JP2015530968A - 金銀花精製抽出物の製造方法及びそれを含む敗血症及び敗血症性ショックの予防及び治療用組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、金銀花精製抽出物の製造方法及びそれを含む敗血症及び敗血症性ショックの予防及び治療用組成物に関する。本発明による金銀花精製抽出物は、重症敗血症CLPモデルテスト、MODSへの影響、及びTNF‐α、IL‐1β、IFN‐γ、HMGB‐1等の多様な炎症性サイトカインの抑制効果の面で強力な抗敗血症活性を見せ、また、広範囲抗生剤のような市販の抗敗血症剤とともに使用したとき、敗血症及び敗血症性ショックの治療に予想外の相乗効果を見せ、医薬品及び健康機能性食品として敗血症及び敗血症性ショックの治療及び予防に有効に使用することができる。【選択図】図2
Description
本発明は、金銀花(Lonicera Japonica THUNBERG)精製抽出物の製造方法及びそれを含む敗血症、並びに、敗血症性ショックの予防及び治療用組成物に関する。
重症敗血症(severe sepsis)は、臓器の機能不全と低潅流を伴う敗血症状態であって、全身の酸素要求量と酸素供給との間の不均衡をもたらして敗血症性ショック(septic shock)や多臓器機能不全症侯群(multiple organ dysfunction syndrome、以下、「MODS」とも称する)に急速に進行し、高い死亡率を示す疾患である。発熱あるいは低体温症、心拍動増加、心拍出量の増加、全身の循環抵抗の減少、呼吸性アルカローシス及び白血球数の異常増加あるいは減少などが一般的症状であり、その進行は臓器損傷を速めてひいては死に至らせる。重症敗血症及び敗血症性ショックによる患者の死亡率は米国で29%、欧州で27%であり、集中治療室患者の主要な死亡原因である(非特許文献1)。米国の場合、毎年750,000名以上の敗血症患者が発生し、そのうち毎年210,000名以上が死亡する。欧州では、集中治療室患者の約37%及び約15%が重症敗血症及び敗血症性ショック患者であり、韓国では重症敗血症による死亡率が65%に至る。
敗血症は、細菌、ウイルス、真菌のような感染性物質の以外にも、外傷のような非感染性過程を経てさらに悪化し得、敗血症性ショックや多臓器機能不全症侯群(MODS)に進行する(非特許文献2)。敗血症の発病過程における最も顕著な特徴は、敗血症初期に体内の炎症係の過活性化、すなわち、細菌内毒素のような異物を認識して活性化されて炎症誘発サイトカインが過分泌されることであり、このような現象がサイトカインストーム(cytokine storm)と呼ばれ、敗血症の発病から10〜12時間維持される。サイトカインのうちTNF‐αは、敗血症初期段階で最も先に血中から検出されるサイトカインであって、インターロイキン‐5(IL‐5)及びインターロイキン‐8(IL−8)のようなサイトカインの分泌を促進させるだけでなく、他のサイトカインとともに好中球と血管内皮細胞から細胞接着分子の発現を促進させることで、炎症反応を一層加速化させる(非特許文献3,4)。インターロイキン‐6(IL‐6)は、主にリンパ球と単球から分泌される炎症性サイトカインであって、敗血症が発病してから6時間で最高の血中濃度値を示す(非特許文献5)。
そこで、TNF‐α、IL‐6、IL‐1及びIL‐8のように炎症を同伴するか又は促進する炎症仲介物質を抑制するNSAIDSのような抗炎症剤、または、サイトカインの放出を抑制する、例えば、武田薬品工業製のTAK−242(R)及びエーザイ株式会社製のEritoran(R)のようなTLR4選択的抑制剤などの研究が数多く行われてきたが、効果が制限的であるなどの短所がある。
近年、米国と欧州で承認されて重症敗血症治療剤として使用されている薬物は、Eli lilly社製のXigris(R)が唯一である。しかし、これも適応症及び効能が制限的であることや、深刻な出血や脳卒中などの有害反応などの短所を有している(非特許文献6)。
したがって、強力な効能を有して毒性の低い新規な抗敗血症薬の開発が依然として求められており、韓国ではその非毒性のために頻繁に使用されている天然物から効果的な薬物を開発しようとする研究が行われている。
韓国に分布する金銀花は、ルテオリン(luteolin)、イノシトール(inositol)、サポニン(saponin)、タンニン(tannin)、イソクロロゲン酸(isochlorogenic acid)、クロロゲン酸(chlorogenic acid)などの成分を含むことが知られている(非特許文献7)。
しかし、上記の文献のどこにも、金銀花精製抽出物の敗血症に対する治療効果又は改善された効果については言及も示唆もされていない。
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本発明者らは、クロロゲン酸及びその誘導体のような有効成分を多量に含む金銀花精製抽出物を製造する新たな方法及び該金銀花精製抽出物の治療効果を研究するため、重症敗血症CLPモデルテスト、MODSへの影響、TNF‐α、IL‐1β、IFN‐γ、HMGB‐1等の多様な炎症性サイトカインの抑制効果などに対する幾つかの動物モデルテストと共に成分分析を行い、金銀花精製抽出物が多量の有効成分を含んで敗血症及び敗血症性ショックに強力な治療効果を有することを確認し、本発明の完成に至った。
本願発明の他の目的は、下記の詳細な説明によって明らかになるであろう。本発明は、乾燥状態の金銀花試料を抽出溶媒で抽出する第1段階;抽出された抽出物を濾過法、遠心分離法またはこれらの組合せの少なくとも1つ、望ましくは濾過法で処理して金銀花の粗抽出物を得る第2段階;前記粗抽出物に精製水を加えて懸濁溶液を製造した後、前記懸濁溶液を非極性溶媒可溶分画と極性溶媒可溶分画とに分画して非極性溶媒可溶物質を除去し、残渣を回収して1次精製抽出物を得る第3段階;前記1次精製抽出物に精製水を入れ、前記精製水と同一重量の吸着性樹脂(resin)を用いた吸着クロマトグラフィー、イオンカラムクロマトグラフィーまたはこれらの組合せの少なくとも1つの精製工程を行った後、洗浄溶媒で数回洗浄して2次精製抽出物を得る第4段階;前記2次精製抽出物を真空濃縮及び乾燥する第5段階を含む、金銀花精製抽出物の製造方法を提供する。ここで、製造された金銀花精製抽出物は、有効成分を多量に含み、特に、乾燥精製抽出物の重量を基準にクロロゲン酸及びその誘導体を2.0〜30.0%(w/w)、望ましくは5.0〜20.0%(w/w)、さらに望ましくは7.0〜15.0%(w/w)の量で含む。
本発明による製造方法の第1段階において、前記抽出溶媒としては、金銀花試料重量の約1〜100倍(v/w)、望ましくは約2〜20倍(v/w)、さらに望ましくは5〜15倍の体積(v/w)の精製水、酒精、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ヘキサン、エチルアセテート、シクロヘキサン、ジメチルスルホキシド(DMSO)、クロロホルム、及びメチレンクロライドから選択された少なくとも一つの溶媒を使用することが望ましく、精製水、メタノール、エタノール、プロパノール、またはブタノールから選択された少なくとも一つの溶媒を使用することがより望ましく、精製水を使用することが最も望ましい。抽出溶媒として精製水を使用する場合、抽出効率を高めるために金銀花試料重量の0.1〜5重量%、望ましくは0.2〜2重量%の炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)、炭酸ナトリウム(NaCO3)などの弱塩基を精製水に添加することが最も望ましい。
また、本発明による製造方法の第1段階において、前記抽出方法としては、温水還流抽出、冷浸抽出、ソックスレー(Soxhlet)抽出、超音波抽出、またはこれらの組合せの1つ以上を使用でき、特に、20〜120℃、望ましくは30〜100℃の抽出温度で約1〜72時間、望ましくは2〜12時間の条件で温水還流抽出することが望ましい。
本発明による製造方法の第2段階において、濾過法、遠心分離法、またはこれらの組合せの1つ以上、望ましくは濾過法を用いて金銀花の粗抽出物を得ることが望ましい。
本発明による製造方法の第3段階において、約0.005〜5倍、望ましくは0.05〜3倍の体積(v/w、粗抽出物の重量基準)の精製水を加えて懸濁溶液を製造した後、ヘキサン、メチレンクロライド、クロロホルム、エチルアセテート、望ましくは、ヘキサン、メチレンクロライド、またはエチルアセテート、さらに望ましくは、ヘキサンまたはメチレンクロライドのような非極性溶媒を約0.1〜50倍、望ましくは約0.5〜10倍の体積(v/v、懸濁溶液の体積基準)で添加し、前記溶液を非極性溶媒可溶分画と極性溶媒可溶分画とに分画して非極性可溶物質を除去する。
前記第3段階を通じて、ヘキサデカン酸、メチルリノレート、リナロール、カルバクロール及びメチルパルミテートなどのような精油、及びβ‐シトステロールのようなステロール化合物などの非極性溶媒に可溶な非極性溶媒可溶物質を抽出物から除去することができる。
本発明による製造方法の第4段階において、前記1次精製抽出物に約1〜30倍、望ましくは約5〜15倍、さらに望ましくは約5〜10倍の量(w/w、1次精製抽出物の重量基準)の精製水を入れ、前記精製水と同一重量のSP207、HP20SS、ダイヤイオン(Diaion)HP20、SP−850レジン、活性炭またはアンバーライト(Amberlite)XAD‐2,4の少なくとも1つ、望ましくは、ダイヤイオンHP20、SP−850レジンまたはアンバーライトXAD‐2,4の少なくとも1つの吸着性樹脂(resin)を用いた吸着クロマトグラフィーの方法を用いて追加的な精製工程を行うことが望ましい。
また、本発明による製造方法の第4段階において、吸着クロマトグラフィー法の外に、前記精製水と同一重量のAG50W−x8、アンバーライトIR−120、アンバーライトIRA−400、ダウエックス(Dowex)50W−x8又はSK1Bなどのような強酸性樹脂の少なくとも1つ;アンバーライトIRC−50、バイオ−レックス(Bio−Rex)70、デュオライト(Duolite)−436またはWK40のような弱酸性樹脂の少なくとも1つ;若しくは、アンバーライトIR−67又はダウエックス3−x4などのような弱塩基性樹脂の少なくとも1つ、望ましくは強酸性樹脂であるアンバーライトIR−120、アンバーライトIRA−400又はSK1Bの少なくとも1つ、さらに望ましくは強酸性樹脂であるアンバーライトIR−120又はアンバーライトIRA−400の少なくとも1つのイオン性樹脂を用いたイオンカラムクロマトグラフィー法を用いて追加的な精製工程を行うこともできる。
また、本発明による製造方法の第4段階において、精製水、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール又はこれらの混合溶媒、望ましくは精製水とメタノールとの混合溶媒を洗浄溶媒として用いて樹脂吸着物を数回洗浄することで、2次精製抽出物を得る洗浄工程を行うことができる。
前記第4段階を通じて、プロリンなどのアミノ酸、グルコース、スクロース、イノシトールなどの糖など、薬理活性を示さない不活性物質を抽出物から除去することができる。
代案的に、上述した第4段階の精製工程の外に、セファデックス(Sephadex)LH−20レジン、セファデックスG15レジン又はセファデックスG35などのセファデックスを使用したセファデックスカラムクロマトグラフィー法を用いてさらに精製工程を行うことが望ましい。
また、本発明による製造方法の第5段階において、抽出物を真空下、10℃〜80℃、望ましくは60℃以下の温度範囲で濃縮した後、常温乾燥法、凍結乾燥法、熱風乾燥法又はこれらの組合せのいずれか1つ、望ましくは凍結乾燥法の乾燥方法で乾燥することで、金銀花精製抽出物(以下、「HS−23抽出物」とも称する)を製造することができる。
本発明者らは、前記精製工程を通して、上記の方法によって製造される金銀花精製抽出物が、多量の有効成分を含み、特に、クロロゲン酸収率の約5.8倍及びクロロゲン酸とその誘導体を含む総クロロゲン酸誘導体収率の約5.2倍、例えば、乾燥精製抽出物の重量を基準に、3,5‐O‐カフェオイルキナ酸(caffeoylquinic acid)、メチル3,5‐ジ‐O‐カフェオイルキナ酸などを2.0〜30.0%(w/w)、望ましくは5.0〜20.0%(w/w)、さらに望ましくは7.0〜15.0%(w/w)範囲で含み、これは当技術分野において金銀花精製抽出物を製造するための公知の抽出方法で製造する場合の5倍以上である。
さらに、前記HS−23抽出物は、重症敗血症CLPモデルテスト、MODSへの影響、及びTNF‐α、IL‐1β、IFN‐γ、HMGB‐1等の多様な炎症性サイトカインの抑制効果の面で強力な抗敗血症活性を見せ、また、広範囲抗生剤のような市販の抗敗血症剤とともに使用したとき、敗血症及び敗血症性ショックの治療に予想外の相乗効果を見せた(重症敗血症を誘発させた動物モデルにおいて単独治療群と比べて約120%の生存率)。
したがって、本発明は、敗血症、MODS又は敗血症性ショックを治療および予防するため、乾燥精製抽出物の重量を基準にクロロゲン酸及びその誘導体を2.0〜30.0%(w/w)、望ましくは5.0〜20.0%(w/w)、さらに望ましくは7.0〜15.0%(w/w)で含み、乾燥状態の金銀花試料を抽出溶媒で抽出する第1段階;抽出された抽出物を濾過法、遠心分離法またはこれらの組合せの少なくとも1つ、望ましくは濾過法で処理して金銀花の粗抽出物を得る第2段階;前記粗抽出物に精製水を加えて懸濁溶液を製造した後、前記懸濁溶液を非極性溶媒可溶分画と極性溶媒可溶分画とに分画して非極性溶媒可溶物質を除去し、残渣を回収して1次精製抽出物を得る第3段階;前記1次精製抽出物に精製水を入れ、前記精製水と同一重量の吸着性樹脂(resin)を用いた吸着クロマトグラフィー、イオンカラムクロマトグラフィーまたはこれらの組合せの少なくとも1つの精製工程を行った後、洗浄溶媒で数回洗浄して2次精製抽出物を得る第4段階;前記2次精製抽出物を真空濃縮及び乾燥する段階で製造される金銀花の精製HS−23抽出物を提供することを目的とする。
また、本発明による製造方法で精製した金銀花の精製HS−23抽出物を有効成分として含む敗血症、MODS又は敗血症性ショック治療及び予防用薬学組成物を提供することを目的とする。
本発明による精製HS−23抽出物は、乾燥精製抽出物の重量を基準に、クロロゲン酸及びその誘導体を2.0〜30.0%(w/w)、望ましくは5.0〜20.0%(w/w)、さらに望ましくは7.0〜15.0%(w/w)で含み、従来の抽出方法で製造された抽出物より強力な薬理効果を有する。
本発明は、ヒトを含む哺乳動物における敗血症、MODS又は敗血症性ショックの治療および予防のための治療剤を製造するため、上記の方法により精製された金銀花の精製HS−23抽出物の用途を提供することを目的とする。
また、本発明は、上述した方法により精製された金銀花の精製HS−23抽出物の有効量を薬学的に受容可能な担体とともに投与することを含む、ヒトを含む哺乳動物における敗血症、敗血症性ショック又はMODSを治療または予防する方法を提供することを目的とする。
なお、本明細書において「敗血症」とは、様々な敗血症を含み、例えば、軽度の敗血症、重症敗血症、火傷による感染症または敗血症、急性咽頭喉頭炎、潰瘍性大腸炎、IBS(過敏性腸症候群)、リウマチ性関節炎、退行性関節炎、急性肝炎、慢性肝炎、望ましくは、軽度の敗血症、重症敗血症、火傷による感染症または敗血症が上げられるが、これらに限定されることはない。
また、本明細書において「MODS(多臓器機能不全症候群)」とは、様々なMODSを含み、例えば、軽度の敗血症、重症敗血症、または火傷による感染症または敗血症、特に重症敗血症に起因する肝臓、腎臓、心臓、肺、小腸、大腸、十二指腸、胃、膵臓、脾臓などから選択される臓器の損傷が挙げられるが、これらに限定されることはない。
また、本明細書において「敗血症性ショック」とは、様々な敗血症性ショックを含み、例えば、軽度の敗血症、重症敗血症、火傷による感染症または敗血症によって引き起こされる敗血症性ショックが挙げられるが、これらに限定されることはない。
強力な抗敗血症活性を示す前記HS−23抽出物は、敗血症、敗血症性ショック又はMODSを治療及び防止するための相乗効果を得るため、市販の抗敗血症剤と共に使用することができる。
従って、敗血症、MODS又は敗血症性ショックを治療及び予防するため、有効成分として上述した方法によって精製された金銀花の精製HS−23抽出物と市販の抗敗血症剤との組合せを含む薬学組成物を提供することを目的とする。
本発明は、ヒトを含む哺乳動物における敗血症、MODS又は敗血症性ショックを治療及び予防するための治療剤を調製するため、上述した方法によって精製された金銀花の精製HS−23抽出物と市販の抗敗血症剤との組合せの用途を提供することを目的とする。
また、本発明は、上述した方法により精製された金銀花の精製HS−23抽出物と市販の抗敗血症剤との組合せの有効量を薬学的に受容可能な担体とともに投与することを含む、ヒトを含む哺乳動物における敗血症、MODS又は敗血症性ショックを治療または予防する方法を提供することを目的とする。
また、本明細書において「上述した方法により精製された金銀花の精製HS−23抽出物と市販の抗敗血症剤との組合せ」とは、(a)上述した方法により精製された金銀花の精製HS−23抽出物と(b)市販の抗敗血症剤とが0.1〜10:0.1〜10(w/w)、望ましくは1〜10:1〜10、さらに望ましくは、1〜5:1〜5(w/w)の混合比で混合されたものを含む。
また、本明細書において「市販の抗敗血症剤」とは、様々な市販の抗敗血症剤を含み、例えば、ペニシリン系、キノロン系、モノバクタム系、アミノグリコシド系、セファロスポリン系、テトラサイクリン系、グリコペプチド系、カルバペネム系などの抗生剤;メフェナム酸、インドメタシン、イブプロフェン、ピロキシカム、ジクロフェナクなどの抗炎症剤;アムホテリシンB、ナイスタチン、グリセオフルビン、アゾール系などの抗真菌剤;及びセチリジン、フェキソフェナジン、クロルフェニラミンなど抗アレルギー剤からなる群より選択された抗敗血症剤、望ましくは、ペニシリン系、キノロン系、モノバクタム系、アミノグリコシド系、セファロスポリン系、テトラサイクリン系、グリコペプチド系、カルバペネム系などの抗生剤からなる群より選択された抗敗血症剤、さらに望ましくは、アモキシシリン、アンピシリン、バンコマイシン、アミカシン、イミペネムなどからなる群より選択された抗敗血症剤が挙げられるが、これらに限定されることはない。
本発明の薬学組成物は、組成物の総重量を基準に、前記抽出物を約0.01〜50重量%で含有することができる。
本発明の組成物は、当技術分野で周知の方法に従って、従来の担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含むことができる。このとき、前記担体は使用状況や適用方法に応じて適切な物質を使用することが望ましいが、それに限定されない。適切な希釈剤は、Remington’s Pharmaceutical Science(Mack Publishing co、Easton PA)に記載されている。
下記の製剤方法および賦形剤は単なる例示であって、本発明を制限するものではない。
本発明の組成物を含有する医薬製剤は、任意の形態で調製することができ、例えば、凍結乾燥製剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、軟カプセル剤、エリキシル丸剤、サシェなどの固体経口製剤、懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ、水薬などのような液体経口製剤などの経口剤形;クリーム、軟膏、ローション、ゲル、バーム、パッチ、ペースト、スプレー溶液、エアゾールなどの局所用製剤;又は滅菌溶液、懸濁液、凍結乾燥製剤、非水系注射、または水系注射など、望ましくは、無菌注射可能な製剤のような坐剤又は注射用製剤の非経口製剤が挙げられる。
本発明に係る組成物は、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、精製水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油などのような薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または希釈剤を含む薬学組成物として提供することができる。製剤は、さらに、溶媒、添加剤、希釈剤、緩衝剤、等張剤、安定剤、酸化防止剤、疼痛緩和剤、乳化剤、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香味剤、保存剤等を含むことができる。具体的には、前記溶媒、添加剤、または希釈剤は、滅菌蒸留水、生理食塩水、pH調整剤、アルブミン、塩化ナトリウム、マンニトール、リンガー液、ブドウ糖などを含む。粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、軟カプセル剤、エリキシル丸薬、サシェなどの固体経口製剤は、少なくとも1つの賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを用いて本発明の抽出物を混合することで調製することができる。また、必要に応じて、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤などの追加的な添加剤も配合できる。懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ剤、水薬などの液体経口製剤は、水又は流動パラフィンのような一般的な希釈剤の外に、例えば、湿潤剤、香味剤、甘味料、防腐剤などの少なくとも一つの賦形剤と、本発明の抽出物を混合することによって調製することができる。非経口剤形の場合、滅菌溶液、懸濁液、凍結乾燥製剤、非水系注射、または水系の注射などの注射可能な製剤は、基材として例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エチルオレートのような注射可能なエステルを使用することができ、坐剤は、本発明において塩基としてウィテップゾール(witepsol)、マクロゴール、ツイーン61、カカオ脂、ラウリン油、グリセロール−ゼラチンなどを基材として使用することができる。
当技術分野で周知の方法を用いることにより、患者への投与後に有効成分の迅速な放出、持続的な放出または遅延放出を調節するため、本発明の組成物を製剤化することができる。
例えば、本発明の組成物は、オイル、プロピレングリコール、または一般に注射製造に使用される他の溶媒に溶解させることができる。担体の好適な例としては、生理食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物油、ミリスチン酸イソプロピルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。局所投与のために、本発明の抽出物は軟膏およびクリームの形態で製剤化することができる。本発明による組成物の医薬剤形は、その薬学的に許容可能な塩の形態で使用されても良く、単独で、または、関連する他の薬学的に活性な化合物と組み合わせて使用することができる。
本発明の抽出物または組成物の望ましい投与量は、症状及び投与の対象、重症度、薬物形態、投与の経路および期間によって多様であるが、当業者によって選択され得る。しかし、望ましい効果を得るためには、一般に1μg〜5mg/日の量で投与することが推奨され、8μg〜2mg/日が望ましく、16μg〜1mg/日がさらに望ましい。投与量は、一回で投与されるか又は一日数回に分けて投与され得る。例えば、2日〜1週間の期間で一回のように定期的に投与することもできるが、それに限定するものではない。本発明の範囲は、全ての変形、投薬量と回数の変化、および当業者によって考えられ得る任意の投与経路をすべて含む。組成物の面において、本発明の抽出物の量は、組成物の総重量を基準に0.01〜50%であり得、0.5〜40%が望ましい。
本発明の薬学組成物は、多様な経路を介して、哺乳動物(ラット、マウス、家畜又はヒト)などの対象動物に投与することができる。あらゆる投与方法が考えられ、例えば、経口投与、直腸投与、または静脈内、筋肉内、皮下、皮内、髄腔内、硬膜外または脳室内注射などの投与方法で投与することができる。
本発明の抽出物は、毒性及び副作用がなく、安全に使用することができる。
本発明は、敗血症、MODS又は敗血症性ショックを緩和又は予防するための有効成分として、上記の方法により精製された金銀花の精製HS−23抽出物を含む健康機能性食品を提供する。
本発明は、敗血症、MODS又は敗血症性ショックを緩和又は予防するための有効成分として、上述した方法により精製された金銀花の精製HS−23抽出物と市販の抗敗血症剤との組み合わせを含む健康機能性食品を提供する。
また、本発明は、上記の方法により精製された金銀花の精製HS−23抽出物、および敗血症、MODS又は敗血症性ショックを緩和又は予防するための食品学的に許容可能な添加剤を含む健康機能性食品を提供する。
また、本発明は、上述した方法により精製された金銀花の精製HS−23抽出物と市販の抗敗血症剤との組み合わせ、及び敗血症、MODS又は敗血症性ショックを緩和又は予防するための食品学的に許容可能な添加剤を含む健康機能性食品を提供する。
本発明は、望ましい実施形態において、食品学的に許容可能な添加剤とともに、敗血症、MODS又は敗血症性ショックを緩和又は予防するための上記の方法により精製された金銀花の精製HS−23抽出物を含むヘルスケア食品を提供することを他の目的とする。
また、本発明は、望ましい実施形態において、食品学的に許容可能な添加剤とともに、敗血症、MODS又は敗血症性ショックを緩和又は予防するための上述した方法により精製された金銀花の精製HS−23抽出物と市販の抗敗血症剤との組み合わせを含むヘルスケア食品を提供することを他の目的とする。
本発明の健康機能性食品またはヘルスケア食品の粗薬学組成物は、その粉末形、そこから抽出された形態、またはその乾燥抽出物の形態で使用される。
本明細書において「食品学的に許容可能な添加剤」とは、当技術分野で周知の入手可能な添加剤を含み、例えば、米国食品医薬品局(FDA)の食品添加物リストに公開されている(www.fda.gov/foodを参照)。
目的とする疾患を予防および改善するための健康機能性食品組成物は、組成物の総重量を基準に前記粗抽出物を0.01〜95w/w%、望ましくは0.5〜80w/w%で含むことができる。
前記粗薬学組成物は、目的とする疾患を予防および改善するため、食品、添加物または飲料に添加することができる。目的とする疾患を予防及び改善するため、食品または飲料における前記粗薬学組成物の量は、一般に約0.1〜15w/w%であり、健康食品組成物においては食品の全体重量に対して1〜10w/w%であることが望ましく、健康飲料組成物100mlに対して1〜30g、好ましくは3〜10gである。
本発明の健康飲料組成物は、提示された比率で必須成分として上述した抽出物を含有することの外に、他の成分には特に制限がなく、従来の飲料と同様に、種々の脱臭剤または天然炭水化物などを他の液体成分として含むことができる。前記天然炭水化物の例としては、グルコース、フルクトースなどの単糖類;マルトース、スクロースなどの二糖類;デキストリン、シクロデキストリンなどの通常の糖;キシリトール、エリスリトールなどの糖アルコールが挙げられる。上述した以外の消臭剤、例えば、タウマチン、ステビア抽出物(レバウディオサイドA、グリチルリチンなど)のような天然消臭剤;サッカリン、アスパルテームのような合成消臭剤を好適に使用することができる。前記天然炭水化物の量は、一般に飲料組成物100mlに対して約1〜20gであり、望ましくは5〜12gである。
本発明の組成物は、上述した成分の外に、様々な栄養剤、ビタミン、ミネラル又は電解質、及び合成香味剤、着色剤、およびチーズ、チョコレートなどの改良剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護コロイド状接着剤、pH調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料等に使用する炭化剤を含むことができる。上述したものの外に本発明の組成物は、天然果汁、果汁飲料および野菜飲料を調製するための果実ジュースでもあり得、その構成要素は独立して又は組み合わせて使用することができる。成分の比率はあまり重要ではないが、一般に、本発明の組成物の100w/w%当たり約0〜20w/w%の範囲である。
本発明の要旨または範囲から逸脱することなく、本発明の組成物、用途及び製剤において様々な修正および変形が可能であることは当業者にとって明らかであろう。
本発明は、有効成分を多量に含む金銀花精製抽出物を調製するための方法を提供する。
本発明は、敗血症および敗血症性ショックを予防および治療するため、有効成分として有効な量の金銀花精製抽出物を含む薬学組成物を提供する。
本発明は、また、哺乳動物またはヒトにおける敗血症および敗血症性ショックを治療および予防するための薬学組成物を調製するための前記抽出物の用途を提供する。
本発明の上述した目的および他の目的、特徴および他の利点は、添付される図面及び後述される詳細な説明によってより明確に理解できるであろう。
本発明の要旨または範囲から逸脱することなく、本発明の組成物、用途及び製剤において様々な修正および変形が可能であることは当業者にとって明らかであろう。
本発明は、有効成分を多量に含む金銀花精製抽出物を調製するための方法を提供する。
本発明は、敗血症および敗血症性ショックを予防および治療するため、有効成分として有効な量の金銀花精製抽出物を含む薬学組成物を提供する。
本発明は、また、哺乳動物またはヒトにおける敗血症および敗血症性ショックを治療および予防するための薬学組成物を調製するための前記抽出物の用途を提供する。
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
以下の参考例、実施例および実験例は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明をより完全に説明するためのものである。
比較例1.従来の金銀花の粗抽出液の製造(SL−101)
金銀花の乾燥した花を10倍量の精製水に添加し、100℃で3時間、温水還流抽出法により抽出した。抽出液を濾過し、濾液を60℃未満で真空濃縮装置(EYELA N−1000、EYELA社製、日本)で濃縮した後、凍結乾燥機(FDCF−12012、Operon社製、韓国)で乾燥し、金銀花の乾燥粗抽出物を得た(収率:40.0%、以下、「SL−101」とする)。乾燥粉末を、比較試験試料として以下の実験にて用いた。
金銀花の乾燥した花を10倍量の精製水に添加し、100℃で3時間、温水還流抽出法により抽出した。抽出液を濾過し、濾液を60℃未満で真空濃縮装置(EYELA N−1000、EYELA社製、日本)で濃縮した後、凍結乾燥機(FDCF−12012、Operon社製、韓国)で乾燥し、金銀花の乾燥粗抽出物を得た(収率:40.0%、以下、「SL−101」とする)。乾燥粉末を、比較試験試料として以下の実験にて用いた。
実施例1.金銀花精製抽出物の製造(HS−23a、23b)
1−1.5倍量のHP−20樹脂使用(HS−23a)
金銀花の乾燥した花を10倍量の精製水に添加し、100℃で3時間、温水還流抽出法により抽出した。抽出液を濾過し、濾液を60℃未満で真空濃縮装置(EYELA N−1000、EYELA社製、日本)で濃縮した後、凍結乾燥機(FDCF−12012、Operon社製、韓国)で乾燥し、金銀花の乾燥粗抽出物を得た。得られた抽出物を1.5倍量の精製水(v/w、粗抽出物の重量基準)に懸濁した後、懸濁液を同量のエチルアセテートで三回分画してエチルアセテート可溶分画を除去し、1次精製抽出物を得た。そこに5倍量の精製水(w/w、1次精製抽出物の重量基準)を添加し、さらに同量のHP−2樹脂(三菱化学製)を添加して5時間撹拌し、精製水可溶物質を除去した。洗浄溶媒として10倍量の精製水および同量の30%メタノールを残りの分画に添加し、5時間撹拌して2次精製抽出物を得た。吸着した吸着物を60℃未満で真空濃縮装置(EYELA N−1000、EYELA社製、日本)で濃縮した後、凍結乾燥機(FDCF−12012、Operon社製、韓国)で乾燥し、金銀花精製抽出物を得た(最終収率:3.1%、以下、「HS−23a」とする)。乾燥粉末を、試験試料として以下の実験にて用いた。
1−1.5倍量のHP−20樹脂使用(HS−23a)
金銀花の乾燥した花を10倍量の精製水に添加し、100℃で3時間、温水還流抽出法により抽出した。抽出液を濾過し、濾液を60℃未満で真空濃縮装置(EYELA N−1000、EYELA社製、日本)で濃縮した後、凍結乾燥機(FDCF−12012、Operon社製、韓国)で乾燥し、金銀花の乾燥粗抽出物を得た。得られた抽出物を1.5倍量の精製水(v/w、粗抽出物の重量基準)に懸濁した後、懸濁液を同量のエチルアセテートで三回分画してエチルアセテート可溶分画を除去し、1次精製抽出物を得た。そこに5倍量の精製水(w/w、1次精製抽出物の重量基準)を添加し、さらに同量のHP−2樹脂(三菱化学製)を添加して5時間撹拌し、精製水可溶物質を除去した。洗浄溶媒として10倍量の精製水および同量の30%メタノールを残りの分画に添加し、5時間撹拌して2次精製抽出物を得た。吸着した吸着物を60℃未満で真空濃縮装置(EYELA N−1000、EYELA社製、日本)で濃縮した後、凍結乾燥機(FDCF−12012、Operon社製、韓国)で乾燥し、金銀花精製抽出物を得た(最終収率:3.1%、以下、「HS−23a」とする)。乾燥粉末を、試験試料として以下の実験にて用いた。
1−2.10倍量のHP−20樹脂(HS−23b)使用
HP−21樹脂の使用量を精製水の10倍量(w/w、1次精製抽出物の重量基準)にしたことを除いて、実施例1−1とすべて同じ精製工程によって金銀花精製抽出物を得た(最終収率:3.1%、以下、「HS−23b」とする)。乾燥粉末を、試験試料として以下の実験にて用いた。
HP−21樹脂の使用量を精製水の10倍量(w/w、1次精製抽出物の重量基準)にしたことを除いて、実施例1−1とすべて同じ精製工程によって金銀花精製抽出物を得た(最終収率:3.1%、以下、「HS−23b」とする)。乾燥粉末を、試験試料として以下の実験にて用いた。
実施例2.金銀花精製抽出物の製造(HS−23c)
金銀花の乾燥した花を10倍量の精製水に添加し、100℃で3時間、温水還流抽出法により抽出した。抽出液を濾過し、濾液を60℃未満で真空濃縮装置(EYELA N−1000、EYELA社製、日本)で濃縮した後、凍結乾燥機(FDCF−12012、Operon社製、韓国)で乾燥し、金銀花の乾燥粗抽出物を得た。得られた抽出物を1.5倍量の精製水(v/w、粗抽出物の重量基準)に懸濁した後、懸濁液を同量のエチルアセテートで三回分画してエチルアセテート可溶分画を除去し、1次精製抽出物を得た。そこに10倍量の精製水(w/w、1次精製抽出物の重量基準)を添加し、さらに同量のSP−850樹脂(三菱化学製)を添加して5時間撹拌し、精製水可溶物質を除去した。残りの精製水可溶物質を確認しながら、洗浄溶媒として10倍量の精製水を残りの分画に添加し、3倍量の10%メタノールを残りの画分に添加して5時間撹拌し、3倍量の20%メタノールを残りの樹脂に添加して同様の方法で濃縮および減圧乾燥した。30%メタノールを用いて洗浄工程を繰り返し、10%、20%および30%メタノールを用いた洗浄工程からの溶出液を回収した。回収された2次精製抽出物を60℃未満で真空濃縮装置(EYELA N−1000、EYELA社製、日本)で濃縮した後、濃縮物を3倍量の30%メタノールに溶解した。溶解液をセファデックスLH樹脂(GEヘルスケア社製、米国)を用いてさらに精製し、2.5kD M.W.未満を有するステロイド、テルペノイド、脂質、ポリフェノール、アルカロイド、アミノ酸などの残りの非有効成分を除去した。30%のメタノール溶媒を移動相として精製される残りの溶出液を60℃未満で真空濃縮装置(EYELA N−1000、EYELA社製、日本)で濃縮した後、凍結乾燥機(FDCF−12012、Operon社製、韓国)で乾燥し、金銀花精製抽出物を得た(最終収率:1.6%、以下、「HS−23c」とする)。乾燥粉末を、試験試料として以下の実験にて用いた。
金銀花の乾燥した花を10倍量の精製水に添加し、100℃で3時間、温水還流抽出法により抽出した。抽出液を濾過し、濾液を60℃未満で真空濃縮装置(EYELA N−1000、EYELA社製、日本)で濃縮した後、凍結乾燥機(FDCF−12012、Operon社製、韓国)で乾燥し、金銀花の乾燥粗抽出物を得た。得られた抽出物を1.5倍量の精製水(v/w、粗抽出物の重量基準)に懸濁した後、懸濁液を同量のエチルアセテートで三回分画してエチルアセテート可溶分画を除去し、1次精製抽出物を得た。そこに10倍量の精製水(w/w、1次精製抽出物の重量基準)を添加し、さらに同量のSP−850樹脂(三菱化学製)を添加して5時間撹拌し、精製水可溶物質を除去した。残りの精製水可溶物質を確認しながら、洗浄溶媒として10倍量の精製水を残りの分画に添加し、3倍量の10%メタノールを残りの画分に添加して5時間撹拌し、3倍量の20%メタノールを残りの樹脂に添加して同様の方法で濃縮および減圧乾燥した。30%メタノールを用いて洗浄工程を繰り返し、10%、20%および30%メタノールを用いた洗浄工程からの溶出液を回収した。回収された2次精製抽出物を60℃未満で真空濃縮装置(EYELA N−1000、EYELA社製、日本)で濃縮した後、濃縮物を3倍量の30%メタノールに溶解した。溶解液をセファデックスLH樹脂(GEヘルスケア社製、米国)を用いてさらに精製し、2.5kD M.W.未満を有するステロイド、テルペノイド、脂質、ポリフェノール、アルカロイド、アミノ酸などの残りの非有効成分を除去した。30%のメタノール溶媒を移動相として精製される残りの溶出液を60℃未満で真空濃縮装置(EYELA N−1000、EYELA社製、日本)で濃縮した後、凍結乾燥機(FDCF−12012、Operon社製、韓国)で乾燥し、金銀花精製抽出物を得た(最終収率:1.6%、以下、「HS−23c」とする)。乾燥粉末を、試験試料として以下の実験にて用いた。
実施例3.金銀花精製抽出物の製造(HS−23d)
金銀花の乾燥した花を10倍量の精製水に添加し、100℃で3時間、温水還流抽出法により抽出した。抽出液を濾過し、濾液を60℃未満で真空濃縮装置(EYELA N−1000、EYELA社製、日本)で濃縮した後、凍結乾燥機(FDCF−12012、Operon社製、韓国)で乾燥し、金銀花の乾燥粗抽出物を得た。得られた抽出物を1.5倍量の精製水(v/w、粗抽出物の重量基準)に懸濁した後、懸濁液を同量のエチルアセテートで三回分画してエチルアセテート可溶分画を除去し、1次精製抽出物を得た。そこに10倍量の精製水(w/w、1次精製抽出物の重量基準)を添加し、さらに同量のアンバーライトXAD−2樹脂(ローム・アンド・ハース社製、米国)を添加して5時間撹拌し、精製水可溶物質を除去した。洗浄溶媒として10倍量の精製水および同量の30%メタノールを残りの分画に添加し、5時間撹拌して2次精製抽出物を得た。吸着した吸着物を60℃未満で真空濃縮装置(EYELA N−1000、EYELA社製、日本)で濃縮した後、凍結乾燥機(FDCF−12012、Operon社製、韓国)で乾燥し、金銀花精製抽出物を得た(最終収率:2.8%、以下、「HS−23d」とする)。乾燥粉末を、試験試料として以下の実験にて用いた。
金銀花の乾燥した花を10倍量の精製水に添加し、100℃で3時間、温水還流抽出法により抽出した。抽出液を濾過し、濾液を60℃未満で真空濃縮装置(EYELA N−1000、EYELA社製、日本)で濃縮した後、凍結乾燥機(FDCF−12012、Operon社製、韓国)で乾燥し、金銀花の乾燥粗抽出物を得た。得られた抽出物を1.5倍量の精製水(v/w、粗抽出物の重量基準)に懸濁した後、懸濁液を同量のエチルアセテートで三回分画してエチルアセテート可溶分画を除去し、1次精製抽出物を得た。そこに10倍量の精製水(w/w、1次精製抽出物の重量基準)を添加し、さらに同量のアンバーライトXAD−2樹脂(ローム・アンド・ハース社製、米国)を添加して5時間撹拌し、精製水可溶物質を除去した。洗浄溶媒として10倍量の精製水および同量の30%メタノールを残りの分画に添加し、5時間撹拌して2次精製抽出物を得た。吸着した吸着物を60℃未満で真空濃縮装置(EYELA N−1000、EYELA社製、日本)で濃縮した後、凍結乾燥機(FDCF−12012、Operon社製、韓国)で乾燥し、金銀花精製抽出物を得た(最終収率:2.8%、以下、「HS−23d」とする)。乾燥粉末を、試験試料として以下の実験にて用いた。
実施例4.成分分析
比較例および実施例で製造した抽出物の成分を、表1に示された条件でHPLCで分析した。その結果を表2に示した。
比較例および実施例で製造した抽出物の成分を、表1に示された条件でHPLCで分析した。その結果を表2に示した。
1−1.試薬
CGA(クロロゲン酸>96%、アルドリッチC3878)、TFA(トリフルオロ酢酸、シグマアルドリッチ299537)、HP−20樹脂(三菱化学)、アセトニトリル(バーディック&ジャクソン、HPLC)、精製水(バーディック&ジャクソン、HPLC)、およびエチルアセテート(純正化学)を実験に使用した。
CGA(クロロゲン酸>96%、アルドリッチC3878)、TFA(トリフルオロ酢酸、シグマアルドリッチ299537)、HP−20樹脂(三菱化学)、アセトニトリル(バーディック&ジャクソン、HPLC)、精製水(バーディック&ジャクソン、HPLC)、およびエチルアセテート(純正化学)を実験に使用した。
1−2.試料の処理
比較例および実施例で調製した抽出物100mgを精製水70mlに溶解し、超音波抽出により抽出した。抽出物を濾過し、濾液に精製水を添加して100mlにした。成分パターンおよび有効成分の量を決定するため、各濾液の成分をHPLCで分析した。
比較例および実施例で調製した抽出物100mgを精製水70mlに溶解し、超音波抽出により抽出した。抽出物を濾過し、濾液に精製水を添加して100mlにした。成分パターンおよび有効成分の量を決定するため、各濾液の成分をHPLCで分析した。
1−3.結果
表2に示すように、従来の抽出方法(図1参照)によって製造したSL−101の抽出物と比較して、HS−23b精製抽出物中の3,5‐O‐カフェオイルキナ酸、メチル3,5‐ジ‐O‐カフェオイルキナ酸などのクロロゲン酸(CGA)及びその誘導体が、クロロゲン酸およびクロロゲン酸を含む総クロロゲン酸誘導体の収率に対してそれぞれ約5.8倍及び約5.2倍の収率と大幅に増加したことが確認された。
表2に示すように、従来の抽出方法(図1参照)によって製造したSL−101の抽出物と比較して、HS−23b精製抽出物中の3,5‐O‐カフェオイルキナ酸、メチル3,5‐ジ‐O‐カフェオイルキナ酸などのクロロゲン酸(CGA)及びその誘導体が、クロロゲン酸およびクロロゲン酸を含む総クロロゲン酸誘導体の収率に対してそれぞれ約5.8倍及び約5.2倍の収率と大幅に増加したことが確認された。
実験例1.重症敗血症CLPモデルにおける抗生剤との併用投与
重症敗血症CLPモデルにおける、実施例で製造した精製抽出物と抗生剤との併用投与の治療効果を測定するため、以下の文献に開示された方法を変形して実験を行った(非特許文献8)。
重症敗血症CLPモデルにおける、実施例で製造した精製抽出物と抗生剤との併用投与の治療効果を測定するため、以下の文献に開示された方法を変形して実験を行った(非特許文献8)。
マウス(ICRメス、23〜25g、8週齢、www.dhbiolink.com)に麻酔薬(塩酸ケタミン、100mg/kg、Yuhan PHARM社製)を腹腔内に注射し、CLP(Cecal ligation and puncture)を用いて敗血症を誘導した。腹腔の中央部を切開した後、盲腸を外部に出して回盲弁の末端を絹縫合糸(silk suture、医療用縫合糸1号&2号、www.lead-care.com)で結紮し、スレッドを用いて盲腸に2つの穴を穿孔して所定量の糞便を流出させた。糞便とともに盲腸を腹腔内に入れ、生理食塩水を皮下注射して敗血症を誘導した。実施例で製造したサンプル(HS−23b)を尾静脈に注射した。
特に、本実験例では、回盲弁末端の縫合位置を変更し、穿孔の回数を2以上にすることで、流出する糞便の量を増加させ、重症の敗血症CLPモデルを誘導した。
重症敗血症CLPモデルを誘導した直後及び24時間後にHS−23(40mg/kg)のみを投与した単独処置群の生存率、並びにHS−23(40mg/kg)と抗生剤(イミペネム、Cat.番号I0160、シグマアルドリッチ社製、25mg/kg)とを12時間毎に4日間投与した併用処置群の生存率を10日間測定した。10日後の最終的な生存率は、CLP処置群(8%)、イミペネムの単独処置群(33%)、およびHS−34とイミペネムとの併用処置群(50%)であって、従来の広範囲抗生剤の単独処置に比べてHS−34とイミペネムとの併用処置群の生存率が17%増加する効果を奏することが分かった(図2参照)。
生理食塩水及びPBS(リン酸緩衝生理食塩水)のみを投与したビヒクル処置群の場合、CLP後、1日目、2日目、3日目、及び4日目〜10日目の生存率がそれぞれ75%、33%、17%、及び8%であった。
イミペネム(25mg/kg)単独処置群では、CLP後、1日目、2日目、3日目、及び4日目〜10日目の生存率がそれぞれ83%、58%、50%、及び42%であった。
イミペネム(25mg/kg)とHS−34(40mg/kg)との併用処置群では、CLP後、1日目、2日目、3日目、及び4日目〜10日目の生存率がそれぞれ92%、75%、58%、及び50%であった。
実験例2.重症敗血症CLPモデルにおけるMODSに対する有効性の評価
重症敗血症CLPモデルにおける、実施例で製造した精製抽出物のMODSに対する治療効果を測定するため、以下の文献に開示された方法を変形して実験を行った(非特許文献9)。
重症敗血症CLPモデルにおける、実施例で製造した精製抽出物のMODSに対する治療効果を測定するため、以下の文献に開示された方法を変形して実験を行った(非特許文献9)。
肝臓、腎臓、心臓などの様々な臓器の機能損傷をH&E12染色法によって観察した。各臓器の機能を評価するためのそれぞれ指標のレベルとしては、肝機能にはALT(アラニンアミノトランスフェラーゼ)、腎臓機能にはBUN(血中尿素窒素)とCRE(クレアチニン)、心臓機能にはLDH(乳酸脱水素酵素)を自動化学分析装置(日立7600、東京、日本)で測定して用いた。
CLP後、1、3、6、12、24、および48時間に血液を採集して血清を分離した。ALT、BUN、CRE及びLDHのレベルを測定し、その結果を表3に示した。
表3に示したように、ALT、BUN、CREおよびLDHの増加が急激に低下し、これは重症敗血症CLPモデルにおけるMODSに対する実験サンプルの強力な阻害効果を意味する。
実験例3.LPS誘発炎症モデルにおける生存率と有効性の決定
LPS誘発炎症モデルにおける、実施例で製造した精製抽出物の生存率及び有効性を評価するため、以下の文献に開示された方法を変形して実験を行った(非特許文献10)。
LPS誘発炎症モデルにおける、実施例で製造した精製抽出物の生存率及び有効性を評価するため、以下の文献に開示された方法を変形して実験を行った(非特許文献10)。
マウス(C57BL/6、メス、8週齢、KRIBB)にLPS(Lipopolysaccharide;E.Coli 0111:B4 シグマアルドリッチ、L4130)を腹腔内注射し、注射後1〜8時間以内にHS−23を静脈内に注射してマウスの生存率を評価した。
LPS注射後1時間でHS−23を処置した群における生存率は、LPS注射後18時間で90%、21時間で80%、24〜72時間で70%であることが分かった(表4参照)。
LPS注射後、毎時間毎に血液を遠心分離して得た血清から、ELISA法により様々な炎症誘発因子の発現レベルを測定し、その結果を表5〜表8に示した。
時間毎に測定した結果、TNF‐αはLPS注射の1時間後、IL‐1βおよびIFN‐γは8時間後、HMGB−1は19時間後に発現レベルが最大レベルに達することがわかった。
マウスにHS−23抽出物を静脈内注射すると同時にLPSを腹腔内注射した後、TNF‐α、IL‐1βとIFN‐γ、およびHMGB‐1の炎症誘発因子のレベルのが最大レベルに達する時間をELISA法により測定した。
その結果、表9に示すように、HS−23処置群では炎症誘発因子の発現レベルの増加を強力に阻害していることが確認された。
実験例4.安定性テスト
実施例で調製した精製抽出物およびHS−23抽出物の凍結乾燥形態を含有する注射製剤の安定性を確認するため、韓国食品医薬品安全処の安定性ガイドラインに従って以下の実験を行った(www.kfda.go.kr)。
実施例で調製した精製抽出物およびHS−23抽出物の凍結乾燥形態を含有する注射製剤の安定性を確認するため、韓国食品医薬品安全処の安定性ガイドラインに従って以下の実験を行った(www.kfda.go.kr)。
4−1.試験方法
試験試料とHS−23抽出物の凍結乾燥形態を含有する注射製剤をもって、大韓薬典の規定及びガイドラインに従って2年間の冷蔵保管(5±3℃)条件で長期安定性テストを行った。
試験試料とHS−23抽出物の凍結乾燥形態を含有する注射製剤をもって、大韓薬典の規定及びガイドラインに従って2年間の冷蔵保管(5±3℃)条件で長期安定性テストを行った。
4−2.試験結果
表10および表11に示したように、金銀花の指標物質の量、すなわち、クロロゲン酸(CGA)の含量の変化が安定性試験期間中にほとんどなく、ガイドラインに適合するほど、試験試料が非常に薬学的に安定していることが確認された。
表10および表11に示したように、金銀花の指標物質の量、すなわち、クロロゲン酸(CGA)の含量の変化が安定性試験期間中にほとんどなく、ガイドラインに適合するほど、試験試料が非常に薬学的に安定していることが確認された。
実験例5.毒性テスト
実施例で調製した精製抽出物の毒性を確認するため、韓国食品医薬品安全処の毒性ガイドラインに従って以下の実験を行った(www.kfda.go.kr)。
実施例で調製した精製抽出物の毒性を確認するため、韓国食品医薬品安全処の毒性ガイドラインに従って以下の実験を行った(www.kfda.go.kr)。
げっ歯類/非げっ歯類の単回投与毒性試験、安全性薬理試験、遺伝毒性試験、4週反復投与毒性試験などを含むすべての毒性試験は、GLP認証機関で行った(www.biotoxtech.com)。
表12に示されたように、単回投与毒性試験における試験サンプルの致死量は500mg/kg以上であり、4週反復投与毒性試験におけるNOAEL値は75mg/kg以上であった。さらに、心血管系、呼吸器系、中枢神経系システムなどの安全性薬理試験においても、100mg/kg及び300mg/kg以上で安全であることが証明された。
したがって、本発明の精製抽出物は、安全且つ非毒性であることが証明された。
以下、賦形剤の処方方法および種類について説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。また、代表的な製剤例を以下に説明する。
粉剤の製造
HS−23b 20mgの乾燥粉末
乳糖 100mg
タルク 10mg
HS−23b 20mgの乾燥粉末
乳糖 100mg
タルク 10mg
上記の成分を混合し、密閉パッケージに充填して粉末を製造した。
錠剤の製造
HS−23a 10mgの乾燥粉末
コーンスターチ 100mg
乳糖 100mg
ステアリン酸マグネシウム 2mg
HS−23a 10mgの乾燥粉末
コーンスターチ 100mg
乳糖 100mg
ステアリン酸マグネシウム 2mg
上記の成分を混合し、打錠して錠剤を製造した。
カプセル剤の製造
HS−23c 10mgの乾燥粉末
コーンスターチ 100mg
乳糖 100mg
ステアリン酸マグネシウム 2mg
HS−23c 10mgの乾燥粉末
コーンスターチ 100mg
乳糖 100mg
ステアリン酸マグネシウム 2mg
上記の成分を混合し、従来のゼラチン製造法によりゼラチンカプセルに充填することによりカプセル剤を製造した。
注射剤の製造
HS−23d 10mgの乾燥粉末
マンニトール 180mg
注射用蒸留水 2974mg
pH調整剤(Na2HPO412H2O) 適量
HS−23d 10mgの乾燥粉末
マンニトール 180mg
注射用蒸留水 2974mg
pH調整剤(Na2HPO412H2O) 適量
有効成分を溶解してpHを約7.5に制御した後、全成分を2mlアンプルに充填し、従来の注射剤製造方法によって滅菌して注射剤を製造した。
液剤の製造
HS−23b 20mgの乾燥粉末
異性化糖 10g
マンニトール 5g
蒸留水 適量
HS−23b 20mgの乾燥粉末
異性化糖 10g
マンニトール 5g
蒸留水 適量
適量のレモン香とともに上記の成分を蒸留水に溶解して混合し、褐色瓶に蒸留水で100mlに調整した後、従来の水薬製造方法によって滅菌して液剤を製造した。
健康機能性食品の製造
HS−23a 1000mgの乾燥粉末
ビタミン混合物 適量
ビタミンAアセテート 70μg
ビタミンE 1.0mg
ビタミンB1 0.13mg
ビタミンB2 0.15mg
ビタミンB6 0.5mg
ビタミンB12 0.2μg
ビタミンC 10mg
ビオチン 10μg
ニコチン酸アミド 1.7mg
葉酸 50μg
パントテン酸カルシウム 0.5mg
ミネラル混合物 適量
硫酸第一鉄 1.75mg
酸化亜鉛 0.82mg
炭酸マグネシウム 25.3mg
リン酸一カリウム 15mg
リン酸二カルシウム 55mg
クエン酸カリウム 100mg
塩化マグネシウム 24.8mg
HS−23a 1000mgの乾燥粉末
ビタミン混合物 適量
ビタミンAアセテート 70μg
ビタミンE 1.0mg
ビタミンB1 0.13mg
ビタミンB2 0.15mg
ビタミンB6 0.5mg
ビタミンB12 0.2μg
ビタミンC 10mg
ビオチン 10μg
ニコチン酸アミド 1.7mg
葉酸 50μg
パントテン酸カルシウム 0.5mg
ミネラル混合物 適量
硫酸第一鉄 1.75mg
酸化亜鉛 0.82mg
炭酸マグネシウム 25.3mg
リン酸一カリウム 15mg
リン酸二カルシウム 55mg
クエン酸カリウム 100mg
塩化マグネシウム 24.8mg
上述したビタミンおよびミネラル混合物は多様に変更することができ、このような変更が本発明の要旨および範囲から逸脱するものとして解釈されてはならない。
健康飲料の製造
HS−23c 100mgの乾燥粉末
クエン酸 1000mg
オリゴ糖 100g
濃縮アンズ 2g
タウリン 1g
蒸留水 900ml
HS−23c 100mgの乾燥粉末
クエン酸 1000mg
オリゴ糖 100g
濃縮アンズ 2g
タウリン 1g
蒸留水 900ml
有効成分を溶解して混合し、85℃で1時間撹拌した後、濾過し、次いで2lの容器に全成分を充填し、従来の健康飲料製造方法によって滅菌して健康飲料を製造した。
以上のように説明された本発明は多様に変更することができ、このような変更が本発明の要旨および範囲から逸脱するものとして見なされてはならない。また、全ての変更が本発明の特許請求範囲の範囲内に含まれることは当業者にとって自明であるだろう。
本発明による、金銀花精製抽出物は、重症敗血症CLPモデルテスト、MODSへの影響、および、TNF‐α、IL‐1β、IFN‐γ、HMGB‐1などの様々な炎症性サイトカインの抑制効果において強力な抗敗血症活性を見せるだけでなく、当業界の広範囲抗生剤のような市販の抗敗血症剤とともに使用したとき、敗血症及び敗血症性ショックの治療に予想外の相乗効果を見せた。したがって、本発明は、薬剤及び健康機能性食品として敗血症および敗血症性ショックの治療および予防において有用に使用することができる。
Claims (27)
- 乾燥状態の金銀花試料を抽出溶媒で抽出する第1段階;
抽出された抽出物を濾過法、遠心分離法またはこれらの組合せの少なくとも1つの方法で処理して金銀花の粗抽出物を得る第2段階;
前記粗抽出物に精製水を加えて懸濁溶液を製造した後、前記懸濁溶液を非極性溶媒可溶分画と極性溶媒可溶分画とに分画して非極性溶媒可溶物質を除去し、残渣を回収して1次精製抽出物を得る第3段階;
前記1次精製抽出物に精製水を入れ、前記精製水と同一重量の吸着性樹脂を用いた吸着クロマトグラフィー、イオンカラムクロマトグラフィーまたはこれらの組合せの少なくとも1つの精製工程を行った後、洗浄溶媒で数回洗浄して2次精製抽出物を得る第4段階;および、
前記2次精製抽出物を真空濃縮及び乾燥して多量の有効成分を含む金銀花精製抽出物を得る第5段階、を含むことを特徴とする金銀花精製抽出物の製造方法。 - 前記第1段階の抽出溶媒が、金銀花試料重量(v/w)を基準に1〜100倍体積の精製水、酒精、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ヘキサン、エチルアセテート、シクロヘキサン、ジメチルスルホキシド(DMSO)、クロロホルム、及びメチレンクロライドからなる群より選択された少なくとも一つの溶媒を含むことを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- 前記第1段階の抽出溶媒が、抽出効率を高めるため、金銀花試料重量(w/w)を基準に0.1〜5重量%のNaHCO3、NaCO3のような弱塩基を精製水に溶解した1〜100倍体積の塩基性溶液を含むことを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- 前記第1段階の抽出工程が、温水還流抽出、冷浸抽出、ソックスレー抽出、超音波抽出、またはこれらの組合せから選択される抽出方法で行われることを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- 前記第2段階で金銀花の粗抽出物を得る処理が、濾過法、遠心分離法またはこれらの組合せの少なくとも1つで行われることを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- 前記第3段階で1次精製抽出物を得る工程が、約0.005〜5倍体積の精製水(v/w、粗抽出物の重量基準)を加えて懸濁溶液を製造した後、ヘキサン、メチレンクロライド、クロロホルム、エチルアセテートのような非極性溶媒を約0.1〜50倍体積(v/v、懸濁溶液の体積基準)で添加し、前記溶液を非極性溶媒可溶分画と極性溶媒可溶分画とに分画して非極性可溶物質を除去することを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- 前記第4段階で金銀花の2次精製抽出物を得る工程が、前記1次精製抽出物に約1〜30倍量の精製水(w/w、1次精製抽出物の重量基準)を入れ、SP207、HP20SS、ダイヤイオンHP20、SP−850レジン、活性炭またはアンバーライトXAD‐2,4の少なくとも1つの樹脂、及び前記精製水と同一重量の吸着性樹脂を用いた吸着クロマトグラフィーにより追加的な精製を行うことを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- 前記第4段階で金銀花の2次精製抽出物を得る工程が、AG50W−x8、アンバーライトIR−120、アンバーライトIRA−400、ダウエックス50W−x8又はSK1Bから選択される強酸性樹脂の少なくとも1つ;アンバーライトIRC−50、バイオ−レックス70、デュオライト−436またはWK40から選択される弱酸性樹脂の少なくとも1つ;若しくは、アンバーライトIR−67又はダウエックス3−x4から選択される弱塩基性樹脂の少なくとも1つ;望ましくはアンバーライトIR−120、アンバーライトIRA−400又はSK1Bから選択される強酸性樹脂の少なくとも1つ、及び前記精製水と同一重量のイオン性樹脂を用いたイオンカラムクロマトグラフィーを行うことを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- 前記第4段階で金銀花の2次精製抽出物を得る洗浄工程が、精製水、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール又はこれらの混合溶媒から選択された少なくとも1つの洗浄溶媒で樹脂吸着物を洗浄することで行われることを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- 前記第4段階で金銀花の2次精製抽出物を得る洗浄工程が、第4段階の精製工程の外に、セファデックスLH−20レジン、セファデックスG15レジン又はセファデックスG35から選択された少なくとも1つのセファデックスレジンを使用したセファデックスカラムクロマトグラフィーをさらに行うことを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- 前記第5段階で金銀花精製抽出物を得る真空濃縮及び乾燥工程が、前記抽出物を真空下、10℃〜80℃の温度範囲で濃縮した後、常温乾燥法、凍結乾燥法、熱風乾燥法又はこれらの組合せのいずれか1つの乾燥方法で乾燥して金銀花精製抽出物を製造することを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- 敗血症、MODS又は敗血症性ショックを治療および予防するための、
乾燥精製抽出物の重量を基準にクロロゲン酸及びその誘導体を2.0〜30.0%(w/w)で含み、乾燥状態の金銀花試料を抽出溶媒で抽出する第1段階;
抽出された抽出物を濾過法、遠心分離法またはこれらの組合せの少なくとも1つの方法で処理して金銀花の粗抽出物を得る第2段階;
前記粗抽出物に精製水を加えて懸濁溶液を製造した後、前記懸濁溶液を非極性溶媒可溶分画と極性溶媒可溶分画とに分画して非極性溶媒可溶物質を除去し、残渣を回収して1次精製抽出物を得る第3段階;
前記1次精製抽出物に精製水を入れ、前記精製水と同一重量の吸着性樹脂を用いた吸着クロマトグラフィー、イオンカラムクロマトグラフィーまたはこれらの組合せの少なくとも1つの精製工程を行った後、洗浄溶媒で数回洗浄して2次精製抽出物を得る第4段階;および、
前記2次精製抽出物を真空濃縮及び乾燥して多量の有効成分を含む金銀花精製抽出物を得る第5段階で製造される、金銀花の精製HS−23抽出物。 - 請求項1に記載された製造方法により得られた金銀花の精製HS−23抽出物を有効成分として含む、敗血症、MODS又は敗血症性ショックの治療および予防用薬学組成物。
- 前記敗血症が、軽度の敗血症、重症敗血症、火傷による感染症または敗血症、急性咽頭喉頭炎、潰瘍性大腸炎、IBS(過敏性腸症候群)、リウマチ性関節炎、退行性関節炎、急性肝炎、慢性肝炎であることを特徴とする請求項13に記載の薬学組成物。
- 前記MODSが、軽度の敗血症、重症敗血症、または火傷による感染症または敗血症に起因する肝臓、腎臓、心臓、肺、小腸、大腸、十二指腸、胃、膵臓、脾臓から選択される損傷した臓器で発生することを特徴とする請求項13に記載の薬学組成物。
- 前記敗血症性ショックが、軽度の敗血症、重症敗血症、火傷による感染症または敗血症によって引き起こされる敗血症性ショックであることを特徴とする請求項13に記載の薬学組成物。
- 請求項1に記載された製造方法により得られた金銀花の精製HS−23抽出物と市販の抗敗血症剤との組合せを有効成分として含む、敗血症、MODS又は敗血症性ショックの治療および予防用薬学組成物。
- 前記組合せが、(a)請求項1に記載された製造方法により精製された金銀花の精製HS−23抽出物と(b)市販の抗敗血症剤とが0.1〜10:0.1〜10(w/w)の混合比で混合されたものであることを特徴とする請求項17に記載の薬学組成物。
- 前記市販の抗敗血症剤が、ペニシリン系、キノロン系、モノバクタム系、アミノグリコシド系、セファロスポリン系、テトラサイクリン系、グリコペプチド系、カルバペネム系などの抗生剤;メフェナム酸、インドメタシン、イブプロフェン、ピロキシカム、ジクロフェナクなどの抗炎症剤;アムホテリシンB、ナイスタチン、グリセオフルビン、アゾール系などの抗真菌剤;及びセチリジン、フェキソフェナジン、クロルフェニラミンなど抗アレルギー剤からなる群より選択された抗敗血症剤の少なくとも1つであることを特徴とする請求項17に記載の薬学組成物。
- 請求項1に記載された製造方法により精製された金銀花の精製HS−23抽出物を有効成分として含む、敗血症、MODS又は敗血症性ショックの緩和又は予防用健康機能性食品。
- 請求項1に記載された製造方法により得られた金銀花の精製HS−23抽出物と市販の抗敗血症剤との組合せを有効成分として含む、敗血症、MODS又は敗血症性ショックの緩和又は予防用健康機能性食品。
- 食品学的に許容可能な添加剤とともに、請求項1に記載された製造方法により精製された金銀花の精製HS−23抽出物を含む、敗血症、MODS又は敗血症性ショックの緩和又は予防用ヘルスケア食品。
- 食品学的に許容可能な添加剤とともに、請求項1に記載された製造方法により精製された金銀花の精製HS−23抽出物と市販の抗敗血症剤との組合せを含む、敗血症、MODS又は敗血症性ショックの緩和又は予防用ヘルスケア食品。
- ヒトを含む哺乳動物における敗血症、MODS又は敗血症性ショックの治療および予防用治療剤を製造するための、請求項1に記載された製造方法により精製された金銀花の精製HS−23抽出物の用途。
- ヒトを含む哺乳動物における敗血症、MODS又は敗血症性ショックの治療および予防用治療剤を製造するための、請求項1に記載された製造方法により精製された金銀花の精製HS−23抽出物と市販の抗敗血症剤との組合せの用途。
- 請求項1に記載された製造方法により精製された金銀花の精製HS−23抽出物の有効量を薬学的に受容可能な担体とともに投与することを含む、ヒトを含む哺乳動物における敗血症、敗血症性ショック又はMODSを治療または予防する方法。
- 請求項1に記載された製造方法により精製された金銀花の精製HS−23抽出物と市販の抗敗血症剤との組合せの有効量を薬学的に受容可能な担体とともに投与することを含む、ヒトを含む哺乳動物における敗血症、敗血症性ショック又はMODSを治療または予防する方法。
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