JP2017018140A - グルカン酸の細胞での産生 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、35U.S.C.§119(e)のもとに2008年4月4日に出願された米国仮出願番号第61/042,502号、名称「グルカン酸の微生物による産生」の利益を主張し、これは本明細書にその全体が参照として組み込まれる。
この研究は、海軍研究事務所による助成金番号N000140510656から資金の一部を得た。政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、グルクロン酸およびグルカン酸の組換え遺伝子発現による産生に関する。
組換えDNA技術の応用を包含する代謝工学は、組換えタンパク質産生、生産力増強のための経路エンジニアリング、および新しい産物生成のための新規な経路設計などの多くの目的に対して、細胞機能を最適化するその潜在能力を示している。宿主種に見出されない変換のシーケンスとして定義された新規な経路であって、1,3−プロパンジオール(C. E. Nakamura and G. M. Whited (2003). Curr. Opin. Biotechnol. 14: 454-459)、アモルファジエン(Nature Biotech, 21, pp796-802)、および1,2,4−ブタントリオール(JACS, 125, pp12998-12999)の産生のための前記経路が、大腸菌内に設計され構築されている。これらのアプローチにおいて、各段階は酵素の利用可能性に基づいて設計され、種々の生物から採用した酵素の活性が同定され、これらの酵素的段階を組み合わせて、新規な経路が大腸菌内に構築された。これらの例の背景にある基本的なアイディアは、酵素を含むタンパク質を交換可能な部品とみなすことであり、用語「合成生物学」がこの概念を説明するために用いられている(Nature 421, p118;Nature Chemical Biology, 3, pp521-525)。
本明細書には、ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする第1のudh遺伝子のクローニングおよび特徴づけが記載される。さらに本明細書には、大腸菌などの細胞内での、Dグルクロン酸またはDグルカン酸いずれかの産生のための、異なる生物からの「生物学的部分」を組み合わせることによる、新規な経路の構築が記載される。第1の酵素、ミオイノシトール1−リン酸シンターゼ(Ino1/MIPS)は、グルコースからグルコース−6−リン酸を中間体としてミオイノシトールを産生する(Dean-Johnson and Henry 1989)。第2の酵素、ミオイノシトールオキシゲナーゼ(MIOX)は、ミオイノシトールをグルクロン酸に変換する。これらの2つの酵素の大腸菌などの細胞内での共発現により、グルコースからグルクロン酸の産生が可能となる。ウロン酸デヒドロゲナーゼは、グルクロン酸をグルカン酸に変換することができる(Bateman, Kosuge et al. 1970;Wagner and Hollman 1976)。本明細書に記載するように、この第3の遺伝子とINO1およびMIOXとの発現により、グルコースからのグルカン酸の産生が可能となる。驚くべきことには、ウロン酸デヒドロゲナーゼの組換え発現は、経路のフラックスを大幅に増加させて、多量のグルカン酸を得ることができるようにした。
ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび/またはミオイノシトール1−リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、プラスミドから発現されることができ、または細胞のゲノム内に統合することができる。いくつかの態様において、グルカン酸の産生は、細胞内でのウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび/またはミオイノシトール1−リン酸シンターゼ酵素のタンパク質工学により、または細胞内でグルカン酸代謝経路の成分を突然変異させることにより、増加する。本発明は、いくつかの態様において、ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよびミオイノシトール1−リン酸シンターゼをコードする1または2以上の組換え核酸分子を含む、遺伝的に改変された微生物を含む。
いくつかの態様において、細胞は、ミオイノシトールオキシゲナーゼを組換え技術により発現し、グルクロン酸を産生する。いくつかの態様において、細胞は、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよびミオイノシトール1−リン酸シンターゼを組換え技術により発現し、グルクロン酸を産生する。いくつかの態様において、細胞は、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよびウロン酸デヒドロゲナーゼを組換え技術により発現し、グルカン酸を産生する。いくつかの態様において、細胞は、ミオイノシトールオキシゲナーゼ、ミオイノシトール1−リン酸シンターゼおよびウロン酸デヒドロゲナーゼを組換え技術により発現し、グルカン酸を産生する。
本発明はまた、上記の細胞または方法により産生されるグルカン酸を提供する。いくつかの態様において、グルカン酸は細胞培養物により産生され、ここで細胞培養物中の細胞は、ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよびミオイノシトール1−リン酸シンターゼの少なくとも1つを組換え技術により発現するように遺伝子操作されている。いくつかの態様において、ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、Pseudomonas syringae遺伝子またはAgrobacterium tumefaciens遺伝子などの細菌遺伝子である。いくつかの態様において、ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、マウス遺伝子などの哺乳動物遺伝子である。いくつかの態様において、ミオイノシトール1−リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、Saccharomyces cerevisiae遺伝子などの真菌遺伝子または酵母遺伝子である。
グルカン酸の産生のために、ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび/またはミオイノシトール1−リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、プラスミド上に発現されるか、または細胞のゲノム内に統合することができる。いくつかの態様において、グルカン酸の産生は、細胞内でのウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび/またはミオイノシトール1−リン酸シンターゼ酵素のタンパク質工学により、または、細胞内のグルカン酸代謝経路の成分を突然変異させることにより、増加する。
本発明はまた、本明細書に記載のウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドに選択的に結合する、単離された抗体も含む。いくつかの態様において、抗体は、配列番号2と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドに選択的に結合する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号1と少なくとも95%のヌクレオチド同一性を有する核酸によりコードされるポリペプチドに結合する。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはこれらの抗原結合断片であることができる。
本発明の側面は、細胞内での組換え遺伝子発現を介した、グルクロン酸およびグルカン酸の産生のための方法および組成物である。本明細書に記載されるのは、グルクロン酸をグルカン酸に変換する酵素であるウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のクローニングである。ウロン酸デヒドロゲナーゼをミオイノシトール1−リン酸シンターゼおよびミオイノシトールオキシゲナーゼと組み合わせて組換え発現することを介して、グルコースからグルクロン酸およびグルカン酸を発現するように設計および実装された、新規な経路が記載される。この新規な経路は、ナイロンおよびポリエステルの生産から癌治療までの広い範囲の用途を有する分子である、グルカン酸を産生するための、非常に効率的な新しい系である。
クローニングベクターは、自己複製可能であるか、または宿主細胞内に統合されているベクターであって、これはさらに1または2以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を特徴とし、該部位においては、ベクターを確定的な様式で切断することができ、またその中に所望のDNA配列をライゲーションして、新しい組換えベクターが、宿主細胞内で複製するその能力を保持するようにすることができる。プラスミドの場合、所望の配列の複製は、宿主細菌内でのプラスミドのコピー数が増加するに従って多数回生じるか、または、有糸***によって宿主が複製する前に、宿主当たり1回のみ生じる。ファージの場合、複製は、溶菌相の間に能動的に生じてもよく、または溶原相の間に受動的に生じてもよい。
遺伝子発現に必要な調節配列の正確な性質は、種または細胞型により異なり得るが、しかし一般的に、必要に応じて、それぞれ転写および翻訳の開始に関連する5’非転写配列および5’非翻訳配列を含み、例えばTATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列等である。特にかかる5’非転写調節配列は、操作可能に結合した遺伝子の転写制御用のプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。調節配列はまた、所望により、エンハンサー配列または上流アクチベーター配列を含んでもよい。本発明のベクターは、任意に、5’リーダー配列またはシグナル配列を含んでもよい。適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および裁量の範囲内である。
いくつかの態様において、本発明の2または3以上の核酸を、同一の発現ベクターまたはプラスミド内でクローニングすることができる。実施例の節に記載するように、いくつかの態様においては、INO1遺伝子およびMIOX遺伝子を、同一のプラスミド内、例えばpRSFDプラスミドにクローニングする。
いくつかの態様において、本発明に関連する酵素は、細菌細胞内に組換え技術により発現される。本発明による細菌細胞は、任意の種類および組成の培地(富栄養または最少)中で培養可能である。例1は、グルコースを補足しIPTGで誘導した富栄養培地(LB培地、BD Biosciences; San Jose, CA)が最適であると見出された態様を示す。当業者が理解するように、ルーチンの最適化により、M9最少培地などの最少培地を含む、他の種類の培地の使用も許容される。選択された培地には、種々の追加要素を補足することができる。同様に、培地および増殖条件の他の側面も、ルーチンの実験を介して最適化してよい。例えば、pHおよび温度は、最適化できる因子の非限定例である。本発明の側面により、細胞を増殖させるのに用いる液体培養物は、当分野で知られ用いられている、任意の培養容器中に収容することができる。
タンパク質発現の最適化にはまた、いくつかの態様において、本発明に関連する酵素をコードする遺伝子を、細胞内への導入の前に、細菌細胞内での発現のためのコドン最適化を介するなどして、改変することが求められる。種々の生物に対するコドンの使用は、インターネットサイト「コドン使用データベース」において評価することができる。例えば本発明は、大腸菌での発現用にコドン最適化により合成された、マウスMIOX遺伝子を包含する。
一般に、相同体および対立遺伝子は典型的には、ウロン酸デヒドロゲナーゼ核酸およびポリペプチドと、それぞれ少なくとも75%の核酸同一性および/または少なくとも90%のアミノ酸同一性を共有しており、いくつかの例においては、少なくとも90%の核酸同一性および/または少なくとも95%のアミノ酸同一性を共有しており、さらに他の例においては、少なくとも95%の核酸同一性および/または少なくとも99%のアミノ酸同一性を共有している。相同性は、NCBIのインターネットサイトから入手可能な、NCBI(Bethesda, Maryland)により開発された種々の公的に利用可能なソフトウェアツールを用いて計算することができる。例示のツールとしては、NCBIのインターネットサイト(www.ncbi.nlm.nih.gov)から入手可能なBLASTソフトウェアが挙げられる。ペアワイズおよびClustalWアラインメント(BLOSUM30マトリクスセッティング)、およびKyte-Doolittleヒドロパシー分析も、Mac Vector配列解析ソフトウェア(Oxford Molecular Group)を用いて得ることができる。前述の核酸のワトソン・クリック補体もまた、本発明に包含される。
本発明はまた、天然材料に存在するものに対する代替的コドンも含む、変性核酸も含む。例えば、セリン残基は、コドンTCA、AGT、TCC、TCG、TCTおよびAGCによりコードされる。6つのコドンの各々は、セリン残基をコードする目的に対して等価である。したがって、セリンをコードするヌクレオチドトリプレットの任意のものを、in vivoまたはin vitroでのタンパク質合成装置の誘導に用いて、セリン残基が延長されたウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチド内に組み込み可能であることは、当業者には明白である。同様に、他のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列トリプレットには、限定はしないが以下が含まれる:CCA、CCC、CCGおよびCCT(プロリンコドン);CGA、CGC、CGG、CGT、AGAおよびAGG(アルギニンコドン);ACA、ACC、ACGおよびACT(スレオニンコドン);AACおよびAAT(アスパラギンコドン);およびATA、ATCおよびATT(イソロイシンコドン)。他のアミノ酸残基も、複数のヌクレオチド配列により同様にしてコードすることができる。したがって、本発明は、遺伝子コードの変性のために、生物学的に単離された核酸とはコドン配列が異なる、変性核酸を包含する。本発明はまた、宿主細胞の最適なコドン使用に適するコドン最適化も包含する。
ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする核酸の突然変異は、コード配列のアミノ酸リーディング・フレームを保存するのが好ましく、変異体ポリペプチドの発現に有害となり得るヘアピンやループなどの二次構造を、ハイブリダイズにより形成し勝ちである核酸領域を作らないのが好ましい。
ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの機能的に等価な変異体を産生するための、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドのアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換は、ウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする核酸の変化により作られる。かかる置換は、当業者に知られた種々の方法により作ることができる。例えば、アミノ酸置換は、PCR定方向(PCR-directed)突然変異、Kunkelの方法(Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488-492, 1985)による部位特異的突然変異、またはウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする遺伝子の化学的合成により、作ることができる。
例1:グルカン酸産生:組換え大腸菌における生合成経路
大腸菌においてグルコースからグルクロン酸およびグルカン酸を産生するための合成経路が構築された(図1)。Saccharomyces cerevisiaeからのミオイノシトール1−リン酸シンターゼ(Ino1)およびマウスからのミオイノシトールオキシゲナーゼ(MIOX)をコードする遺伝子の共発現により、中間体ミオイノシトールを介したグルクロン酸の産生がもたらされる。0.3g/Lまでのグルクロン酸濃度を培養ブロス内で測定した。MIOXの活性は律速因子であり、ミオイノシトールおよび最終産物としてのグルクロン酸をほぼ同じ濃度で蓄積する。第3の酵素、Pseudomonas syringaeからのウロン酸デヒドロゲナーゼ(Udh)の含有により、グルクロン酸のグルカン酸への変換が促進された。この組換え酵素の活性は、Ino1およびMIOXのそれよりも2桁以上高く、経路を通る全フラックスを、グルカン酸濃度で1g/Lを超えるものにと増加させた。これは、バイオマスからの「高付加価値化学物質」であるグルカン酸の生物学的産生のための、新規な微生物系を提示する。
株、増殖培地、およびプラスミド
大腸菌株DH10B[F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15ΔlacX74 recA1 endA1 araΔ139Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL (StrR) nupG]を、全ての分子生物学的操作に用いた。DH10BおよびBL21Star(商標)(DE3)[F- ompT hsdSB (rB -mB -) gal dcm rne131 (DE3)]を、有機酸産生の宿主として用いた。両株のコンピテント細胞を、Invitrogen Corporation(Carlsbad, CA)から購入した。培養物は、LBまたはM9倍地のどちらかで増殖させた。LB(Miller)培地は、製造業者の指示に従って脱水パウダーから調製した(BD Biosciences, San Jose, CA)。M9は記載のようにして調製し(32)、これは以下からなる:1×M9塩(12.8g/LのNa2HPO4/7H2O、3g/LのKH2PO4、0.5g/LのNaCl、1g/LのNH4Cl)、2mMのMgSO4、0.1mMのCaCl2、および10g/L(1%)のグルコース。ロイシンを、最終濃度105μg/mLでDH10Bに対して加えた。プラスミド維持のために選択的な圧力を提供することが望ましい場合には、カナマイシンを最終濃度20μg/mLで、およびアンピシリンを最終濃度100μg/mLで加えた。
INO1、MIOXおよびudh遺伝子の機能の発現を、酵素活性のin vitroアッセイにより確認した。粗溶解物(粗ライセート)を以下のようにして調製した:1〜2mL培養物からの細胞ペレットを、初めに、1mg/mLのリゾチームを含む100〜200μLの10mMトリス−Cl(pH8.0)中に再懸濁させた。細胞溶液を、液体窒素中での凍結と、30〜40℃の水での解凍を5サイクル繰り返すことにより、溶解させた。得られた溶液を14,000rpm、4℃で15分間遠心分離して、不溶解物を除去した。溶解物の総タンパク質濃度は、Bradford法(11)を用いて決定した。
ミオイノシトール1−リン酸シンターゼ活性についてのアッセイは、前に記載のようにして行った(1、6)。簡単に述べると、グルコース−6−リン酸基質を、50mMのトリス酢酸(pH7.5)、0.8mMのNAD+、14mMのNH4Cl、5mMのメルカプトエタノール、および5mMのグルコース−6−リン酸からなる反応バッファー内で、ミオイノシトール1ホスファターゼに変換した。反応は、溶解物を加えることにより開始され、37℃で1時間インキュベートした。反応は、0.4容積の20%トリクロロ酢酸を加えて終了させた。産物の定量化のために、等量の0.2MのNaIO4を用いた酸化により、ミオイノシトール1−リン酸から無機リン酸塩を除去した。過剰の過ヨウ素酸塩を等量の1MのNa2SO3を加えて破壊した。コントロール反応は、グルコース−6−リン酸なしで、過ヨウ素酸塩の添加なしで行った。
ウロン酸デヒドロゲナーゼ活性についてのアッセイは、前に記載のように(35、40)、340nmでのNADH補因子生成をモニタリングすることにより行った。反応混合物は、100mMのリン酸ナトリウムバッファー(pH8.0)、2.5mMのグルクロン酸、0.9mMのNAD+、および上述のようにして調製した細菌溶解物を含んだ。
培養物は、10g/Lのグルコースを補足したLB培地中で増殖させ、結果に示すようにIPTGで誘導した。接種物(inoculum)はLB倍地中で調製し、1または2%(v/v)を用いて、50または100mLの培地を含有する250mLのバッフルフラスコへの接種を行った。培養物は30℃で250rpmにてインキュベートし、培養倍地中の細胞密度および産物の濃度を決定するために定期的にサンプリングした。
グルクロン酸およびグルカン酸を含む代謝物を、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により定量化した。グルカン酸アッセイには、試料は前述のようにして前処理し(28、40)、グルクロン酸を含む他の代謝物からグルカン酸を分離した。簡単に述べると、グルカン酸に存在する共平面隣接cis−ヒドロキシ基に親和性を有するボロン酸親和性ゲル(Affi-gel boronate gel, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)(28)を試料と混合し、80mMのリン酸カリウム−20mMのホウ酸バッファー(pH7.0)で洗浄した。グルカン酸を0.1Mの塩酸で溶出した。溶出物を、10MのNaOHを加えて中性にし、つぎにHPLCで分析した。HPLC分析は、Aminex HPX-87Xカラム(300mm×7.8mm、Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)と屈折率およびダイオードアレイ検出器を備えたAglient 1100シリーズ装置により、次の条件下で行った:移動相、水中の5mMの硫酸;流速、0.5mL/分;注入容量、50μL;温度、55℃;UV波長、210nm。
組換えIno1およびMIOX活性の検証
Saccharomyces cerevisiaeからのミオイノシトール1−リン酸シンターゼ(Ino1)の、大腸菌発酵を介した高濃度のミオイノシトールの産生への使用は、前に報告されている(15)。産物の21g/Lまでの力価が、高細胞密度の下で54時間の補給バッチ(fed-batch)発酵で得られた。振とうフラスコ内でIno1性能を確認するために、対応する遺伝子を増幅し、適合ベクター内に挿入し、つぎに高コピー数および中程度のコピー数プラスミドの両方に、共通の実験室株DH10Bでの発現のためにサブクローニングした。プラスミドpTrc−INO1は、数百のコピー数をもたらす改変ColE1レプリコンを含み、一方、pMMB−INO1は、10の桁のコピー数のRSF1010レプリコンに基づく。2つのプラスミドを評価して、INO1およびMIOX遺伝子の、適合ベクターを用いた単一株内での共発現の可能性を探索した。344nmol/時間/mgおよび128nmol/時間/mgのin vitro活性がそれぞれ、pTrc−INO1およびpMMB−INO1を含み、かつ30℃でインキュベートした培養物に対して測定可能であり、酵素の発現の成功を示唆した(表1)。しかし、高コピー数プラスミドからの発現のみが、培養倍地中での測定可能な量、0.37g/Lのミオイノシトールの蓄積をもたらした。活性は温度の強い関数でもあり、37℃で増殖した培養物には検出なしであった。ミオイノシトール産生を、M9最少培地でも試験した。最少培地中、グルコースのみを炭素源として増殖させると、グルコースフラックスが増加し、したがってミオイノシトール産生が増加すると考えられた。しかし、半分の量のミオイノシトールのみが産生され、このことは、グルコースフラックスは実際に高かったが、これらの条件下で発現されたIno1酵素は解糖に対して基質と効率的に競合しないことを示唆した。次の実験を、グルコースを補足したLB培地中で行った。
グルコースからのグルクロン酸の産生には、INO1とMIOX両方が、同じ株内で共発現することが必要である。適合プラスミドpTrc99AおよびpMMB206両方を、pTrc−INO1とpMMB−MIOX、またはpMMB−INO1とpTrc−MIOXを含有する2重に形質転換された株を産生に用いることができると予想して検討した。しかし結果は、培養倍地中のそれぞれ所望の産物の蓄積により決定される、合理的なin vivo活性は、高コピー数プラスミドからの両遺伝子の発現によってのみ実現可能であることを示した。この問題に取り組むため、両方の酵素を、それぞれがT7プロモーターの後ろにある複数クローニング部位の対を含む、高コピー数pRSFDuetベクターに導入した。酵素活性は前に記載のようにして確認し、発現はSDS−PAGEにより確認した(データ示されず)。この様式で、0.1mMのIPTG濃度が好ましいと決定された。宿主株は、DH10BからBL21(DE3)に変えて、T7プロモーターからの発現を可能とした。我々は前に、DH10Bがグルクロン酸を増殖のために消費できないことを観察した(データ示されず)。BL21(DE3)はグルクロン酸を代謝可能である;しかし、その消費は、異化代謝産物抑制を受けるようであった(データ示されず)。したがって、過剰なグルコースでの株の培養は、所望産物の消費を防ぐ。
例2は、P. syringae pv. tomato株DC3000からのウロン酸デヒドロゲナーゼ活性をコードする遺伝子の、クローニングおよび特徴づけを示す(40)。udh遺伝子は、大腸菌で非常に良好に発現され、高い酵素活性をもたらすことが見出された。グルカン酸の産生のために、我々は、pRSFD−IN−MIに適合する、前に構築したpTrc99Aのudh遺伝子を含むベクターを用いた。両方のベクターをBL21(DE3)に導入して、INO1、MIOX、およびudhを担持する大腸菌株を構築した。この株の生産性を、いくつかの異なる誘導条件下で測定した(表3)。最初の2つの遺伝子を含む系において前に観察されたのは0.27g/Lのみのグルクロン酸であったにもかかわらず、驚くべきことに、1g/Lまでのグルカン酸が産生された。グルクロン酸に前に用いたものと同一の誘導条件下で(表3、条件A)、0.72g/Lのグルカン酸が産生された。この系の特徴をさらに明らかにするために、粗溶解物中の酵素活性を、培養の各日に測定した(図3)。udh活性は最大であり、Ino1活性よりも2桁以上高く、MIOX活性よりも3桁以上高かった。Udhの高い活性はしたがって、グルコースフラックスをグルカン酸経路を通って引き寄せ、グルカン酸の比較的高い力価をもたらす。これらの試料において、MIOX活性は前に観察されたのと同じく、時間とともに低下せず、しかし、活性の程度は非常に低いままである。さらに、ここでの最初のデータ点は1日後であり、これは、MIOX活性が指数増殖の間に観察された値から顕著に低下することが前に示された時期である(表2)。3日間の培養期間後にグルクロン酸は検出されず、一方、ミオイノシトールは蓄積されて、MIOXが触媒する段階が律速的であることを確認した。
本明細書に示されるのは、3つの異種のソース:S. cerevisiaeのINO1、マウスのMIOX、およびP. syringaeのUdhからの酵素を用いた、グルカン酸産生のための生合成経路のアッセンブリーである。内因性のホスファターゼもまた、この経路に関与する。大腸菌のsuhB遺伝子産物は、in vitroでイノシトール1リン酸活性を有することが示され、したがってこの内因性活性に対する合理的な候補である(23)。この経路は熱力学的視点から魅力的であり、その理由は、グループ寄与理論により推定されるように(21、24)、また分子の酸素を究極の酸化剤と考えると、全3段階に対する標準の自由エネルギー変化(ΔG)が全て負だからである:グルコースからミオイノシトール段階に対して−14.3Kcal/mol;ミオイノシトールからグルクロン酸段階に対して−86.8Kcal/mol;グルクロン酸からグルカン酸段階に対して−55.9Kcal/mol。しかし、Khosla and Keaslingが示したように(18)、代謝工学は単に種々の酵素を採用するだけではない。これはまた、宿主生物への新しい経路の導入などの摂動がなされた場合の、代謝フラックスの全般的最適化も含む。プラスミドの維持およびプラスミドによりコードされる遺伝子の発現に関連する、代謝性負荷の問題は、この場合に特に興味深い(9、10、17)。我々の系において、検出可能量のグルクロン酸は、高コピー数プラスミドによってのみ、in vivoで産生された。過剰なグルコースを補足したLB培地を増殖に用いているので、最初の基質であるグルコース−6−リン酸は中央代謝に対して律速的であってはならない。したがって、早くて頑強な解糖経路と競合し、グルコース−6−リン酸をグルクロン酸へと分流させるために、組換え遺伝子の高い発現レベルが必要となる。
ウロン酸デヒドロゲナーゼを、P. syringae pv. tomato株DC3000、Pseudomonas putidaKT2440、およびAgrobacterium tumefaciens株C58からクローニングした。遺伝子は、グルクロン酸塩を単一の炭素原として消費することはできないが、グルカレートで増殖できる大腸菌変異体を用いた新規な相補性アッセイを用いることにより、同定した。P. syringaeのショットガンライブラリのスクリーニングを、変異体大腸菌内にて、グルクロン酸を含有する最少培地上で形質転換細胞を増殖することにより行った。生存したコロニーを、グルクロン酸をグルカン酸に変換できるウロン酸デヒドロゲナーゼについて評価した。この様式で、0.8Kbのオープンリーディングフレームを同定し、続いてudhであることを確認した。相同の酵素を、配列決定ゲノムの類似性探索に基き、P. putidaおよびA. tumefaciensにおいて同定した。大腸菌で発現された3種の微生物の各々からの組換えタンパク質を精製して特徴づけた。全3種の酵素について、代謝回転数kcatは、基質としてのグルクロン酸塩に対して、ガラクツロン酸塩に対するよりも高かった;しかし、ミカエリス定数Kmはガラクツロン酸塩対して低かった。A. tumefaciens酵素は最大の速度定数を有することが見出され(グルクロン酸塩に対してkcat=1.9×102s−1)、これは両方のPseudomonas酵素よりも2倍以上高かった。
細菌でのアルドヘキサウロネート(aldohexuronate)異化作用には、2つの異なる経路、すなわち異性化反応段階により開始される経路と、酸化段階により開始される経路とが関与すると報告されている。異性化反応経路において、アルドヘキサウロネート(グルクロン酸塩、ガラクツロン酸塩)がウロン酸イソメラーゼによりケトヘキサウロネートに異性化され、最終的にはピルベートと3−ホスホグリセルアルデヒドに分解される。異性化反応経路は前に細菌において起こることが報告されており、その細菌としては大腸菌(7)、Erwinia carotovora(18)、Erwinia hrysanthemi(15)、Areobacter aerogenes(9、23)、およびSerratia marcescens(28)が挙げられる。酸化経路においては、アルドヘキサウロネートは、ウロン酸デヒドロゲナーゼによりアルドヘキサレート(aldohexarate)に酸化され、さらにピルベートに異化される。(2、5、7、9、18、19、24)。この経路の鍵となる酵素であるウロン酸デヒドロゲナーゼ(Udh)を、2種の植物病原性細菌であるPseudomonas syringaeおよびAgrobacterium tumefaciensにおいて検討した。これまで、Udhの特性に関して限定された研究のみが文献に報告されており(3、6、38、43)、配列はまだ同定されていない。Udhは、全分子量が約60,000のNAD結合酸化還元酵素として分類されている(EC 1.1.1.203)。これは、それぞれが約30,000の分子量の2つのサブユニットからなるホモダイマーである(38)。Udhは熱的に不安定で、可逆性酵素であり、最適なpHは約8.0である(3、6、38)。
細菌株、プラスミド、および増殖条件
本研究に用いた株、プラスミド、およびプライマー配列を表4に示す。培地および化学試薬はSigma(St. Louis, MO, USA)またはBD Biosciences(San Jose, CA, USA)から購入した。P. syringae pv. tomato株DC3000はゲノムライブラリのソースとして用い、これはMassachusetts General HospitalのFrederick Ausubel博士から寄贈されたものである。P. syringaeは50μg/mLのリファムピシンを加えたLB(Luria-Bertani)培地中30℃で増殖させた。Pseudomonas putidaKT2440(ATCC 47054)はAmerican Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)から購入し、LB培地中30℃で増殖させた。大腸菌株は2YT培地(1リットル当たり16gのトリプトン、10gの酵母抽出物、および10gの塩化ナトリウム)中37℃で増殖させた。必要に応じて、アンピシリンおよびカナマイシンをそれぞれ100および25μg/mLで培地に加えた。大腸菌DH10B(F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu) 7697 galU galK λ- rpsL nupG)を、ゲノムライブラリに対する宿主株として、およびスクリーニングする遺伝子(Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, USA)のサブクローニングのために用いた。大腸菌MG1655のΔuxaCは、University of Wisconsin-Madisonの大腸菌ゲノムプロジェクトのF. R. Blattner博士より提供を受けた。M9最少寒天については、22mMのグルコース、グルクロン酸塩、またはグルカレートを炭素源として用いた。プラスミドベクターpTrc99AおよびpTrc99SEを、それぞれゲノムライブラリの構築のため、および候補遺伝子に対する発現ベクターとして用いた(表4)。プラスミドpTrc99SEは、Gyeongsang National University, KoreaのSeon-Won Kim博士より寄贈された。pBluescript(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を一般クローニングベクターとして用いた。
ゲノムDNAの調製および一般クローニングの手順は、Sambrook et al.(35)に記載のようにして行った。A. tumefaciens株Cr58のゲノムDNAは、ATCC(ATCC番号33970D)から購入した。制限酵素およびT4リガーゼは、New England Biolabs(Beverly, MA, USA)より購入した。P. syringaeゲノムDNAはBfuCIで部分的に消化され、次に0.8%アガロースゲル上に負荷した。2〜6Kbの断片をゲルから精製し、脱リン酸化されたBamHI末端でpTrc99Aにライゲーションした。4℃で2日間のライゲーション後に、反応混合物を用いて大腸菌DH10Bを形質転換した。成功した形質転換体クローンを収集し、寒天プレートからプールし、次に−80℃で保管した。コロニープールから単離したプラスミドプールを用いて大腸菌MG1655ΔuxaCを形質転換し、Udh活性についてスクリーニングした。形質転換株を、22mMのグルクロン酸塩を加えたM9最少寒天プレート上、30℃で4日間培養した。プレートからの生存クローンを、それらのプラスミドの精製および配列決定によりスクリーニングした。配列決定結果を、GenBankアクセッション番号NC_004578(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)に報告されているP. syringae pv. tomato株DC3000のゲノム配列と比較した。
PCR増幅を、PfuターボADを用いて、製造業者の記載(Stratagene, La Jolla, CA, USA)のようにして行った。3つの候補遺伝子、iolE、iolB、およびPSPTO_1053を、それぞれ表4に挙げたプライマーを用いて、ゲノムDNAから増幅した。PCR産物をEcoRV消化pBluescriptIIに平滑末端ライゲーションし、pBiolE、pBiolB、pBiolEB、およびpB1053を得て、これらはそれぞれ配列決定して、その同一性を確認した。iolE、iolB、およびiolEBは、それぞれEcoRIおよびSalIでの消化により開裂し、次に同じ酵素により消化されたpTrc99Aにライゲーションして、それぞれpTiolE、pTiolB、pTiolEBを構築した。pB1053からのPSPTO_1053は、NcoIおよびSacIでの消化により開裂し、次に同じ酵素により消化されたpTrc99Aにライゲーションして、pT1053を得た。
A. tumefaciens、P. putida、およびP. syringaeのゲノムDNAからの推定udh遺伝子を、それぞれプライマー対ATudh2−F/ATudh2−R、PPudh−F/PPTudh−RおよびPSudh−F/1053−Rを用いて増幅した(表4)。PCR産物は、EcoRVで消化されたpBluescriptIIに平滑末端ライゲーションし、プラスミドpBATudh2、pBPPudh、およびpBPSudhを得た。プラスミドpTATudh2、pTPPudh、およびpTPSudhを構築するために、対応する遺伝子をそれぞれpBATudh2、pBPPudh、およびpBPSudhからのEcoRIおよびSacIで切除し、pTrc99SEの同一部位に挿入した。
A. tumefaciens、P. putida、およびP. syringaeのゲノムDNAからのudh遺伝子を、表4に挙げたようにプライマーATuEQ−F/R、PPuEQ−F/R、およびPSuEQ−F/Rを用いて増幅した。PCR産物をSacIおよびHindIIIで消化し、6XHis−Tagを含むpET21bの同じ部位に挿入して、それぞれpETATu、pETPPu、およびpETPSuを構築した(表4)。これらのプラスミドを用いて大腸菌BL21(DE3)を形質転換し、これをタンパク質発現に用いた。組換え大腸菌BL21株を、IPTG誘導後に30℃、250rpmで6時間培養した。タンパク質精製は、ProBond(商標)精製システムを用いて、製造業者の記載に従って行った(Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, USA)。SDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法)をSambrook et. al.の記載(35)に従って行った。精製タンパク質の基質上での酵素活性は、室温で340nmにおける初期のNADHの生成をモニタリングすることにより、測定した。グルクロン酸塩およびガラクツロン酸塩の反応速度解析は、100mMのトリス−HCl、pH8.0中の0〜10mMのグルクロン酸塩またはガラクツロン酸塩と1.2mMのNAD+を用いて行った。NAD+での反応速度解析は、100mMのトリス−HCl、pH8.0中の0〜2mMのNAD+と10mMのグルクロン酸塩を用いて行った。一連の酵素分析を行って、初期の活性を出発基質濃度の関数として推定した。これらのデータを用いて、ミカエリス・メンテン反応速度モデルのパラメータkcatおよびKmを、非線形最小二乗回帰により適合させた。非線形最小二乗回帰分析は、ガウス−ニュートン法により、固有のMatlab(登録商標)関数nlinfitによる実行を介して行った。
Udhによりグルクロン酸塩からグルカレートを産生するための反応混合物は、20mMのグルクロン酸塩、21.6mMのNAD+、40mMのリン酸ナトリウムバッファー、pH8.0、および上記のようにして調製した細菌溶解物からなる。酵素反応は、粗溶解物または精製タンパク質のどちらかを反応混合物に加え、室温で60分間インキュベートし、ついで1Mの水酸化ナトリウム加えて停止することにより、実施した。グルカレートの共平面隣接cis−ヒドロキシル基に結合可能な、ボロン酸親和性ゲル(Affi-gelボロン酸ゲル、Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)を充填したカラムを用いて、グルカレートを反応混合物から分離した。グルクロン酸塩はそのtrans−ジオール基のためにこのゲルには結合できない。Affi-gelに反応混合物を負荷した後、カラムを80mMリン酸カリウム−20mMホウ酸バッファー(pH7.0)で洗浄し、次にグルカレートを0.1MのHClを添加して溶出した。溶出物を5MのNaOHを加えて中性化し、LC−MSにより、Aminex HPX-87Hカラム(300×7.8mm、Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA USA)および電子スプレーイオン化検出器を備えたAgilent 1100シリーズLC/MSD(Agilent Technologies, US)を用いて分析した。質量スペクトルを、陽イオンおよび陰イオン検出モードの両方で得た。図8に示すスペクトルは、陰イオン検出モードからのものである。0.1%(v/v)トリフルオロ酢酸、pH2.0を移動相として、0.5mL/分の流速で室温にて用いた。
グルクロン酸塩から形成されたグルカレートの立体化学を、その円偏光二色性(CD)スペクトルを真正グルカレート標準のそれと比較することにより確認した。CDは、Aviv Model 202CDスペクトロメータ(Aviv Biomedical, Lakewood, NJ)で行った。反応混合物は、20mMのグルクロン酸、7mMのNAD+、100mMのリン酸カリウムバッファー(pH8.0)、および上記のように調製した精製酵素を含む。グルカレートはグルクロン酸から、上記のようにボロン酸親和性ゲルを用いて分離した。
Biocyc(商標)(http://bicyc.org/)を用いて、関連する代謝経路および代謝物を同定した。P. syringae 、P. putida、およびA. tumefaciensのDNA配列をNCBI(National Center for Biotechnology Information;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)より、それぞれアクセッション番号NC_004578、NC_002947、およびNC_003063として得た。相同性および保存ドメイン探索は、NCBIのBLASTアルゴリズムを用いて行った。配列の管理およびアラインメントは、Vector NTIソフトウェア(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いて行った。アラインメントおよび系統学的解析は、Vector NTIのAlignXモジュールを用いて行った。
P. syringaeからのudh遺伝子配列を、GenBankにアクセッション番号EU377538(核酸配列は配列番号1;アミノ酸配列は配列番号2)として寄託した。A. tumefaciensおよびP. putidaからの対応する遺伝子を、それぞれアクセッション番号BK006462(DNA:配列番号23;タンパク質:配列番号24)およびBK006380(DNA:配列番号25;タンパク質:配列番号26)として寄託した。
酵素分析用の細菌溶解物は、凍結融解法により調製した。udh遺伝子を含む大腸菌株は、0.1mMのIPTG(イソプロピルβ−D−1チオガラクトピラノシド)を含有するLB倍地中一晩増殖させた。ペレットは1mg/mLのリソザイム溶液中に再懸濁させ、氷上で30分インキュベートした。懸濁物を液体窒素で凍結し、37℃の水浴で融解した。このステップを5回繰り返した。細胞溶解物を14,000rpm、4℃で15分遠心分離し、上清を酵素分析に用いた。グルクロン酸塩のUdh活性を、340nmでのNADH(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元)の生成をモニタリングすることにより測定した(38)。反応混合物は、2.5mMのグルクロン酸塩、0.9mMのNAD+(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)、および100mMのリン酸ナトリウムバッファーからなる。反応は、溶解物を反応混合物に室温で加えることにより誘導し、モニタリングした。Udh活性用に最適なpHを決定するため、反応混合物のpHをHClまたはNaOH溶液を添加して6.5〜9.9に調節した。総タンパク質濃度はBradford法(Bradford (1976) Anal Biochem 72:248-54))を用いて決定した。特異的活性は、総タンパク質1ミリグラム当たりの単位(1U=生成した1μmolNADH/分)で表した。化学物質はSigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)から購入した。
Pseudomonas syringaeからのudh遺伝子のクローニング
P. syringaeのUdh活性に対応する遺伝子を同定するために確立されたスクリーンは、大腸菌MG1655の変異株を利用した。uxaCの欠失は、グルクロン酸塩での増殖を妨害し、一方でグルカレートを単一の炭素源として増殖する能力を保持する。Udhはグルクロン酸塩のグルカレートへの変換を触媒するため(3、38)、P. syringaeのゲノムライブラリからのudh遺伝子を含む大腸菌MG1655ΔuxaCクローンは、グルクロン酸塩を単一の炭素源として増殖するはずである。大腸菌DH10BおよびpTrc99Aを、それぞれ、P. syringaeのゲノムライブラリの最初の構築のための宿主株およびプラスミドベクターとして用いた。ライブラリプラスミドプールを大腸菌DH10Bクローンプールから調製し、ΔuxaC株の形質転換に用いた。形質転換ΔuxaCクローンを、グルクロン酸塩含有のM9最少寒天上、30℃で4日間インキュベートした。
P. syringaeからのudhの翻訳タンパク質配列を、NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)のBLASTPを用いて解析し、推定相同体を同定した。A. tumefaciensのUdh活性は前に検討されている(5、6、43)。A. tumefaciensのオープンリーディングフレームAtu3143の翻訳は、最大の配列同一性47.8%を有し、相同体Udhの候補と考えられた。他の候補となるオープンリーディングフレーム、Pseudomonas putidaKT2440のPP1171もまた、P. syringaeUdhと、75.6%の配列同一性という高い類似性を有することが見出された。Atu3143およびPP1171をそれぞれのゲノムからPCR増幅し、P. syringaeからのudhと共にプラスミドベクターpTtrc99SEに組み込んで、それぞれプラスミドpTATudh2、pTPPudh、およびpTPSudhを作り出し、発現組換えタンパク質の相対的活性を比較した。形質転換DH10Bクローンは、0.1mMのIPTG有りまたは無しのLBで培養され、つぎに粗溶解物を調製して酵素分析を行った(図7)。これらのアッセイにより、P. syringaeで前に得られたものと同様に、A. tumefaciensおよびP. putidaの組換えタンパク質に対して、グルクロン酸塩が基質として存在する中でのNAD+消費活性が確認された。A. tumefaciensおよびP. putidaからの2つのudh遺伝子も、GenBankに、それぞれアクセッション番号BK006462(DNA:配列番号23;タンパク質:配列番号24)およびBK006380(DNA:配列番号25;タンパク質:配列番号26)として寄託した。
P. syringaeのudh遺伝子を含む大腸菌粗溶解物を用いた酵素反応により、低い基質負荷について、反応速度がグルクロン酸塩濃度に比例している、グルクロン酸塩を基質として用いる活性の存在を確認した(データ示されず)。この活性は、NAD+も利用するが、補因子としてNADP+は利用しない(データ示されず)。これらの結果は、基質が酸化されたことを示した。グルクロン酸塩の構造の検討により、2つの可能な酸化点が示唆される:アルコールのケトンへの変換、またはアルデヒドのカルボン酸への変換であり、後者の反応はグルカレートを産生する。これら2つの産物の違いは質量スペクトルからも明らかであり、前者は基質に対して−2の質量差であり、一方後者は+16の質量差が生じる。酵素反応の産物がグルカレートであることを確認するために、試料をLC−MSで分析した。酵素反応から分離された溶出物のスペクトルと、グルカレート標準のスペクトルは一致し、グルカレートがUdh反応の産物であることを示唆した(図8)。
精製した調製物を、各酵素の反応速度パラメータkcatおよびKmの決定に用いた。グルクロン酸塩およびガラクツロン酸塩の両方を基質として用いて、NAD+補因子濃度を変えて、対応するKmを決定した(表5)。補因子濃度を変えることにより得たkcatの測定値は、グルクロン酸塩を基質として用いて得た値の20%以内であった(データ示されず)。全てのケースにおいて、kcatはグルクロン酸塩に対してガラクツロン酸塩に対するよりも高かった。最大の速度定数は、グルクロン酸塩を基質として用いた、A. tumefaciens酵素について見出され(kcat=1.9×102s−1)、これはPseudomonas酵素についての速度よりも2倍以上大きかった。しかし、ミカエリス(親和性)定数は全てのケースにおいて、ガラクツロン酸塩に対して低く、最少のKmは0.04mMで、これはガラクツロン酸塩を基質として用いた、P. syringae酵素について見出された。一次速度定数kcat/Kmは、ガラクツロン酸塩を基質として用いた場合にもっとも高く、グルクロン酸塩とガラクツロン酸塩の間の最大の差はP. syringaeについて観察された。
これらの反応の産物の最終的な特徴づけのために、ボロン酸親和性ゲルを用いて、精製タンパク質を用いたin vitro反応における全3種の酵素から産生された推定グルカレートを単離した。3つの産物の試料を次に円偏光二色性(CD)分析して、化合物の立体化学を試験した。全3つのスペクトルはグルカレート標準と一致し、産物がグルカン酸であることの同定を、および、3つの遺伝子がウロン酸デヒドロゲナーゼをコードするものであることの同定を確認した(データ示されず)。
ウロン酸デヒドロゲナーゼ(Udh)は、細菌でのアルドヘキサウロネート異化作用のための酸化経路の第1段階を触媒する。細菌においては、P. syringaeおよびA. tumefaciensのUdhの限定された研究のみが報告されている。さらに、Udhは真核生物では研究報告はさらに稀である。Udh配列はワイン用ブドウVitis viniferaにおいて報告されており、ここではガラクツロン酸レダクターゼとして同定されている(EC 1.1.1.203;BRENDAアクセッション番号A1Y2Z0、GenBankアクセッション番号DQ843600)。我々はこの遺伝子を、大腸菌内での発現用に最適化されたコドンを用いて合成し(DNA 2.0, Menlo Park, CA)、組換えタンパク質を発現した。しかし、NAD+またはNADP+のどちらかを補因子として用いた場合に、Udhに関連する活性は観察されていない(データ示されず)。この配列と本研究において同定されたP. syringaeUdhのアラインメントは、これらの間に10%のみの同一性を明らかにした。我々は、V. vinifera酵素が大腸菌で機能的に発現されなかった可能性を除外できない;しかし、アラインメントに基づけば、V. viniferaからの報告された配列は、ウロン酸デヒドロゲナーゼではないか、または酵素の高度に発散したもの(divergent version)である。
本明細書に開示された全ての参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。
Claims (75)
- ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現し、かつミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する細胞。
- ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、細菌遺伝子である、請求項1に記載の細胞。
- ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、Pseudomonas syringae遺伝子またはPseudomonas putida遺伝子である、請求項1または2に記載の細胞。
- ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、Agrobacterium tumefaciens遺伝子である、請求項1または2に記載の細胞。
- ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子が、哺乳動物遺伝子である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細胞。
- ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子が、マウス遺伝子である、請求項5に記載の細胞。
- 細胞が、ミオイノシトール1−リン酸シンターゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の前記細胞。
- ミオイノシトール1−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、酵母遺伝子である、請求項7に記載の細胞。
- ミオイノシトール1−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、Saccharomyces cerevisiae遺伝子である、請求項8に記載の細胞。
- 細胞が、原核細胞である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の前記細胞。
- 細胞が、細菌細胞である、請求項10に記載の前記細胞。
- 細菌細胞が、大腸菌細胞である、請求項11に記載の細胞。
- ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび/またはミオイノシトール1−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、細菌での発現のためにコドン最適化により改変されている、請求項1〜12のいずれか一項に記載の細胞。
- 細胞が、真核細胞である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の前記細胞。
- 細胞が、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である、請求項14に記載の前記細胞。
- ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび/またはミオイノシトール1−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、プラスミド上に発現される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の細胞。
- ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび/またはミオイノシトール1−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、細胞のゲノム内に統合されている、請求項1〜15のいずれか一項に記載の細胞。
- グルカン酸の産生が、細胞内でのウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび/またはミオイノシトール1−リン酸シンターゼ酵素のタンパク質工学により増加する、請求項1〜17のいずれか一項に記載の細胞。
- グルカン酸の産生が、細胞内のグルカン酸代謝経路の成分を突然変異させることにより増加する、請求項1〜18のいずれか一項に記載の細胞。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載の細胞を培養することを含む、グルカン酸を産生するための方法。
- グルカン酸を細胞から回収することをさらに含む、請求項20に記載の方法。
- ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよびミオイノシトール1−リン酸シンターゼをコードする1または2以上の組換え核酸分子を含む、遺伝的に改変された微生物。
- グルカン酸を産生するための方法であって、細胞を、ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよびミオイノシトール1−リン酸シンターゼの少なくとも1つを組換え技術により発現するように、遺伝子操作すること、該細胞の集団を培養すること、およびグルカン酸を産生するように遺伝的に改変された細胞の集団から、グルカン酸を回収することを含む、前記方法。
- 細胞が、ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する、請求項23に記載の方法。
- 細胞が、ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する、請求項23または24に記載の方法。
- 細胞が、ミオイノシトール1−リン酸シンターゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する、請求項23〜25のいずれか一項に記載の方法。
- ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、細菌遺伝子である、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、Pseudomonas syringae遺伝子またはPseudomonas putida遺伝子である、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、Agrobacterium tumefaciens遺伝子である、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子が、哺乳動物遺伝子である、請求項23〜29のいずれか一項に記載の方法。
- ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子が、マウス遺伝子である、請求項30に記載の方法。
- ミオイノシトール1−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、酵母遺伝子である、請求項23〜31のいずれか一項に記載の方法。
- ミオイノシトール1−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、Saccharomyces cerevisiae遺伝子である、請求項32に記載の方法。
- 細胞が、原核細胞である、請求項23〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が、細菌細胞である、請求項34に記載の方法。
- 細菌細胞が、大腸菌細胞である、請求項35に記載の方法。
- ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび/またはミオイノシトール1−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、細菌での発現のためにコドン最適化により改変されている、請求項23〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が、真核細胞である、請求項23〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である、請求項38に記載の方法。
- ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび/またはミオイノシトール1−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、プラスミド上に発現される、請求項23〜39のいずれか一項に記載の方法。
- ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび/またはミオイノシトール1−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、細胞のゲノム内に統合されている、請求項23〜37のいずれか一項に記載の方法。
- グルカン酸の産生が、細胞内でのウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび/またはミオイノシトール1−リン酸シンターゼ酵素のタンパク質工学により増加する、請求項23〜41のいずれか一項に記載の方法。
- グルカン酸の産生が、細胞内のグルカン酸代謝経路の成分を突然変異させることにより増加する、請求項23〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養物により産生されたグルカン酸であって、前記細胞培養物中の細胞が、ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよびミオイノシトール1−リン酸シンターゼの少なくとも1つを組換え技術により発現するように遺伝的に改変された、前記グルカン酸。
- 細胞が、ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する、請求項44に記載のグルカン酸。
- 細胞が、ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する、請求項44または45に記載のグルカン酸。
- 細胞が、ミオイノシトール1−リン酸シンターゼをコードする遺伝子を組換え技術により発現する、請求項44〜46のいずれか一項に記載のグルカン酸。
- ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、細菌遺伝子である、請求項44〜47のいずれか一項に記載のグルカン酸。
- ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、Pseudomonas syringae遺伝子またはPseudomonas putida遺伝子である、請求項44〜48のいずれか一項に記載のグルカン酸。
- ウロン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、Agrobacterium tumefaciens遺伝子である、請求項44〜48のいずれか一項に記載のグルカン酸。
- ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子が、哺乳動物遺伝子である、請求項44〜50のいずれか一項に記載のグルカン酸。
- ミオイノシトールオキシゲナーゼをコードする遺伝子が、マウス遺伝子である、請求項51に記載のグルカン酸。
- ミオイノシトール1−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、酵母遺伝子である、請求項44〜52のいずれか一項に記載のグルカン酸。
- ミオイノシトール1−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、Saccharomyces cerevisiae遺伝子である、請求項53に記載のグルカン酸。
- 細胞が、原核細胞である、請求項44〜54のいずれか一項に記載のグルカン酸。
- 細胞が、細菌細胞である、請求項55に記載のグルカン酸。
- 細菌細胞が、大腸菌細胞である、請求項56に記載のグルカン酸。
- ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび/またはミオイノシトール1−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、細菌での発現のためにコドン最適化により改変されている、請求項44〜57のいずれか一項に記載のグルカン酸。
- 細胞が、真核細胞である、請求項44〜54のいずれか一項に記載のグルカン酸。
- 細胞が、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である、請求項59に記載のグルカン酸。
- ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび/またはミオイノシトール1−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、プラスミド上に発現される、請求項44〜60のいずれか一項に記載のグルカン酸。
- ウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび/またはミオイノシトール1−リン酸シンターゼをコードする遺伝子が、細胞のゲノム内に統合されている、請求項44〜60のいずれか一項に記載のグルカン酸。
- グルカン酸の産生が、細胞内でのウロン酸デヒドロゲナーゼ、ミオイノシトールオキシゲナーゼおよび/またはミオイノシトール1−リン酸シンターゼ酵素のタンパク質工学により増加する、請求項44〜62のいずれか一項に記載のグルカン酸。
- グルカン酸の産生が、細胞内のグルカン酸代謝経路の成分を突然変異させることにより増加する、請求項44〜63のいずれか一項に記載のグルカン酸。
- 以下からなる群:
(a)配列番号1、配列番号23または配列番号25を含む、単離された核酸分子;
(b)配列番号2、配列番号24または配列番号26の配列を含むアミノ酸配列をコードする、単離された核酸分子;
(c)(a)または(b)の全長配列の逆補体である、単離された核酸分子;
(d)(a)〜(c)のいずれかと少なくとも95%のヌクレオチド同一性を有する、単離された核酸分子、
から選択される、単離された核酸分子。 - 転写調節要素に操作可能に結合した請求項65に記載の核酸分子を含む、組換え発現ベクター。
- 請求項65に記載の核酸分子によりコードされた、単離されたウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチド。
- 配列番号2と少なくとも95%のアミノ酸同一性を含む、単離されたウロン酸デヒドロゲナーゼポリペプチド。
- 請求項66の組換え発現ベクターを含む、細胞。
- 細胞が、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞である、請求項69に記載の細胞。
- 請求項69または70に記載の細胞を、ポリペプチドの発現を許容する条件下で培養することを含む、ウロン酸デヒドロゲナーゼの産生方法。
- ポリペプチドを培養培地または細胞から回収することをさらに含む。請求項71に記載の方法。
- 請求項67のポリペプチドに選択的に結合する、単離された抗体。
- 請求項68のポリペプチドに選択的に結合する、単離された抗体。
- 抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはこれらの抗原結合断片である、請求項73または74に記載の前記抗体。
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