、猫疱疹病毒、猫全白细胞减少症病毒、梭菌、肝簇虫、伯氏疏螺旋体、支气管炎博德特菌、衣原体、和巴贝西虫或泰勒虫的种。

对于人：疟原虫、利什曼虫、弓形虫、水痘-带状疱疹病毒、HIV、人***瘤病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、狂犬病病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、肝炎病毒类、流感病毒、嗜血杆菌类、链球菌类、棒状杆菌类、博德特菌类、奈瑟氏菌和梭菌。

在可供选择的实施方案中，本发明的组合疫苗可以有利地将来自一个以上问号钩端螺旋体血清群的钩端螺旋体组合。例如，对于犬类目标：问号钩端螺旋体(广义)犬群和黄疸出血群；或者：问号钩端螺旋体(广义)犬群、黄疸出血群、澳洲群、和感冒伤寒群。在它们中，一种或多种可以是(来自于)根据本发明的钩端螺旋体培养物；优选所有都是(来自)根据本发明的钩端螺旋体培养物。

在本发明的组合疫苗的进一步优选的实施方案中，组合疫苗包含(除了其他的免疫活性组分之外)，一种或多种相应于一种以上问号钩端螺旋体血清群的钩端螺旋体。例如对于猪类目标，组合疫苗可以包括：问号钩端螺旋体(广义)犬群、黄疸出血群、澳洲群、感冒伤寒群、波摩那群和塔拉索夫群，以及红斑丹毒丝菌和猪细小病毒。在这个组合中，一种或多种钩端螺旋体是根据本发明的钩端螺旋体培养物；优选所有都是根据本发明的钩端螺旋体培养物。

根据本发明，出于实用和过程控制的原因，有利的是以单独培养物的形式生产这种组合疫苗中的每一种钩端螺旋体抗原。这是因为这样每一种都可以其特定优化条件来生产。制备下一个单独的疫苗抗原，然后将不同的钩端螺旋体抗原组合。

在进一步的方面，本发明涉及根据本发明的钩端螺旋体培养物、或者所述钩端螺旋体的制备物的应用，用于制造钩端螺旋体病疫苗。

通过技术人员众所周知的方法实现本发明疫苗的“制造”。这种制造通常包括将根据本发明的钩端螺旋体培养物、或其制备物与药学可接受的赋形剂混合并进行配制的步骤，然后分装到尺寸合适的容器中。制造过程的各个阶段需要通过足够的测试来监控，例如通过免疫测试监控抗原的质量和数量；通过微生物测试来监控无菌性和外来试剂的存在与否；并且最终通过体外或体内实验确定疫苗的效力和安全性。所有这些都是技术人员熟知的。

根据本发明的疫苗可以制造成适合于给人或动物目标施用，并与所希望的应用方式和所希望的效果相匹配的形式。

众所周知的疫苗形式是例如：液体、凝胶、油膏、粉末、片剂、或胶囊剂，这取决于所希望的对目标的应用方法。优选根据本发明的疫苗配制成可注射液体，例如混悬液、溶液、分散液、或乳液。通常将这些疫苗制成无菌的。

在一个实施方案中，根据本发明的疫苗是基于灭活的根据本发明的钩端螺旋体培养物。对于本发明来说，现在可以使用众所周知的技术制造这种基于菌苗的灭活疫苗。

因此，在进一步的方面，本发明提供了生产钩端螺旋体病疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：

a. 在体外***中使钩端螺旋体培养物增殖，

b. 向所述钩端螺旋体培养物补充多不饱和C18脂肪酸，

c. 灭活并收获所述补充的钩端螺旋体培养物，以及

d. 将灭活的钩端螺旋体培养物与药学可接受的载体混合。

根据众所周知的钩端螺旋体病疫苗的增殖、灭活和配制程序实施该方法。还可以如现有技术进行收获，除了现在比现有技术在收获的时间点上有更多的选择：当需要现有技术水平的抗原量时，现在可以比以前更早进行收获。

或者，当希望获得最大的抗原量时，可以首先允许培养物增殖到其最大生物量，如以前那样，只是现在当如根据本发明的方法向培养物中补充多不饱和C18脂肪酸时，产生显著更多的抗原。

术语“增殖”具有使钩端螺旋体细菌能够并诱导其经过多个细胞***循环的一般含义。本发明的增殖包括类似术语的含义，所述类似术语指细胞数量和细胞尺寸的增加，例如“生长”、“培养”、或“扩增”。增殖阶段之前是接种，并且在此之前依次是菌株筛选、预调整(pre-conditioning)、和/或预增殖。

“体外***”是在人体或动物体之外，在人为控制条件下，对钩端螺旋体细菌进行有意增殖的公知途径。这通常使用恒化器或发酵罐，以及(半)合成培养基。常规地，在适当的时候监测并调整几个关键的发酵参数，并且这甚至可以是自动化的。任何规模的体外细菌细胞增殖***的技术、材料和设备是众所周知的，并且可以容易地从生命科学工业的许多供应商那里获得。

在根据本发明的疫苗的生产方法的优选实施方案中，引入了中间步骤，其允许不连续地进行这个过程。在增殖和补充步骤之间引入中间步骤，并且中间步骤涉及在第一步中增殖的钩端螺旋体培养物的收获、储存和/或纯化。

因此，在优选的实施方案中，根据本发明的钩端螺旋体病疫苗的生产方法包括在第一步和第二部之间的附加步骤，所述附加步骤包括钩端螺旋体培养物的收获、储存和/或纯化。

该中间步骤允许对根据本发明的方法的增殖和补充阶段进行单独操作和优化。中间步骤以保持钩端螺旋体培养物的存活或生物化学完整性的方式进行，这种方式使得在该方法的进一步的步骤中有效利用它们。例如，可以通过离心或透析过滤进行收获。收获的结果是，钩端螺旋体可以是更浓缩的形式。可以在大约2和大约30 ℃ 之间的温度，在含水环境下进行储存。纯化可以包括增殖培养基的更新或替换，例如给后续步骤提供最优条件。这些操作的每一个都可以单独进行、组合进行、或随后进行、或者以任何逻辑顺序进行。

在根据本发明的方法中，向钩端螺旋体培养物补充多不饱和C18脂肪酸。但是，在低利润产品例如用于兽用疫苗的产品的生产中大规模使用超纯化学药品的多不饱和C18脂肪酸可能过于昂贵。因此在这些方法中使用的多不饱和C18脂肪酸可以以不同的形式或纯度补充，例如以衍生物或相对富含多不饱和C18脂肪酸的化合物或组合物的形式，如上所定义的。

因此，在本发明的进一步的方面，涉及相对富含多不饱和C18脂肪酸的化合物或组合物在根据本发明方法中的应用。

技术人员完全能够测试并选择相对富含多不饱和C18脂肪酸的化合物或组合物，并对它们在根据本发明方法中的应用进行优化。

用于根据本发明方法的多不饱和C18脂肪酸的一种非常经济的来源是植物油，因为公知这些油中的一些含有非常高水平的多不饱和C18脂肪酸，它们价格低廉，并且质量和纯度对于在本发明方法中的应用来说都是可以接受的。

因此，在根据本发明应用的优选实施方案中，相对富含多不饱和C18脂肪酸的化合物或组合物是植物油。

“植物油”是来自于植物的一部分的油，最经常是来自于果实和种籽，例如浆果、豌豆、豆类、谷物和坚果；或者来自：叶、茎、花、花蕾、根、或甜菜。这些植物油可以通过压榨、提取等从其植物原材料中提取出来；从古代已经知道获得和纯化植物油的方法。

相对富含亚油酸的植物油的实例列于表1中。其值以总脂肪酸含量的% w/w表示，并且是近似平均值，其可能随着植物种类和所使用的提取工艺而变化。参考：U.S.Department of Agriculture, National Nutrient Database for Standard Reference,release 24, September 2011。

表1：植物油中亚油酸的近似含量 (以总脂肪酸的% w/w表示)

(1) 在这些油的惯用名中，没有说明种籽，即使该油是从种籽获得的。

(2) 不关注该油的高油酸含量变体。

(3) 葡萄籽油的变体是Canola®油，其具有降低的芥酸含量。

(4) 亚麻籽(Linseed)也称为：亚麻籽(flax seed)。

还有，更多一些外来的非食物的植物(种籽)油富含亚油酸；例如来自以下种籽的油：火棘：总脂肪酸的70%；俄勒冈葡萄：52%；和撒尔沙植物：51%，(S. Özgül-Yücel 2005,J.A.O.C.S, vol. 82, p. 893)。

α亚麻酸的公知来源是来自以下的种籽油：芡欧鼠尾草、奇异果、紫苏、亚麻、***、越橘、油菊、橡胶、亚麻荠、马齿苋、沙棘、和油菜籽。

γ亚麻酸的公知来源是来自以下的种籽油：月见草、紫草、黑醋栗、红花、和***。

亚麻油酸的公知来源是来自以下的种籽油：***、黑醋栗、田紫草、和蓝蓟。

因此，对于本发明来说，总脂肪酸的至少25% w/w是多不饱和C18脂肪酸的植物油是优选的，更优选总脂肪酸的至少30、40、50、60、70、或者甚至至少75% w/w是多不饱和C18脂肪酸，按优先级排列。

根据本发明的钩端螺旋体培养物还可以有利地用于诊断方法中。其实例是在检测测试样品中钩端螺旋体特异性抗体或抗原的诊断测试中的应用。例如，根据本发明的钩端螺旋体培养物的制备物可以包被在板或载体上，或者可以用作捕获抗原。或者，该制备物可以用作具有高抗原量的标准参照抗原。

本发明将参照下述非限制性实例进行进一步描述。

实施例

1. 通用材料和方法

1.1. 钩端螺旋体的增殖

1.1.1 细菌菌株、培养基和预增殖

将问号钩端螺旋体的菌株的工作种子接种到EMJH培养基中并在29℃度温育3-5天。如果需要的话，可以进行多达5次的连续预培养传代，由此，对预培养就其充分增殖(浑浊度)进行目测观察，作为转移到下一次传代的标准。

NB：当用活钩端螺旋体进行工作时，必须采取适当的生物安全和污染措施。

1.1.2 主要发酵

所有的实验在0.5、2或20 L工作体积、计算机控制的发酵罐(Sartorius)中进行，其中分别装有0.5、1或10 L无菌过滤的EMJH培养基。标准EMJH培养基含有1% w/v BSA和0.125% w/v聚山梨醇酯80。起始时培养基的pH为7.4 ± 0.1。第0天用5% v/v血清群黄疸出血群的预培养物(第5代)接种发酵罐，给出为2-4 x10⁷个细胞/ml的接种密度。在接种的第5或6天当发酵停止时，最终产生的钩端螺旋体生物量通常是大约1-2 x10⁹个细胞/ml。

在所有发酵实验过程中，控制温度为大约29℃。在培养基顶部空间通入气流，通过搅拌速度的自动变化控制溶解氧(pO₂)浓度，以保持设定的pO₂浓度。在线监控温度、pH和pO₂浓度。但是不控制pH和泡沫形成。

在比较实验中，平行运行达4个发酵罐，它们用相同的培养基和钩端螺旋体接种物同时开始。随后，一个发酵罐通常仅含有EMJH培养基并作为参照，而在其它发酵罐中，进行不同的多不饱和C18脂肪酸的补充。

1.1.3 补充亚油酸

或者用作为纯乙醇中的10% v/v储液(JT Baker)的纯亚油酸(Sigma Aldrich, >99%纯)进行补充。或者，通过使用构建的具有高水平亚油酸的BSA (高LA BSA)补充亚油酸。使用这种高LA BSA替换EMJH培养基中的标准BSA，或者除了EMJH培养基中的BSA之外，还使用这种高LA BSA，在这种情况下，以无菌水中的25% w/v储液的形式加入。高LA BSA或纯亚油酸/乙醇补充物以0.1-0.2 ml/小时历经4小时的过程给料到发酵罐中，速度为，直到发酵罐培养物已经接收到所希望的亚油酸总量。已测试了不同的亚油酸总可利用水平，在按总体积计大约5和425 µg/ml之间。以不同的细胞密度，即在早期、中期、或末期培养阶段，补充钩端螺旋体的发酵罐培养物。通常中期细胞密度为大约5x10⁸个细胞/ml，其在主要温育的第2天期间达到。在用来自乙醇储液中的纯亚油酸的亚油酸进行补充之后，有时会观察到pH的微微下降，这可以通过使用一些NaOH来修正。

1.1.4 取样和离线分析

每天直接从发酵罐中无菌地取5 ml样品，以进行总细胞计数(通过Petroff-Hausser计数室)；抗原量(通过抗原量ELISA)；灭活细胞的分析；并进行培养基中脂肪酸类型和相对数量(通过气相色谱)的剖析。

在29℃用0.1或0.2 % v/v BPL对样品灭活16-24小时。在24小时内在抗原ELISA中对灭活的钩端螺旋体进行测试。

1.2. 抗原ELISA

在抗原ELISA中确定钩端螺旋体LPS抗原的抗原量，其是基于一组血清群或血清型特异的凝集性小鼠单克隆抗体(moabs)，该抗体自WHO/FAO/OIE和National CollaboratingCentre for Reference and Research on Leptospirosis, Department of BiomedicalResearch, Royal Tropical Institute, Amsterdam, The Netherlands获得。所使用的moabs列于表2中。参考文献参见：R. A. Hartskeerl等人，(International course onlaboratory methods for the diagnosis of Leptospirosis, 4th Edition, 1 April2004. Royal Tropical Institute, Amsterdam)。

ELISA设置为捕获测定，其中使用相同的moab进行包被和检测。

表2：问号钩端螺旋体(广义)的抗原ELISA使用的Moabs。

血清群	血清型	moab
			犬群	Portland-vere型	F152C11
黄疸出血群	哥本哈根型	F12C3
			澳洲群	布拉迪斯拉发型	F81C3
感冒伤寒群	Dadas型	F71C9
			波摩那群	波摩那型	F43C9
塔拉索夫群	Gatuni型	F151C8
			赛卓群	哈德焦型	F22C6

1.2.1 用于包被的单克隆抗体的制备

用于抗原ELISA的moabs可以来自于腹水或来自于细胞培养物。在使用前，这两种类型都要通过标准的非色谱方法进行纯化。简单来说：用辛酸沉淀白蛋白和其它非IgG蛋白。然后，用硫酸铵沉淀IgG级分。用此方法能够分离超过80%的IgG，其纯度等于通过阴离子交换色谱纯化的IgG。

或者，可以通过蛋白-G柱色谱纯化moabs。

1.2.2 制备缀合单克隆抗体

对于抗原ELISA，使用标准程序，由moabs制备辣根过氧化物酶(HRP)-IgG缀合物。基本上，反应包括对HRP酶的碳水化合物残基进行高碘酸氧化，以形成醛基，其然后与单克隆IgG分子的游离氨基基团反应。

1.2.3 抗原量参考标准的制备

为每一个进行抗原ELISA测试的钩端螺旋体菌株制备参照标准品。标准是一批来自灭活细胞的单价钩端螺旋体抗原。这是用普通技术制备的，基本上是通过如上所述的在EMJH培养基中增殖特定的钩端螺旋体菌株，并如前所述灭活。接下来将标准品浓缩和/或在磷酸盐缓冲液中稀释，以含有大约1x10⁹个细胞/ml。给样品规定任意数值抗原单位，例如1000单位/ml。当需要补充标准品时，在替换旧标准品之前，将相同标准品的后续制备物与旧标准品并排比较并滴定几次。

1.3. 脂肪酸分析

根据众所周知的程序，对钩端螺旋体细胞、培养基组分、以及完全EMJH培养基样品测试脂肪酸组成和-量。如Bligh & Dyer (1959, Can. J. of Biochem. Physiol., vol.37, p. 911)和Morrison & Smith (1964, J. of Lipid Res., vol. 5, p. 600)所公开的进行脂肪酸的提取。简短地说：测试0.5 ml样品，其含有纯的完全培养基，或钩端螺旋体细胞(每0.5 ml在1x10⁹和1x10¹⁰之间；细胞已经进行BPL灭活)或1% w/v的BSA样品的用水稀释的样品。通过混合3分钟，使用1 ml甲醇和2 ml氯仿对该0.5 ml进行提取。加入另外0.5ml水，混合30秒，并将样品在2-8℃以1.000xg离心10 min。将2 ml氯仿(下部的)相转移至玻璃瓶中，并在N₂气流条件下使氯仿干燥。将干燥的脂质重新溶解在0.6 ml甲醇中的BF3中，并在95℃加热15 min，使脂肪酸甲基化。接下来加入0.3 ml水和0.3 ml己烷，将其摇动混合，然后将己烷(上部的)相转移至标准气相色谱装置进行图谱和提取物中脂肪酸相对量的分析。使用已知浓度的C21:0脂肪酸(二十一酸)样品作为内标。通常样品测量一式两份，并且在玻璃容器中制备和测量样品。

2. 现有技术增殖条件的比较

作为比较实施例，分析在标准现有技术条件下(因此没有补充)的钩端螺旋体分批培养物中抗原量的形成。在已用聚山梨醇酯80 (Croda)、和标准市售BSA (Millipore)补充的标准EMJH培养基中培养血清群黄疸出血群的钩端螺旋体。在几轮预增殖之后，接种主要发酵罐培养物并运行5或6天。对于血清群黄疸出血群的钩端螺旋体，在平均经3-5天，当培养物是静止的时，在这些增殖条件下获得的抗原量，通常在每1x10⁹个细胞500和700抗原单位(的血清群黄疸出血群)之间。

当在内部体外效价测定中，测试这一批钩端螺旋体抗原时，没有达到所需要的最小效价水平。

在EMJH培养基中使用特别推荐用于钩端螺旋体培养物的市售BSA：BovoLep® BSA(Bovogen, Australia)，没有解决这一问题。随后，测试BovoStar®，来自同一制造商的标准通用BSA，且随后为在之前使用的BSA (Millipore)。结果显示于表3。“na”是：不可得。

有趣的是，BovoLep®确实提高了钩端螺旋体的生物量，如所宣传的那样，但是它对于它们的抗原量没有显著影响。这代表了直至今日的钩端螺旋体增殖的经典方法：重点在于生物量水平。

表 3：在EMJH培养基中使用不同BSA成分的结果：

发酵罐条件	C18:2总浓度µg/ml	第3天的细胞数量	Ag U/109个细胞/ml，第3天
				BSA, Millipore	5	1.6x109	525
BSA, BovoStar®	na	1.6x109	533
				BSA, BovoLep®	na	1.8x109	498

3. 多不饱和C18脂肪酸的效果

3.1. 亚油酸

只有在更多的亚油酸(C18:2)为钩端螺旋体培养物可利用的时候，抗原量才增加。

如上所测试和描述的，发现标准EMJH培养基提供大约5 µg/ml的亚油酸(参见表3)。这主要是来自于0.125%的聚山梨醇酯80，因为1%的标准BSA提供少于1 µg/ml的亚油酸，接近于气相色谱分析的检测限。

就这一点而言，聚山梨醇酯80，如药典所定义的，可以含有最多占其脂肪酸的18%的亚油酸。但是，实际上，发现它所携带的少得多，通常少于1.5%。对于一种常见类型的聚山梨醇酯80 (类型：蔬菜级，来自于：Croda, France)，本发明人在几年中比较了48个批次的亚油酸含量，并且发现亚油酸的平均量是总脂肪酸的大约0.3% w/w。假定聚山梨醇酯80基本由脂肪酸组成，那么EMJH培养基中使用的0.125% v/v的聚山梨醇酯80，向培养基提供大约4 µg/ml的亚油酸。

构建包含提高量的亚油酸的BSA。在EMJH培养基中使用1% w/v的这种高LA BSA向钩端螺旋体培养物提供大约21 µg/ml的亚油酸；加上聚山梨醇酯的贡献，这种培养基向钩端螺旋体的发酵罐培养物提供25 µg/ml的亚油酸。这增加了可利用的亚油酸的量，大大提高了钩端螺旋体抗原的产生，达到1636 Ag U/1x10⁹个细胞的抗原量(平均3-5天)。

以这种方式，本发明人已证明其发现的实用性：当钩端螺旋体中补充25 µg/ml亚油酸来代替5 µg/ml亚油酸时，钩端螺旋体培养物的抗原量能提高124%。

图1和2显示了使用在EMJH培养基中的高LA BSA，来自具有亚油酸补充的增殖钩端螺旋体培养物中每天取样的分析结果。在图1中，显示生物量(左侧纵轴)在增殖的所有六天中稳定提高。抗原量(右侧纵轴)达到的水平比在培养基中使用标准BSA能获得的水平高得多。尽管如此，在第3天后，抗原量没有提高多少。图2表明了原因，在该培养物的培养基的脂肪酸图谱中，明显证明亚油酸在这种背景下的相关性，结果以总脂肪酸的% w/w表示。请注意C16:0 (棕榈酸)、C18:0 (硬脂酸)、和C18:1 (油酸)的水平对应左侧纵轴，而C18:2 (亚油酸)的水平对应右侧纵轴。

图 2显示了在培养的过程中，培养基中C16:0、C18:0、和C18:1的量基本不变，其中来自聚山梨醇酯80的C18:1构成了脂肪酸总量的主体。但是，C18:2的水平在前三天中显示大幅下降，并且在第3-5天低于检测限(≤ 0.3 %)。亚油酸的耗尽与抗原产生提高上的减少同时发生，如图1所示。

3.2. 亚麻酸

在多批BSA或聚山梨醇酯80中，都无法检测到在气相色谱的检测限(大约0.6 µg/ml脂肪酸)以上的亚麻酸(C18:3)的异构体：α-或γ-。因此，标准完全EMJH培养基不含有任何显著量的C18:3。结果是，在所测试的向钩端螺旋体培养物补充亚麻酸的实验中，基本上所有的为培养物可利用的亚麻酸都来自于通过单独加入补充到培养物中的亚麻酸。

4. 向钩端螺旋体培养物进一步补充亚油酸

如果进一步补充亚油酸(C18:2)，抗原量可进一步增加。

在上述的类似培养物中，在第2天，在指数中期，用在乙醇中稀释的纯亚油酸来补充亚油酸。加入的亚油酸量在培养物中提供100 µg/ml的亚油酸。如图3的脂肪酸图谱所显示的，在快速初始阶段降低之后，且明显的尖峰是由第2天的补充造成的，在继续培养中亚油酸水平再次稳定降低。测定C16:0和C18:1脂肪酸的水平作为内参，但它们如所预期的基本不变。

在用于血清群黄疸出血群的钩端螺旋体的这个实验中，产生的抗原量是1767 Ag.U/1x10⁹个细胞 (平均3-5天)。

5. 在不同补充条件下的比较培养

在与前述实施例具有相同设置的更精细的实验中，来自血清群黄疸出血群的钩端螺旋体的比较发酵罐培养物平行运行，其中对亚油酸(C18:2)补充的不同条件进行比较。为了突出亚油酸补充的效果，在EMJH培养基中使用标准BSA。在一些发酵罐中，在指数中期补充亚油酸，以乙醇中的纯的形式，或者作为与BSA的复合物，通过高LA BSA溶液的添加。

补充的亚油酸量是50、75和150 µg/ml。表4还列出了为培养物可利用的亚油酸总量。

对于所有发酵罐，每天对细胞和培养基进行取样并分析。结果显示于图4和5，以及下述的表4。抗原量的值是基于第3-5天培养物的平均值。还将不同补充的抗原量的相对提高表示为相对使用标准BSA并且未补充的培养物的百分比。术语“未补充”指在EMJH中使用标准BSA的培养物。

表 4：不同的亚油酸补充对钩端螺旋体抗原量的影响

从表4和图4 (生物量)和5 (抗原量)的相应图中清楚看出，当给培养物补充亚油酸时，钩端螺旋体抗原量快速且显著地提高，这在未补充的培养物中没有观察到。补充亚油酸后生物量出现一些提高，但是抗原量的提高显著超过它。当给培养物补充150 µg/ml时，与补充75 µg/ml相比，抗原量的提高更多一点。但是，在以纯的形式，或以与BSA的复合物形式补充亚油酸时，二者之间没有多大差别。这可能是抗原量提高和某些毒性之间的权衡。

进一步的有利效果可以从图5中导出：现在可以通过补充亚油酸更快地达到提高的抗原量。例如，图5显示通过补充亚油酸，可以在补充后数小时内达到高抗原量。

此外，当比较最终获得的最大抗原量水平时，明显地，当补充的培养物与之前运行相同的时长时，则可以获得大大提高量的抗原量。

6. 不同血清群钩端螺旋体中亚油酸补充效果的确认

在下一项研究中，证明补充亚油酸(C18:2)之后抗原量的提高在钩端螺旋体中是普遍现象。在几个实验中，来自几种血清群的钩端螺旋体菌株培养物在与之前类似设置的发酵罐中增殖，并进行类似补充：在EMJH培养基中，使用标准BSA或高LA BSA；一些培养物进一步补充100 µg/ml亚油酸，来自于乙醇中的纯亚油酸。生物量和抗原量分析的结果显示于图6 - 7 (赛卓群)、和8 - 9 (感冒伤寒群)中，并总结于表5中。

对于血清群赛卓群(哈德焦血清型)的钩端螺旋体，补充100 µg/ml亚油酸的高LABSA培养基导致抗原量可观地提高184 %。在补充之后观察到一些生物量的提高，但是抗原量的提高大得多。发酵罐运行了6天，这些实验的数值是培养第5天和第6天的平均值。

对于血清群感冒伤寒群，数值是培养第4天和第5天的平均值。观察到抗原量提高63%，这是由亚油酸的补充导致的。

类似地，对于血清群澳洲群(布拉迪斯拉发血清型)，观察到抗原量增加45%；这里使用低LA BSA培养基用于补充。

表 5：对不同血清群钩端螺旋体补充亚油酸对抗原量的影响的确认

6.1. 钩端螺旋体血清群塔拉索夫群的补充

在与上述实施例6类似的补充中，测试了不同量的C18:2脂肪酸的补充对于具有标准BSA的EMJH培养基中钩端螺旋体血清群塔拉索夫群的培养物的生物量和抗原量的影响。结果显示于图11和12中。

尽管发现300 µg/ml C18:2的补充对于该培养物有毒性，100或200 µg/ml C18:2的补充确实使每单位生物量的抗原量产生了极大的提高：与未补充的参考培养物相比，分别提高67%和99%。

7. 最大补充水平

在一项研究中，研究了亚油酸(C18:2)补充的最大水平：在具有高LA BSA的EMJH中培养血清群黄疸出血群的钩端螺旋体，并额外补充100、200或400 µg/ml亚油酸，其来自于乙醇中的纯亚油酸。由结果明显可以看到加入400 µg/ml诱导了对细菌的毒性，因为补充之后细胞数量快速减少。因此，通过给予类似地高水平的亚油酸补充，但其来自于已由亚油酸饱和的BSA复合物中的亚油酸，重复该实验。100 µg/ml补充组的刺激效果之前已观察过，而200 µg/ml组给出了与100 µg/ml组相比略小的抗原量的提高。

因此，在这些条件之下，当使25和250µg/ml之间的亚油酸为钩端螺旋体培养物可利用时，使用纯亚油酸的补充看起来是最佳的。

8. 补充的时间点

在进一步的实验中，确定钩端螺旋体培养物补充的时间点的相关性。使用血清群黄疸出血群的钩端螺旋体，所测试的补充时间点是指数阶段的早期、中期和晚期。向具有标准BSA的EMJH培养基中补充100 µg/ml的乙醇中的纯亚油酸。因此为这些培养物可利用的亚油酸总量是105 µg/ml。

结果显示于表6和图10中。如图10所证明的，在钩端螺旋体培养物的所有阶段都能诱导抗原量的急剧提高，且在补充之后2、4和8小时已有非常快的攀升。在这种时间范围内，该提高主要是由生化过程导致的，而较少是由增殖导致的。

当较晚进行补充时所产生的抗原量看起来较少的事实，源自于亚油酸补充对于生物量的微小的正面效果。当表示为每标准细胞量的抗原量时，这就持平了，参见表6。

表 6：钩端螺旋体培养物增殖的不同阶段亚油酸补充的影响。

进行进一步时间点补充的测试：收获后、洗涤后和浓缩后。终点阶段培养物的温育可能需要培养基更新；尽管于此，估计对终点培养物的补充是最有利的，因为在该阶段，细胞数量最大，并仍然能够形成抗原量。除此之外，在这个阶段，补充的亚油酸的任何残余毒性是否会干扰细胞的增殖能力的相关性降低了，因为不再需要增殖。

9. 由补充的钩端螺旋体培养物制备的疫苗有提高的免疫效价的确定

已生产了补充亚油酸的钩端螺旋体培养物，如上所述。如本领域众所周知地将它们配制成灭活的加入佐剂的钩端螺旋体病疫苗，并在如药典专题中所规定的体内实验中进行测试。监测血清反应、攻毒保护、和不良接种反应的水平的效果。

因为对于钩端螺旋体病疫苗，抗原量和免疫保护能力之间的关系是众所周知的，可以确定无疑地预测比以前具有更高抗原量的菌苗疫苗，将也会诱导更高水平的免疫保护。

类似地，因为钩端螺旋体菌苗的蛋白载量明显涉及对疫苗副作用的诱发效果，还可以预测具有较少蛋白、但与之前具有等同抗原量的钩端螺旋体菌苗疫苗，将会诱发更少的副作用，但诱发等同的、或者可能提高的免疫作用。

10. 给钩端螺旋体培养物补充亚麻酸

基本如上述对亚油酸(C18:2)的补充所述，给钩端螺旋体培养物补充亚麻酸(C18;3)，α-或γ-。结果在很大程度上也是相当的，除了例如有特定的钩端螺旋体对一种形式的多不饱和C18脂肪酸表现出超出其它的特别偏好。

在钩端螺旋体培养物为静止的天数期间，也以类似的方式计算每单位生物量的抗原量；通常这是在接种后第3-4-5天，偶尔并且对于某些血清群是接种后第4-5-6天。如前文所述，按每1x10⁹个细胞(灭活前)计算ELISA的平均抗原量分值。根据参考培养物计算抗原量的相对提高，所述参照培养物没有接受补充。参照培养物的平均抗原量/1x10⁹个细胞设定为提高0 %。

在所有给钩端螺旋体培养物补充了C18:3的实验中，使用标准BSA (Milipore)，和聚山梨醇酯80 (Croda)制备EMJH。如所述的，这种EMJH培养基本身含有可忽略量的C18:3。

α-和γ C18:3均作为纯化学药品(> 98%)购得。在用于补充前不久，将其在纯乙醇中稀释至10 %或20% v/v，这取决于要添加到培养物中的C18:3的量。通过经4小时的时期，分5剂添加，将这种乙醇中的稀释物加入到钩端螺旋体培养物中。

10.1. 钩端螺旋体培养物中亚麻酸的消耗

与实施例4和图1-3中对C18:2的描述一致，研究了补充和不补充情况下C18:3的消耗。EMJH培养基中钩端螺旋体血清群黄疸出血群培养物的结果在图13和14中显示。这些培养物的标准生物量增长与图1显示的类似。

图13显示了未补充培养基中主要脂肪酸相对量的图谱：C16:0和C18:1，它们对应于左侧纵轴显示，并且保持相对恒定，甚至是当培养物扩增的时候。C18:2和C18:3的量对应于右侧纵轴显示：在第3天，C18:2的水平已经耗尽，并且C18:3-α稳步下降，在第5天往后被耗尽。

图14显示类似的图谱，但是，是在接种后第3天补充了200 µg/ml α C18:3的培养物。在该图中，所有脂肪酸的相对量是基于左侧纵轴显示的。可以看出，α C18:3的补充导致在第3.3天的取样点的明显可检测水平的C18:3。在后面的时间中，该量被稳步消耗，并且在第5天被再次耗尽。抗原量的相应增加显示在图16、18和20中。

10.2. 补充不同量的C18:3的效果

与实施例5、和图4和5中C18:2描述的相当，向EMJH培养基中的钩端螺旋体血清群黄疸出血群的培养物补充不同量的C18:3，或者α-亚麻酸(α C18:3)或者γ-亚麻酸(γC18:3)。结果显示在图15-20中。

在所有这些结果中可以清楚看到：补充亚麻酸在钩端螺旋体培养物中诱导了抗原量的提高，其极大地超过了生物量的提高，这使得每单位生物量的抗原量产生净提高。

图15和16显示了补充100、200、300、或400 µg/ml α C18:3对于生物量和抗原量的效果。明显地，补充300或400 µg/ml对培养物有毒性效果。对于其它量，100 µg/ml α C18:3给出的抗原量提高：122%，略好于200 µg/ml α C18:3：81 %。

图17和18显示补充200、300、或400 µg/ml γ C18:3对于生物量和抗原量的效果。明显地，黄疸出血群培养物对γ C18:3的耐受比对α C18:3的耐受好，因为只有400 µg/ml的量显示出毒性。

补充200 µg/ml γ C18:3的抗原量提高略低于补充300 µg/ml γ C18:3：114 %相对于153 %。

图19和20显示了等量α-或γ C18:3对EMJH培养基中的钩端螺旋体血清群黄疸出血群的培养物的生物量和抗原量的效果的比较。补充100 µg/ml α C18:3诱导的相对抗原量的提高大于100 µg/ml γ C18:3：122%相对于170%。

这证明钩端螺旋体血清群黄疸出血群对C18:3的α异构体的偏好。

10.3. 其他钩端螺旋体血清群C18:3补充的效果

与实施例6、和图6-9和11-12中对C18:2所描述的相当，也对除黄疸出血群之外的钩端螺旋体血清群测试了亚麻酸补充对于抗原量的效果。具体地，通过补充100或200 µg/ml α C18:3，或者100 µg/ml γ C18:3，对血清群澳洲群(布拉迪斯拉发血清型)、塔拉索夫群、感冒伤寒群、波摩那群、或犬群的培养物进行了测试。结果显示于图21-32，以及表7和8中。

表7：C18:3补充对于各种血清群的钩端螺旋体培养物的影响

应当注意到血清群澳洲群、塔拉索夫群、感冒伤寒群的钩端螺旋体通常对于两种C18:3异构体没有强烈的偏好。但是血清群波摩那群具有强烈的偏好，即对于γ C18:3；当补充α C18:3时，其产生的抗原量甚至少于参考培养物。

用几种量的α-或γ C18:3，对血清群犬群的钩端螺旋体(菌株WS 280503)进行测试，因为犬群在表现出抗原量的相对提高之前，看起来需要(分别是：能够耐受)更大量的脂肪酸。结果显示于图29-32，和表8中。

表8：钩端螺旋体血清群犬群培养物补充C18:3的效果

10.4. C18:3的最大补充水平

与实施例7中对C18:2所描述的相当，补充的C18:3的量的效果，在实际操作中似乎受到它对钩端螺旋体具有细胞毒性的限制。虽然血清群犬群似乎耐受稍高水平的C18:3补充，大部分其他血清群对200 µg/ml C18:3或更高显示出细胞毒性。在C18:3的α-或γ异构体的细胞毒性之间没有观察到明显差异。

10.5. C18:3补充的时间点

与实施例8和图10中对C18:2所描述的相当，在培养的不同时间点，用α-或γ C18:3测试了补充对于EMJH培养基中的钩端螺旋体血清群黄疸出血群培养物的影响。结果显示于图33-36。

图33和34显示了在1、5、或8 x10⁸个细胞/ml补充α C18:3的效果。观察到的抗原量的相对提高分别是：163%、164%、和140%。

图35和36显示了在2、5、或8 x10⁸个细胞/ml补充γ C18:3的效果。观察到的抗原量的相对提高分别是：71%、81%、和162%。

因此，C18:3补充的时间选择的效果，作为补充时刻的细胞浓度的函数，似乎并不非常重要。虽然α C18:3补充在低-中细胞浓度应用时给出最大的抗原量提高，而γ C18:3补充在高细胞浓度应用时给出最大的的提高。

10.6. 组合补充不同的多不饱和C18脂肪酸

令人惊讶地是，观察到多不饱和C18脂肪酸还可以组合补充，并由此导致累积效果。用EMJH培养基中的钩端螺旋体血清群黄疸出血群的培养物对此进行了测试，其中补充100 µg/ml C18:2、补充100 µg/ml α C18:3、或补充50 µg/ml C18:2和50 µg/ml α C18:3的组合。通过几乎同时添加作为乙醇中的分离的10%稀释物的两种脂肪酸，向培养物提供脂肪酸的组合，在4个小时的时间中分5次加入。

获得的相对抗原量的提高分别是：77%、144%和118%。结果显示于图37和38中。

显著地，通过补充C18:2和C18:3的组合获得的抗原量的提高产生抗原量的相对提高(118%)，这非常接近于单独补充的相对提高的算术平均值(111 %)。

附图说明

图1：在含有高LA BSA的EMJH培养基中血清群黄疸出血群的钩端螺旋体培养物上，随时间的生物量和抗原ELISA结果，其中没有进一步补充。

图2：图1所示培养物的培养基中脂肪酸图谱分析的结果。

图3：来自具有高LA BSA的EMJH培养基中血清群黄疸出血群的钩端螺旋体培养物的培养基的脂肪酸图谱，其中在第2天在细胞密度为5x10⁸个细胞/ml时，向培养基补充100µg/ml亚油酸。

图4和5：分别是血清群黄疸出血群的钩端螺旋体的不同培养物的生物量和抗原量测量结果，其在具有标准BSA的EMJH培养基中增殖；培养物或者是未补充的，作为参照培养物，或者是补充亚油酸：一个补充75 µg/ml亚油酸，其来自乙醇中的纯亚油酸；一个补充150µg/ml，也来自乙醇中的纯亚油酸；并且还有一个补充50 µg/ml亚油酸，以与BSA复合的亚油酸。

图6和7：分别是血清群赛卓群(哈德焦血清型)的钩端螺旋体的不同培养物的生物量和抗原量测量结果，其在具有高LA BSA的EMJH培养基中增殖；培养物或者是未补充的，作为参照培养物，或者补充100 µg/ml亚油酸，其来自乙醇中的纯亚油酸。

图8和9：分别是血清群感冒伤寒群的钩端螺旋体的不同培养物的生物量和抗原量测量结果，其在具有高LA BSA的EMJH培养基中增殖；培养物或者是未补充的，作为参照培养物，或者补充100 µg/ml亚油酸，其来自乙醇中的纯亚油酸。

图10：当在增殖的不同阶段对钩端螺旋体培养物进行补充的时候，对于抗原量提高的效果。在标准EMJH培养基中培养血清群黄疸出血群的钩端螺旋体，并在早期、中期、或晚期补充100 µg/ml亚油酸。在补充后2、4、和8小时进行初次取样。

图11和12：补充不同量的亚油酸对于标准EMJH培养基中钩端螺旋体血清群塔拉索夫群培养物的生物量和抗原量的效果。

图13和14：EMJH培养基中钩端螺旋体血清群黄疸出血群培养物中相对脂肪酸量随时间的图谱。

图13：未补充的培养物；NB：C18:2和C18: 3水平相对于右边的纵轴表示。

图14：补充200 µg/ml α C18:3的培养物。

图15-20：补充不同量的α-或γ C18:3对于EMJH培养基中钩端螺旋体血清群黄疸出血群培养物的生物量和抗原量的效果。

图21-32：补充不同量的α-或γ C18:3对EMJH培养基中不同血清群钩端螺旋体培养物的生物量和抗原量的效果。

图21和22：钩端螺旋体血清群澳洲群(布拉迪斯拉发血清型)培养物，

图23和24：钩端螺旋体血清群塔拉索夫群培养物，

图25和26：钩端螺旋体血清群感冒伤寒群培养物，

图27和28：钩端螺旋体血清群波摩那群培养物，

图29至32：钩端螺旋体血清群犬群培养物。

图33-36：在培养的不同时间点向EMJH培养基中血清群黄疸出血群的钩端螺旋体培养物添加α-或γ C18:3的效果。

图37和38：

单独补充相对于组合补充不同多不饱和C18脂肪酸对于EMJH培养基中血清群黄疸出血群的钩端螺旋体培养物的生物量和抗原量的效果的比较。

Claims (9)

1.用于提高钩端螺旋体培养物的抗原量的方法，所述方法包括向所述钩端螺旋体培养物补充浓度为至少15 µg 多不饱和C18脂肪酸/ml的多不饱和C18脂肪酸的步骤，其中所述多不饱和C18脂肪酸是选***油酸、α-亚麻酸、和γ-亚麻酸组成的组的一种或多种。

2.根据权利要求1的方法可获得的钩端螺旋体培养物，其中所述钩端螺旋体培养物具有提高的抗原量。

3.根据权利要求2的钩端螺旋体培养物，或所述培养物的制备物，其用于针对钩端螺旋体病的疫苗。

4.针对钩端螺旋体病的疫苗，其包含根据权利要求2的钩端螺旋体培养物、或所述培养物的制备物。

5.根据权利要求2的钩端螺旋体培养物、或所述培养物的制备物用于制造针对钩端螺旋体病的疫苗的用途。

6.生产针对钩端螺旋体病的疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：

a. 在体外***中增殖钩端螺旋体培养物，

b. 向所述钩端螺旋体培养物补充浓度为至少15 µg 多不饱和C18脂肪酸/ml的多不饱和C18脂肪酸，

c. 灭活并收获所述补充的钩端螺旋体培养物，和

d. 将灭活的钩端螺旋体培养物与药学可接受的载体混合，

其中所述多不饱和C18脂肪酸是选***油酸、α-亚麻酸、和γ-亚麻酸组成的组的一种或多种。

7.根据权利要求6的方法，其中在步骤a.和b.之间，存在附加步骤，所述附加步骤包括钩端螺旋体培养物的收获、储存和/或纯化。

8.相对富含多不饱和C18脂肪酸的化合物或组合物在根据权利要求1、6、或7任一项的方法中的用途，其中所述多不饱和C18脂肪酸是选***油酸、α-亚麻酸、和γ-亚麻酸组成的组的一种或多种。

9.根据权利要求8的用途，其中相对富含多不饱和C18脂肪酸的化合物或组合物是植物油。