JPH09511577A

JPH09511577A - 慢性肝炎ｂ型ウイルス感染の診断方法

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Publication number: JPH09511577A
Application number: JP7525885A
Authority: JP
Inventors: アール．ミリチ，デイヴィッド; マルヤマ，トシユキ; ショーデル，フロリアン; ピーターソン，ダレル
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1994-03-31
Filing date: 1995-03-31
Publication date: 1997-11-18
Also published as: EP0754243A1; WO1995027083A1; CA2186338A1; EP0754243A4; AU696608B2; US5726011A; AU2204195A

Abstract

(57)【要約】ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）のコア抗原に結合するヒト抗体は、急性Ｂ型肝炎患者と比べて慢性Ｂ型肝炎患者において上昇する。抗ＷＨＶコア抗原抗体のレベルを検出するイムノアッセイを用いて、慢性Ｂ型肝炎患者と急性Ｂ型肝炎患者とを識別することができる。

Description

【発明の詳細な説明】慢性肝炎Ｂ型ウイルス感染の診断方法この発明は、米国立衛生研究所により与えられた認可番号ＡＩ−２０７２０の下、政府の援助で成された。政府は、この発明について、一定の権利を有する。発明の背景１．発明の分野本発明は、一般的に肝炎Ｂ型ウイルス（ＨＢＶ）に関するものであり、特に慢性肝炎Ｂ型ウイルス感染の診断方法に関するものである。２．関連技術の説明肝炎Ｂ型ウイルスの感染は、世界的な健康上の問題であり、慢性キャリアーはアジア及びアフリカの人口の約１０％を占める。慢性活動性肝炎、肝硬変及び肝細胞性悪性腫瘍は、ＨＢＶ関連の死亡率の主な原因となっている。慢性的キャリアー及び新たな感染者の両者ともに、そのような合併症により死亡する危険がある。ある一つの重大な感染経路は、活動性感染者又は慢性キャリアーである母親から生まれた新生児の分娩時の感染である。他の感染経路としては、他の健康上の問題に対処するために用いられる汚染した血液又は血液製剤がある。ＨＢＶの感染は、往々にして潜伏性の若しくは急性の自己限定性肝臓病となるか、又は長期慢性感染となり得る。ＨＢＶ慢性感染は、慢性活動性肝炎（ＣＡＨ）の最も重篤な形態からそれほど重篤でない慢性持続性肝炎（ＣＰＨ）、さらには無症状のキャリアー（ＡＳＣ）の状態に至るまでの広範な疾病を誘起する。最近、多数の診断上のアッセイが開発されたことにより、肝炎Ｂ型ウイルス感染をウイルス性肝炎の他の形態（すなわち、ＨＡＶ、ＨＥＶ、ＨＣＶ）から区別する点で、臨床医の助けとなっている。しかしながら、急性Ｂ型肝炎（ＡＨ−Ｂ）感染と症候性慢性Ｂ型肝炎（ＣＨ−Ｂ）感染とを区別する可能性については、未だ問題が残る。ＣＡＨ及びＣＰＨの患者がしばしば示すように、肝炎の周期的なパターンは正常な肝機能と肝障害の急性悪化（Ａ．Ｅ．）とを交互に繰り返すことを特徴とするのであるから、このことは特に明らかである。ＨＢＶに感染すると、多量のウイルスと関連粒子が血清中に存在する。感染の症候期には、急性及び慢性ＨＢＶ患者の両者ともに、肝臓酵素レベルが上昇し、血清中にＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）をもち、ヌクレオキャプシド抗原（ＨＢｃＡｇ）に対する抗体を産生する。ＨＢｓＡｇ又はＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）に特異的な抗体は検出されない。ＨＢｓＡｇに対する抗体の出現が観察されるのは、たいてい循環ＨＢｓＡｇが消失してから２ヵ月後である。血清中のウイルス粒子は、その表面コードをぬぎすてて、コア抗原（ＨＢｃＡｇ）として知られるヌクレオキャプシドを露出していることが知られている。ＨＢｃＡｇに対する抗体生成は、ＨＢＶ感染の急性期の初期段階に起こり、長年持続し得る。そして、慢性感染患者は高力価の抗ＨＢｃ抗体を産生する。従来の研究より、ＨＢＶ及びウッドチャック肝炎ウイルス（woodchuck hapati tis virus:ＷＨＶ）のヌクレオキャプシドは交差反応性エピトープを共有することが示されている(Wernerら，J.Virol．1:314，1979; Millmanら,Infection and Immunity 2:752, 1982; Stannardら,J.Gen.Virol. 64:975, 1983; Ponzettoら, Virus Research 2:301，1985)。ヒト抗ＨＢｃ抗体がウッドチャック肝炎ヌクレオキャプシド抗原（ＷＨｃＡｇ）を認識するかどうか、又はＨＢＶ感染の異なる段階における患者からの血清をＷＨｃＡｇに対する異なる反応性に基づいて区別できるかどうかは、本発明以前には知られていなかった。ほとんどのウイルス感染と異なり、急性及び慢性ＨＢＶ感染患者は、しばしばＩｇＭ抗ＨＢｃ抗体とＩｇＧ抗ＨＢｃ抗体の両者を産生する。それゆえ、ＩｇＭ抗ＨＢｃの単なる存在は、急性感染の診断に役に立たない。しかしながら、より高レベルのＩｇＭ抗ＨＢｃは、慢性感染と比較すると一般的に急性期の間に産生され、この量的相違は、慢性感染の急性悪化から急性ＨＢＶ感染を区別するための、血清学上の唯一の手段となっている。慢性ＨＢＶ感染から急性ＨＢＶ感染を区別する際のＩｇＭ抗ＨＢｃアッセイの有用性にも、問題が提起されている。予後の及び可能な治療法の点から、急性ＨＢＶ感染と慢性ＨＢＶ感染とを区別することは重要である。かくして、慢性ＨＢＶ感染患者から急性ＨＢＶ感染患者を区別するための、簡便、安価、かつ確実なアッセイが必要である。本発明は、そのようなアッセイを提供する。本発明の概要本発明は、ＨＢｃＡｇ^Wに対する抗体のレベルに基づいて急性Ｂ型肝炎ウイルス感染患者と慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染患者とを容易に区別できるという予期せざる知見に基づくものである。一つの態様において、本発明は、患者のＩｇＧ抗ウッドチャック肝炎コア抗原抗体を検出することによって、患者の慢性ＨＢＶ感染を診断するアッセイを提供する。他の態様において、上記のアッセイをＩｇＭ抗ＨＢｃＡｇ抗体の検出とともに実施し、ＩｇＭ抗ＨＢｃＡｇ抗体：ＩｇＧ抗ＨＢｃＡｇ^W抗体の比を決定する。さらに他の態様において、本発明は、抗ＨＢｅ抗体、ＨＢｅＡｇ／抗ＨＢｅ免疫複合体（ＩＣ）、及びＨＢｓＡｇ／抗ＨＢｓＩＣ（これらすべては、急性Ｂ型肝炎患者に対して慢性Ｂ型肝炎患者では顕著に増加している）の血清レベルの検出を含む一連のアッセイを提供する。図面の簡単な説明図１は、急性Ｂ型肝炎（ＡＨ−Ｂ）患者と慢性Ｂ型肝炎（ＣＨ−Ｂ）患者とにおける、抗ＨＢｅ（パネルＡ）、ＨＢｅＡｇ／抗ＨＢｅＩＣ（パネルＢ）、及びＨＢｓＡｇ／抗ＨＢｓＩＣ（パネルＣ）の血清レベルの比較である。図２は、急性Ｂ型肝炎（ＡＨ−Ｂ）患者と慢性Ｂ型肝炎（ＣＨ−Ｂ）患者とにおける、抗ＨＢｃ、ＩｇＭ抗ＨＢｃ、ＩｇＧ抗ＨＢｃ^Wの血清レベル、及びＩｇＭ抗ＨＢｃ／ＩｇＧ抗ＨＢｃ^W比の比較である（パネルＡ＝総抗ＨＢｃ、パネルＢ＝ＩｇＭ抗ＨＢｃ、パネルＣ＝ＩｇＧ抗ＨＢｃ^W、及びパネルＤ＝ＩｇＭ抗ＨＢｃ／ＩｇＧ抗ＨＢｃ^W比）。図３は、ＡＨ−Ｂ（△−△）患者及びＣＨ−Ｂ（○−○）患者の血清中の抗ＨＢｃ^WＩｇＧの終点滴定である（▲−▲＝正常ヒト血清（ＮＨＳ））。図４は、ＡＨ−Ｂ患者及びＣＨ−Ｂ患者におけるＨＢｃＡｇに対する抗体生産の動態を表す。ＩｇＭ抗ＨＢｃ（●−●）、ＩｇＧ抗ＨＢｃ（▲−▲）、及びＩｇＧ抗ＨＢｃ^W（△−△）について、ＡＨ−Ｂ（パネルＡ）及びＣＨ−Ｂ（パネルＢ）からの連続した血清サンプルを分析したものである。図５は、ＣＨ−Ｂ患者の血清学的なプロフィールを表す。最上のパネルは、標準的な血清学的パラメーターを示す。図６は、ＣＨ−Ｂ患者の血清の抗原阻害アッセイである。パネルＡは抗ＨＢｃ^W であり、パネルＢは抗ＨＢｃであり、これらは、直接ＥＩＡにより分析した（ＨＢｅＡｇ，▲−▲；ＨＢｃＡｇ，○−○；及びＷＨｃＡｇ，△−△）。図７は、ウッドチャックＨｃＡｇ変性に対する抗ＨＢｃ^Wの反応性の感度を示す（Ｍａｂ２２２１，△−△；Ｒａ−ＷＨＣ，▲−▲；Ｍａ−ＷＨＣ，▲----▲ ；Ｈａ−ＨＢｃ^W，○−○）。発明の詳細な説明本発明は、ウッドチャック肝炎コア抗原（ＷＨｃＡｇ）に対する抗体を検出して急性Ｂ型肝炎と慢性Ｂ型肝炎とを区別するための、感度のよい新しいアッセイ法を提供する。このアッセイは、慢性Ｂ型肝炎感染患者がウッドチャック肝炎コア抗原と交差反応する抗ＨＢｃ抗体種（すなわち抗ＨＢｃ^W）を高血清レベルで保有しているという予期せざる発見に基づくものである。他の態様において、本発明は、抗ＨＢｅ抗体、ＨＢｅＡｇ／抗ＨＢｅ免疫複合体（immune complex：ＩＣ）およびＨＢｓＡｇ／抗ＨＢｓＩＣの血清レベルの検出を含む一連のアッセイを提供する。こうした物質はすべて急性Ｂ型肝炎患者に比べて慢性患者において著しく上昇することが本発明により明らかにされた。本発明は、慢性肝炎Ｂ型ウイルス（ＨＢＶ）感染の疑いがある被検者由来のサンプルを、ウッドチャック肝炎ウイルス抗原のアミノ酸配列を含みかつウッドチャック肝炎Ｂ型コア抗原に対する抗体と結合するエピトープと接触させ、該サンプル中のウッドチャック肝炎Ｂ型コア抗原と反応する抗体の存在を検出することを含んでなる、被検者における慢性ＨＢＶ感染の診断方法を提供する。被検者はどのような動物であってもよいが、ヒトが好ましい。本発明において用いる「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープに結合する抗原上の抗原決定基を指す。通常、エピトープ決定基はアミノ酸や糖側鎖のような化学的に活性な表面分子群からなり、一般に特定の三次元構造特性と特定の電荷特性を有する。サンプル中の抗ウッドチャック肝炎Ｂ型コア抗原抗体（抗ＨＢｃ^W）を検出するための本発明方法はin vitroで行われ、例えば、抗体を液相中で同定するか、または固相担体に結合した抗原もしくはエピトープに抗体を結合させて同定するイムノアッセイにより実施される。さらに、こうしたイムノアッセイで抗ウッドチャックＨＢｃ抗体を検出するための抗体は、様々な方法で検出可能に標識することができる。サンプル中の抗ウッドチャックＨＢｃ抗体の検出に利用されるイムノアッセイの種類としては、直接または間接のいずれかのフォーマットで実施される競合的および非競合的イムノアッセイが挙げられる。この種のイムノアッセイの例はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）とサンドイッチ（イムノメトリック）アッセイである。本発明方法を用いて抗体を検出するには、生理学的サンプルについての競合イムノアッセイおよび免疫組織化学的アッセイを含めて、フォワード、リバースまたは同時モードで実施されるイムノアッセイを利用することができる。当業者であればその他のイムノアッセイフォーマットについても熟知しており、過度の実験を行わなくとも簡単に確認できるだろう。ウッドチャックＨＢｃ抗原（ＷＨｃＡｇ）またはそのエピトープは多くの異なる担体に結合させて、サンプル中の抗ウッドチャックＨＢｃ抗体の検出に用いられる。公知の担体の例を挙げると、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および改質セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、マグネタイトなどがある。本発明の目的にとって、担体の性質は可溶性であっても不溶性であってもよい。当業者は抗原またはエピトープ結合用の他の適当な担体について熟知しており、ルーチンの実験作業によりそれを確認できるだろう。多くの異なる標識および標識方法が当業者に知られている。本発明において用いることのできる標識の種類を挙げると、例えば、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物、生物発光化合物などがある。当業者は本発明のモノクローナル抗体に結合させるための他の適当な標識について熟知しており、ルーチンの実験作業によりそれを確認できるだろう。さらに、こうした標識を本発明方法で用いる抗体に結合させるには、当業者に知られた標準的な技法を用いることができる。本発明のために、ウッドチャックＨＢｃＡｇに結合する抗体は抗ヒトＩｇＧ抗体を使って検出できる。検出可能量のウッドチャックＨＢｃＡｇ抗体を含むサンプルはどれも使用できる。サンプルは尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清などの液体でありうる。血清が好ましいサンプルである。また、本発明は、急性Ｂ型肝炎患者に比べて慢性患者において著しく上昇する抗ＨＢｅ抗体、ＨＢｅＡｇ／抗ＨＢｅ免疫複合体（ＩＣ）およびＨＢｓＡｇ／抗ＨＢｓＩＣの血清レベルの検出を含む一連のアッセイを提供する。これらの抗原および抗体の検出は抗ウッドチャック肝炎ウイルス抗体の検出について上述した方法に従って行われる。例えば、抗ＨＢｅ抗体を検出するためには、ＨＢｅ抗原またはエピトープを含むペプチドを固相支持体に固定して、その抗原とサンプル中の抗体とを反応させた後に抗ＨＢｅ抗体に結合する種特異的抗体を加える。同様に、サンプル中の免疫複合体は該複合体中の抗原と結合する二次抗体および該複合体中の抗体と結合する三次抗体との反応により検出できる。例えば、ＨＢｓＡｇまたはＨＢｅＡｇに特異的な非競合的モノクローナル抗体を固相支持体に固定し、血清サンプルを加えた後でヒトＩｇＧに対する標識モノクローナル抗体を加える。対照血清中の抗体およびＩＣのレベルと比べたときのサンプル（Ｐ）中の抗体およびＩＣのレベルを表すＰ／Ｎ比は、下限またはカットオフとして約２より大であることが好ましく、３より大であることが最も好ましい。有利には、サンプル血清と対照血清の吸光度（ＯＤ₄₉₂）値を測定して検出を行う。当業者はサンプル中の抗体またはＩＣのレベルを測定するための他の技術について熟知しているだろう。本発明のアッセイで用いる材料はキットの製造に申し分なく適している。こうしたキットはバイアル、チューブなどの１以上の容器手段を密着拘束状態で収容するように区画化されたキャリアー手段を含んでなり、それぞれの容器手段には該方法で用いる個々の要素が収納される。例えば、容器手段の１つはウッドチャックＨＢｃＡｇまたはウッドチャックＨＢｃＡｇエピトープを含み、もう１つの容器は検出可能に標識されているかまたは標識されうる抗ヒト抗体を含むことができる。キットの形に組み込むことができるアッセイの種類はたくさんあり、例えば競合的および非競合的アッセイが含まれる。本発明の抗体を利用しうるアッセイの代表例はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびイムノメトリックまたはサンドイッチイムノアッセイである。「イムノメトリックアッセイ」または「サンドイッチアッセイ」なる用語は同時サンドイッチ、フォワードサンドイッチおよびリバースサンドイッチイムノアッセイを含むものである。こうした用語は当業者によく理解されている。また、当業者であれば、本発明による抗体が、現在知られているか将来開発されるかもしれないアッセイの他の変法および形態にも有用であることが認識できるだろう。これらの変法および形態も本発明の範囲に含まれるものである。アッセイを行うにあたって、インキュベーション媒体（通常は可溶性の標識抗体が加えられる）中にいくつかの「遮断剤」を含めることが望ましいかもしれない。この「遮断剤」は、例えば実験サンプル中に存在する、非特異的なタンパク質、プロテアーゼ、または抗ＨＢｃ^Wイムノグロブリンに対する抗異種親和性イムノグロブリンが固相支持体上の抗体または放射性標識指示抗体と架橋したり、それを破壊したりして、偽陽性や偽陰性の結果を生じるのを回避するため加えられる。従って、「遮断剤」の選択は本発明において記載されるアッセイの特異性の実質的増加につながるかもしれない。アッセイに用いる抗体と同一のクラスまたはサブクラス（イソタイプ）（例：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＭなど）の無関係の（すなわち非特異的な）抗体を「遮断剤」として使用できることがわかった。適当な感度を維持し、しかも検体中に含まれる交差反応性タンパク質による望ましくない干渉を妨げるためには、「遮断剤」の濃度（通常は１〜１００μｇ／μｌ）が重要である。本発明のアッセイは、ＷＨｃＡｇ、ＨＢｃＡｇ^W、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｅＡｇ／抗ＨＢｅＩＣおよびＨＢｓＡｇ／抗ＡＢｓＡｇＩＣまたはそのフラグメントと免疫反応性の抗体を用いることを含む。実施例で用いたようなモノクローナル抗体は、公知の方法(Kohlerら，Nature，256:495，1975)により適当な宿主（例えばマウス）を全タンパク質の抗原含有フラグメントで免疫感作することにより作製できる。ここに記載のＩＣに対して反応性を有する抗体は市販されているか、Ma ruyamaら(J．Immunol．Meth.，155:65，1992)に記載されるとおりに製造することができる。ここで用いる「抗体」という用語は、完全な分子だけでなくそのフラグメント、例えば様々なＨＢＶまたはＷＨＶ抗原上のエピトープ決定基と結合しうるＦａｂおよびＦ（ａｂ’）₂も含むものである。以下の実施例は本発明を例示するものであって制限するものではない。それらは使用可能なものを代表するもので、当業者に知られた他の方法も過度の実験を繰り返すことなく採用しうるだろう。実施例１材料および方法１．組換え抗原および合成ペプチドａｙｗサブタイプの組換えＨＢｃＡｇ、ａｙｗサブタイプの組換えＨＢｅＡｇおよび組換えＷＨｃＡｇを、以前に記載された〔Schodelら，Vaccines 90，Cold Spring Harbor Laboratory，pp．193-198，1990; Schodelら，J．Biol．Chem. ，268:1332-1337，1993; Schodelら，Vaccine，6:624-628，1993（WHcAgのヌクレオチド／アミノ酸配列を示す）〕大腸菌ベクターから得た。ＷＨｃＡｇ配列から誘導される合成ペプチドはMerrifield固相法で合成し、Ｃ１８逆相カラムでＨＰＬＣにかけた。用いたペプチドはすべて単一の主要ピーク（＞９０％）として溶出されたものである。合成ペプチドはG.B．ThorntonによるR.W.Johnson Pharm aceutical Research Institute（La Jolla，CA）のペプチドライブラリー中に作製した。２．抗体組換えＨＢｃＡｇまたはＷＨｃＡｇで免疫感作することによりマウスポリクローナル抗ＨＢｃ、抗ＷＨｃおよびウサギポリクローナル抗ＷＨｃを生産した。ポリクローナルウサギ抗ＨＢｃはDAKO(CA)から購入した。モノクローナル（Ｍａｂ）抗ＨＢｃ(3105，3120)、抗ＨＢｅ(904，905)および抗ＨＢｅＡｇペプチド(222 1)抗体はM．Mayumi(自治医大)から提供されたものである(Takahashiら，J．Immu nol.，130:2903-2907，1983; Imaiら，J．Immunol.，128:69-72，1982; Takahas hiら，J．Immunol.，147:3156-3160，1991)。これらの抗体は日本のInstitute o f Immunologyから購入できる。モノクローナル抗ＨＢｃ(440,442)および抗ＨＢｅ(420,422,426)抗体はミドリ十字（日本、大阪）から購入した。ペルオキシダーゼ結合Ｍａｂ抗ヒトＩｇＧはOrtho Diagnostics(NJ)から提供された。ペルオキシダーゼ結合ポリクローナルヤギ抗マウスまたはウサギＩｇはBoehringer Man nheim(IN)から購入した。３．直接固相エンザイムイムノアッセイ固相エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）を用いて血清の抗ＨＢｃ^W、ＩｇＧ抗ＨＢｃ、ＩｇＭ抗ＨＢｃまたは抗ＨＢｅレベルを測定した。マイクロタイタープレートに組換えＷＨｃＡｇ、ＨＢｃＡｇまたはＨＢｅＡｇを４℃で一夜コーティングし（５０ｎｇ／ウェル）、プレートを１％ＢＳＡ、0.005% Tween 20、５％熱不活化ヤギ血清を含むＰＢＳ（遮断バッファー）５０μｌとともに３７℃で１時間プレインキュベートした。ヒト血清を遮断バッファーで１／５００に希釈し、プレートに加えて２時間インキュベートした。次に、プレートを５０μｌのペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧ（１：３０００）または抗ヒトＩｇＭ（１：１０００）とともに２時間インキュベートした。最後に、プレートを５０μｌのｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）とともに１０分間インキュベートして呈色させた。自動マイクロタイタープレートリーダーを使って吸光度を読み取った。データは少なくとも１５の対照血清の平均吸光度値に対するサンプル（Ｐ）の吸光度（ＯＤ₄₉₂）値を表すＰ／Ｎ比として表される。 Abbott Corzyme-Mキット(Abbott Labs，Chicago，IL)を使って製造業者の手順に従って血清ＩｇＭ抗ＨＢｃの定量も行った。陽性対照平均値（ＰＣ）の０．２５倍に陰性対照平均値（ＮＣ）をプラスしたカットオフ値（０．２５×ＰＣ＋ＮＣ）を計算し、製造業者に従ってサンプル／カットオフ比をカットオフ指数（C. I.）と定めた。同時に、直接ＥＩＡを用いて血清ＩｇＭ抗ＨＢｃの定量を行った。Corzyme-M キットと直接ＥＩＡで試験した血清のＩｇＭ抗ＨＢｃ値には高い相関関係が見られた（ｐ＜０．００１，ｒ＝０．６２，ｎ＝８６）。また、Abbott Corzymeキット(Abbott Labs，Chicago，IL)を使って製造業者の手順に従って総血清抗ＨＢｃの定量を行った。このアッセイでは、抗ＨＢｃを阻害パーセントとして表し、５０％より高い阻害率を抗ＨＢｃ陽性と見なした。４．ＨＢｓＡｇまたはＨＢｅＡｇ特異的免疫複合体の定量的アッセイヒト血清中のＨＢｓＡｇまたはＨＢｅＡｇ特異的免疫複合体を検出するために、固相ＥＩＡを開発した(Maruyamaら，J．Immunol．Meth.，155:65-75，1992)。簡単に説明すると、捕捉試薬としてＨＢｓＡｇに特異的なモノクローナル抗体(1 B1E7F7)(Ortho Diagnostic，N.J.)、またはＨＢｅＡｇ特異的ペプチドに特異的なモノクローナル抗体(2221)をプレートにコーティングした（０．５μｇ／ｍｌ）。これらの固相モノクローナル抗体（Ｍａｂ）を選択した理由は、それらが遊離の抗原だけでなく免疫複合体化した抗原とも結合することが以前に実証されていたためである。固相Ｍａｂをコーティングしたウェルに遮断バッファーで１／２５に希釈した試験血清を加え、２時間のインキュベーション後にプレートを洗った。その後、免疫複合体の血清抗ＨＢｓまたは抗ＨＢｅ抗体成分をヒトＩｇＧに対するペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体により検出した。データは、少なくとも１５の対照血清の平均吸光度値に対するサンプル（Ｐ）の吸光度（ＯＤ₄₉₂）値を表すＰ／Ｎ比として表される。５．患者急性Ｂ型肝炎（ＡＨ−Ｂ）患者２６人と、１２人の慢性持続性肝炎（ＣＰＨ）患者および４１人の慢性活動性肝炎（ＣＡＨ）患者を含む慢性Ｂ型肝炎（ＣＨ− Ｂ）患者５３人について研究した。ＡＨ−Ｂの診断は、最近の黄疸の発生と急性肝炎の他の典型的症状とともに、血清中のＨＢｓＡｇおよびＩｇＭ抗ＨＢｃ抗体の検出と関連した血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の上昇値（正常値の上限の少なくとも１０倍）が見られることに基づいていた。すべてのＡＨ−Ｂ患者は肝臓障害以前にはＨＢｓＡｇ陰性であることが判っていた。さらに、すべてのＡＨ−Ｂ患者は、ＡＬＴの正常化と血清からのＨＢｓＡｇのクリアランスを示して、疾病から完全に回復した。１年以上にわたり血清中のＨＢｓＡｇとＨＢｅＡｇが一貫して陽性であった本研究のＣＨ−Ｂ患者は組織学的検査によりＣＰＨまたはＣＡＨのいずれかであると診断された。すべてのＡＨ−Ｂ患者が東京大学の第一内科において継続管理された。全部の血清について、ＨＢｓＡｇ／抗ＨＢｓ、ＨＢｅＡｇ／抗ＨＢｅ、抗ＨＢｃ、ＩｇＭ抗ＨＢｃ、ＩｇＭ抗肝炎Ａ型ウイルス、抗ＨＤＶおよび抗ＨＣＶをエンザイムイムノアッセイの市販品( ＥＩＡ；Abbott Laboratories)を用いて検査し、さらにＩｇＭ抗ＨＢｃ、ＩｇＧ抗ＨＢｃ、抗ＨＢｅ、抗ＨＢｃ^WおよびＨＢｓＡｇまたはＨＢｅＡｇ特異的免疫複合体の実験的アッセイを直接固相ＥＩＡにより行った。ＡＨ−ＢおよびＣＨ− Ｂ患者は全員がＩｇＭ抗ＨＡＶ、抗ＨＤＶおよび抗ＨＣＶに関して陰性であった。新規な抗ＨＢｃ^Wアッセイのための対照として、健常者２６人、急性Ａ型肝炎患者７人、急性Ｃ型肝炎患者８人、慢性Ｃ型肝炎患者３０人、そしてＨＢｓＡｇ陽性でＨＢｅＡｇ陰性の慢性Ｂ型肝炎患者１０人から血清を採取した。ＨＢＶ−ＤＮＡはドットブロット法を使って判定された(Liebermanら，Hepato logy，3:285-291，1983)。簡単に説明すると、血清１０μｌを変性させ、減圧下でニトロセルロース膜にアプライした。³²Ｐで標識したクローン化ＨＢＶ−ＤＮＡ（比活性２〜４×１０⁸ｃｐｍ／μｇ）を用いてハイブリダイゼーションを行った。この膜をＸ線フィルム上で９６時間オートラジオグラフにかけた。連続希釈した既知量のクローン化ＨＢＶ−ＤＮＡを陽性対照として使用し、このアッセイでは０．５ｐｇのＨＢＶ−ＤＮＡが検出可能であった。すべてのアッセイにおける平均値の比較をスチューデントのｔテストで調べた。ｐ値＜０．０５のとき有意差ありと見なした。実施例２急性および慢性ＨＢＶ感染における抗ＨＢｅ、ＨＢｅＡｇ／抗ＨＢｅＩＣおよびＨＢｓＡｇ／抗ＨＢｓＩＣの保有率の比較急性Ｂ型肝炎（ＡＨ−Ｂ）患者２６人と慢性Ｂ型肝炎（ＣＨ−Ｂ）患者５３人からアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のピーク上昇期に採取した血清サンプルを（ＡＨ−Ｂ患者の平均ＡＬＴは１７９０±１３５１Ｕ／ｌ；ＣＨ− Ｂ患者では３８５±２２９Ｕ／ｌ）、記載した実験的イムノアッセイにより抗ＨＢｅ、ＨＢｅＡｇ／抗ＨＢｅ免疫複合体（ＩＣ）およびＨＢｓＡｇ／抗ＨＢｓＩＣの存在について分析した。ＡＨ−ＢおよびＣＨ−Ｂ患者の血清は、市販のアッセイ(Abbott Laboratories)で検査したとき、すべて抗ＨＢｅ抗体陰性であったことに注目されたい。対照的に、血清を直接ＥＩＡ法で分析した場合には、ＣＨ −Ｂ患者が全員顕著な抗ＨＢｅ抗体の生産を示した（図１Ａ）。図１は、抗ＨＢｅ、ＨＢｅＡｇ／抗ＨＢｅＩＣおよびＨＢｓＡｇ／抗ＨＢｓＩＣの血清レベルの、ＡＨ−Ｂ患者とＣＨ−Ｂ患者との比較を示す。２６人のＡＨ −Ｂ患者と５３人のＣＨ−Ｂ患者からの血清サンプルを（Ａ）１／５００の希釈率で抗ＨＢｅ、（Ｂ）１／２５の希釈率でＨＢｅＡｇ／抗ＨＢｅＩＣ、そして（Ｃ）１／２５の希釈率でＨＢｓＡｇ／抗ＨＢｓＩＣについて直接ＥＩＡで分析した。最も重篤な肝障害の時期を表すＡＬＴ上昇のピーク時に各患者から一つの血清サンプルを採取した。結果はＰ／Ｎ（陽性／陰性）比として表され、各患者グループについての平均±標準偏差も示される。Ｎ＝0.016±0.0002（抗ＨＢｅアッセイ）；Ｎ＝0.081±0.028（ＨＢｅＡｇ／抗ＨＢｅＩＣアッセイ）；およびＮ＝0.093±0.034（ＨＢｓＡｇ／抗ＨＢｓＩＣアッセイ）。ほとんどのＡＨ−Ｂ患者の血清は抗ＨＢｅ陽性であったが、ＡＨ−Ｂ患者の血清はＣＨ−Ｂ患者と比べて著しく少ない抗ＨＢｅ抗体を含んでいた。しかし、１３％のＣＨ−Ｂ患者と４６％のＡＨ−Ｂ患者はＰ／Ｎ値７．９〜２４．１の間でオーバーラップする抗ＨＢｅレベルを示した。オーバーラップの程度はＡＨ−Ｂ感染とＣＨ−Ｂ感染を識別するという観点からこのアッセイの有効性を危うくするものである。肝障害の時期に採取したＡＨ−ＢおよびＣＨ−Ｂ患者の血清はまたＨＢｅＡｇ陽性であるので、ＨＢｅＡｇ／抗ＨＢｅＩＣの存在についても分析した（図１Ｂ）。ＣＨ−Ｂ患者の血清はＡＨ−Ｂ患者の血清と比べてかなり増大したレベルのＨＢｅＡｇ／抗ＨＢｅＩＣを含んでおり、２つの患者グループ間のオーバーラップの程度はかなり低かった（７％のＣＨ−Ｂ患者と１９％のＡＨ− Ｂ患者が２．２〜３．５の間でオーバーラップするＰ／Ｎ値を示した）。同様に、ＣＨ−Ｂ患者の血清はＡＨ−Ｂ患者の血清と比べて有意に高いレベルのＨＢｓＡｇ／抗ＨＢｓＩＣを含んでいた（図１Ｃ）。しかしながら、ＨＢｓＡｇ／抗ＨＢｓＩＣアッセイにおいてはＰ／Ｎ値１．１〜５．４でＣＨ−Ｂ患者（１８％）とＡＨ−Ｂ患者（９２％）の間に相当のオーバーラップが見られた。抗ＨＢｅ、ＨＢｅＡｇ／抗ＨＢｅＩＣおよびＨＢｓＡｇ／抗ＨＢｓＩＣを測定するための実験的アッセイを繰り返したところ、ＡＨ−ＢおよびＣＨ−Ｂ患者の血清間ではこれらパラメーターの平均レベルに大きな有意差があったが、いずれか一つのアッセイに基づく完全な識別は境界域で重なる値のため困難であろう（図１Ａ〜Ｃ）。しかしながら、すべてのＡＨ−ＢおよびＣＨ−Ｂ患者の血清は単一の同じ希釈率（すなわち、抗ＨＢｅ分析では１／５００；ＩＣ分析では１／２５）で分析された。アッセイの設計を変えることにより、急性ＨＢＶ患者グループと慢性ＨＢＶ患者グループとを識別するのにより有効な結果が得られる可能性がある。実施例３急性および慢性ＨＢＶ感染におけるＩｇＧ抗ＨＢｃ、ＩｇＭ抗ＨＢｃおよび抗ＨＢｃ^Wの比較レベル血清の１／５００希釈物を用いることにより改変した市販の抗ＨＢｃアッセイ (Corzyme，Abbott Labs)を使って、ＡＨ−ＢおよびＣＨ−Ｂ患者の血清の総抗ＨＢｃを比較した。図２は、ＡＨ−ＢおよびＣＨ−Ｂ患者間の抗ＨＢｃ、ＩｇＭ抗ＨＢｃ、ＩｇＧ抗ＨＢｃ^Wの血清レベルおよびＩｇＭ抗ＨＢｃ／ＩｇＧ抗ＨＢｃ^W 比の比較を示す。２６人のＡＨ−Ｂ患者と５３人のＣＨ−Ｂ患者からの血清サンプルを（Ａ）Corzymeアッセイ(Abbott Laboratories)により１／５００の希釈率で総抗ＨＢｃについて、（Ｂ）Corzyme-Mアッセイ(Abbott Laboratories)により１／1000の希釈率でＩｇＭ抗ＨＢｃについて、（Ｃ）固相リガンドとしてＷＨｃＡｇを用いる直接ＥＩＡにより１／５００の希釈率でＩｇＧ抗ＨＢｃ^Wについて、そして（Ｄ）ＩｇＭ抗ＨＢｃ／ＩｇＧ抗ＨＢｃ^Wの比について分析した。ＡＬＴ上昇のピーク時に各患者から一つの血清サンプルを採取した。結果は抗ＨＢｃアッセイでは阻害％として、ＩｇＭ抗ＨＢｃアッセイではカットオフ指数（Cut- Off Index：C.I.）およびＰ／Ｎ比として、そしてＩｇＧ抗ＨＢｃ^WアッセイではＰ／Ｎ比として表してある。各患者グループについての平均±標準偏差も示してある。Ｎ＝４．６±９．５％（ＩｇＧ抗ＨＢｃアッセイ）；Ｎ＝０．０７５±０．０１２および1C.I.＝０．２９８（ＩｇＭ抗ＨＢｃアッセイ）；およびＮ＝０．０１４±０．００２（ＩｇＧ抗ＨＢｃ^Wアッセイ）。先に示したとおり、ＡＨ−Ｂ患者とＣＨ−Ｂ患者はどちらも抗ＨＢｃをよく産生するが、ＣＨ−Ｂ患者の血清（１０１±３％の阻害率）はＡＨ−Ｂ患者の血清（８９±１５％の阻害率）よりも高いレベルを示した（ｐ＜０．００１）。直接ＥＩＡを用いてＡＨ−ＢおよびＣＨ−Ｂ患者血清中のＩｇＧ抗ＨＢｃを測定したが、結果は市販のアッセイと同様であった。両方の抗ＨＢｃアッセイにおいて１／５００の血清希釈物を用いても、ＩｇＧ抗ＨＢｃ値に関してＡＨ−ＢおよびＣＨ−Ｂ患者間に非常に大きなオーバーラップが見られた（図２、パネルＡ）。これに対して、ＩｇＭ抗ＨＢｃ抗体の測定にCorzyme-Mキット（AbbottLaboratorie s）を用いたところ、ＣＨ−Ｂ患者と比べてＡＨ−Ｂ患者にＩｇＭ抗ＨＢｃ抗体の優位な生産が見られた（図２、パネルＢ）。カットオフ指数（C.I.）として表される平均ＩｇＭ抗ＨＢｃレベルは、ＡＨ−Ｂ患者血清が９．２±３．０（またはＰ／Ｎ比３７．０±１２．１）であり、ＣＨ−Ｂ患者血清が１．１±０．９（またはＰ／Ｎ比４．６±４．０）であった（ｐ＜０．００１）。それにもかかわらず、２０％のＣＨ−Ｂ患者と２３％のＡＨ−Ｂ患者は１．６Ｃ．Ｉ．（６．６Ｐ／Ｎ）値から６．３Ｃ．Ｉ．（２５．４Ｐ／Ｎ）値の間でオーバーラップするＩｇＭ抗ＨＢｃレベルを示した。以前の研究からは、ＨＢＶとＷＨＶのヌクレオキャプシドが交差反応性エピトープを共有することが示された(Wernerら，J．Virol.，1:314-322，1979;Millma nら，Infection and Immunity，2:752-757，1982; Stannardら，J．Gen.Virol. ，64:975-980，1983; Ponzettoら，Virus Research，2:301-315，1985)。従って、ヒト抗ＨＢｃ抗体がＷＨｃＡｇを認識するかどうか、また、ＡＨ−ＢおよびＣＨ−Ｂ患者血清をＷＨｃＡｇに対する示差的反応性に基づいて識別できるかどうかを調べることには興味がもてた。そのため、固相リガンドとして組換えＷＨｃＡｇを、プローブとしてヒトＩｇＧに特異的なモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を用いる直接ＥＩＡを開発した。図３は、５人のＡＨ−Ｂ患者の血清、５人のＣＨ−Ｂ患者の血清および５人の正常ヒトの血清（ＮＨＳ）の各プールを固相ＷＨｃＡｇへのＩｇＧ結合についてアッセイしたときの終点滴定を示す。データは吸光度値（ＯＤ₄₉₂）の平均±標準偏差として表してある。ＣＨ−Ｂ患者血清の終点力価は１／６２，５００であったのに対し、ＡＨ−Ｂ患者血清では１／１００であった。この結果から、ヒト抗ＨＢｃ抗体の少なくとも一部分はＷＨｃＡｇと交差反応し、しかも慢性的なＨＢＶ感染患者は抗ＨＢｃ^Wと名づけられた交差反応性の特異性物質を優先的に産生していることが示唆された。終点滴定分析に基づいて、２６人のＡＨ−Ｂ患者と５３人のＣＨ−Ｂ患者の血清を固相ＷＨｃＡｇへのＩｇＧ結合についてスクリーニングするために１／５００の血清希釈率が選ばれた（図２、パネルＣ）。ＣＨ−Ｂ患者血清（Ｐ／Ｎ３７．５±１０．５）はＡＨ−Ｂ患者血清（Ｐ／Ｎ２．５±１．４）と比べて著しく高レベルのＩｇＧ抗ＨＢｃ^Wを示した（ｐ＜０．００１）。さらに、ＡＨ− Ｂ患者血清とＣＨ−Ｂ患者血清のＩｇＧ抗ＨＢｃ^W値間にオーバーラップがまったくなかった（図２、パネルＣ）。ＩｇＭ抗ＨＢｃ^W抗体についても検査したが、ＡＨ−Ｂ患者（Ｐ／Ｎ２．１±１．６）とＣＨ−Ｂ患者（Ｐ／Ｎ２．４± ４．２）により産生された低レベルのＩｇＭ抗ＨＢｃ^W間に有意差は観察されなかった。ＩｇＭ抗ＨＢｃアッセイとＩｇＧ抗ＨＢｃ^Wアッセイを別個に行ったが、両アッセイとも急性ＨＢＶ感染と症候性の慢性ＨＢＶ感染とを識別するのに最も有効なアッセイであった。しかし、両アッセイを実施して、その結果をＩｇＭ抗ＨＢｃ／ＩｇＧ抗ＨＢｃ^Wの比として表すことにより、ＡＨ−Ｂ感染と症候性ＣＨ− Ｂ感染を識別するための、非常に強力な血清学的方法が得られる。実施例４抗ＨＢｃ^Wの生産はＨＢＶ感染に独特である急性ＨＢＶ感染と慢性ＨＢＶ感染とを識別するための抗ＨＢｃ^Wアッセイの利用を提案する前に、抗ＨＢｃ^W抗体の生産がＨＢＶ感染に特異的であって、急性または慢性肝障害の非特異的な結果ではないということを確立する必要があった。先に記載した５３人のＨＢｅＡｇ陽性ＣＨ−Ｂ患者の血清に加えて、１０人のＨＢｅＡｇ陰性ＣＨ−Ｂ患者の血清、７人の急性Ａ型肝炎患者の血清、１０人の急性Ｃ型肝炎患者の血清、３０人の慢性Ｃ型肝炎患者の血清および２６人の正常対照血清を抗ＨＢｃ^Wアッセイで評価した（表１）。ＨＢｓＡｇ陽性で、ＨＢｅＡｇ陽性または陰性のＣＨ−Ｂ患者だけが抗ＨＢｃ^W抗体を産生し、これらの患者グループは１００％の頻度で抗ＨＢｃ^Wを産生した。表示のように診断された患者からＡＬＴ値が上昇している間に採取した血清サンプルを１／５００に希釈し、直接ＥＩＡによりＩｇＧ抗ＨＢｃ^W反応性を分析した。データは吸光度（ＯＤ₄₉₂）値の平均±標準偏差として表してある。実施例５急性および慢性ＨＢＶ感染におけるＩｇＭ抗ＨＢｃ、ＩｇＧ抗ＨＢｃおよび抗ＨＢｃ^W抗体産生の動態抗ＨＢｃ抗体産生の動態を検討するため、ＡＬＴ上昇のピーク時をはさむ４〜５か月間に１４人のＡＨ−Ｂ患者と２１人のＣＨ−Ｂ患者（ＣＰＨ４人およびＣＡＨ１７人）から採取した一時血清サンプル中のＩｇＭ抗ＨＢｃ、ＩｇＧ抗ＨＢｃおよびＩｇＧ抗ＨＢｃ^Wを分析した。図４は、ＡＨ−ＢおよびＣＨ−Ｂ患者におけるＨＢｃＡｇに対する抗体生産の動態を示す。１４人のＡＨ−Ｂ患者（Ａ）と２１人のＣＨ−Ｂ患者（Ｂ）から連続的に採取した血清サンプル中のＩｇＭ抗ＨＢｃ（●−●）、ＩｇＧ抗ＨＢｃ（▲−▲）およびＩｇＧ抗ＨＢｃ^W（△− △）をＡＬＴ値のピーク時に対する表示時点で分析した。すべての抗体を直接ＥＩＡにより測定した。結果をＰ／Ｎ比の平均±標準偏差として表してある。Ｎ＝０．０１５±０．００５（ＩｇＭ抗ＨＢｃアッセイ）；Ｎ＝０．０１１±０．００４（ＩｇＧ抗ＨＢｃアッセイ）；およびＮ＝０．０１１±０．００５（ＩｇＧ抗ＨＢｃ^Wアッセイ）。ＡＨ−Ｂ患者において、ＩｇＭ抗ＨＢｃレベルはＡＬＴ上昇のピーク前に高く、その後低下した（平均９．８から４．ＩＰ／Ｎ）。反対に、ＩｇＧ抗ＨＢｃの生産は初めに低く、肝炎の消散過程で増加した（平均９から２７．５Ｐ／Ｎ）。そして、ＩｇＧ抗ＨＢｃ^Wの生産は低いままであり、観察期間を通して陰性であった（図４Ａ）。ＣＨ−Ｂ患者では、ＩｇＭ抗ＨＢｃレベルは肝障害の５〜８週前には比較的低いが、ＡＬＴの上昇とともに増加し、その後低下した（平均３．０から６．２Ｐ／Ｎ）（図４Ｂ）。ＣＨ−Ｂ患者のＩｇＧ抗ＨＢｃレベルは観察期間を通してかなり高く維持され（平均３２．３から３９．０Ｐ／Ｎ）、ＩｇＧ抗ＨＢｃ^Wの生産も同様であった（平均４３．０から５０．３Ｐ／Ｎ）（図４Ｂ）。これらのデータから、肝障害の期間中にＡＨ−ＢまたはＣＨ−Ｂ患者から採取した単一の血清サンプルはＩｇＭおよびＩｇＧ抗ＨＢｃ抗体レベルの変動を示して、急性感染と慢性感染の急性悪化とを明確に区別できないことが明らかである。対照的に、ＡＨ−Ｂ患者の抗ＨＢｃ^Wレベルは肝障害の前、途中、後に一貫して低いままであり、ＣＨ−Ｂ患者では常に高かった（図４Ａ，Ｂ）。抗ＨＢｃ^Wアッセイの一貫性および有用性は図５に示した一人のＣＨ−Ｂ患者の血清学的プロフィールにより実証される。ＣＡＨ患者（Ｈ．Ｍ．２２才の女性）を６年間追跡し、その間に肝障害の急性悪化が２回（４／８８および４／９０）生じた。上段に示した標準血清学的パラメーターを市販のアッセイで測定した。ＩｇＭ抗ＨＢｃ、ＩｇＧ抗ＨＢｃおよびＩｇＧ抗ＨＢｃ^Wは記載したような直接ＥＩＡにより測定した。データはそれぞれの時点でのＰ／Ｎ比として表してある（▲−▲＝ＩｇＭ抗ＨＢｃ；●−●＝ＡＬＴ；△−△＝ＩｇＧ抗ＨＢｃ；○− ○＝ＩｇＭ抗ＨＢｃ^W）。このＣＨ−Ｂ患者は肝障害の急性悪化を１９８８年４月と１９９０年４月に２回経験している。この患者がＨＢＶ感染の以前の病歴を告げずに１９９０年４月に初めて病院を訪れたのであれば、急性ＨＢＶ感染ではなく慢性ＨＢＶ感染の急性悪化を示しうる唯一の血清学的マーカーは抗ＨＢｃ^W値の上昇だけである。ＩｇＭ抗ＨＢｃ値は、この患者が医者の手当てを最も必要としていると思われる重篤な肝障害の時期に著しく上昇することに注目されたい。実施例６ＨＢｃ^Wエピトープの免疫学的特性付け慢性ＨＢＶ感染においては、ＷＨｃＡｇと反応性のＩｇＧ抗体の生産がＩｇＧ抗ＨＢｃ抗体の生産と関連していたが、ＷＨｃＡｇとＨＢｃＡｇとの抗原的な関係を直接確かめることが必要だった。そのために、抗ＨＢｃ^W陽性のＣＨ−Ｂ患者６人から得られた血清プールを抗原競合アッセイにより分析した。図６はＣＨ −Ｂ患者血清の抗原阻害分析を示す。抗ＨＢｃ抗体および抗ＨＢｃ^W抗体に陽性の６人のＣＨ−Ｂ患者から得られた血清を、表示濃度の可溶性インヒビターＨＢｃＡｇ、ＷＨｃＡｇまたはＨＢｅＡｇとともに４℃で一夜プレインキュベートした。その後、抗ＨＢｃ^W（Ａ）または抗ＨＢｃ（Ｂ）の残留反応性を、固相リガンドとしてそれぞれ固相ＷＨｃＡｇまたはＨＢｃＡｇを用いて直接ＥＩＡによりアッセイした。データは可溶性インヒビターの不在下で得られた吸光度値（ＯＤ₄₉₂ ）に対する結合パーセントとして表してある。ＣＨ−Ｂ患者血清を、固相ＷＨｃＡｇ（図６Ａ）または固相ＨＢｃＡｇ（図６Ｂ）に加える前に可溶性のＨＢｃＡｇ、ＨＢｅＡｇまたはＷＨｃＡｇとプレインキュベートし、非吸着ＣＨ−Ｂ患者血清に対する固相リガンドへのＩｇＧ結合のパーセントを求めた。固相ＷＨｃＡｇへのＣＨ−Ｂ患者ＩｇＧの結合はＷＨｃＡｇとＨＢｃＡｇによって同程度に定量的に阻害されたが、ＨＢｅＡｇによっては阻害されなかった（図６Ａ）。この結果から、ＣＨ−Ｂ患者のＩｇＧにより認識されるＨＢｃ^WエピトープはＨＢｃＡｇとＷＨｃＡｇのどちらにも存在するが、ＨＢｅＡｇには存在しないことが明らかである。逆のアッセイにおいて、固相ＨＢｃＡｇへのＣＨ−Ｂ患者ＩｇＧの結合はＨＢｃＡｇによってのみ定量的に阻害され、ＷＨｃＡｇやＨＢｅＡｇによっては阻害されなかった（図６Ｂ）。可溶性ＷＨｃＡｇがＣＨ−Ｂ患者ＩｇＧとＨＢｃＡｇとの結合を阻害できなかったことは、ＨＢｃ^WエピトープがほんのわずかなＨＢｃＡｇエピトープとのみ交差反応性であり、ＣＨ−Ｂ患者血清中に検出されたＨＢｃ^W特異的抗体が総ＩｇＧ抗ＨＢｃ応答の少量成分にすぎないことを示している。このことはＨＢｃＡｇ特異的モノクローナル抗体がＷＨｃＡｇを認識しなかった観察と一致する（表２）。組換えＷＨｃＡｇ、ＨＢｃＡｇおよびＨＢｅＡｇを固相にコーティングし（５０ｎｇ／ウエル）、直接ＥＩＡで表示抗体の結合をアッセイした。モノクローナル抗体（Ｍａｂ）は０．５μｇ／ｍｌでアッセイし、ポリクローナル血清は１／８０００に希釈した。データは吸光度（ＯＤ₄₉₂）値として表してある。同様に、ＨＢｅＡｇ特異的ＭａｂもＷＨｃＡｇを認識することができなかった。ＨＢｃ／ＨＢｅ抗原の残基１２９−１４０に特異的なＭａｂ２２２１だけがＷＨｃＡｇと結合した（表２）。１２９−１４０配列はＷＨｃＡｇとＨＢｃＡｇとに高度に保存されている。次に、ヒト抗ＨＢｃ^W抗体による結合にとって必要とされる天然ＷＨｃＡｇ構造の要件を調べた。組換えＷＨｃＡｇをある濃度範囲のＳＤＳ／２ＭＥ（０．００６〜６．４％）で処理し、固相に結合させた変性ＷＨｃＡｇへの結合についてＣＨ−Ｂ患者血清のグループから得られたヒト抗ＨＢｃ^WＩｇＧと、ｒＷＨｃＡｇで免疫することにより生産されたマウス抗ＷＨｃおよびウサギ抗ＷＨｃＩｇＧを分析した。図７はＷＨｃＡｇの変性に対する抗ＨＢｃ^W反応性の感度を示す。組換えＷＨｃＡｇ（１ｍｇ／ｍｌ）を表示濃度のＳＤＳ／２ＭＥで３７℃、２時間処理し、ＷＨｃＡｇ（１０００倍に希釈）を固相にコーティングした（５０ｎｇ／ウェル）。ポリクローナルマウス抗ＷＨｃ（Ｍａ−ＷＨｃ）（▲−▲）、ポリクローナルウサギ抗ＷＨｃ（Ｒａ−ＷＨｃ，▲…▲）、モノクローナル抗ＨＢｅペプチド（Ｍａｂ２２２１）（△−△）、または４人のＣＨ−Ｂ患者から得られたヒト抗ＨＢｃ^W陽性血清（Ｈａ−ＨＢｃ^W）（○−○）をウェルに加え、ペルオキシダーゼ標識抗マウス、ウサギまたはヒトＩｇにより結合抗体を検出した。データはＳＤＳ／２ＭＥ処理を行わないで得られた吸光度値（ＯＤ₄₉₂）に対する結合パーセントとして表してある。適度に変性したＷＨｃＡｇが固相ウェルに確実に付着することを確かめるため、直鎖状のペプチドエピトープ１２９−１４０と結合するＭａｂ２２２１を陽性対照として用いた。ヒト抗ＨＢｃ^WのＷＨｃＡｇへの結合はＷＨｃＡｇの変性に非常に感受性で、０．１％のＳＤＳ／２ＭＥでＷＨｃＡｇを処理することにより８０％も減少した。同様に、天然ＷＨｃＡｇに対するポリクローナルマウスおよびウサギ抗血清の結合もＷＨｃＡｇの変性に対して同程度の感受性を示した。さらに、ヒト抗ＨＢｃ^Wのコンホメーション依存性はＷＨｃＡｇ由来の重複ペプチド群へのヒト抗ＨＢｃ^Wの結合を検出できなかったことからも実証された。最後に、ヒト抗ＨＢｃ^WＩｇＧにより認識されるＷＨｃＡｇ上のエピトープが種特異的であるか否かを調べるために、ヒト抗ＨＢｃ^W抗血清と、ｒＷＨｃＡｇに対するマウスおよびウサギポリクローナル抗体との間で抗体競合アッセイを行った（表３）。抗ＨＢｃ^W反応性について陽性である、４人のＣＨ−Ｂ患者の血清のＷＨｃＡｇへの結合は、競合物質ウサギおよびマウスポリクローナル抗ＷＨｃ抗血清により定量的に阻害された。反対に、ウサギおよびマウス抗ＷＨｃ抗血清のＷＨｃＡｇへの結合は、競合物質として用いた６人の抗ＨＢｃ^W陽性の抗血清によって阻害された（表３）。従って、ヒト抗ＨＢｃ^W陽性の抗血清により認識されるＷＨｃＡｇ交差反応性エピトープは、ＷＨｃＡｇで免疫したマウスおよびウサギによっても認識される。表示した競合抗体のポリクローナルウサギ（Ｒ）もしくはマウス（Ｍ）抗ＷＨｃ、またはＣＨ−Ｂ患者血清由来のヒト（Ｈ）抗ＨＢｃ^Wを固相ＷＨｃＡｇ（５０ｎｇ／ウェル）と３７℃で２時間プレインキュベートした。その後、表示した一次抗体をウェルに加え、免疫前血清または正常ヒト血清による阻害に対する競合抗体による阻害パーセントを求めた。以上、本発明について詳しく説明してきたが、当業者にはさまざまな変更および修飾が本発明の精神または範囲を逸脱することなく可能であることが明らかだろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人ヴァージニアコモンウェルスユニバーシティーアメリカ合衆国 23298−0568 ヴァージニア州リッチモンド，ボックス 980568，エムシーヴィーステーション（番地なし) (72)発明者ミリチ，デイヴィッドアール. アメリカ合衆国 92020 カリフォルニア州エルカジョン，バーネットコート 11649番地 (72)発明者マルヤマ，トシユキ東京都文京区後楽２−21−12−503 (72)発明者ショーデル，フロリアンアメリカ合衆国 20910 メリーランド州シルバースプリングス，メイウッドアヴェニュー 8800番地 (72)発明者ピーターソン，ダレルアメリカ合衆国 23832 ヴァージニア州チェスターフィールド，ラウンドヒルドライブ 4345番地

Claims

【特許請求の範囲】１．被検者における慢性肝炎Ｂ型ウイルス（ＨＢＶ）感染を診断する方法であって、ａ．ＨＢＶ感染の疑いがある被検者由来のサンプルを、ウッドチャック肝炎ウイルス抗原のアミノ酸配列を含みかつウッドチャック肝炎Ｂ型コア抗原に対する抗体と結合するエピトープと接触させ、そしてｂ．該サンプル中のウッドチャック肝炎Ｂ型コア抗原に対する抗体の存在を検出する、ことを含んでなる方法。２．サンプルが血清である、請求項１に記載の方法。３．エピトープが固相支持体に結合されている、請求項１に記載の方法。４．検出が抗ウッドチャック肝炎Ｂ型コア抗原抗体に結合する二次抗体の添加を含む、請求項１に記載の方法。５．二次抗体が検出可能に標識されている、請求項４に記載の方法。６．標識が酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物、リン光化合物および生物発光化合物よりなる群から選ばれる、請求項５に記載の方法。７．抗ウッドチャック肝炎Ｂ型コア抗原抗体がイソタイプＩｇＧである、請求項１に記載の方法。８．被検者におけるＩｇＭ抗肝炎Ｂ型コア抗原抗体のレベルを検出することをさらに含む、請求項７に記載の方法。９．ＩｇＭ抗肝炎Ｂ型コア抗原抗体とＩｇＧ抗ウッドチャック肝炎Ｂ型コア抗原抗体の比を求める、請求項８に記載の方法。 10．慢性肝炎が慢性急性肝炎である、請求項１に記載の方法。 11．慢性肝炎が慢性持続性肝炎である、請求項１に記載の方法。 12．被検者における慢性肝炎Ｂ型ウイルス（ＨＢＶ）感染を診断する方法であって、ａ．慢性ＨＢＶ感染の疑いがある被検者由来のサンプルを、抗ＨＢｅ抗体と結合する第一試薬、ＨＢｅＡｇ／抗ＨＢｅ免疫複合体と結合する第二試薬およびＨＢｓＡｇ／抗ＨＢｓ免疫複合体と結合する第三試薬と接触させ、そしてｂ．該サンプル中の抗ＨＢｅ抗体、ＨＢｅＡｇ／抗ＨＢｅ免疫複合体およびＨＢｓＡｇ／抗ＨＢｓ免疫複合体の存在を検出する、ことを含んでなる方法。 13．サンプルが血清である、請求項12に記載の方法。 14．試薬が抗原または抗体である、請求項12に記載の方法。 15．試薬が固相支持体に結合されている、請求項12に記載の方法。 16．試薬が検出可能に標識されている、請求項12に記載の方法。 17．標識が酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物、リン光化合物および生物発光化合物よりなる群から選ばれる、請求項16に記載の方法。 18．検出が陽性対陰性（Ｐ／Ｎ）比として測定される、請求項12に記載の方法。 19．Ｐ／Ｎ比が３より大きい、請求項18に記載の方法。 20．ウッドチャック肝炎Ｂ型コア抗原エピトープを入れた第一容器およびヒト抗体に結合する抗体を入れた第二容器を含む、１以上の容器を密着拘束状態で収容するように区画化されたキャリアー手段を含んでなる、慢性肝炎Ｂ型感染を診断するための試薬キット。 21．ヒト抗体に結合する抗体が標識されている、請求項20に記載のキット 22．標識が酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物、リン光化合物および生物発光化合物よりなる群から選ばれる、請求項21に記載のキット。 23．ＨＢｃ抗原を入れた第一容器、ＨＢｅＡｇ／抗ＨＢｅ免疫複合体に結合する抗体を入れた第二容器、およびＨＢｓＡｇ／抗ＨＢｓ免疫複合体に結合する抗体を入れた第三容器を含む、１以上の容器を密着拘束状態で収容するように区画化されたキャリアー手段を含んでなる、慢性肝炎Ｂ型感染を診断するための試薬キット。 24．ヒト抗体に結合する抗体を入れた容器をさらに含む、請求項23に記載のキット。 25．ヒト抗体に結合する抗体が標識されている、請求項24に記載のキット。 26．標識が酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物、リン光化合物および生物発光化合物よりなる群から選ばれる、請求項25に記載のキット。