JP2015508892A - 慢性ｂ型肝炎患者の応答予測及び治療観察のためのｂ型肝炎ウイルス免疫複合体 - Google Patents

Abstract

本発明は、インターフェロン療法に対して感受性があるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染している対象を同定する方法であって、ａ）上記対象の試料中のＨＢＶ免疫複合体の量を測定する工程、ｂ）工程ａ）で得られたＨＢＶ免疫複合体の量を基準値と比較する工程、及びｃ）工程ｂ）で実施された比較の結果に基づき、インターフェロン療法に対して感受性があるＨＢＶに感染している対象を同定する工程を含む方法に関する。本発明は、更にインターフェロン療法に対して感受性があるＨＢＶに感染している対象由来の試料中のＨＢＶ免疫複合体量の測定、及びＨＢＶに感染している対象を同定するためのＨＢＶ免疫複合体の検出試薬の使用に関する。更に、本発明は、インターフェロン療法に対して感受性があるＨＢＶに感染している対象の同定を可能にする装置及びキットに関する。【選択図】なし

Description

本発明は診断の分野に関する。具体的には、本発明は、インターフェロン療法に対して感受性があるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染している対象の同定法であって、ａ）上記対象の試料中のＨＢＶ免疫複合体の量を測定する工程、ｂ）工程ａ）で得られたＨＢＶ免疫複合体の量を基準値と比較する工程、及びｃ）工程ｂ）で実施された比較の結果に基づき、インターフェロン療法に対して感受性があるＨＢＶに感染している対象を同定する工程を含む方法に関する。本発明は、更にＨＢＶに感染している対象由来の試料中のＨＢＶ免疫複合体の量の測定法の使用、及びインターフェロン療法に対して感受性があるＨＢＶに感染している対象を同定するためのＨＢＶ免疫複合体の検出試薬の使用に関する。更に、本発明は、インターフェロン療法に対して感受性があるＨＢＶに感染している対象の同定を可能にする装置及びキットに関する。

Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に起因する肝臓の感染性炎症疾患である。ウイルスは体液との接触により感染し、輸血、透析、薬物常用者による注射針の常用、及び周産期感染症による感染が主要な感染形態である。

急性Ｂ型肝炎ウイルス感染は、肝臓の炎症、嘔吐、及び黄疸を特徴とする。典型的には、症状は数週間持続し、その後免疫系により感染が治るとともに、徐々に好転する。完全な回復、及び防御免疫の確立は年齢と共に増加する。５％の成人が数週間を超えて持続する持続的な感染、すなわち慢性ＨＢＶ感染を患うだけであるが、この割合は幼児では７０％まで、また周産期に感染した新生児では９５％まで上昇する。

慢性ＨＢＶは肝硬変及び肝臓癌の発症の深刻な危険因子と関連しており、それが、ＷＨＯの国際がん研究機関（ＩＡＲＣ）によりＨＢＶが発がん性クラス１、すなわちヒトに対する発がん物質として分類されている理由である。したがって、患者の免疫系によって感染の治癒を可能にする治療を受けることは、患者にとって最も重要である。典型的な治療計画には、インターフェロンアルファと共に、ウイルスＤＮＡポリメラーゼを阻害するヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が含まれる。重要な改善は、インターフェロンの半減期を長くするペグインターフェロン（例えば、Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標））を治療に導入することであった。ＨＢＶ感染の疫学及び治療の総説については、J.L. Dienstag N Engl J Med 2008, 359; 1486-1500を参照されたい。

一方では、高力価の抗−ＨＢＶ抗体は疾患の重症度と直接相関するが、他方では、自然発生的なセロコンバージョン（すなわち、血清からＨＢＶｅ抗原を排除）の何年も前に、患者には抗−ＨＢＶｅ抗原抗体が存在することがわかっていたので、慢性ＨＢＶ感染の血清学は複雑である（Maruyamaら(1993), J. Clin. Invest. 91, 2586-2595）。治療法が改善されたにもかかわらず、治療により一部の患者のみで感染症が治癒するが、他の患者では治癒しない。患者の第二のグループ、すなわち無反応者のグループのメンバーは、例えば、用量の増加、治療の延長、又は追加の医薬のようなより積極的な治療法により、感染症を治癒すことができる場合がある。したがって、できる限り最初から治療を正しく調節するために、標準的なインターフェロン療法に対する患者の反応を予測することができることが望ましい。最近の改善で、治療の１２週後の患者試料中のＨＢＶ可溶性抗原（ＨＢｓＡｇ）の変化の定量値が治療結果を予測するための境界値として使用できることがわかった。しかし、境界値は、主にアジア太平洋地域の患者における事例である、ＨＢＶｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）も陽性の患者についてのみ有効である。例えば、欧州では大多数であるＨＢｅＡｇ陰性患者では、境界値を規定することは、より困難であり、治療開始から１２週の間の少なくとも１０％の減少を一時しのぎの境界値として使用する。

近年、ＨＢｅＡｇ陽性患者において、治療開始前のＨＢｓＡＧ及び抗−ＨＢｓＡｇ−ＩｇＧを含む大量のＨＢＶ複合体が、標準的なインターフェロン療法に対する良好な反応と相関を有していることが報告された。しかし、ＨＢｅＡｇ陰性患者については、これで予測することはできない。いずれにしても、現在のところ、患者のＨＢｅＡｇの状態にかかわらず、全ての患者群に対して治療開始前に治療結果を予測できる有効な方法は存在しない。

したがって、本発明の基礎をなす技術的課題は、上記要求に応じる手段及び方法を提供することとみなすことができる。上記技術的課題は、請求の範囲及び以下に特徴づけられる態様により解決される。

したがって、本発明は、インターフェロン療法に対して感受性があるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染している対象の同定法であって、
ａ）上記対象の試料中のＨＢＶ免疫複合体の量を測定する工程、
ｂ）工程ａ）で得られたＨＢＶ免疫複合体の量を基準値と比較する工程、及び
ｃ）工程ｂ）で実施された比較の結果に基づき、インターフェロン療法に対して感受性があるＨＢＶに感染している対象を同定する工程を含む方法に関する。

本発明の方法は、好ましくはインビトロでの方法である。更に、本発明は、上記に明記した工程に加え、更なる工程を含んでもよい。例えば、更なる工程は、工程ａ）の試料の前処理、又は前記方法により得られた結果の評価等に関する。更に、試料の品質管理、又は性能管理等の内部管理を使用してもよい。前記方法は、手作業で実施してもよく、又は自動化によって補助してもよい。好ましくは、工程（ａ）から（ｃ）は、例えば、工程（ａ）におけるＨＢＶ免疫複合体の測定のための適切なロボット及びセンサー設備等により、全体として又は部分的に自動化により補助してもよい。

本明細書で用いられる場合、「同定」という用語は、対象を、インターフェロン療法に対して感受性がある対象群（いわゆる「応答者」）、又はインターフェロン療法に対して感受性のない対象群（いわゆる「非応答者」）に割り振ることを意味する。当業者に理解されるように、前記同定は、通常、分析する対象の１００％に対して正確であることを意図していない。しかし、前記用語は、評価が分析する対象の統計的にかなりの部分に対して有効であることを必要とする。一部が統計的に有意であるかどうかは、様々な周知の統計的評価手段、例えば信頼区間の決定、ｐ値の決定、スチューデントのｔ−検定、マン−ホイットニー検定などを用いて、当業者であれば苦もなく決定することができる。詳細は、Dowdy及びWearden,Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％である。ｐ値は、好ましくは、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、又は０．０００１である。好ましくは、本発明により予測される可能性により、この区別が所与の群又は集団の対象の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％に対して正確であることである。

好ましくは、本発明の方法による同定は、対象のＨＢＶｅ抗原の状態に関する知識がない状況で実施することができる。すなわち、同定によって、調査する対象のＨＢｅＡｇの状態にかかわらず、対象をインターフェロン療法に対して感受性がある対象群又はインターフェロン療法に対して感受性のない対象群へ正しく割り当てることができる。したがって、前記方法は、血清試料中に検出可能な量のＨＢｅＡｇを含む対象だけでなく、血清試料中に検出可能な量のＨＢｅＡｇを含まない対象に対しても適用することができる。

「Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）」という用語は、Ｂ型肝炎の原因病原体である、ヘパドナウイルス科由来のウイルス種を意味する。ＨＢＶウイルス粒子は、外膜（脂質エンベロープとも呼ばれる）、正２０面体のヌクレオカプシド、及びＤＮＡゲノムから構成される。ＨＢＶは当該技術分野で周知であり、その特性が明らかにされている。

「Ｂ型肝炎ウイルス感染」又は「ＨＢＶ感染」という用語は、対象におけるＨＢＶの検出可能な存在に関する。好ましくは、ＨＢＶの存在は、対象由来の試料中の少なくとも１種のウイルスポリペプチドの検出により診断され、更に好ましくはウイルス抗原ＨＢｓ（ＨＢｓＡｇ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：AAL66340.1 GI:18252577、配列番号１）、ＨＢｃ（ＨＢｃＡｇ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：CAA51257.1 GI:288930、配列番号：２）、及びＨＢｅ（ＨＢｅＡｇ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：AAM96930.1 GI:22530876、配列番号：３）の少なくとも１種が検出される。当業者は、ＨＢＶポリペプチドを特定のポリペプチドではなく、バイオマーカーと呼び、ＨＢＶという用語は、前記ＨＢＶポリペプチドの配列変異体を含み得る様々な株のＨＢＶを包含するものと理解する。したがって、Ｇｅｎｂａｎｋの受入番号で寄託されている特定の配列を有する前記ポリペプチドは、バイオマーカーを示す例示的な配列として理解されるべきである。前記で議論したＨＢＶ感染に対するバイオマーカーとして適切である限り、特定の配列を有するポリペプチドからの少なくとも１個のアミノ酸付加、置換及び／又は欠失により変化した変異ペプチドも本発明に包含される。好ましくは、変異ポリペプチドは、特定のポリペプチドに対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である。本明細書で用いる場合、「同一」という用語は、最も高い一致が得られるように配列を並べた、２個の核酸配列又はアミノ酸配列間の同一アミノ酸の数を決定することにより特徴づけられる配列同一性を意味する。同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ又はＦＡＳＴＡ(Altschul 1990, J Mol Biol 215,403)のようなコンピュータプログラム中で体系化された、公開された技術又は方法を用いて計算することができる。一側面において、同一の割合の値は全体のアミノ酸配列にわたって算出される。異なる配列を比較するために、様々なアルゴリズムに基づく一連のプログラムが当業者に利用される。これに関連し、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、又はＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムにより、特に信頼できる結果が得られる。配列アラインメントを実施するために、ＰｉｌｅＵｐプログラム（Higgins 1989, CABIOS 5, 151）、又はＧａｐ及びＢｅｓｔＦｉｔプログラム（Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482）を使用することができるが、これらはＧＣＧソフトウェアパケット（Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711）の一部である。本発明の他の側面では、前記配列同一性の値（パーセント（％））は配列領域全体にわたって下記の設定でＧＡＰプログラムを用いて決定されるが、この設定は、特に規定しない限り、配列アラインメントの標準設定として常に使用されるものとする：ギャップ重み付け：５０，長さ重み付け：３，平均一致度：１０．０００、及び平均不一致度：０．０００。

また、好ましくは、ＨＢＶの存在は、対象由来の試料中に少なくとも１種のウイルスポリヌクレオチド、好ましくはウイルスＤＮＡを検出することにより検出される。ウイルスポリヌクレオチド又は全体のＨＢＶの全ゲノムのヌクレオチド配列は当該技術分野で周知である。好ましくは、ＨＢＶのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００３９７７．１で寄託されているものである。当業者はＨＢＶポリヌクレオチドを特定のポリヌクレオチドではなく、バイオマーカーと呼び、ＨＢＶという用語は、変異ヌクレオチド配列を含む様々な株のＨＢＶを包含するものと理解する。したがって、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号で寄託されている特定の配列を有する前記ポリペプチドは、バイオマーカーを表わす例示的配列と理解すべきである。前記で議論したＨＢＶ感染に対するバイオマーカーとして適切である限り、特定の配列を有するポリヌクレオチドからの少なくとも１個のヌクレオチドの付加、置換及び／又は欠失により変化した変異ポリヌクレオチドも本発明に包含される。好ましくは、変異ポリヌクレオチドは、特定のポリヌクレオチドに対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である。同一性は、アミノ酸配列について本明細書の他の場所で示したように算出することができる。

好ましくは、本明細書に記載されるＨＢＶ感染は慢性ＨＢＶ感染であり、前記慢性ＨＢＶ感染は、好ましくは４週を超え、５週を超え、６週を超え、７週を超え、８週を超え、９週を超え、１０週を超え、１１週を超え、又は１２週を超え、対象中で検出することが可能なＨＢＶの存在により特徴づけられる。更に好ましくは、本明細書に記載される慢性ＨＢＶ感染はアメリカ疾病予防管理センター（ＣＤＣ）により公開された定義に従い、これに従えば、慢性ＨＢＶ感染は以下の実験室基準により特徴づけられる：Ｂ型肝炎コア抗原に対するＩｇＭ抗体（ＩｇＭ抗ＨＢｃ）陰性、かつ、以下の検査の１つにおいて陽性：Ｂ型肝炎表層抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）、若しくはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡ、又は少なくとも６ヶ月違いで２回のＨＢｓＡｇ陽性若しくはＨＢＶのＤＮＡ陽性反応を示すこと（６ヶ月違いで実施されたこれらの検査のどのような組み合わせも受け入れることができる）。

「インターフェロン療法」及び「標準的療法」という用語は、好ましくは、インターフェロンと、好ましくはウイルスＤＮＡポリメラーゼ阻害剤を用いたＨＢＶ感染の治療に関する。しかし、本発明により、インターフェロン療法は好ましくはインターフェロンを用いた単剤治療であり、標準的療法は好ましくはウイルスＤＮＡポリメラーゼ阻害剤を用いた単剤治療であるとも考えられる。好ましくは、これに関して言及されるインターフェロンはポリエチレングリコールと共有結合したインターフェロン（ＰＥＧ−インターフェロン）であり、より好ましくは、インターフェロンはインターフェロン２アルファであり、最も好ましくは、インターフェロンはポチエチレングリコールと共有結合したインターフェロン２アルファ（ＰＥＧ−インターフェロン２アルファ、ＰＥＧａｓｙｓ（登録商標）として市販されている）である。好ましくは、ウイルスＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は、ヌクレオチド又はヌクレオシド類似体であり、より好ましくは｛［２−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）エトキシ］メチル｝ホスホン酸（例えばアデフォビル（登録商標））である。したがって、標準的又はインターフェロン療法は、好ましくはインターフェロン２アルファとヌクレオチド類似体を用いた療法である。より好ましくは、標準的又はインターフェロン療法はＰＥＧ−インターフェロン２アルファとヌクレオチド類似体を用いた療法であり、更により好ましくは、標準的インターフェロン療法は、ＰＥＧ−インターフェロン２アルファ（例えば、ＰＥＧａｓｙｓ（登録商標））及びアデフォビル（登録商標）を１年未満用いる療法である。最も好ましくは、標準的インターフェロン療法は、以下の治療計画に従い、ＰＥＧ−インターフェロン２アルファ、例えばＰＥＧａｓｙｓ（登録商標）とアデフォビル（登録商標）を用いた療法である：通常、皮下投与（週に１回の皮下注射）によるＰＥＧａｓｙｓ（登録商標）療法を４８週の期間実施し、一方で、ウイルスＤＮＡポリメラーゼ阻害剤（ヌクレオシド／ヌクレオチド類似体）をより長い期間、すなわち１年を超えて８０％の患者に経口投与する。詳細については、J.L. Dienstag N Engl J Med 2008, 359; 1486-1500も参照されたい。

「インターフェロン療法に感受性がある」という用語は、対象が治療に成功するか、または治療に成功した患者数と比較し有意に増大した尤度で少なくとも治療に成功することを意味する。本明細書で述べるインターフェロン療法により治療に成功する可能性がある対象は、応答者とも呼ばれる。ＨＢＶ感染が、それと関連する少なくとも１つの症状、又はそれに併発する少なくとも１つの合併症がかなりの程度まで改善され、及び／又は治癒される場合、本明細書で述べる療法は成功といえる。好ましくは、治療の成功は、本明細書で上述した対象由来の試料中の検出可能なＨＢＶポリペプチド及び／又はＨＢＶポリヌクレオチドの減少をも伴う。より好ましくは、治療の成功は、治療開始後、６０〜８０週、好ましくは６５〜７５週、又は最も好ましくは７２週と決定された治療期間の、最大１年、最大５０週、最大４９週、又は最大４８週後に、対象由来の試料中に検出可能な量のＨＢｓＡＧ及び／又はＨＢｅＡＧが存在しないことを特徴とする。

インターフェロン療法による治療に成功しない対象は非応答者とも呼ばれる。このような対象では、ＨＢＶ感染、ＨＢＶ感染に関連づけられる少なくとも１つの症状又は少なくとも１つの合併症は改善も治癒もしない。好ましくは、このような非応答対象は、インターフェロン療法の前後でＨＢｓＡＧが検出可能であるがＨＢｅＡＧは検出されないか、又は標準的なインターフェロン療法の前後でＨＢｓＡＧ及びＨＢｅＡＧが検出可能である、重症の慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染を患う。インターフェロン療法に感受性がないと同定された対象は、インターフェロン及び／若しくはポリメラーゼ阻害剤の用量の増加、並びに／又は治療期間の延長、並びに／又は追加の投薬のような治療方法の改善について考慮すべきである。

本明細書で用いられる場合、「ＨＢＶ免疫複合体」という用語は、少なくとも１つのＨＢＶポリペプチドと、後述するような少なくとも１つのＨＢＶポリペプチドに対して指向する少なくとも１つの免疫グロブリン、すなわち抗ＨＢＶ免疫グロブリンとの間に形成された複合体に関する。好ましくは、前記複合体は、少なくとも１つのＨＢＶポリペプチドと、前記少なくとも１つのＨＢＶポリペプチドに対して指向する１より多い、２より多い、３より多い、４より多い、５より多い、１０より多い、２０より多い、５０より多い、又は１００より多い抗ＨＢＶ免疫グロブリン分子との間に形成される。好ましくは、前記ＨＢＶポリペプチドは、上記の本明細書で関連するＨＢＶ抗原のリストから選択され、より好ましくは、ＨＢＶポリペプチドはＨＢｓＡＧである。抗ＨＢＶ免疫グロブリンは、好ましくは対象の少なくとも１種の体液、好ましくは血液又は血清中に存在する可溶性免疫グロブリンである。好ましくは、抗ＨＢＶ免疫グロブリンはＩｇＧであり、より好ましくは血清ＩｇＧである。最も好ましくは、ＨＢＶ免疫複合体中に含まれる抗ＨＢＶ免疫グロブリンは、ＨＢｓＡｇに対して指向するＩｇＧ、すなわち抗ＨＢｓＡｇ−ＩｇＧである。当然のことだが、ＨＢＶ免疫複合体は、本明細書において明示的に詳述したもの以外の分子を含み得るが、好ましくは、本発明の抗ＨＢＶ免疫グロブリンとＨＢＶポリペプチドは、ＨＢＶ免疫複合体の実質的な部分を形成する。したがって、抗ＨＢＶ免疫グロブリン及びＨＢＶポリペプチドは、好ましくはＨＢＶ免疫複合体の質量の少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％を構成する。より好ましくは、ＨＢＶ免疫複合体は本質的に抗ＨＢＶ免疫グロブリン及びＨＢＶポリペプチドから構成され、すなわち、抗ＨＢＶ免疫グロブリン及びＨＢＶポリペプチドは、ＨＢＶ免疫複合体の質量の少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を構成する。更により好ましくは、ＨＢｓＡｇ及び抗ＨＢｓＡｇ−ＩｇＧは、ＨＢＶ免疫複合体の実質的な部分を構成する。最も好ましくは、ＨＢＶ免疫複合体は、本質的にＨＢｓＡｇ及び抗ＨＢｓＡｇ−ＩｇＧから構成される。

当業者は、「免疫グロブリン」又は「Ｉｇ」という用語を理解する。該用語は、免疫グロブリンファミリーのメンバー分子に関し、それらは、外来抗原との接触に反応して、個体の免疫系により産生される可溶性ポリペプチドであることを特徴とする。好ましくは、免疫グロブリンは、哺乳動物由来の免疫グロブリンであり、より好ましくは、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。また、好ましくは、免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭからなる群から選択される。より好ましくは、免疫グロブリンはＩｇＧであり、最も好ましくはヒトＩｇＧである。ヒトＩｇＧは、約１５０ｋＤａの分子量と、約５０ｋＤａの２本の同一の重鎖及び約２５ｋＤａの２本の同一の軽鎖から構成される構造を特徴とする。２本の重鎖は、ジスルフィド結合によりお互いに軽鎖と連結し、典型的なＹ型分子を形成する。好ましくはＩｇＧはグリコシル化されており、より好ましくはＩｇＧはＮ−グリコシル化によってグリコシル化されている。好ましくは、ＩｇＧは、亜群ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のうちの１種である。

「抗免疫グロブリン抗体」という用語は、好ましくは免疫グロブリンを認識する、好ましくはヒト免疫グロブリンを認識する抗体のタンパク質ファミリー由来の可溶性分子に関し、すなわち、本発明の抗免疫グロブリン抗体は、好ましくは抗ヒト免疫グロブリン抗体であり、より好ましくはヒトＩｇＧを認識する、すなわち抗ヒトＩｇＧ抗体である。本発明の抗免疫グロブリン抗体は、好ましくは後述するように低親和性から中程度の親和性と高結合力（ａｖｉｄｉｔｙ）を有する抗体である。エピトープに対する抗体の親和性は、前記抗体の抗原認識部位と前記エピトープ間の全ての非共有相互作用の強度として定義される。高親和性を有する抗体は、多数及び／又は強力な非共有相互作用により抗原と強力に結合し、相対的に長期間抗原と結合したままである。一方、低親和性を有する抗体は、少数及び／又は弱い非共有相互作用で相互作用し、その結果、抗原から急速に解離する。当然のことだが、当業者は、抗体の親和性を解離常数（Ｋ_ｄ）により説明する。好ましくは、１０^−１０ｍｏｌ／Ｌ〜１０^−９ｍｏｌ／Ｌの解離常数は非常に高い親和性であることを示し、１０^−８ｍｏｌ／Ｌの解離常数は高親和性であることを示し、１０^−７ｍｏｌ／Ｌの解離常数は低親和性であることを示し、１０^−６ｍｏｌ／Ｌ及びそれ以上の解離常数は非常に低い親和性であることを示す。したがって、抗免疫グロブリン抗体の解離常数は、好ましくは１０^−６ｍｏｌ／Ｌ〜１０^−８ｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは解離常数は１０^−７ｍｏｌ／Ｌ〜１０^−８ｍｏｌ／Ｌである。例えば、抗体のような、１個以上の結合部位を有する分子では、第一の結合部位の相互作用は、更なる結合部位が相互作用する可能性を上昇させる。このような１個以上の結合部位を有する分子と結合する分子間の複数の相互作用の強度は、結合力として当業者に知られている。したがって、高結合力は、１個の結合部位の相対的に低い親和性を補う可能性がある。したがって、抗免疫グロブリン抗体は、好ましくは２個以上の抗原認識部位、より好ましくは４個以上の抗原認識部位を有する。最も好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は１０個以上の抗原認識部位を有する。好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥであり、より好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は２個以上の抗原認識部位を有する抗体、例えばＩｇＡであり、最も好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は、１個の分子中に４個以上の抗原認識部位を有する抗体、例えばＩｇＭである。抗免疫グロブリン抗体はポリクローン性又はモノクローン性であり、抗体産生に適した哺乳動物又は哺乳動物細胞内で産生される。好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は、本発明の免疫グロブリンのエピトープと特異的に結合する。より好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は抗ヒト免疫グロブリン抗体であり、すなわち本発明のヒト免疫グロブリンと結合し、更により好ましくは、この結合はヒト免疫グロブリンに特異的である。最も好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は抗ヒトＩｇＧ抗体であり、すなわち、ヒトＩｇＧと特異的に結合する。しかし、本発明によって、抗免疫グロブリン抗体は、ＨＢＶ免疫複合体中で免疫グロブリンがＨＢＶポリペプチドに結合することにより形成されるネオエピトープと特異的に結合すると予測される。抗体を産生する方法は当該技術分野で公知であり、例えば公知の実験計画による生きている動物への免疫、又は細胞培養系におけるモノクローナル又はポリクローナル抗体の産生が挙げられる（Sambrookら、1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual）。好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、ロバ、ヤギ、ヒツジ等、又は卵中で産生される。しかし、本発明により、抗免疫グロブリン抗体は形質転換植物内で産生されることも検討される。好ましくは、抗免疫グロブリン抗体はＩｇＭであり、最も好ましくはモノクローナルＩｇＭである。より好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は、抗（凝集ヒトＩｇＧ）ＩｇＭ、すなわち上述したようにヒトＩｇＧに対して低親和性及び高結合力を有するＩｇＭであり、例えば、ＷＯ２００８／１３５２７４に開示されている＜ｈ−ａｇｇ．ＩｇＧ＞ＩｇＭであり、最も好ましくは、抗ヒト免疫グロブリン抗体は、ＭＡｂ＜ｈ−Ａｇｇ．−ＩｇＧ＞Ｍ−３．０２２．５−ＩｇＭ（ＤＳＭ ＡＣＣ２８７３）、ＭＡｂ＜ｈ−Ａｇｇ．−ＩｇＧ＞Ｍ−１．０１０．２−ＩｇＭ、及びＭＡｂ＜ｈ−Ａｇｇ．−ＩｇＧ＞Ｍ−１．１．７−ＩｇＭ（表１に示す）であり、ＭＡｂ＜ｈ−Ａｇｇ．−ＩｇＧ＞Ｍ−３．０２２．５−ＩｇＭ（ＤＳＭ ＡＣＣ２８７３）が最も好ましい。

好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は標識を含む。本明細書で用いられる場合、「標識」という用語は検出可能なシグナルを生成する可能性がある任意の物質に関する。好ましくは、標識は、色原体化合物、蛍光剤化合物、化学発光化合物、若しくは電気化学発光化合物、触媒、酵素、酵素基質、染料、コロイド金属粒子若しくは非金属粒子、又は有機ポリマー粒子等である。

本明細書で用いられる場合、「対象」という用語は、哺乳動物、好ましくはヒトに関する。対象は、好ましくはＨＢＶに感染している。より好ましくは、対象は慢性ＨＢＶに感染している。更に好ましくは、対象はＨＢＶｅ抗原の状態が未知である。

「試料」という用語は、体液試料、組織若しくは臓器由来の試料、又は体表の外側若しくは内側から得て洗浄／すすぎを行った試料に関する。試料は、好ましくはポリペプチドを、より好ましくはＨＢＶ抗原を、最も好ましくはＨＢｓＡｇを含む。血液、血漿、血清、尿、唾液、又は涙液試料は、本発明の方法に包含される。このような試料は、ブラシ、綿球（綿棒）、へら、すすぎ／洗浄液、パンチ生検装置、針を用いた空洞穿刺術、又は手術器具を用いることによって得ることができる。しかし、好ましくはスクレーパー、綿球を含む周知の方法により得られた試料、又は泌尿生殖路、肛門周囲部、肛門管、口腔、上気道消化管及び表皮由来の生検材料も、本発明の試料として含まれる。無細胞体液は、ろ過又は遠心分離のような分離方法によって、体液、組織又は臓器から得ることができる。好ましくは、ＨＢＶに感染している対象におけるＨＢＶポリペプチドを含んでいることがわかっている体液、すなわち、好ましくは血液、血清、唾液等から得られる。当然のことだが、本発明の方法を実施するために、更に試料を処理してもよい。具体的には、当該技術分野で公知の方法及び手段によって得られた試料から細胞を除去してもよい。更に、当該技術分野で公知の方法及び手段によって得られた試料から、ＨＢＶ免疫複合体を抽出及び／又は精製してもよい。したがって、試料という用語は、上述したいずれかの試料から精製及び／又は抽出したＨＢＶ免疫複合体に関するものである。

「測定する」という用語は、試料中に存在するＨＢＶ免疫複合体の量の定量、すなわち、好ましくは半定量的又は定量的に前記ＨＢＶ免疫複合体の量又は濃度を測定することに関する。測定は、直接的又は間接的に実施することができる。免疫複合体の量の測定は、当業者に公知の様々な方法、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、それに続くウェスタンブロッティング、共免疫沈降法等で実施することができる。好ましくは、ＨＢＶ免疫複合体の量は、後述する実施例に記載の方法により測定される。有利なことに、実施例で用いられるサンドイッチ−ＥＬＩＳＡによりＨＢＶ免疫複合体の確実な定量が可能なことがわかった。更に、抗ヒトＩｇ抗体として、凝集抗体、例えば、凝集ＩｇＧを使用することにより、シグナル対ノイズ比が非常に改善されることがわかった。

本発明によれば、ＨＢＶ免疫複合体の量の測定は、試料中のポリペプチド又はペプチドの量を測定するための公知の全ての手段により達成することができる。ただし、該手段が本発明のＨＢＶ免疫複合体を特異的に検出するのに適合するという条件がある。好ましくは、ＨＢＶ免疫複合体と特異的に結合し、そして検出を可能にする検出試薬を使用すべきである。検出試薬は、好ましくは、複合体、該複合体と特異的に結合するアプタマー、アンチカリン、又は設計アンキリン反復タンパク質(Designed Ankyrin Repeat Proteins)（ＤＡＲＰｉｎｓ）と特異的に結合する抗体又はその断片を含む。好ましくは、二重特異性免疫測定法、すなわち、シグナルの存在又は強度がＨＢＶ免疫複合体中に含まれる分子（すなわちＨＢＶポリペプチド及び抗ＨＢＶ免疫グロブリン）の両方の種類の分子の存在に依存する測定法が適用される。前記手段には、様々なサンドイッチ、競合、又は他の測定形式において標識分子を利用することのできる免疫測定装置及び方法が含まれる。前記測定法は、ＨＢＶ免疫複合体の存在又は非存在を示すシグナルを発生する。更に、シグナル強度を、好ましくは試料中に存在するＨＢＶ免疫複合体量と、直接的又は間接的に（例えば、反比例的に）関連付けることができる。前記方法には、好ましくは、バイオセンサー、免疫測定法と連結した光学素子、バイオチップ、質量分析計、ＮＭＲ分析計又はクロマトグラフィー装置のような分析装置が含まれる。更に、方法としては、マイクロプレートＥＬＩＳＡに基づく方法、全自動又はロボットによる免疫測定法（例えば、多重パラメータバイオチッププラットフォーム又はＥｌｅｃｓｙｓＴＭ分析計で利用できる）、ＣＢＡ（例えば、Ｒｏｃｈｅ−ＨｉｔａｃｈｉＴＭ分析計で利用しできる酵素コバルト結合分析）、及びラテックス凝集反応（例えば、Ｒｏｃｈｅ−ＨｉｔａｃｈｉＴＭ分析計で利用できる）が挙げられる。

本明細書で用いられる場合、「量」という用語は、本明細書に記載されるＨＢＶ免疫複合体の絶対量、本明細書に記載されるＨＢＶ免疫複合体の相対量若しくは濃度、並びに量に関連する任意の値又はパラメータを包含する。このような値又はパラメータには、測定により本明細書に記載されるＨＢＶ免疫複合体から得られる全ての特定の物理的又は化学的性質由来の強度シグナル値、例えば、本明細書に記載されるポリペプチドと反応し生物学的読み取り装置から測定される発現量、又は特異的結合リガンドから得られる強度シグナルが含まれる。当然のことだが、前記量又はパラメータと関連づけられる値も、全ての標準的な数学的手法により得ることができる。

本明細書で用いられる場合、「比較する」は、分析すべき試料に含まれる、本明細書に記載されるＨＢＶ免疫複合体の量を、本明細書の他の場所に特定された適切な基準試料中の前記ＨＢＶ免疫複合体の量と比較することを含む。試料中のＨＢＶ抗原、好ましくはＨＢｓＡｇに対するＨＢＶ免疫複合体の量の比を、適切な基準比と比較することも含まれる。当然のことだが、本明細書で用いられる場合、比較は、対応するパラメータ又は値の比較、例えば、本明細書に記載されるＨＢＶ免疫複合体の絶対量を前記ＨＢＶ免疫複合体の絶対基準量と比較すること；本明細書に記載されるＨＢＶ免疫複合体濃度を前記ＨＢＶ免疫複合体の基準濃度と比較すること；試験試料中の本明細書に記載されるＨＢＶ免疫複合体から得られる強度シグナルを基準試料中の前記ＨＢＶ複合体の同じ種類の強度シグナルと比較すること；又はＨＢＶ免疫複合体量の本明細書に記載されるＨＢＶ抗原量に対する比を対応する基準比と比較することを意味する。本発明の方法における比較は、手作業で実施してもよく、又はコンピュータにより補助してもよい。コンピュータにより補助する比較について、測定量の値又は比を、コンピュータプログラムによりデータベースに格納してある適切な基準に対応する値と比較してもよい。コンピュータプログラムでは、更にエキスパートシステムの手段を用いて比較結果を評価してもよい。したがって、本明細書に記載される同定の結果は、適切な出力形式で自動的に提供されてもよい。

本明細書で用いられる場合、「基準値」という用語は、試料が由来する対象について推測すべき、インターフェロン療法に対して感受性であるか、インターフェロン療法に対して感受性でないかを評価することができる、ＨＢＶ免疫複合体の量を意味する。適切な基準値は、一緒に分析すべき基準試料から、すなわち、試料と同時、又は試料の後に決定することができる。

原則として、基準量は、標準的な統計法を適用することにより、所与のＨＢＶ免疫複合体についての算術的平均値又は平均値に基づき、本明細書で規定された対象の群又は集団について算出することができる。具体的には、事象を診断するかしないかを目的とする方法のような試験の精度は受信者動作特性（ＲＯＣ）により最もよく説明されている（特に、Zweig 1993, Clin. Chem. 39:561-577を参照されたい）。ＲＯＣグラフは、得られたデータの全範囲にわたる識別閾値の連続的変化に起因する特異度対に対する敏感度の全てのプロットである。診断法の臨床成績は、その精度、すなわち特定の予後又は診断に対して対象を正確に割り当てる能力に依存する。ＲＯＣのプロットは、区別するのに適切な閾値の全範囲について１−特異度に対する敏感度をプロットすることにより２つの分布間の重複部分を示す。Ｙ−軸は敏感度、又は真陽性の数及び偽陰性の試験結果数の積に対する真陽性の試験結果数の比として定義される真陽性率である。これは、疾患又は症状が存在する場合の陽性とも呼ばれる。これは、単に疾患に冒された亜群から算出される。Ｘ−軸は偽陽性率、又は真陰性の数及び偽陽性の結果数の積に対する偽陽性の結果数の比として定義される１−特異度である。これは特異度の指数であり、もっぱら疾患に冒されていない亜群から算出される。真陽性率及び偽陽性率は、２つの異なる亜群からの試験結果を用いて全く別個に算出されるので、ＲＯＣのプロットは集団内の事象の患者数と無関係である。ＲＯＣプロット上の各ポイントは、特定の識別閾値に対応する敏感度／−特異度の対を表わす。完全に識別できる試験（２つの結果の分布に重複がない）は、左上隅を通るＲＯＣプロットを有しており、真陽性率は１．０又は１００％（完全な敏感度）であり、偽陽性率は０（完全な特異度）である。識別力のない、試験のための理論的プロット（２つの群の結果の分布が同一）は、左下隅から右上隅への４５°の斜線である。ほとんどのプロットは、これら２つの両端の間に入る。ＲＯＣプロットが４５°の斜線を完全に下回る場合、「陽性」の基準を「超える」から「未満」に置き換えることにより容易に改善され、逆も同様である。定性的には、プロットが左上隅に近づくと、試験の全体の精度が高くなる。所望の信頼区間により、閾値はＲＯＣ曲線から導き出され、敏感度及び特異度、それぞれ適切なバランスで所与の事象の診断又は予測が可能になる。したがって、本発明の方法に用いられる基準値は、好ましくは上述したように前記集団のＲＯＣを作成し、そこから閾値を得ることにより作成することができる。診断法の所望の敏感度及び特異度に依存し、ＲＯＣプロットにより、適切な閾値を得ることが可能になる。

好ましくは、本明細書で用いられる場合、基準量は治療前に得た対象の試料に由来するが、そのためには、提供者が治療に反応したか否かが知られていなければならない。この基準量レベルは、個々の数値であってもよく、ある範囲の数値であってもよい。明らかに、基準レベル又は量は、ＨＢＶ免疫複合体の個々の株の間で変化し得る。したがって、測定系は、好ましくは既知量のＨＢＶ免疫複合体又は複数のＨＢＶ免疫複合体を含む、試料又は一連の試料を用いて校正される。より好ましくは、一定容量のＨＢｓＡｇのみの血清、すなわち、多量のＨＢｓＡｇを含むが、抗ＨＢＶ免疫グロブリン又はＨＢＶ免疫複合体を含まない血清と、一定容量の抗ＨＢｓＡｇ免疫グロブリンのみの血清、例えば高力価の抗ＨＢｓＡｇ−ＩｇＧを含むが、ＨＢｓＡｇ又はＨＢＶ免疫複合体を含まない血清とを含む一連の混合物を用いて、系を校正する。当然のことだが、このような場合には、当業者は、好ましくはＨＢＶ免疫複合体の量を任意の単位（ＡＵ）で表わす。したがって、好ましくは、ＨＢＶ免疫複合体又は複数の免疫複合体の量は、試料から得られたシグナルを検量線に含まれるシグナルと比較することにより決定される。

個々の対象に対して適用できる基準量は、年齢、性又は亜集団等の様々な生理的パラメータによって変動する可能性がある。したがって、適切な基準量は、一緒に、すなわち、試験試料と同時又はその後に分析すべき基準試料から本発明の方法により決定することができる。更に、閾値は、好ましくは基準量として用いることができる。好ましくは、閾値を超えるＨＢＶ免疫複合体量は、軽症のＨＢＶ感染であることを示し、閾値以下のＨＢＶ免疫複合体量は重症のＨＢＶ感染であることを示す。当然のことだが、上記量は、統計値又は測定誤差によって変動する可能性がある。

本発明の方法の一態様においては、ＨＢＶ免疫複合体量が多い場合は、好ましくは対象がインターフェロン療法に対して感受性があることを示し、ＨＢＶ免疫複合体量が少ない場合は、対象がインターフェロン療法に対して感受性のないことを示す。この場合には、基準量は、好ましくは所与の対象の個体群又は集団について治療前のＨＢＶに感染している対象に見出される算術的平均値又は平均値である。本明細書に記載される、ＨＢＶ免疫複合体量が少ないか多いかは、好ましくは統計的に有意に少ないか多いことを意味する。

基準量は、好ましくはインターフェロン療法に対して感受性があることが知られている、ＨＢＶに感染している対象又は対象群の試料から得てもよい。このような場合には、ＨＢＶ免疫複合体の測定量が基準量と比較して本質的に同一であるか多い場合は、対象がインターフェロン療法に対して感受性があることを示すものとする。量が少ない場合は、対象がインターフェロン療法に対して感受性のないことを示すものとする。

基準量は、好ましくはインターフェロン療法に対して感受性のないことが知られている、ＨＢＶに感染している対象又は対象群の試料から得てもよい。このような場合には、ＨＢＶ免疫複合体の測定量が基準量と比較して本質的に同一であるか少ない場合は、対象がインターフェロン療法に対して感受性のないことを示すものとする。量が多い場合は、対象がインターフェロン療法に対して感受性があることを示すものとする。

有利なことに、対象由来の試料中に存在するＨＢＶ免疫複合体量の測定により、標準的なインターフェロン療法に対して感受性があるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染している対象を同定することが可能になる。本発明の実施例に詳述するように、好ましくは、ＨＢＶ免疫複合体量が多い場合は、対象がインターフェロン療法に対して感受性があることを示し、ＨＢＶ免疫複合体量が少ない場合は、対象がインターフェロン療法に対して感受性のないことを示す。好ましくは、ＨＢＶ免疫複合体量が多い対象は、標準的なインターフェロン療法に対して反応する可能性が高く、ＨＢＶ免疫複合体の量が少ない対象は、標準的なインターフェロン療法に対して反応する可能性が低いことを意味する。したがって、本発明の方法を用いることにより、治療開始前に、対象が標準的なインターフェロン療法による治療を受けるべきか、改善された治療法を受けることが好ましいかをを決めることが可能になる。また、有利なことに、ＨＢｅＡｇの状態についての知識、すなわち対象のＨＢｅＡｇの状態を決定することは、インターフェロン療法に対する対象の感受性を正確に特定するために、本発明の方法には無関係であることがわかった。

前述の定義は、変更すべきところは変更して、必要なら変更を加えて、以下に適用される。
本発明は、好ましくは前述の本発明の方法によりインターフェロン療法に対して感受性がある対象を同定し、インターフェロン療法に対して感受性があることが示された対象に、本明細書の他の場所で特定したインターフェロン療法の治療的有効量を投与することを含む、インターフェロン療法によりＨＢＶに感染している対象を治療する方法をも意図する。

本発明は、下記工程を含む、ＨＢＶに感染している対象を軽症ＨＢＶ感染と重症ＨＢＶ感染とに識別する方法にも関する：
ａ）前記対象の試料中のＨＢＶ免疫複合体量を測定する工程、
ｂ）工程ａ）で得られたＨＢＶ免疫複合体量を基準値と比較する工程、及び
ｃ）工程ｂ）で実施した比較の結果に基づき、軽症ＨＢＶ感染と重症ＨＢＶ感染とを識別する工程。

この場合には、重症ＨＢＶ感染は、本明細書の他の場所に記載されたＨＢＶ免疫複合体量が少ないことを特徴とするが、軽症ＨＢＶ感染は、ＨＢＶ免疫複合体量が多いことを特徴とする。この事例では、基準量は、好ましくは、対象の所与の個体群又は集団について、治療開始前のＨＢＶに感染している対象において見出される算術平均値又は平均値である。

「軽症」ＨＢＶ感染は、好ましくは、本明細書の他の場所に記載されたインターフェロン療法により治療する可能性がある状態であるが、「重症」は、好ましくはインターフェロン療法により治療することのできない慢性ＨＢＶ感染である。

本発明は、インターフェロン療法に対して感受性があるＨＢＶに感染している対象を同定するための、ＨＢＶに感染している対象由来の試料中のＨＢＶ免疫複合体の量、又は前記試料中のＨＢＶ免疫複合体の検出試薬の使用にも関する。

試料中に存在するＨＢＶ複合体の決定に用いることのできる適切な検出試薬は、本明細書の他の場所に詳細に説明されている。
更に、本発明は、ＨＢＶ免疫複合体の量を決定するための分析ユニットと、前記量を基準量と比較し、インターフェロン療法に対して感受性があるＨＢＶに感染している対象を同定するための評価ユニットとを備える、インターフェロン療法に対して感受性があるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染している対象を同定するための装置にも関する。

本明細書で用いられる場合、「装置」という用語は、識別が可能なように、お互いに動作可能に連結した、少なくとも前記手段を備える、複数の手段の系に関する。前記ＨＢＶ免疫複合体量を測定するのに好ましい手段、及び比較を実施するための手段は、本発明の方法に関連し、前記に開示されている。操作方式において、どのように連結するかは、装置が備える手段の種類に依存する。例えば、自動的にＨＢＶ免疫複合体量を測定するための手段を適用し、該自動的に作動する手段によって得られたデータを、診断を確立する（すなわち、インターフェロン療法に感受性がある対象を同定する）ために、例えばコンピュータプログラムにより処理することができる。そのような場合、前記手段は、好ましくは単一の装置で構成される。したがって、前記装置は、試料中のＨＢＶ免疫複合体量を測定するための分析ユニット、及び前記診断のために得られたデータを処理するための評価ユニットを備えていてもよい。また、ＨＢＶ免疫複合体量を測定するために試験片のような手段が用いられる場合、診断のための手段は、測定した量を、標準的なインターフェロン療法に対する応答又はインターフェロン療法に対する無応答が起こることが知られている量に割り当てるための比較片又は比較表を備えていてもよい。検出に好ましい手段は、前記本発明の方法に関する態様と関連して記載されている。このような事例では、前記手段は、マニュアル内に提供された使用説明書及び解説により、システムの使用者が定量、及びその診断値の結果を一つにまとめるという点で、動作可能なように連結されている。上記態様では、前記手段は別個の装置のように見え、好ましくはキットと一緒に包装されている。当業者には、更なる創作能力なしでも、どのように前記手段と連結するかが分かっている。好ましい装置は、専門の臨床医の特別な知識がなくてもで利用することのできるもの、例えば、単に試料を載せることが必要な試験片又は電子デバイスである。結果は、パラメータに関する診断の生データの出力として、好ましくは絶対量又は相対量として提供してもよい。当然のことだが、これらのデータは臨床医による説明を必要とする。しかし、出力が、説明に専門の臨床医を必要としない、処理された診断の生データを含むエキスパートシステムも想定される。更に好ましい装置は、分析ユニット／装置（例えば、バイオセンサー、アレイ、特にポリペプチドを認識するリガンドと連結した固体支持体、表面プラズモン共鳴装置、ＮＭＲスペクトロメータ、質量分析計等）、又は本発明の方法において前記に説明した評価ユニット／装置を備えている。

本発明は、本発明の方法を実施するための使用説明書、ＨＢＶ免疫複合体量を測定するための検出試薬、及び好ましくは標準的なインターフェロン療法に対して感受性があるＨＢＶに感染している対象を同定することを可能にする基準量のための標準物質を含むキットを意図する。

本明細書で用いられる場合、「キット」という用語は、前記構成要素を集めたものを意味し、好ましくは別々に、又は１つの容器で供給される。また、前記容器は、好ましくは本発明の方法を実施するための使用説明書を含む。このようなキットの構成要素、並びにそれらを使用するための方法の例は本明細書に記載されている。キットは、好ましくはすぐに使用できる形態として前記構成要素を含んでいる。好ましくは、キットは、追加の使用説明書、例えば、本発明の方法により供給された診断に関するあらゆる測定の結果を説明するための使用者のマニュアルを含んでいてもよい。特に、このようなマニュアルは、ＨＢＶ免疫複合体の測定量を、ある程度診断に割り当てるための情報を含んでいてもよい。詳細は、本明細書の他の場所に見出される。更に、このような使用者のマニュアルは、それぞれのバイオマーカーの量を測定するためのキットの構成要素を正確に使用することに関する使用説明書を供給してもよい。使用者のマニュアルは紙で、又は例えば、ＣＤ若しくはＣＤ ＲＯＭに格納された電子形態で供給してもよい。本発明は、本発明の方法のいずれかにおける前記キットの使用にも関する。

本明細書で引用された全ての文献は、全体の開示内容、及び特に本明細書に記載される内容に関し、引用により本明細書に援用する。

図１はＨＢＶ免疫複合体検出の原理を示す。抗−ＨＢｓＡｇ捕捉抗体（ビオチンａＨＢＳ１、ビオチンａＨＢＳ２）は固相表面に結合する。ＨＢＶ免疫複合体（ＨＢｓＡｇ及び抗ＨＢｓＡｇ−ＩｇＧを含む）は表面に捕捉され、ジゴキシゲニンと結合したヒトＩｇＧに対して親和性が低いが結合力が高いモノクローナルＩｇＭ（抗＜凝集ヒトＩｇＧ＞ＩｇＭ−ジゴキシゲニン）により検出される。 図２は研究デザインの計画図を示す。 図３はＨＢｅＡｇの状態によって区別されない、集団における標準的な療法への応答に対するＨＢＶ免疫複合体の量を示す。Ａ）及びＢ）：０週（すなわち治療開始前、Ａ）及び治療１２週目（Ｂ）における、標準的な療法に対して応答する（Ｒ）又は応答しない（ＮＲ）患者由来の血清試料中のＨＢｓＡｇ濃度。応答者及び非応答者間の相違は統計的に有意ではない。Ｃ）及びＤ）：０週（Ｃ）及び治療１２週目（Ｄ）における、標準的な療法に対して応答する（Ｒ）又は応答しない（ＮＲ）患者由来の血清試料中のＨＢｓＡｇ／抗ＨＢｓＡｇ−ＩｇＧ複合体の濃度。応答者及び非応答者間の相違は、０週（ｐ＝０．００９３）及び１２週（Ｐ＝０．０１７９）で統計的に有意である。 図４は図３で得られたデータについてのＲＯＣ曲線を示す。

以下の実施例は単に本発明を説明するものである。それらは、いかなる場合でも本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでない。

実施例１
リウマチ因子様特異性を有する、モノクローナルマウスＩｇＭ抗体の製造
免疫原：Ｈ−ＩｇＧポリマー：
１０ｍｇのヒトＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ社）を、０．６ｍＬの２５ｍＭ重炭酸塩緩衝液ｐＨ９．５に溶解する。３．５μＬの１２．５％グルタルジアルデヒド溶液を加えた後、室温で２時間インキュベートする。次いで、溶液を氷浴中で冷却し、５０ｍＭトリエタノールアミン溶液、ｐＨ８．０を用いてｐＨ８．３に調整し、そして０．１５ｍＬの新鮮に調製された水素化ホウ素ナトリウム溶液（８ｍｇ水素化ホウ素／ｍＬ水）を加える。０℃に２．５時間置いた後、調製物を、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液／０．２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５に対し、４℃で１６時間透析する。ＩｇＧポリマーを含む透析物を一定分量ずつ８０℃で保存するか、又は免疫のため、そしてハイブリドーマ細胞の培養上清中における特異性試験のために用いる。Ｈ−ＩｇＧ３ポリマーは、ヒトＩｇＧ３（Ｓｉｇｍａ社）から出発し、類似の方法で作製される。

マウスの免疫：
１２週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスに、まず、１００μｇのＨ−ＩｇＧ１又はＩｇＧ３ポリマーをアジュバントＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）とともに腹腔内に免疫する。８日後、ＣＦＡ中、１００μｇのそれぞれのＩｇＧポリマーを用いて、追加免疫を実施する。最初の免疫から１３日後、２００μｇのそれぞれのポリマーをアジュバントなしで腹腔内に投与し、最初の免疫から１４及び１５日後に、いずれの場合についても腹腔内及び静脈内に１００μｇを投与する。１６日後に融合を行う。

ハイブリドーマクローンの製造：
融合及びクローニング：
免疫したマウスの脾臓細胞を、Galfre, G., Methods in Enzymology 73 (1981) 3-46の方法に従い、骨髄腫細胞と融合させる。免疫したマウスの約１×１０^８個の脾臓細胞を２×１０^７個の骨髄腫細胞（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８０）と混合し、遠心分離する（４℃、３００ｇで１０分間）。次いで、細胞をウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含まないＲＰＭＩ−１６４０培地で１回洗浄し、５０ｍＬのコニカルチューブ中で、４００ｇで再度遠心分離する。１ｍＬのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）（分子量４０００、Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）を加え、ピペット操作により混合する。３７℃の水浴中に１分間置いた後、ＦＣＳを含まない５ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０を滴下して加えて混合し、培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ）を５０ｍＬまで満たした後、遠心分離する。沈殿した細胞を１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中に取り、そしてヒポキサンチン−アザセリン選択培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ中、１００ｍｍｏｌ／Ｌヒポキサンチン、１μｇ／ｍＬアザセリン）中に播種する。増殖因子として、インターロイキン６（１００Ｕ／ｍＬ）を培地に加える。約１０日後、初代培養を、特異的抗体合成に関して試験した。凝集ヒトＩｇＧ１と陽性反応を示すが、単量体ＩｇＧと交差反応しない初代培養を、９６ウェルの細胞培養プレート中、蛍光活性化細胞選別装置を用いてクローニングする。増殖添加剤として、インターロイキン６（１００Ｕ／ｍＬ）を培地に加える。

この方法により、以下のハイブリドーマクローンを得た：

凝集ヒトＩｇＧに対して特異性を有するモノクローナル抗体のスクリーニング試験
ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）をビオチン化ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３でコーティングする。その後、これらを、細胞培養上清中でモノクローナル抗体とともにインキュベートする。次いで、結合した抗体を、抗＜マウスＩｇＭ＞−ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を用い、ＰＯＤ基質との反応により通常の方式で検出する。

固相に結合したヒトＩｇＧを用いる、サブクラス特異性の決定：
ハイブリドーマ細胞の培養上清中の抗体の特異性を決定するために、組換え型ストレプトアビジンでコーティングしたＭＴＰｓ（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ社、注文番号１２−Ｋ９６Ｎ）を、インキュベーション緩衝液中、サブクラス１又は２又は３又は４の１μｇ／ｍＬビオチン化ｈ−ＩｇＧ（＝ｈ−ＩｇＧ−Ｂｉ）でコーティングする。ビオチンを介して固相に結合したＩｇＧは、凝集したポリマー性ＩｇＧのように振る舞うため、この実験方法は、サブクラス特異性を決定するのに用いることができる。このために、ウェルあたり１００μＬのｈ−ＩｇＧ−Ｂｉ溶液を、振盪しながら室温で６０分間インキュベートした後、０．９％ＮａＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄する。次の工程で、試験すべき抗体溶液（培養上清）１００μＬをコーティングしたウェルに加え、振盪しながら室温で１時間インキュベートする。０．９％塩化ナトリウム／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄した後、試料由来の結合抗体を検出するために、ヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｄｉａｎｏｖａ社、注文番号１１５−０３６−０７５、０．１６μｇ／ｍＬインキュベーション緩衝液の濃度を用いる）由来のポリクローナル抗体のＰＯＤ標識化Ｆａｂ断片１００μＬを各場合に添加して、振盪しながら室温で１時間インキュベートした後、０．９％塩化ナトリウム／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄する。最後に、１００μＬ／ウェルのＡＢＴＳ（登録商標）基質（Roche Diagnostics GmbH、注文番号1684 302）を加え、室温に３０分置いた後、４０５／４９２ｎｍの吸光度を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ社のＭＲ７００マイクロプレートリーダーで測定する。

インキュベーション緩衝液：４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、２００ｍＭ酒石酸ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、０．２％ウシ血清アルブミン。
単量体ヒトＩｇＧ１との反応性／交差反応の決定：
単量体の非凝集Ｈ−ＩｇＧ１との反応性／交差反応を決定するために、前記試験において、試験すべきモノクローナル抗体を、漸増濃度又は過剰量の単量体の非凝集ＩｇＧ１とともにプレインキュベートする。測定シグナルが高いレベルで変化しない場合、交差反応性は起こっていない。測定シグナルが低下する場合、交差反応が起こっている。

組換え型ストレプトアビジンでコーティングした前記マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ社、注文番号１２−Ｋ９６Ｎ）を、インキュベーション緩衝液中、１μｇ／ｍＬのビオチン化ＨＩｇＧ１（＝Ｈ−ＩｇＧ１−Ｂｉ）でコーティングする。ウェルあたり、１００μＬのＨ−ＩｇＧ１−Ｂｉ溶液を用い、振盪しながら室温で６０分間インキュベートした後、０．９％ＮａＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄する。交差反応について試験すべきモノクローナル抗体を、１μｇ／ｍＬ以下の一連の濃度の単量体の非凝集ＩｇＧ１とともにプレインキュベートする。振盪しながら室温で１時間、コーティングしていない９６ウェルのＭＴＰ中でプレインキュベートする。

次の工程で１００μＬの前記溶液（抗体＋過剰量の非凝集単量体ＩｇＧ１）をコーティングしたウェルに添加し、そそして振盪しながら室温で１時間インキュベートする。０．９％塩化ナトリウム／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄した後、試料由来の結合抗体を検出するために、ヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｄｉａｎｏｖａ社、注文番号１１５−０３６−０７５、０．１６μｇ／ｍＬインキュベーション緩衝液の濃度を用いる）由来のポリクローナル抗体のＰＯＤ標識化Ｆａｂ断片１００μＬを、各場合に添加して、振盪しながら室温で１時間インキュベートし、その後、０．９％塩化ナトリウム／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄する。

最後に、１００μＬ／ウェルのＡＢＴＳ（登録商標）基質（Roche Diagnostics GmbH、注文番号1684 302）を加え、室温に３０分置いた後、４０５／４９２ｎｍの吸光度を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ社のＭＲ７００マイクロプレートリーダーで測定する。本発明の意味において適切なモノクローナルリウマチ因子様結合性を有する抗体は、全てのヒトＩｇＧサブクラスを認識し、競合試験において、単量体ｈ−ＩｇＧと１０％未満の交差反応を示す。Ｈ−ＩｇＧ１ポリマーを反応性の決定に用いる場合、測定シグナルは大幅に低下する。表１に、判明したモノクローナル抗体の主な特性を示す。

モノクローナル抗体を単離するためのハイブリドーマクローンの発酵：
得られたハイブリドーマ細胞を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地に１×１０^５細胞／ｍＬの密度で播種し、発酵槽（Ｔｈｅｒｍｏｄｕｘ社、Ｗｅｒｔｈｅｉｍ／＿Ｍａｉｎ、モデルＭＣＳ−１０４ＸＬ、注文番号１４４−０５０）中で７日間増殖させる。培養上清中、１ｍＬあたり１００μｇのモノクローナル抗体の平均濃度に到達する。

モノクローナル抗体ＭＡｂ＜ｈ−Ａｇｇ．−ＩｇＧ＞Ｍ−３．０２２．５−ＩｇＭの単離：
５ｍｇのＭＡｂ＜ｈ−Ａｇｇ．−ＩｇＧ＞Ｍ−３．０２２．５−ＩｇＭ（ＤＳＭ ＡＣＣ２８７３）を、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）で全量２ｍＬに調整する。ジメチルスルホキシド中、ジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチル−カルボニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの１．１１ｍＭ溶液５０μＬをこの溶液に加えた後、２５℃で６０分間撹拌する。ＩｇＭの活性化ジゴキシゲニンに対する比は１：１０である。生成したＩｇＭ−ジゴキシゲニンを２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液／０．１ＭのＮａＣｌ／３％スクロース（ｐＨ７．５）に対して透析する。透析したＩｇＭ−Ｄｉｇを一定分量ずつ−８０℃で保存する。

実施例２
マルチパラメータバイオチッププラットフォームによる完全自動化免疫アッセイ（ＩＭＰＡＣＴ）
マルチパラメータバイオチッププラットフォームは、Hornauer, H.ら, BIOspectrum, Special Proteomics 10 (2004) 564-565、及びHornauer, H.ら, Laborwelt 4 (2004) 38-39に開示されている。複合体レベルを決定するために、アレイに基づくアッセイを用いた(IMPACT-Immunological Multi-Parameter Chip Technology、Roche Diagnostics)。

黒色に染色したポリスチレン支持体（固相）上の約２．５×６ｍｍの試験領域全域にわたってストレプトアビジンのコーティングを行なう。インクジェット方式により試験領域に治療抗体のビオチン化断片からなる、１列あたり約１０〜２０個の同一スポットの列を作製する。スポットの直径は約１５０μｍである。

以下の試験特異性試薬を用いた：
試料希釈緩衝液及び抗体検出緩衝液：
５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ６．６；３０ｍＭのＭＥＳ；５０ｍＭのＮａＣｌ；０．１％洗浄剤（ポリドカノール）；５ｍＭのＥＤＴＡ；０．５％カゼイン；０．２％保存剤（オキシピリオン及びメチルイソチアゾロン塩酸塩（ＭＩＴ））
試料が非常に高濃度のＨＢＶ免疫複合体を示し、結果が測定範囲外である場合、Elecsys Diluent MultiAssay（識別番号０３６０９９８７）を用いて手動により追加の試料希釈を行う。試料を、１０倍のステップ（例えば、１：１０、１：１００、１：１０００）で更に希釈した。

洗浄緩衝液：１０ｍＭのＴｒｉｓ，０．０１％ポリドカノール，０．００１％オキシピリオン，０．００１％ＭＩＴ
試料：ペグインターフェロンアルファ−２ａ（ＰＥＧＡＳＹＳ）及びアデフォビルを用いた治療の前と治療の最中の慢性Ｂ型肝炎患者由来のヒト血清（図２、表２）
ＨＢｓ抗原に特異的に結合する２つの異なるビオチニル化抗体を、ビオチニル化捕捉抗体として用いた。ＨＢｓ抗原及び抗ＨＢｓ抗原の免疫複合体は、固相と結合した捕捉抗体と結合した。免疫複合体を、ヒト凝集ＩｇＧ（ＭＡｂ＜ｈ−Ａｇｇ．−ＩｇＧ＞Ｍ−３．０２２．５−ＩｇＭ）に対して特異的なモノクローナルＩｇＭ抗体により検出した（図１）。

試料を、測定のために試料希釈緩衝液で１：５の比で希釈した。希釈した試料を３７℃で１２分間インキュベートした。試料を吸引し試験領域を洗浄緩衝液で洗浄した後、それらをＭＡｂ＜ｈ−Ａｇｇ．−ＩｇＧ＞Ｍ−３．０２２．５−ＩｇＭ（ＤＳＭ ＡＣＣ２８７３）、ジゴキシンで標識した抗体（ジゴキシン標識モノクローナル抗体＜ｈ−Ａｇｇ．−ＩｇＧ＞）とともに３７℃で６分間インキュベートし、その後洗浄工程を行った。蛍光標識＜Ｄｉｇ＞抗体とともに３７℃で３分間インキュベートした後、試験領域を洗浄し、真空乾燥させ、シグナルをＣＣＤカメラで検出した（図３）。濃度は、適切な複合体校正装置を用いて算出することができる。

Claims (14)

1. インターフェロン療法に対して感受性があるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染している対象を同定する方法であって、該方法が、
   ａ）上記対象の試料中のＨＢＶ免疫複合体の量を測定する工程、
   ｂ）工程ａ）で得られたＨＢＶ免疫複合体の量を基準値と比較する工程、及び
   ｃ）工程ｂ）で実施された比較の結果に基づき、インターフェロン療法に対して感受性があるＨＢＶに感染している対象を同定する工程を含み、
   該対象のＨＢＶｅ抗原状態が未知である、前記方法。
2. 前記ＨＢＶ感染が慢性ＨＢＶ感染である、請求項１に記載の方法。
3. 前記インターフェロン療法が、ＰＥＧ−インターフェロン及びウイルスＤＮＡポリメラーゼ阻害剤による療法を含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記ＰＥＧ−インターフェロン療法がＰＥＧａｓｙｓ（登録商標）であり、前記ウイルスＤＮＡポリメラーゼ阻害剤がＡｄｅｆｏｖｉｒ（登録商標）である、請求項３に記載の方法。
5. 前記ＨＢＶ免疫複合体が、Ｂ型肝炎可溶性抗原（ＨＢｓＡｇ）及び抗−ＨＢｓＡＧＩｇＧを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. ＨＢＶ免疫複合体量が多い場合は対象がインターフェロン療法に対して感受性があることを示し、ＨＢＶ免疫複合体量が少ない場合は対象がインターフェロン療法に対して感受性のないことを示す、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記試料が血清試料である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記ＨＢＶ免疫複合体量を、抗−免疫グロブリン抗体を用いて検出する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. ｉ）前記ＨＢＶ免疫複合体が、抗−ＨＢｓＡＧ−ＩｇＧ、抗−ＨＢｅＡｇ−ＩｇＧ、又は抗−ＨＢｃＡｇ−ＩｇＧであり、ｉｉ）該ＨＢＶ免疫複合体量を、抗（凝集−ヒトＩｇＧ）ＩｇＭを用いて検出する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. ＨＢＶ免疫複合体量を、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いて検出する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. インターフェロン療法に対して感受性があるＨＢＶに感染している対象を同定するための、ＨＢＶに感染している対象由来の試料中のＨＢＶ免疫複合体の量、又は前記試料中のＨＢＶ免疫複合体の検出試薬の使用。
12. ＨＢＶ免疫複合体の量を検出するための分析ユニットと、前記量を基準量と比較し、インターフェロン療法に対して感受性があるＨＢＶに感染している対象を同定するための評価ユニットとを備える、インターフェロン療法に対して感受性があるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染している対象を同定するための装置。
13. 本発明の方法を実施するための使用説明書と、ＨＢＶ免疫複合体を定量するための検出試薬と、好ましくは標準的なインターフェロン療法に対して感受性があるＨＢＶに感染している対象を同定することが可能な基準量のための標準物質とを含むキット。
14. 前記対象のＨＢＶｅ抗原の状態が未知である、請求項１１に記載の使用、請求項１２に記載の装置、又は請求項１３に記載のキット。