JP2015210237A - 免疫クロマト分析キット及び免疫クロマト分析方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1.口腔内から採取される血液検体を希釈して展開するための検体希釈液並びに試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置を含む免疫クロマト分析キット。
2.前記検体希釈液及び前記検出部の展開方向上流の少なくとも一方に、アルキルグルコシド類及び陰イオン性界面活性剤を含有する前項1に記載の免疫クロマト分析キット。
3.前記検体中の被検出物質が血液中の糖化タンパク質である前項1または2に記載の免疫クロマト分析キット。
4.前記糖化タンパク質がHbA1cである前項3に記載の免疫クロマト分析キット。
5.前記アルキルグルコシド類が、炭素数が5〜15のアルキル基を有するアルキルグルコシドまたはアルキルマルトシドである前項2〜4のいずれか1項に記載の免疫クロマト分析キット。
6.前記陰イオン性界面活性剤がドデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム及びポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウムからなる群から選ばれた1種以上である前項2〜5のいずれか1項に記載の免疫クロマト分析キット。
7.前記検出部の展開方向上流に、前記アルキルグルコシド類を1〜1700μg、前記陰イオン性界面活性剤を8〜800μg含有する前項2〜6のいずれか1項に記載の免疫クロマト分析キット。
8.歯間ブラシを用いて口腔内から血液検体を採取することを特徴とする前項1〜7のいずれか1項に記載の免疫クロマト分析キット。
9.口腔内から採取される血液検体中の被検出物質を検出するための免疫クロマト分析装置であって、試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含み、前記検出部の展開方向上流に、アルキルグルコシド類及び陰イオン性界面活性剤を含有する、免疫クロマト分析装置。
10.試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用いて、口腔内から採取される血液検体に含まれる被検出物質を検出する方法であって、以下の工程(1)〜(4)を含む免疫クロマト分析方法。
(1)検体希釈液により前記血液検体を希釈した検体処理液を試料添加部に添加する工程
(2)標識物質保持部に保持されている標識物質により被検出物質を認識させる工程
(3)アルキルグルコシド類及び陰イオン性界面活性剤存在下で前記血液検体及び標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
(4)展開された移動相中の被検出物質を検出部で検出する工程
(1)検体希釈液により前記血液検体を希釈した検体処理液を試料添加部に添加する工程
(2)標識物質保持部に保持されている標識物質により被検出物質を認識させる工程
(3)アルキルグルコシド類及び陰イオン性界面活性剤存在下で血液検体及び標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
(4)展開された移動相中の被検出物質を検出部で検出する工程
以下の手順で、図1に示すような免疫クロマト分析装置1を作製した。
(1)試料添加部12
試料添加部12には、グラスファイバーパッド(ミリポア社製商品名グラスファイバーコンジュゲートパッド、サイズ縦32mm(検体処理液展開方向)、横150mm、厚さ0.43mm)に、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を、60μg/cm2の割合で均一に添加し、50℃で4時間乾燥することにより作製した。
抗体塗布部18の作製
メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート(ミリポア社製、商品名:HF120、250mm×25mm)を用いた。5質量%のスクロース及び5質量%のイソプロパノールを含む10mMのリン酸緩衝液(pH7.4)で1.0mg/mlの濃度になるように抗HbA1cモノクローナル抗体、抗ヘモグロビンモノクローナル抗体または抗IgGモノクローナル抗体を希釈し、その希釈された溶液150μLを抗体塗布機(BioDot社製)によりメンブラン上に1mmの幅で別々の場所に塗布し、50℃で30分間乾燥させ、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体部14上に抗HbA1c抗体塗布部16、抗ヘモグロビン抗体塗布部17、抗IgG抗体塗布部18をそれぞれ設けた。
金コロイド懸濁液(田中貴金属工業社製:平均粒子径40nm)0.5mLに、Tris緩衝(pH8.5)で0.1mg/mLの濃度になるように希釈した抗ヘモグロビンモノクローナル抗体0.1mL加え、室温で10分間静置した。次いで、0.01質量%のPEG−SH(日本油脂株式会社製、商品名:SUNBRIGHT ME−200SH、分子量20000)を含むTris緩衝液(pH8.5)を0.1ml加え(添加後のPEG−SH濃度:0.001質量%)、室温で10分間静置した。その後、十分撹拌した後、8000×gで15分間遠心分離を行い、上清を除去した後、1質量%の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液(pH7.4)0.1mLを加え、標識物質溶液を作製した。
上記作製した標識物質溶液 220μlに100μlの25質量%トレハロース水溶液を含むリン酸緩衝液(pH9.0)を加えたものを8mm×100mmのグラスファイバーパッド(ミリポア社製)に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識物質保持部13を作製した。次に、プラスチック製粘着シート11上に、上記作製した試料添加部12、標識物質で標識された標識物質保持部13、クロマトグラフ媒体部14を貼り合わせ、汎用の吸収部15をさらに貼り合わせ、裁断機で幅が5mmとなるように裁断し、免疫クロマト分析装置1を作製した。この時、一装置あたりに含有するSDSの量は、96μgであった。
グルコシド類として、C8グルコシド(同仁化学(株)社製、製品名n-Octyl-β-D-glucoside):10mM
非イオン性界面活性剤として、TritonX−100(SIGMA社製、商品名)とTween20(和光純薬(株)社製、商品名)との1:5の質量比の混合物:1.2質量%
バッファーとしてのBicine緩衝液:50mM
無機塩として塩化カリウム:0.6質量%
添加剤としてカゼインナトリウム:2.0質量%
残量:水
健康成人男性及び糖尿病男性患者それぞれの指先を穿刺することにより採取されたHbA1c濃度が既知の血液を混合することにより、5.5%のHbA1c濃度を有する血液を調整した。また、健康成人男性から唾液を採取した。
血液と唾液を (容量比) 1:49となるように混合し、該混合物と前記検体希釈液とを、前者:後者として(容量比)、1:19で混合し、検体処理液1を調製した。
検体処理液2の調製
唾液を含有しない血液と前記検体希釈液とを、前者:後者として(容量比)、1:1000で混合し、検体処理液2を調製した。
検体処理液3の調製
健康成人男性及び糖尿病男性患者それぞれの指先を穿刺することにより採取されたHbA1c濃度が既知の血液を混合し調整された6.5%のHbA1c濃度を有する血液1μLと、健康成人男性の口腔内から、歯間ブラシを歯肉溝に穿刺し採取した唾液を含む血液検体とを、1.0mLの検体希釈液に浸漬し攪拌し、検体処理液3を調製した。
上記のようにして作製した免疫クロマト分析装置1の試料添加部12に、検体処理液1を110μl供給し、展開10分後に検出部の発色の度合いをイムノクロマトリーダー(浜松ホトニクス(株)社製 製品名)により測定した。イムノクロマトリーダーによる測定値は、各実施例及び比較例において繰り返し3回の試験を行った。
同様の方法で、検体処理液2についても免疫クロマト分析を実施した。
下記式で求められる発色度変化率を表1及び図2に示す。
発色度変化率(%)=100×(検体処理液1の平均測定値)/(検体処理液2の平均測定値)
100%は変化なしを示し、数値が小さくなるほど唾液を含む検体での感度低下が大きいことを示す。
実施例1において、検体希釈液中のアルキルグルコシド類を、C8グルコシドからC12グルコシドのn-Dodecyl-β-D-glucoside(花王(株)社製、製品名マイドール12)に変更したこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表1及び図2に示す。
実施例1において、検体希釈液中のアルキルグルコシド類を、C8グルコシドからC12グルコシドのn-Decyl-β-D-glucoside(花王(株)社製、製品名マイドール10)に変更したこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表1及び図2に示す。
実施例4
実施例1において、試料滴下部に含有させる陰イオン性界面活性剤を、SDSからSDBS(関東化学 (株) 社製、製品名ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム)に変更したこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表1及び図2に示す。
実施例5
実施例1において、検体希釈液中のアルキルグルコシド類を、C8グルコシドからC8マルトシド((株)同仁化学研究所 社製、製品名n-Octyl-β-D−maltoside)に変更したこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表1及び図2に示す
実施例1において、検体希釈液中にアルキルグルコシド類及び試料滴下部にSDSを含有させないこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表1及び図2に示す。
実施例1において、検体希釈液中にC8グルコシドを含有させないこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表1及び図2に示す。
実施例1において、試料滴下部にSDSを含有させないこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表1及び図2に示す。
実施例1の検体処理液1の調製において、5.5%、6.0%、6.5%の各種HbA1c濃度を有する血液を用い、唾液を含む血液検体の分析のみを実施したこと以外は実施例1を繰り返した。また、免疫クロマト分析において、イムノクロマトリーダーを用いずに、検出部での発色の度合いを目視で判定した。結果を表2に示す。なお表中の評価基準は以下の通りである。
+:赤色の発色を確認できるもの
++:強い赤色の発色を確認できるもの
+++:非常に強い赤色の発色が確認できるもの
実施例6において、検体処理液1に代え検体処理液3を用い唾液を含む血液の実検体について試験したこと以外は、実施例6を繰り返した。目視判定の結果は、非常に強い赤色の発色(+++)が確認された。また、6.5%以上のHbA1c濃度を有する糖尿病患者の血液検体を歯間ブラシで採取し、検体希釈液で1000倍に希釈処理し試験した場合でも同様の結果が得られる。
11 プラスチック製粘着シート
12 試料添加部
13 標識物質保持部
14 クロマトグラフ媒体部
15 吸収部
16 抗HbA1c抗体が塗布された抗HbA1c抗体塗布部
17 抗ヘモグロビン抗体が塗布された抗HbA0抗体塗布部
18 コントロールとして抗IgG抗体が塗布された抗IgG抗体塗布部
1.口腔内から採取される血液検体を希釈して展開するための検体希釈液並びに試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置を含む免疫クロマト分析キットであって、
前記血液検体中の被検出物質が血液中の糖化タンパク質であり、
前記検体希釈液が、アルキルグルコシド類を含有し、
前記検体希釈液及び前記検出部の展開方向上流の少なくとも一方に、陰イオン性界面活性剤を含有する
免疫クロマト分析キット。
2.前記試料添加部が、陰イオン性界面活性剤を含有する前項1に記載の免疫クロマト分析キット。
3.前記糖化タンパク質がHbA1cである前項1または2に記載の免疫クロマト分析キット。
4.前記アルキルグルコシド類が、炭素数が5〜15のアルキル基を有するアルキルグルコシドまたはアルキルマルトシドである前項1〜3のいずれか1項に記載の免疫クロマト分析キット。
5.前記陰イオン性界面活性剤がドデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム及びポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウムからなる群から選ばれた1種以上である前項1〜4のいずれか1項に記載の免疫クロマト分析キット。
6.前記検体希釈液が前記アルキルグルコシド類を0.025〜50mM含有し、前記検出部の展開方向上流に、前記陰イオン性界面活性剤を8〜800μg含有する前項1〜5のいずれか1項に記載の免疫クロマト分析キット。
7.歯間ブラシを用いて口腔内から血液検体を採取することを特徴とする前項1〜6のいずれか1項に記載の免疫クロマト分析キット。
8.試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用いて、口腔内から採取される血液検体に含まれる被検出物質を検出する方法であって、前記血液検体中の被検出物質が血液中の糖化タンパク質であり、かつ以下の工程(1)〜(4)を含む免疫クロマト分析方法。
(1)アルキルグルコシド類を含有する検体希釈液により前記血液検体を希釈した検体処理液を試料添加部に添加する工程
(2)標識物質保持部に保持されている標識物質により被検出物質を認識させる工程
(3)アルキルグルコシド類及び陰イオン性界面活性剤存在下で前記血液検体及び標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
(4)展開された移動相中の被検出物質を検出部で検出する工程
9.前記試料添加部が、陰イオン性界面活性剤を含有する前項8に記載の免疫クロマト分析方法。
Claims (10)
- 口腔内から採取される血液検体を希釈して展開するための検体希釈液並びに試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置を含む免疫クロマト分析キット。
- 前記検体希釈液及び前記検出部の展開方向上流の少なくとも一方に、アルキルグルコシド類及び陰イオン性界面活性剤を含有する請求項1に記載の免疫クロマト分析キット。
- 前記血液検体中の被検出物質が血液中の糖化タンパク質である請求項1または2に記載の免疫クロマト分析キット。
- 前記糖化タンパク質がHbA1cである請求項3に記載の免疫クロマト分析キット。
- 前記アルキルグルコシド類が、炭素数が5〜15のアルキル基を有するアルキルグルコシドまたはアルキルマルトシドである請求項2〜4のいずれか1項に記載の免疫クロマト分析キット。
- 前記陰イオン性界面活性剤がドデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム及びポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウムからなる群から選ばれた1種以上である請求項2〜5のいずれか1項に記載の免疫クロマト分析キット。
- 前記検出部の展開方向上流に、前記アルキルグルコシド類を1〜1700μg、前記陰イオン性界面活性剤を8〜800μg含有する請求項2〜6のいずれか1項に記載の免疫クロマト分析キット。
- 歯間ブラシを用いて口腔内から血液検体を採取することを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載の免疫クロマト分析キット。
- 口腔内から採取される血液検体中の被検出物質を検出するための免疫クロマト分析装置であって、試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含み、前記検出部の展開方向上流に、アルキルグルコシド類及び陰イオン性界面活性剤を含有する、免疫クロマト分析装置。
- 試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用いて、口腔内から採取される血液検体に含まれる被検出物質を検出する方法であって、以下の工程(1)〜(4)を含む免疫クロマト分析方法。
(1)検体希釈液により前記血液検体を希釈した検体処理液を試料添加部に添加する工程
(2)標識物質保持部に保持されている標識物質により被検出物質を認識させる工程
(3)アルキルグルコシド類及び陰イオン性界面活性剤存在下で前記血液検体及び標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
(4)展開された移動相中の被検出物質を検出部で検出する工程
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