JP2017108733A

JP2017108733A - ジンセノサイドグリコシダーゼを用いたマイナージンセノサイドの製造方法

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Publication number: JP2017108733A
Application number: JP2016125769A
Authority: JP
Inventors: サンチャンキム; Sung Chan Kim; ワンタクイム; Wan Taek Im; チャンホチェ; Chang Hao Cui
Original assignee: Intelligent Synthetic Biology Center
Current assignee: Intelligent Synthetic Biology Center
Priority date: 2015-12-18
Filing date: 2016-06-24
Publication date: 2017-06-22
Anticipated expiration: 2036-06-24
Also published as: EP3181695B1; JP6146753B1; US9926585B2; KR20170073781A; CN106893755A; KR101785809B1; US20170175159A1; EP3181695A1

Abstract

【課題】高麗人参のサポニンであるジンセノサイドの６位の炭素の糖を特異的に加水分解することによって、ジンセノサイドを体内吸収が容易な形態のマイナージンセノサイドに変換する、マイナージンセノサイドの製造方法。
【解決手段】ミクロバクテリウム属微生物由来のジンセノサイドグリコシダーゼタンパク質を用いたマイナージンセノサイドの製造方法、前記タンパク質を含むマイナージンセノサイドへの変換用組成物。前記タンパク質、前記タンパク質をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ベクターが導入された形質転換体。メジャージンセノサイドのマイナージンセノサイドの変換がＲｇ_１からＦ_１へ、Ｒｈ_１からＰＰＴへ、ＲｅからＦ_１へ、Ｒｇ_２からＰＰＴへ及びＲｆからＦ_１への変換であるマイナージンセノサイドの製造方法。
【選択図】図４

Description

本発明は、ミクロバクテリウム属（Microbacterium sp.）微生物由来のジンセノサイドグリコシダーゼ（Ginsenoside glycosidase）タンパク質を用いた、マイナージンセノサイドの製造方法、及び前記タンパク質を含むマイナージンセノサイドへの変換用組成物に関する。

サポニンとは、植物界に広く存在する配糖体において糖でない部分が様々な環式化合物からなる物質を意味する。高麗人参又は紅参に主要生理活性成分として含まれるサポニン成分であるトリテルペンサポニン（triterpene saponin）は、他の植物において見られるサポニンとは化学構造が異なるので、この高麗人参サポニンを他の植物系サポニンと区別するために、高麗人参（Ginseng）配糖体（Glycoside）という意味でジンセノサイド（Ginsenoside）と呼ぶ。

ジンセノサイドは、アグリコン（aglycone）の構造によってプロトパナキサジオール系（Protopanaxadiol-type, ＰＰＤタイプ）ジンセノサイド、プロトパナキサトリオール系（Protopanaxatriol-type, ＰＰＴタイプ）ジンセノサイド、及びオレアノール酸系（Oleanolic acidタイプ）ジンセノサイドの３種類に分類される。これら３つのグループは、さらに化合物構造中の環の３位の炭素、６位の炭素及び２０位の炭素位置にグリコシド結合（glycosicid bond）により付着する糖部分（アグリコン）（sugar moieties（aglycones））の位置及び数によって分類される。ＰＰＤタイプのジンセノサイドには、Ｒｂ_１、Ｒｂ_２、Ｒｂ_３、Ｒｃ、Ｒｄ、ギペノシド（gypenoside, Gyp）ＸＶＩＩ、ＣｏｍｐｏｕｎｄＯ、ＣｏｍｐｏｕｎｄＭｃ１、Ｆ_２、ＣｏｍｐｏｕｎｄＹ、ＣｏｍｐｏｕｎｄＭＣ、Ｒｇ_３、Ｒｈ_２及びＣ−Ｋなどが含まれる。ＰＰＴタイプのジンセノサイドには、Ｒｅ、Ｒｇ_１、Ｒｆ、Ｒｇ_２、Ｒｈ_１及びＦ_１などが含まれる。

また、乾参におけるジンセノサイドの９０％以上を占めるのはメジャージンセノサイドであるが、これは１，０００ダルトン付近の大きなサイズであるため生体内での吸収率が非常に低い（非特許文献１）。よって、ジンセノサイドの薬効を増大させるために、メジャージンセノサイドを相対的に吸収が容易で薬効もより優れたマイナージンセノサイドに変換する過程を必要とする（Akao, Kida et al. 1998, Tawab, Bahr et al.2003）。すなわち、メジャージンセノサイドはインビボ（in vivo）で効果的に生理活性を生じさせるために、糖を構成するグルコース、アラビノース、ラムノース、キシロースなどを除去する変換過程（deglycosylated）が求められる。メジャージンセノサイドには、Ｒｇ_１、Ｒｅ、Ｒｂ_１、Ｒｂ_２、Ｒｃ及びＲｄなどが含まれ、微量で存在するマイナージンセノサイド（希少なジンセノサイド）には、Ｆ_２、Ｒｇ_３、Ｒｈ_１、Ｒｈ_２、ギペノシド（gypenoside, Gyp）ＸＶＩＩ、ギペノシドＬＸＸＶ、ＣｏｍｐｏｕｎｄＫ、Ｃ−Ｋ、ＣｏｍｐｏｕｎｄＭｃ、ＣｏｍｐｏｕｎｄＭｃ１などが含まれる。

希少なジンセノサイドＦ_１は抗老化及び抗酸化効能を有することが知られており、ＨａＣａＴ角質細胞をＵＶＢにより誘導されるアポトーシス（apoptosis）から保護する効果を示し（Lee, Cho et al. 2003）、皮膚美白効能と抗癌活性を有することが報告されている（Han, Lee et al. 2014, Kim, Baek et al. 2015）。しかし、ジンセノサイドＦ_１は、このような有用性にもかかわらず、１９７６年に発見されて以来、最近になってようやくその薬理学的活性が報告された。これは、ジンセノサイドＦ_１は高麗人参の葉に少量で存在するので、ジンセノサイドＦ_１の生物学的活性をテストするために十分な量を得るのが困難であったからである。

高麗人参に微量で存在するマイナージンセノサイドＦ_１を生産する方法として、化学的分解法、酵素的方法及び配糖体合成を用いた方法などが提示されているが、これらの方法は、１）製造工程上、複数のステップを経なければならないこと、２）製造過程において目的とする成分が消失すること、３）食用に適さない触媒を用いること、４）低い収率を示すことから、依然として大量生産には限界があった。特に、酵素的方法においては、様々な微生物から得た助酵素を用いる方法や、微生物のメジャージンセノサイドの生体変換（biotransformation）について多くの研究が行われた。しかし、これらも大量生産の方法としては効果的でなく、多くのコストが発生するという問題がある。

現在までＦ_１生産に関して報告された方法は、グリコシダーゼ（glycosidase）を用いて０．５ｇのＰＰＴタイプの混合物から数百ｍｇのＦ_１、Ｒｈ_１、Ｒｇ_２及びＲｇ_１を生物学的に生産する方法や、真菌類から分離したβ−グルコシダーゼを用いてＲｇ_１からＦ_１を生産する方法であった。また、ジンセノサイドＦ_１の大量生産に関する最近の技術としては、テラバクター属（Terrabacter sp.）微生物由来のβ−グルコシダーゼ（β-glucosidase）を用いてＦ_１をグラム単位で大量生産することに成功した事例（特許文献１）が報告されている。

そこで、本発明者らは、高麗人参などの植物体に微量で存在する形態であるマイナージンセノサイドを得る方法を開発すべく鋭意努力した結果、ミクロバクテリウム属（Microbacterium sp.）菌株由来のジンセノサイドグリコシダーゼＭＴ６１９がテラバクター属由来のβ−グルコシダーゼより、メジャー形態のジンセノサイドからマイナー形態のジンセノサイドに非常に優秀に生体変換されることを確認し、本発明を完成するに至った。

韓国登録特許第10-1340079号公報

Park, J. H., Food Ind. Nutr., 2004, 9:23-27

本発明は、ジンセノサイドグリコシダーゼ（ginsenoside glycosidase）タンパク質と、前記タンパク質をコードする核酸を含むベクターが導入された形質転換体と、前記形質転換体の培養物とからなる群から選択される少なくとも１つを用いて、ジンセノサイドの６位の炭素の糖を特異的に加水分解することにより脱グリコシル化した形態に変換するステップを含む、マイナージンセノサイドの製造方法を提供することを目的とする。

また、本発明は、ジンセノサイドグリコシダーゼ（ginsenoside glycosidase）タンパク質と、前記タンパク質をコードする核酸を含むベクターが導入された形質転換体と、前記形質転換体の培養物とからなる群から選択される少なくとも１つを用いて、ジンセノサイドの６位の炭素の糖を特異的に加水分解することにより脱グリコシル化した形態に変換するステップを含む、マイナージンセノサイドの変換用組成物を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、ジンセノサイドグリコシダーゼ（Ginsenoside glycosidase）タンパク質を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記タンパク質をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、及び前記ベクターが導入された形質転換体を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明の一態様は、ジンセノサイドグリコシダーゼ（ginsenoside glycosidase）タンパク質と、前記タンパク質をコードする核酸を含むベクターが導入された形質転換体と、前記形質転換体の培養物とからなる群から選択される少なくとも１つを用いて、ジンセノサイドの６位の炭素の糖を特異的に加水分解することにより脱グリコシル化した形態に変換するステップを含む、マイナージンセノサイドの製造方法を提供する。

本発明における「ジンセノサイドグリコシダーゼ（Ginesenoside glycosidase）」とは、グルコシド結合を加水分解する酵素であり、具体的にはジンセノサイドの６位の炭素の糖を特異的に加水分解する酵素を意味する。同じグリコシダーゼに属する酵素であっても、その酵素活性がグルコシダーゼ、セルラーゼのように様々な酵素活性を示し得るので、ジンセノサイドの６位の炭素の糖を特異的に加水分解する活性を有する適切な酵素を見出す必要性がある。よって、本発明者らは、このような活性を有するジンセノサイドグリコシダーゼをスクリーニングすることによりその機能を確認した。本発明の目的上、前記ジンセノサイドグリコシダーゼは、ジンセノサイドの６位の炭素の糖を加水分解する酵素であれば限定されず、具体的には配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むジンセノサイドグリコシダーゼであってもよい。前記ジンセノサイドグリコシダーゼは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質だけでなく、上記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、さらに具体的には９５％以上、最も具体的には９８％以上の相同性を示すアミノ酸配列であって、実質的に配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むジンセノサイドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質であれば、本発明に含まれる。また、このような相同性を有する配列であって、本発明のジンセノサイドグリコシダーゼと実質的に同一又は対応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質変異体も本発明に含まれることは言うまでもない。

前記相同性とは、野生型（wild type）タンパク質のアミノ酸配列又はそれをコードする核酸配列と類似する程度を示すものであり、本発明のアミノ酸配列又は核酸配列と上記パーセント以上同一である配列を含む。このような相同性の比較は、肉眼で行うか、購入が容易な比較プログラムを用いて行う。

配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むジンセノサイドグリコシダーゼは、ミクロバクテリウム属（Microbacterium. sp.）微生物、具体的にはミクロバクテリウム・テスタセウム由来の酵素であり、これは本願発明においてＭＴ６１９と混用される。前記ジンセノサイドグリコシダーゼは、β−グルコシダーゼ（β-glucosidase）活性を有し、グルコース、Ｇｌｃ（１→２）Ｇｌｃ、又はｒｈａ（１→２）Ｇｌｃを分解することができるので、６位の炭素に糖が結合されたジンセノサイドをマイナージンセノサイドであるＦ_１及びＰＰＴに変換することができる。

本発明の一実施例においては、ミクロバクテリウム・テスタセウムから配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するジンセノサイドグリコシダーゼをスクリーニングし、これをＭＴ６１９と命名した（実施例１）。前記ＭＴ６１９をコードするポリヌクレオチドは、１８５７ｂｐ長のポリヌクレオチドを含み、６１９個のアミノ酸で構成されたポリペプチドをコードする。

前記ジンセノサイドグリコシダーゼは、ジンセノサイドの６位の炭素に位置する糖に対して、外側及び内側のグルコース、Ｇｌｃ（１→２）Ｇｌｃ、又はｒｈａ（１→２）Ｇｌｃの選択的加水分解能を有する。

本発明の一実施例においては、ジンセノサイドＲｇ_１からＦ_１への変換を確認することにより、本発明のジンセノサイドグリコシダーゼがジンセノサイドの６位の炭素のグルコースに対する選択的加水分解によりジンセノサイドＦ_１を製造できることが確認された（図４）。

本発明のジンセノサイドグリコシダーゼタンパク質は、６位の炭素に糖が結合されたジンセノサイドを体内吸収が容易な形態である可溶性のマイナージンセノサイドに変換することができ、このタンパク質は、活性及び安定性が維持されるものであれば様々な温度及びｐＨ条件で用いることができ、ＣａＣｌ_２、ＣｏＣｌ_２、ＤＴＴ、ＥＤＴＡ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＭｎＣｌ_２、ＮａＣｌ、ＳＤＳ及びメルカプトエタノールからなる群から選択される少なくとも１つの金属及び化学物質を共に用いることができるが、これらに限定されるものではない。

本発明の一実施例において、ｐＨがＭＴ６１９の活性及び安定性に及ぼす影響を分析した結果、ＭＴ６１９はｐＨ５〜８．０の範囲で安定性を示し、具体的にはｐＨ７．０で最も安定性を示すことが確認された（実施例３−２，図２）。

本発明の他の実施例において、温度がＭＴ６１９の活性及び安定性に及ぼす影響を分析した結果、ＭＴ６１９の活性は３０〜５５℃で高くなり、最適温度は４５℃であった。また、ＭＴ６１９の温度安定性については、０〜４５℃で安定性を示し、具体的には０〜３０℃で優れた安定性を示した（実施例３−３，図３）。

本発明のさらに他の実施例において、金属及び他の化学試薬がＭＴ６１９の活性に及ぼす影響を分析した結果、酵素活性はＣｕ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｈｇ^２＋及びＺｎ^２＋などのイオンの存在下では強く阻害されたが、Ｃａ^２＋、Ｎａ^＋及びＫ^＋は酵素活性をそれほど増加させなかった（実施例３−４，表１）。

本発明のさらに他の実施例において、ＭＴ６１９の基質特異性を分析した結果、ＭＴ６１９はｐＮＰ−β−Ｄ−グルコピラノシドに対して最も高い基質特異性を示し、ｏＮＰ−β−Ｄ−グルコピラノシドに対しても基質特異性を示した（実施例４，表２）。

また、前記ジンセノサイドグリコシダーゼは、Ｆ_１を大量生産することが知られているテラバクター属（Terrabacter. sp）微生物由来のβ−グルコシダーゼよりジンセノサイドの６位の炭素に結合された糖に対する加水分解活性が非常に高いので、マイナージンセノサイドの大量生産に有用である。

本発明の一実施例においては、ＭＴ６１９を用いてジンセノサイドＲｇ_１からＦ_１を生産する能力を評価した。ジンセノサイドＲｇ_１を基質として用いてＦ_１を生産することが知られているテラバクター・ジンセノサイジミュータンス（Terrabacter ginsenosidimutans）由来のＢｇｐＡを比較対照群として用いると、ＭＴ６１９がＲｇ_１を基質としてＦ_１を生産する能力に非常に優れることが確認された。具体的には、ＭＴ６１９は反応開始から１時間〜３時間で優れた生産能力を示し、より具体的には、２時間で最も優れた生産能力を示し、０．１ｍｇ／ｍｌの酵素濃度においてＢｇｐＡが０．１８ｍｇのＦ_１を生産するのに対して、ＭＴ６１９は１．３ｍｇのＦ_１を生産し、ＭＴ６１９がＢｇｐＡに比べて実に７倍以上となる多量のＦ_１を生産することが確認された（図６）。

これらの結果から、ジンセノサイドグリコシダーゼＭＴ６１９は、ジンセノサイドの６位の炭素の糖を特異的に加水分解する能力が、公知のジンセノサイドグリコシダーゼＢｇｐＡより非常に優れていることが分かる。

本発明において、６位の炭素に糖が結合されたジンセノサイドは、ＰＰＤ（protopanazadiol）系のジンセノサイドであってもよい。前記「ＰＰＴ（protopanaxatriol）系のジンセノサイド」とは、ダンマラン系サポニンであり、３位、６位、１２位及び２０位の炭素位置に−ＯＨ基を有するＰＰＴ又は前記ＰＰＴの前記−ＯＨ基がグリコシル化されたジンセノサイドを意味する。その例として、ジンセノサイドＲｅ、Ｒｇ_１、Ｒｆ、Ｆ_１、Ｒｇ_２、ＰＰＴ又はＲｈ_１が挙げられる。特に、本発明の目的上、前記ＰＰＴ系のジンセノサイドには、前記ジンセノサイドグリコシダーゼの活性によりジンセノサイドＦ_１又はＰＰＴに変換されるジンセノサイドが全て含まれる。

本発明の一実施例においては、代表的にＲｇ_１が本発明のジンセノサイドグリコシダーゼの活性によりＦ_１に変換されることが確認された（図４）。前記ＰＰＴタイプのジンセノサイドは、具体的にはＲｇ_１、Ｒｈ_１、Ｒｅ、Ｒｇ_２及びＲｆであるが、これらに限定されるものではない。

前記ＰＰＴ系のジンセノサイドは、分離及び精製された形態のジンセノサイドを用いることもでき、高麗人参又は紅参の粉末又は抽出物に含まれるジンセノサイドを用いることもできる。すなわち、ジンセノサイドを含む高麗人参又は紅参の粉末又は抽出物を直接出発物質として用いて本発明の方法を実施することもできる。本発明において用いられる高麗人参としては、公知の様々な高麗人参を用いることができ、オタネニンジン（Panax ginseng）、アメリカニンジン（P. quiquefolius）、サンシチニンジン（P. notoginseng）、トチバニンジン（P. japonicus）、ミツバニンジン（P. trifolium）、ヒマラヤニンジン（P. pseudoginseng）及びベトナムニンジン（P. vietnamensis）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明における「マイナージンセノサイド」とは、体内吸収が困難なメジャー（major）形態のジンセノサイドの６位の炭素に位置する糖を加水分解することにより生成された、相対的に体内吸収が容易なマイナー（minor）形態のジンセノサイドを意味する。具体的には、前記マイナージンセノサイドはＦ_１又はＰＰＴであるが、これらに限定されるものではない。

具体的には、前記ジンセノサイドグリコシダーゼは、ジンセノサイドＲｇ_１及びＲｈ_１の場合、ジンセノサイドＲｇ_１及びＲｈ_１の６位の炭素に対する選択的加水分解能を有するので、６位の炭素に位置する１つのグルコース部分（glucose moiety）を加水分解することにより、それぞれジンセノサイドＦ_１及びＰＰＴに変換することができる。

また、前記ジンセノサイドグリコシダーゼは、ジンセノサイドＲｅ及びＲｇ_２の場合、Ｒｅ及びＲｇ_２の６位の炭素に位置するｒｈａ（１→２）Ｇｌｃを加水分解することにより、Ｆ_１及びＰＰＴに変換することができ、ジンセノサイドＲｆの場合、Ｒｆの６位の炭素に位置するＧｌｃ（１→２）Ｇｌｃを加水分解することにより、Ｆ_１に変換することができる。

本発明における「Ｇｌｃ（１→２）Ｇｌｃ」とは、グルコース（glucose, Glc）の１位の炭素と他のグルコースの２位の炭素がα又はβ結合により連結された二糖類を意味し、具体的にはグルコースの１位の炭素と他のグルコースの２位の炭素がα結合により連結された二糖類であるが、これらに限定されるものではない。

本発明における「ｒｈａ（１→２）Ｇｌｃ」とは、ラムノース（rhamnose, rha）の１位の炭素とグルコースの２位の炭素がα又はβ結合により連結された二糖類を意味し、具体的にはラムノースの１位の炭素とグルコースの２位の炭素がα結合により連結された二糖類であるが、これらに限定されるものではない。

本発明のマイナージンセノサイドの製造方法は、具体的にはジンセノサイドＲｇ_１からジンセノサイドＦ_１への変換過程、Ｒｈ_１からＰＰＴへの変換過程、ＲｅからＦ_１への変換過程、Ｒｇ_２からＰＰＴへの変換過程、ＲｆからＦ_１への変換過程、及びＲｆからＦ_１への変換過程からなる群から選択される少なくとも１つの変換過程を含むが、これらに限定されるものではない。このようなジンセノサイドグリコシダーゼの変換活性を図４に示す。

本発明のマイナージンセノサイドを製造する方法は、前記ジンセノサイドグリコシダーゼタンパク質をコードする核酸を含むベクターが導入された形質転換体又は前記形質転換体の培養物と、６位の炭素に糖が結合されたジンセノサイドとを反応させるステップを含んでもよい。

本発明における「ベクター」とは、好適な宿主細胞において標的タンパク質を発現する発現ベクターであり、核酸挿入物が発現するように作動可能に連結された必須の調節因子を含む核酸調製物を意味する。

本発明における「形質転換」とは、ＤＮＡを宿主に導入してＤＮＡが染色体の因子として又は染色体への組込みにより複製可能になることであり、外部のＤＮＡを細胞に導入して人為的に遺伝的な変化を起こす現象を意味する。

本発明の形質転換方法は、任意の形質転換方法を用いることができ、当業界の通常の方法により容易に行うことができる。

上記方法で形質転換された、本発明のジンセノサイドグリコシダーゼタンパク質をコードする核酸を含むベクターが導入された形質転換体は、ＰＰＴ系のジンセノサイドを変換することによりジンセノサイドＦ_１に変換する活性を有し、ＰＰＴ系のジンセノサイドであるジンセノサイドＲｅとＲｇ_１からジンセノサイドＦ_１への変換活性、ジンセノサイドＲｈ_１からＰＰＴへの変換活性、ＲｅからＦ_１への変換活性、Ｒｇ_２からＰＰＴへの変換活性、又はＲｆからＦ_１への変換活性を有する形質転換体を意味することが好ましいが、これらに限定されるものではない。また、前記形質転換体は、ＰＰＴ系のジンセノサイドを変換することによりジンセノサイドＦ_１に変換する活性を有するが、これに限定されるものではない。

本発明における宿主は、本発明の核酸を発現するものであれば、特に限定されるものではない。本発明に用いられる宿主の例としては、大腸菌（E. coli）などのエシェリキア（Escherichia）属細菌、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）などのバチルス（Bacillus）属細菌、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）などのシュードモナス（Pseudomonas）属細菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）などの酵母、動物細胞及び昆虫細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

また、前記形質転換体を培養して得られた培養物を用いることにより、６位の炭素に糖が結合されたジンセノサイドの６位の炭素の糖を特異的に加水分解することができる。具体的には、ジンセノサイドＲｇ_１、Ｒｈ_１、Ｒｅ、Ｒｇ_２及びＲｆを変換することにより、ジンセノサイドＦ_１又はＰＰＴを製造することができる。

本発明における「培養物」とは、前記形質転換体を公知の微生物培養方法により培養して得られた産物を意味する。前記培養物には、培養上清や細胞破砕液が全て含まれ、細胞が含まれてもよく、含まれなくてもよい。前記ジンセノサイドグリコシダーゼをコードする核酸を含む発現ベクターが導入された形質転換体の培養物は、ＰＰＴ系のジンセノサイドであるジンセノサイドＲｇ_１、Ｒｈ_１、Ｒｅ、Ｒｇ_２及びＲｆからＦ_１又はＰＰＴへの変換活性を有するが、これらに限定されるものではない。

本発明の他の態様は、配列番号１で表されるアミノ酸配列で規定されるジンセノサイドグリコシダーゼ（Ginsenoside glycosidase）タンパク質と、前記タンパク質をコードする核酸を含むベクターが導入された形質転換体と、前記形質転換体の培養物とからなる群から選択される少なくとも１つを有効成分として含む、ジンセノサイドの６位の炭素の糖を特異的に加水分解することにより脱グリコシル化した形態のマイナージンセノサイドへの変換用組成物を提供する。

前記ジンセノサイド、ジンセノサイドグリコシダーゼタンパク質、マイナージンセノサイド、形質転換体及び培養物については前述した通りである。

前記ジンセノサイドグリコシダーゼタンパク質は、高麗人参のジンセノサイドの６位の炭素に対して非常に選択的加水分解能が高いので、マイナージンセノサイドを大量生産するのに有用である。

本発明のさらに他の態様は、配列番号１で表されるアミノ酸配列で規定されるジンセノサイドグリコシダーゼ（Ginsenoside glycosidase）タンパク質、前記タンパク質をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、及び前記ベクターが導入された形質転換体を提供する。

前記ジンセノサイドグリコシダーゼタンパク質、前記タンパク質をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、及び前記ベクターが導入された形質転換体については前述した通りである。

前記ジンセノサイドグリコシダーゼタンパク質をコードする核酸は、具体的には配列番号２で表される核酸を意味するが、これに限定されるものではない。前記ジンセノサイドグリコシダーゼをコードする核酸は、ジンセノサイドグルコシダーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸であればこれに限定されず、配列番号２で表される核酸配列だけでなく、上記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、さらに具体的には９５％以上、最も具体的には９８％以上の相同性を示す配列であって、実質的にジンセノサイドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質をコードする配列が挙げられる。前記相同性は前述した通りである。

本発明は、ミクロバクテリウム属（Microbacterium testaceum）微生物由来のジンセノサイドグリコシダーゼ（Ginsenoside glycosidase）タンパク質を用いた、マイナージンセノサイドの製造方法、及び前記タンパク質を含むマイナージンセノサイドへの変換用組成物に関するものであり、前記ジンセノサイドグリコシダーゼは、ジンセノサイドの６位の炭素の糖を特異的に加水分解することにより、ジンセノサイドを体内吸収が容易な形態であるマイナージンセノサイドに変換する非常に優れた活性を示すので、ジンセノサイドの大量生産に有用である。

ＧＳＴ結合アガロース樹脂を用いて精製した後の組換えＭＴ６１９のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である（Ｍ：サイズマーカー，レーン１：タンパク質の発現が誘導されない粗抽出物，レーン２：ＧＳＴ結合アガロース樹脂で精製した後のＧＳＴ−ＭＴ６１９）。各ｐＨにおける組換えタンパク質の活性と安定性を示す図である。各温度における組換えタンパク質の活性と安定性を示す図である。組換えＭＴ６１９によるジンセノサイドＦ_１への変換を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で分析した結果を示す図である（Ｓ：ジンセノサイド標準物質）。組換えＭＴ６１９によるジンセノサイドＲｅ、Ｒｇ_１及びＲｇ_２の各変換経路を示す図である。組換えＭＴ６１９のＦ_１生産能力を示す図である（ＢｇｐＡ：テラバクター・ジンセノサイジミュータンス(Terrabacter ginsenosidimutans)由来のグリコシダーゼ）。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１：新規なジンセノサイドグリコシダーゼを含む組換え発現ベクター及び形質転換微生物の作製
本発明においては、メジャージンセノサイドをマイナージンセノサイドに変換する新規なジンセノサイドグリコシダーゼを作製するために、まずミクロバクテリウム・テスタセウム（Microbacterium testaceum）から配列番号１のジンセノサイドグリコシダーゼ（gincenoside glycosidase）をスクリーニングし、これをＭＴ６１９と命名した。前記ＭＴ６１９をミュータジェネックス（mutagenex, 米国）に依頼して、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）から発現させるために、ＭＴ６１９の塩基配列を最適化した（配列番号２）。

実施例２：ジンセノサイドグリコシダーゼ（ginsenoside glycosidase）の作製
実施例１のジンセノサイドグリコシダーゼを大量生産するために、前記形質転換された菌株をアンピシリン（Ampicillin）が添加されたＬＢ培地１００ｍｌの入った三角フラスコに接種し、６００ｎｍにおける吸光度が０．６になるまで３７℃の振盪培養器にて２００ｒｐｍで種菌培養を行った。可溶性タンパク質が発現するか否かを各温度（１８，２２，２５，３０，３７℃）で確認し、これにＩＰＴＧ（isopropyl-beta-D-thiogalactoside）を最終濃度が０．１ｍＭとなるように添加することにより、本発明のジンセノサイドグリコシダーゼの大量発現を誘導した。菌株が静止期（stationary phase）に入ったら、菌株の培養液を６，０００×ｇで４℃にて１０分間遠心分離し、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（Sodium phosphate buffer, pH7.0）を添加して懸濁し、その後前記細胞溶液を破砕機（sonicator）で破砕した。前記細胞破砕物を再度１３，０００×ｇで４℃にて１５分間遠心分離し、次いで可溶性のジンセノサイドグリコシダーゼＭＴ６１９の上清を得た。前記上清を分離精製し、ＭＴ６１９をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。

その結果、前記ジンセノサイドグリコシダーゼＭＴ６１９のアミノ酸の数は６１９であった。前記ＭＴ６１９のアミノ酸配列番号を１とした。また、ＧＳＴ−ＭＴ６１９の分子量はアミノ酸配列で計算した約９４．４ｋＤａと同等になることが確認された（図１）。

実施例３：ジンセノサイドグリコシダーゼＭＴ６１９酵素の特性分析
実施例３−１：ＭＴ６１９の活性の分析方法
基質であるＰＮＰＧ（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside）を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて、３７℃で前記精製されたＭＴ６１９の特異活性を測定した。１ＭのＮａ_２ＣＯ_３０．１ｍｌで５分間処理して反応を終了させ、４０５ｎｍでｐ−ニトロフェノール（p-nitrophenol）の分泌を直ちに測定した。活性の１ユニット（one unit of activity）を１分当たりｐ−ニトロフェノール１μｍｏｌの分泌量と定義した。特異活性はタンパク質１ミリグラム（milligram）当たり１ユニットであった。タンパク質濃度はビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質分析法（Pierce, Rockford, IL）を用いて、牛血清アルブミン（Sigma）のＢｉｏ−Ｒを基準に測定し、全ての分析法を３回繰り返した。

実施例３−２：ｐＨ変化による活性評価
ｐＨが前記ＭＴ６１９の酵素活性に及ぼす効果を測定するために、基質として２．０ｍＭのｐＮＰＧｌｃ（p-nitrophenyl-D-glucopyranoside; Sigma）を用いると共に、下記の緩衝液（５０ｍＭ）を用いてｐＨを調節した。
ｐＨ２〜１０の範囲：ＫＣｌ−ＨＣｌ（ｐＨ２），グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３），酢酸ナトリウム（ｐＨ４及びｐＨ５），リン酸ナトリウム（ｐＨ６及びｐＨ７），Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８及びｐＨ９），グリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ１０）

また、ｐＨが酵素安定性に及ぼす効果を測定した。４℃の温度にて上記各緩衝液で酵素を２４時間インキュベートし、その後５０ｍＭのカリウム（potassium）緩衝液中でｐＮＰＧｌｃを分析することにより、ｐＨの変動による酵素安定性を測定した。標準分析方法により残基の活性を分析し、最適ｐＨにおいて得られた活性の百分率でその結果を図２に示す。

その結果、図２に示すように、ジンセノサイドグリコシダーゼＭＴ６１９は、ｐＨ６〜ｐＨ８の範囲で活性及び安定性を示し、具体的にはｐＨ７．０で最も高い活性及び安定性を示すことが確認された。また、ｐＨ６．０以下及びｐＨ８．０以上においては酵素活性及び安定性が急速に減少することが分かった。

実施例３−３：温度変化による活性評価
温度が前記ＭＴ６１９の酵素活性に及ぼす効果を測定するために、４〜６５℃の様々な温度にて２．０ｍＭのｐＮＰＧｌｃ（p-nitrophenyl-β-Dglucopyranoside; Sigma）を用いて、１０分間最適ｐＨで５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液中の温度依存的な活性を分析した。

また、温度がＭＴ６１９の酵素安定性に及ぼす効果を測定するために、同一温度範囲内で３０分間リン酸カリウム緩衝液５０ｍＭ中で当量の酵素をインキュベートした。具体的には、氷でサンプルを１０分間冷却し、その後標準分析方法で測定された残存活性を確認することにより、温度安定性の分析を行った。その結果を図３に示す。

その結果、図３に示すように、ジンセノサイドグリコシダーゼＭＴ６１９の活性は３０〜５５℃で高くなり、具体的には４５℃で最高の活性となった。また、ＭＴ６１９の温度安定性は０〜４５℃の範囲で安定性を示し、具体的には０〜３０℃で優れた安定性を示した。

実施例３−４：金属及び化学試薬による活性評価
金属及び他の化学試薬がジンセノサイドグリコシダーゼＭＴ１６９の活性に及ぼす影響を分析するために、ＭＴ１６９を３７℃で３０分間１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、ＣａＣｌ_２、ＣｏＣｌ_２、ＣｕＣｌ_２、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ＥＤＴＡ、ＨｇＣｌ_２、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＭｎＣｌ_２、ＮａＣｌ、ＳＤＳ又はＺｎＣｌ２と共にインキュベートし、その後ｐＮＰＧを基質として残存活性を測定し、化合物を含まない場合に対する百分率で活性を下記表１に示す。

その結果、表１に示すように、ジンセノサイドグリコシダーゼＭＴ６１９の酵素活性はＣｕ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｈｇ^２＋、Ｚｎ^２＋などのイオンの存在下では強く阻害されたが、Ｃａ^２＋、Ｎａ^＋及びＫ^＋は酵素活性をそれほど増加させなかった。

実施例４：ＭＴ６１９の基質特異性分析
前記ＭＴ６１９の基質特異性を分析するために、２．０ｍＭの発色するｏ−ニトロフェニル（ＯＮＰ）とｐ−ニトロフェニル（ＰＮＰ）を基質として用いて、３７℃で５分間測定した。１活性単位は１分当たり１μｍｏｌのｏ−ニトロフェノール又はｐ−ニトロフェノールの放出と定義した。分析に用いた基質は、ｐＮＰ−α−Ｌ−アラビノフラノシド（pNP-α-L-arabinofuranoside）、ｐＮＰ−β−Ｌ−アラビノピラノシド（pNP-β-L-arabinopyranoside）、ｐＮＰ−α−Ｌ−Ｄ−フコピラノシド（pNP-α-L-D-fucopyranoside）、ｐＮＰ−α−Ｌ−ラムノピラノシド（pNP-α-L-rhamnopyranoside）、ｐＮＰ−α−Ｄ−グルコピラノシド（pNP-α-D-glucopyranoside）、ｐＮＰ−α−Ｄ−マンノピラノシド（pNP-α-D-mannopyranoside）、ｐＮＰ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（pNP-β-D-galactopyranoside）、ｏＮＰ−β−Ｄ−グルコピラノシド（oNP-β-D-glucopyranoside）、ｏＮＰ−β−Ｄ−フコピラノシド（oNP-β-D-fucopyranoside）、ｐＮＰ−β−Ｄ−キシロピラノシド（pNP-β-D-xylopyranoside）、ｐＮＰ−β−Ｌ−アラビノフラノシド（pNP-β-L-arabinofuranoside）、ｏＮＰ−β−Ｄ−フコピラノシド（oNP-β-D-fucopyranoside）、ｏＮＰ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（oNP-α-D-galactopyranoside）及びｐＮＰ−β−Ｄ−グルコピラノシド（pNP-β-D-glucopyranoside）であり、シグマから購入した。

ａ：最終基質濃度２．０ｍＭ
ｂ：ｐＮＰ−β−Ｄ−グルコピラノシドに対する酵素活性を基準とする

その結果、表２に示すように、ジンセノサイドグリコシダーゼＭＴ６１９はｐＮＰ−β−Ｄ−グルコピラノシドに対して最も高い基質特異性を示し、ｏＮＰ−β−Ｄ−グルコピラノシドに対しても基質特異性を示した。他の基質に対しては活性を示さなかった。

実施例５：ＭＴ６１９のジンセノサイド変換能力評価
ジンセノサイドの６位の炭素（Ｃ−６）部位に付着した糖の加水分解に対する酵素の特異性及び選択性を分析するために、ジンセノサイドＲｅ、Ｒｇ_１及びＲｇ_２を基質として用いた。

５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するＭＴ６１９を、前述した３種の基質が２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）と同量の体積で３７℃にて反応させた。ＭＴ６１９の分解活性を測定するために、前記サンプルを反応１．５時間後に回収し、水溶液で飽和したブタノールを同量の体積で添加することにより反応を終了させた。ｎ−ブタノール分画を乾燥及び蒸発させ、残基をＣＨ_３ＯＨに溶解させてＴＬＣ（thin layer chromatography）で分析した。その結果を図４にそれぞれ示す。

その結果、図４に示すように、ジンセノサイドＲｅとＲｇ_１がジンセノサイドＦ_１に変換されることが確認された。これらの結果は、ジンセノサイドＲｇ_１の６位の炭素位置に存在する糖が切断されることによりジンセノサイドＦ_１に変換されることを示すものである（図５）。

これらの結果は、本発明の配列番号１で表されるジンセノサイドグリコシダーゼがマイナーサポニンに効率的に変換させ、可溶性サポニンであるジンセノサイドＦ_１を効率的に製造できることを裏付けるものである。

実施例６：ＭＴ６１９のＦ_１生産能力評価
前記ＭＴ６１９がＲｇ_１を基質として用いてＦ_１を生産する能力を評価するために、ミクロバクテリウム・テスタセウム由来のジンセノサイドグルコシダーゼとＦ_１生産能を比較した。

ジンセノサイドＲｇ_１を基質として用いてＦ_１を生産することが知られているテラバクター・ジンセノサイジミュータンス（Terrabacter ginsenosidimutans）由来のＢｇｐＡを比較対照群として用いた。

その結果、図６に示すように、精製された酵素濃度０．１ｍｇ／ｍｌにおいて、ＭＴ６１９はＲｇ_１（２．０ｍｇ／ｍｌ）を基質として用いてＦ_１を生産する能力が非常に優れていることが分かった。ＢｇｐＡが反応初期にＦ_１の生産能力が低調であるのに対して、ＭＴ６１９は反応初期からＦ_１を早く生産した。ＭＴ６１９は反応開始から１時間〜３時間で優れた生産能力を示し、具体的には２時間で最も優れた生産能力を示し、ＢｇｐＡが０．１８ｍｇのＦ_１を生産するのに対して、ＭＴ６１９は１．３ｍｇのＦ_１を生産し、ＭＴ６１９がＢｇｐＡに比べて実に７倍以上となる多量のＦ_１を生産することが確認された。

これらの結果から、ジンセノサイドグリコシダーゼＭＴ６１９はジンセノサイドの６位の炭素の糖を特異的に加水分解する能力が公知のジンセノサイドグリコシダーゼＢｇｐＡより非常に優れていることが分かった。

以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書ではなく特許請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。

Claims

配列番号１で表されるアミノ酸配列で規定されるジンセノサイドグリコシダーゼ（Ginsenoside glycosidase）タンパク質と、前記タンパク質をコードする核酸を含むベクターが導入された形質転換体と、前記形質転換体の培養物とからなる群から選択される少なくとも１つを用いて、ジンセノサイドの６位の炭素の糖を特異的に加水分解することにより脱グリコシル化した形態に変換するステップを含む、マイナージンセノサイドの製造方法。
前記ジンセノサイドは、Ｒｇ_１、Ｒｈ_１、Ｒｅ、Ｒｇ_２及びＲｆからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の製造方法。
前記糖は、グルコース、Ｇｌｃ（１→２）Ｇｌｃ、又はｒｈａ（１→２）Ｇｌｃである、請求項１に記載の製造方法。
前記マイナージンセノサイドの製造は、Ｒｇ_１からＦ_１への変換過程、Ｒｈ_１からＰＰＴへの変換過程、ＲｅからＦ_１への変換過程、Ｒｇ_２からＰＰＴへの変換過程、及びＲｆからＦ_１への変換過程からなる群から選択される少なくとも１つの変換過程を含む、請求項１に記載の製造方法。
前記変換は、ｐＨ５〜８．５又は１０〜５０℃の温度で行われる、請求項１に記載の製造方法。
配列番号１で表されるアミノ酸配列で規定されるジンセノサイドグリコシダーゼ（Ginsenoside glycosidase）タンパク質と、前記タンパク質をコードする核酸を含むベクターが導入された形質転換体と、前記形質転換体の培養物とからなる群から選択される少なくとも１つを有効成分として含む、ジンセノサイドの６位の炭素の糖を特異的に加水分解することにより脱グリコシル化した形態のマイナージンセノサイドへの変換用組成物。
前記ジンセノサイドは、Ｒｇ_１、Ｒｈ_１、Ｒｅ、Ｒｇ_２及びＲｆからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項６に記載の組成物。
前記糖は、グルコース、Ｇｌｃ（１→２）Ｇｌｃ、又はｒｈａ（１→２）Ｇｌｃである、請求項６に記載の組成物。
前記マイナージンセノサイドの変換は、Ｒｇ_１からＦ_１への変換、Ｒｈ_１からＰＰＴへの変換、ＲｅからＦ_１への変換、Ｒｇ_２からＰＰＴへの変換、及びＲｆからＦ_１への変換からなる群から選択される少なくとも１つの変換を含む、請求項６に記載の組成物。