CN107003307B

CN107003307B - 降低干扰的方法

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Publication number: CN107003307B
Application number: CN201580069004.8A
Authority: CN
Inventors: B.乌普迈尔; T.扎恩特; J.波尔茨
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2014-12-18
Filing date: 2015-12-17
Publication date: 2020-04-07
Anticipated expiration: 2035-12-17
Also published as: JP6850254B2; US20180128825A1; EP3234601B1; CN107003307A; WO2016097116A1; ES2761427T3; US11156610B2; JP2018501483A; US20220057393A1; EP3234601A1

Abstract

本发明涉及用于测定疑似含有所述分析物的样品中的分析物的方法，其包括a)使至少所述分析物的第一和第二捕获化合物与所述样品接触，其中所述第一和第二捕获化合物是不同的捕获化合物，且其中所述捕获化合物竞争结合所述分析物；b)使与所述样品接触的所述捕获化合物与指定剂接触，其中所述指定剂与所述分析物竞争结合所述捕获化合物；c)测定包含所述指定剂和捕获化合物的复合物的量；和d)基于步骤c)的结果测定样品中的所述分析物。本发明还涉及用于改善用于测定分析物的间接免疫测定的特异性的方法，其包括通过不同的捕获化合物替代至少10％的捕获化合物；其中被替代的捕获化合物与引入的捕获化合物竞争结合所述分析物。本发明还涉及与上述方法相关的试剂盒、设备和用途。

Description

降低干扰的方法

发明领域

本发明涉及用于测定疑似包含所述分析物的样品中的分析物的方法，其包括a)使至少所述分析物的第一和第二捕获化合物与所述样品接触，其中所述第一和第二捕获化合物是不同的捕获化合物，且其中所述捕获化合物竞争结合所述分析物；b)使与所述样品接触的所述捕获化合物与指定剂接触，其中所述指定剂与所述分析物竞争结合所述捕获化合物；c)测定包含所述指定剂和捕获化合物的复合物的量；和d)基于步骤c)的结果测定样品中的所述分析物。本发明还涉及用于改善用于测定分析物的间接免疫测定的特异性的方法，其包括通过不同的捕获化合物替代至少10％的捕获化合物；其中被替代的捕获化合物与引入的捕获化合物竞争结合所述分析物。本发明还涉及与上述方法相关的试剂盒、设备和用途。

相关技术

实验室测试，特别是免疫学测试，已成为疾病诊断中的无价工具。具体地，免疫测定已提供了在复杂混合物，例如体液诸如血液或血浆中特异性检测单一分析物或分析物组的可能性。然而，已经鉴定了免疫测定中的干扰的几个原因，例如，干扰物质与捕获化合物的交叉反应性，检测剂化合物与固相的非特异性结合，通过异嗜性抗体或特别是人抗小鼠抗体(HAMA)对捕获化合物和检测剂化合物的“桥接”结合，仅举几例(参见例如Park &Kricka (2013), Ch. 5.3- Interferences in Immunoassay, in The ImmunoassayHandbook (Fourth Edition), 由David Wild编辑, Elsevier, Oxford: 403;Schiettecatte (2012), Interferences in Immunoassays, Advances in ImmunoassayTechnology, Dr. Norman H.L. Chiu (Ed.))。

在竞争性免疫测定中，包含在样品中的分析物与标记的分析物(指定剂)竞争结合捕获化合物，其通常为抗体，或者在测试血清样品中例如病原体的抗体的存在的情况下，所述病原体的抗原。在样品中分析物的浓度高的情况下，则存在强烈竞争，导致指定剂与捕获化合物的结合减少，引起信号降低，其取决于测试形式，导致定量或定性测试结果。本领域已知的免疫测定的缺点是用作捕获化合物的抗原也可以被来自样品的干扰化合物结合。这些干扰化合物与指定剂竞争结合捕获化合物的表位。根据竞争的严重程度，假测试结果是可能的，其引起相应免疫测定的特异性降低。如果使用潜在地甚至由具有大量构象表位的几个亚单位组成的复合捕获化合物，例如病毒衣壳，则特异性的这种降低可以是特别显著的。在这种情况下，消除干扰的经典方法，例如，添加干扰化合物的替代靶标，可能是低效的。

在非竞争性免疫测定中，通过使分析物与特异性结合分析物并携带标记本身或作为携带标记的第二分子的靶标的化合物接触来检测分析物。因此，在非竞争性免疫测定中，通过测定分析物和携带标记的检测剂化合物之间形成的复合物的量来测定分析物的量。因此，可能如上所述面临类似的特异性问题。

仅免疫学轻微不同的抗原(例如通过在不同表达***中产生，不同的氨基酸序列，糖基化的差异，纯化和重折叠程序的差异以及缓冲液和储存条件的差异)具有各自的干扰范围。因此，导致用抗原X1进行免疫测定的错误结果的样品可以在用抗原X2的测试中提供正确的结果，反之亦然。因此，频繁用抗原交换不同抗原不会导致特异性的改善，但仅导致引起错误结果的样品范围的变化。

待解决的问题

因此，本发明的目的是提供避免上述问题的改善的免疫测定法。

发明概述

这些问题通过具有独立权利要求的特征的方法、试剂盒、设备和组合物来解决。在从属权利要求中列出了可能以分离的方式或任何任意组合实现的典型实施方案。

因此，本发明涉及用于测定疑似含有所述分析物的样品中的分析物的方法，其包括

a)使至少所述分析物的第一和第二捕获化合物与所述样品接触，其中所述第一和第二捕获化合物是不同的捕获化合物，且其中所述捕获化合物竞争结合所述分析物；

b)使与所述样品接触的所述捕获化合物与指定剂接触，其中所述指定剂与所述分析物竞争结合所述捕获化合物；

c)测定包含所述指定剂和捕获化合物的复合物的量；和

d)基于步骤c)的结果测定样品中的所述分析物。

如以下中所使用，术语“具有”、“包含”或“包括”或其任意语法变体以非排他性的方式使用。因此，这些术语既可以是指其中除了这些术语引入的特征之外在本上下文中描述的实体中没有另外特征存在的情况，而且可以是指其中存在一个或多个另外特征的情况。作为实例，表述“A具有B”、“A包含B”和“A包括B”既可以是指其中除了B之外在A中没有另外要素存在的情况(即其中单独且仅由B组成的情况)，而且可以是指其中除了B之外在实体A中存在一种或多种另外要素诸如要素C、要素C和D或甚至其它要素的情况。

此外，如下所用，术语“优选”、“更优选”、“最优选”、“具体地”、“更具体地”、“特别地”、“更特别地”或类似术语与任选的特征结合使用，而不限制可替代的可能性。因此，这些术语引入的特征是任选的特征，并不意图以任何方式限制权利要求的范围。如本领域技术人员将认识到，可以通过使用替代特征来执行本发明。类似地，通过“在本发明的实施方案中”或类似表述引入的特征意图是任选的特征，关于本发明的替代实施方案没有任何限制，关于本发明的范围没有任何限制，并且关于将以这样的方式引入的特征与本发明的其它任选或非任选特征组合可能性的没有任何限制。在本发明的具体值或比率的上下文中的术语“约”是指所述值或比率+/- 30 %、+/- 20 %、+/- 10 %，或者在一个实施方案中+/- 5 %的给定值或比率。

在一个实施方案中，本发明的方法是体外方法。此外，它可以包括除了具体提到的步骤之外的步骤。具体地，步骤b)可以包括提供样品的步骤，或者步骤c)可以包括添加其它化合物以促进结合和检测。此外，一些或所有步骤可以通过自动化设备辅助。

如本文中所使用，术语“测定”是指通过本发明的方法测定样品中的待测定的分析物的至少一种免疫学特征。在一个实施方案中，根据本发明的免疫学特征是分析物的结构特征，其促进通过免疫学方式检测样品中的分析物。在一个实施方案中，所述免疫学特征促进鉴定，在另一个实施方案中，通过免疫学方式定量分析物。因此，典型的免疫学特征是促进区分所述分析物与样品中其它化合物的特征。在一个实施方案中，测定分析物是确定分析物是否以高于方法检测限值的浓度存在于样品中。确定检测限值的方法是本领域技术人员已知的。在另一个实施方案中，测定是半定量或定量地测定样品中分析物的量或浓度。为了进行定量测定，将测定分析物的绝对或精确量，或将测定分析物的相对量。可以在分析物的精确量无法测定或不应测定的情况下测定相对量。在所述情况下，可以确定分析物的存在量相对于包含第二量的分析物的第二样品是增加还是减少。

如本领域技术人员将理解，通常不需要分别测定第一捕获化合物/分析物和第二捕获化合物/分析物复合物。因此，在一个实施方案中，一起测定第一捕获化合物和分析物的复合物以及第二捕获化合物和分析物的复合物，即在所述第一和所述第二捕获化合物之间不加区分。因此，在一个实施方案中，测定与第一捕获化合物或第二捕获化合物的复合物中存在的分析物的总量。

如本领域技术人员将进一步理解，分析物/捕获化合物复合物的测定将取决于所选择的测定形式。在一个实施方案中，测定法是竞争性免疫测定法，通常是竞争性、非均相免疫测定法，即免疫测定法，其中分析物与所述分析物的标记衍生物竞争结合与固体表面结合的捕获化合物，且其中测定与所述捕获化合物结合的所述分析物的标记的衍生物的量。在一个实施方案中，竞争性测定法是抗HBc、抗HAV(抗甲型肝炎病毒)、抗HBe(抗乙型肝炎e抗原)、叶酸、叶酸RBC(红血细胞)、抗TSH-R、总维生素D、维生素B12、甲状腺素(Tyroxin)T4、FT4(游离甲状腺素)、甲状腺素T3、FT 3(游离三碘甲状腺原氨酸)、睾酮、孕酮、洋地黄毒苷、抗TG、抗TPO(抗甲状腺过氧化物酶)、DGEA或***的测定法。在另一个实施方案中，免疫测定法是双抗原夹心测定法(“DAGS”)，其中二价分析物，例如，抗体结合至与固体表面结合的捕获化合物，且其中通过如下文所述的检测剂化合物与所述分析物/捕获化合物复合物的结合来测定分析物/捕获化合物复合物的量。在一个实施方案中，DAGS测定法是抗弓形体IgG、抗风疹IgG、抗HBs 1G、HCV(丙型肝炎病毒)、例如HCVII、CMV(巨细胞病毒)IgG、梅毒、HTLV(人类T细胞淋巴细胞病毒)或查加斯病(美洲锥虫病)。

术语“生物分子”是本领域技术人员已知的，并且通常涉及由至少一种生物体的代谢产生的分子。因此，术语“生物大分子”在一个实施方案中涉及由生物体从单体前体产生的聚合物。典型的生物大分子是多肽、DNA、RNA或多糖。

如本文中所使用，术语“分析物”涉及化学分子，在一个实施方案中，有机分子，其以足够的亲和力结合本发明的捕获化合物和/或检测剂化合物，以允许检测分析物/捕获化合物和/或检测剂化合物复合物。在一个实施方案中，分析物/配体复合物的解离常数(K_d)为至多10^-7 mol/L，在另一个实施方案中为至多10^-8 mol/l，在另一个实施方案中为至多10^-9 mol/L。在一个实施方案中，本发明的第一捕获化合物与分析物之间形成的复合物的解离常数和本发明的第二捕获化合物与分析物之间形成的复合物的解离常数相差不超过5倍；在一个实施方案中不超过2倍；在另一个实施方案中不超过1.5倍。在一个实施方案中，第一捕获化合物和分析物之间形成的复合物的解离常数具有第二捕获化合物和分析物之间形成的复合物的解离常数的70％至130％的值。在另一个实施方案中，第一捕获化合物和分析物之间形成的复合物的解离常数具有第二捕获化合物和分析物之间形成的复合物的解离常数的80％至120％的值。在另一个实施方案中，第一捕获化合物和分析物之间形成的复合物的解离常数具有第二捕获化合物和分析物之间形成的复合物的解离常数的90％至110％的值。在另一个实施方案中，第一捕获化合物和分析物之间形成的复合物的解离常数和第二捕获化合物和分析物之间形成的复合物的解离常数基本上相等或相等。在一个实施方案中，分析物的分子量为至少100(对应于100原子质量单位，和100Da；1 Da对应于1.66×10⁻²⁷kg)，在另一个实施方案中，至少250，在另一个实施方案中，至少500个，或在另一个实施方案中至少1000。在一个实施方案中，分析物是生物分子，在另一个实施方案中，分析物是生物大分子。在另一个实施方案中，分析物是多肽。

在一个实施方案中，在本发明的分析物是多肽的情况下，多肽是由感染病原体，例如病毒或细菌产生的抗原，或抗体，例如由受试者针对由感染病原体产生的抗原产生的抗体。在一个实施方案中，分析物是多肽，在另一个实施方案中，是针对病毒抗原的抗体，在另一个实施方案中，是针对病毒多肽的抗体，或者在另一个实施方案中，是针对病毒衣壳多肽的抗体。在一个实施方案中，病毒衣壳多肽是肝炎病毒衣壳多肽，在一个实施方案中，是乙型肝炎病毒(HB)衣壳多肽，或在另一个实施方案中是HB核心(HBc)抗原。因此，在一个实施方案中，分析物是针对肝炎病毒衣壳多肽、例如针对乙型肝炎病毒(HB)衣壳多肽、通常针对HB核心(HBc)抗原或HBe抗原的的抗体。在一个实施方案中，第一捕获化合物是HBc抗原，如Genbank Acc No:Q17UT2 GI:123867942 (SEQ ID NO:1)所示。在另一个实施方案中，第一种捕获化合物是如Genbank Acc No:Q17UT2 GI:123867942 (乙型肝炎病毒亚型adw2核心抗原，SEQ ID NO:1)所示的HBc抗原，且第二种捕获化合物是如Genbank Acc No. P03147.1GI:116947 (乙型肝炎病毒基因型D亚型adw核心抗原，SEQ ID NO:2)所示的HBc抗原。在另一个实施方案中，第一和第二捕获化合物是选自本领域已知的HBc抗原序列的HBc抗原序列，诸如通过其Genbank Acc. No:P03148.3 GI:166215076、P03149.1 GI:116945、NP_647607.1 GI:21326588和AY123424.1 GI:22203511标识的HBcAg蛋白序列。

在一个实施方案中，为了促进克隆，可以通过缺失所述抗原序列的N-和/或C-端氨基酸的1-5个氨基酸来缩短每个HBV核心抗原序列的N-和/或C-端末端。在另一个实施方案中，可以将包含2至15个氨基酸的标签添加至抗原的N-端或C-端末端或两个末端，而不干扰HBV核心抗原的抗原性质。

在一个实施方案中，如本文中所使用的术语多肽包括特别指定的多肽的变体和片段。变体包括包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与特别指定的氨基酸序列(例如SEQID NO:1或2中所示)具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性。百分比同一性值优选地在整个氨基酸序列区域计算。技术人员可用基于各种算法的一系列程序用于比较不同序列。在这种背景下，Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法给出特别可靠的结果。为了进行序列比对，可使用程序PileUp (J.Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989:151-153)或程序Gap和BestFit [Needleman和Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970))和Smith和Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981))]，它们是GCG软件包的一部分[Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711(1991)]。优选地使用程序GAP在整个序列区域用以下设置测定以百分比(％)表示的序列同一性值：空位权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000和平均错配：0.000，其除非另有规定，否则应始终用作序列比对的标准设置。

在一个实施方案中，包含任何前述多肽序列的片段的多肽也作为本发明的多肽被包括。该片段是仍作为上述捕获化合物或检测剂化合物的多肽。因此，多肽可以包含赋予所述生物活性的本发明多肽的结构域或由其组成。如本文意指的片段优选包含前述氨基酸序列中任一个的至少50个、至少100个、至少250个或至少500个连续的氨基酸序列，其包含前述氨基酸序列中任一个的至少20个、至少30个、至少50个、至少80个、至少100个或至少150个连续氨基酸。

本发明的多肽基本上由上述氨基酸序列组成或包含上述氨基酸序列。因此，它们也可以含有另外的多肽序列。具体地，本发明的多肽可以是融合蛋白，其中融合蛋白的一个配偶体是如上所述的多肽。这样的融合蛋白可以包含作为脂肪酸或脂质生物合成途径的其它酶的其它部分，用于监测表达的多肽(例如绿色、黄色、蓝色或红色荧光蛋白、碱性磷酸酶等)或所谓的“标签”，其可以用作可检测标记或用作用于纯化目的或将所述多肽结合至固体表面的辅助量度。用于不同目的的标签是本领域众所周知的，并且包含FLAG-标签、6-组氨酸-标签、MYC-标签、生物素等。

然而，还设想分析物是可以通过与捕获化合物形成复合物测定的低分子量化合物，包括例如，甲状腺素(T4)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、叶酸、叶酸结合蛋白、维生素B₁₂、内在因子等。

如本文中所使用，术语“捕获化合物”涉及直接或间接地结合上文所述的本发明的分析物并结合至固体表面或适于结合至固体表面的化学分子。

在一个实施方案中，捕获化合物是有机分子，在另一个实施方案中，是如上文所述的生物大分子，例如上文所述的多肽。在一个实施方案中，捕获化合物以足够的亲和力间接结合本发明的分析物，以允许检测包含分析物和捕获化合物的复合物；即在这种情况下，捕获化合物是间接配体。如本文中所使用，术语“间接结合”涉及结合，其中配体不直接接触分析物，但接触结合分析物的化学分子，在一个实施方案中，特异性结合分析物，其中，在一个实施方案中，结合分析物的所述分子是直接结合分析物的分子，即是直接配体。因此，在一个实施方案中，分析物，结合分析物的化学分子，和间接配体形成具有上述性质的复合物，特别是具有如所示的解离常数。如本领域技术人员将理解，术语“竞争结合”的定义加上必要的变更适用于本发明的间接配体，即间接配体，在一个实施方案中具有不能同时结合至结合分析物的所述分子的性质。在另一个实施方案中，捕获化合物以足够的亲和力直接结合本发明的分析物，以允许检测如上文所述的分析物/捕获化合物复合物。因此，在一个实施方案中，捕获化合物是直接配体。

根据本发明，提供至少第一和第二捕获化合物，其中所述第一和第二捕获化合物是不同的捕获化合物。如本文中所使用，术语“不同的”捕获化合物涉及在至少一种化学和/或物理性质中可测量地不同的两种或更多种捕获化合物分子。通常，所述至少一种化学和/或物理性质不是指示剂，且不是与所述捕获化合物与固体表面的结合相关的性质。典型的性质是氨基酸序列、糖基化、三维折叠和/或构象以及多肽链的长度。然而，本发明还考虑相同捕获化合物的两种制备物中浓度的差异和/或杂质的同一性。因此，在一个实施方案中，第二捕获化合物通过以下至少一种来衍生或可衍生自第一捕获化合物：(i)将至少一个氨基酸交换引入所述第一捕获化合物的氨基酸序列，(ii)在与所述第一捕获化合物相比不同的细胞背景中产生所述第二捕获化合物，(iii)与所述第一捕获化合物相比，除去或阻止所述第二捕获化合物的糖基化，(iv)通过与所述第一捕获化合物相比不同的方式纯化所述第二捕获化合物，(v)在与所述第一捕获化合物相比不同的条件下变性和/或重折叠所述第二捕获化合物，和(vi)在与所述第一捕获化合物相比不同的条件下储存所述第二捕获化合物。在一个实施方案中，所述第一和第二捕获化合物是识别基本相同的表位的抗体，且所述第二捕获化合物是作为第一捕获化合物的抗体的变体。在另一个实施方案中，所述第一和第二捕获化合物中的至少一种不是抗体。在另一个实施方案中，所述第一和第二捕获化合物不是抗体。

根据本发明，提供至少第一和第二捕获化合物，其中所述捕获化合物竞争结合所述分析物。如本文中所使用，表示两种化合物“竞争结合”分析物的术语涉及所述化合物不能同时结合所述分析物的基本相同的结合位点的分子性质。因此，通常，在两种捕获化合物竞争结合分析物的情况下，和在所述分析物具有所述捕获化合物的一个结合位点的情况下，在每个时间点，只有一个分子的所述捕获化合物可以结合所述分析物。本领域技术人员将理解，在分析物具有捕获化合物的两个或更多个结合位点的情况下，上述加上必要的变更适用。本领域技术人员知道如何确定结合中的竞争。在一个实施方案中，竞争结合分析物是结合所述分析物的相同或基本上相同的亚结构。在另一个实施方案中，在分析物是多肽的情况下，由第一捕获化合物结合的表位和由第二捕获化合物结合的表位具有共同的分析物的至少3个氨基酸，在一个实施方案中具有共同的分析物的3个连续氨基酸。通常，在这种情况下，由第一捕获化合物结合的表位和由第二捕获化合物结合的表位具有共同的分析物的至少4、5、6或7个氨基酸。

在一个实施方案中，第一和第二捕获化合物不竞争结合干扰化合物。如本文中所使用的术语“干扰化合物”涉及降低免疫测定法的特异性的化合物。在一个实施方案中，干扰化合物是结合本发明的捕获化合物的化合物，其不是分析物。

在一个实施方案中，第一和第二捕获化合物以1:5至5:1、通常1:2至2:1、约1:1或1:1的比率使用。在另一个实施方案中，三种捕获化合物以约2:1:1、1:2:1或1:1:2、约1:1:1或1:1:1的比率使用。因此，在一个实施方案中，第一和第二捕获化合物和潜在存在的另外的捕获化合物以约相同量(在另一个实施方案中以相同量)存在于反应混合物中。

将生物分子(通常为多肽)与固体表面结合的方法是本领域熟知的，并且包括例如，通过疏水相互作用结合，生物素化和经由固定的链霉抗生物素蛋白结合，共价结合，抗体-抗原相互作用等，或这些相互作用的组合，例如抗体和病原体多肽之间的抗体-抗原相互作用，其中所述抗体被生物素化并经由固定的链霉抗生物素蛋白结合至固体表面。因此，捕获化合物也可以优选为捕获复合物。在一个实施方案中，捕获化合物是直接结合分析物的捕获复合物的化合物。本领域技术人员知道如何将捕获化合物或复合物与固体表面结合，这取决于所选择的固体表面。在一个实施方案中，捕获化合物是病毒多肽，例如病毒衣壳多肽。在一个实施方案中，所述捕获化合物是肝炎病毒衣壳多肽，在一个实施方案中是乙型肝炎病毒(HB)衣壳多肽，例如HB核心(HBc)抗原或HBe抗原。然而，也设想捕获化合物是抗体。

如本文中所使用的术语“抗体”包括单克隆抗体，由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出如本文别处所指定的所需结合活性。在一个实施方案中，抗体不是包含在抗血清中的抗体，通常不是多克隆抗体或多克隆血清。因此，在一个实施方案中，抗体是包含在混合物中的抗体，其中包含在所述混合物中的至少80％，在一个实施方案中至少90％，在另一个实施方案中至少95％的抗体分子是至少一种捕获化合物或至少一种本发明的检测剂化合物。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，所述抗体是全长抗体或抗体片段。

根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可以被分配到不同的类别。存在五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的，并且通常描述于例如Abbas等人, Cellular and Mol.Immunology,第4版, W.B. Saunders, Co. (2000)。抗体可以是通过抗体与一种或多种其它蛋白或肽的共价或非共价缔合形成的较大融合分子的一部分。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本文中可互换地用于指其基本上完整形式的抗体，而不是如下定义的抗体片段。术语特别是指具有含有Fc区的重链的抗体。在一个实施方案中，“抗体片段”包含完整抗体的一部分，其包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，各自具有单一抗原结合位点)和剩余的“Fc”片段(其名称反映了其容易结晶的能力)。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段，其具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。“Fv”是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由紧密、非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链可以以类似于双链Fv种类的“二聚”结构缔合。正是以这种构型，每个可变结构域的三个高变区(HVR)相互作用以限定抗原结合位点。总共六个HVR赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或仅包含对抗原特异性的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点。术语“双体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述片段包含与相同多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许同一链上的两个结构域之间的配对的接头，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双体可以是二价或双特异性的。双体更完全地描述于例如，EP 0 404 097; WO 1993/01161; Hudson等人, Nat. Med. 9 (2003)129-134;和Hollinger等人, PNAS USA 90 (1993) 6444-6448。三体和四体也描述于Hudson等人, Nat. Med. 9 (2003) 129-134。

如本文中所使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即构成群体的单一抗体除了可以少量存在的可能突变(例如天然存在的突变)以外是相同的。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征不是离散抗体的混合物。在某些实施方案中，这样的单克隆抗体通常包括包含结合分析物的多肽序列的抗体，其中通过包括从多个多肽序列中选择单个分析物结合多肽序列的方法获得分析物结合多肽序列。例如，选择过程可以是从许多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的合并物中选择独特克隆。应当理解，选择的靶标结合序列可进一步改变，例如以改善对靶标的亲和力、将靶标结合序列人源化、改善其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未被其它免疫球蛋白污染。

如本文中所使用，术语“固体表面”涉及适于结合本发明的捕获化合物且适于例如通过物理方式从样品分离的任何合适的固体表面。在一个实施方案中，所述固体表面是珠粒的表面，在一个实施方案中，是微珠例如磁性或顺磁性微珠。在一个实施方案中，所述表面适于改善捕获化合物的结合，例如通过共价或非共价地附接结合捕获化合物的亚结构的分子。结合捕获化合物的亚结构的典型分子是，例如抗体、链霉抗生物素蛋白、复合镍离子等。在另一个实施方案中，固体表面通过共价或非共价键结合所述捕获化合物，例如，通过疏水相互作用。因此，在一个实施方案中，所述固体表面是多簇板的表面。在一个实施方案中，将多簇板的表面预处理以增加结合捕获化合物的亲和力和/或能力。合适的预处理是本领域已知的。

如本文中所使用的术语“样品”涉及怀疑包含本发明分析物的样品。在一个实施方案中，所述样品是或包含体液的样品，来自组织或器官的样品，或洗涤/漂洗液的样品或从外或内体表面获得的拭子或涂物。在一个实施方案中，所述样品包含至少一种如本文别处指定的分析物。本发明的方法包括血液、血浆、血清、尿液、唾液或泪液的样品。可以通过使用刷子、(棉花)拭子、抹刀、漂洗/洗涤液、钻取活检设备、用针或柳叶刀穿刺腔或通过外科手术仪器化来获得样品。然而，通过众所周知的技术获得的样品，包括在一个实施方案中，来自泌尿生殖道、肛周区域、肛管、口腔、上呼吸消化道和表皮的刮擦物、拭子或活检，也被包括作为本发明的样品。可以通过裂解技术诸如均质化和/或通过分离技术诸如过滤或离心从体液或组织或器官获得无细胞的液体。在一个实施方案中，样品获得自已知包含HB病毒多肽或/和针对至少一种HB病毒多肽的抗体的体液，即在一个实施方案中，血液、血浆、血清、唾液等。应当理解，可以进一步处理样品以便实施本发明的方法。具体地，可以通过本领域已知的方法和方式从样品中除去细胞。此外，可以通过本领域已知的方法和方式从样品提取和/或纯化至少一种分析物。因此，术语样品还可以涉及包含或怀疑包含至少一种分析物的制备物，其从样品稀释、富集、纯化和/或提取。

在一个实施方案中，本发明的方法是竞争性免疫测定。因此，该方法还包括将指定剂混合至样品。在一个实施方案中，本发明的方法是异质竞争性免疫测定，并且包括通过测定在所述指定剂和所述不同的捕获化合物之间形成的复合物的量来间接测定分析物与两种不同的捕获化合物之间形成的复合物的量。

如本发明的方法的上下文中使用的术语“接触”是本领域技术人员理解的。在一个实施方案中，该术语涉及使本发明的化合物与样品或另外的化合物物理接触，由此例如允许样品和化合物相互作用。

术语“指定剂”是本领域技术人员已知的，并且涉及与分析物竞争结合与指定剂结合的捕获化合物的化合物。通常，指定剂在结构上类似于分析物。通常，指定剂包含被与指示剂结合的捕获化合物结合的分子的亚结构。在一个实施方案中，所述指定剂是包含分析物和作为结构元件的指示剂的化合物，或者所述指定剂由与指示剂共价结合的分析物组成。

如本文中所使用的术语“指示剂”是适于使包含所述指示剂的分子或复合物的存在可检测的化合物。通常，所述指示剂具有可检测的性质，通常为光学或/和酶学性质。然而，还设想所述可检测性质是发射放射性的性质。

如本文中所使用的术语“光学性质”涉及可由光学仪器检测的任何性质。具体地，光学可测定的性质可以是或可以包含至少一种选自以下的性质：反射性、透射性、发射性、散射性、荧光性、磷光性、衍射性和极化性。本发明设想的另外的光学性质是颜色、荧光、发光或折射。在一个实施方案中，本文所提及的光学可测定的性质是指可以光学检测的化学化合物的性质，诸如光吸收、发光、光缓解或与其相关的性质。应当理解，检测如本文中所使用的光学可测定的性质包括检测以前不可检测的性质的存在，检测以前没有检测到的性质的不存在，以及检测性质的定量变化，即检测与至少一种光学性质的变化程度相关的信号强度的变化。应当理解，在一个实施方案中，术语“光学可测定的性质”也涉及电化学发光，其也称为电致化学发光。

如本文中所使用的术语“酶性质”涉及通过生物催化从底物产生可检测产物的指标的性质。因此，酶特性通常由所述指示剂中具有所述酶性质的多肽的存在赋予。通常，酶性质是选自以下的至少一种酶活性：磷酸酶活性(例如碱性磷酸酶)、过氧化物酶活性(例如辣根过氧化物酶)和糖苷酶活性(例如β-半乳糖苷酶)。酶活性的典型底物是本领域熟知的。通常，所述酶活性产生具有如上文所述的可测定光学性质的产物，或/和所述酶活性产生可由电子仪器测定的产物。

在一个实施方案中，本发明的方法是双抗原夹心测定法(“DAGS”)。因此，所述方法还包括通过以下步骤检测所述分析物和所述捕获化合物之间形成的复合物：(i)使所述复合物与至少一种检测剂化合物接触，和(ii)测定包含所述分析物、所述捕获化合物和所述检测剂化合物的三元复合物的量。

在DAGS测定法的实施方案中，使用检测剂化合物。如本文中所使用的术语“检测剂化合物”涉及直接或间接地结合上文指定的本发明的分析物并与如本文别处指定的指示剂结合的化学分子。在一个实施方案中，检测剂化合物不与固体表面结合，并且不适于结合至固体表面。如本领域技术人员将理解，检测剂化合物也可以是间接检测剂化合物，即不与分析物直接接触的检测剂化合物，如上文对于本发明的配体所指定。在一个实施方案中，检测剂化合物是直接检测剂化合物。因此，在一个实施方案中，上述针对本发明的捕获化合物提供的定义，只要它们不涉及化合物与固体表面的结合，就加上必要的变更适用于本发明的检测剂化合物。

如本领域技术人员将理解，术语“特异性”用于表示存在于样品中的其它化合物(通常为生物分子)不显著结合本发明的配体(捕获化合物或检测剂化合物)；如本领域技术人员将理解，这不排除化学化合物与捕获化合物或检测剂化合物分子的区域的结合，所述区域不参与与分析物、指定剂或标签的相互作用，所述分析物、指定剂或标签用作调节与固相的结合的功能部分。

此外，本发明涉及

(i)改善用于测定分析物的间接免疫测定的特异性的方法，其包括通过不同的捕获化合物替代至少10％，在一个实施方案中，至少25％，在另一个实施方案中，至少40％，在另一个实施方案中，至少45％，在另一个实施方案中，约50％的捕获化合物，其中替代的捕获化合物与引入的捕获化合物竞争结合所述分析物；或者

(ii)改善用于测定分析物的双抗原夹心免疫测定的特异性的方法，

其包括通过不同的捕获化合物替代至少50％，在一个实施方案中，至少75％，在另一个实施方案中，至少90％，在另一个实施方案中，约100％的捕获化合物，其中替代的捕获化合物与引入的捕获化合物竞争结合所述分析物，且其中所述至少一种捕获化合物和至少一种检测剂化合物是所述分析物的不同的配体，或者

其包括通过不同的检测剂化合物替代至少50％，在一个实施方案中，至少75％，在另一个实施方案中，至少90％，在另一个实施方案中，约100％的检测剂化合物，其中替代的检测剂化合物与引入的检测剂化合物竞争结合所述分析物，且其中所述至少一种捕获化合物和至少一种检测剂化合物是所述分析物的不同的配体。

通常，将选择替代的捕获化合物或检测剂化合物的级分，使得可以理论上预期替代的可测量的影响。如本领域技术人员将理解，可测量的效果的预期将取决于用于替代的不同配体的数量。例如，如果在改善后的测定中使用三种捕获化合物代替一种捕获化合物，则优选替代例如66％的初始捕获化合物。通常，设想给定捕获化合物或检测剂化合物的分数为(100% / n) ± 50%，其中n =(测定中使用的不同捕获化合物或检测剂化合物的数目)。在另一个实施方案中，使用(100% / n) ± 20%的级分。如本领域技术人员将理解，使用的级分的总和将加起来为100％。因此，在一个实施方案中，替代的捕获化合物或检测剂化合物的级分为10％至90％，在一个实施方案中为25％至75％，在另一个实施方案中为40％至60％，在另一个实施方案中为约50％。

此外，本发明涉及用于检测样品中的分析物的试剂盒，其包含

(i)所述分析物的至少两种不同的捕获化合物，其中所述捕获化合物竞争结合所述分析物；或

(ii)所述分析物的至少两种不同的检测剂化合物，其中所述检测剂化合物竞争结合所述分析物。

在一个另外的实施方案中，本发明涉及用于检测样品中的分析物的试剂盒，其包含

(i) 所述分析物的至少两种不同的捕获化合物，其中所述捕获化合物竞争结合所述分析物，和

(ii) 指示剂，其中所述指定剂与所述分析物竞争结合所述捕获化合物。

如本文中所使用的术语“试剂盒”是指可以包装在一起或可以不包装在一起的本发明的上述化合物、方法或试剂的集合。试剂盒的组分可以由单独的小瓶(即，作为单独部分的试剂盒)包含或提供在单个小瓶中。此外，应当理解，本发明的试剂盒用于实施上文所述的方法。在一个实施方案中，设想为了实践上述方法，所有组分都以即用方式提供。此外，在一个实施方案中，试剂盒含有用于实施所述方法的说明书。说明书可以由用户手册以纸张或电子形式提供。例如，所述手册可以包含用于解释当使用本发明的试剂盒实施上述方法时获得的结果的说明书。在一个实施方案中，用于检测样品中的分析物的试剂盒（包含至少两种不同的本发明的捕获化合物）还包含至少两种不同的检测剂化合物，其中所述检测剂化合物竞争结合所述分析物，且其中所述捕获化合物不与所述检测剂化合物竞争结合所述分析物。在另一个实施方案中，所述试剂盒还包含用于固定所述捕获化合物或固定分析物的固体支持物。

在一个实施方案中，所述试剂盒中包含2至10种所述分析物的捕获化合物，在一个实施方案中，2至5种所述分析物的捕获化合物，在一个实施方案中，2至4种捕获化合物，在一个实施方案中，2至3种所述分析物的捕获化合物。在另一个实施方案中，所述试剂盒中包含2至10种所述分析物的检测剂化合物，在一个实施方案中，2至5种所述分析物的检测剂化合物，在一个实施方案中，2至4种检测剂化合物，在一个实施方案中，2至3种所述分析物的检测剂化合物。

此外，本发明涉及用于检测样品中的分析物的设备，其包含

(ii)所述分析物的至少两种不同的检测剂化合物，其中所述检测剂化合物竞争结合所述分析物，和任选地用于测定所述检测剂化合物中包含的指示剂的光学或/和酶性质的装置。

如本文中所使用，术语“设备”涉及包含至少上述可操作相互连接以允许测定的装置的装置***。上文结合本发明的方法公开了用于测定分析物的量的典型装置和用于进行测定的装置。如何以操作方式连接装置将取决于设备中包含的装置的类型。在一个实施方案中，所述装置由单个设备包含。因此，所述设备可以包括(i)用于测量所应用样品中分析物的量的分析单元和(ii)用于处理用于评估的所得数据的计算机单元。关于与上述本发明的方法相关的实施方案公开了用于检测的典型装置。在这种情况下，可操作连接所述装置，因为***的用户由于手册中给出的说明和解释将指示剂和分析物的光学或/和电化学上可测定的性质的测定结果汇集在一起，或者所述说明和解释包括在所述设备中包含的可执行程序代码中，使得作为测定的结果，将所应用的样品中的分析物的量或浓度输出至所述用户。本领域技术人员将意识到如何无需再费周折地连接所述装置。典型的设备是可以在没有专门技术人员的特定知识的情况下应用的设备，例如仅需要用样品上样的测试条或电子设备。结果可以给出为原始数据的输出，其需要由技术人员解释。然而，在一个实施方案中，该设备的输出是处理，即评估的原始数据，其解释不需要技术人员。其它典型的设备包括分析单元/设备(例如，生物传感器，阵列，与特异性识别肽的配体偶联的固体支持物，等离子体表面共振设备，NMR光谱仪，质谱仪等)或上述根据本发明的方法提及的评估单元/设备。

在一个实施方案中，所述设备中包含2至10种所述分析物的捕获化合物，在一个实施方案中，2至5种所述分析物的捕获化合物，在一个实施方案中，2至4种捕获化合物，在一个实施方案中，2至3种所述分析物的捕获化合物。在另一个实施方案中，所述设备中包含2至10种所述分析物的检测剂化合物，在一个实施方案中，2至5种所述分析物的检测剂化合物，在一个实施方案中，2至4种检测剂化合物，在一个实施方案中，2至3种所述分析物的检测剂化合物。

此外，本发明涉及组合物，其包含(i)指示疾病的分析物的至少两种不同的捕获化合物，其中所述捕获化合物竞争结合所述分析物；或(ii)指示疾病的分析物的至少两种不同的检测剂化合物，其中所述检测剂化合物竞争结合所述分析物；其用于诊断中。

如本文中所使用的术语“组合物”是指以固体、液体或气体形式配制的任何组合物。所述组合物包含本发明的化合物，任选地与合适的辅助化合物诸如稀释剂或载体或另外成分一起。合适的稀释剂和/或载体取决于组合物待使用的目的和其它成分。本领域技术人员可以无需再费周折地确定这样的合适的稀释剂和/或载体。在一个实施方案中，用于诊断中的组合物（包含至少两种不同的本发明的捕获化合物）还包含至少两种不同的检测剂化合物，其中所述检测剂化合物竞争结合所述分析物，且其中所述捕获化合物不与所述检测剂化合物竞争结合所述分析物。

如本文中所使用的术语“诊断”是指受试者患有或将患有疾病或病况的概率的评价。如本领域技术人员将理解，这样的评价通常并非意图对于待诊断的100％受试者是正确的。然而，该术语要求统计学显著部分的受试者可被正确诊断为患有疾病或病况。本领域技术人员可以使用各种众所周知的统计评估工具来无需再费周折地确定部分是否是统计学显著的，例如，置信区间的确定，p-值确定，Student´s t-检验，Mann-Whitney检验等。详情见于Dowdy和Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York1983。优选的置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。p-值优选为0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。优选地，本发明设想的概率允许将针对给定组群或群体的至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的受试者校正诊断。待诊断的典型状况是例如生育状态或怀孕。待诊断的典型疾病是，例如，普遍或以前感染病原体，例如病毒，甲状腺功能亢进或甲状腺功能减退，维生素缺乏等。

此外，本发明涉及组合物用于测定样品中的分析物的用途，所述组合物包含(i)第一和第二捕获化合物，其中所述第一和第二捕获化合物是不同的捕获化合物，且其中所述捕获化合物竞争结合所述分析物，或(ii)第一和第二检测剂化合物，其中所述第一和第二检测剂化合物是不同的检测剂化合物，且其中所述检测剂化合物竞争结合所述分析物。

概述本发明的发现，公开了以下实施方案：

实施方案1. 用于测定疑似包含所述分析物的样品中的分析物的方法，其包括

a) 使至少所述分析物的第一和第二捕获化合物与所述样品接触，其中所述第一和第二捕获化合物是不同的捕获化合物，且其中所述捕获化合物竞争结合所述分析物；

b) 使与所述样品接触的所述捕获化合物与以下接触：

(i)检测剂化合物，其中所述检测剂化合物与所述捕获化合物竞争结合所述分析物；或

(ii)指定剂，其中所述指定剂与所述分析物竞争结合所述捕获化合物；

c) 测定包含以下的复合物的量：

(i)所述检测剂化合物和捕获化合物，或

(ii)所述指定剂和捕获化合物；和

d) 基于步骤c)的结果测定样品中的所述分析物。

实施方案2. 实施方案1的方法，其中竞争结合分子是结合所述分子的基本上相同或相同的亚结构，在一个实施方案中，其中竞争结合所述分析物是结合所述分析物的基本上相同或相同的亚结构，在一个实施方案中，其中竞争结合所述捕获化合物是结合所述至少一种（在一个实施方案中所有）捕获化合物的基本上相同或相同的亚结构。

实施方案3. 实施方案1或2的方法，其中所述不同的捕获化合物是生物分子，在一个实施方案中，生物大分子，在另一个实施方案中多肽。

实施方案4. 实施方案1至3中任一项的方法，其中所述两种不同的捕获化合物是病毒多肽的变体，在一个实施方案中，病毒衣壳多肽的变体。

实施方案5. 实施方案1至4中任一项的方法，其中所述两种不同的捕获化合物是肝炎病毒衣壳多肽的变体，在一个实施方案中，乙型肝炎病毒(HB)衣壳多肽的变体，在另一个实施方案中，HB核心(HBc)抗原的变体。

实施方案6. 实施方案1至2中任一项的方法，其中所述第二捕获化合物是作为第一捕获化合物的抗体的变体；或其中所述第一和第二捕获化合物是识别基本相同的表位的抗体。

实施方案7. 实施方案1至6中任一项的方法，其中所述第二捕获化合物通过以下至少一种来衍生或可衍生自所述第一捕获化合物：

(i)将至少一个氨基酸交换引入所述第一捕获化合物的氨基酸序列，

(ii)在与所述第一捕获化合物相比不同的细胞背景中产生所述第二捕获化合物，

(iii)与所述第一捕获化合物相比，除去或阻止所述第二捕获化合物的糖基化，

(iv)通过与所述第一捕获化合物相比不同的方式和/或通过不同的方法纯化所述第二捕获化合物，

(v)在与所述第一捕获化合物相比不同的条件下变性和/或重折叠所述第二捕获化合物，和

(vi)在与所述第一捕获化合物相比不同的条件下储存所述第二捕获化合物。

实施方案8. 实施方案1至7中任一项的方法，其中所述分析物是生物大分子。

实施方案9. 实施方案1至8中任一项的方法，其中所述分析物是多肽。

实施方案10. 实施方案1至9中任一项的方法，其中所述分析物是针对病毒抗原的抗体，在一个实施方案中针对病毒多肽的抗体，在另一个实施方案中针对病毒衣壳多肽的抗体。

实施方案11. 实施方案1至10中任一项的方法，其中所述分析物是针对肝炎病毒衣壳多肽的抗体，在一个实施方案中，针对乙型肝炎病毒(HB)衣壳多肽的抗体，在另一个实施方案中，针对HB核心(HBc)抗原的抗体。

实施方案12. 实施方案9至11中任一项的方法，其中由所述捕获化合物结合的表位具有共同的至少3个氨基酸。

实施方案13. 实施方案1至12中任一项的方法，其中所述测定分析物定性或定量地测定所述分析物的量。

实施方案14. 实施方案1至13中任一项的方法，其中步骤a)包括使2至10种所述分析物的捕获化合物，在一个实施方案中，2至5种所述分析物的捕获化合物，在一个实施方案中，2至4种捕获化合物，在一个实施方案中，2至3种所述分析物的捕获化合物与所述样品接触。

实施方案15. 实施方案1至14中任一项的方法，其中所述指定剂包含被与指示剂结合的捕获化合物结合的分子的亚结构。

实施方案16. 实施方案1至15中任一项的方法，其中所述指定剂是包含分析物和指示剂的化合物。

实施方案17. 实施方案1至16中任一项的方法，其中所述指定剂由共价结合至指示剂的分析物组成。

实施方案18：实施方案1至17中任一项的方法，其中所述捕获化合物不包含在多克隆抗血清中，在一个实施方案中不是多克隆抗体。

实施方案19. 实施方案1至18中任一项的方法，其中所述第一和第二捕获化合物不竞争结合干扰化合物。

实施方案20. 实施方案1至19中任一项的方法，其包括步骤：

c)测定包含所述指定剂和捕获化合物的复合物的量；和

d)基于步骤c)的结果测定样品中的所述分析物。

实施方案21. 用于测定疑似包含所述分析物的样品中的分析物的方法，其包括

a) 使所述样品与至少所述分析物的第一和第二检测剂化合物接触，其中所述第一和第二检测剂化合物是不同的检测剂化合物，且其中所述检测剂化合物竞争结合所述分析物；

b) 使包括至少所述分析物的所述样品的成分与固体表面结合，

c) 测定包含与所述固体表面结合的检测剂化合物的复合物的量；和

d) 基于步骤c)的结果测定样品中的所述分析物。

实施方案22. 实施方案22的方法，其中所述分析物包含抗体，在一个实施方案中为抗体。

实施方案23. 实施方案21至22中任一项的方法，其中所述检测剂化合物还包括指示剂。

实施方案24. 实施方案15至17或23中任一项的方法，其中所述指示剂是具有可检测性质、在一个实施方案中光学或/和酶学性质的化合物。

实施方案25. 实施方案20至24中任一项的方法，其中所述第一和第二检测剂化合物不竞争结合干扰化合物。

实施方案26. 实施方案20至25中任一项的方法，其中步骤a)在步骤b)之后进行。

实施方案27. 改善以下的特异性的方法：

(a)(i)用于测定分析物的间接免疫测定法或(ii)用于测定分析物的双抗原夹心免疫测定法，其包括：

通过不同的捕获化合物替代至少10％，在一个实施方案中，至少25％，在另一个实施方案中，至少40％，在另一个实施方案中，至少45％，在另一个实施方案中，约50％的捕获化合物，其中被替代的捕获化合物与引入的捕获化合物竞争结合所述分析物；或者

(b)用于测定分析物的双抗原夹心免疫测定法，其包括：

通过不同的检测剂化合物替代至少25％，在一个实施方案中，至少40％，在另一个实施方案中，至少45％，在另一个实施方案中，约50％的检测剂化合物，其中被替代的检测剂化合物与引入的检测剂化合物竞争结合所述分析物，且其中所述至少一种捕获化合物和至少一种检测剂化合物是不同的所述分析物的捕获化合物。

实施方案28. 实施方案1至27中任一项的方法，其中所述捕获化合物和/或结合所述分析物的所述检测剂化合物中的化学结构在所有所述不同的捕获化合物和/或所有所述不同的检测剂化合物中是相同的。

实施方案29.

用于检测样品中的分析物的试剂盒，其包含

(i)所述分析物的至少两种不同的捕获化合物，在一个实施方案中，2至10种所述分析物的捕获化合物，在一个实施方案中，2至5种所述分析物的捕获化合物，在一个实施方案中，2至4种捕获化合物，在一个实施方案中，2至3种所述分析物的捕获化合物，其中所述捕获化合物竞争结合所述分析物；或

(ii)所述分析物的至少两种不同的检测剂化合物，在一个实施方案中，2至10种所述分析物的检测剂化合物，在一个实施方案中，2至5种所述分析物的检测剂化合物，在一个实施方案中，2至4种检测剂化合物，在一个实施方案中，2至3种所述分析物的检测剂化合物，其中所述检测剂化合物竞争结合所述分析物。

实施方案30. 实施方案29的试剂盒，其还包含用于固定所述捕获化合物的固体支持物或包含至少所述分析物的所述样品的组分。

实施方案31. 用于测定样品中的分析物的设备，其包含

(ii)所述分析物的至少两种不同的检测剂化合物，在一个实施方案中，2至10种所述分析物的检测剂化合物，在一个实施方案中，2至5种所述分析物的检测剂化合物，在一个实施方案中，2至4种检测剂化合物，在一个实施方案中，2至3种所述分析物的检测剂化合物，其中所述检测剂化合物竞争结合所述分析物，和任选地用于测定所述检测剂化合物中包含的指示剂的光学或/和酶性质的装置。

实施方案32. 组合物，其包含

(i)指示疾病的分析物的至少两种不同的捕获化合物，其中所述捕获化合物竞争结合所述分析物，或

(ii)指示疾病的分析物的至少两种不同的检测剂化合物，其中所述检测剂化合物竞争结合所述分析物；

其用于诊断疾病。

实施方案33. (i)用于分析物的至少两种不同的捕获化合物，其中所述捕获化合物竞争结合所述分析物；和/或

(ii)用于分析物的至少两种不同的检测剂化合物，其中所述检测剂化合物竞争结合所述分析物；

用于制造诊断组合物或诊断设备的用途。

实施方案34. 用于实施方案32的或用于实施方案33的组合物，其中所述疾病是病毒性肝炎。

实施方案35. 包含以下的组合物用于测定样品中的分析物的用途：(i)第一和第二捕获化合物，其中所述第一和第二捕获化合物是不同的捕获化合物，且其中所述捕获化合物竞争结合所述分析物；或(ii)第一和第二检测剂化合物，其中所述第一和第二检测剂化合物是不同的检测剂化合物，且其中所述检测剂化合物竞争结合所述分析物。

附图简要说明

将在后续的实施方案的描述中，在一个实施方案中，结合从属权利要求来更详细地公开本发明的另外的任选的特征和实施方案。其中，各个任选的特征可以以分离的方式以及任何任意可行的组合来实现，如本领域技术人员将实现。本发明的范围不受公开的实施方案的限制。在附图中示意性地描绘实施方案。其中，这些图中相同的参考数字是指相同或功能相当的要素。

在图中：

图1 示意性地表示如应用于竞争性测定法的本发明的原理；a：分析物，s：指定剂，c1：捕获化合物1，c2：捕获化合物2，i1: 干扰剂1，i2：干扰剂2。A)在分析物不存在的情况下，指定剂与捕获化合物1结合。B)在分析物存在的情况下，分析物结合捕获化合物1并防止指定剂结合捕获化合物1。C)在对捕获化合物1具有亲和力(但对捕获化合物2没有)的干扰剂1存在的情况下，干扰剂1结合捕获化合物1，因此防止指定剂结合。D)在对捕获化合物2具有亲和力(但对捕获化合物1没有)的干扰剂2存在的情况下，干扰剂2不结合捕获化合物1，因此允许指定剂结合捕获化合物1。相反，E)在对捕获化合物1具有亲和力(但对捕获化合物2没有)的干扰剂1不结合捕获化合物2，因此允许指定剂结合捕获化合物2；且F)干扰剂2的确结合捕获化合物2，因此防止指定剂结合。(G)和H)) 在例如以1:1比率使用捕获化合物1和2的情况下，由干扰剂1或干扰剂2诱导的假信号降低将降低至约50％。

图2 示意性地显示抗肝炎核心(HBc)抗原抗体的竞争性测试的测试原理。HBc：乙型肝炎核心抗原；α-HBc：抗HBc抗原抗体；以双周长描绘的非缀合的α-HBc抗体是可能存在于来自患者的样品中的抗体，以单周长描绘的缀合抗体是在测定期间添加的α-HBc抗体；用Ru：钌-络合物或bio：生物素缀合；strp: 固体支持物的链霉抗生物素蛋白-涂层。A)在分析物(α-HBc抗体)不存在的情况下，Ru-缀合和bio-缀合的α-HBc抗体可以结合添加至测定混合物的HBc。经由bio-strp-相互作用，所述络合物与固体支持物结合，并且在洗涤后，可以测量由Ru-缀合产生的信号。B)在分析物(α-HBc抗体)存在的情况下，防止α-HBc-bio抗体和Ru-缀合的抗体结合添加至测定混合物的HBc，因此防止络合物与固体支持物的结合。因此，洗涤后，不能从Ru-络合物产生信号，因为这将被洗掉。在图2中，HBc以及α-HBc-bio缀合物是捕获化合物复合物的一部分。

图3 示意性地表示如应用于双抗原夹心(DAGS)形式的本发明的原理。a：分析物，d：检测剂化合物，c1：捕获化合物1，c2：捕获化合物2，i1：干扰剂1，i2：干扰剂2。A)在分析物不存在的情况下，没有分析物结合至固定在固体支持物上的捕获化合物1(或2)，因此，将在洗涤步骤中洗掉检测剂化合物。B)在分析物(例如，抗体)存在的情况下，分析物结合捕获化合物1和检测剂化合物，因此介导检测剂化合物与固体表面的结合。C)在结合捕获化合物1和检测剂化合物，但不结合捕获化合物2的干扰剂1存在的情况下，检测剂化合物变得经由与干扰剂1的相互作用固定至固体支持物。D)在结合捕获化合物2和检测剂化合物、但不结合捕获化合物1的干扰剂2存在的情况下，检测剂化合物不经由干扰剂1固定至固体支持物。相反，E)在干扰剂存在的情况下，检测剂化合物不经由与干扰剂2的相互作用固定至固体支持物；且F)在干扰剂2存在的情况下，检测剂化合物将经由捕获化合物2固定至固体支持物。(G)和H)) 在例如以1:1比率使用捕获化合物1和2的情况下，由干扰剂1或干扰剂2诱导的假信号增加将降低至约50％。可以加上必要变更地绘制用于使用两种不同的检测剂化合物。

实施方案的详述：

实施例1

重组乙型肝炎核心抗原的克隆和纯化

编码乙型肝炎核心抗原(HBcAg)的合成基因购自Eurofins MWG Operon(Ebersberg, Germany)。基于Novagen (Madison, WI, USA)的pET24a表达质粒，进行以下克隆步骤。用BamH1和Xho1消化载体，并***包含HBcAg的盒。将所得质粒的***物测序，并发现其编码所需蛋白。所得蛋白的氨基酸序列显示于本发明的序列方案中。重组HBcAg不含C-端六组氨酸标签。

根据以下方案纯化重组HBcAg。使携带表达质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)细胞在加有卡那霉素(30 µg/ml)的LB培养基中生长至OD600为1，并通过添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至1mM的最终浓度而诱导细胞溶质过表达，生长温度为37℃。诱导后4小时，通过离心(5000 x g，20分钟)而收获细胞，冷冻并储存于-20℃。对于细胞裂解，将冷冻的沉淀物重悬浮于每50 ml缓冲液(蛋白酶抑制剂混合物) 25mM磷酸钠pH 8.5、6 mM MgCl₂、10 U/mlBenzonase^®、1片Complete^®和1片Complete^® EDTA-free中，并通过高压均质化来裂解所得悬浮液。将粗裂解物离心，并用硫酸铵(35% w/v)沉淀上清液中的HBcAg。另外离心后，将沉淀物重新悬浮并针对磷酸盐缓冲液透析，随后为加热步骤(70℃，30分钟)。离心后，将澄清的上清液施加到在25mM磷酸钾pH 7中预平衡的Toyopearl DEAE 650-11柱(来自TosohBioscience)上。然后通过施加梯度至500mM的氯化钾浓度来洗脱蛋白。最后，将蛋白进行大小排阻色谱(S400)，并合并含蛋白的级分。

实施例2

用于以竞争性测试形式检测抗HBc抗体的免疫测定

在自动化Cobas e®分析仪(Roche Diagnostics GmbH)中在竞争性抗HBc ECLIA(电化学发光免疫测定)中分析来自一组健康献血者的血清样品中抗HBc抗体的存在。Cobase®和Elecsys®是Roche集团的注册商标。样品用至少一种CE标记的抗-HBc测定法测试为阴性，所述CE标记的抗-HBc测定法不同于Elecsys® 抗-HBc测定法并且可商购。

在测定中，血清与HBc反应。在添加生物素化抗体和钌络合物(三(2,2'-联吡啶)钌(II)-络合物；(Ru(bpy)32+)-标记的抗体，两者对HBcAg特异性，与链霉抗生物素蛋白包被的微粒一起)之后，HBc-抗原上的仍可用的（still-free）结合位点变得被占据。整个复合物经由生物素和链霉抗生物素蛋白的相互作用而与固相结合。在除去未结合的物质后，向电极施加电压，并在铂电极处激发后诱导在620nm的化学发光，其通过光电倍增管测量。

高测量值表示添加的生物素化抗体和钌络合物标记的抗体的结合以及因此样品中不存在抗HBc抗体。在样品中存在抗HBc抗体的情况下，这些抗体与两种类型的测定特异性抗体竞争结合抗原HBcAG，导致在铂电极处激发后620nm处的发光减少。信号输出为任意光单位。

因此，具有高于截止指数1.0的测量值的样品被认为是不反应的，而具有低于或等于截止指数1.0的测量值的样品被认为是反应的。

基于竞争性Elecsys® 抗HBc测定形式，测试了三种不同的HBcAg设置。“HBcAg X”是指包含SEQ ID NO:2的抗原；“HBcAg Y”是指包含SEQ ID NO:1的抗原。只有抗原设置被修饰，所有其它试剂和条件保持不变。应用HBcAg X和Y的组合作为第一和第二捕获化合物不影响真阳性(感染)样品的结果(数据未显示)。表1仅是指样品组的差异(=假)阳性结果。三种不同的设置如下：

A) HBcAg X用作竞争性抗HBc测定中的靶标。

B) HBcAg Y(略微不同于HBcAg Y)用作竞争性抗HBc测定中的靶标。

C) HBcAg X和HBcAg Y的组合一起用作竞争性抗HBc测定中的靶标。

表1显示竞争性抗HBc-ECLIA(电化学发光免疫测定)的结果。使用针对HBc抗原的抗体阴性的市售血清(巴伐利亚红十字会)作为样品。表1仅列出具有差异发现的那些结果。不同的HBcAG显示差异阳性抗HBc结果的个体模式。当使用HBc-抗原(HBcAG)的两种不同制备物时，当使用HBcAG X时，11个样品被测试为(假)阳性(反应性)，仅当使用第二HBcAG Y时7个样品被测试为(假)阳性，而2个样品用HBcAG X和HBcAG Y测试为(假)阳性。相比之下，当使用两种抗原(即HBcAG X和HBcAG Y)的1:1混合物时，这18个样品中只有5个被测试为阳性，使假阳性测试次数减少超过3倍。详细地，当使用所述两种抗原( HBcAG X和HBcAG Y)的1:1混合物时，使用仅HbcAG X测试为假阳性的样品数量从11降低至3，而仅使用HBcAGY测试假阳性的样品数量在从9降低至5。如所预期，两个样品用两种抗原都测试为假阳性(样品编号2942和3657)，并且用混合物也测试为假阳性。

因此，当将至少两种略微不同的HBc抗原作为混合物应用时，这种竞争性免疫测定的特异性增加。

通过在基于竞争性测试形式的方法中应用使用两种略微不同的第一和第二分析物的捕获化合物的原理，可以显著增加特异性，即可以在相当程度上避免假阳性结果。

表 1：竞争性抗HBc ECLIA(电化学发光免疫测定)的结果，COI：截止指数。

。

序列表

<110> Roche Diagnostics GmbH

F. Hoffmann-La Roche AG

<120> 降低干扰的方法

<130> RD11433PC

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 185

<212> PRT

<213> 乙型肝炎病毒

<400> 1

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp

20 25 30

Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys

35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu

50 55 60

Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala

65 70 75 80

Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys

85 90 95

Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg

100 105 110

Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr

115 120 125

Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro

130 135 140

Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg

145 150 155 160

Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg

165 170 175

Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys

180 185

<210> 2

<211> 183

<212> PRT

<213> 乙型肝炎病毒

<400> 2

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp

20 25 30

Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys

35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp

50 55 60

Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Pro Ala

65 70 75 80

Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys

85 90 95

Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg

100 105 110

Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr

115 120 125

Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro

130 135 140

Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr

145 150 155 160

Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser

165 170 175

Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys

180

Claims

1.用于测定疑似包含分析物的样品中的所述分析物的方法，其包括：

a)使所述分析物的至少第一和第二捕获化合物与所述样品接触，其中所述第一和第二捕获化合物是不同的捕获化合物，其在至少一种化学和/或物理性质方面可测量地不同，其中所述至少一种化学和/或物理性质不是指示剂，且不是与所述捕获化合物与固体表面的结合相关的性质，其中所述捕获化合物竞争结合所述分析物，其中所述第一和第二捕获化合物不竞争结合干扰化合物，且其中所述捕获化合物是多肽；

b)使与所述样品接触的所述捕获化合物与结合至指示剂的指定剂接触，其中所述指定剂与所述分析物竞争结合所述捕获化合物；

c)测定包含所述指定剂和捕获化合物的复合物的量；和

d)基于步骤c)的结果测定样品中的所述分析物。

2.权利要求1的方法，其中竞争结合是结合所述分析物、干扰化合物或捕获化合物的基本上相同或相同的亚结构。

3.权利要求1或2的方法，其中所述多肽是HB核心(HBc)抗原。

4.权利要求1或2的方法，其中所述第二捕获化合物通过以下至少一种衍生自所述第一捕获化合物：

(iv)与所述第一捕获化合物相比通过不同的方式和/或通过不同的方法纯化所述第二捕获化合物，

5.权利要求1或2的方法，其中所述分析物是针对病毒抗原的抗体。

6.权利要求1或2的方法，其中步骤a)包括使2至3种所述分析物的捕获化合物与所述样品接触。

7.权利要求1或2的方法，其中结合所述分析物的所述捕获化合物中的化学结构在所有所述不同的捕获化合物中是相同的。

8.用于检测样品中的分析物的试剂盒，其包含：

至少两种不同的捕获化合物，其在至少一种化学和/或物理性质方面可测量地不同，其中所述至少一种化学和/或物理性质不是指示剂，且不是与所述捕获化合物与固体表面的结合相关的性质，其中所述捕获化合物竞争结合所述分析物，其中所述捕获化合物不竞争结合干扰化合物，且其中所述捕获化合物是多肽，

和与指示剂结合的指定剂，其中所述指定剂与所述分析物竞争结合所述捕获化合物。

9.权利要求8的试剂盒，其还包含用于固定所述捕获化合物或包含至少所述分析物的所述样品的组分的固体支持物。

10.用于测定样品中的分析物的设备，其包括(i)用于测量所述样品中所述分析物的量的分析单元和(ii)用于处理所得数据的计算机单元，其中所得数据用于评估，所述设备包含：

至少两种不同的捕获化合物，其在至少一种化学和/或物理性质方面可测量地不同，其中所述至少一种化学和/或物理性质不是指示剂，且不是与所述捕获化合物与固体表面的结合相关的性质，其中所述捕获化合物竞争结合所述分析物，其中所述捕获化合物不竞争结合干扰化合物，且其中所述捕获化合物是多肽；和与指示剂结合的指定剂，其中所述指定剂与所述分析物竞争结合所述捕获化合物。

11.组合物，其包含：

至少两种不同的捕获化合物，其在至少一种化学和/或物理性质方面可测量地不同，其中所述至少一种化学和/或物理性质不是指示剂，且不是与所述捕获化合物与固体表面的结合相关的性质，其中所述捕获化合物竞争结合分析物，其中所述捕获化合物不竞争结合干扰化合物，且其中所述捕获化合物是多肽；和与指示剂结合的指定剂，其中所述指定剂与所述分析物竞争结合所述捕获化合物；

其用于诊断疾病。

12.权利要求11的组合物，其中所述疾病是病毒性肝炎。

13.(i)包含第一和第二捕获化合物的组合物和(ii)与指示剂结合的指定剂用于测定样品中的分析物的用途，其中所述第一和第二捕获化合物是不同的捕获化合物，其在至少一种化学和/或物理性质方面可测量地不同，其中所述至少一种化学和/或物理性质不是指示剂，且不是与所述捕获化合物与固体表面的结合相关的性质，其中所述捕获化合物竞争结合所述分析物，其中所述第一和第二捕获化合物不竞争结合干扰化合物，其中所述捕获化合物是多肽，且其中所述指定剂与所述分析物竞争结合所述捕获化合物。

14.(i)用于分析物的至少两种不同的捕获化合物，其中所述捕获化合物竞争结合所述分析物；和与指示剂结合的至少一种指定剂，其中所述指定剂与所述分析物竞争结合所述捕获化合物；

用于制造诊断组合物或诊断设备的用途。

15.组合物在制备用于诊断疾病的试剂盒中的用途，所述组合物包含：

至少两种不同的捕获化合物，其在至少一种化学和/或物理性质方面可测量地不同，其中所述至少一种化学和/或物理性质不是指示剂，且不是与所述捕获化合物与固体表面的结合相关的性质，其中所述捕获化合物竞争结合分析物，其中所述捕获化合物不竞争结合干扰化合物，且其中所述捕获化合物是多肽；和与指示剂结合的指定剂，其中所述指定剂与所述分析物竞争结合所述捕获化合物。

16.权利要求15的用途，其中所述疾病是病毒性肝炎。