JP2016029400A - 表面増強ラマン分光法（ｓｅｒｓ）活性粒子を使用するアッセイ - Google Patents

表面増強ラマン分光法（ｓｅｒｓ）活性粒子を使用するアッセイ Download PDF

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Abstract

【課題】当技術分野で知られている生物学的アッセイには制限がある。【解決手段】本明細書では、液体ベースアッセイ、磁気捕捉アッセイ、アッセイにおいてシグナル増幅を行うための微小粒子−ナノ粒子サテライト構造、標的の増強検出に有用な複合ＳＥＲＳ活性粒子、ならびに試料チューブおよびそれを使用するためのプロセスを含む、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）活性粒子を使用する診断アッセイが開示されている。【選択図】図１

Description

本明細書で開示されている発明対象は、液体ベースアッセイ、磁気捕捉アッセイ、アッセイにおいてシグナル増幅を行うための微小粒子−ナノ粒子サテライト構造、標的の増強検出に有用な複合ＳＥＲＳ活性粒子、ならびに試料チューブおよびそれを使用するためのプロセスを含む、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）活性粒子を使用する診断アッセイに関する。
アッセイにおいて１つまたは複数の分析対象の存在を検出するさまざまな技術が開発されている。例えば、蛍光、発光、化学発光、または電気化学発光技術が、生体試料中の分析対象を検出するために使用されてきた。生体試料中の１つまたは複数の分析対象の存在および／または量を検出するために微小またはナノ粒子が使用されるアッセイを含む多くの生物学的アッセイにおいて、分析対象の存在を検出するために、シグナル伝達事象の発生が利用される。
米国特許第６，３４４，２７２号明細書 米国特許第６，６８５，９８６号明細書 米国特許第６，６９９，７２４号明細書 米国特許第６，９１３，８２５号明細書 米国特許第６，５１４，７６７号明細書 米国特許出願公開第２００３／０１６６２９７号明細書 米国特許出願公開第２００５／０１５８８７０Ａ１号明細書 米国特許第５，２６６，４９８号明細書 米国特許第７，００２，６７９号明細書 米国特許出願公開第２００６／０２４０５７２号明細書 米国特許出願公開第２００５／０２４８７５８号明細書 米国特許第６，５４８，１６８号明細書 米国特許出願公開第２００１／０００２３１５号明細書 米国特許第５，８６０，９３７号明細書 米国特許第５，９０６，７４４号明細書 米国特許第６，８２１，７８９号明細書 米国特許第６，５１４，７６７Ｂ１号明細書 米国特許第７，１９２，７７８Ｂ２号明細書 米国特許出願公開第２００５／１５８８７０Ａ１号明細書 米国特許第５，９４５，２８１号明細書 米国特許第６，５１４，４１５Ｂ２号明細書 米国特許第５，４７２，８８１号明細書 米国特許第７，１６９，５５６号明細書 米国特許出願公開第２００６／００５４５０６号明細書 米国特許出願公開第２００６／００４６３１３号明細書
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しかし、当技術分野で知られているこのような生物学的アッセイには制限がある。そこで、限定はしないが、増強感度、特異性、確度、反復可能性、およびこれらの組合せを含む、１つまたは複数の増強された特性を有するアッセイを実現すると好都合であり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されている発明対象は、対象とする１つまたは複数の分析対象に対する親和性を有する結合要素が付着した磁気捕捉粒子およびこれもまた対象とする１つまたは複数の分析対象に対する親和性を有する結合要素が付着したＳＥＲＳ活性ナノ粒子を含む液体ベースアッセイを提供する。１つまたは複数の分析対象を含む生体試料と接触すると、磁気捕捉粒子−分析対象−ＳＥＲＳ活性ナノ粒子複合体が形成される。磁気捕捉粒子−分析対象−ＳＥＲＳ活性ナノ粒子複合体をアッセイ容器内の特定の領域内に局在させてＳＥＲＳシグナルを検出するために、磁気捕捉粒子の磁気特性を利用することができる。
他の実施形態において、本明細書で開示されている発明対象は、基準標識を組み込んだ磁気捕捉／液体ベースアッセイを提供する。このような実施形態では、磁気プルダウン（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ）に使用される磁性粒子は、対象とする分析対象に特異的な結合要素に加えて、検出可能なシグナルを発生することができる基準標識で標識する。ペレットサイズ、形状、または位置の変動を補正するために、磁気捕捉粒子−分析対象−ＳＥＲＳ活性ナノ粒子複合体のＳＥＲＳ活性ナノ粒子によって放出されるシグナルの基準を、磁気捕捉粒子に付着した基準標識のシグナルに合わせることができる。
さらなる実施形態では、液体ベースアッセイなどのアッセイにおいて、磁気プルダウンを伴い、または磁気プルダウンを伴わずに、溶解試薬を使用することができる。溶解試薬を使用すると、例えば、ヒト血液、血漿、または血清などの生体マトリックス中の、または細胞内の対象とする分析対象に対するシグナルの増強および／または検出限度の向上をもたらすことができる。
さらに他の実施形態では、液体ベースアッセイでシグナルを増幅するための方法が提供される。このような方法は、磁気捕捉複合体を局在させる前にアッセイ溶液中にすでに存在しているレポーター分子、例えば、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子と同じシグナル発生能力を有する第２のアリコートのレポーター分子を加えるステップを含む。この第２のアリコートのレポーター分子には、アッセイ溶液中に存在するレポーター分子の結合要素に対する親和性を有する１つまたは複数の結合要素が付着している。したがって、第２のレポーター分子は、第１のレポーター分子に結合することができ、その結果、磁気捕捉粒子−分析対象−レポーター分子複合体１つ当たりのシグナルが大きくなる。
他の実施形態では、磁気捕捉／液体ベースアッセイにおけるラマン基準スペクトルおよびスペクトル分析を改善するための方法が提供される。一実施形態では、対象とする１つまたは複数の分析対象の基準スペクトルは、溶液中で得られる分析対象の基準スペクトルを使用するのとは反対に、磁化ペレット内に配置された分析対象により得られる。他の実施形態では、分析が実行される波長領域を選択するステップと、初期分析からの結果に基づきスペクトルフィッティング法、例えば、最小二乗フィッティング法の構成要素を選択するステップとを含む、ＳＥＲＳスペクトル分析を改善する方法が提供される。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されている発明対象は、コア粒子に結合している、複数のシグナル担持粒子、例えば、ナノ粒子を含む、本明細書で「サテライト」構造と称する複合構造を含む複合ナノ構造を提供する。他の実施形態では、コア粒子、コア粒子を囲むラマン活性物質などの活性物質、および活性物質を囲む金属シェルなどの１つまたは複数のシェルを含む、本明細書で「コアシェル」構造と称する複合構造が提供される。本明細書で開示されているサテライトおよびコアシェル構造は、ＳＥＲＳアッセイなどのアッセイでシグナルを増幅または他の何らかの方法で増強するために使用できる。
いくつかの実施形態では、一貫性のあるサイズ、形状、および密度を有する磁性粒子ペレットを形成するように設計された試料チューブが提供され、この試料チューブは、磁性粒子ペレットを所望のサイズに物理的に制約する寸法を有する。試料チューブは、磁性粒子ペレットから発生した光シグナルを検出するための光学窓を含むことができる。試料チューブに隣接し、その下に位置する磁石を使用する磁性粒子ペレットを形成するためのシステムが提供される。このシステムは、磁気捕捉アッセイで使用することができる。本明細書で開示されている発明対象は、さらに、試料チューブ内により小さな、密度の高い、磁性粒子ペレットを確実に形成する方法に関する。
本明細書では、本発明で開示されているアッセイを実行するのに好適な代表的システムおよび計装類も提示される。
上述の本明細書で開示されている発明対象の特定の態様は本明細書で開示されている発明対象によって全部または一部取り扱われているが、以下において最もよく説明されている添付の実施例および図面とともに読むと説明が進行するにつれ他の目的も明らかになる。
本明細書で開示されている発明対象について一般用語で説明してきたが、その際に、必ずしも縮尺通りでない付属の図面を参照することにする。
本明細書で開示されている代表的な磁気捕捉アッセイの略図である。 磁気捕捉粒子上の基準として基準標識、例えば、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子を使用することを示す略図である。 非基準シグナルと基準シグナルの比較を示すグラフである。非基準シグナル（Ｂ）は、トランス−１，２−ビス（４−ピリジル）エチレン（ＢＰＥ）ラマンレポーターの１５９０ｃｍ-1におけるピーク強度であり、基準シグナル（Ａ）は、１５９０ｃｍ-1におけるピーク強度と１１８０ｃｍ-1におけるピーク強度との比であり、これは、４，４'−ジピリジル（ＤＰＹ）レポーターに対応するピーク強度である。グラフの左側の目盛は、基準シグナル（Ａ）に対応しているが、グラフの右側の目盛は、非基準シグナル（Ｂ）に対応していることに留意されたい。 本明細書で開示されているアッセイとともに使用するのに適している光学系の一例の略図である。 試料チューブ回転によるペレット形成を表す略図である。 試料チューブ回転によるペレット形成を表す略図である。 試料チューブ回転によるペレット形成を表す略図である。 試料チューブ回転によるペレット形成を表す略図である。 溶血試薬（ｒｇｔｓ）がある場合とない場合の緩衝液、血漿、および溶解血液中の４，４'−ジピリジル（ＤＰＹ）レポーターシグナルの比較を示すグラフである。 シグナル増幅法を使用する本明細書で開示されているアッセイを示す代表的な略図である。 本明細書で開示されているシグナル増幅法が存在しない場合に同一試薬で実施された液体ベースのイムノアッセイの比較を示す図である。 本明細書で開示されているシグナル増幅法が存在する場合に同一試薬で実施された液体ベースのイムノアッセイの比較を示す図である。 ポリヌクレオチド検出形式の本明細書で開示されている増幅法を示す代表的な略図である。 本明細書で開示されているシグナル増幅法が存在しない場合のＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイの結果を示す図である。 本明細書で開示されているシグナル増幅法が存在する場合のＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイの結果を示す図である。 特徴の誤った整列によりランダムシグナルが入力変数に誤って割り当てられる可能性を示す図である。最小二乗法ルーチンを使用して、標準偏差が１０，０００である正規分布している不規則雑音のフィッティングが行われた。この実施例では、他のマーカーの負の重みのバランスをとるためにマーカー４に重み０．５が割り当てられた。 特徴の誤った整列によりランダムシグナルが入力変数に誤って割り当てられる可能性を示す図である。最小二乗法ルーチンを使用して、標準偏差が１０，０００である正規分布している不規則雑音のフィッティングが行われた。この実施例では、他のマーカーの負の重みのバランスをとるためにマーカー４に重み０．５が割り当てられた。 溶液中で得られた代表的な基準スペクトルを示す図である。 磁性粒子ペレット中で得られた代表的な基準スペクトルを示す図である。マーカー１に関するマーカー５のピーク（８６５ｎｍに近い）は、ペレット内では高く、８８０ｎｍのピークの形状は、わずかに異なる。 多重化実験における５つのマーカーのうちの１つについての濃度推定値を示すグラフである。濃度レベル２０は、２．５Ｅ８マーカー粒子／ｍＬに対応する。ペレットベースの基準スペクトル（塗りつぶした菱形）を使用した推定値は、溶液ベースの基準スペクトル（白抜きの円）に比べて、特に低い濃度で、確度および精度がよいことを示している。直線は、１：１の関係を示している。（わかりやすくするため、溶液ベースのデータ点はｘ軸上のペレットベースの点からオフセットされる。） 本明細書で開示されている発明対象の一実施形態によるサテライト構造の透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）である。 本明細書で開示されている発明対象の一実施形態による分析対象シグナルを増幅するためのサテライト構造を使用するサンドイッチアッセイの図である。 本明細書で開示されている発明対象の一実施形態による分析対象シグナルを増幅するためのサテライト構造を使用するサンドイッチアッセイを示す図である。 磁場を印加した後の図１６Ａのサンドイッチアッセイを示す図である。 本明細書で開示されている発明対象の一実施形態によるコアシェル複合粒子の断面を示す図である。 本明細書で開示されている発明対象の一実施形態による試料チューブの側面図である。 図１８Ａに示されている試料チューブのセクションＡ−Ａにそって切り取った側断面図である。 図１８Ａに示されている試料チューブの底面図である。 本明細書で開示されている発明対象の一実施形態による試料チューブに隣接し、下に位置する磁石の側面図である。 図１９Ａに示されている磁石および試料チューブの上面図である。 本明細書で開示されている発明対象の一実施形態による試料チューブを使用する甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）アッセイ結合曲線を例示するグラフである。
次に、本明細書で開示されている発明対象の、すべてではないが、いくつかの実施形態が示されている、付属の図面を参照しつつ、本明細書で開示されている発明対象についてさらに詳しく以下で説明する。本明細書に記載されている、本明細書で開示されている発明対象の多くの修正形態および他の実施形態は、本明細書で開示されている発明対象が関係する当業者であれば前記の説明および関連する図面に提示されている教示を利用して思い付くものである。したがって、本明細書で開示されている発明対象は、開示されている特定の実施形態に限定されず、また修正形態および他の実施形態は、付属の請求項の範囲内に含まれることを意図されていることは理解されるであろう。本明細書では特定の用語が使用されているが、これらの用語は、一般的で説明的な意味でのみ使用され、制限することを目的としていない。
「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という語は、請求項を含めて、本出願で使用される場合に「１つまたは複数」を指す。したがって、例えば、「試料（ａ ｓａｍｐｌｅ）」への言及は、文脈上明らかに反していない限り（例えば、複数の試料である場合）、複数の試料を含み、他も同様である。
本明細書および請求項の全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、文脈上排他的な意味を必要とする場合を除き、非排他的な意味で使用される。
本明細書で使用されているような「約（ａｂｏｕｔ）」という語は、値に言及する場合、指定された量から、いくつかの実施形態では±５０％、いくつかの実施形態では±２０％、いくつかの実施形態では±１０％、いくつかの実施形態では±５％、いくつかの実施形態では±１％、いくつかの実施形態では±０．５％、いくつかの実施形態では±０．１％の変動を包含することを意図されており、そのような変動は、開示されている方法を実施するか、または開示されている組成物を採用するうえで適切な量である。
さらに、量、濃度、または他の値もしくはパラメータが、ある範囲、好ましい範囲、または上側の好ましい値と下側の好ましい値のリストのいずれかとして与えられた場合、これは、範囲が別に開示されていようといまいと、範囲上限値または好ましい値と範囲下限値または好ましい値の対から形成されたすべての範囲を特に開示するものとして理解されるべきである。本明細書において数値の範囲が記載されている場合、特に断りのない限り、この範囲は、その終点、およびその範囲内のすべての整数および分数を含むことが意図されている。本明細書で開示されている発明対象の範囲は、数値範囲を定義するときに記載される特定の値に限定されることを意図されていない。
Ｉ．ＳＥＲＳ活性粒子を使用するアッセイ
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている発明対象は、生体試料中の対象とする分析対象またはリガンドの存在を検出するか、もしくは量を測定するための診断アッセイを実現する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている発明対象は、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子を使用して診断アッセイを実行するためのアッセイ方法、組成物、システム、機器、およびキットを実現する。
以下でさらに詳しく説明されるように、本明細書で開示されているアッセイの検出能力は、当技術分野で知られているアッセイに対し１つまたは複数の点で改善される。これらの改善点は、限定はしないが、シグナル強度の増大、特異性の増強、確度の向上、反復性の改善、およびこれらの組合せを含む。本明細書で開示されているアッセイは、さらに、当技術分野で知られているアッセイに比べて短い時間で診断結果を出すことができる。単独または併用によるこのような改善により、検出方法としてラマン分光法を使用する診断アッセイ、組織の光学的画像化、および他の用途などの、このような増強を必要とする用途で本明細書で開示されている方法を使用できる。
診断アッセイで使用される場合、本明細書で開示されている方法について観察される増強される特性を使用することで、当技術分野で知られているＳＥＲＳ法を使用して測定可能なものと比べて低い濃度で、限定はしないが、タンパク質、ポリヌクレオチド、および代謝産物を含む、バイオマーカーを検出することができ、また細胞（例えば、有機体全体）を検出することもできる。これらの増強された特性は、さらに、ラマンシグナルが全血または血清などの複合媒質を通過しなければならない用途、つまり、ラマンシグナルがそのような媒質を通じて伝送される用途に役立つ。さらに、増強された特性を有する診断アッセイは、対象の健康状態または疾患状態を早期に検出するために必要になる場合がある。
Ａ．概要：表面増強ラマン分光法
分子に特定の周波数の光子を照射すると、光子が散乱する。入射光子の大半は、周波数が変化することなく弾性的に散乱されるが（レイリー散乱）、入射光子のわずかな部分（１０6に対し約１の割合）は、照射された分子の振動モードと相互作用し、非弾性的に散乱される。非弾性的に散乱された光子は、周波数の偏移を起こし、周波数が高くなるか（反ストーク）、または周波数が低くなるか（ストーク）のいずれかである。非弾性的に散乱される光子の周波数をその強度に関してプロットすることにより、分子のラマンスペクトルが観察される。しかし、従来のラマン分光法の感度は低いため、（複数の）標的分析対象が典型的には少量存在する生体試料を特徴付けるための使用は制限されている。
ラマン活性分子が、金属表面上に吸着されるか、または金属表面に近接している、例えば、約５０Å以内の近さにある場合、ラマン活性分子から発生するラマンシグナルの強度は、増強することができる。例えば、ラマンシグナルが約１０3倍から約１０6倍、または場合によっては、１０14倍に高められることがこれまでに報告されている。この増強は、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）効果と称される。ＳＥＲＳ効果は、銀電極粗面上に吸着されたピリジンから強いラマン散乱が生じたことを観察したＦｌｅｉｓｈｍａｎらによって１９７４年に初めて報告された。（例えば、非特許文献１参照。また非特許文献２および非特許文献３参照。）これ以来、ＳＥＲＳは、金属表面上に吸着された多数の異なる分子について観察されてきた。（例えば、非特許文献４参照。）
ＳＥＲＳ増強の大きさは、金属表面における電磁場に関する吸着分子中に存在するさまざまな結合の位置および整列を含む多数のパラメータに依存する。ＳＥＲＳが生じるメカニズムは、（ｉ）入射光の局所的強度を増強する金属中の表面プラズモン共鳴と（ｉｉ）金属表面とラマン活性分子との間の電荷移動錯体の形成およびその後の遷移との組合せから生じる結果であると考えられている。
ＳＥＲＳ効果は、金属ナノ粒子を含む、金属コロイド粒子、誘電体基材上の金属膜、および金属粒子アレイ上に吸着されているか、または近接しているラマン活性分子で観察できる。例えば、Ｋｎｅｉｐｐらは、色素、クレシルバイオレットの単分子がコロイド状銀ナノ粒子の凝集塊上に吸着されることを検出したことを報告した。（例えば、非特許文献５参照。）その同じ年に、ＮｉｅとＥｍｏｒｙは、表面増強共鳴ラマン分光（ＳＥＲＲＳ）シグナルを観察したが、そこでは、ラマン活性分子の吸収エネルギーとナノ粒子の吸収エネルギーとの間の共鳴が、単一の銀ナノ粒子上に吸着された色素分子の約１０10から約１０12の大きさの増強を生じ、このナノ粒子は球形から棒状に至るまでいろいろであり、寸法は約１００ｎｍであった。（例えば、非特許文献６および非特許文献７参照。）
（複数の）ＳＥＲＳ活性分子に会合している、例えば、吸着または付着しているラマン増強粒子は、本明細書では「ＳＥＲＳ活性粒子」と称される。より具体的には、本明細書で称されているようなＳＥＲＳ活性粒子は、表面増強ラマン光散乱（ＳＥＲＳ）または表面増強共鳴ラマン光散乱（ＳＥＲＲＳ）を誘起する、引き起こす、または他の何らかの形で対応できる表面を有する粒子を含む。粗面、織目のある表面、および滑らかな表面を含む他の表面を含む、多くの表面が、ＳＥＲＳシグナルを発生することができる。
「ラマン散乱」は、一般的に、分子上に入射する光子の非弾性散乱を指す。非弾性散乱された光子は、入射光の周波数（ｖ0）と異なる周波数（ｖi）を有する。入射光と非弾性散乱光とのエネルギーの差（ΔＥ）は、（ΔＥ）＝ｈ｜ｖ0−ｖi｜と表すことができるが、ただし、ｈは、プランクの定数であり、分子によって吸収されるエネルギーに対応する。入射光は、任意の周波数ｖ0を有するものとすることができるが、典型的には、可視光または近赤外線スペクトル領域において単色光である。差の絶対値｜ｖ0−ｖi｜は、赤外振動数、例えば、振動周波数である。より具体的には、ｖ0以外の周波数の光を発生するプロセスが、「ラマン散乱」と称される。「ラマン散乱」光の周波数ｖ1は、ｖ0以上とすることができるが、周波数ｖ1＜ｖ0の光（ストークス光）の量は、周波数ｖ1＞ｖ0の光（反ストークス光）の量よりも大きい。
本明細書で使用されているように、「放射線」（ｒａｄｉａｔｉｏｎ、他の単語と結びついたときに訳し方により「光」）という用語は、検査対象の試料、例えば、１つまたは複数のＳＥＲＳ活性レポーター分子が会合するＳＥＲＳ活性ナノ粒子を含む試料中で表面増強ラマン散乱を誘起できる電磁放射線の形態のエネルギーを指す。より具体的には、この「放射線」（他の単語と結びついたときに訳し方により「光」）という用語は、ナノ粒子の表面に、ナノ粒子表面に近いところにあるレポーター分子中に光散乱、例えば、ラマン散乱を誘起する、放射する、対応できる、または他の何らかの形で引き起こさせる電磁放射線の形態のエネルギーを指す。本明細書で使用されているような「レポーター分子」は、固有波長の放射線を照射されたときにラマンスペクトルを発生することができる任意の分子または化合物を指す。「レポーター分子」は、本明細書では、「標識」、「色素」、「ラマン活性分子」、または「ＳＥＲＳ活性分子」とも称され、それぞれの用語は入れ替えて使用することができる。
「表面増強ラマン散乱」または「ＳＥＲＳ」は、ラマン活性分子が金属表面上に吸着されるか、または近接している、例えば約５０Åの範囲内の近さにある場合にラマン散乱シグナル、つまり強度が増強されたときに発生する現象を指す。「表面増強共鳴ラマン散乱」または「ＳＥＲＲＳ」は、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子表面に近接しているレポーター分子が励起波長で共鳴するときに発生する高められたＳＥＲＳシグナルを指す。
Ｂ．本明細書で開示されている方法とともに使用するのに適している代表的なナノ粒子
１．ナノ粒子の概要
任意のＳＥＲＳ活性粒子は、本発明で開示されている方法で使用するのに適している。このようなＳＥＲＳ活性粒子は、典型的には、ナノ粒子であり、また「ナノタグ」とも称される。本明細書で使用されているように、「ナノ粒子」、「ナノ構造」、「ナノ結晶」、「ナノタグ」、および「ナノコンポーネント」という用語は、入れ替えて使用することができ、また１ｎｍから１０００ｎｍの間の整数値（約１、２、５、１０、２０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、および１０００ｎｍを含む）を含む、約１ｎｍから約１０００ｎｍの範囲内の少なくとも１つの寸法を有する粒子を指す。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、金属ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、球形粒子、またはコア径が約２ｎｍから約２００ｎｍ（約２、５、１０、２０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、および２００ｎｍを含む）である実質的に球形の粒子である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、約２ｎｍから約１００ｎｍ（約２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、および１００ｎｍを含む）のコア径を有し、いくつかの実施形態では、約２０ｎｍから１００ｎｍ（約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、および１００ｎｍを含む）のコア径を有する。当業者であれば、本明細書で開示されている発明対象を検討した後、本明細書で開示されているアッセイとともに使用するのに適しているナノ粒子が、ラマン効果を誘起するコア、例えば、金属コアを含むことができ、さらにナノ粒子構造のサイズ、例えば、全直径にも寄与することができるＳＥＲＳ活性物質、カプセル材料、および／または外殻構造の１つまたは複数の層を含むことができることを理解するであろう。
本明細書で開示されている方法とともに使用するのに適しているＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、典型的には、少なくとも１つの金属、つまり、一般に金属と呼ばれる、元素周期表から選ばれた少なくとも１つの元素を含む、好適な金属としては、Ｃｕ、Ａｇ、およびＡｕなどの第１１族の金属、またはアルカリ金属などのＳＥＲＳに対応できる当業者に知られている他の金属がある。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、実質的に、単一の金属元素を含む。例えば、金ナノ粒子の生成については、非特許文献８において説明されている。他の実施形態では、ナノ粒子は、合金、例えば、二元合金などの少なくとも２つの元素の組合せを含む。いくつかの実施態様では、ナノ粒子は、磁性を有する。
他の実施形態では、金属は、Ａｕ2Ｓ／Ａｕコアシェル粒子などに追加の構成要素を含む。Ａｕ2Ｓ／Ａｕコアシェル粒子は、広くチューニング可能な近赤外線光学共鳴を持つことが報告されている。（例えば、非特許文献９参照。）さらに、文献に記載されているような（例えば、非特許文献１０参照）Ａｇコア／Ａｕシェル粒子、またはＡｕコア／Ａｇシェル粒子、またはＳＥＲＳ活性金属を伴う任意のコアシェルの組合せが使用できる。ＡｕまたはＡｇ官能化シリカ／アルミナコロイド、ＡｕまたはＡｇ官能化ＴｉＯ2コロイド、Ａｕナノ粒子キャップＡｕナノ粒子（例えば、非特許文献１１参照）、Ａｕナノ粒子キャップＴｉＯ2コロイド、および銀キャップＳｉＯ2コロイドまたは金キャップＳｉＯ2コロイドなどの、金属シェルとともにＳｉコアを有する粒子（つまり、「ナノシェル」）を含む、コアシェル粒子で使用するのに好適な他の組合せが、本明細書で開示されている方法とともに使用するのにも適している。（例えば、非特許文献１２参照。また参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇらの特許文献１および特許文献２参照。）バイオセンシング用途でこのようなナノシェルを使用することについて説明されている。（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているＷｅｓｔらの特許文献３参照。）
本明細書で開示されている方法とともに使用するのに適している他のクラスのナノ粒子としては、内側面を有するナノ粒子がある。このようなナノ粒子は、中空粒子および中空ナノ結晶または多孔質もしくは半多孔質ナノ粒子を含む。（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているＯｓｔａｆｉｎらの特許文献４参照。）したがって、本明細書で開示されている発明対象は、さらに、ＳＥＲＳに対し活性のあるコアシェル粒子またはＳＥＲＳに対し活性のある中空ナノ粒子を含むナノ粒子を実現する。いくつかの実施形態では、このようなナノ粒子は、改善されたＳＥＲＳシグナルを示す場合がある。
粒子形状およびアスペクト比は、ナノ粒子の物理的、光学的、および電子的特性に影響を及ぼすことがあると認識されるが、特定の形状、アスペクト比、または内部表面積の有無は、ナノ粒子としての粒子の性質に影響を与えない。したがって、本明細書で開示されている方法とともに使用するのに適しているナノ粒子は、さまざまな形状、サイズ、および組成を持つことができる。さらに、ナノ粒子は、中身が詰まっているもの、またはいくつかの実施形態では、すぐ上で説明されているように、中空のものとすることができる。好適なナノ粒子の限定されない例としては、コロイド金属の中空の、または中身が詰まっているナノバー、磁性、常磁性、導電性、または絶縁体のナノ粒子、合成粒子、ヒドロゲル（コロイドまたは棒状物）、および同様のものが挙げられる。当業者であれば、ナノ粒子は、限定はしないが、回転楕円体、棒、円板、錐体、立方体、円柱、ナノヘリクス、ナノスプリング、ナノリング、棒形ナノ粒子、矢形ナノ粒子、涙滴形ナノ粒子、台形ナノ粒子、角柱形ナノ粒子、ならびに複数の他の幾何学的および幾何学的形状を含む、さまざまな形状のものが存在できることを理解するであろう。
さらに、本明細書で開示されている方法とともに使用するのに適しているナノ粒子は、等方性または異方性とすることができる。本明細書で参照されているように、異方性ナノ粒子は、長さと幅を有する。いくつかの実施形態では、異方性ナノ粒子の長さは、ナノ粒子が生成されたときの開口に平行な方向の寸法である。いくつかの実施形態では、異方性ナノ粒子は、約３５０ｎｍ以下の直径（幅）を有する。他の実施形態では、異方性ナノ粒子は、約２５０ｎｍ以下の直径（幅）を有し、またいくつかの実施形態では、約１００ｎｍ以下の直径（幅）を有する。いくつかの実施形態では、異方性ナノ粒子の幅は、約１５ｎｍから約３００ｎｍまでである。さらに、いくつかの実施形態では、異方性ナノ粒子は、約１０ｎｍから３５０ｎｍまでの間の長さを有する。
ＳＥＲＳの文献の多く（実験の文献と理論の文献の両方）は、異方性粒子（棒、三角形、角柱）は、球形と比べてラマンシグナルの増強が高い場合があることを示唆している。例えば、いわゆる「アンテナ効果」から、ラマン増強が曲率の大きい領域では大きくなることが予測される。銀（Ａｇ）角柱および「分枝した」金（Ａｕ）粒子を含む、異方性粒子の多くの報告が最近説明されている。
異方性ＡｕおよびＡｇナノロッドは、Ｎａｎｏｂａｒｃｏｄｅｓ（登録商標）粒子の作製と同様の方法で、予成形アルミナ鋳型への電着により作製できる。（例えば、非特許文献１３および非特許文献１４参照。）これらの粒子は、予成形アルミナ鋳型への物質、典型的にはＡｕおよびＡｇの交互に重ねた層の蒸着により作製され、約２５０ｎｍの直径および約６ミクロンの長さを持つことができる。
２．カプセル封入ＳＥＲＳ活性ナノ粒子
ＳＥＲＳ活性金属ナノ粒子は、水溶液中で凝集する傾向を有し、いったん凝集すると、再度分散することが困難である。さらに、いくつかのラマン活性分子の化学組成は、タンパク質などの他の分子を金属ナノ粒子に付着させるために使用される化学作用と相容れない。これらの特性は、ラマン活性分子、付着化学作用、および金属ナノ粒子に付着される他の分子の選択を制限することがある。
したがって、いくつかの実施形態では、ＳＥＲＳ活性レポーター分子は、ナノ粒子に付着させる、例えば、吸着させるか、または共有結合させるときに、例えばポリマー、ガラス、またはセラミック材料を含む異なる材料のシェル内にコーティングするか、またはカプセル封入することができる。このような実施形態は、本明細書では「カプセル封入ＳＥＲＳ活性ナノ粒子」と称する。カプセル封入ＳＥＲＳ活性ナノ粒子を作製するための方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているＮａｔａｎの特許文献５で説明されている。
本明細書で開示されている方法とともに使用するのに適している粒子の例としては、Ｏｘｏｎｉｃａ Ｎａｎｏｔａｇｓ（カリフォルニア州マウンテンビュー所在のＯｘｏｎｉｃａ Ｉｎｃ．社）が挙げられる。一実施形態では、ナノタグは、上記のように、直径約５０ｎｍの金のコアを含み、別個のレポーター分子でコーティングされ、いくつかの実施形態では１０ｎｍから５０ｎｍの保護ガラスコーティング、いくつかの実施形態では１５ｎｍから４０ｎｍの保護ガラスコーティング、いくつかの実施形態では３０ｎｍから４０ｎｍの保護ガラスコーティング、およびいくつかの実施形態では３５ｎｍの保護ガラスコーティング中にカプセル封入される。ナノタグは、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｎａｔａｎの特許文献５、Ｎａｔａｎの特許文献６、Ｎａｔａｎの特許文献７においてさらに説明されている。
本明細書で開示されているカプセル封入ＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、金属ナノ粒子、金属ナノ粒子の表面に近接する１つまたは複数のレポーター分子のサブ単分子層、単分子層、または多分子層を含むことができる。「近接する」という語は、ナノ粒子の外面から約５０ｎｍ以下の範囲内を意味することが意図されている。ナノ粒子コアの外面に付着している１つまたは複数のレポーター分子のサブ単分子層、単分子層、または多分子層を有するナノ粒子は、さらに、カプセル封入シェルを含むことができる。このような実施形態では、レポーター分子は、金属ナノ粒子の外面とカプセル封入シェルの内面との間の界面に配置される。
カプセル封入ナノ粒子を含むナノ粒子コアは、直径が約２０ｎｍから約２００ｎｍである金属球、例えば、金、銀、または銅の球体とすることができる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子コアは、金属の偏球または長球を含む。ナノ粒子コアの直径は、入射光の波長に一部は基づき選択できる。いくつかの実施形態では、カプセル封入シェルは、ポリマー、ガラス、金属、ＴｉＯ2およびＳｎＯ2などの金属酸化物、金属硫化物、またはセラミック材料などの誘電体材料を含む。いくつかの実施態様では、カプセル材料は、ガラス、例えば、ＳｉＯxである。本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子をガラスに封入するために、ガラスプライマー、つまり、ガラスの一様なコーティングの成長をもたらすことができるか、または粒子へのガラスコートの接着度を改善できるか、またはその両方が可能な材料で金属ナノ粒子コアを処理することができる。次いで、ガラスを、当技術分野で知られている標準的技術によって金属ナノ粒子上で成長させることができる。
カプセル封入プロセスは、１つまたは複数のレポーター分子をコアナノ粒子に付着または吸着した後に、または付着または吸着しているときに実行できる。この方法で、色素は、金属ナノ粒子コアの表面上のコーティングとして周囲溶媒から封鎖される。このような構成で安定したＳＥＲＳ活性を有する金属ナノ粒子コアが形成される。色素は、金属ナノ粒子コアの表面上にサブ単分子層、完全な単分子層、または多分子層の集合を形成することができる。色素層は、単一の色素を含むか、または異なる色素の混合物とすることができる。
したがって、いくつかの実施形態では、ＳＥＲＳ活性レポーター分子は、ナノ粒子コアの外面上に１つの層を形成し、その層は、少なくとも部分的に、ナノ粒子コアの外面を覆い、また内面と外面とで定められる。カプセル材料は、ナノ粒子コアの外面とＳＥＲＳ活性レポーター分子の層の外面の少なくとも一方に配置され、ＳＥＲＳ活性レポーター分子の層で少なくとも部分的に覆われているナノ粒子コアを少なくとも部分的に囲む。
さらに、いくつかの実施形態では、カプセル材料は、生体分子をはじめとする、複数の分子を外面に付着するように修飾され、例えば、当技術分野で知られている標準的技術によって誘導体化できる。この特性により、色素のラマン活性を妨げることなく、本明細書で開示されているカプセル封入ＳＥＲＳ活性ナノ粒子を、タンパク質および核酸などの、生体分子を始めとする分子に、または固形担体にコンジュゲートさせることができる。ガラスおよびカプセル封入シェルに適している他の材料は、分子付着しやすい官能基を含む。例えば、好適なベース内にガラスを浸漬することで、アルキルトリクロロシランまたはアルキルトリアルコキシシランを共有結合させ、アルキルトリクロロシランまたはアルキルトリアルコキシシラン基のアルキル基の末端に利用可能な付加官能基を持たせることができる。いくつかの実施形態では、アミノアルキルトリアルキルオキシシラン基、メルカプトアルキルトリアルコキシシラン基、またはカルボキシアルキルトリアルコキシシラン基のうちの１つまたは複数は、ガラス表面に共有結合できる。したがって、ガラス表面は、細胞をはじめとする、多くの形態の生体分子および生体分子上部構造、さらには酸化物、金属、ポリマー、および同様の物で修飾できる。同様に、ガラスの表面は、適切に組織化されている単分子層で修飾できる。したがって、ガラスコーティングは、多くの種類の化学官能化（本明細書では「誘導体化」と称する）に対応できる。他の形態のカプセル材も、同様に官能化できる。したがって、本明細書で開示されているナノ粒子は、化学反応性の高い官能基を有する当技術分野で知られている化学種に付着させることができる。
カプセル材料の厚さは、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子の必要な物理的特性に応じて変化できる。沈降係数などの物理的特性は、カプセル材料の厚さの影響を受けやすい。一般に、カプセル材料が厚ければ厚いほど、周囲溶媒からの金属ナノ粒子コア上のＳＥＲＳ活性色素の封鎖がより効果的なものとなる。
カプセル材料がガラスである実施形態では、ガラスの厚さは、典型的には、約１ｎｍから約５０ｎｍまでの範囲内とすることができる。例示的な限定されない実施形態では、カプセル封入ＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、いくつかの場合において約１０ｎｍから約５０ｎｍまでの範囲、いくつかの場合において約１５ｎｍから約４０ｎｍまでの範囲、いくつかの場合において約３５ｎｍの厚さを有するガラスの球体中に封入されている直径が約５０ｎｍから約１００ｎｍまでの範囲内の金ナノ粒子を含む。本明細書で開示されているカプセル封入ＳＥＲＳ活性ナノ粒子の寸法の最適化は、当業者であれば実施できる。例えば、コアシェルナノ粒子（例えば、Ａｕ／ＡｕＳナノ粒子）はＳＥＲＳに対応することができ、純粋な金属ナノ粒子と比べて異なる光学的特性を有することが当技術分野で知られている。同様に、長球からのＳＥＲＳは、同じ長軸を有する球体に関して増強できることは当技術分野で知られている。さらに、単一粒子増強は、波長に依存することも知られている。そのため、粒子サイズは、所定励起波長に対し最大のＳＥＲＳシグナルを発生するように「チューニング」することができる。したがって、粒子の組成、またはそのサイズもしくは形状は、ＳＥＲＳシグナルの強度を最適化するように本明細書で開示されている発明対象に従って変更できる。
本明細書で開示されているカプセル封入ＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、扱いやすく、また格納しやすい。さらに、これらは、凝集に対する耐性があり、溶媒および空気中における色素の分解に対抗して安定し、化学的に不活性であり、例えば、磁気プルダウン技術によって濃縮され、ＳＥＲＳ活性を失うことなく再度分散できる。
以下でさらに詳しく説明されるように、本明細書で開示されている発明対象は、さらに、ＳＥＲＳ活性粒子を使用してアッセイを増強することができるより特化したナノ粒子も形成する。
３．レポーター分子
レポーター分子は、適切な照射を受けた後にラマンシグナルを発生する任意の分子とすることができる。「レポーター分子」は、ラマンシグナルを発生することができる任意の分子または化合物を指す。「レポーター分子」は、本明細書では、「標識」、「色素」、「ラマン活性分子」、または「ＳＥＲＳ活性分子」とも称され、それぞれの用語は入れ替えて使用することができる。強いラマンスペクトルを持つ多数の別個のレポーター分子が知られており、多重化機能を使用可能にするＳＥＲＳ活性粒子の別個の「フレーバー」を作製するために使用できる（「フレーバー」という用語は、照射後に異なるラマンシグネチャをもたらす粒子を示す）。このような粒子は、典型的には、近赤外線（ＮＩＲ）波長領域で機能することができ、全血中で検出可能であり、また光安定性を有する。さらに、多数の異なる「フレーバー」が、単一波長で励起できる。
Ｃ．代表的な捕捉プローブ
抗体またはＤＮＡプローブなどの捕捉プローブは、知られているバイオコンジュゲーション技術を使用して保護ガラスコーティング上に固定化できる。このアプローチの利点は、ＳＥＲＳシグナル発生レポーター分子が、金表面に近接して固定され、生物または化学攻撃からガラスコーティングによって保護される点である。それに加えて、レポーター分子と捕捉プローブとの間の競合的結合が排除され、ナノ粒子コア表面上のレポーター分子とガラス表面上の捕捉プローブの表面被覆率をそれぞれ最大にすることができる。
より一般的に、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、標的分析対象に結合することができる、結合ペアの特異的結合要素などの分子で官能化できる。結合事象は、分析対象の存在および／または量を指示する、検出可能なシグナルを発生する。検出可能なシグナルは、ＳＥＲＳタグの局在検出に対応するか、またはＳＥＲＳスペクトル中の検出可能な波長偏移によって表すことができる。
官能化されたＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、非官能化ナノ粒子に勝るいくつかの利点を有する。第１に、官能基が、標的分析対象との特異的相互作用を生じさせることによりナノ粒子にある程度の特異性を付与する。第２に、標的分析対象は、それ自体ラマン活性である必要はなく、その存在は、ナノ粒子に付着したラマン活性色素のＳＥＲＳスペクトルを測定することにより判定できる。このような測定は、本明細書では「間接的検出」と称され、生体試料中の標的分析対象またはリガンドの有無が、対象とする標的分析対象またはリガンドから直接的に発せられないＳＥＲＳシグナルを検出することにより判定される。
本発明で開示されている方法とともに使用するのに適しているＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、少なくとも２つの異なる方法で標的分析対象に結合するように官能化できる。いくつかの実施形態では、ＳＥＲＳ活性レポーター分子、つまり、ＳＥＲＳ活性色素は、結合ペアの特異的結合要素とコンジュゲートされるが、他の実施形態では、結合ペアの特異的結合要素は、ナノ粒子に直接付着できる。ナノ粒子コアがカプセル封入シェルによって少なくとも部分的に囲まれている実施形態では、この結合要素は、カプセル封入シェルの外面に付着することができる。
本明細書で使用されているような「コンジュゲート」という用語は、分子が、適宜連結基を通じて結合し単一の分子構造を形成する２つ以上のサブユニットを含むことを指す。結合は、サブユニット同士の間の直接的化学結合によって、または連結基を介してのいずれかで、形成できる。コンジュゲート中のこのような結合は、典型的には不可逆である。本明細書で使用されているように、「親和性」という用語は、特定の結合部位における結合ペアの一方の結合要素と他方の結合要素との間の引力の強さを指す。「特異性」という用語、およびその派生形は、結合要素が結合ペアの他方の要素に結合する可能性を指す。結合ペア、例えばリガンドもしくは分析対象の一方の結合要素、例えば、結合タンパク質と他方の結合要素との間のこのような結合は、可逆であるものとすることができる。
「特異的結合要素」という用語は、少なくとも１つの分離した、相補的結合分子が存在する分子を指す。特異的結合要素は、特異的分子に結合する、付着する、または他の何らかの形で会合する分子である。結合、付着、または会合は、化学的または物理的なものとすることができる。特異的結合要素の結合相手となる特異的分子は、限定はしないが、抗原、ハプテン、タンパク質、炭水化物類、ヌクレオチド配列、核酸、アミノ酸、ペプチド、酵素、および同様の物を含む、さまざまな分子のうちの任意のものとすることができる。さらに、特定の種類の特異的結合要素は、特定の種類の分子を結合する。このような場合、特異的結合要素は、「特異的結合ペア」と称する。したがって、抗体は、抗原に特異的に結合する。他の特異的結合ペアとしては、アビジンとビオチン、炭水化物類とレクチン、相補ヌクレオチド配列、相補ペプチド配列、酵素と酵素補因子、および同様の物がある。
１．結合ペアの特異的結合要素が直接付着しているＳＥＲＳ活性ナノ粒子
いくつかの実施形態では、特異的結合ペアの結合要素、例えば、モノクローナル抗体などの抗体は、ナノ粒子の表面に直接付着できる。例示的な一実施形態では、結合ペアの特異的結合要素、例えば、モノクローナル抗体は、リンカー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で処理され、ＰＥＧリンカーを通じてナノ粒子に直接付着できる。
当業者であれば理解するように、リンカーの選択は、アッセイの目的に応じてさまざまな因子によって決定できる。例えば、ＰＥＧをリンカーとして使用すると、抗原のエピトープが、ナノ粒子の表面から離れる方向を指すように抗体の整列を安定化することができる。このようにして、官能化されたナノ粒子は、エピトープまたは他の結合領域の試験液への提示を最大化し、それにより、アッセイの感度を潜在的に高められるように設計できる。
結合要素に応じて、他のリンカーも使用できる。例えば、抗体およびペプチドのリンカーとしてアルカンチオールを使用できる。限定はしないが、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）およびＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）を含む、短鎖アルカンチオールは、スルフヒドリル脱保護の後にリンカーとして使用できる。他の特性も、リンカー鎖の長さなどのリンカーの選択を決定できる。例えば、ＰＥＧは、試薬の表面を保護する働きもし、また柔軟性を有するという点で望ましいものであり、対象とする分析対象に結合する試薬の能力を増強させることができる。
抗体などの特異的結合要素は、さらに、チオレート化ＰＥＧリンカーなどのリンカーで修飾され、ナノ粒子に付着されるようにもできる。
２．代表的な結合要素
いくつかの実施形態では、ＳＥＲＳ活性レポーター分子を介して本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子とコンジュゲートされているか、またはナノ粒子それ自体の外面に直接付着されている結合要素は、グルコース結合タンパク質などのポリペプチドまたはタンパク質を含む。代表的な結合要素としては、限定はしないが、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫＭＢ）アイソザイム、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）タンパク質、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、インフルエンザＡ（Ｆｌｕ Ａ）抗原、インフルエンザＢ（Ｆｌｕ Ｂ）抗原、および呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原などの、標的分析対象の核酸、タンパク質ドメイン、抗体フラグメント、細胞、および抗体を含む標的分析対象に対する親和性を有する特異的結合要素が挙げられる。このような標的分析対象に対する抗体は、当技術分野で知られている。
分析対象および結合要素は、結合パートナーとして働くことができる。本明細書で使用されているような「会合」または「結合」という用語は、検出手段によってタンパク質への結合を検出することを可能にする十分に強い相対的結合定数（Ｋｄ）を有する結合パートナーを指す。Ｋｄは、タンパク質の半分が結合する遊離分析対象またはその逆の濃度として計算できる。対象とする分析対象がグルコースである場合、結合パートナーに対するＫｄ値は、約０．０００１ｍＭから約５０ｍＭまでの範囲内にある。
Ｄ．診断アッセイの概要
ＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、診断アッセイで使用できる。例えば、Ｒｏｈｒらは、複数の構成要素および洗浄ステップを含むＳＥＲＳ検出によるイムノアッセイを実証している。（例えば、非特許文献１５参照。）また、Ｎｉらは、インキュベートおよび洗浄ステップを含む不均一検出アッセイにおける金スライドへのレポーター付着を実証している。（例えば、非特許文献１６参照。）ＲｏｈｒらならびにＮｉらによって開示されているＳＥＲＳアッセイ、さらには当技術分野で知られている他のアッセイは、長時間のインキュベートおよび洗浄ステップを必要とする。
ＳＥＲＳを使用するアッセイの他の例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているＴａｒｃｈａらの特許文献８で開示されている。Ｔａｒｃｈａらは、標識または抗体がＳＥＲＳ表面に付着されている多重試薬システムの使用を開示している。第２の試薬は、標識または抗体のいずれかの相補的なペアを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、生物学的アッセイにおいて光タグとして使用できる。いくつかの実施形態では、検出しなければならない標的分子、例えば、抗原は、固体表面に付着している第１の結合パートナーによって捕捉される。これもまた標的分子に特異的な第２の結合パートナーは、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子に付着できる。分析対象が存在する場合、第１と第２の両方の結合パートナーは、標的を結合し、したがって、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子−標的−固体表面のサンドイッチを形成する。固体表面は、例えば、不動基材または移動可能粒子とすることができる。
Ｅ．液体ベースアッセイ
ＳＥＲＳ活性ナノ粒子を使用する液体ベースアッセイアプローチがすでに開示されている。（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている非特許文献１７参照。）Ｈｉｒｓｃｈらは、粒子相互作用によって生じる光吸収の変化を測定することによる対象とする分析対象の存在下での粒子凝集の光学的検出を開示している。Ｈｉｒｓｃｈらによって開示されているアッセイにおけるナノ粒子の凝集により、粒子の凝集の結果生じるプラズモン共鳴減少を検出する。しかし、Ｈｉｒｓｃｈらは、ラマンシグナルを検出に利用することについては開示していない。
本明細書で開示されているアッセイの一実施形態では、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、いわゆる「無洗浄」または「均一」アッセイで使用できる。このようなアッセイでは、試料は、容器、例えば、試料収集容器、アッセイ容器、または本発明で開示されているアッセイとともに使用するのに適している他の試料容器内に集められ、容器、例えば、アッセイ容器から試料を取り出すことなくアッセイが実行される。都合のよいことに、試料は、アッセイを実行するために必要なすべての試薬をすでに収容しておくことができる容器内に集めることができる。しかし、いくつかの実施形態では、試料収集の後、１つまたは複数の試薬を容器に追加できる。本明細書で開示されているアッセイとともに使用するのに適している代表的な容器は、以下の第ＩＩＩ節で詳しく説明されている。
他の実施形態では、本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、不均一アッセイで使用できる。本明細書で使用されているように、「不均一アッセイ」という用語は、一般的に、アッセイの１つまたは複数の構成要素がアッセイに対し順次追加されるかまたは取り除かれるアッセイを指す。より具体的には、不均一アッセイは、固相の表面にアッセイ中の分析対象を結合することにより液体試料から固相へ分析対象を移動することに部分的には依存することができる。アッセイのある段階では、そのシーケンスはアッセイプロトコルに応じて変わり、固相および液相は分離され、分析対象の検出および／または定量化をもたらす測定が、２つの分離相のうちの一方に対し実行される。したがって、不均一アッセイは、例えば、対象とする分析対象を結合し、それにより検査対象の試料中の他の成分から分析対象を分離するか、または取り除く抗原または抗体によりコーティングされた固相担体を備えることができる。これらの他の成分は、１つまたは複数の洗浄ステップによって試料から選択的に取り除くことができ、分析対象は、それが検出される固相担体に結合したままであるか、または追加の洗浄ステップによって取り除かれ、その後検出することができる。
液体ベースアッセイでは、試料は、典型的には、例えば周囲条件の下でインキュベートするが、さらに、試料の特定温度または振盪などの制御された状態にすることもできる。インキュベート期間の後に、容器を読み取り装置内に入れて、容器内に事前装填された、または順次容器内に追加された１つまたは複数のＳＥＲＳ活性粒子からのシグナルを取得することができる。ラマンシグナルは、特定の波長の入射光、例えば、レーザー光線による探索後に、生成され、検出される。
１．対象とする（複数の）表面固定化標的分析対象
液体ベースアッセイのいくつかの実施形態では、対象とする（複数の）標的分析対象は、例えば、容器、例えば試料収集容器またはアッセイ容器の官能化された内面などの固相担体の局在領域上に固定化される。対象とする固定化された（複数の）標的分析対象は、次いで、対象とする（複数の）標的分析対象に対する親和性を有する特異的結合要素、例えば、抗体とコンジュゲートされているＳＥＲＳ活性ナノ粒子を含む検出試薬と接触させることができる。ＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、対象とする固定化された（複数の）標的分析対象と相互作用するか、または会合する、例えば、可逆的にもしくは不可逆的に結合できる。適当なインキュベート時間が過ぎた後、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子と固定化された（複数の）標的分析対象との間のこの相互作用は、適切な波長の入射光を固相担体の局在領域に照射し、ＳＥＲＳ活性レポーター分子によって放射されるＳＥＲＳシグナルを測定することにより検出することができる。さらに、それぞれの種類のＳＥＲＳ活性レポーター分子は、固有のＳＥＲＳスペクトルを示すので、検出試薬中に異なるＳＥＲＳ活性レポーター分子を含むＳＥＲＳ活性ナノ粒子を入れることにより、単一のＳＥＲＳスペクトルを使用して対象とする複数の標的分析対象を検出することができる。したがって、本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、多重化アッセイフォーマットで使用できる。
２．レポーターの選択と使用法
レポーター分子は、好ましくは、線幅の狭い比較的単純なラマンスペクトルを示す。この特性のため、同じ試料体積中で複数の異なるラマン活性種を検出することができる。したがって、この特徴があるおかげで、それぞれ異なる色素を含む複数のＳＥＲＳ活性ナノ粒子を、それぞれの色素のラマンスペクトルが異なる種類のナノ粒子の混合物中で区別されるように作製することができる。この特徴があるため、小さな試料体積中で複数の異なる標的種を多重検出することができる。したがって、レポーター分子が会合または付着しているナノ粒子も、多重化化学アッセイにおいて使用するのに適しており、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子の同一性によって、アッセイの標的の同一性がコードされる。
このようなレポーター分子は、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子と会合または付着したときに、多重化アッセイにスペクトル多様性および分解能を付与する。それぞれのＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、標的特異性試薬に結合したときに、その特定の標的分子の同一性をコードすることができる。さらに、特定のラマンシグナルの強度は、その特定の標的分子の量を明らかにすることができる。したがって、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、試薬の位置に左右される局在を必要とすることなく標的分子に関する定性的および／または定量的情報を提供するために多重化アッセイで使用できる。
検出試薬は、アッセイの要件に応じて、複数の種類の標識、例えば、複数の種類のＳＥＲＳ活性レポーター分子を含むことができる。例えば、異なる種類のＳＥＲＳ活性レポーター分子は、ラマンシグナル、つまり、ラマンスペクトルまたはラマンスペクトルの特徴を、異なる波長で示すことができ、対象とする特異的分析対象に対し固有のラマン「フィンガープリント」を生成するために使用でき、それによって、アッセイの特異性が高まる。異なるレポーター分子は、異なる特異的結合要素に付着され、これにより、対象とする１つより多い分析対象、例えば、対象とする複数の分析対象を検出することができる試薬を構成できる。さらに、複数のレポーター分子が、特に比較的弱いシグナルを示すか、または示すことが予想される試料中でシグナル検出からバックグラウンド雑音を区別するために使用できる内部基準シグナルを生成するために使用できる。それに加えて、検査対象の試料溶液から放射される非特異的放射線、つまり、対象とする分析対象の直接的または間接的測定に帰因しえない試料溶液から放射される放射線を回避するか、または克服するために複数のＳＥＲＳレポーター分子が使用できる。
Ｆ．液体ベースアッセイ中の磁気捕捉
液体ベースアッセイのいくつかの実施形態では、磁気捕捉試薬が、アッセイ容器内の粒子の局在を容易にするために使用できる。このような実施形態では、磁気捕捉粒子は、対象とする１つまたは複数の分析対象に対して親和性を有する結合要素で標識できる。このような磁気捕捉粒子は、対象とする１つまたは複数の分析対象に結合することができ、これはさらに、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子に結合して、磁気捕捉粒子−分析対象−ＳＥＲＳ活性ナノ粒子複合体を形成することができる。磁気捕捉粒子−分析対象−ＳＥＲＳ活性ナノ粒子をアッセイ容器内の特定の領域内に局在させてＳＥＲＳシグナルを検出するために、磁気捕捉粒子の磁気特性を利用することができる。
したがって、いくつかの実施形態では、磁気捕捉粒子−分析対象−ＳＥＲＳ活性ナノ粒子複合体は、アッセイ容器、例えば、試料収集容器またはチューブ内の所定の領域に局在する。次いで、その局在領域に放射線を当て、ＳＥＲＳシグナルを検出することができる。磁気捕捉粒子−分析対象−ＳＥＲＳ活性ナノ粒子複合体の局在により、レポーター分子−表面間の相互作用が高まり、またアッセイ容器の特定領域に対しＳＥＲＳ効果を集中させることによりシグナルが高められる。
粒子の磁気捕捉は、限定はしないが、アッセイ容器の局在領域に強力な磁石を置くか、または磁場を誘起することを含む、当技術分野で知られている方法を使用して達成できる。磁場は、例えば、１つまたは複数の永久磁石または電磁石によって誘起できる。
より具体的には、いくつかの実施形態では、対象とする（複数の）標的分析対象に対して親和性を有する特異的結合要素とコンジュゲートされた本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、容器、例えば、試料収集容器内に、対象とする１つまたは複数の標的分析対象を含んでいることが疑われる生体試料を中に配置する前に、または配置したと同時に、または配置した後に配置することができる。磁性粒子は、対象とする（複数の）標的分析対象に対して親和性を有する特異的結合要素ともコンジュゲートされ、容器内に配置できる。試料中に存在する対象とする（複数の）標的分析対象は、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子および磁性粒子に結合し、これにより、複合体、例えば、磁気捕捉粒子−分析対象−ＳＥＲＳ活性ナノ粒子複合体を形成し、その際に、（複数の）標的分析対象は、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子と磁性粒子との間にサンドイッチ状に挟まれている。例えば、本明細書で開示されている発明対象とともに使用するのに適している代表的な磁気捕捉アッセイを示す図１を参照のこと。
次に図１を参照すると、生体試料中の１つまたは複数の分析対象の存在を検出するための代表的な磁気捕捉アッセイの略図が示されている。本明細書で開示されている磁気捕捉アッセイは、生体試料中の対象とする１つまたは複数の分析対象１３０に対して親和性を有する少なくとも１つの特異的結合要素１１０ａが会合している、１つまたは複数の磁気捕捉粒子１００を含む。このアッセイは、さらに、１つまたは複数の分析対象１３０に対して親和性を有する少なくとも１つの結合要素１１０ｂが会合している、１つまたは複数のＳＥＲＳ活性ナノ粒子１２０も含む。ＳＥＲＳ活性ナノ粒子１２０と会合している結合要素１１０ｂは、磁気捕捉粒子１００と会合している結合要素１１０ａと同じであるか、または異なることがある。磁性粒子１００およびＳＥＲＳ活性ナノ粒子１２０は、対象とする１つまたは複数の分析対象１３０を含む生体試料と接触させ、１つまたは複数の分析対象１３０が生体試料中に存在する場合に、一定期間インキュベートして、磁気捕捉粒子−分析対象−ＳＥＲＳ活性ナノ粒子複合体１４０、例えば、抗体−抗原「サンドイッチ」構造を形成する。磁気捕捉粒子−分析対象−ＳＥＲＳ活性ナノ粒子複合体１４０が磁場（図に示されていない）に曝されると、これにより、複合体１４０は、容器１５０、例えば、アッセイ容器または試料収集容器の局在領域に移動し、ペレット１６０を形成する。例えば図４に示されているようなシステム内で、ペレット１６０に１つまたは複数の波長の入射光が照射されると、これにより、ＳＥＲＳ活性レポーター分子は、生体試料中の１つまたは複数の分析対象の存在または量を検出するための検出可能なシグナルを発生する。当業者であれば、本明細書で開示されている発明対象を検討した後、磁気捕捉粒子１００、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子１２０、およびこれらの組合せが、容器１５０内に収められてから、その中に試料が配置されるか、または容器１５０の中に試料を配置する前に、または配置するのと同時に、または配置した後に、容器１５０に加えることができることを理解するであろう。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で開示されているアッセイ内で、磁性粒子濃縮が都合よく使用できる。このような一アプローチでは、付着されている対象とする（複数の）分析対象の１つまたは複数の捕捉プローブを有するＳＥＲＳ活性粒子は、試料収集前に、容器、例えば、試料収集容器内に存在しているか、またはいくつかの実施形態では、収集後に加えることができる。インキュベート段階において、標的分析対象は、捕捉プローブによってＳＥＲＳ活性粒子表面上に結合する。容器内に用意されている、さらに対象とする（複数の）標的への捕捉プローブが付着している磁性粒子は、同じ（複数の）標的、例えば、対象とする１つまたは複数の分析対象上の異なるエピトープに付着し、次いで、標的がＳＥＲＳ活性ナノ粒子と磁性粒子との間にサンドイッチ状に挟まれている複合体を形成する。次いで、磁石を使って、指定されたスペースにそれらのサンドイッチを集中させる、つまり、容器内にペレットを形成することができる。磁石は、容器が読み取り装置内に置かれる前に施すか、または読み取り装置内に組み込むことができる。次いで、所望の波長の入射光、例えば、レーザー光線を濃縮されたＳＥＲＳ活性ナノ粒子−磁性粒子サンドイッチ状複合体のペレット上に集束すると、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子からＳＥＲＳシグナルが得られる。
本明細書でさらに詳しく開示されているように、本明細書で開示されているアッセイの磁気捕捉実施形態は、さらに、複数の種類のＳＥＲＳ活性ナノ粒子を試料に接触させることを含むことができ、その際に、それぞれの種類のＳＥＲＳ活性ナノ粒子に、固有のラマンシグナルを示すＳＥＲＳ活性レポーター分子が付着している。このような実施形態は、対象とする複数の分析対象を検出するために使用することができ、これは本明細書では多重化と称する。
Ｇ．磁気プルダウン液体ベースアッセイにおける基準および対照
従来のイムノアッセイでは、抗原の検出は、２つの抗体の間に抗原を「サンドイッチ」状に挟むことにより行うことができ、これらの抗体のうちの一方は、光学、比色分析、または放射線分析レポーターで標識される。測定されたシグナル、例えば、光学、比色分析、または放射線分析レポーターを使用して、試料中に存在する抗原の濃度を測定することができる。従来の酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によるイムノアッセイは、この種類の技術の例である。この技術的アプローチで問題になるのは、光シグナルの大きさが、抗原の存在および／または量に加えて複数の因子に依存することである。例えば、光学系の整列および性能は、測定されたシグナルに影響を及ぼすことがある。典型的には、この問題を回避するために、抗原の濃度が知られている追加の対照試料が測定される。
本明細書で開示されている発明対象の一実施形態では、上記のように、測定可能なシグナルは、ＳＥＲＳ標識ナノタグと磁気捕捉粒子との間に抗原介在複合体を形成することにより生成される。これらの複合体は、磁場を印加することにより溶液から分離することができ、その結果得られる磁気ペレットからの光シグナルが測定される。
探索用光学系に相対的な磁気ペレットの位置は、測定される光シグナルの大きさに、最終的には、アッセイの較正に影響を及ぼすことがある。それに加えて、磁気ペレットの形状は、常に一貫性があるわけではない。例えば、磁性粒子の表面機能性を変えると、ペレットの密度および／または形状も変化する場合がある。
本明細書で開示されている発明対象の実施形態によれば、ペレットのサイズ、形状、または位置の変動を補正することが可能である。これらの方法は、さらに、ペレットが形成される他のアッセイフォーマットにも適用可能である。一実施形態では、磁気プルダウンに使用される磁性粒子は、捕捉プローブ、例えば、対象とする抗原に特異的な抗体に加えて、基準標識を付けられる。基準標識は、限定はしないが、蛍光団、有機色素、希土類元素、およびラマンレポーターを含む、検出可能なシグナルを（自然に、またはある種の刺激を加えた後に）発生することができる任意の部分とすることができ、またそのような構成要素を含む粒子を含むことができる。基準標識の具体例として、本明細書で開示されている種類のＳＥＲＳ活性粒子およびシリカ粒子上に、またはシリカ粒子全体にわたって分布する蛍光団を有するシリカ粒子が挙げられる。
基準標識をアッセイに組み込む例は、図２に示されている。基準標識を組み込んだ本明細書で開示されている磁気捕捉アッセイは、生体試料中の対象とする１つまたは複数の分析対象２４０に対して親和性を有する少なくとも１つの特異的結合要素２１０ａが会合している、１つまたは複数の磁気捕捉粒子２００を含む。この実施形態では、１つまたは複数の磁気捕捉粒子２００には、さらに、検出可能なシグナルを発生することができる少なくとも１つの基準標識２３０が会合している。いくつかの実施形態では、基準標識２３０は、１つまたは複数の分析対象２４０と複合体２５０を形成する１つまたは複数のＳＥＲＳ活性ナノ粒子２２０と異なるレポーター分子を有する第２のＳＥＲＳ活性ナノ粒子を含む。
このアッセイは、さらに、１つまたは複数の分析対象２４０に対して親和性を有する少なくとも１つの結合要素２１０ｂが会合している、１つまたは複数のＳＥＲＳ活性ナノ粒子２２０も含む。ＳＥＲＳ活性ナノ粒子２２０と会合している結合要素２１０ｂは、磁気捕捉粒子２００と会合している結合要素２１０ａと同じであるか、または異なることがある。
図１に示されているアッセイと同様に、磁性粒子２００およびＳＥＲＳ活性ナノ粒子２２０は、対象とする１つまたは複数の分析対象２４０を含む生体試料と接触させ、１つまたは複数の分析対象２４０が生体試料中に存在する場合に、一定期間インキュベートして、磁気捕捉粒子−分析対象−ＳＥＲＳ活性ナノ粒子複合体２５０を形成する。磁気捕捉粒子−分析対象−ＳＥＲＳ活性ナノ粒子複合体２５０が磁場（図に示されていない）に曝されると、これにより、複合体２５０は容器、例えば、アッセイ容器または試料収集容器の局在領域に移動し、図１にすでに示されているようにペレットを形成する。
容器内に存在するすべての磁性粒子（複合体であってもなくても）は、容器の局在領域、例えば、光学的読み取り領域内に引き下ろされる。磁気捕捉粒子−分析対象−ＳＥＲＡ活性ナノ粒子複合体２５０を含むペレットに、例えば図４に示されているようなシステム内で、１つまたは複数の波長の入射光を照射すると、これによりＳＥＲＳ活性ナノ粒子２２０は第１の検出可能なシグナルを発生し、基準標識２３０は第２の検出可能なシグナルを発生する。ＳＥＲＳ活性ナノ粒子２２０の第１の検出可能なシグナルは、基準標識２３０の第２の検出可能なシグナルと比較され、これにより、生体試料中の１つまたは複数の分析対象２４０の存在または量を検出することができる。
粒子２２０からのラマンシグナルは、分析対象２４０、例えば、抗原の存在量に関係するが、基準標識２３０、例えば、粒子２２０と異なるＳＥＲＳレポーター分子を有するナノ粒子からのシグナルは、基準として働き、ペレットの形状、密度、および／または位置の変動を補正する。したがって、較正は、レポーター１、例えば、粒子２２０の強度とレポーター２、例えば、基準標識２３０の強度との比較に基づいて行うことができる。例えば、シグナルは、（レポーター１の強度／レポーター２の強度）で計算できる、言い換えると、レポーター１の強度とレポーター２の強度との比である。
図２には、磁気捕捉粒子１個に対し１つのＳＥＲＳ活性粒子が示されているが、磁性粒子１個に対し複数の基準標識／粒子も可能であるか、またはその代わりに、磁気捕捉粒子の一部に、１つまたは複数の基準標識を付けることができるが、磁気捕捉粒子の残り部分は、基準を含まない。
図１に示されているアッセイと同様に、当業者であれば、本明細書で開示されている発明対象を検討した後、磁気捕捉粒子２００、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子２２０、およびこれらの組合せが、容器内に収められてから、その中に試料が配置されるか、または容器の中に試料を配置する前に、または配置するのと同時に、または配置した後に、容器に加えることができることを理解するであろう。
本明細書で開示されている発明対象は、さらに、磁性粒子−ＳＥＲＳ活性ナノ粒子のサンドイッチが事前に複合体化され、基準標識として本明細書で開示されている方法とともに使用できる実施形態を包含する。この複合体は、不活性である、つまり、対象とする分析対象との複合体を作らない。このような事前複合体化された粒子を知られている量だけ、基準として試料に加えることができる。
Ｈ．液体ベースアッセイにおける溶解試薬の使用
さらに他の実施形態では、液体ベースアッセイなどのアッセイにおいて、磁気プルダウンを伴い、または磁気プルダウンを伴わずに、溶解試薬を使用することができる。ヒト血液、血漿、または血清などの生体マトリックス中で使用された場合、溶解試薬は、バイオマーカーに対するシグナルの増強および／または検出限度の向上を果たすことができる。特に、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子を使用するイムノアッセイで使用された場合、溶解試薬を加えると、溶解試薬を含まない試料と比べてラマンシグナル強度が高まる。
本明細書で開示されている方法とともに使用するのに適している１つの溶解試薬は、成分（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、塩化ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、β−グリセロリン酸、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）およびプロテアーゼ阻害剤、およびこれらの組合せのうちの１つまたは複数を含む。（例えば、非特許文献１７参照。）溶解試薬として使用するのに多くの洗剤が適している。陰イオン洗剤の代表例として、限定はしないが、コール酸塩、カプリル酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、およびデオキシコール酸塩が挙げられる。陽イオン洗剤の代表例として、限定はしないが、塩化セチルピリジニウムおよび塩化ベンザルコニウムが挙げられる。両性イオン界面活性剤の代表例として、限定はしないが、３［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）およびホスファチジルコリンが挙げられる。非イオン洗剤の代表例として、限定はしないが、ジギトニン、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ツイン ４０（ポリオキシエチレンソルビタン、モノラウレート）、およびＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００が挙げられる。これらの溶解試薬は、さらに、限定はしないが、アプロチニン、ＥＤＴＡ、ロイペプチン、α−マクログロブリン、ペプスタチン、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、トシル−Ｌ−リシンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）、およびトシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）を含む、プロテアーゼ阻害剤を含むことができ、特定のプロテアーゼ標的に応じて選択できる。
本明細書で開示されている発明対象とともに使用するのに適している他の溶解試薬として、限定はしないが、ジチオスレイトール、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ＮＰ−４０、グリココール酸、タウロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、Ｂｒｉｊ ３５、Ｂｒｉｊ ５８Ｐ、Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミン、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、オクチル−ｂ−Ｄ−１−チオグルコピラノシド、Ｓｐａｎ ２０、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、３−（４−ヘプチル）フェニル３−ヒドロキシプロピル）ジメチルアンモニオプロパンスルホナート、およびアミドスルホベタイン−１４が挙げられる。さらに溶解試薬は、細胞を溶解するのにも使用できる。
当業者であれば、当技術分野で知られている他の溶解試薬も、本発明で開示されている方法とともに使用するのに適していることを理解するであろう。さらに、当業者であれば、試料の細胞内含有量の実質的にすべてを効果的に溶解できる量だけ溶解試薬を試料と接触させることを理解するであろう。この方法の例は、実施例２で取りあげられている。
実施例２に示されているように、ＳＥＲＳによって検出されるイムノアッセイでは、検査対象の試料に溶解試薬を加えると、溶解試薬を含まない試料に比べて、シグナルレベルが高くなり、および／または生体マトリクス中のバイオマーカー検出の感度が向上する。感度の向上には多くの利点があり、例えば、「結果が出るまでの時間」を短縮することができ、また患者予後を潜在的に改善できる。溶解試薬の存在下で観察されるラマンシグナルが大きいほど、計装の費用を低減できる。溶解試薬は、限定はしないが、側方流動アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ、および表面プラズモン共鳴アッセイを含む、さまざまなアッセイに対する感度を高めるために使用することができる。溶解試薬は、さらに、結核検出用の喀痰などの、血液、血清、または血漿以外の種類の生体試料、あるいはバイオマーカーの検出を必要とする診断に使用される他の種類の試料を取り扱うためにも使用できる。溶解試薬中の個々の成分は、単独または併用で使用することにより、類似の効果を得ることもできる。
Ｉ．検査対象の試料によって放射されるＳＥＲＳシグナルを検出するための代表的計装
次に図４を参照すると、本明細書で開示されているアッセイとともに使用する代表的なシステムが提示されている。システム４００は、ＳＥＲＳ活性粒子中にラマンシグナルを誘起することができる電磁放射線を発生することが可能な光源４０２を備える。いくつかの実施形態では、光源４０２は、レーザーであり、これは、いくつかの実施形態では、近赤外線スペクトル領域内で動作することができるレーザー、例えば、約７８５ｎｍの発光波長を持つ固体ダイオードレーザーである。光源４０２から放射される電磁放射線、例えば、１つまたは複数の特定の波長を持つ光は、ファイバー４０４によってレンズ４０６ａに誘導することができる。ファイバー４０４は、本明細書で開示されているシステムとともに使用するのに適している光ファイバーとすることができる。例えば、ファイバー４０４は、単一ファイバー４０４ａまたはファイバーバンドル４０４ｂとすることができる。
レンズ４０６ａは、ファイバー４０４を透過した光を広げ、その光を、いくつかの実施形態では帯域通過フィルタであるフィルタ４０７ａに通し、ビームスプリッタ４０８、例えば、誘電体ビームススプリッタ上に当てる。ビームスプリッタ４０８に入射した光の一部は、レンズ４０６ｂに送られ、このレンズにより、光は、容器４１０、例えば、試料収集容器またはアッセイ容器に入れられた試料４１２に当たる。試料４１２は、本明細書で開示されているような１つまたは複数の磁気捕捉粒子−分析対象−ＳＥＲＳ活性ナノ粒子複合体を含む。試料４１２上に入射した光は、試料４１２を含む磁気捕捉粒子−分析対象ＳＥＲＳ活性ナノ粒子複合体からＳＥＲＳシグナル、つまり、散乱放射線を誘起することができる。試料４１２から放射された散乱放射線は、レンズ４０６ｂによって集束され、ビームスプリッタ４０８に誘導される。散乱放射線の一部は、ビームスプリッタ４０８を透過して、フィルタ４０７ｂ、例えば、ロングパスフィルタに送られる。フィルタ４０７ｂを通過した後、散乱放射線は、レンズ４０６ｃに送られ、レンズは散乱放射線をファイバー４１４上に集束する。ファイバー４１４は、本明細書で開示されているシステムとともに使用するのに適している光ファイバーとすることができる。例えば、ファイバー４１４は、単一ファイバー４１４ａまたはファイバーアレイ４１４ｂとすることができる。ファイバー４１４は、散乱放射線を、いくつかの実施形態では電荷結合素子（ＣＣＤ）４１８を備える分光計４１６に送る。
いくつかの実施形態では、レーザーは、対象とする１つまたは複数の標的分析対象を検出するために使用される入射光の励起源として使用される。当業者であれば、本明細書で開示されている発明対象を検討した後、本明細書で説明されているＳＥＲＳ活性レポーター分子とともに使用するのに適している、強度および励起波長を含む、レーザーの種類を確認することができる。試料から散乱されるか、または放射される放射線は、当技術分野で知られている検出システムを使用して検出できる。
いくつかの実施形態では、複数の種類の放射線源、または複数の励起波長を使用できる。例えば、対象とする２つの分析対象を検出すべき実施形態では、試薬は、２つの別個の種類のＳＥＲＳ活性レポーター分子および／または２つの別個の種類の特異的結合要素を含むことができる。他の実施形態では、２つ以上の別個のＳＥＲＳ活性レポーター分子から異なるラマンスペクトルを誘起するために単一波長の入射光が使用できる。しかし、以下の実施形態では、異なる波長の入射光は、対象とするそれぞれの分析対象について別個のラマンシグナルを発生するために使用できる。当業者であれば、本明細書で開示されている発明対象を検討した後に理解するように、使用される（複数の）特定の波長の選択は、対象とする分析対象、使用される特異的結合要素、および使用される特定のＳＥＲＳ活性レポーター分子に依存する。
本発明で開示されているアッセイは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているＢｒａｄｙらの特許文献９で開示されているラマン分光計システムのような、Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（米国ノースカロライナ州モリスビル所在のＣｅｎｔｉｃｅ社）を始めとする、当技術分野で知られている好適なラマン分光計システムで行うことができる。より具体的には、常磁性粒子を使用するラマン分光法アッセイ用のシステムおよび方法は、Ｃａｒｒｏｎらの特許文献１０で開示されており、また本明細書で開示されているアッセイとともに使用するのに適しているラマン分光計システムは、Ｃａｒｒｏｎらの特許文献１１で開示されており、これらの特許はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
光学的検出器などの感知デバイス、放射線源、ならびにコンピュータシステム、マイクロプロセッサ、コンピュータソフトウェア、およびアルゴリズムは、本明細書で開示されている方法を実施する際に組み合わせて使用できる。したがって、いくつかの実施形態では、ソフトウェア、または他のコンピュータ可読命令を使用して、本明細書で開示されている光学的アッセイに関係する出力データを解釈し、分析し、コンパイルし、または他の何らかの方法で解析することができる。ソフトウェアまたは他のコンピュータシステムは、１人または複数のユーザーに対して、デジタル形式または他の形式で出力データを表示し、格納し、または伝送するために使用できる。
Ｊ．液体ベースアッセイでＳＥＲＳシグナルを増幅するための方法
生物学的アッセイでは、多くの場合、さまざまな媒質中の生体分子の検出が正確で、しかも感度が高いことを必要とする。より感度の高いアッセイの開発を目指すアプローチの１つは、アッセイの出力シグナルを高めようとするものである。本明細書で開示されている方法では、いくつかの実施形態において、３倍以上のシグナル増強が可能であることを実証している。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている発明対象は、上で説明され、図１に示されている種類の液体ベースアッセイで出力シグナルを増幅するための方法を実現するものである。
一実施形態による増幅方法は、限定はしないが、ＳＥＲＳレポーター分子を含むＳＥＲＳ活性ナノ粒子などの、磁気捕捉粒子およびレポーター分子の両方を含む溶液に試料を加え、短時間の間にインキュベートすることから始まり、そのときに、磁気捕捉粒子、分析対象、およびレポーター分子を含むサンドイッチ状複合体を形成できる。
本明細書で開示されている発明対象のシグナル増幅特性は、磁気捕捉粒子が局在する前に、さらにアリコートのレポーター分子、例えば、アッセイ溶液に加えられた第１のアリコートと、同じシグナル発生能力を有するアリコートのＳＥＲＳ活性ナノ粒子、例えば同じラマンレポーター分子を加えることで生じる。この第２のアリコートのレポーター分子、例えば、第２のアリコートのＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、アッセイにおいて元々存在している第１のアリコートのレポーター分子、例えば、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子上の抗体を認識する抗体（または他の分子、例えば、特異的結合要素）を示す。第２のアリコートのレポーター分子が存在する結果、検査対象の試料中のサンドイッチ１つ当たりのレポーター分子の数が増え、したがって、サンドイッチ複合体１つ当たりのシグナルが高くなる。
例えば、図７に示されているように、第１のアリコートのＳＥＲＳ活性ナノ粒子上の未結合抗体を認識する抗体をコーティングされたＳＥＲＳ活性ナノ粒子を、アッセイ溶液に加えることができる。これらの二次抗体が第１のアリコートのＳＥＲＳ活性ナノ粒子に結合すると、シグナルレベルはサンドイッチ複合体１つ当たりＳＥＲＳ活性粒子数１から３に変わる。
より具体的には、次に図７を参照すると、シグナル増幅法を使用する本明細書で開示されているアッセイの代表的な略図が示されている。本明細書で開示されているアッセイは、生体試料中の対象とする１つまたは複数の分析対象７３０に対して親和性を有する少なくとも１つの特異的結合要素７１０ａが会合している、１つまたは複数の磁気捕捉粒子７００を含む。このアッセイは、さらに、１つまたは複数の分析対象７３０に対して親和性を有する少なくとも１つの結合要素７１０ｂが会合している、検出可能なシグナルを発生することができる１つまたは複数のレポーター分子７２０、例えば、１つまたは複数のＳＥＲＳ活性ナノ粒子も含む。レポーター分子７２０と会合している結合要素７１０ｂは、磁気捕捉粒子７００と会合している結合要素７１０ａと同じであるか、または異なることがある。磁性粒子７００およびレポーター分子７２０は、対象とする１つまたは複数の分析対象７３０を含む生体試料と接触させ、１つまたは複数の分析対象７３０が生体試料中に存在する場合に、一定期間インキュベートして、磁気捕捉粒子−分析対象−レポーター分子複合体７４０、例えば、抗体−抗原「サンドイッチ」構造を形成する。
図７に示されているアッセイは、次いで、第１のアリコートのレポーター分子７２０の特異的結合要素７１０ｂに対して親和性を有する少なくとも１つの特異的結合要素７１０ｃが会合している検出可能なシグナルを発生することができる第２のアリコートの１つまたは複数のレポーター分子７５０を含む。第２のアリコートのレポーター分子７５０は、容器７６０内に、試料および／または第１のアリコートの１つまたは複数のレポーター分子７２０を配置する前に、または配置するのと同時に、または配置した後に配置することができ、その際に、第２のアリコートのレポーター分子７５０のうちの１つまたは複数のレポーター分子は、第１のアリコートのレポーター分子７２０のうちの１つまたは複数のレポーター分子と同じである。
レポーター分子７５０が会合している、磁気捕捉粒子７００、分析対象７３０、レポーター分子７２０のサンドイッチ複合体を含む、複合体７４０が磁場（図に示されていない）に曝されると、これにより、複合体７４０は、容器７６０、例えば、アッセイ容器または試料収集容器の局在領域に移動し、ペレット７７０を形成する。例えば図４に示されているようなシステム内で、ペレット７７０に１つまたは複数の波長の入射光が照射されると、これにより、レポーター分子は、生体試料中の１つまたは複数の分析対象の存在または量を検出するための検出可能なシグナルを発生する。
当業者であれば、本明細書で開示されている発明対象を検討した後、磁気捕捉粒子７００、レポーター分子７２０、レポーター分子７５０、およびこれらの組合せが、容器７６０内に収められてから、その中に試料が配置されるか、または容器７６０の中に試料を配置する前に、または配置するのと同時に、または配置した後に、容器７６０に加えることができることを理解するであろう。
アッセイの形態に応じて、第２のアリコートのＳＥＲＳタグを、任意の段階で、例えば、第１のアリコートのＳＥＲＳタグとともに順次または同時に、あるいは試料とともに順次または同時に加えることができる。また、アッセイにおけるバックグラウンド雑音の大きな増加を回避するために、第２のＳＥＲＳ活性ナノ粒子の表面上の生体分子が、磁気捕捉粒子の表面上の生体分子を認識しないことが好ましい。イムノアッセイの場合、この特性は、生体分子、例えば、磁気捕捉ナノ粒子およびＳＥＲＳ活性ナノ粒子上の異なる化学種に由来する抗体を固定化することにより得られる。例えば、いくつかの実施形態では、初期アッセイ溶液は、ヤギで産生された抗体を有する磁気捕捉粒子を含むことができ、またＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、マウスで作り出された抗体を示すことができる。第２のアリコートのＳＥＲＳ活性ナノ粒子が抗マウス抗体で標識された場合、磁気捕捉粒子への結合は生じない。本明細書で開示されている増幅法を使用し、直交エピトープを持つ２つの結合パートナーが使用されることを前提とすると、ＤＮＡを含む、事実上いかなる分析対象をも検出することができる。
所定のアッセイでシグナル出力を高めた場合の利点としてはさらに、分析対象の検査に機能が比較的低い（および比較的安価）検出システムを使用できるという点が挙げられる。
次に図８を参照すると、本明細書で開示されている増幅方法の代表的な結果が示されている。図８Ａは、図１にすでに示されているように増幅しない均一タンパク質アッセイの典型的な結合曲線を示している。ｙ軸は、それぞれの試料に対するＳＥＲＳシグナルのレベルを定量化するアルゴリズムの出力である。図８Ｂは、図７に示されている増幅ステップで同一の試薬および濃度を用いて実行されるアッセイを示している。このグラフは、増幅ステップを含めた後に３倍以上のシグナル増大があったことを示している。
本明細書で開示されている方法を使用し、直交エピトープを持つ２つの結合パートナーが使用されることを前提とすると、事実上いかなる分析対象をも検出することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本発明で開示されている増幅法は、ポリヌクレオチドを検出するために使用できる。「ポリヌクレオチド」という用語を使用していても、本明細書で開示されている方法をＤＮＡを含むポリヌクレオチドに限定する意図はない。当業者であれば、ポリヌクレオチドはリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの組合せを含むことができることを理解するであろう。このようなデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは、天然分子および合成類似体の両方を含む。より具体的には、「ポリヌクレオチド」という用語は、単数形単語の核酸とともに複数形単語の核酸を包含することを意図されており、また単離核酸分子または構築体、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖、直鎖または環状とすることができる。ポリヌクレオチドは、従来型ホスホジエステル結合または非従来的型結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含むことができる。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１つまたは複数の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントを指す。「単離」核酸またはポリヌクレオチドという用語は、天然環境から取り出された、核酸分子、ＤＮＡ、またはＲＮＡを意味する。単離ポリヌクレオチドの例としては、溶液中の異種宿主細胞または（部分的にまたは実質的に）精製されたポリヌクレオチド中に保持されている組み換え型ポリヌクレオチドが挙げられる。本発明による単離ポリヌクレオチドまたは核酸は、さらに、合成されたそのような分子を含む。単離ポリヌクレオチドは、さらに、単離発現ベクター、発現構築体、またはその集団を含むことができる。「ポリヌクレオチド」は、さらに、ポリメラーゼ連鎖反応のように、それ自体の増幅産物を指す場合もある。「ポリヌクレオチド」は、ホスホロチオアート、リン酸塩、環原子、修飾誘導体類、および同様の物などの修飾核酸を含むことができる。「ポリヌクレオチド」は、天然ポリヌクレオチド（つまり、人の介入によらずに天然に存在しているもの）、または組み換え型ポリヌクレオチド（つまり、ヒトの介入によってのみ存在するもの）とすることができる。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、両方とも、ヌクレオチドのポリマーを指すが、本明細書で使用されているようなオリゴヌクレオチドは、典型的には長さがヌクレオチド１００個未満である。
図９は、ポリヌクレオチド検出に使用される増幅法を示す代表的な略図である。次に図９を参照すると、本発明で開示されている増幅法は、捕捉プローブ９１０ａ、例えば、塩基対を１５個有する捕捉プローブが付着している磁気捕捉粒子９００を備える。また、レポーター分子９２０、例えば、捕捉プローブ９１０ｂ、例えば、塩基対を１５個有する捕捉プローブが付着しているＳＥＲＳ活性ナノ粒子が形成される。標的ポリヌクレオチド９３０、例えば、塩基対を３０個有するポリヌクレオチドと接触させた場合、複合体９４０が形成され、標的ポリヌクレオチド分子９３０ならびに捕捉プローブ９１０ａおよび９１０ｂからなる二本鎖ポリヌクレオチド９５０を含む。次いで、複合体９４０を、捕捉プローブ９１０ｃ、例えば、レポーター分子９２０に付着している未結合捕捉プローブ９１０ｂに相補的な捕捉プローブが付着している、レポーター分子９６０、例えば、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子と接触させると、捕捉プローブ９１０ｂおよび９１０ｃを含む二本鎖ポリヌクレオチド９７０を含む、複合体９８０を形成できる。複合体９８０を磁場（図に示されていない）に曝すと、複合体９８０は容器、例えば、図７にすでに示されているようなアッセイ容器または試料収集容器の局在領域に移動し、帯磁したペレットが形成される。例えば、図４に示されているようなシステム内で、ペレットに１つまたは複数の波長の入射光が照射されると、これにより、レポーター分子は、生体試料中の１つまたは複数の標的ＤＮＡの存在または量を検出するための検出可能なシグナルを発生する。
本明細書で開示されているＤＮＡアッセイからのデータは、図１０Ａおよび１０Ｂに示されている。
Ｋ．磁気プルダウン液体ベースアッセイにおける改善されたラマン基準スペクトルおよびスペクトル分析
本明細書で開示されている発明対象は、他の実施形態では、ラマン分光法ベースの分析で使用するための基準スペクトルを発生する方法を提供する。この方法は、本明細書で開示されている種類の液体アッセイにおいて磁性粒子結合ナノ粒子とともに使用することができ、好都合である。試料中の特異的ＳＥＲＳ活性ナノ粒子の量を測定するために、一般的に、知られている量の特異的ＳＥＲＳ活性ナノ粒子によってラマンシグナルが発生されなければならない。典型的には、その知られている、または基準シグナルは、溶液中の特異的ＳＥＲＳ活性ナノ粒子によって生成され、試料処理を簡素化することができる。
本明細書で開示されているようないくつかのアッセイシステムでは、ＳＥＲＳ活性粒子は、対象とする分析対象を伴う反応を介して磁性粒子と複合体を作る。これらの組み合わされた粒子は、外部磁石によって小さな容積内に引き込まれる。溶液からすでに得られている基準シグナルを使用して、このペレット内のナノ粒子によって生成されるラマンシグナルの分析を行うことができる。
しかし、本明細書で開示されている発明対象では、同じ単一の種類のＳＥＲＳ活性ナノ粒子が試料中に含まれているとしても、ペレットからのラマンスペクトルが溶液からのラマンスペクトルと異なると定めている。改善された結果は、上記の基準スペクトルがペレットから得られ、溶液からは得られない場合に得ることができる。ペレットのスペクトルと比較したときのこれらの溶液スペクトル中の差異により、試料中のナノ粒子の量を定量化する際に誤差が発生することがある。この観察結果は、特に、多重化環境では正しく当てはまり、そこでは、固有ラマンシグナルを有するいくつかのＳＥＲＳ活性ナノ粒子が試料中に存在している。例えば、基準スペクトルに含まれていない試料シグナル内の特徴は、試料中の他のＳＥＲＳ活性ナノ粒子に由来するものとして解釈できる（実施例４を参照のこと）。
溶液およびペレットから出るスペクトルの差は、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子の定量化に影響を及ぼすほど大きくないのがよい（実施例４を参照のこと）。これは、一方のＳＥＲＳ活性ナノ粒子が大量に存在し、他方のＳＥＲＳ活性ナノ粒子が全く存在していない場合に特に正しい。これらの状況において、誤差が小さければ、存在しないＳＥＲＳ活性ナノ粒子について得られる結果は偽陽性になる場合がある。
この実施形態によれば、ラマンスペクトルは、最小二乗フィッティングによって分析することができ、この場合、それぞれの潜在的成分に対し基準シグナルが使用される。最小二乗フィッティング法では、分析されるシグナルは、スペクトルの一次結合からなるものと想定され、それぞれの寄与は試料中の特異的ＳＥＲＳ活性ナノ粒子の相対量によって変わる。基準シグナルのどれとも「フィッティング」しえない測定されたシグナル内の特徴は、もっぱらバックグラウンドシグナル内に分割できる。しかし、測定されたシグナルの特徴が、基準シグナルの特徴と一致する場合、このフィッティングでは、全シグナルの一部をその基準源に割り当てる。例えば、スペクトルが、ナノ粒子のペレット化の影響を受ける場合、それらの変化は、必ず、定量化の際の誤差に寄与する。これらの変化が基準スペクトルで捕捉された場合、そのような誤差試料分析は低減できる。当業者であれば、限定はしないが、部分最小二乗法、主成分分析、および同様の技術を含む、他の多変量分析技術が、本明細書で開示されている方法とともに使用できることを理解するであろう。
本明細書で開示されている発明対象では、他の実施形態において、ラマンスペクトル、特にＳＥＲＳ活性ナノ粒子から、また特に異なるラマンスペクトルを持つ粒子が複数の分析対象を同定するために使用される多重化された状況において得られるスペクトルを分析する方法が提供される。試料中の特異的ＳＥＲＳ活性ナノ粒子（固有ラマンシグナルを発生する特異的ＳＥＲＳ活性ナノ粒子を含むナノ粒子）の量を測定するために、試料のスペクトルは、典型的には、広範な波長または波数にわたって記録され、次いで、１つまたは複数の基準スペクトルと比較される。この比較は、一貫性のある好適な波長または波数範囲にわたって基準スペクトルに試料スペクトルをフィッティングすることを伴う。
本明細書で開示されている発明対象は、この典型的な比較から行ったナノ粒子成分の推定を、第１の比較の結果に基づき２通りに精密化することができることを示している。第１に、異なる成分についてのスペクトルの寄与分の間の差はスペクトル範囲にわたって変化することがあるため、第１の推定における成分の相対量に応じて、計算の際にそれらのスペクトル内の特定の範囲に大きな重みを付けることができる。第２に、存在しないか、または非常に低い濃度で存在すると推定される成分を、分析から取り除き、残りの成分を推定し直すことができる。いずれの場合も、適合精度（「適合度」）の増大を計算し、評価することができる。「適合度」は、試料スペクトルとフィッティングされたスペクトルとの間の差を表し、当技術分野で知られている方法によって決定され、例えば、最小二乗フィッティング法の残余として報告できる。これら２つの方法は、組み合わせて適用することも、別々に適用することもできる。それに加えて、本発明で開示されている方法は、区別されなければならないスペクトルを同様に有するさまざまなＳＥＲＳ活性ナノ粒子に適用可能である。
ＩＩ．複合ナノ構造およびその使用方法
本明細書で開示されている発明対象は、コア粒子に結合している複数のシグナル担持粒子、例えば、ナノ粒子を含む、本明細書において「サテライト」構造と称する複合構造、ならびにコア粒子、コア粒子を囲むラマン活性物質などの活性物質、および活性物質を囲む金属シェルなどの１つまたは複数のシェルを含む、本明細書において「コアシェル」と称する複合構造を含む、複合ナノ構造を実現する。本発明において開示されるサテライトおよびコアシェル構造は、ＳＥＲＳアッセイなどのアッセイでシグナルを増幅または他の何らかの方法で増強するために使用できる。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている発明対象は、アッセイを実行するための方法を提供し、この方法は、サテライト構造、コアシェル構造、またはこれらの組合せのうちの少なくとも１つを形成するステップと、サテライト構造および／またはコアシェル構造を、１つまたは複数の標的分析対象を含むことが疑われる試料に接触させるステップと、検出ステップを実行して、試料中の１つまたは複数の標的分析対象の有無を判定するステップとを含む。
より具体的には、一実施形態では、シグナル増強は、コア粒子（例えば、微小粒子）に結合している複数のシグナル担持サテライト（例えば、ナノ粒子）を有する複合構造を、その結果得られる複合サテライト構造が複数のシグナルを発生できるように形成することにより達成できる。したがって、サテライト構造は、低い濃度の分析対象を有する試料などについて、アッセイ内の分析対象の検出を改善することができる。
本明細書で開示されている発明対象のさまざまな態様によれば、サテライト粒子は、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子、有機ナノ粒子、および／または無機ナノ粒子とすることができる。同様にコア粒子は、磁性体、シリカ、金属（例えば、金）、または有機物質の微小粒子もしくはナノ粒子とすることができる。サテライトおよびコア粒子は、球形または非球形とすることができる。サテライト粒子は、静電気、共有結合、またはファンデルワールス力を使用してそれぞれのコア粒子に結合できる。それに加えて、サテライト粒子は、典型的には、検出を容易にする蛍光、ラマン活性、または酵素レポーター分子などのレポーター分子を含む。サテライト粒子および／または少なくとも１つのコア粒子には、さらに、抗体、核酸プローブ、または遮断薬などの分子を結合することができる。
他の実施形態では、本明細書で開示されている発明対象は、コア粒子、コア粒子を囲む、ラマン活性物質などの活性物質、および活性物質を囲むシェルを備えるコアシェル構造を形成し、このシェルは、連続層、または好ましくは互いに近接する複数のナノ粒子とすることができる。コアおよびシェル物質は、同じでも異なっていてもよく、望ましくは、活性物質のスペクトルを増強する物質から選択される。例えば、金コアおよび金シェルは、表面増強ラマン散乱の応用事例におけるラマン活性物質の検出可能なスペクトルを改善する。
この方法のさらに他の態様は、表面増強ラマン散乱を使用して標的分析対象を検出することを含むことができる。例えば、標的分析対象用の抗体を有する複数の磁気ビーズ、金属ビーズ、または半導体ビーズを、標的分析対象に対する類似の結合分子を有する複合構造とともに、アッセイ内に導入することができる。分析対象は、もし存在すれば、複合構造とビーズとの間にサンドイッチ状に挟まれる。ビーズを、例えば、磁場を印加することにより操作し、ラマンスペクトルを介して検出できるように複数のサンドイッチを凝縮することができる。本明細書で開示されている発明対象の他の態様は、複数の本明細書で開示されている複合構造を複数の条件の下で細胞または組織と接触させて複合構造を分析対象（例えば、正常もしくは癌性の細胞）に付着させるステップとこれらの構造を画像化するステップとを含む。
Ａ．サテライトナノ構造
本明細書で開示されている発明対象は、いくつかの実施形態において、ＳＥＲＳアッセイなどのアッセイでシグナルを増幅または増強するために使用できる、微小粒子−ナノ粒子サテライト構造を形成する。
次に、図１４を参照すると、本明細書で開示されている発明対象の一実施形態によるサテライト構造１４００の透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）が示されている。サテライト構造１４００は、微小粒子１４１４に結合している複数のナノ粒子１４１２などの、より大きな粒子（例えば、担体）に結合している複数のより小さな粒子（例えば、シグナル伝達部分）を備える。以下でさらに詳しく開示されているように、サテライト構造１４００は、アッセイ内の分析対象のシグナルを増幅することができる。したがって、サテライト構造１４００ではシグナルを増幅することで、他の方法では検出されえない、低い濃度の分析対象を含む試料などの中の分析対象を検出することができる。
本明細書で説明されているサテライト構造１４００を使用することで、分析対象をいくつでも検出できることが理解される。「分析対象」という用語は、限定することを意図しておらず、タンパク質、核酸、または代謝産物などの対象とする任意の分子とすることができる。その代わりに、分析対象は癌性細胞などの細胞とすることもできる。さらに、分析対象を分析するために使用されるアッセイは、均一または不均一とすることができる。例えば、不均一アッセイは、典型的には、アッセイ手順の個々のステップの間で、洗浄または他の物理的手段による、反応要素の分離を必要とするが、均一アッセイは、分離ステップを必要としない。それに加えて、分析対象を同定し、分析するために、所望のアッセイを使用することができる。例えば、サンドイッチイムノアッセイを使用することができ、この実施例について、以下でさらに詳しく述べる。さらに、サテライト構造１４００を使用すると、そのような複数の分析対象を検出するために多重検出を使用できるように複数の分析対象についてシグナル伝達事象を増幅することができる。例えば、異なるシグナル、例えば、別個のＳＥＲＳスペクトルを持つ第１のサテライト構造は、第１の分析対象に対する抗体を含み、異なる、別個のシグナル、例えば、別個のＳＥＲＳスペクトルを示し、第２の種類の分析対象に対し特異的な第２の抗体を有する第２のサテライト構造と直接混合される。
ナノ粒子１４１２は、結合事象の発生を検出するために使用される検出可能なシグナルを発生することができる適当な任意の粒子とすることができる。例えば、ナノ粒子１４１２は、金属、半導体、有機物質、または無機物質のナノ粒子であるものとすることができる。図１４に示されている実施例では、ナノ粒子１４１２は金粒子である。同様に、微小粒子１４１４は、複数のナノ粒子１４１２の付着を容易にする所望の担体とすることができる。例えば、微小粒子１４１４は、磁性体、シリカ、金属（例えば、金）、および／または有機物質の微小粒子とすることもできる。図１４に示されている実施例では、微小粒子は、アミン官能化シリカ粒子である。ナノ粒子１４１２は、典型的には、検出可能なシグナルそれ自体を発生することができ、例えば、量子ドットまたはＳＥＲＳ活性粒子とすることができる。本明細書で開示されている方法とともに使用するのに適している他の粒子も、当業者に知られている。例えば、ナノ粒子１４１２のそれぞれは、ナノ粒子が他の方法では自力でシグナル伝達要素として働くことができない場合にナノ粒子がシグナル伝達要素として働くことができるようにする蛍光、ラマン、および酵素レポーター分子などのレポーター分子を含むことができる。（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている特許文献５参照。）
「微小粒子」という用語が全体を通して使用されているが、微小粒子１４１４は、ナノ粒子１４１２より大きい任意の粒子とすることができることが理解される（ナノ粒子は、直径が約２ｎｍから約２００ｎｍの範囲のサイズを有するものと定義される）。ナノ粒子をそれぞれの微小粒子１４１４に結合するために、静電気、共有結合、またはファンデルワールス力などを使用するさまざまな技術が使用できる。さらに、ナノ粒子１４１２は、ポリマー、ＤＮＡ、アミノ酸、短炭素鎖、ストレプトアビジン／ビオチン結合、または同様の要素などのさまざまなリンカーを使用して微小粒子１４１４に付着させることができ、これにより、微小粒子の周りのナノ粒子の密度を高めることが可能になる。リンカーの長さおよび種類は、微小粒子１４１４に付着しているナノ粒子１４１２の個数、およびナノ粒子と微小粒子との間の間隔をチューニングするように選択できる。ナノ粒子１４１２および／または微小粒子１４１４は、さらに、粒子間相互作用を制御するように（例えば、ポリマーで）コーティングすることができる。
任意の数のナノ粒子１４１２を微小粒子１４１４に結合することができるが、ナノ粒子の正確な数は、実行される特定の実験によって決めることができる。例えば、粒子の比、および反応時の混合状態を最適化することにより、微小粒子１４１４に対するナノ粒子１４１２の分布が一様で、最大となるサテライト構造１４００を得ることが可能である。さらに、ナノ粒子１４１２および微小粒子１４１４は、球形または非球形（例えば、ナノロッド）など、検出される分析対象に応じて、さまざまなサイズおよび構成をとることができる。例えば、図１４は、透過電子顕微鏡画像を示しており、ナノ粒子１４１２および微小粒子１４１４は、球形であり、ナノ粒子は、直径４０ｎｍであり、微小粒子は、直径１μｍである。それに加えて、微小粒子１４１４は、直径をサブミクロン（例えば、０．５μｍ）のものとすることができる。
さらに、ナノ粒子１４１２および／または微小粒子１４１４は、有機化合物、無機化合物、ポリマー、タンパク質、受容体、抗体、核酸プローブ、および遮断薬などの化学種で標識され、分析対象との結合事象を増強または促進するかまたは分析対象との結合事象を促進するか、または不要な相互作用を防ぐことができる。例示的な遮断薬としては、アルブミン、カゼイン、ポリビニルアルコール、ポリ（エチレングリコール）、およびγグロブリンがある。
さまざまな検出技術、例えば、蛍光またはラマン分光分析を使用して、サテライト構造１４００を介して対象とする１つまたは複数の分析対象を検出することができる。検出を実行するために、典型的には、サテライト構造１４００と分析対象との間に少なくとも１つの結合事象が存在する（例えば、後述のようにサンドイッチを介して）。シグナルの増幅は、単一のナノ粒子がその結合事象から１つのシグナルのみを発生するのではなく、複数のナノ粒子１４１２のそれぞれが単一の結合事象に基づいて複数のシグナルを発生する結果として生じる。
図１５は、本明細書で開示されている発明対象の一実施形態によるサンドイッチアッセイ１５００を示している。特に、このアッセイは、担体１５２４上に固定化された抗体１５２２ａを含むが、サテライト構造１５１０も、ナノ粒子１５１２のうちの１つに固定化された抗体１５２２ｂを含む。この特定の実施形態は、抗体１５２２ｂが、ナノ粒子１５１２を介してサテライト構造１５１０に結合していることを示しているが、いくつかの実施形態では、抗体１５２２ｂを担体の微小粒子１５１４に付着させると都合がよい場合があることが理解される。分析対象１５１６は、抗体１５２２ａ、１５２２ｂの間に捕捉され、その結果結合事象が生じる。サテライト構造１５１０は、ナノ粒子１５１２のそれぞれによるシグナル伝達事象によって複数の検出可能なシグナル伝達事象の発生を促進し、その結果、分析対象１５１６と分析対象を捕捉するナノ粒子１５１２との間に結合事象の増幅が生じる。担体１５２４上の抗体１５２２ａおよびサテライト構造１５１０上の抗体１５２２ｂは、同じである必要はないことが理解される。
図１６Ａは、本明細書で開示されている発明対象の他の実施形態によるサンドイッチアッセイ１６００を示している。アッセイ１６００は、複数のサテライト構造１６１０、分析対象１６１６、およびビーズ１６４０を入れたアッセイ容器１６２８を備える。ビーズ１６３０は、磁場によって引き付けることができる磁性体、半導体、または金属物質であるか、または例えば、重力もしくは遠心力を介して、分離／濃縮を他の何らかの方法で促進する構造であるものとすることができる。サテライト粒子１６１０および分析対象１６１６の個数に応じて、ビーズ１６３０はいくつあってもよく、またビーズは、ビーズとサテライト構造との間で分析対象をサンドイッチ状に挟むことができるの任意のサイズおよび構成とすることができる。例えば、限定はしないが、例示的な一実施形態によれば、サンドイッチアッセイ１６００は、約１，０００から１００，０００個までのビーズ１６３０、アッセイ毎に約１，０００から１００，０００個までのサテライト構造１６１０、および微小粒子１６１４毎に約５０から１０，０００個までのナノ粒子１６１２を含むことができる。それに加えて、ビーズ１６３０は、抗体、核酸プローブ、遮断薬、または同様の物質などの化学種をその上に配置できる。
分析対象１６１６は、サテライト構造１６１０とビーズ１６３０との間に捕捉するか、またはサンドイッチ状に挟むことができる。この点に関して、分析対象１６１６は、それぞれのサテライト構造１６１０のナノ粒子１６１２に付着することができるが、ビーズ１６３０は、分析対象がナノ粒子とビーズとの間にサンドイッチ状に挟まれ結合事象を引き起こすように分析対象に付着できる。複数の分析対象１６１６が捕捉される所定の時間を見越して、アッセイ１６００に磁場（例えば、永久磁石または電磁石によって引き起こされる）を印加することができ、これは、図１６Ｂに示されているように、サンドイッチ状に挟まれている分析対象１６１６を特定の場所、例えば、アッセイ容器１６２８の底部に集めて濃縮ペレット１６３２にする。ペレット１６３２は、磁場が印加される方向に応じてアッセイ容器１６２８の底部または側面に形成できる。次いで、ペレット１６３２を分析して、サテライト構造から送られてくるシグナルを介して分析対象１６１６の存在を判定することができる。それぞれのサテライト構造１６１０から得られるシグナルは、上述のように複数のナノ粒子１６１２が存在することにより増強される。表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）は、ラマン活性物質を含むサテライト構造１６１０からのシグナルを検出するために使用できる。
本明細書で開示されている発明対象の他の実施形態は、細胞画像化を対象とするもので、サテライト構造１６１０は、細胞の分析を促進するために使用できる。細胞を分析するために従来の技術を使用することで、限られた数の粒子を癌性細胞などの細胞に付着させ、正常細胞か癌性細胞かを判別するための細胞の画像化を行いやすくすることができる。例えば、１０個の表面マーカーが付着している細胞は、１０個の表面マーカーに対応するシグナル伝達事象が１０個しかないように１０個のナノ粒子にのみ結合することができるであろう。それぞれが複数のナノ粒子を有するサテライト構造１６１０を送って細胞に付着させると、それぞれのサテライト構造を細胞に結合することにより複数のシグナル伝達事象を発生させることができる。例えば、上記の例を続けるとすると、それぞれが１０個のナノ粒子１６１２を含むサテライト構造１６１０が１０ありえ、そのようなシグナルは１００個のナノ粒子から発生し、それぞれの個別結合事象を１０倍に増幅する。したがって、シグナル伝達事象の増幅は、細胞画像化を使用する細胞の同定能力を高めることができる。上述のように、サテライト構造１６１０に、抗体コーティングを標識して、結合事象を促進することができる。サテライト構造１６１０のサイズは、ナノ粒子１６１２が付着する微小粒子１６１４のサイズを最適化することにより最大個数のナノ粒子１６１２によって細胞の装飾が可能になるように修正することができる。したがって、微小粒子１６１４が非常に小さい場合には、ほんの一握りのナノ粒子１６１２がそれに付着できるだけである。その一方で、微小粒子１６１４が非常に大きい場合には、ごく少数のサテライト構造１６１０のみが細胞に結合できる。
Ｂ．複合コアシェルナノ粒子
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている発明対象は、コア粒子、コア粒子を囲むラマン活性物質などの活性物質、および活性物質を囲む金属シェルなどの１つまたは複数のシェルを含む、本明細書で「コアシェル」構造と称する複合粒子を形成し、これは、いくつかの実施形態では、ＳＥＲＳアッセイなどのアッセイでシグナルを増幅または増強するために使用できる。
次に図１７を参照すると、複合構造１７００は、コア１７０２、コアの周りのラマン活性物質１７０４などの活性物質、および活性物質の周りの連続したシェル１７０６を備える。典型的には、外殻１７０６は、厚さ２０ｎｍ以下である。特定の一実施形態では、コア１７０２は、直径約２０から約２００ｎｍの金コアであり、シェル１７０６も金であり、厚さは２から２０ｎｍであり、活性物質は、トランス−１，２−ビス（４−ピリジル）エチレン（ＳＰＥ）などのラマン活性物質である。それに加えて、５ｎｍ未満と薄いシリカ層が、シェル１７０６の下のラマン活性物質上に配置できる。シリカは、いくつかの状況において金シェルの作製を促進するために有利である。その代わりに、ラマン活性物質への金の結合を促進するために二官能性分子を使用できる。金は、表面増強ラマン散乱を行ううえで有利な金属であるが、銀および銅などの金属（またはそのような金属の合金）も有用である。
コアシェル複合構造の他の実施形態では、コアシェル構造は、図１７のものと似ているが、シェルは、典型的にはコアのサイズ以下のサイズを有するナノ粒子で構成される。そのような一実施形態では、コアは、直径約２０から約２００ｎｍの金コアであり、活性物質は、トランス−１，２−ビス（４−ピリジル）エチレン（ＢＰＥ）などのラマン活性物質であり、ナノ粒子も金であり、約２ｎｍからコアのサイズまでの直径を有する。それに加えて、５ｎｍ未満と薄いシリカ層が、ナノ粒子の下のラマン活性物質上に堆積できる。その代わりに、ラマン活性物質への金の結合を促進するために二官能性分子を使用できる。金は、表面増強ラマン散乱を行ううえで有利な金属であるが、銀および銅などの金属（またはそのような金属の合金）も有用である。
図１４〜１７に示されている、また上で説明されている実施形態は、限定することを意図していないことが理解される。特に、本明細書で開示されている発明対象のサテライトおよびコア／シェル構造は、均一アッセイまたは側方流動アッセイなどの、分析対象シグナルを増強するためのさまざまなアッセイにおいて使用できる。単一のアッセイで、両方の種類の粒子を使用することも可能である。ナノ粒子１５１２および微小粒子１５１４のサイズ、個数、材料、および構成は、同定される分析対象１５１６およびシグナル伝達事象の所望の増幅に応じて変化できる。同様に、コア／シェル構造１７００についても、サイズ、材料、および厚さは、特定のアッセイまたは環境に適合させることができる。
上記のように、本明細書で開示されている発明対象にとって特に有利な応用は、表面増強ラマン散乱である。２つの金属ナノ構造が近接している場合、これら２つの構造からプラズモン場の電磁結合が生じ、電磁場増強が大きくなる。ラマン活性分子が、増強電磁場内に置かれると、分子から出るラマンシグナルの強度は、分子が孤立ナノ粒子上にあるときのシグナルに対し数桁の増大を示す。従来、当技術分野では、複数の金属ナノ粒子の凝集を試みてきたが、そのような凝集は、困難であり、また大部分は制御不能である。本明細書で開示されている発明対象は、所望の電磁結合を実現することができるが、より有利な形で実現する。
それに加えて、特定の理論に限定されないが、２つの相互作用するプラズモン構造（コアとシェルまたはコアとサテライト）により、複合構造の表面プラズモン共鳴が生じる波長をチューニングすることができると考えられる。このチューニングを行い、さらに励起レーザーの波長とのからみで、複合構造からのラマンシグナルがさらに増強されると予想され、これにより、アッセイの感度が高まる。
本明細書で開示されている発明対象の複合構造は、適切な技術によって製造できる。シリカコーティングを含む、ナノ粒子形成に関する開示は、例えば、特許文献１２、特許文献５、および特許文献１３にあり、これらは参照により本明細書に組み込まれている。金属粒子を形成し操作する他の方法は、当業者に知られている。
上述の球形粒子に加えて、棒状または他の細長い形状の粒子、および複数の粒子を含むコアなど、他の構成も可能である。
ＩＩＩ．試料チューブおよび試料チューブを使用する方法
本発明の試料チューブおよび試料チューブを使用する方法は、本明細書で開示されている粒子または分析方法のどれとも使用できる。
Ａ．試料収集容器の概要
いくつかの実施形態では、試料容器は、キュベット、血液採取チューブなどのチューブ、一般にアッセイ容器、または検査およびＳＥＲＳ測定の対象となる試料に適合する他の試料収集容器からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、試料収集容器、例えば、チューブは、周囲環境の大気圧より小さい内部圧力を持つことができる。このような試料収集容器は、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Ｃｏｈｅｎの特許文献１４、Ｃａｒｒｏｌｌらの特許文献１５、およびＡｕｇｅｌｌｏらの特許文献１６において開示されている。さらに、いくつかの実施形態では、試料収集容器は、本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子を含む検出試薬を収納する。このような実施形態では、利用者、例えば、患者もしくは医療技術者が検出する生体試料、例えば、血液を採取する前に、この試料収集容器の中に検出試薬を配置しておく。例えば、検出試薬は、試料収集容器の内面、例えば、内壁に固定化されるか、または単純に、試料容器内に他の何らかの方法で配置できる。
試料収集容器、例えば、血液採取チューブを、検出試薬を中に入れたまま利用者に出荷することができる。その代わりに、利用者は、好適な検出試薬を選択して、その検出試薬を収集デバイス内に導入した後、試料を収集することもできる。さらに、本明細書で開示されている発明対象は、血液採取チューブなどの試料収集容器、ＳＥＲＳ活性レポーター分子が付着しているナノ粒子を含む１つまたは検出試薬などの１つまたは複数の試薬、磁気捕捉粒子、およびその個別の成分のうちの１つまたは複数を備えるキットを含むことができる。このようなキットには、限定はしないが、ナノ粒子に付着しているか、またはそれとは別にパッケージされている複数のレポーター分子または複数の特異的結合要素を含む、アッセイの任意の構成要素を入れることができる。
Ｂ．本明細書で開示されている試料収集容器
従来のイムノアッセイでは、抗原の検出は、２つの抗体の間に抗原を「サンドイッチ」状に挟むことにより行うことができ、これらの抗体のうちの一方は、光学または比色分析レポーターで標識される。次いで、測定された光シグナルを使用して、試料中に存在する抗原の濃度を測定することができる。従来の酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によるイムノアッセイは、この種類の技術の例である。
磁気捕捉アッセイは、サイズが数百ナノメートルから数十マイクロメートルまでの範囲のマイクロビーズなどの小さな磁気感受性粒子を、標的特異的物質、例えば、リガンドまたは抗体にコーティングすることを伴う。これらの粒子は、標的要素の溶液、および望ましくない生体分子を含むウェル内に導入される。次いで、標的要素は、磁性粒子上のコーティングに結合する。細胞、タンパク質、核酸配列、および同様のものは、標的要素の例である。磁石が、ウェルの近くに置かれ、磁場がウェルと溶液に印加される。
粒子に結合している標的要素を含む、磁性粒子は、磁石に引き付けられる。磁石は、目的にかなう形で粒子を蓄積するのに十分な磁力を供給する。磁石の配置によっては、粒子は、ウェルの底部または側壁に集まることがある。「平坦な形状」になるようにビーズがそれぞれのウェルのベースの周りに一様に分布するか、または粒子がウェルの側壁に均一に引かれる形状などの一様な粒子分離形状が望ましい。
他のアッセイフォーマットでは、磁気捕捉アッセイは表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）レポーターを使用し、光シグナルは、ＳＥＲＳ標識ナノタグと磁気捕捉粒子との間に抗原介在複合体を形成することにより生成される。ここでまた図１を参照すると、磁気捕捉ＳＥＲＳアッセイの例が示されている。この技術的アプローチを使用した場合、光シグナルの大きさは、磁性粒子ペレットのサイズ、密度、および位置に依存することがある。
探索用光学系に相対的な磁気ペレットのサイズ、密度、および位置は、測定される光シグナルの大きさおよび再現性に影響を及ぼすことができる。例えば、磁性粒子の表面機能性を変えると、ペレットの形状が変化し、延いては光シグナルが著しく異なることもある。大きな窓を持つ以前の試料分析チューブ設計では、チューブを磁石の上に保持して磁性粒子をチューブの底へ引き寄せることにより、アッセイ反応のクエンチングを行うことができる。チューブの窓は、磁性粒子の絶対数に比べて大きいので、密度の高いペレットは、一貫性を保って形成されるとは限らず、ペレット形成の追加のステップが必要になることがある。一貫性のある磁気ペレットを形成する方法の１つは、試料チューブの下に取り付けた磁石を使用することを含み、その際に磁石の中心は、試料チューブの軸に関して中心から外れた位置に置かれる。この方法は、図５に例示されている。典型的には、磁石で試料チューブの底部にペレットを形成するのにわずか数秒しか要しない。典型的には、ペレットは、トーラスの形状をとり、ペレットの中心に粒子はほとんど見られない。中心軸を中心として試料チューブを回転すると、ペレットが受ける磁場が変調され、このため、ペレットはより密度が高くなる。これにより、いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている発明対象は、小さく、密度の高い磁性粒子ペレットを確実に作製する方法を提供する。
次に図５を参照すると、中心外れ位置に取り付けられている磁石の上で試料チューブを回転させることによる信頼性の高いペレット形成のプロセスが例示されている。図５Ａは、試料チューブ５００および磁石５１０の側面を示している。図５Ａに示されているように、磁石５１０（例えば、棒）が試料チューブ５００の下に取り付けられており、磁石の中心は、試料チューブの軸に関して中心から外れた位置に置かれる（図５Ａに破線で示されている）。容器５００および磁石５１０の上面図が、図５Ｂに示されており、磁石５１０の上部は、断面領域５２０として示されている。本明細書で説明されている種類の液体ベースアッセイでは、典型的には、磁石５１０で試料チューブ５００の底部にペレットを形成させるのに要する時間は、短く、例えば、数秒である。典型的には、ペレットは、トーラスの形状をとり、ペレットの中心に粒子はほとんど見られない。図５Ｃは、トーラスの形状のペレット５３０の形成を示す上面図である。磁石５１０の断面領域５２０は、ほとんど粒子を含まない、ペレット５３０の中心を通して見ることができる。本明細書で開示されている発明対象では、中心軸を中心として試料チューブ５００を回転すると、ペレット５３０が受ける磁場が変調され、このため、ペレット５３０はより密度が高くなる。次に図５Ｄを参照すると、中心軸を中心として試料チューブ５００を回転した後に形成される、より密度の高いペレット５４０の上面図が示されている。
Ｃ．磁性粒子を使用する液体ベースアッセイにおけるペレット形成
磁石のサイズを小さくし、試料チューブの回転を増やすことで、磁性粒子ペレットの信頼性が高まり、また密度も高くすることができる。しかし、磁石の位置の変動とともに、回転速度の変動により、ペレットの位置および密度が変調され、したがって、最終的に、測定された光シグナルが変化することもある。したがって、磁性粒子ペレットを形成するステップは、慎重に、また巧妙に実行されなければならない。したがって、試料チューブ内に一貫性のある密度および形状を有する磁性粒子ペレットを形成するためのシステムが必要であり、またこれはより単純なプロセスで達成できる。
ここでまた図１および４を参照すると、磁気捕捉アッセイおよび検出システムの例が示されている。アッセイは、磁性粒子に付着した捕捉抗体を使用する。検出抗体は、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）標識ナノ粒子に付着される。捕捉抗体および検出抗体は、それぞれ、標的分析対象上の異なる、別個のエピトープに特異的に結合する。したがって、ＳＥＲＳ標識ナノ粒子と磁気捕捉粒子との間の抗原介在複合体（Ｓ−Ａ−Ｍ「サンドイッチ」）を形成できる。次いで、Ｓ−Ａ−Ｍサンドイッチ複合体は、磁場を印加することにより試料溶液から隔離できる。サンドイッチ複合体をチューブの底部に引き付けるために磁石が使用され、そこで、結果として得られる磁性粒子ペレットから来る光シグナルが測定される。本明細書で開示されている発明対象は、このプロセスおよび技術とともに使用できる。
この技術的アプローチを使用した場合、光シグナルの大きさは、磁性粒子ペレットのサイズ、密度、および位置に依存することがある。磁気ペレットの形状は、常に一貫性があるわけではない。例えば、磁性粒子の表面機能性を変えると、ペレットの密度および／または形状も変化することがある。図５に示されているように、代替えアプローチでは、試料チューブの下に取り付けられた磁石を使用する。中心軸を中心として試料チューブを回転することにより、試料チューブの底部に小さなペレットが形成できる。さらに、本発明で開示されている方法で使用する試料チューブが提示されている。
次に、図１８Ａから１８Ｃを参照すると、本明細書で開示されている発明対象の少なくとも１つの実施形態により、試料チューブ１８１０は、開放端１８１４を有する細長い本体１８１２と閉鎖端１８１８を有する円錐部１８１６を備えることができる。円錐部１８１６は、さらに、閉鎖端１８１８のところに平坦な底部１８２０を備えることができる。試料チューブ１８１０は、平坦な底部１８２０に対して法線方向にある中心長手方向軸１８２２を有することができる。図１８Ａ〜１８Ｃに例示されている実施形態は、円筒状の細長い本体１８１２を例示しているが、本明細書で開示されている発明対象は、この形状を有する試料チューブに限定されない。細長い本体１８１２は、例えば、三角形、正方形、五角形、六角形、および八角形などの多角形、および他の幾何学的形状などの所望の形状を有することができる。細長い本体の形状は、重要でない。図１８Ａから１８Ｃに例示されている、円錐部分１８１６も、円錐に限定されず、先細りになっている部分があるか、または他の何らかの形で細長い本体の直径または寸法と比べて直径または寸法が小さくなる部分を持つものである限り、外側の形状が細長い本体と一致するような、また細長い本体と異なる形状などの先細り形状をとることもできる。
さまざまな実施形態により、試料チューブ１８１０は、約０．１ｍｍから約１．２５ｍｍまでの範囲、例えば、約０．６３５ｍｍの厚さ１８２５を有する壁１８２４を備えることができる。どのような壁厚も許容可能であり、この所定の厚さより厚い、または薄い壁厚も使用できる。さまざまな実施形態により、細長い本体１８１２は、約２．０ｍｍから約２５ｍｍの範囲、例えば、いくつかの実施形態では、約２．０ｍｍから約１２ｍｍの範囲、または特定の実施形態では、約１０．２ｍｍの内径１８２６を開放端１８１４のところに有することができる。どのような内側または内径も許容可能であり、これらの所定の量より大きい、または小さい内径も使用できる。また、寸法を持たない幾何学的形状が使用される場合、記載されている直径は、定義された空間の端から端までの長さまたは平均長または最長の長さとすることができる。この特性は、本明細書で開示されている発明対象のすべての態様に適用される。
細長い本体１８１２は、円錐部分１８１６に向かって、例えば１度から３度までなど、約０度から約５度までの範囲の角度などわずかに、先細りになるものとすることができる。この所定の量よりも大きい、または小さい角度も使用できる。平坦な底部１８２０は、中心軸１８３４を有し、円錐部分１８１６は、中心軸１８３４に向かって先細りになるものとすることができる。この角度は、約１０度から約５０度まで、または約１５度から約４５度まで、または約１５度から４０度まで、または２０度から３０度までとすることができる。この所定の量よりも大きい、または小さい角度も使用できる。それぞれの場合における角度は、中心軸１８３４を基準線として使用することにより決定される。
さまざまな実施形態により、試料チューブ１８１０は、約１０ｍｍから約５０ｍｍまでの範囲、例えば、２５．４ｍｍなど、２０から３０ｍｍまでの範囲の全長１８２３を有することができる。どのような全長も許容可能であり、これらの長さより大きい、または小さい全長も使用できる。さまざまな実施形態により、試料チューブ１８１０は、内部容積を定めることができる。内部容積は、約０．１ｍＬから約５０ｍｌまで、いくつかの実施形態では、約０．１ｍＬから約２．０ｍＬ以上まで、または約０．２ｍＬから約１．５ｍＬまでの範囲、例えば、約１．４ｍＬ、または約０．４ｍＬとすることができる。この範囲より上または下の量も使用することができ、またこの大きさは重要でない。
さまざまな実施形態により、円錐部分１８１６は、約２．０ｍｍから約１０．０ｍｍまでの範囲、例えば、約６．３５ｍｍなどの任意の長さを有するものとすることができる。この長さよりも大きい、または小さい長さも使用できる。さまざまな実施形態により、円錐部分１８１６は、約１０μＬから約５０ｍＬまで、約１０μＬから約５ｍＬまで、約１０μＬから約１ｍＬまで、約１０μＬから約５００μＬまで、または約５０μＬから約４００μＬまでの範囲、例えば、約２００μＬなどの任意の量の内部容積を定めることができる。内部容積は、この範囲の上または下にあるものとすることができる。
試料チューブ１８１０は、内面１８２６および外面１８２８を有する平坦な底面１８２０を備えることができる。内面１８２６および／または外面１８２８は、光学的品質の仕上げ面または研磨面を有することができる。さまざまな実施形態により、平坦な底面１８２０は、約０．１０ｍｍから約２．０ｍｍまで、または約０．２５ｍｍから約１．０ｍｍまでの範囲、例えば、約０．６３５ｍｍなどの厚さを有するものとすることができる。この量よりも大きい、または小さい他の厚さも使用できる。
さまざまな実施形態により、平坦な底面１８２０は、約０．２５ｍｍから約１０ｍｍまで、いくつかの実施形態では、約０．２５ｍｍから約２．５ｍｍまで、または約０．５ｍｍから約１．２５ｍｍまでの範囲、例えば、約１ｍｍなどの任意の内径１８２９を有することができる。さまざまな実施形態において、平坦な底面１８２０は、約１．２５ｍｍから約２５ｍｍの範囲、例えば、いくつかの実施形態では、約１．２５ｍｍから約６ｍｍの範囲、およびいくつかの実施形態では、約２．５０ｍｍなどの任意の外径１８３０を有することができる。
一般に、本明細書で述べている寸法または容積に関して、他の試料チューブサイズおよび寸法が適している場合もある。一般に、例えば、試料の種類と体積、アッセイの種類、試薬の量、および／または磁性粒子ペレットの所望のサイズを考慮することができる。
さまざまな実施形態により、試料チューブ１８１０は、開放端を囲むフランジ１８２１を備えることができる。フランジ１８２１は、約０．２５ｍｍから約１．２５ｍｍまでの範囲、例えば、約０．８０ｍｍなどの厚さを有することができる。
さまざまな実施形態により、試料チューブ１８１０は、さらに、開放位置および開放端１８１４を封止する閉鎖位置を有するキャップまたは閉鎖デバイス（図に示されていない）を備えることができる。いくつかの実施形態では、キャップは、開放端１８１４内にぴったり嵌るように構成できる。キャップは、チューブ開口部の周囲を保護および被覆し、試料チューブの内側に汚染物質が入り込まないようにしやすい構成のサイズおよび形状を有することができる。抵抗摩擦力に逆らってキャップを下方に押すことにより、キャップを試料チューブに封止することができる。閉鎖の形状はどのようなものでもよく、スナップ嵌合、ネジ嵌合、ストッパー、および同様の方法などの閉鎖方法を伴うことができる。いくつかの実施形態では、キャップは、柔軟なヒンジによって試料チューブ１８１０に装着することができる。
さまざまな実施形態により、試料チューブ１８１０は、中に置かれた成分と反応しない物質を備えるものとすることができる。さまざまな実施形態により、これらの物質が光の透過およびバックグラウンドスペクトルに対し及ぼす影響は最小であるものとすることができる。試料チューブ１８１０は、ガラス、セラミック、および／またはポリマー材料、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、環状オレフィンコポリマー、および同様の物質、またはこれらの組合せを含むことができる。試料チューブ１８１０は、例えば、射出成形または他の成形技術などの標準的手法によって作製できる。
さまざまな実施形態により、試料チューブ１８１０は、熱伝導性物質を含み、かつ／またはポリメラーゼ連鎖反応温度サイクリングの際に生じるような、急速熱伝達を許す厚さを有する壁を備えることができる。
さまざまな実施形態により、平坦な底面１８２０は、光学的品質の窓を備えることができる。光学窓の基本特性としては、表面品質、厚さの一様性、および／または光学純度が挙げられる。光学的品質は、所望の透過レベルが達成されるように吸収および散乱損失が最小であるか、または全くないことを指す。光学的品質は、さらに、屈折率などの光学的特性の一様性も含む。さまざまな実施形態により、光学的品質の窓には、λを放射光の波長としてλ／２を超え、λ／４以下の大きさの引っかき傷または欠陥はありえない。
本明細書で開示されている発明対象は、個別の試料チューブに限定されない。さまざまな実施形態により、試料チューブは、マルチウェルプレートを備えることができる。試料チューブは、例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、または１５３６ウェルプレートを備えることができる。さまざまな実施形態において、マルチウェルプレートは、高生産性の応用事例で使用することができ、典型的には自動化システムを伴う。このようなシステムでは、例えば、それぞれの９６ウェルプレートは、８×１２ウェルとして配置され、それぞれの３８４ウェルプレートは、１６×２４ウェルとして配置され、それぞれの１５３６ウェルプレートは、３２×４８ウェルとして配置できる。本明細書で開示されている発明対象では、どのような配置をも使用できる。
さまざまな実施形態により、試料チューブ内に磁性粒子ペレットを形成するためのシステムは、試料チューブおよび試料チューブの隣下に位置付けられた磁石を備えることができる。試料チューブは、閉じた平坦な底面を有する円錐部分を備えることができ、試料チューブは一定体積の磁性粒子を中に入れて保持することができる。いくつかの実施形態では、磁石は、試料チューブの平坦な底面に隣接して（例えば、下に）配置することができ、磁石は、その容積内に入っている磁性粒子を平坦な底面に引き付けるのに十分な磁力を供給し、それによって磁性粒子ペレットを形成することができる。さまざまな実施形態により、試料チューブは、試料チューブ内に配置された磁性粒子を含む試料を収納することができる。
さまざまな実施形態により、試料チューブは、さらに、試料チューブ内に配置される磁性粒子を収納することができる。試料チューブの平坦な底面は、内径を有し、磁性粒子ペレットは内径を形成できるのと実質的に同じ（内径の１０％以内、５％以内、１％以内の）直径またはサイズを有するものとすることができる。
さまざまな実施形態により、磁性粒子は、常磁性体、超常磁性体、および／または強磁性体で形成することができる。磁性粒子は、従来の磁性体であるか、または含むことができ、またどのようなサイズ／直径にもできる。磁性粒子は、どのようなサイズでもよく、またさまざまな実施形態により、約０．０５ミクロンから約５．０ミクロンまでの範囲の直径、あるいはより小さなもしくは大きな直径または長さ／幅を有することができる。磁性粒子は、例えば、酸化鉄、マグネタイト、またはこれらの組合せを含むことができる。磁性粒子は、カプセル封入磁性粒子、例えば、ポリマーシェルによりカプセル封入されたマグネタイトを豊富に含むコアを備える粒子を含むことができる。磁性粒子は、例えば、直径約１ミクロンなどの常磁性微小球を含むことができ、これは、インディアナ州フィッシャーズ所在のＢａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社から入手できる。
さまざまな実施形態により、磁石の表面積（例えば、Ｌ×Ｗ）は、平坦な底面の表面積と同じか、または大きいか、または小さいものとすることができる。例えば、次に図１９を参照すると、磁石１９４０の表面積は、平坦な底面１９２０の表面積より大きいものとすることができる。磁石１９４０は、試料チューブ１９１０の平坦な底面１９２０の隣下に位置付けることができる。さまざまな実施形態により、磁石は、平坦な底面に完全に重ねて包み込む。さまざまな実施形態により、磁石は、平坦な底面の表面積より、例えば、約１％から約２００％までの範囲、または約３％から１００％までの範囲、または約５％から５０％までの範囲、または約５％から２５％までの範囲、または約５％から１５％までの範囲、または約１％または１０％までの範囲の量だけ大きい表面積を有することができる。表面積に関して磁石をどれだけ大きくできるかということに関して上限はない。平坦な底面より広く、平坦な底面を包み込む表面積を有する磁石を使用すると、試料チューブ１９１０を、磁石に関してある程度の柔軟性をもって配置し、それでもなお一貫性のある磁性粒子ペレットを生産することができる。
図１９Ａおよび１９Ｂに示されている実施形態は、円形磁石１９４０を例示しているが、他の望ましい形状の磁石も使用できる。好ましくは、磁石は、試料チューブ１９１０によって占有される容積の一部または全部の中へ入り込む、磁石表面に向かう方向に一様な勾配を有する実質的に一様な平行磁場を形成する。磁石１９４０は、例えば、三角形、正方形、矩形、六角形、台形、または楕円形の形状または他の幾何学的形状を有することができる。
さまざまな実施形態により、磁石１９４０は、任意の種類の外部磁場発生デバイスで構成することができる。磁石１９４０は、例えば、１つまたは複数の強磁性体、フェリ磁性体、ポリマー結合磁石、希土類磁石、セラミック磁石、および／または電磁石、あるいはこれらの組合せで形成することができる。磁石は、電磁デバイスとすることができる。磁石１９４０は、例えば、酸化鉄、マグネタイト、ガドリニウム、アルニコ、チコナル、バリウム−ストロンチウム、ネオジム−鉄−ホウ素、および／またはサマリウムコバルト、またはこれらの任意の組合せ、および同様の物質を含むことができる。磁石１９４０は、平坦な底面１９０２にすべての磁性粒子を付着するのに十分な強さの磁場を発生することができ、また磁石１９４０は、試料チューブ１９１０が磁石１９４０によってもたらされる磁場の影響下にあるように位置付けることができる。磁場が弱すぎる場合、磁性粒子ペレットは、不完全であるか、または完成するまでに時間が長くかかることがある。さまざまな実施形態により、磁石は、約１ミリテスラ（ｍＴ）から約１テスラ（Ｔ）までの範囲の強さ、またはこの範囲を超える、例えば１０Ｔの強さを有することができる。磁石は、シングルピースであるか、または複数の磁石が何らかの構成で配列されるようなマルチピースとすることができる（例えば、積層、隣り合わせの整列、など）。
磁石は、例えば、保護ハウジング内に入れることができる。さまざまな実施形態により、ハウジングは、さらに、複数の試料チューブを受け入れることができ、１つまたは複数の磁石は、それぞれの試料チューブが少なくとも１つの磁石に隣接するハウジング内に位置付けられるようにハウジング内に配置できる。さまざまな実施形態により、複数の電磁石を使用することができ、その際に、それぞれの電磁石は、例えば、専用電源を使用して独立制御することができる。
さまざまな実施形態により、システムは、複数の試料チューブを備えることができ、それぞれの試料チューブは閉じた平坦な底面を有する円錐部分を備え、一定体積の磁性粒子を中に入れて保持することができる。システムは、さらに、複数の試料チューブの隣下に位置する１つまたは複数の磁石を備えることができ、この１つまたは複数の磁石は、それぞれの試料チューブのそれぞれの平坦な底面に磁性粒子を引き寄せるのに十分な磁力を供給することができる。
図１９Ａに例示されているように、試料チューブ１９１０は、長手方向軸１９２２を有し、磁石１９４０は、長手方向軸１９２２に実質的に平行に整列している磁場１９４２を発生することができる。磁場１９４２は、試料チューブ１９１０によって取り囲まれている容積内への実質的に平行な整列を維持することができる。試料チューブ１９１０および磁石１９４０は、磁場１９４２が長手方向軸１９２２に実質的に整列するように隣接して位置付けることができる。それに加えて、磁場１９４２の平行な整列は、本明細書で開示されている発明対象から逸脱することなく、容積全体にわたってわずかに変化することができる。
図１９Ａおよび１９Ｂに例示されているように、平坦な底面１９２０は、内面１９２６を備え、磁石１９４０は、内面１９２６に対し実質的に法線方向に整列している磁場１９４２を発生することができる。磁場１９４２は、磁性粒子を入れた試料チューブ１９１０内の流体を貫通するときにその実質的に法線方向の整列を維持することができ、また内面１９２６全体にそって実質的に一様な強さを持つことができる。
少なくとも１つの実施形態により、試料チューブ内に磁性粒子ペレットを形成する方法では、閉じた平坦な底面を有する円錐部分を備え、中に内部容積を定め、内部容積内に磁性粒子を含む試料チューブを形成できる。磁石は、平坦な底面の隣下に位置付けることができ、磁石は、磁性粒子を平坦な底面に引き付けるのに十分な磁力を供給して、平坦な底面に磁性粒子ペレットを形成することができる。さまざまな実施形態により、平坦な底面は、内径を有し、磁性粒子ペレットは、実質的に内径と同じであるか、または大きいペレット直径を持つことができる。
さまざまな実施形態により、磁石は、試料チューブの平坦な底面の隣下に位置付けられ、磁石および試料チューブは両方とも、磁性粒子ペレットが形成されている間に、静止状態を保つことができる（例えば、回す必要がない）。さまざまな実施形態により、磁性粒子ペレットは、約１秒から約５分までの範囲、またはそれ以上の時間、いくつかの実施形態では、約１分間にわたって平坦な底面上に形成することができる。
少なくとも１つの実施形態では、複数の試料チューブが形成され、それぞれの試料チューブは細長い本体と閉じた平坦な底面とを有する円錐部分を備え、中に内部容積を定めることができる。試料チューブは、それぞれ、内部容積内に磁性粒子を含むことができる。この方法は、さらに、複数の試料チューブの隣下に１つまたは複数の磁石を位置付けるステップを含み、この１つまたは複数の磁石は、それぞれの試料チューブのそれぞれの平坦な底面に磁性粒子を引き寄せるのに十分な磁力を供給することができる。さまざまな実施形態により、複数の試料チューブのそれぞれに印加される磁力は、実質的にそれぞれの試料チューブ間で等しいものとすることができる。さまざまな実施形態により、磁力は、実質的に同じ期間にそれぞれの試料チューブに印加することができる。さまざまな実施形態により、磁力は、実質的に同じ時点にそれぞれの試料チューブ内の磁性粒子を引き付け始めるものとすることができる。
さまざまな実施形態により、シグナルを検出するシステムは、閉じた平坦な底面を有する円錐部分を備え、一定体積の磁性粒子複合体を中に入れて保持することができる試料チューブを備えることができる。試料チューブは、検出可能なシグナルを発生することができる一定体積の磁性粒子複合体を収納することができる。さまざまな実施形態により、磁石は、試料チューブの平坦な底面の隣下に位置付けることができる。磁石は、容積内に入っている磁性粒子複合体を平坦な底面に引き付けて磁性粒子複合体ペレットを形成するのに十分な強さの磁力を供給することができる。さまざまな実施形態により、システムは、形成されたペレット内の磁性粒子複合体から発生したシグナルを検出することができる検出器を備えることができる。
さまざまな実施形態により、磁性粒子複合体は、標的分析対象に特異的な第１の捕捉プローブを含む磁性粒子、標的分析対象に特異的な第２の捕捉プローブを含むＳＥＲＳ活性粒子、および標的分析対象を備えることができる。磁性粒子複合体は、ラマンシグナルを発生することができる。これらの複合体は、磁場を印加することにより溶液から分離され、その結果得られる磁気ペレットからの光シグナルが測定される。ＳＥＲＳ標識ナノタグは、さらに、例えば、参照によりその開示全体が本明細書に組み込まれている、特許文献１７、特許文献１８、および特許文献１９において説明されている。磁気捕捉剤および磁気捕捉アッセイは、さらに、例えば、参照によりその開示全体が本明細書に組み込まれている、特許文献２０、特許文献２１、および非特許文献１８において説明されている。本明細書で開示されている発明対象では、これらの方法および／または物質を使用することができる。
システムのさまざまな実施形態により、試料チューブは、光学窓を備える平坦な底面を具備することができる。磁性粒子複合体から発生したシグナルは、光学窓を通じて検出できる。シグナルは、例えば、ラマンシグナルとすることができる。さまざまな実施形態により、検出器は、磁性粒子複合体を探索することができるレーザーを備えることができる。検出器は、例えば、分光計および／または電荷結合素子を備えることができる。図４を参照すると、磁性粒子複合体から発生したシグナルを検出するための光学系が例示されている。図４のシステムは、本明細書で開示されている発明対象の試料チューブおよび方法とともに使用できる。
さまざまな実施形態により、試料中の標的分析対象を検出する方法は、閉じた平坦な底面を有する円錐部分を備え、一定体積の磁性粒子複合体を中に入れて保持する試料チューブを形成するステップを含むことができる。磁性粒子複合体は、標的分析対象を含み、検出可能なシグナルを発生することができる。この方法は、さらに、磁石を平坦な底面の隣下に位置付けるステップを含むことができ、磁石は、試料チューブ内に収納されている磁性粒子複合体を平坦な底面に引き付けて磁性粒子複合体ペレットを形成するのに十分な磁力を供給することができる。さまざまな実施形態により、磁性粒子複合体は、平坦な底面上に形成できる。さまざまな実施形態により、磁性粒子複合体ペレットから発生したシグナルは、標的分析対象の有無を判定するために検出し、分析することができる。いくつかの実施形態では、分析対象の定量的量および／または同一性を測定することができる。
この方法のさまざまな実施形態により、複数の試料チューブを形成することができる。それぞれの試料チューブは、標的分析対象を含む一定体積の磁性粒子複合体を収納することができる。この方法は、さらに、複数の試料チューブのそれぞれに印加される磁力が実質的にそれぞれの試料チューブ間で等しいものとなるように１つまたは複数の磁石を位置付けるステップを含むことができる。さまざまな実施形態により、磁力は、実質的に同じ期間にそれぞれの試料チューブに印加することができる。さまざまな実施形態により、磁力は、実質的に同じ時点にそれぞれの試料チューブ内の磁性粒子複合体を引き付け始めるものとすることができる。
この方法のさまざまな実施形態により、磁性粒子複合体は、標的分析対象に特異的な第１の捕捉プローブを含む磁性粒子、標的分析対象に特異的な第２の捕捉プローブを含むＳＥＲＳ活性粒子、および標的分析対象を備えることができる。磁性粒子複合体の一例が、図１に示されている。さまざまな実施形態により、標的分析対象は、第１のエピトープおよび第１のエピトープと異なる第２のエピトープを含むことができる。第１の捕捉プローブは、第１のエピトープに特異的に結合する第１の部分を含み、第２の捕捉プローブは、第２のエピトープに特異的に結合する第２の部分を含むことができる。したがって、「サンドイッチ」複合体を形成することができる。さまざまな実施形態により、磁性粒子複合体は、ラマンシグナルを発生することができる。
少なくとも１つの実施形態において、標的分析対象に特異的な第１の捕捉プローブを含む磁性粒子、標的分析対象に特異的な第２の捕捉プローブを含むＳＥＲＳ活性粒子、および分析される試料が、試料チューブ内に導入される。磁性粒子複合体が形成されるように、適切な条件がさらに整えられる。例えば、図１に例示されている「サンドイッチ」複合体などの磁性粒子複合体を形成することができる。さまざまな実施形態により、この方法は、複数の試料チューブを備えることができる。実質的に等しい磁力が実質的に同じ時点においてそれぞれの試料チューブに加えられるように、１つまたは複数の磁石を配置することができる。さまざまな実施形態により、磁性粒子複合体形成に対し、等しいクエンチングを行うことができる。本明細書で開示されている発明対象では、光源、例えば、レーザーを使用して磁性粒子複合体の探索を行うことができる。試料チューブは、光学窓を備え、この光学窓を通してシグナルを検出することができる。シグナルは、分光計および／または電荷結合素子を使用して検出できる。
したがって、本明細書で開示されている発明対象では、磁気捕捉アッセイに適している磁性ペレットは、好ましくはＳＥＲＳまたは多の検出技術などのアッセイ目的の磁性ペレットを形成するためにチューブおよび／または磁石の回転を伴わないより単純なプロセスで形成することができる。本明細書で開示されている発明対象を使用して、一貫性のある均一なかつ／または再現性のある検査を実施することができ、これにより、本明細書で説明されているようなアッセイの目的にかなう所望の特性およびパラメータを有する試料チューブ内の再現性のある磁性ペレットを形成できる。本明細書で開示されている発明対象では、磁石の整列が試料チューブに揃うことは重要でなく、アッセイの目的のために検出可能なシグナルを発生することができる一貫性のある均一なかつ／または再現性のある磁性粒子複合体を形成できる。いくつかの以前のアッセイシステムでは、磁石の整列が重要であり、整列が適切でなければ、アッセイの目的に使用するのに十分な一貫性のある、望ましい形で形成しなかった。
本明細書で開示されている発明対象では、他の利点として、本明細書で開示されている発明対象が同時に（例えば、１０分以内、５分以内、１分以内、３０秒以内、１５秒以内、および同様に時間内）クエンチングを実行することができるという点が挙げられる。試料チューブの設計により、クエンチングを本質的に一度に実行することができるため、サンドイッチ状挟み込みのクエンチングが行われて、抗体反応が停止され、これにより、ＳＥＲＳおよび同様のものを使用して正確で、完全で、再現性のあるアッセイを達成する目的に望ましい含有量を有するよりよい磁性粒子複合体を得ることができる。
図２０を参照すると、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）アッセイが示されている。アッセイは、本明細書で開示されている発明対象の実施形態により試料チューブを使用して実行された。アッセイは、３連で実行され、その結果得られた結合曲線が図に示されている。達成された最小検出限界（ＭＤＬ）および信頼できる検出限界（ＲＤＬ）は、少なくとも、以前の試料チューブ設計を使用して典型的には観察されたのと同程度によい。
ＩＶ．対象とする代表的な標的分析対象
本明細書で開示されている方法は、生体試料中の１つまたは複数の標的分析対象の存在または量を評価し、または測定するために使用できる。本明細書で使用されているような「分析対象」という用語は、一般的に、検査試料中に存在するか、存在することが疑われうる、検出される物質を指す。より具体的には、「分析対象」は、結合タンパク質または受容体などの天然の特異的結合パートナーが存在する、または特異的結合パートナーを作製できる、任意の物質とすることができる。したがって、「分析対象」は、アッセイにおいて１つまたは複数の特異的結合パートナーを結合することができる物質である。いくつかの実施形態では、分析対象は、少なくとも１つの結合部位を有する、検出または測定される代謝産物などの化合物とすることができる。
標的分析対象は、検査対象の試料中で存在または量が決定されるべき、任意の分子または化合物とすることができる。本明細書で開示されている方法によって測定することができる分析対象のクラスの例として、限定はしないが、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、プロテオグリカン、リポタンパク質、リポ多糖類、薬物、薬物代謝産物、有機小分子、無機分子、および天然または合成ポリマーなどの、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物類、脂肪酸、脂質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、糖タンパク質が挙げられる。標的分析対象の例としては、限定はしないが、グルコース、遊離脂肪酸、乳酸、Ｃ反応性タンパク質、およびサイトカイン、エイコサノイド、またはロイコトリエンなどの抗炎症性メディエータが挙げられる。いくつかの実施形態では、標的分析対象は、脂肪酸、Ｃ反応性タンパク質、およびロイコトリエンからなる群から選択される。他の実施形態では、標的分析対象は、グルコース、乳酸、および脂肪酸からなる群から選択される。
より具体的には、いくつかの実施形態では、分析対象として、上述のようなグルコース、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫＭＢ）アイソザイム、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）タンパク質、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、インフルエンザＡ（Ｆｌｕ Ａ）抗原、インフルエンザＢ（Ｆｌｕ Ｂ）抗原、および呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原が挙げられる。
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は、前立腺の細胞によって産生されるタンパク質であり、典型的には健常男性の血清中に少量存在する。ＰＳＡは、前立腺癌または他の前立腺障害を患っている男性において増大することがある。正常なＰＳＡ血中濃度は、典型的には、０．０から４．０ｎｇ／ｍＬの間にあると考えられるが、４から１０ｎｇ／ｍＬ（ナノグラム／ミリリットル）の間のＰＳＡ血中濃度は、疑わしい濃度であると考えられる。
クレアチンキナーゼ（ＣＫ）は、クレアチンリン酸キナーゼまたはクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）とも称され、心臓、脳、および骨格筋内にもっぱら見られる酵素である。クレアチンキナーゼは、構造がわずかに異なる次のような３つのアイソザイムを含み、ＣＫ−ＢＢ（ＣＰＫ−１ともいう）は、脳と肺内で濃縮され、ＣＫ−ＭＢ（ＣＰＫ−２ともいう）は、大半が心臓内に見られ、ＣＫ−ＭＭ（ＣＰＫ−３ともいう）は、大半が骨格筋中に見られる。特定のＣＰＫアイソザイムに対する診断テストは、典型的には、全ＣＰＫレベルが高い場合に実施され、損傷組織の源を識別しやすくするのに役立つ。例えば、脳損傷、例えば、脳卒中、または肺の損傷、例えば、肺塞栓は、ＣＫ−ＢＢの上昇レベルに関連するものとすることができる。さらに、ＣＫ−ＭＭは、通常、健常対象のほとんどすべてのＣＰＫ酵素活性に関与している。この特定のアイソザイムが、高くなった場合、通常は、骨格筋の損傷またはストレスがあることを示す。
胸痛のある対象のＣＫ−ＭＢレベルを、心臓発作があったかどうかを診断するために、および／または心臓発作時の心筋障害の指標として、測定することができる。典型的には、ＣＫ−ＭＢ値は、心臓発作の後の最初の２から３時間以内にＣＫ−ＭＢ値の著しい上昇を示す。心筋に対しさらなる障害がない場合、レベルは１２〜２４時間でピークとなり、組織死が生じてから１２〜４８時間後に正常に戻る。ＣＫ−ＭＢレベルは、通常は、狭心症、肺塞栓（肺に血栓ができる）、またはうっ血性心不全によって胸痛が引き起こされる場合でも上昇しない。ＣＫ−ＭＢレベルの上昇は、心筋炎（例えば、ウイルスによる心筋の炎症）、電気的損傷、心臓の外傷、心臓除細動、および心臓切開手術の対象において観察できる。このようなアッセイで測定された血清ＣＫ−ＭＢ値は、典型的には、約０．０から約１０ｎｇ／ｍＬまでの範囲である。約５ｎｇ／ｍＬより大きいＣＫ−ＭＢ値だと、典型的には、心筋梗塞の診断が確認される。
心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）タンパク質も、主要な心イベントの独立予測因子である。（例えば、非特許文献１９参照。）心筋梗塞が疑われる対象において測定された血清のｃＴｎＩ値は、約０．４ｎｇ／ｍＬから約１．５ｎｇ／ｍＬまでの範囲である。同文献。しかし、０．１ｎｇ／ｍＬの検出下限を持つｃＴｎＩアッセイは、心筋障害を検出するのにより感度が高い可能性がある。同文献。
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）は、甲状腺の内分泌機能を調節する脳下垂体前葉内の甲状腺刺激ホルモン産生細胞によって合成され、分泌される。ＴＳＨレベルは、甲状腺ホルモンの過剰（甲状腺機能亢進症）または不足（甲状腺機能低下症）があることが疑われる対象の血液で検査される。成人の正常なＴＳＨレベルは、約０．４ミリ国際単位／リットル（ｍＩＵ／Ｌ）から約４．５ｍＩＵ／Ｌまでの範囲である。ＴＳＨの現在アッセイには、血清または血漿中のＴＳＨを測定するためのサンドイッチＥＬＩＳＡが含まれ、試料中のＴＳＨは、抗ＴＳＨモノクローナル抗体によって結合され、次いで、分光光度法または比色分析法によって検出される。
本明細書で開示されているアッセイは、さらに、インフルエンザウイルスを検出するためにも使用できる。インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、およびインフルエンザウイルスＣの３種類のインフルエンザウイルスが存在する。インフルエンザＡ（Ｆｌｕ Ａ）およびインフルエンザＣ（Ｆｌｕ Ｃ）は、複数の種に感染するが、インフルエンザＢ（Ｆｌｕ Ｂ）はほぼヒトだけに感染する。Ａ型ウイルスは、インフルエンザのこれら３つの型のうち最も悪性のヒト病原体であり、典型的には、最も重い疾患を引き起こす。インフルエンザＡウイルスは、これらのウイルスに対する抗体応答に基づく異なる血清型に細分され、Ｈ１Ｎ１（つまり、「スペイン風邪」）、Ｈ２Ｎ２（つまり、「ホンコン風邪」）、Ｈ５Ｎ１（つまり、インフルエンザ株または「鳥インフルエンザ」）、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、およびＨ１０Ｎ７を含む。インフルエンザＢは、ほぼヒトだけの病原体であり、インフルエンザＡに比べてまれであり、１つの血清型しか含まない。インフルエンザＣウイルスは、ヒトとブタに感染し、重大な疾病を引き起こして地域的流行をもたらすが、他の型に比べてまれである。
インフルエンザに利用できる診断テストとしては、高速イムノアッセイ、免疫蛍光アッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、血清学、およびウイルス培養が挙げられる。免疫蛍光アッセイは、蛍光顕微鏡による観察のため蛍光標識された抗体を使用して顕微鏡スライド上に固定化された標本の染色を必要とする。培養法では、細胞培養における初期ウイルス分離を使用し、その後、赤血球吸着阻害アッセイ、免疫蛍光アッセイ、または中和アッセイを行って、インフルエンザウイルスの存在を確認する。インフルエンザ感染を診断する抗原検出アッセイは、ＤＩＲＥＣＴＩＧＥＮ（商標）ＥＺ Ｆｌｕ ＡまたはＤＩＲＥＣＴＩＧＥＮ（商標）ＥＺ Ｆｌｕ Ａ＋Ｂ検査キット（メリーランド州スパークス所在のＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から入手可能）を含む。このような高速クロマトグラフィイムノアッセイは、症状のある患者の鼻咽頭洗浄物／吸引物、鼻咽頭スワブ、および咽頭スワブからのインフルエンザＡまたはインフルエンザＡおよびＢウイルス抗原の直接的検出に使用できる。さらに、このような診断テストは、インフルエンザＡとインフルエンザＢとを区別するためにも使用できる。
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、１歳未満の乳幼児の細気管支炎および肺炎の最も一般的な原因である。ＲＳＶは、マイナスセンスのエンベロープＲＮＡウイルスである。ＲＳＶ感染の診断は、ウイルスの単離、ウイルス抗原の検出、ウイルスＲＮＡの検出、血清抗体の増大の実証、またはこれらのアプローチの組合せによって行うことができる。呼吸器系ウイルスを検出する従来の方法は、細胞培養と直接蛍光抗体法（ＤＦＡ）を含んでいた。酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）および高速手動システムが、インフルエンザＡ／ＢおよびＲＳＶなどの特定ウイルスに対し利用できる。現在、大半の臨床検査室では、ＲＳＶ感染を診断するために、ウイルス性呼吸器感染症が疑われる対象からの鼻咽頭洗浄物、鼻咽頭吸引物、鼻咽頭スワブ、および鼻咽頭スワブ／洗浄物中のＲＳＶ抗原を直接的に、また定性的に検出するための高速クロマトグラフィイムノアッセイである、ＤＩＲＥＣＴＩＧＥＮ（商標）ＥＺ ＲＳＶ検査（メリーランド州スパークス所在のＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から入手可能）などの抗原検出アッセイを使用している。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている発明対象は、生体試料、例えば、血清中の標的分析対象の存在または量を検出する方法を提供するもであり、標的分析対象は、グルコース、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫＭＢ）アイソザイム、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）タンパク質、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、インフルエンザＡ（Ｆｌｕ Ａ）抗原、インフルエンザＢ（Ｆｌｕ Ｂ）抗原、および呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原を含み、この方法は生体試料を分析対象に対して親和性を有する少なくとも１つの特異的結合要素、例えば、対象とする分析対象に対する特異的結合タンパク質またはモノクローナルもしくはポリクローナル抗体が会合している１つまたは複数のＳＥＲＳ活性ナノ粒子、および少なくとも１つのＳＥＲＳ活性レポーター分子を含む試薬に接触させるステップと、ある波長の入射光を生体試料に照射してＳＥＲＳ活性レポーター分子にＳＥＲＳシグナルを発生させるステップと、ＳＥＲＳシグナルを測定して、生体試料中の分析対象の存在または量を検出するステップとを含む。
本明細書で使用されているように、「炭水化物」という用語は、限定はしないが、単糖類、二糖類、オリゴ糖、および多糖類を含む。「炭水化物」は、さらに、限定はしないが、糖類の従来の定義に収まらない炭素、水素、および酸素を含む分子、つまり、少なくとも３つの炭素原子を含む、直鎖ポリヒドロキシルアルコールのアルデヒドまたはケトン誘導体を含む。したがって、例えば、本明細書で使用されているような炭水化物は、３つより少ない炭素原子含むことができる。
本明細書で使用されているような「脂肪酸」という用語は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）および他の分子とエステル結合している脂肪酸を含む、すべての脂肪酸を含む。特定脂肪酸の例としては、限定はしないが、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、オレイン酸塩、リノール酸塩、リノレン酸塩、およびアラキドン酸塩が挙げられる。「遊離脂肪酸」という用語は、ＦＦＡがトリグリセリドまたはリン脂質などの他の分子の一部ではないという点で当技術分野で知られているように本明細書で使用されている。遊離脂肪酸は、さらに、アルブミンに結合または吸着されている非エステル結合脂肪酸を含む。本明細書で使用されているように、「遊離脂肪酸」（非結合型ＦＦＡ）という用語は、アルブミンまたは他の血清タンパク質への結合または吸着がなされていない１つまたは複数の遊離脂肪酸を表すために使用される。
本明細書で使用されているように、「脂質」という用語は、当技術分野で使用されているように使用される、つまり、大半の有機溶媒中に容易に溶けるが、水性溶媒にはごくわずかに溶けるように主にまたは専ら非極性化学基から構成される生物由来の物質である。脂質の例としては、限定はしないが、脂肪酸、トリアシルグリセロール、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロール、ステロイド、およびこれらの誘導体が挙げられる。例えば、「脂質」は、限定はしないが、スフィンゴミエリン、セレブロシド、およびガングリオシドなど、スフィンゴ脂質の誘導体およびセラミドの誘導体である、セラミドを含む。「脂質」は、限定はしないが、ホスファチジン酸塩、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、および同様の物質などのグリセロリン脂質（またはリン脂質）の共通クラスも含む。
本明細書で使用されているように、「薬物」は、特定の細胞型に対する活性または効果がまだ知られていない、知られている薬物または薬物候補とすることができる。「薬物代謝産物」は、他の１つまたは複数の化合物に化学的に変化する薬物の副産物または崩壊産物のいずれかである。本明細書で使用されているように、「有機小分子」は、限定はしないが、本明細書で特に取りあげられている他の分類に正確に収まらない有機分子または化合物を含む。より具体的には、本明細書で使用されているような「有機小分子」という用語は、比較的低分子量で、タンパク質、ポリペプチド、または核酸ではない、天然または人工の（例えば、化学合成を用いた）有機化合物を指す。典型的には、小分子は、約１５００ｇ／モル未満の分子量を有する。また、小分子は、典型的には、複数の炭素炭素結合を有する。
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている発明対象は、核酸、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ＤＮＡフラグメント、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、および同様の物質のうちの１つまたは複数を検出する方法を提供する。一般的に、この方法は、核酸、ＤＮＡフラグメント、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドのうちの１つまたは複数を、オリゴヌクレオチドが付着している本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子と接触させるステップと、そのＳＥＲＳスペクトルの存在または変化を検出するステップとを含む。例示的な実施形態では、本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドは、標的核酸、ＤＮＡフラグメント、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの配列の一部に相補的な、１つまたは複数の配列を有する。検出可能なＳＥＲＳスペクトル、および／またはＳＥＲＳスペクトルの変化は、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドと標的核酸、ＤＮＡフラグメント、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの結果として観察することができる。
本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子、オリゴヌクレオチド、またはその両方は、オリゴヌクレオチドがナノ粒子に付着するように官能化することができる。このような方法は、当技術分野で知られている。例えば、３’末端または５’末端のところでアルカンチオールで官能化されたオリゴヌクレオチドは、金および他の金属ナノ粒子を含む、ナノ粒子に容易に付着する。（例えば、非特許文献２０および非特許文献２１（オリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着するためにも使用できる３’チオールＤＮＡを平坦な金表面に付着する方法を説明している）参照。）
オリゴヌクレオチドを固体表面に付着するのに適した他の官能基は、ホスホロチオエート基（例えば、オリゴヌクレオチド−ホスホロチオエートを金表面に結合することについて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているＢｅｅｂｅらの特許文献２２を参照）、置換アルキルシロキサン（例えば、オリゴヌクレオチドをシリカおよびガラス表面に結合することについては非特許文献２２および２３を、アミノアルキルシロキサンの結合およびメルカプトアルキルシロキサンの類似の結合については非特許文献２４を参照）を含む。５’チオヌクレオシドまたは３’チオヌクレオシドを末端とするオリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオチドを固体表面に付着させるのに使用できる。
オリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着する他の方法が、当技術分野で知られている。このような方法は、さまざまな代表的文献において説明されている。（例えば、非特許文献２５（金上の二硫化物）、非特許文献２６（アルミニウム上のカルボン酸）、非特許文献２７（銅上のカルボン酸）、非特許文献２８（シリカ上のカルボン酸）、非特許文献２９（白金上のカルボン酸）、非特許文献３０（白金上の芳香環化合物）、非特許文献３１（白金上のスルホラン、スルホキシド、および他の官能化溶媒）、非特許文献３２（白金上のイソニトリル）、非特許文献３３（シリカ上のシラン）、非特許文献３４（シリカ上のシラン）、非特許文献３５（シリカ上のシラン）、非特許文献３６（二酸化チタンおよびシリカ上の芳香族カルボン酸、アルデヒド、アルコール、およびメトキシ基）、非特許文献３７（金属上の剛性のあるホスフェート）参照。）
さらに、環状ジスルフィド、例えば、少なくとも２つの硫黄原子を含む五または六員環を持つ環状ジスルフィドで官能化されたオリゴヌクレオチドも、本明細書で開示されている発明対象とともに使用するのに適している。好適な環状ジスルフィドは、市販されているものであるか、または知られている手順で合成することができる。還元型の環状ジスルフィドも使用できる。いくつかの実施形態では、環状ジスルフィドには、さらに、リンカー、例えば、ステロイド残基などの炭化水素部分を付着させることができる。
それぞれのナノ粒子には、複数のオリゴヌクレオチドを付着できる。その結果、それぞれのナノ粒子−オリゴヌクレオチドコンジュゲート体は、相補配列を有する複数のオリゴヌクレオチドまたは核酸に結合できる。所定の配列のオリゴヌクレオチドを作製する方法がよく知られている。（例えば、非特許文献３８および３９参照。）オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドに対し、固相合成法を使用できる（ＤＮＡを合成する知られている方法は、ＲＮＡを合成するのにも使用できる）。オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドは、さらに、酵素を用いて作製することもできる。
したがって、本明細書で開示されている発明対象は、核酸を検出する方法を確立する。本明細書で開示されている方法を使用すれば、どのような種類の核酸でも検出できる。したがって、本明細書で開示されている方法は、核酸の検出が、例えば、疾患の診断および核酸のシーケンシングにおいて必要な複数の応用事例において使用できる。本明細書で開示されている方法によって検出できる核酸の例として、限定はしないが、遺伝子（例えば、特定の疾患に関与する遺伝子）、ウイルスのＲＮＡおよびＤＮＡ、細菌のＤＮＡ、菌類のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡフラグメント、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖および二本鎖核酸、天然および合成核酸、および同様の物質が挙げられる。
核酸を検出する方法の代表的使用例としては、限定はしないが、科学捜査、ＤＮＡシーケンシング、親子鑑定、細胞株認証、遺伝子治療のモニタリング、およびその他多くの目的を持つ、ウイルス性疾患（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、およびエプスタインバーウイルス）、細菌性疾患（例えば、結核、ライム病、ヘリコバクターピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）感染、レジオネラ感染、マイコプラズマ感染、サルモネラ菌食中毒）、性感染症（例えば、淋病）、遺伝性疾患（例えば、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球貧血）、および癌（例えば、癌発生に関わる遺伝子）の診断および／またはモニタリングが挙げられる。
検出する核酸は、知られている方法によって単離できるか、または細胞、組織試料、生体液（例えば、唾液、尿、血液、血清、および同様の物質）、ＰＣＲ成分を含む溶液、過剰のオリゴヌクレオチドまたは高分子量ＤＮＡを含む溶液、および当技術分野で知られているような他の試料中で直接検出することができる。（例えば、非特許文献３８および４０参照。）ハイブリダイゼーションプローブで検出するための核酸を作製する方法も、当技術分野でよく知られている。（例えば、非特許文献３８および４０参照。）核酸が少量存在する場合、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を含む、当技術分野で知られている方法によって適用することができる。（例えば、非特許文献３８および４０参照。）
核酸を検出するための本明細書で開示されている方法の１つは、核酸をオリゴヌクレオチドが付着している本明細書で開示されているナノ粒子のうちの１つまたは複数に接触させることを含む。検出する核酸は、少なくとも２つの部分を持つことができる。これらの間の部分の長さおよび（複数の）距離は、もしあれば、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが核酸にハイブリダイズするときに、検出可能なＳＥＲＳシグナルを観察できるように選択される。これらの長さおよび距離は、経験的に、また使用される粒子の種類およびそのサイズおよびアッセイで使用される溶液中に存在する電解質の種類（当技術分野で知られているように、いくつかの電解質は核酸の立体配座に影響を及ぼす）に応じて決定できる。
また、核酸が、他の核酸の存在下で検出される場合、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが結合する核酸の部分は、十分な一意的配列を含み、核酸の決定が特異的になるように選択されなければならない。そうするためのガイドラインは、当技術分野でよく知られている。ナノ粒子−オリゴヌクレオチドコンジュゲート体と核酸との接触は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸の（複数の）標的配列とのハイブリダイゼーションにとって有効な条件の下で行われる。これらのハイブリダイゼーション条件は、当技術分野でよく知られており、使用される特定のシステムに合わせて容易に最適化できる。（例えば、非特許文献３８参照。）いくつかの実施形態では、厳格なハイブリダイゼーション条件が用いられる。
オリゴヌクレオチドが付着しているＳＥＲＳ活性ナノ粒子を使用することにより核酸を検出するための代表的方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているＰａｒｋらの特許文献２３で開示されている。
本明細書で使用されているように、「試料」という用語は、赤血球、白血球、血小板、血清、および血漿などの全血または全血成分を含む生理液、腹水、尿、唾液、汗、乳、滑液、腹膜液、羊水、経脳脊髄液、リンパ液、肺塞栓症、脳脊髄液、心嚢液、頚腟部試料、組織抽出液、細胞抽出物、および対象とする分析対象を含むことが疑われている人体の他の構成要素などの、生物源由来の試料を含む、任意の液体または流体試料を指す。生理液に加えて、環境または食品生産アッセイを行うための水、食品、および同様のものなどの他の液体試料は、本明細書で開示されている発明対象とともに使用するのに適している。分析対象を含むことが疑われている固形物も、検査試料として使用できる。いくつかの例において、液状媒質を形成するか、または分析対象を放出するように固形検査試料を修正すると都合がよい場合がある。
いくつかの実施形態では、試料は、使用するのに先立って、血液から血漿を用意する、粘性流体を希釈する、または同様の操作などの前処理を行うことができる。このような処理方法は、濾過、蒸留、濃縮、妨害化合物の不活性化、および試薬の追加を伴う場合がある。
試料は、対象から採取された任意の試料とすることができる。「対象」という用語は、試料を採取できる生命体、組織、または細胞を指す。対象は、状態または疾患の診断および／または治療などの医療目的のための被検者、および医療、獣医学目的、または発生学的目的のための動物対象を含むことができる。対象は、さらに、組織培養、細胞培養、臓器複製、幹細胞産生などの試料物質を含むことができる。好適な動物対象としては、哺乳類と鳥類がある。本明細書で使用されているような「鳥類」という用語は、限定はしないが、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ、およびキジを含む。本明細書で使用されているような「哺乳類」という用語は、限定はしないが、霊長類、例えば、ヒト、サル、類人猿、および同様の霊長類、ウシ亜科の動物、例えば、畜牛、雄牛など、ヒツジ属、例えば、ヒツジなど、ヤギ属、例えば、ヤギなど、ブタ、例えば、子ブタ、親ブタなど、ウマ属、例えば、ウマ、ロバ、シマウマなど、野生のネコおよび飼いネコを含むネコ科の動物、イヌを含むイヌ科の動物、ウサギ、野ウサギなどを含むウサギ目の動物、ハツカネズミ、ネズミなどを含む齧歯類を含む。好ましくは、対象は、哺乳類または哺乳類細胞である。より好ましくは、対象は、ヒトまたはヒト細胞である。ヒト対象は、限定はしないが、胎児、新生児、幼児、未成年者、および成人の対象を含む。さらに、「対象」は、状態または疾患のある、またはあることが疑われる患者を含むことができる。そこで、「対象」および「患者」という用語は、本明細書では互いに取り替えて使用される。対象は、さらに、生存能力、分化、マーカー作製、発現、および同様の事柄について検査する際の実験室培地またはバイオプロセス培地中の細胞または細胞群を指すことができる。
本明細書で開示されている方法は、疾患状態または病状を予後については診断するため、またはモニタリングするために使用することができる。本明細書で使用されているように、「診断」という用語は、疾患、障害、または他の病状の有無、重症度、または治療過程の評価を行う予測プロセスを指す。本明細書の目的に関して、診断は、さらに、治療の結果の転帰を判定するための予測プロセスを含む。同様に、「診断する」という語は、試料が状態または疾患の１つまたは複数の特性を示すかどうかの判定を指す。「診断する」という語は、例えば、標的抗原または試薬結合標的の有無を確定すること、または種類、悪性度、病期、または類似の状態を含む、状態または疾患の１つまたは複数の特性を確定するか、または他の何らかの方法で判定することを含む。本明細書で使用されているように、「診断する」という語は、一方の形態の疾患を他方の形態の疾患から区別することを含むことができる。「診断する」という語は、状態または疾患の初期診断または検出、予後診断、およびモニタリングを包含する。
「予後診断」という用語およびその派生形は、疾患または状態の経過を判定または予測することを指す。疾患または状態の経過は、例えば、平均寿命または生活の質に基づいて決定できる。「予後診断」は、１つまたは複数の治療がある場合、またはない場合の疾患または状態の時間的経過の決定を含む。（複数の）治療が考えられる場合、予後診断は、疾患または状態の治療の有効性を判定することを含む。
本明細書で使用されているように、「リスク」という用語は、特定の転帰の確率の評価を行う予測プロセスを指す。
「疾患または状態の経過をモニタリングする」などのような「モニタリングする」という語は、疾患または状態を有する、または有すると疑われる対象から採取される試料の継続的診断を指す。
「マーカー」という用語は、試料中に検出された場合に、疾患または状態の特徴を示すか、またはその存在を示す、抗原を含むタンパク質などの分子を指す。
本明細書で開示されている発明対象は、さらに、限定はしないが、心臓疾患、冠動脈疾患、糖尿病、代謝性疾患、リウマチ関節炎などの炎症性疾患、および癌などの慢性疾患を含む、対象内の疾患状態をモニタリングするための方法も提供する。代謝性疾患としては、限定はしないが、高脂血症、低脂血症、甲状腺機能亢進症、および甲状腺機能低下症が挙げられる。
さらに、本明細書で開示されている方法は、慢性疾患の特異的マーカーをモニタリングするために使用できる。分子アーチファクト、代謝産物、および疾患状態の有害および／または有益な分子の濃度をモニタリングすることにより、対象の進行、退行、または安定性を評価し、次に、それに応じて、治療を調節または改訂することができる。例えば、本明細書で開示されているバイオセンサーを使用してインビボでモニタリングすることができる心臓疾患用のマーカーは、限定はしないが、全脂肪酸、乳酸塩、グルコース、遊離脂肪酸、および限定はしないが、カルジオグリコシドおよび交感神経興奮薬などのさまざまな強心剤を含む。糖尿病のマーカーとしては、限定はしないが、グルコース、乳酸塩、および脂肪酸が挙げられる。同様に、冠動脈疾患のマーカーとしては、限定はしないが、Ｃ反応性ペプチドおよび遊離脂肪酸が挙げられる。一般的に、さまざまな代謝性疾患のマーカーは、限定はしないが、特異的脂肪酸を含む。
本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子も、薬物治療をモニタリングするデバイスで使用するのに適している。実際、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、薬物、薬物候補、または薬物代謝産物を特異的に結合するように設計できる。この方法で、薬物の血漿濃度のモニタリングを行い、ＳＥＲＳ法によって実行される濃度測定結果に基づき投薬量を調節または維持することができる。したがって、薬物または薬物代謝産物を特異的に、また可逆的に結合して薬物の血漿濃度を決定することができるＳＥＲＳ活性ナノ粒子の使用を含む、処方計画を特定対象に合わせて個別化することができる。次いで、ＳＥＲＳ法によって得られる濃度を使用して、対象中の薬物の生物学的利用能を決定することができる。対象に投与される薬物の用量は、対象に対する薬物の生物学的利用能を加減して治療効果を最大にし、毒性を避けるように変更することができる。
本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、さらに、さまざまな代謝産物を同時にモニタリングするために使用でき、その測定結果を使用して、対象の代謝または身体状態のプロファイリングを行うことができる。例えば、長時間にわたって激しい運動を行ったときに、グルコースは、嫌気性プロセスで乳酸に分解される。本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、運動選手の乳酸塩閾値を測定してトレーニングの有効性を最大にし、回復時間を短縮するために使用できる。同様に、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、兵士の乳酸塩閾値を測定して疲労と消耗を防ぎ、回復時間を短縮するために使用することができる。この目的のために、本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、運動時または肉体的ストレスがかかっているときに、グルコースレベル、乳酸レベル、および他の代謝産物をモニタリングするために使用できる。
本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、さらに、緊急救命室または術後回復室または病院などの救急治療設備内の患者の病状または疾患状態をモニタリングするために使用できる。例えば、対象のグルコースレベルをモニタリングするための方法を提供する実施形態では、グルコースレベルがモニタリングされ、正常値に保たれているときに術後患者の死亡率を３０％程度減少させることができることを研究が示している。こうして、本明細書で開示されているＳＥＲＳベースの診断アッセイは、グルコースまたは他の代謝産物のモニタリングが対象の回復または健康全般に不可欠である状況で使用することができる。
検査対象の試料中に存在する１つまたは複数の分析対象の量は、濃度として表すことができる。本明細書で使用されているように、「濃度」という用語は、当技術分野における通常の意味を有する。濃度は、標的分析対象の有無を示す、定性的な値、例えば、マイナス型またはプラス型の結果、例えば、「ＹＥＳ」または「ＮＯ」応答として、あるいは定量的な値として表すことができる。さらに、与えられた分析対象の濃度は、相対量または絶対量として、例えば、「定量値」として報告できる。本明細書で開示されているアッセイは、いくつかの実施形態では、約５ｆｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬまでの濃度範囲、いくつかの実施形態では、約１０ｆｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬまでの濃度範囲、いくつかの実施形態では、約５０ｆｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬまでの濃度範囲の対象とする分析対象を検出することができる。
分析対象の量（濃度）が０に等しければ、探索されている特定の分析対象が存在しないこと、または特定の分析対象の濃度がアッセイの検出限界を下回っていることを示す。測定される量は、追加の測定または操作を行うことなくＳＥＲＳシグナルとすることができる。その代わりに、測定される量は、特定の分析対象の測定値と、限定はしないが、標準または他の分析対象を含む、他の化合物の測定値との差、割合、または比として表すことができる。差が負であれば、測定された（複数の）分析対象の量が減少していることを示す。量は、さらに、異なる時点において測定された、それ自身に対する（複数の）分析対象の差または比として表すこともできる。分析対象の量は、発生するシグナルから直接決定することができるか、または発生したシグナルを、発生したシグナルの値と試料中の（複数の）分析対象の量との相関関係を求めるように設計されているアルゴリズムで使用することができる。
本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、１つまたは複数の分析対象の濃度を連続測定することができるデバイスとともに使用するうえで順応性がある。本明細書で使用されているように、「連続的」という語は、分析対象の測定と併せて、デバイスがデバイス寿命期間の任意の時点において検出可能なシグナルを発生するか、または発生することができることを意味するために使用される。検出可能なシグナルは、シグナルが検出されないとしても、デバイスが常にシグナルを発生しているという点で一定であるものとすることができる。その代わりに、デバイスを一時的に使用し、所望の時点において検出可能なシグナルを発生し、検出することができる。
Ｖ．細胞画像化
本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子のサイズが小さいため、ナノ粒子を細胞内に組み込むことができる。例えば、ＳＥＲＳを使用する化学療法薬とＤＮＡとの錯体形成が実証されている。（例えば、非特許文献４１および４２参照。）ＳＥＲＳは、さらに、特定の癌に対する化学療法耐性の機序を調べるために使用されてきた。（例えば、非特許文献４３参照。）さらに、ＳＥＲＳは細胞内の特定の化学物質の分布を特徴付け、細胞質と細胞核とを区別するために使用されている。（例えば、非特許文献４４参照。）
したがって、いくつかの実施形態では、レポーター分子で標識されたナノ粒子は、細胞画像化に使用され、これで、例えば、生体試料中の正常細胞に対し、異常な細胞、例えば、癌性細胞などの異常を示す細胞を区別することができる。このような実施形態では、色素から生じるラマンシグナルの強度は、検出された細胞の密度に比例する。さらに、いくつかの実施形態では、レポーター分子で標識されたナノ粒子に、さらに、結合ペアの特異的結合要素、例えば、抗体などの他の化学種を標識して、対象とする細胞への結合を促進することができる。細胞画像化にＳＥＲＳ活性ナノ粒子を使用することについては、参照によりそれぞれその全体が本明細書に組み込まれている特許文献２４および２５で説明されている。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている発明対象は、試料細胞中の１つまたは複数の標的構造の存在を検出するための方法を提供し、この方法は、（ａ）１つまたは複数の試料細胞を、１つまたは複数の結合要素を試料細胞中の１つまたは複数の標的構造に結合するのに適している条件の下で１つまたは複数の結合要素で標識された、区別可能なラマンシグナルを発生することができるレポーター分子が会合している１つまたは複数のＳＥＲＳ活性ナノ粒子に接触させるステップと、（ｂ）試料細胞から１つまたは複数の区別可能なＳＥＲＳシグナルを検出して、試料細胞中の１つまたは複数の標的構造の存在を示すステップとを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、細胞内の微細構造を染色するために使用できる。このような実施形態では、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、知られている標的微細構造または受容体に特異的に結合する少なくとも１つのリガンドで標識できる。いくつかの実施形態では、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子プローブのセットを使用することができ、このセットのそれぞれの要素は、知られている標的または受容体に特異的に結合するリガンドと標的との結合後に区別可能なＳＥＲＳシグナルを発生することができる１つまたは複数のＳＥＲＳ活性色素の組合せを含む。
適当な条件の下で、標識されたＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、細胞内の受容体および他の微細構造に特異的に結合することができる。そこで、「染色した」細胞は、例えば、走査型ラマン顕微鏡を使用して細胞内の特定受容体および微細構造の存在および配置を決定することにより画像化できる。さらに、特定のリガンドと会合している個別のラマン活性色素からのＳＥＲＳシグナルを使用して、細胞内の特定受容体および微細構造を区別し、細胞内の受容体および微細構造のプロファイルを作製することができる。本明細書で開示されている方法に従ってアッセイされる標的細胞のプロファイルを同じ種類の正常細胞から同様に得られたプロファイルと比較して、標的細胞内の異常の存在を判定することができる。標的細胞は、生きているか、または死んでいるかのいずれかとすることができる。
本明細書で使用されているように、「微細構造」という用語は、限定はしないが、フィブロネクチンおよびラミニンなどの細胞外マトリックス分子、アクチンフィラメントおよび微小管などの細胞内構造、ヒストンなどの細胞核構造、および同様の構造を含む。このような微細構造に結合するのに適しているリガンドは、本明細書で開示されているリガンドから選択することができ、また限定はしないが、抗フィブロネクチン抗体および抗アクチン抗体などの抗体、および抗ヒストンタンパク質などの他の天然リガンドを含む。
ラマンスペクトル情報を含む細胞の画像は、当技術分野で知られているさまざまな方法によって得ることができる。例えば、顕微鏡を電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラに接続して、試料の完全画像を得ることができる。典型的には、このような実施形態では、単色光分光器または液晶同調フィルタなどの波数（または波長）フィルタリングデバイスを試料とＣＣＤカメラとの間に挿入することができる。フィルタリングデバイスでは、どの時点においても狭い帯域の散乱光のみがＣＣＤカメラに到達できる。複数画像が、ＣＣＤカメラによって集められ、そこで、それぞれの画像が散乱光の特定のスペクトル範囲をカバーすることができる。ソフトウェアで、画像内のそれぞれの点からのスペクトルを構築することができる。その代わりに、画像の単一点からの光を単色光分光器に通して分散させ、アレイ検出器上でその点の完全スペクトルを取得することができる。試料は、画像内のそれぞれの点が分離して得られるように走査できる。次いで、ソフトウェアでラマン画像が構築される。他のアプローチでは、放射線で試料を励起する線走査計測器を構築することができる。この線は、直交する軸にそって同時にスペクトル分散しながらＣＣＤカメラの１つの軸にそって空間的に画像化される。カメラのそれぞれの読み出しで、線の中のそれぞれの空間ピクセルの完全スペクトルを取得する。画像を完成するために、試料の端から端まで線を走査する。画像化に適しているＲａｍａｎ計測器の例は、非特許文献４５で説明されている。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、受動的摂取機構によって細胞または組織内に組み込むことができる。ナノ粒子を細胞内に組み込むための他の機構は、小ペプチドを使用するもので、これは、細胞表面上のエンドサイトーシス受容体に結合し、エンドサイトーシスを通じてナノ粒子を細胞内に引き込むことができる。（例えば、非特許文献４６参照。）さらに、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、ＰＥＰ−１などの両親媒性ペプチドの使用、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（米国カリフォルニア州カールズバッド所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．社）などのカチオン性脂質ベース試薬の使用、ならびにトランスフェリン、マンノース、ガラクトース、およびＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）などのミセルおよびトランスフェクション試薬およびデンドリマーベースの試薬ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（商標）（米国カリフォルニア州バレンシア所在のＱｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．社）などの他の試薬の使用を含む、マイクロインジェクション、トランスフェクション、エレクトロポレーション、およびエンドサイトーシス媒介アプローチを介して細胞内に導入することができる。細胞内間接的方法を使用することで、粒子が所望の標的に結合されることを示すことができる。プローブの特異性を実証するのに適している一方法は、免疫蛍光法であり、これは、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子の配置を検証するために使用できる。生細胞中の細胞構造（ミトコンドリア、ゴルジ体、および小胞体など）を標識するのに役立つ多数の蛍光プローブが市販されている。同一構造を標的とする抗体のコンジュゲート体を作ることにより、標的を能動的に標識するナノ粒子の部分を決定することができる。同様に、非特異的に結合しているナノ粒子の割合も決定できる。ＳＥＲＳ活性ナノ粒子の配置を検証する他のアプローチは、ＧＦＰおよびその類似体などの蛍光タンパク質融合を使用するものである。
いくつかの実施形態では、医学的診断において使用するために、本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子を含む造影剤が用意される。本明細書で開示されている造影剤は、一般的に患者を画像化する際に、および／または特に、患者の病変組織を診断する際に役立つ。上述のように、ナノ粒子コアのサイズ、形状、および組成、色素の同一性、ならびに封止材の組成および厚さを選択することにより、必要に応じて、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子の最適な励起および放出頻度を、約６３０ｎｍから約１０００ｎｍの間で生じるように、つまり、組織による吸収および散乱のある最小領域に来るようにチューニングすることができる。
画像化プロセスは、１つまたは複数の本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子を含む造影剤を細胞、組織試料、または患者などの対象に投与し、次いで、限定はしないが、スポット走査型共焦点顕微鏡、線走査型システム、および光学コヒーレンス断層画像化システムを含む、スペクトル画像化を実行できる当技術分野で知られている任意のシステムを使用して細胞、組織試料、または対象を走査することにより実行できる。細胞、組織試料、または対象中の本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子の存在も、単一波長域上で検出する任意の画像化システムだけでなく、励起光源およびフィルタ処理画像検出機能を備える蛍光画像化システムによって観察できる。本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子とともに使用するのに適している他の画像化システムは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている非特許文献４７で説明されている。動的光散乱分光法および断層撮影法、飛行時間型画像化、準弾性光散乱分光法、光子相関分光法、ドップラー分光法、および拡散波分光法などの時間領域法を含む、他の画像化方法は、本明細書で開示されている発明対象とともに使用するのに適している。これらの技術はすべて、光子間の区別を可能にし、また時間シグネチャに基づいている。ＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、蛍光物質および同様の物質と異なる時間シグネチャを持つことができるので、これらの方法で組織および他の標識に対し区別できる。有用な計測器パラメータとしては、さらに、調光源および時間依存検出器を備える。変調は、パルス的または連続的とすることができる。
細胞、組織試料、または対象の走査により、細胞、組織試料、または対象の内部領域のスペクトルまたは画像が得られ、この走査を使用することで、状態または疾患状態の存在を検出または診断することができる。細胞、組織試料、または対象の領域とは、全細胞、組織試料、または対象、あるいは細胞、組織試料、または対象の特定の領域または一部のことである。対象が患者である場合、本明細書で開示されている造影剤は、血管系、心臓、肝臓、および脾臓を含む、患者の内蔵を画像化するために、また胃腸領域または他の体腔を画像化する際に、あるいは組織特徴付け、血液プール画像化など、当業者に容易に理解されるような他の方法で、使用することができる。
本明細書で開示されている発明対象は、さらに、いくつかの実施形態において、異常病変をインビボで診断する方法を提供し、この方法は、異常病変に関与する分子を標的とする、異常病変に含まれる分子と会合している複数のＳＥＲＳ活性ナノ粒子を異常病変に接触している体液中に導入するステップと、会合しているＳＥＲＳ活性ナノ粒子をインビボで画像化するステップとを含む。本明細書で開示されている方法は、一般的に、胃腸管、心臓、肺、肝臓、頸部、***、および同様の臓器を含む、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子プローブによって接近可能な臓器に適用可能である。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、大腸内視鏡検査の場合のように内視鏡で、または針で対象中に導入することができるか、または使い捨て型先端またはスリーブとともに、またはエンドサイトーシス、トランスフェクション、マイクロインジェクション、および同様の方法を介して使用できる。他の実施形態では、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子プローブは、画像化プローブ自体を直接導入することにより導入できる。いくつかの実施形態では、個別の光ファイバー、または光ファイバーの束を生きている生命体の中に導入して画像化することができる。このような方法は、神経、脳、微細血管、細胞の画像化だけでなく、生体内分布の特徴付けについても実証されている。ゲルコートされた光ファイバーは、センサーの文献においてよく知られている。本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、ゲルに非共有結合することができ、ナノ粒子は、組織内に導入した後組織内に拡散することができる。接触先の液相内に拡散できるようにファイバーの外面上にＳＥＲＳ活性ナノ粒子を固定化するための他のさまざまな方法も、本明細書で開示されている発明対象とともに使用するのに適している。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている発明対象は、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子で動物を標識するための方法を提供し、この方法は、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子を動物体内に導入するステップを含む。本明細書で開示されているＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、限定はしないが、皮下移植法または静脈内注射を含む、好適な方法によって動物体内に導入することができる。ＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、適切な計装を使用して検出できる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている発明対象は、家畜およびペットを含む、動物用の識別システムを構成し、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子を動物の皮下に埋め込んで（または隠して）、識別を可能にする。
以下の実施例は、本明細書で開示されている発明対象の代表的な実施形態を実施する際の当業者向けの手引きとなるように含まれている。本発明の開示および当業者の一般的水準を鑑みると、当業者であれば、以下の実施例が、例示にすぎず、本明細書で開示されている発明対象の範囲から逸脱することなく多くの変更、修正、および改変を加えることができることを理解できる。以下の実施例が用意されているのは、例示するためであって、制限するためではない。
基準標識を使用する磁気捕捉ＳＥＲＳアッセイ
Ｎａｎｏｐｌｅｘ（商標）ＢｉｏｔａｇｓをＯｘｏｎｉｃａ Ｉｎｃ．社（カリフォルニア州マウンテンビュー所在）から購入した。粒子は、直径約５０ｎｍの金粒子であり、トランス−１，２−ビス（４−ピリジル）−エチレン（ＢＰＥ）または４，４'−ジピリジル（ＤＰＹ）から選択されるラマンレポーターで標識され、本明細書で説明されているようにガラス封止された。ガラス封止材はビオチニル化された。磁性粒子（直径約１ミクロン）は、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社（インディアナ州フィッシャーズ所在）から購入したものであり、ストレプトアビジンで標識された。ビオチニル化されたＢＰＥおよびＤＰＹ標識ナノ粒子の２つの溶液をそれぞれストレプトアビジンコートした磁性粒子と混合した。次いで、これら２つの溶液を７：３の比で混ぜ合わせ、図４に例示されている種類のシステムを使用して磁場を印加し、これにより、試料チューブの底部にペレットを形成した。次いで、ペレットを崩して再形成する作業を繰り返し、ペレットの構成毎にラマンシグナルを測定して、ＢＰＥおよびＤＰＹレポーターからのラマンシグナルを同時に測定した。記録されたラマンスペクトルにおいて、１５９０ｃｍ-1のピークは、ＢＰＥラマンレポーターに対応し、１１８０ｃｍ-1のピークは、ＤＰＹレポーターに対応する。
ＢＰＥレポーターのシグナルは、単独で、基準が使用されない場合にシグナルの反復可能性の尺度となる。ＤＰＹレポーターを基準として使用して、ＢＰＥおよびＤＰＹレポーターの比が計算され。図３は、非基準シグナルと基準シグナルの比較を示している。ペレット形成および崩壊を５回繰り返したときの変動係数は、非基準シグナルについいては８．４％、基準シグナルについては３．８％である。したがって、シグナル変動の低減は、第２のレポーターを基準として使用したときに、５５％小さくなる。
溶解試薬を使用する磁気捕捉ＳＥＲＳアッセイ
表面チオール基を持つＯｘｏｎｉｃａ Ｎａｎｏｐｌｅｘ（商標）ナノ粒子が、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート）を使用しヤギ抗ヒトｃＴｎＩポリクローナル抗体（カリフォルニア州エメリービル所在ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ社）で標識された。別に、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を使用して、磁性粒子（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ １μｍ ＢｃＭａｇ（登録商標）、カルボキシ末端化磁気ビーズ）を抗ヒトｃＴｎｌモノクローナル抗体（カリフォルニア州エメリービル所在のＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ社）で標識した。抗体標識ナノ粒子および磁性粒子のマスター混合物を作製したところ、その結果、５．１×１０8個のナノ粒子と１５μｇの磁性粒子を含む１６２μＬのそれぞれのアッセイが得られた。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのβ−グリセロリン酸塩７０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、および１Ｘ Ｓｉｇｍａ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｐ２７１４を含む溶解試薬溶液も、調製した。
アッセイ性能に対する溶解試薬の影響をテストするために、ＰＢＳ希釈緩衝液、血漿、または血液からなる試料を調製した。試料は、４つの群に分けられた。第１の群では、溶解試薬を３つの媒質（緩衝液、血漿、および血液）のそれぞれに加え、約１０分経過した後、緩衝液中にすでに溶解されている心臓トロポニンＩで試料をスパイクして、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬを得た。第２の試料群では、溶解試薬を再び加えるが、代わりに、トロポニンＩを含まない緩衝液を加えて、０ｎｇ／ｍＬの試料を構成した。第３群および第４群は、溶解試薬を使用しない対照試料からなり、０または１００ｎｇ／ｍＬのトロポニンＩを含んでいた。試料毎に、試料１００μＬをマスター混合液６２μＬに加えて、３０分間インキュベートした（低速回転、室温）。生体液の最終濃度は、血漿および血液試料中で約２１％であった。反応は、時切れペレットを形成することにより停止され、それぞれのチューブ内のペレットからのＳＥＲＳシグナルは、カスタム計測器上で読み取られた。
図６は、０および１００ｎｇ／ｍＬの心臓トロポニンＩに対し、溶解試薬がある場合とない場合のＳＥＲＳシグナルレベルを示している。グラフ上のエラーバーは、３つの複製からの±標準偏差を示している。
試料チューブの回転によるペレット形成
水中に分散されたＢａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの磁性粒子（直径約１ミクロン）を使用して、以下のように密度の高いペレットを形成した。磁石（例えば、棒）が試料チューブの下に取り付けられており、磁石の中心は、試料チューブの軸に関して中心から外れた位置に置かれている（図５を参照）。数秒後、磁石が、試料チューブの底部にペレットの形成を引き起こした。中心軸を中心として試料チューブを回転したところ、ペレットが受ける磁場が変調され、その結果ペレットの密度が高くなる。図５の略図は、中心外れ位置に取り付けられている磁石の上で試料チューブを回転させることによるペレット形成のプロセスを示している。
磁石を試料チューブの下に配置した後、粒子を秒単位で磁石によって捕捉した。形成されたペレットは、不規則な形状となり、トーラスの断面に類似していることもある。自軸を中心として試料チューブを回転した後、ペレットの密度が高まる。さらに数回回した後、ペレットの形状は変化しなくなる。その結果得られたペレットは試料チューブを回転せずに形成されたペレットに比べて密度が高く、小さい。
改善されたラマン基準スペクトル
割合を変えて５つの異なるＳＥＲＳ活性ナノ粒子、つまり、「マーカー」とも称される、異なるラマン色素を有するＳＥＲＳ活性ナノ粒子を混ぜ合わせた多重化実験を実施した。ビオチン−アビジン結合技術を使用して、ナノ粒子を磁気ビーズ（直径約１ミクロン）に結合した。上述の実施例３で説明されているように、ペレットを形成した。溶液中のナノ粒子と磁気ビーズペレット中のナノ粒子の二組の基準スペクトルを使用して、ペレット形成された混合物のスペクトルを分析した。
それぞれのＳＥＲＳ活性ナノ粒子だけを含むペレットに対しフィッティングの重みを使用して較正曲線を構成した。次いで、混合物毎にＳＥＲＳ活性ナノ粒子の濃度を推定した。ＳＥＲＳ活性ナノ粒子の濃度は、１．２５Ｅ７粒子／ｍＬから２．５Ｅ８粒子／ｍＬの範囲であった。溶液およびペレットの基準スペクトルが視覚的に区別しがたい場合があっても（図１２を参照）、多重化システムにおける低い濃度を正確に推定するためにはそれらの差が重要である場合がある。０および低濃度の濃度推定値に対する確度と精度は、表１に示されているように改善された。
Figure 2016029400
マーカー１に対する濃度推定値は、図１３にグラフとして示されている。この基準技術の上記の説明は、ラマン分析のため磁性粒子に結合し、ペレット内に引き込まれるＳＥＲＳ活性ナノ粒子が発生するシグナルに基づいているが、この概念は、基準として使用されることもありうる以前の構成と異なる検出時の特定の構成でマーカーが構成されている状況にも適用可能である。
図１１に示されているように、ランダムシグナルは、特徴の誤った整列により入力変数に誤って割り当てられる場合がある。最小二乗法ルーチンを使用して、標準偏差が１０，０００である正規分布している不規則雑音のフィッティングが行われた。入力シグナル１１００は、図１１Ａに示されている。フィッティングされたスペクトル１１１０は、入力シグナル１１００中のランダム雑音による誤差を反映している。この特定の事例では、他のマーカーの負の重みのバランスをとるためにマーカー４に重み０．５が割り当てられた。マーカー４のフィッティングされたスペクトル１１２０は、図１１Ｂに示されている。
代表的な基準スペクトルが、図１２に例示されている。図１２Ａを参照すると、スペクトル１２００は、溶液中のマーカー１のＳＥＲＳスペクトルを表しているが、スペクトル１２１０は、溶液中のマーカー５のＳＥＲＳスペクトルを表している。次に、図１２Ｂを参照すると、スペクトル１２２０は、ペレット中のマーカー１のＳＥＲＳスペクトルを表しているが、スペクトル１２３０は、ペレット中のマーカー５のＳＥＲＳスペクトルを表している。
前記の発明対象は、理解しやすくすることを目的として図解と例とによりある程度詳しく説明されているが、当業者であれば、付属の請求項およびそれと同等の記述の範囲内でいくつかの変更および修正を実施できることを理解するであろう。
すべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それぞれの個別の刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献が参照により組み込まれることが特に、また個別に指示されている場合と同じ範囲にわたって参照により本明細書に組み込まれる。多数の特許出願、特許、および他の参考文献が本明細書において参照されているが、そのような参照を行っていても、これらの文書が当技術分野における共通の一般的知識の一部をなすことを認めることにならないことは理解されるであろう。

Claims (33)

  1. （ａ）（ｉ）アッセイ容器の局在領域に位置付けることができる１つまたは複数の磁性粒子と、
    （ｉｉ）生体試料中の１つまたは複数の分析対象の量に依存する第１の検出可能なシグナルを発生することができる第１のＳＥＲＳ活性ナノ粒子と、
    （ｉｉｉ）前記１つまたは複数の磁性粒子の量および位置に依存するが、前記生体試料中の前記１つまたは複数の分析対象の量には実質的に依存しない第２の検出可能なシグナルを発生することができる第２のＳＥＲＳ活性ナノ粒子とを供給するステップと、
    （ｂ）前記第１の検出可能なシグナルと前記第２の検出可能なシグナルとを比較して、前記アッセイを較正し、生体試料中の１つまたは複数の分析対象の存在または量を検出するステップと、
    を含むことを特徴とする、生体試料中の１つまたは複数の分析対象の存在または量を検出するためのアッセイを較正する方法。
  2. 閉じた平坦な底面を有する円錐部分を備え、一定体積の磁性粒子を中に入れて保持することができる試料チューブと、
    前記試料チューブの平坦な底面の隣下に位置付けられ、前記試料チューブ内に入っている磁性粒子を前記平坦な底面に引き付けるのに十分な磁力を供給して、磁性粒子ペレットを形成することができる磁石と、
    を備えることを特徴とする、試料チューブ内に磁性粒子ペレットを形成するためのシステム。
  3. 前記試料チューブ内に配置されている磁性粒子をさらに備えることを特徴とする請求項２に記載のシステム。
  4. 前記磁性粒子は、０．０５ミクロンから５．０ミクロンまでの範囲の直径を有することを特徴とする請求項２に記載のシステム。
  5. 前記磁性粒子は、酸化鉄、マグネタイト、またはこれらの組合せを含むことを特徴とする請求項２に記載のシステム。
  6. 前記平坦な底面は、第１の表面積を有する第１の表面を備え、前記磁石は、前記第１の表面積より大きい第２の表面積を有する第２の表面を備え、前記第２の表面は、前記第１の表面に向かい合い、実質的に平行であることを特徴とする請求項２に記載のシステム。
  7. 前記第２の表面積は、前記第１の表面積より１パーセントから２００パーセント大きいことを特徴とする請求項６に記載のシステム。
  8. 前記第２の表面は、前記第１の表面に向かい合い、実質的に平行であり、前記第１の表面に完全に重なることを特徴とする請求項６に記載のシステム。
  9. 前記磁石は、強磁性体、電磁石、またはこれらの組合せを含むことを特徴とする請求項２に記載のシステム。
  10. 前記試料チューブは、第１の長手方向軸を有し、前記磁石は、前記第１の長手方向軸に対し実質的に平行に整列した磁場を供給することを特徴とする請求項２に記載のシステム。
  11. 前記平坦な底面は内面を備え、前記磁石は、前記内面に対し実質的に法線方向となるように整列した磁場を供給することを特徴とする請求項２に記載のシステム。
  12. 前記試料チューブは、第１の長手方向軸を有し、前記磁石は、第２の長手方向軸を有する磁場を供給し、前記試料チューブと前記磁石は、前記磁場が前記第１の長手方向軸に実質的に整列するように隣接して位置付けられることを特徴とする請求項２に記載のシステム。
  13. 前記平坦な底面は内径を有し、前記内径と実質的に同じ直径を有する磁性粒子ペレットが形成されることを特徴とする請求項２に記載のシステム。
  14. 前記磁石は、１ミリテスラ（ｍＴ）から１０テスラ（Ｔ）までの範囲の強さを有することを特徴とする請求項２に記載のシステム。
  15. 細長い本体と閉じた平坦な底面を有する円錐部分とを備え、中に内部容積を定める、前記内部容積内に磁性粒子を収納する試料チューブを供給するステップと、
    前記磁性粒子を前記平坦な底面に引き付けるのに十分な磁力を供給することができる磁石を前記平坦な底面の隣下に位置付けるステップと、
    前記平坦な底面上に磁性粒子ペレットを形成するステップと、
    を含むことを特徴とする、試料チューブ内に磁性粒子ペレットを形成する方法。
  16. 前記平坦な底面は、０．５ｍｍから２．０ｍｍまでの範囲の内径を有することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
  17. 前記試料チューブは、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、環状オレフィンコポリマー、またはこれらの組合せを含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
  18. 前記平坦な底面は、第１の表面積を有する第１の表面を備え、前記磁石は、前記第１の表面積より大きい第２の表面積を有する第２の表面を備え、前記第２の表面は、前記第１の表面に向かい合い、実質的に平行であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
  19. 前記第２の表面は、前記第１の表面に向かい合い、実質的に平行であり、前記第１の表面に完全に重なることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
  20. 前記平坦な底面は、内径を有し、前記磁性粒子ペレットは、前記内径と実質的に同じ直径を有することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
  21. 前記磁石は、１Ｔから１０Ｔまでの範囲の強さを有することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
  22. 前記磁性粒子ペレットは、１秒から５分までの範囲の時間で前記平坦な底面上に形成されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
  23. 閉じた平坦な底面を有する円錐部分を備え、検出可能なシグナルを発生することができる一定体積の磁性粒子複合体を中に入れて保持することができる試料チューブと、
    前記試料チューブの平坦な底面の隣下に位置付けられ、前記試料チューブ内に入っている磁性粒子複合体を前記平坦な底面に引き付けるのに十分な磁力を供給して、磁性粒子複合体ペレットを形成することができる磁石と、
    前記ペレット内の前記磁性粒子複合体から発生した前記シグナルを検出することができる検出器と、
    を備えることを特徴とする、シグナルを検出するシステム。
  24. 前記磁性粒子複合体は、
    （ｉ）標的分析対象に特異的な第１の捕捉プローブを含む磁性粒子、
    （ｉｉ）前記標的分析対象に特異的な第２の捕捉プローブを含むＳＥＲＳ活性粒子、および、
    （ｉｉｉ）前記標的分析対象を備えることを特徴とする請求項２３に記載のシステム。
  25. 前記磁性粒子複合体は、ラマンシグナルを発生することができることを特徴とする請求項２３に記載のシステム。
  26. 前記検出器は、前記磁性粒子複合体を探索することができるレーザーを備えることを特徴とする請求項２３に記載のシステム。
  27. 前記検出器は分光計を備えることを特徴とする請求項２３に記載のシステム。
  28. 閉じた平坦な底面を有する円錐部分を備え、検出可能なシグナルを発生することができる、標的分析対象を含む一定体積の磁性粒子複合体を中に入れて保持することができる試料チューブを供給するステップと、
    前記試料チューブ内に収納されている前記磁性粒子複合体を前記平坦な底面に引き付けて磁性粒子複合体ペレットを形成するのに十分な磁力を供給することができる磁石を前記平坦な底面の隣下に位置付けるステップと、
    前記平坦な底面上に磁性粒子複合体ペレットを形成するステップと、
    前記磁性粒子複合体ペレットから発生したシグナルを検出するステップと、
    前記シグナルを分析して前記標的分析対象の有無を判定するステップと、
    を含むことを特徴とする、試料中の標的分析対象を検出する方法。
  29. 前記磁性粒子複合体は、
    （ｉ）前記標的分析対象に特異的な第１の捕捉プローブを含む磁性粒子、
    （ｉｉ）前記標的分析対象に特異的な第２の捕捉プローブを含むＳＥＲＳ活性粒子、および
    （ｉｉｉ）前記標的分析対象を備えることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
  30. 前記標的分析対象は、第１のエピトープおよび前記第１のエピトープと異なる第２のエピトープを含み、
    前記第１の捕捉プローブは、前記第１のエピトープに特異的に結合する第１の部分を含み、
    前記第２の捕捉プローブは、前記第２のエピトープに特異的に結合する第２の部分を含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
  31. 前記磁性粒子複合体は、ラマンシグナルを発生することができることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
  32. 前記シグナルを検出するステップは、レーザーで前記磁性粒子複合体を探索するステップを含むことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
  33. 前記シグナルは、分光計で検出されることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
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