JP2015155442A - 化合物及び生物学的材料並びにそれらの使用 - Google Patents

化合物及び生物学的材料並びにそれらの使用 Download PDF

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Abstract

【課題】正常細胞に損傷を引き起こすことなく、悪性細胞、疾患細胞若しくは感染細胞又は感染体を選択的に破壊するための、改善された光線力学療法(photodynamic therapy)(PDT)用組成物の提供。
【解決手段】式(I)で表される化合物。該化合物の担体分子との複合体、並びに疾患の治療における使用方法。
Figure 2015155442

(bが二重結合を表す場合、Dは-CH2-又はQ、Ra及びRbは双方とも存在せず;bが単結合を表す場合、Dは-C(O)-、-CH2-又はQ、Ra及びRbは双方ともH、又は双方とも-OH;R1が、H、反応性基を含有する部分を表す場合、R2はH又は可溶化基;R1がH又は可溶化基を表す場合、R2はH又は反応性基を含有する部分;GはO又は直接結合;Qは、含ＰＥＧフラグメント)
【選択図】なし

Description

本発明は、正常細胞に損傷を引き起こすことなく、悪性細胞、疾患細胞若しくは感染細
胞又は感染体を選択的に破壊するための、改善された光線力学療法(photodynamic therap
y)(PDT)用組成物に関する。
(背景)
光線力学療法(PDT)は、疾患細胞及び疾患組織を除去する必要のある一連の状態に対す
る最も侵襲性が低い治療である[6、34、35]。電離放射線とは異なり、この療法は、同一
部位に繰り返し投与することができる。化学療法、放射線療法又は手術などの従来のモダ
リティの使用がPDTの使用を妨げることはなく、その逆も同様なので、がん治療におけるP
DTの使用は魅力的である。PDTはまた、特定の細胞集団を破壊しなければならないその他
の用途、血管(加齢性黄斑変性症(AMD[36])又はがんにおける)、免疫障害[37]、心血管疾
患[38]、及び微生物感染症[39、40]の治療などを見出しつつある。
PDTは、静脈内注射又は皮膚がんでは局所投与による光増感剤(photosensitiser)(PS)薬
物の投与で始まる2ステップ又は２成分法である。該薬物はその物理化学的性質により、
がん細胞又はその他の標的細胞により優先的に取り込まれる[41]。好適な腫瘍(又はその
他の標的)内:正常器官内比が得られた後、第2ステップは、特定波長の光を特定線量で用
いることによるPS薬の活性化である。その基底状態又は一重項状態の光増感剤は、特定波
長で光量子を吸収する。この結果、持続時間の短い励起一重項状態がもたらされる。これ
を、項間交差によって持続時間のより長い三重項状態に転換することができる。種々の細
胞毒性作用を実行するのは、この形態の光増感剤である。
反応の主な種類は、ラジカルによる光酸化(I型反応)、一重項酸素による光酸化(II型反
応)、及び酸素を必要としない光反応(III型反応)である。三重項状態の形態の増感剤は、
II型反応を介して、細胞環境中に見出される分子状酸素を反応性酸素種(reactive oxygen
species)(ROS)、主として一重項酸素(1O2)に転換させる。活性化された光増感剤が細胞
成分と相互作用すると、I型反応が起こり、電子又はプロトンが引き抜かれ、ヒドロキシ
ルラジカル(OH・)及びスーパーオキシド(O2 -・)などのラジカルが形成される。これらの
分子種は、DNA、タンパク質及び脂質などの細胞成分に損傷を引き起こす[42]。三重項状
態の光増感剤がフリーラジカルと相互作用して細胞損傷を引き起こすIII型の機構も提唱
されている。細胞損傷の部位は、光増感剤の種類、インキュベーションの長さ、細胞の種
類、及び送達方式によって決まる。疎水性光増感剤は、細胞膜を損傷する傾向があり[42]
、一方、カチオン性光増感剤は、ミトコンドリアなどの膜小胞内に局在し、そこで損傷を
引き起こす[43]。
ROSの光活性化は、非常に細胞毒性である。実際、免疫系の一部の自然なプロセスは、
不必要な細胞を破壊する手段としてROSを利用する。これらの種は、寿命が短く(＜0.04ms
)、それらの発生箇所から近い範囲内(＜0.04mm)で作用する。細胞の破壊は、最終的には
脱落するか再吸収される組織の壊死様領域をもたらす。残りの組織は、通常瘢痕形成する
ことなく、自然に治癒する。組織の加熱はなく、コラーゲン及びエラスチンなどの結合組
織は影響を受けない。このことにより、熱レーザー技術、手術、又は外部ビーム放射線療
法と比較して、その下にある構造体に対するリスクがより低くなる。より詳細な研究によ
り、PDTがアポトーシス(非炎症性細胞死)を誘発し、その結果見られる壊死(炎症性細胞溶
解)は、免疫系によって除去されない死につつある細胞の塊に起因することが示された[44
、45]。
PDTは、冷たい光化学反応であり、すなわち使用されるレーザー光は、電離性でなく、
低レベルの熱エネルギーを送達し、PS薬は、極めて低い全身毒性を有する。PS薬と光の組
合せでは、病的状態の率が低く、機能障害は非常に少なく、この組合せは疾患の治療にお
いて多くの利点を提供する。
より新たな世代のPS薬は、より長い活性化波長を有し、それゆえ、赤色光による、より
深い組織浸透、より高い量子収率、並びに腫瘍選択性及び残留皮膚光感受性に関してより
良好な薬物動態を可能にする。これらの種類のPS薬としては、フタロシアニン、クロリン
、テキサフィリン、及びプルプリン類が挙げられる。合成クロリンであるFoscan(商標)は
、652nmの活性化波長、0.43の量子収率、及び約2週間の皮膚光感受性を有する極めて強力
なPS薬である。良好な結果を伴う、種々のがんに関する多くの臨床試験が存在する[35、3
6]。メタ-テトラヒドロフェニルバクテリオクロリン(m-THPBC)などの、＞700nmで吸収で
きる他のPS薬が、開発され、試験中である。好ましい深赤色の吸収特性(763nmの吸収ピー
ク)を有し、前立腺がんの治療で有望性を示す、パラジウム-バクテリオフェオフォルビド
光増感剤(TOOKAD)が開発されている[47]。
したがって、PDT療法にはいくつかの利点がある。PDT療法は、光による活性化によって
標的指向化し得る非侵襲性の低毒性治療を提供する。標的細胞は、細胞毒性種(ROS)に対
して抵抗性を発現することができない。治療後に、組織の瘢痕形成はほとんど存在しない
。しかし、PS薬は、標的細胞に対してそれほど選択的ではなく、標的内:血液内比率は、
典型的には、せいぜい一桁である。多くの状況、食道がん[60、61]、膀胱がん[62]におけ
る例えばPhotofrin(商標)[58、59]において、この選択性の欠如は、近位の正常組織に対
する許容し得ない損傷につながる。PS薬は、血液タンパク質に乗せて「ピギーバック方式
」で輸送されるので、所望されるより長期に循環中に残存し、最良の場合、患者は2週間
光感受性に維持される。
標準的な化学療法剤と異なり、光増感薬は、細胞毒性効果が光による活性化に由来する
二次的効果であるので、担体に結合している間、なお活性であり且つ機能性であり得る。
このことにより、光増感薬は、標的指向性分子への複合を含む特異的薬物送達機構に適す
るものとなる。
現在のところ、光増感薬を標的指向化可能な要素に連結する好ましい取組みは、誘導体
化された光増感薬を全モノクロナール抗体に直接的に複合することである。全抗体は、15
0KDaの分子量を有し、達成するのに長時間を要する不十分な腫瘍内:器官内比率(2:1)など
の好ましくない薬物動態を有する、極めて大きな光-免疫複合体をもたらす[63、64]。最
近の文献は、モノクロナール抗体上の残基に連結された光増感薬が、不十分な分光学的特
性により発生する消光効果を伴って、互いに有害な効果を有することがあることを示唆し
ている[65]。これに加えて、抗体上への光増感剤の不十分で且つ信頼性のない装填が、抗
体が凝集するか機能を失う前に典型的である4:1の比率で観察されることが示されている[
63〜69]。
光増感剤のカップリングは、各種モノクロナール抗体を用いる種々の戦略を使用して試
みられて来た。例えば、PPaが、抗Her2モノクロナール抗体にカップリングされている。
良好な増感剤:抗体のカップリング比率(10:1の領域)を達成するためには、ポリエチレン
グリコールの鎖を結合させることによって、抗体をより可溶性にする必要があった[68]。
このPEG化は、複合体の薬物動態に有害な効果を有し、より不十分な腫瘍内:血液内比率を
もたらすであろう。さらに、光増感剤の抗体への非共有結合もここで観察された。このよ
うな非共有結合は、抗体-光増感剤複合体を生成させるためのほとんどの報告された試み
の特徴であり、十分に特徴付けられた複合体を確実に生成させる上で重大な問題になる。
さらなる研究において、ポルフィリン増感剤を、イソチオシアネートカップリング法を利
用して、モノクロナール抗体17.1A、FSP77及び35A7と共に使用し、2.8:1にすぎない増感
剤:抗体の比率を得た[67]。別の例が、モノクロナール抗体C225(抗EGFR)とのベルテポル
フィン(ベンゾポルフィリン誘導体、BPD)であった。ここでは、11:1を超えるカップリン
グ比率が、不十分な免疫反応性及び溶解性をもたらした[69]。最良の比率は、約7:1であ
った。これらの例は、高い光増感剤:抗体比率有する十分に特徴付けられた複合体を生成
させることの問題点を例示するのに役立ち、全抗体に比べてより小さい3分の1〜6分の1の
フラグメントを使用することは、より大きなタンパク質種で観察される溶解性及び装填の
問題を考慮すれば、さらにより成功し難いことを示唆している。
モノクロナール抗体に結合させたPS薬に関する研究は、個々のモノクロナール抗体に結
合させるPS分子の数が多すぎると、疎水性に影響を及ぼすことがあり、薬物動態に対して
有害な作用が生じる可能性があることを示した。全モノクロナール抗体に伴う問題点を考
慮すると、小さなフラグメント(scFvなど、30KDa)は、極めて好ましくないカップリング
効率を有し、僅かに1個又は2個の光増感剤がカップリングされると広く考えられている。
それらの選択的結合部位を保持する抗体フラグメントの合成に関連する技術の一般的概説
は、Hollinger及びHudsonの論文、Nature Biotechnology(2005)23,1126〜36中に見出され
るはずである。Birchlerら[70]は、効果的なscFv-光増感剤複合体を生成させることを試
みたが、部位特異的システイン残基を介してscFvへ1個の光増感剤をカップリングさせる
ことができただけであった。
他のグループは、PS薬を分枝炭水化物[71]又はポリエチレングリコール鎖[72]及びポリ
-リシン[73]鎖などの指定した「担体」に連結することを試みることによって、これらの
問題点を回避することを試みた。リガンド-担体を完全に組換えにより調製することはで
きないので、これらの取組みはすべて、さらなる複合する工程を必要とする。このような
ポリマーを使用することは、また、インビボでのタンパク質分解の不安定性などの問題を
有する可能性がある。光増感剤がこの方式で結合されている場合、自己消光し、それらの
光物理学的特性を破壊し、活性な光増感剤となり得る前にリゾチーム中で分解によって「
脱消光(de-quench)」することが知られている[71]。したがって、10:1までのより高いカ
ップリング比率を達成できるが、遊離(非カップリング)の光増感剤で得られるものより低
い光毒性及びより低い一重項酸素収率を伴ってのみ達成される。Roderらによる研究[71]
は、デンドリマーの周縁部の周りに大きな数で共有結合で連結されている場合、フェオフ
ォルビドの光増感活性が、劇的に低下することを示した。これは、エネルギー移動過程、
主として色素から色素へのForster型エネルギー移動の結果である。Forster型エネルギー
移動は、距離依存性であり、距離と共に急速に低下する。色素分子の相互作用は、吸収ス
ペクトルの変化、蛍光寿命及び一重項酸素の量子収率の低下につながる。抗体フラグメン
トをタンパク質担体分子と組み合わせた融合タンパク質も、本発明者らのグループによっ
て記載されている[74]。
Glickmanら[75、76]は、VEGF脈管構造に対してモノクロナール抗体で標的指向化された
眼疾患用PDTを記載している。これは、標準的なカップリング条件を使用しているが、抗
体:光増感剤比率の記載はない。しかし、Hasanら[77]は、光増感剤:抗体のカップリング
比率を改良するための二溶媒系を開示している。そこでは、水性緩衝液と混合された極め
て高濃度の有機溶媒(典型的に40〜60%)を使用して、11:1までの比率が報告されている。
しかし、使用された高濃度の溶媒は、すべての抗体によって許容されそうにない。使用す
るフラグメントについての言及はないが、有機溶媒に対するそれらのより大きな感受性を
考慮すると、それらのフラグメントが、この方法中で有効であるとは期待できないであろ
う。また、Hasanらの方法[77]において、多くのカップリングした光増感剤は、自己消光
性であり、それゆえ、この系は、内部移行及びリソソームでの分解に依存して光毒性分子
を放出する。細胞表面に拘束された光-免疫複合体は、細胞内リソソーム中で見出される
ような分解酵素に曝露されるとは予想されない。このことにより、CEA及びマトリックス/
間質抗原などの低/非内部移行性抗原の標的指向性が排除される可能性がある。
新規な又は確立されたPS薬を、標的指向化可能な小さな担体タンパク質に連結すること
によって、後で光によって活性化することのできる高度に特異的な用量のPS薬を標的組織
に送達することが可能である。これらの担体-PS薬の複合体は、より短い時間間隔で、よ
り多くの量のPS薬が20:1又はより良好な組織内:血液/正常器内の比率で蓄積できるという
点で、既存の標的指向化及び非標的指向化PDT法に優る利点を有する。さらに、これらの
薬剤は、免疫原性がほとんど又は全くなく、副作用がより少なく、他の標的指向化可能な
戦略に優る利点を有する可能性がある。より小さなリガンドが、インスリン[78]、トラン
スフェリン[79、80]、アルブミン[81]、アネキシン[82]、トキシン[83]、エストロゲン[8
4]、ローダミン誘導体[85]、葉酸[86]などの光増感剤、並びにEGF[87]及びVEGF[88]など
の増殖因子を送達するのに使用されている。
国際公開第2007/042775号には、担体が機能性で且つ可溶性のままであることを保証す
る最適化されたカップリング条件を使用して、光増感剤を抗体フラグメント(例えば、scF
v)などの生物学的標的指向性タンパク質にカップリングさせる方法が記載されている。記
載の複合体は、非共有結合を含まず、共有結合で結合された光増感剤の高く且つ一貫した
モル比を有する。国際公開第2007/042775号には、また、最適化された光物理学的及び光
線力学的特性を有する遺伝子工学で操作された組換え抗体-光増感剤複合体、並びにそれ
らの生成方法が記載されている。さらに、国際公開第2007/042775号には、複合体全体の
光物理学的及び光線力学的特性を高めるその他の「非-光増感性」分子をカップリングす
る方法が記載されている。
抗体の生物学的性質は、機能及び完全性を保持するために、それらを、主として水性緩
衝液中に保持することを必要とする。しかし、光増感剤は、本来、疎水性である傾向があ
り、抗体のために通常的に使用される緩衝液の条件で溶解性が低い。水性条件下で光増感
剤を抗体にカップリングさせることは、不十分な光増感剤:抗体比率をもたらし、溶媒中
では、損傷された抗体タンパク質をもたらす。国際公開第2007/042775号には、低濃度の
有機溶媒の組合せを利用する方法が記載されている。
標的指向化された光線力学療法(PDT)のために高い純度及び有効性を有する光免疫複合
体(photoimmunoconjugate)(PIC)を生成させることに関する問題は、当技術分野で解決さ
れていない。
ポルフィリン系マクロ環の大きな疎水性面(光増感剤分子で見出されるような)は、生体
内複合化可能な基の選択が、水溶性を提供する官能基を妨害することなく複合化が実施さ
れることを可能にしなければならないので、水溶性化に対する難題となる。ピロフェオフ
ォルビド-a(PPa)のより溶解性のあるスルホン酸活性エステル誘導体を用いる本発明者ら
の研究(Bhatti M,Yahioglu G,Milgrom LR,Garcia-Maya M,Chester KA,Deonarain MP.の文
献、Int.J Cancer.2008 Mar 1;122(5):1155〜63)は、疎水性ポルフィリン系マクロ環の間
のコフェイシャル(cofacial)相互作用が大きな問題であり、凝集、励起状態の消光、及び
水性溶液中での沈殿に対する機構であろうことを示した。光増感剤の凝集及び沈殿は、複
合の効率を劇的に低下させる。
ピロフェオフォルビド-aのようなクロリン類、及びTOOKADのようなバクテリオクロリン
類(チャート1参照)は、それぞれ赤色及び近赤外領域で強く吸収する(Artech House出版の
、MR Hamblin及びP Mroz編、「光線力学療法の進歩、基礎的説明及び臨床(Advances in P
hotodynamic Therapy,Basic Translational and Clinical)」米国、2008年)。しかし、こ
のような天然に存在するクロリン及びバクテリオクロリン類の水溶性誘導体は、容易には
入手できない。
クロリンe6は、3つのイオン化可能なカルボン酸基を含有する商業的に入手可能なクロ
ロフィルの誘導体であり、そのアスパルチル誘導体は、独立型光増感剤として現在開発中
の唯一の水溶性クロリン誘導体である(タロポルフィン(Taloporfin)ナトリウム、チャー
ト1参照)。しかし、マクロ環のほとんどすべての他の周辺位置の置換基の存在が、合成操
作、特に複合化のための潜在的取っ手(handle)の導入を困難にさせる。このことは、活性
化及び種々の抗体フォーマット上のリシンのようなアミン残基への複合化に利用可能な単
一のプロピオン酸側鎖を有するが、マクロ環の外辺部周りの置換基のその完全な補完が合
成上の順応性を厳しく制約する、PPaを扱う場合に遭遇する同様の問題である(チャート1
参照)。
Figure 2015155442
PPaを機能化するための2つの最も一般的な取組みは、酸化/付加を介するビニル基の改
変、又はプロピオン酸側鎖のアルキル化(又は双方の組合せ)である。この30年間に、多数
の誘導体が、調製され、多くの応用について報告されてきた。機能改変の最も一般的な位
置を上図に示す。しかし、高い水溶性を付与する基の設計上の特徴、及び生体内複合化に
適した取っ手、すなわち遊離カルボン酸官能基の双方を組み込んだ化合物が、当技術分野
で欠如している。
PPaを機能化するための第3の取組みは、5-メソ位を官能化することを含む。この取組み
は、ほぼ30年前の、ビニル基の二重結合が還元されたメチルPPa上での5-ブロム化に関す
る最初の報告以来(GW Kenner,SW McCombie及びK Smithの文献、JCS Perkin Trans 1,1973
,2517)、ほとんど使用されないままであった。
最近、Wasielewski及び共同研究者ら(RF Kelley,MJ Tauber及びMR Wasielewskiの文献
、Angew.Chemie.Int.Ed.2006,45,7979)は、メチルPPaのこのメソ-5-ブロモ誘導体上で、
金属で触媒されるクロスカップリング化学を実施し、限られた数のアルキル及びアリール
基をこの立体的に障害された位置に導入することを可能にすることができることを示した
。
本発明において、この技術は、水溶性を付与すること、及び非共有結合を最小にするこ
との双方のために、或いは担体への複合化のための「取っ手」を取り付けるために、広範
な種類の周辺官能基の導入を可能にするように大きく拡張された。
本発明は、水性溶液への溶解性がより大きい、光増感剤として使用するのに適した新規
化合物を記載する。新規な光増感剤は、コフェイシャル引力を抑制し、且つタンパク質へ
の非共有結合を低減するように作用する。本発明は、また、改善されたインビトロ活性、
改善された薬物動態、及び改善されたインビボ活性を示す、新規光増感剤との新規な光免
疫複合体(PIC)の調製方法を説明する。
(発明の要旨)
本発明は、PPaの一連の新規誘導体を開示する。これらの疎水性光増感剤は、改善され
た水溶性、薬物効力、及びタンパク質/ペプチドへの改善された複合化のために開発され
た。該取組みは、コフェイシャル相互作用(水性緩衝液中での凝集及び沈殿に対して考え
られる機構)を抑制するように、且つタンパク質への非共有結合を低減するように、その
双方で作用する、反応性のあるたった1つのアミン又はチオール基及び水溶性化基を所持
するポルフィリン、クロリン及びバクテリオクロリン類の調製を可能にするいくつかの鍵
となる中間体の合成を含む。
第1態様において、本発明は、式Iの化合物、或いは医薬として許容し得るその塩若しく
は溶媒和物、又は医薬として機能性のあるその誘導体を提供する。
Figure 2015155442
 式中、
bが二重結合を表す場合、Dは、-CH2-又はQを表し、Ra及びRbは双方とも存在せず;
bが単結合を表す場合、Dは、-C(O)-、-CH2-又はQを表し、Ra及びRbは、双方ともHであ
るか、又は双方とも-OHであり;
R1が、H、或いはカルボキシル、ヒドロキシル、アミノ又はチオール基と反応すること
ができる官能基を含有する部分を表す場合、R2は、H又は可溶化基を表すか;或いは
R1がH又は可溶化基を表す場合、R2は、H、或いはカルボキシル、ヒドロキシル、アミノ
又はチオール基と反応することができる官能基を含有する部分を表し;
Gは、O又は直接結合を表し;
Qは、式Ig又はIhの構造フラグメントを表す。
Figure 2015155442
「カルボキシル、ヒドロキシル、アミノ又はチオール基と反応することができる官能基
を含有する部分」とは、ハロ、又は好ましくは、カルボキシル、メルカプト、アミノ、ハ
ロアルキル、ホスホルアミジチル、N-スクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシ
スクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセ
トアミジル、又はマレイミジル基を含有する部分であるか、又は好ましくは部分である部
分を意味する。このような基は、適切な担体分子への複合化のための取っ手として使用す
るのに適している可能性があると考えられる。
「可溶化基」とは、化合物全体の水への溶解性を増大させる任意の官能基を意味し、カ
チオン性(例えば、1つ以上のピリジニウム塩を含有する基)、アニオン性(1つ以上のカル
ボン酸塩を含有する基)、又は中性(例えば、1つ以上のオリゴ-若しくはポリエチレングリ
コール基を含有する基)でよい。このような基は、式Iの化合物の溶液中でのコフェイシャ
ル相互作用を低減し、且つ分子間凝集及び沈殿を防止するように作用することができると
考えられる。
不確かさの回避に関して、一部の状況において、「カルボキシル、ヒドロキシル、アミ
ノ又はチオール基と反応することができる官能基を含有する部分」は、「可溶化基」の定
義にも該当する場合があり、その逆も同様であると考えられる。
挙げることのできる医薬として許容し得る塩としては、酸付加塩及び塩基付加塩がある
。このような塩は、通常の手段によって、例えば、遊離酸又は遊離塩基の形態の式Iの化
合物を1当量以上の適切な酸又は塩基と、任意選択により溶媒中で、又はその塩が不溶性
である媒質中で反応させることによって、続いて前記溶媒又は前記媒質を標準的技術(例
えば、真空中で、凍結乾燥によって、又は濾過によって)を使用して除去することによっ
て形成することができる。塩は、また、塩形態の式Iの化合物の対イオンを、例えば適切
なイオン交換樹脂を使用して別の対イオンと交換することによって調製することができる
。
医薬として許容し得る付加塩の例には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸
及び硫酸などの鉱酸から、酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香
酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、アリールスルホン酸などの有機酸から、及び
ナトリウム、マグネシウム、又は好ましくはカリウム及びカルシウムなどの金属から誘導
されるものが含まれる。
本明細書中で定義されるような式Iの化合物の「医薬として機能性のある誘導体」とし
ては、エステル誘導体、及び/又は任意の関連化合物と同様の生物学的機能及び/又は活性
を有するか、或いは提供する誘導体が挙げられる。したがって、本発明の目的に関して、
該用語は、式Iの化合物のプロドラッグも包含する。
式Iの関連化合物の「プロドラッグ」という用語は、経口又は非経口投与の後に、イン
ビボで代謝されて、実験的に検出可能な量で、且つ予定時間内(例えば、6〜24時間の投与
間隔内で(すなわち1日に1〜4回))にその化合物を形成する任意の化合物を包含する。不確
かさの回避に関して、用語「非経口」投与は、経口投与以外のすべての投与形態を包含す
る。
式Iの化合物のプロドラッグは、化合物上に存在する官能基を、このようなプロドラッ
グを哺乳動物対象に投与した場合にその修飾がインビボで開裂されるような方式で修飾す
ることによって調製することができる。修飾は、典型的には、プロドラッグの置換基をも
つ親化合物を合成することによって達成される。プロドラッグとしては、式Iの化合物中
のヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、カルボキシ又はカルボニル基が、インビボで
開裂されて、それぞれ遊離のヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、カルボキシ又はカ
ルボニル基を再生することができる任意の基に結合されている式Iの化合物が挙げられる
。
プロドラッグの例には、限定はされないが、ヒドロキシ官能基のエステル及びカルバメ
ート、カルボキシル官能基のエステル基、N-アシル誘導体及びN-マンニッヒ塩基が含まれ
る。プロドラッグに関する一般的情報は、例えば、Bundegaard,H.の文献、「プロドラッ
グの設計(Design of Prodrugs)」1〜92頁、Elesevier、New York-Oxford(1985)中に見出
すことができる。
式Iの化合物、並びにこのような化合物の医薬として許容し得る塩、溶媒和物、及び医
薬として機能性のある誘導体は、簡潔さのために以後、一緒にして「式Iの化合物」と呼
ばれる。
式Iの化合物は、1つ以上の不斉炭素を含有し、それゆえ、光学異性及び/又はジアステ
レオ異性を示す可能性がある。ジアステレオマーは、従来技術、例えば、クロマトグラフ
ィー又は分別晶出を使用して分離することができる。種々の立体異性体を、例えば分別晶
出又はHPLCなどの従来の技術を使用して、該化合物のラセミ混合物又はその他の混合物を
分離することによって単離することができる。別法として、所望される光学異性体は、ラ
セミ化又はエピマー化を引き起こさない条件下での光学的に活性な適切な出発原料の反応
によって(すなわち、「キラルプール」法);適切な出発原料と後に適切な段階で除去でき
る「キラル補助剤」との反応によって;例えばホモキラルな酸を用いる誘導体化（すなわ
ち、動的分割を含む分割）、それに続くジアステレオマー性誘導体のクロマトグラフィー
などの従来手段による分離によって;或いはすべて当業者に既知の条件下での適切なキラ
ル試薬又はキラル触媒を用いる反応によって調製することができる。すべての立体異性体
及びそれらの混合物は、本発明の範囲に包含される。
bが単結合であり、且つRa及びRbが双方ともOHである場合、当該OH基は、互いにトラン
ス、又は好ましくはシス配向で存在することができると考えられる。
不確かさを回避するために、構造フラグメントIg及びIhに関して、本明細書中に示した
ような分子の左手側の破線(すなわち、式Igのフラグメントの-C(O)-末端の破線、及び式I
hのフラグメントのアルキン末端の破線)は、式Iの化合物の中央環(すなわち、ポルフィリ
ン環)への結合点を意味すると考えられる。
挙げることのできる式Iの化合物としては、R1が、H、或いはカルボキシル、ヒドロキシ
ル、アミノ又はチオール基と反応することができる官能基を含有する部分を表し、且つR2
が、H又は可溶化基を表す化合物がある。
挙げることのできる式Iの化合物としては、R1が、H又は可溶化基を表し、且つR2が、H
、或いはカルボキシル、ヒドロキシル、アミノ又はチオール基と反応することができる官
能基を含有する部分を表す化合物がある。
挙げることのできる式Iの化合物としては、
R1が、H、-(CH2)t-X、-(CH2)u-C(R3)=C(R4)-(CH2)v-X、又は-(CH2)w-C≡C-(CH2)x-Xを
表し;
tが、1〜20(例えば、1〜12)を表し;
uとvとの和が、2〜6であり;
wとxとの和が、2〜15(例えば、2〜10)であり;
Xが、-C(O)-L1、-OH、スルホニルエステル(例えば、メシレート、トシレート)、-NO2、
-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミ
ジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエス
テル(例えば、1,2,3,5,6-ペンタフルオロフェニル、4-スルホ-2,3,5,6-ペンタフルオロフ
ェニル)、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、マレイミジル、アリール、又はヘ
テロアリール(後の2つの基は、-C(O)-L1、-OH、スルホニルエステル(例えば、メシレート
、トシレート)、-NO2、-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒ
ドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、
フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、及びマレイミジ
ルから選択される1つ以上の基で置換されている)を表し;
L1が、-OH、又は適切な脱離基(例えば、-O-C(O)-R5、ハロ、1-オキシベンゾトリアゾイ
ルなどの活性化されたエステル、又はニトロ、フルオロ、クロロ、シアノ、及びトリフル
オロメチルから選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよいアリールオキシ基)を
表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官能基を表し;
R2が、H、1つ以上の-C(O)O-E+基、-SO3 -E+基、第4級アンモニウム塩、ピリジニウムイ
オン又は直鎖若しくは分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若し
くはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100(例えば約3〜約20)である)で独立に置換され
たアルキル、シクロアルキル、アルキレニル(alkylenyl)、アルキニル、アリール、ベン
ジル、ヘテロアリール(ここで、後の3つの基は、-OH、-NH2、又は1つ以上のハロ原子で置
換されたC1〜C6アルキルから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)を表すか、
或いはR2が、-NR6(R7)又は-N(R6a)-(CH2)z-SO3 -E+を表し;
R3〜R5及びR3aが、独立に、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていて
もよいC1〜C6アルキルを表し;
R6及びR7が、R6及びR7の少なくとも一方はHでないとの条件で、独立に、H、アルキニル
、ピリジニウムイオン、-(CH2)z-NR8(R9)又は-(CH2)z-N+R8(R9)(R10)A-を表し;
R6aが、H、又は-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6
アルキルを表し;
zが、1〜20(例えば、1〜10)を表し;
R8〜R10が、独立に、H、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよ
いアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはヘテロアリールを表し;
E+が、適切なカチオン基(例えば、Na+、K+)を表し;
A-が、適切なアニオン基(例えば、I-、Cl-、Br-)を表す;化合物がある。
挙げることができる式Iの化合物としては、
bが二重結合を表す場合、Dが、-CH2-を表し、Ra及びRbが双方とも存在せず;
bが単結合を表す場合、Dが、-C(O)-又は-CH2-を表し、Ra及びRbが双方ともHであり;
Gが、Oを表し;
R1が、-(CH2)t-X、-(CH2)u-C(R3)=C(R4)-(CH2)v-X、又は-(CH2)w-C≡C-(CH2)x-Xを表し
;
tが、1〜20(例えば、1〜12)を表し;
uとvとの和が、2〜6であり;
wとxとの和が、2〜15(例えば、2〜10)であり;
Xが、-C(O)-L1、-OH、スルホニルエステル(例えば、メシレート、トシレート)、-NO2、
-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミ
ジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエス
テル(例えば、1,2,3,5,6-ペンタフルオロフェニル、4-スルホ-2,3,5,6-ペンタフルオロフ
ェニル)、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、マレイミジル、アリール、又はヘ
テロアリール(後の2つの基は、-C(O)-L1、-OH、スルホニルエステル(例えば、メシレート
、トシレート)、-NO2、-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒ
ドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、
フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、及びマレイミジ
ルから選択される1つ以上の基で置換されている)を表し;
L1が、-OH、又は適切な脱離基(例えば、-O-C(O)-R5、ハロ、1-オキシベンゾトリアゾイ
ルなどの活性化されたエステル、又はニトロ、フルオロ、クロロ、シアノ、及びトリフル
オロメチルから選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよいアリールオキシ基を
表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官能基を表し;
R2が、1つ以上の-C(O)O-E+基、-SO3 -E+基、第4級アンモニウム塩、ピリジニウムイオン
又は直鎖若しくは分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくは
ポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100(例えば約3〜約20)である)で独立に置換されたア
ルキル、シクロアルキル、アルキレニル、アルキニル、アリール、ベンジル、ヘテロアリ
ール(ここで、後の3つの基は、-OH、-NH2、又は1つ以上のハロ原子で置換されたC1〜C6ア
ルキルから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)を表すか、或いはR2が、-NR6
(R7)又は-N(R6a)-(CH2)z-SO3 -E+を表し;
R3〜R5及びR3aが、独立に、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていて
もよいC1〜C6アルキルを表し;
R6及びR7が、R6及びR7の少なくとも一方はHでないとの条件で、独立に、H、ピリジニウ
ムイオン、-(CH2)z-NR8(R9)又は-(CH2)z-N+R8(R9)(R10)A-を表し;
R6aが、H、又は-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6
アルキルを表し;
zが、1〜20(例えば、1〜10)を表し;
R8〜R10が、独立に、H、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよ
いアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはヘテロアリールを表し;
E+が、適切なカチオン基(例えば、Na+、K+)を表し;
A-が、適切なアニオン基(例えば、I-、Cl-、Br-)を表す;化合物がある。
挙げることのできる式Iの化合物としては、DがQを表し、Qが、式Ih又はとりわけIgの構
造フラグメントを表す化合物がある。
挙げることのできる式Iのさらなる化合物としては、
(a)bが二重結合を表し、DがQを表し、Qが式Igの構造フラグメントを表し、GがOを表し、R
1が-(CH2)w-C≡C-(CH2)x-Xを表し、R2がアルキルを表す;
(b)bが二重結合を表し、DがQを表し、Qが式Igの構造フラグメントを表し、GがOを表し、R
1が、-(CH2)w-C≡C-(CH2)x-Xを表し、R2が分枝ポリ-エチレンオキシ基で置換されたベン
ジルを表す;
(c)bが二重結合を表し、DがQを表し、Qが式Ihの構造フラグメントを表し、GがOを表し、R
1がHを表し、R2がHを表す;
(d)bが二重結合を表し、Dが-CH2-を表し、Gが直接結合を表し、R1がハロ(とりわけBr)を
表し、R2が-NR6(R7)を表し、R6がアルキニルを表し、R7がHを表す;
(e)bが単結合を表し、Ra及びRbが双方とも-OHを表し、Dが-CH2-を表し、GがOを表し、R1
がハロ(とりわけBr)を表し、R2が分枝ポリ-エチレンオキシ基で置換されたベンジルを表
す;
化合物が含まれる。
よりさらなる態様において、本発明は、式IIIの化合物、或いは医薬として許容し得る
その塩若しくは溶媒和物、又は医薬として機能性のあるその誘導体を提供する。
Figure 2015155442
 式中、
R1、R2は、本明細書中で定義される通りであり;
baが二重結合を表す場合、Daは-CH2-を表し;
baが単結合を表す場合、Daは-C(O)-又は-CH2-を表す。
式IIIの化合物、並びにこのような化合物の医薬として許容し得る塩、溶媒和物、及び
医薬として機能性のある誘導体は、簡潔性のために、以後、合わせて「式IIIの化合物」
と呼ばれる。
挙げることのできる式IIIの化合物としては、R1が、カルボキシル、ヒドロキシル、ア
ミノ又はチオール基と反応することができる官能基を含有する部分を表し、R2が可溶化基
を表す化合物がある。
挙げることのできる式IIIの化合物としては、R1が可溶化基を表し、R2が、カルボキシ
ル、ヒドロキシル、アミノ又はチオール基と反応することができる官能基を含有する部分
を表す化合物がある。
挙げることができる式IIIの化合物としては、
R1が、-(CH2)t-X、-(CH2)u-C(R3)=C(R4)-(CH2)v-X、又は-(CH2)w-C≡C-(CH2)x-Xを表し
;
tが、1〜20(例えば、1〜12)を表し;
uとvとの和が、2〜6であり;
wとxとの和が、2〜15(例えば、2〜10)であり;
Xが、-C(O)-L1、-OH、スルホニルエステル(例えば、メシレート、トシレート)、-NO2、
-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミ
ジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエス
テル(例えば、1,2,3,5,6-ペンタフルオロフェニル、4-スルホ-2,3,5,6-ペンタフルオロフ
ェニル)、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、マレイミジル、アリール、又はヘ
テロアリール(後の2つの基は、-C(O)-L1、-OH、スルホニルエステル(例えば、メシレート
、トシレート)、-NO2、-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒ
ドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、
フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、及びマレイミジ
ルから選択される1つ以上の基で置換されている)を表し;
L1が、-OH、又は適切な脱離基(例えば、-O-C(O)-R5、ハロ、1-オキシベンゾトリアゾイ
ルなどの活性化されたエステル、又はニトロ、フルオロ、クロロ、シアノ、及びトリフル
オロメチルから選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよいアリールオキシ基)を
表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官能基を表し;
R2が、1つ以上の-C(O)O-E+基、-SO3 -E+基、第4級アンモニウム塩、ピリジニウムイオン
、又は直鎖若しくは分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しく
はポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100(例えば約3〜約20)である)で独立に置換された
アルキル、シクロアルキル、アルキレニル、アルキニル、アリール、ベンジル、ヘテロア
リール(ここで、後の3つの基は、-OH、-NH2、又は1つ以上のハロ原子で置換されたC1〜C6
アルキルから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)を表すか、或いはR2が、-N
R6(R7)又は-N(R6a)-(CH2)z-SO3 -E+を表し;
R3〜R5及びR3aが、独立に、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていて
もよいC1〜C6アルキルを表し;
R6及びR7が、R6及びR7の少なくとも一方はHでないとの条件で、独立に、H、ピリジニウ
ムイオン、-(CH2)z-NR8(R9)又は-(CH2)z-N+R8(R9)(R10)A-を表し;
R6aが、H、又は-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6
アルキルを表し;
zが、1〜20(例えば、1〜10)を表し;
R8〜R10が、独立に、H、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよ
いアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはヘテロアリールを表し;
E+が、適切なカチオン基(例えば、Na+、K+)を表し;
A-が、適切なアニオン基(例えば、I-、Cl-、Br-)を表す;化合物がある。
Dへの言及は、以後、Daへも適用されると意図される。同様に、bへの言及は、以後、ba
にも適用される。
挙げることのできる式I又は式IIIの化合物としては、
R1が、式Ia、Ib、Ic、Id、Ie、Ifの構造フラグメント:
Figure 2015155442
 (式中、破線は、分子の残部に対する結合点を示す)を表すか、或いはR1が、-(CH2)t-Z、-
(CH2)u-C(R3)=C(R4)-(CH2)v-Z、又は-(CH2)wC≡C-(CH2)x-Zを表し;
R11が、H、アルキル(-OH、ハロ、及び直鎖若しくは分枝エチレンオキシ基(ここで、オ
リゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100(例えば約3〜約20)である)から選択
される1つ以上の基で置換されていてもよい)、又は直鎖若しくは分枝エチレンオキシ基(
ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100(例えば、約3〜約20)であ
る)を表し;
R12〜R14が、独立に、H、又は-OH、ハロ及び直鎖若しくは分枝エチレンオキシ基(ここ
で、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100(例えば約3〜約20)である)か
ら選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表し;
Y-が、任意の適切なアニオン基(例えば、I-、Br-、Cl-)を表し;
tが、1〜20(例えば、1〜12)を表し;
uとvとの和が、2〜6であり;
wとxとの和が、2〜15(例えば、2〜10)であり;
Zが、-C(O)O-E+、-SO3 -E+、第4級アンモニウム塩、式Ia〜Ifの構造フラグメントを表す
か、或いはZが、1つ以上の-C(O)O-E+基、-SO3 -E+基、第4級アンモニウム塩、ピリジニウ
ムイオン、又は直鎖若しくは分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここでオリゴ
若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100(例えば、約3〜約20)である)で置換され
たアリール、ベンジル、ヘテロアリール(ここで、後の3つの基は、-OH、-NH2、又は1つ以
上のハロ原子で置換されたC1〜C6アルキルから選択される1つ以上の基で置換されていて
もよい)を表し;
E+が、任意の適切なカチオン(例えば、Na+、K+)を表し;
R2が、-C(O)-L3、-OH、スルホニルエステル(例えば、メシレート、トシレート)、-NO2
、-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイ
ミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエ
ステル(例えば、1,2,3,5,6-ペンタフルオロフェニル、4-スルホ-2,3,5,6-ペンタフルオロ
フェニル)、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、マレイミジル、アリール、又は
ヘテロアリール(後の2つの基は、-C(O)-L1、-OH、スルホニルエステル(例えば、メシレー
ト、トシレート)、-NO2、-CHO、-N3、-CN、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒド
ロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フ
ルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル及びマレイミジルか
ら選択される1つ以上の基で置換されている)を表し;
L3が、-OH又は適切な脱離基(例えば、-O-C(O)-R15、ハロ、1-オキシベンゾトリアゾイ
ルなどの活性化されたエステル、又はニトロ、フルオロ、クロロ、シアノ及びトリフルオ
ロメチルから選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよいアリールオキシ基)を表
すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官能基を表し;
R15が、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキ
ルを表す;化合物がある。
特記しない限り、用語「アルキル」は、置換(例えば、1つ以上のハロ原子で)されてい
ても、されていなくてもよい、非分枝又は分枝の、環状の、飽和又は不飽和の(それゆえ
、例えばアルケニル又はアルキニルを形成する)ヒドロカルビル基を指す。用語「アルキ
ル」が非環式基を指す場合、それは、好ましくは、C1〜20アルキル(例えば、C1〜12)、よ
り好ましくはC1〜6アルキル(エチル、プロピル(例えば、n-プロピル若しくはイソプロピ
ル)、ブチル(例えば、分枝若しくは非分枝のブチル)、ペンチル、又はより好ましくはメ
チル)など)である。用語「アルキル」が環状基である場合(基「シクロアルキル」と特定
される場合でよい)、それは、好ましくは、C3〜12シクロアルキル、より好ましくはC5〜1
0(例えば、C5〜7)シクロアルキルである。不確かさの回避に関して、用語「アルケニル」
は、本明細書中で使用する場合、少なくとも2つの炭素及び少なくとも1つの炭素-炭素二
重結合を含有する、先に定義した通りのアルキル基を指し、用語「アルキニル」は、本明
細書中で使用する場合、少なくとも2つの炭素及び少なくとも1つの炭素-炭素三重結合を
含有する、先に定義した通りのアルキル基を指す。
用語「ハロ」及び/又は「ハロゲン」は、本明細書中で使用する場合、フッ素、塩素、
臭素、及びヨウ素を包含する。
用語「アリール」は、本明細書中で使用する場合、C6〜14(C6〜13、例えば、C6〜10な
ど)アリール基を包含する。このような基は、単環式、二環式又は三環式でよく、6〜14個
の環原子を有し、その少なくとも1つの環は芳香族である。アリール基の結合点は、環系
の任意の原子を経由できる。しかし、アリール基が二環式又は三環式である場合、それら
のアリール基は、分子の残部に芳香族環を介して連結される。C6〜14アリール基としては
、フェニル、1,2,3,4-テトラヒドロナフチルなどのナフチル、インダニル、インデニル及
びフルオレニルが挙げられる。最も好ましいアリール基としては、フェニル基が挙げられ
る。
用語「ヘテロアリール」は、本明細書中で使用する場合、N、O及びSから好ましくは選
択される1つ以上のヘテロ原子(例えば1〜4個のヘテロ原子)を含有する芳香族基(それゆえ
、例えば単環、二環又は三環式へテロ芳香族基を形成する)を指す。ヘテロアリール基と
しては、少なくとも1つの環が芳香族であるとの条件で、5〜14(例えば10)員を有し、単環
式、二環式又は三環式でよい基が挙げられる。しかし、ヘテロアリール基が二環式又は三
環式である場合、それらは、分子の残部に芳香族環を介して連結されている。挙げること
のできる複素環式基としては、ベンゾチアジアゾリル(2,1,3-ベンゾチアジアゾリルを含
む)、イソチオクロマニル、より好ましくはアクリジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾ
ジオキサニル、ベンゾジオキセピニル、ベンゾジオキソリル(1,3-ベンゾジオキソリルを
含む)、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾキサジアゾリル(
2,1,3-ベンゾキサジアゾリルを含む)、ベンゾキサジニル(3,4-ジヒドロ-2H-1,4-ベンゾキ
サジニルを含む)、ベンゾキサゾリル、ベンゾモルホリニル、ベンゾセレナジアゾリル(2,
1,3-ベンゾセレナジアゾリルを含む)、ベンゾチエニル、カルバゾリル、クロマニル、シ
ンノリニル、フラニル、イミダゾリル、イミダゾ[1,2-a]ピリジル、インダゾリル、イン
ドリニル、インドリル、イソベンゾフラニル、イソクロマニル、イソインドリニル、イソ
インドリル、イソキノリニル、イソチアジオリル(isothiaziolyl)、イソキサゾリル、ナ
フチリジニル(1,6-ナフチリジニル、又は好ましくは1,5-ナフチリジニル及び1,8-ナフチ
リジニルを含む)、オキサジアゾリル(1,2,3-オキサジアゾリル、1,2,4-オキサジアゾリル
及び1,3,4-オキサジアゾリルを含む)、オキサゾリル、フェナジニル、フェノチアジニル
、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダ
ジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、キノリジニル
、キノキサリニル、テトラヒドロイソキノリニル(1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリニル
及び5,6,7,8-テトラヒドロイソキノリニルを含む)、テトラヒドロキノリニル(1,2,3,4-テ
トラヒドロキノリニル及び5,6,7,8-テトラヒドロキノリニルを含む)、テトラゾリル、チ
アジアゾリル(1,2,3-チアジアゾリル、1,2,4-チアジアゾリル及び1,3,4-チアジアゾリル
を含む)、チアゾリル、チオクロマニル、チオフェネチル、チエニル、トリアゾリル(1,2,
3-トリアゾリル、1,2,4-トリアゾリル及び1,3,4-トリアゾリルを含む)などが挙げられる
。ヘテロアリール基上の置換基は、該当する場合、ヘテロ原子を含む環系中の任意の原子
上に位置することができる。ヘテロアリール基の結合点は、ヘテロ原子(窒素原子など)を
含む(該当する場合)環系中の任意の原子、或いは環系の一部として存在することができる
任意の縮合炭素環式環上の原子を介して存在することができる。ヘテロアリール基は、ま
た、N-又はS-が酸化された形態で存在することができる。とりわけ好ましいヘテロアリー
ル基としては、ピリジル、ピロリル、キノリニル、フラニル、チエニル、オキサジアゾリ
ル、チアジアゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、テトラゾリ
ル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、ピリミジニル、インドリル、ピラ
ジニル、インダゾリル、ピリミジニル、チオフェネチル、チオフェニル、ピラニル、カル
バゾリル、アクリジニル、キノリニル、ベンゾイミダゾリル、ベンズチアゾリル、プリニ
ル、シンノニリル、及びプテリジニルが挙げられる。とりわけ好ましいヘテロアリール基
としては、単環式ヘテロアリール基が挙げられる。
「直鎖のオリゴ又はポリ-エチレンオキシ基」とは、次式-(CH2-CH2-O)xx-CH3のオリゴ-
又はポリ-エチレンオキシ鎖を意味し、式中のxxは、エチレンオキシ基の総数が100を超え
ないとの条件で、2〜100(約3〜約20など)、例えばxxは3でよい。
「分枝オリゴ又はポリ-エチレンオキシ基」とは、1つ以上の-(CH2-CH2-O)-単位が、該
オリゴ-又はポリ-エチレンオキシ単位中への分枝箇所の組込みを可能にする単位(例えば
、-(CH(-O-CH2-CH2-O-)-CH2-O)-)によって代替されているオリゴ又はポリ-エチレンオキ
シ鎖を意味する。
不確かさの回避に関して、式Iの化合物中の2つ以上の置換基の識別が同一物であり得る
場合、それぞれの置換基の実際の識別は、何ら互いに依存することはない。
挙げることのできる式I又は式IIIの化合物としては、bが二重結合を表し、且つDが-CH2
-を表すものがある。挙げることのできる式Iの化合物としては、bが単結合を表し、且つD
が-C(O)-又はCH2-を表すものがある。
挙げることのできる式I又は式IIIの化合物としては、bが単結合を表し、且つDが、-C(O
)-又は-CH2-を表すものがあり、その立体化学は、下記式IA:
Figure 2015155442
 (式中、R1及びR2は、先に定義された通りである)で定義される通りである。
挙げることのできる式I又は式IIIのよりさらなる化合物としては、bが単結合を表し、
且つDが-CH2-を表すものがある。
挙げることのできる式I又は式IIIの化合物としては、
R1が、-(CH2)u-C(R3)=C(R4)-(CH2)v-X又は-(CH2)w-C≡C-(CH2)x-Xを表し;
wとxとの和が2〜10であり;
Xが、-C(O)-L1、-OH、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシス
クシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフ
ェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、マレイミジル、アリール、
又はヘテロアリール(後の2つの基は、-C(O)-L1、-OH、スルホニルエステル(例えば、メシ
レート、トシレート)、-NO2、-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル
、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエス
テル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、及びマレ
イミジルから選択される1つ以上の基で置換されている)を表し;
L1が、-OH又は-O-C(O)-R5を表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化され
るカルボン酸官能基を表し;
R2が、1つ以上の直鎖又は分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここで、オリ
ゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100(例えば、約3〜約20)である)で独立に
置換されたアルキル、シクロアルキル、アルキレニル、アルキニル、アリール、ベンジル
、ヘテロアリール(ここで、後の3つの基は、-OH、-NH2、又は1つ以上のハロ原子で置換さ
れたC1〜C6アルキルから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)を表すか、或い
はR2が、-NR6(R7)又はN(R6a)-(CH2)z-SO3 -E+を表し;
R6及びR7が、R6及びR7の少なくとも一方がHでないとの条件で、独立に、-(CH2)z-NR8(R
9)又は-(CH2)z-N+R8(R9)(R10)A-を表し;
R6aが、H、又は-OH若しくはハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1
〜C3アルキルを表し;
zが、1〜10を表し;
R8〜R10が、独立に、H、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよ
いアルキル又はアルケニルを表し;
A-が、I-、Cl-、Br-を表す;化合物がある。
挙げることのできる式I又は式IIIのさらなる化合物としては、
R1が、-(CH2)wC≡C-(CH2)x-Xを表し;
wとxとの和が2〜10であり;
Xが、-C(O)-L1、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スル
ホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシア
ナト、ヨードアセトアミジル、又はマレイミジルを表し;
L1が、-OHを表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官
能基を表し;
R2が、1つ以上の直鎖又は分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここで、オリ
ゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100(例えば、約3〜約20)である)で独立に
置換されたアリール、ベンジル、ヘテロアリール(ここで、後の3つの基は、-OH、-NH2、
又は1つ以上のハロ原子で置換されたC1〜C6アルキルから選択される1つ以上の基で置換さ
れていてもよい)を表すか、或いはR2は、-NR6(R7)又は-N(R6a)-(CH2)z-SO3 -E+を表し;
R6及びR7が、R6及びR7の少なくとも一方がHでないとの条件で、独立に、-(CH2)z-NR8(R
9)又は-(CH2)z-N+R8(R9)(R10)A-を表し;
R6aが、Hを表し;
zが、1〜10を表し;
R8〜R10が、独立に、H、又は-OH若しくはハロから選択される1つ以上の基で置換されて
いてもよいアルキルを表し;
A-が、I-、Cl-、Br-を表す;化合物がある。
挙げることのできる式I又は式IIIのよりさらなる化合物としては、
R1が、-(CH2)wC≡C-(CH2)x-Xを表し;
wとxとの和が2〜10であり;
Xが、-C(O)-L1、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スル
ホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシア
ナト、ヨードアセトアミジル、又はマレイミジルを表し;
L1が、-OHを表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官
能基を表し;
R2が、1つ以上の直鎖又は分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここで、オリ
ゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100(例えば、約3〜約20)である)で独立に
置換されたアリール、ベンジル、ヘテロアリール(ここで、後の3つの基は、-OH、-NH2、
又は1つ以上のハロ原子で置換されたC1〜C6アルキルから選択される1つ以上の基で置換さ
れていてもよい)を表す;化合物がある。
挙げることのできる式I又は式IIIのよりさらなる化合物としては、
R1が、-(CH2)wC≡C-(CH2)x-Xを表し;
wとxとの和が2〜10であり;
Xが、-C(O)-L1、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スル
ホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシア
ナト、ヨードアセトアミジル、又はマレイミジルを表し;
L1が、-OHを表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官
能基を表し;
R2が、-NR6(R7)を表し;
R6及びR7が、R6及びR7の少なくとも一方がHでないとの条件で、独立に、-(CH2)z-NR8(R
9)又は-(CH2)z-N+R8(R9)(R10)A-を表し;
zが、1〜10を表し;
R8〜R10が、独立に、H、又は-OH若しくはハロから選択される1つ以上の基で置換されて
いてもよいアルキルを表し;
A-が、I-、Cl-、Br-を表す;化合物がある。
挙げることのできる式I又は式IIIの化合物としては、
R1が、先に定義した通りの式Ia、Ib、Ic、Id、Ie、Ifの構造フラグメントを表し;
R11が、H、アルキル(-OH、ハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)、
又は直鎖又は分枝エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総
数は2〜100(例えば、約3〜約20)である)を表し;
R12〜R14が、独立に、H、又はOH、ハロ、及び直鎖又は分枝エチレンオキシ基(ここで、
オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100(例えば、約3〜約20)である)から
選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表し;
Y-が、I-、Br-又はCl-を表し;
R2が、-C(O)-L3、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スル
ホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル(例えば、1,2,3,
5,6-ペンタフルオロフェニル、4-スルホ-2,3,5,6-ペンタフルオロフェニル)、イソチオシ
アナト、ヨードアセトアミジル、又はマレイミジルを表し;
L3が、-OH又は-O-C(O)-R15、ハロ、1-オキシベンゾトリアゾリルなどの活性化エステル
、又はニトロ、フルオロ、クロロ、シアノ及びトリフルオロメチルから選択される1つ以
上の置換基で置換されていてもよいアリールオキシ基を表すか、或いは-C(O)-L1が、カル
ボジイミドで活性化さるカルボン酸官能基を表し;
R15が、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキ
ルを表す;化合物がある。
挙げることのできる式I又は式IIIの化合物としては、
R1が、先に定義した通りの式Ia、Ib、Ic、Id、Ie、Ifの構造フラグメントを表し;
R11が、アルキル、又は直鎖若しくは分枝エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポ
リ-エチレンオキシ基の総数は約3〜約20である)を表し;
R12〜R14が、独立に、H、又はOH、ハロ、及び直鎖又は分枝エチレンオキシ基(ここで、
オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は約3〜約20である)から選択される1つ以上
の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表し;
Y-が、I-、Br-又はCl-を表し;
R2が、-C(O)-L3、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スル
ホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル(例えば、1,2,3,
5,6-ペンタフルオロフェニル、4-スルホ-2,3,5,6-ペンタフルオロフェニル)、イソチオシ
アナト、ヨードアセトアミジル、又はマレイミジルを表し;
L3が、-OH又は-O-C(O)-R15、を表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化さ
れるカルボン酸官能基を表し;
R15が、-OHから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表す;
化合物がある。
代わりの実施態様において、式IIの化合物:
Figure 2015155442
 が提供され、
式中、
D、b、R1、R2、G、Ra及びRbは、先に定義した通りであり;
Mは、Zn(II)、Fe(II)、Ga(II)、Co(II)、Cu(II)、Mn(II)、Ni(II)、Ru(II)、Al(II)、P
t(II)又はPd(II)を表す。
本発明によるとりわけ好ましい化合物を、式IB〜IGの化合物として下記に示す。
Figure 2015155442
Figure 2015155442
Figure 2015155442
「ただ1つのアミン又はチオールと反応性のある」とは、その官能基が、ペプチド担体
中に含まれるアミノ酸上の、或いは利用可能なアミン又はチオール基を有する別のタイプ
の担体上のアミン又はチオールと反応するのに適していることと意図される。複合化に利
用可能なアミン又はチオール基を有するアミノ酸の例は、リシン、アルギニン、ヒスチジ
ン及びシステインである。
式I〜IIIの任意の化合物は、複合用取っ手の適切な活性化を介するタンパク質への複合
に適している可能性があると思われる。複合用取っ手がカルボン酸基中で終端をなす官能
基である場合、活性化は、その基を活性化されたスクシンイミジルエステルに転換するこ
とによって行うことができる。これは、例えば、実施例1で説明するように、N-ヒドロキ
シスクシンイミド及びDCCを用いて達成することができる。
開示される光増感化合物のいずれも、抗体、又はそのフラグメント若しくは誘導体にカ
ップリングされ得ることが意図される。このような複合化に適した化合物は、本明細書中
で明確に開示される。
本発明は、さらに、実施例1中で開示されるような任意の新規な中間化学化合物を包含
する。
さらなる態様において、本発明は、担体分子にカップリングされた式I〜IIIのいずれか
1つの化合物を含む、光増感物質を含む化合物の製造方法であって、
(i)式I〜IIIのいずれか1つの化合物を含む光増感物質を提供する工程;
(ii)担体分子を提供する工程;
(iii)該光増感物質と該担体分子とを、第1及び第2の極性非プロトン性溶媒並びに水性緩
衝液の存在下で複合させる工程;を含む製造方法を提供する。
光増感物質は、本出願中で提供される式I〜IIIのいずれか1つの定義に包含される任意
の化合物であると認識される。光増感物質の好ましい実施態様には、その中のR1がヘキシ
ン酸であり、R2が、短いトリ(エチレングリコール)モノメチルエーテル(TEG)鎖を有する
ベンジルエーテル単位(実施例1中のスキーム2の化合物(10)、これは複合化の前に化合物(
11)に転換される)である、式I〜IIIのいずれか1つの化合物が含まれる。
好ましくは、化合物は、少なくとも3:1の光増感物質:担体分子の比率を構成する。好ま
しくは、光増感物質の担体分子に対する比率は、5:1を超え、より好ましくは10:1を超え
る。比率は、5:1〜10:1又はそれ以上であってもよい。例えば、比率は、20:1又は40:1或
いはそれ以上でもよい。比率は、10:1〜20:1、又は20:1〜40:1でよい。担体がsvFvである
場合、比率は20:1まで又はそれ以上でもよいと認識される。さらに、担体が、Fab又は二
重特異性抗体である場合、比率は40:1まで又はそれ以上でもよいと認識される。40:1の比
率は、全タンパク質のほぼ10%の置換に等しいと予想することができる。
好ましくは、光増感物質及び担体分子の機能的及び物理的特性は、カップリング後でも
実質的に不変である。
それから第1及び第2の極性非プロトン性溶媒が選択される適切な極性非プロトン性溶媒
としては、限定はされないが、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトニトリル、N,N-ジメ
チルホルムアミド(DMF)、HMPA、ジオキサン、テトラヒドロフラン(THF)、二硫化炭素、グ
ライム及びジグライム、2-ブタノン(MEK)、スルホラン、ニトロメタン、N-メチルピロリ
ドン、ピリジン、及びアセトンを含む群が挙げられる。使用できるその他の極性非プロト
ン性溶媒は、当業者にとって周知である。水性混合物に対する双方の極性非プロトン性溶
媒の総量は、約50容積%であるべきである。2種の極性非プロトン性溶媒の互いに対する相
対量は、1〜49%:49〜1%で変えることができる。
好ましくは、第1及び第2の非プロトン性溶媒は、DMSO、DMF、及びアセトニトリルから
なる群から選択される。より好ましくは、第1及び第2の非プロトン性溶媒は、DMSO及びア
セトニトリルである。
さらにより好ましくは、水性緩衝液:第1非プロトン性溶媒:第2非プロトン性溶媒の比率
は、ほぼ50%:1〜49%:49〜1%である。
さらにより好ましくは、非プロトン性溶媒混合物は、92%PBS:2%DMSO:6%アセトニトリル
であり、光増感物質と担体分子を複合させる工程は、0℃〜5℃の温度で行われる。別法と
して、複合工程は、室温以上で行うことができる。「室温」又は「RT」は、約10℃〜約30
℃の温度を意味し、より好ましくは約15℃〜約25℃の温度でよい。溶媒の組合せは、すべ
ての反応物を均一に保ち、ほぼ30分間だけカップリングを実施することによって、高いカ
ップリング率を達成することができ、非共有結合の形成度合いは極めて低い。タンパク質
を安定化するためにより低い温度でカップリングを実施することが考えられるが、より高
い温度は、より高いカップリング率を提供し得る。
本発明は、さらに、担体分子が抗体フラグメント及び/又はその誘導体である方法を提
供する。好ましくは、抗体フラグメント及び/又は誘導体は、単鎖抗体であり、好都合に
はscFvであり得る。担体分子は、好ましくは、ヒト化された又はヒトのものである。
上記プロトコールを使用すると、活性エステルを形成するように誘導体化されたカルボ
ン酸基を有する光増感剤は、抗体フラグメントに表面接近可能な(surface-accessible)リ
シン残基を介して、効率的、且つ高いモル比でカップリングすることができる。ピロフェ
オフォルビドa(PPA)は、天然物から誘導される光増感剤であり、それを理想的な光増感剤
にする優れた光物性とは別に、単一のプロピオン酸側鎖を所持する。PPAのプロピオン酸
官能基を、対応するN-ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHS)又は「活性エステル」に
容易に転換し、クロマトグラフィーと再結晶との組合せで精製して、複合化可能な状態の
極めて純粋な誘導体を得て、その後、抗体フラグメントに効率的にカップリングさせるこ
とができる。
式I〜IIIの化合物は、実施例1に記載のように、PPAから誘導される。好ましい誘導体の
複合化に適した形態への転換も実施例1中で説明される。光増感剤は、単官能性光増感剤
として説明することができる。
当技術分野で記述される多くの光増感物質は、複数の反応性官能基を有する。光増感剤
上での複数の反応性官能基の存在は、いくつかの問題につながる場合がある。複合反応の
化学量論を調節するために実質上純粋な材料を得ることは困難であり、結果として、反応
は、大過剰の反応性光増感剤を使用して実施され、非共有結合の増大をもたらす。また、
複合化中に分子内抗体架橋が起こり、低いカップリング収率及び凝集物形成の増大をもた
らす場合がある。
抗体フラグメントを用いる本発明者らの研究は、複合化中に光増感剤の化学量論を調節
すること、及びリシン残基に幾何学的に十分な間隔をもたせることが、高い光増感剤の装
填及び優れたPDT活性を備えた光免疫複合体をもたらすことができることを示した。
本発明の光増感剤の担体分子への複合プロセスは、250μg/mL以上の担体分子濃度で実
施することが好ましい。これは、250μg/mL〜5mg/mLの濃度でよい。別法として、それは
、2、3、4又は5mg/mLなどの1mg/mLを超える濃度でよい。好ましくは、担体分子の濃度は
、約5mg/mL以上である。例えば、担体分子の濃度は、10mg/mL以上まででよい。このよう
な濃度は、担体分子がペプチドである場合にとりわけ考慮される。より好ましくは、担体
のこれらの濃度は、担体が抗体又はそのフラグメントである場合に適用できる。複合工程
をより高い担体濃度(例えば、より高い抗体濃度)で実行する能力は、当技術分野で提供さ
れる光増感剤に比べて、より高い式I〜IIIの化合物の水性溶液への溶解性に由来する。よ
り高い抗体濃度で複合工程を実施することは、より高い濃度の光免疫複合体につながる。
このことは、患者に高用量の薬剤を投与することができるので、療法サイクルの総合的結
果に対して有益な効果を有すると考えられる。
好都合には、本発明の方法は、さらに、工程(iii)の後に実施される次の工程を含むこ
とができる:
(iv)調節剤を担体分子にカップリングさせる工程(ここで、該調節剤は、光増感物質の機
能を調節する能力がある)。
光増感剤をリガンドにカップリングさせることと同様に、類似のカップリング化学を使
用して、その他の分子をリガンドに、それらが光-免疫複合体全体の光物理学的又は光線
力学的特性を調節するような方式でカップリングさせることも可能である。これらの代替
分子は、光増感剤の場合と同様の残基型に、化学量論的比率でカップリングさせることが
でき（すなわち、光増感剤のカップリングの前又は後に）、双方のタイプの分子を、異な
る残基型上でカップリングさせる/収容させる(例えば、光増感剤がリシン上にカップリン
グされ、続いて修飾化学物質がアスパラギン酸/グルタミン酸残基にカップリングする)。
光線力学的調節剤は、光増感剤の光照明で生成された反応性酸素種の種類及び量を変え
るのに役立つ可能性がある。例えば、II型反応(すなわち、一重項酸素)をより生じさせる
光増感剤を、高濃度のスーパーオキシド及びヒドロキシドラジカルを伴うI型反応をより
生じさせるように調節することができる。このことは、PDTの有効性又は治療結果に対し
て重要な関連を有する可能性がある。例えば、非内部移行性腫瘍抗原を標的とする光免疫
複合体は、それが、細胞の表面で主にI型反応を引き起こす場合、より強力である可能性
があり、膜損傷を引き起こし、スーパーオキシドジスムターゼ(細胞内で生成された)など
の抗酸化応答に対する敏感性がより小さい。
好ましくは、該調節剤は、安息香酸;4-アジドテトラフルオロフェニル安息香酸のよう
にアジド基を含有する安息香酸;及びアジド部分(N3)を含有する、ポリフルオロベンゼン
、ナフタリン、ナフタキノン、アントラセン、アントラキノン、フェナントレン、テトラ
セン、ナフタセンジオン、ピリジン、キノリン、イソキノリン、インドール、イソインド
ール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピラジン、ベンズイミダゾール、ベンゾフ
ラン、ジベンゾフラン、カルバゾール、アクリジン、アクリドン、フェナントリジン、キ
サンチン、キサントン、フラボン、及びクマリンを含めたその他の芳香族又はヘテロ芳香
族基からなる群から選択される。芳香族及びヘテロ芳香族スルフェネートが、上記の芳香
族/へテロ芳香族基から誘導された。その他の具体的な調節剤としては、トロロクスの様
なビタミンE類似体、ブチルヒドロキシルトルエン、没食子酸プロピル、デオキシコール
酸、及びウルサデオキシコール酸(ursadeoxycholic acid)が挙げられる。光増感剤と一緒
にリガンドにカップリングさせることのできる化学調節剤の一例が、安息香酸(BA)のスク
シンイミジルエステルである。
これは、PPaと共に抗CEAscFvに共カップリングされると、PPa単独とカップリングされ
たscFvと比較して、より強力なPDTのインビトロでの細胞死滅をもたらすことを示した。
好ましくは、該方法は、工程(iii)又は(iv)の後に実施される次の工程をさらに含む:
(v)化合物を医薬として許容し得る担体と組み合わせて医薬製剤を形成する工程。
本発明の方法は、可視化剤を複合体にカップリングさせる任意選択の工程を含むことも
できる。別法として、複合体の一部を形成する光増感物質を、可視化剤として使用するこ
ともできる。
可視化剤は、蛍光又は発光色素でよい。代わりに又は付加的に、可視化剤は、MRI用造
影剤でよい。「MRI用造影剤」は、当技術分野で十分に理解されているように、磁気共鳴
造影のための造影剤を意味する。医療での使用に関して承認されている多くのMRI用造影
剤は、ガドリニウムをベースにした薬剤である。本発明の文脈中で使用するのに適した薬
剤としては、非イオン性薬剤、ヨウ素化されたコントラスト材料、イオン性キレート、極
小超磁性酸化物粒子、及び当業者にとって既知である任意の適切な薬剤を挙げることがで
きる。例えば、MRI用造影剤は、ガドジアミド又はガドテリドールでよい。
免疫によるアッセイ又は診断における組換え抗体の使用は、十分に研究された領域であ
る。抗体及び抗体フラグメントの鋭敏な特異性、高い親和性、及び多用性は、それらを、
検出系の一部としての理想的な結合形成分子にする。例えば、医療用造影において、抗体
は、蛍光色素などの光学的に活性な化合物に連結され、前がん性及びがん性病変を検出、
治療応答を測定、及び再発の早期発見に使用され[95]、インビトロで、蛍光標識化抗体を
用いて伝播性海綿状脳症(プリオン病)が検出された[96]。
臨床的に有用な腫瘍造影は、小さな病変の検出を必要とする。次いで、検出の利益を、
早期処置によって現実化することができる。従来の造影技術に付随する問題の1つは、背
景に対する腫瘍の不十分なコントラストである。腫瘍中での標的指向性分子の局在を増大
させるために、及び正常組織によるそれらの取込みを低減し、かくして腫瘍内:組織比率
を向上させるために、種々の戦略が開発されて来た。これらの取組みには、好ましい薬物
動態を有する小さな腫瘍特異的ペプチド分子[97]を開発すること;改善された標識化技術[
98]、事前標的指向化戦略を使用すること、腫瘍送達を調節すること、及び腫瘍マーカー
の発現を上向き調節することが含まれる。加えて、いくつかの新規な色素が開発された[9
9]。インビボ造影に望ましい多くの特性を有する遠赤外蛍光色素が合成されている。遠赤
外蛍光色素は、血液及び組織が比較的透過性である波長で吸収及び発光し、高い量子収率
を有し、且つ蛍光色素の抗体に対するより高いモル比でさえも良好な溶解性を有する。単
鎖Fvフラグメントなどの小さな抗体種は、良好なコントラスト比をもたらすことができる
薬物動態を所持するが、急速に消失し、標的組織中でレポーター基の低い絶対レベルをも
たらす。より高い蛍光収率は、このより低い堆積を補償して、検出感度を増大させること
ができる。
造影のその他の応用には、研究ツールの開発が含まれる。色素で標識された抗体は、受
容体輸送などの細胞の生物学的過程を可視化することにおいて極めて貴重であった[100]
。増大した蛍光収率は、低存在量の分子の検出及び監視を可能にするであろう。標識され
た細胞を可視化するための通常の方法は、免疫蛍光顕微鏡法であり、そこでは、多重標識
化分子を、異なり且つ重ならない蛍光発光スペクトルを有する一連の特異抗体を使用して
同時的に監視することができる。
色素分子の抗体フラグメント又は他の適切なリガンドへの開示されたカップリング条件
を使用するカップリングは、より高い装填比率をもたらす。このことは、増強された光物
理学的特性に直接的につながる。改善されたPDTのためのより高い一重項酸素の生成に加
えて、優れた光物理学的特性は、増大した蛍光として現れ得る。適切な色素分子との抗体
フラグメント光-免疫複合体は、それらの好ましい薬物動態及び高められた蛍光のため、
より効果的な診断試薬となり得る。急速なクリアランス及び低い非特異的な組織への結合
は、極めて高いコントラスト比につながり、高い蛍光は、出力シグナルのより敏感な検出
を可能にする。上記のように、カップリングのために好ましく間隔をあけた官能基(例え
ばリシンのアミノ基)を含有するように構築され、選択され又は遺伝子操作された抗体フ
ラグメントの使用は、消光及び誤った相互作用の低減のため、より好ましい蛍光を有する
色素につながり得る。このことは、主に医用造影において応用分野を有するが、診断キッ
ト又は細胞造影のためのより敏感な試薬を調製するのに使用することもでき、蛍光色素及
び光増感剤を同一の抗体フラグメントにカップリングさせることによって、二重機能性薬
剤を製造し、腫瘍造影及び光線療法の双方を可能にすることができる。
本発明のさらなる態様において、本発明の方法で得ることのできる化合物が提供される
。該化合物は、本発明の光増感剤にカップリングされた担体を含むと予想できる。この態
様の実施態様において、本発明は、本発明の方法で得ることのできる化合物は、担体分子
に3:1の最小比率でカップリングされた本発明の光増感剤を含むことが想定される。カッ
プリング比率は、5:1、10:1、20:1、40:1、又はこれらの値の間の任意の値でよく、或い
はカップリング比率は、より高くてもよい。さらなる実施態様では、担体分子を、標的細
胞に選択的に結合することができると考えられる。
好ましくは、担体分子は、光増感剤に対比して3:1の上限サイズ、典型的には30kDaの上
限を有する。このような担体の例がscFvである。
有利には、光増感物質及び担体分子の機能的及び物理的特性は、カップリングされてい
ない形態での特性に比較して、カップリングされた形態で実質的に不変である。
好ましくは、担体分子は、抗体フラグメント及び/又はその誘導体、或いは非免疫原性
ペプチドリガンドからなる群から選択される。
好都合には、抗体フラグメント及び/又はその誘導体は、単鎖抗体フラグメント、とり
わけscFvである。
別法として、担体分子は、ヒト化されているか、又はヒトのものである。
好ましくは、光増感物質は、本出願中に記載の式Iの化合物である。
好都合には、光増感物質は、担体分子に、担体分子上のアミノ酸残基又は糖分子の位置
でカップリングされる。
好ましくは、アミノ酸残基は、リシン、システイン、チロシン、セリン、グルタミン酸
、アスパラギン酸、及びアルギニンからなる群から選択される少なくとも1つである。別
法として、糖分子は、ヒドロキシル基を含む糖、アルデヒド基を含む糖、アミノ基を含む
糖、及びカルボン酸基を含む糖からなる群の少なくとも1つから選択される。
光増感剤をリシン残基にカップリングさせることは、一般に簡単であるが、上記の複合
化の方法論は、光増感剤部分上の様々な官能基を使用する他のアミノ酸残基を介する、又
はN-又はO-に連結されるグリコシル化によってタンパク質に結合された糖分子を介する、
光増感剤の抗体フラグメントへのカップリングに応用することもできる。表1に、これら
の残基、及びこのカップリング法と共に使用できるその他の考え得るカップリング化学を
列挙する。
Figure 2015155442
Figure 2015155442
抗体フラグメントは、アミノ酸配列、並びに光増感剤をカップリングさせる官能基の数
及び間隔を異にする。最も一般的で頻繁に使用される複合用官能基は、上記のように、N-
末端に及びリシン残基上に見出される第1級アミンである。本発明者らは、驚くべきこと
に、特定の光増感剤-抗体フラグメント複合体の有効性の主な決定子は、光増感剤分子が
結合される残基の空間的分離であることを見出した。これらの残基は、効果的なカップリ
ング及び生じる複合体の最適な光物理学的特性のために、抗体の表面上で識別され、トポ
ロジー的に離れていなければならない。
光増感剤がカップリングされる可能性のある最適な位置との関連で、ヒト免疫グロブリ
ンの可変領域に関するより詳細な分析は、国際公開第2007/042775号中に提供されている
。
相互作用を最小化するように、担体分子上で光増感物質を離して間隔をあけることが考
えられる。したがって、光増感物質をカップリングさせる残基は、互いにあまりに密であ
ってはならない。他に対して密である残基の定義は、3次元構造において近接している残
基であり得る。
別法として、残基を、一次配列により間隔をあけることができるが、抗体ドメインの折
り畳み構造により空間的に隣接している可能性がある。直接的に隣接した残基とは、3〜4
オングストロームの空間的間隔と定義することができる。
本発明者らは、直接的に隣接しているリシン残基上への光増感剤のカップリングは、光
物理学的消光及びより不十分な光線力学的効果(凝集増加及び光免疫複合体のより不十分
な溶解性)をもたらすことを見出した。カップリングは、リシン残基を、好ましくは2つの
アミノ酸を隔てて(3.5〜7.5オングストローム)、より好ましくは3つのアミノ酸を隔てて(
9〜12オングストローム)、より好ましくは4つのアミノ酸を隔てて(10〜15nm)、さらによ
り好ましくは5つのアミノ酸を隔てて(15〜20nm)、よりさらにより好ましくは6つのアミノ
酸を隔てて(20〜25nm)、さらに間隔をあけた場合に、より効果的である。抗体は、これら
の特性を所持するように選ばれ、選択され、又は遺伝子操作されるべきである。抗体が、
より最適な間隔をあけてより多くのリシン残基を所持すればするほど、ますます、抗体は
、最適な光物理学的及び光線力学的効果を伴って効果的で強力な光免疫複合体を形成する
。
光増感剤のカップリングのためのアミノ酸残基が、互いに密であるか又は隣接している
かどうかを判定する方法は、当技術分野で周知である。クラスター配列アラインメント(h
ttp://www.ebi.ac.uk/clustalw/欧州バイオインフォマティクス研究所などのウェブリソ
ースを使用する)は、アミノ酸一次配列を比較するための十分に確立されたツールである
。さらに、抗体フラグメントに関する完全な3次元構造データの不在下では、抗体フラグ
メントのありそうな構造を導き出し、それによって、カップリング用残基が空間的に密で
あるか、又は隣接しているかどうかを確認するために、既知構造(例えば、マウスscFvの
構造[89])を利用するホモロジーモデリングなどの十分に確立された技術を使用すること
が可能である。抗体及び抗体フラグメントによって呈示される高度の相同性は、高度の信
頼性を以ってこれらの技術を適用できることを意味する。ホモロジーモデリングのための
ウェブリソース、例えば、無料のデスクトップのモデリングプログラムSwissPDB Viewer
も提供しているスイスバイオインフォマティクス研究所(Swiss Institude of Bioinfomat
ics)からのExpert Bioinformatics Analysis System(http://us.expasy.org)を利用でき
る(Guex,N.及びPeitsch,M.C.の文献(1997)「SWISS-MODEL及びSwiss-PdbViewer:タンパク
質比較モデリングのための環境(SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer:An environment
for comparative protein modeling)」Electrophoresis 18,2714〜2723)。
scFv上のリシン残基のこのような好ましい分布の例が、国際公開第2007/042775号中に
提供されている。リシン残基の分布が複合化及び最適な光物理学的特性にとってあまり好
ましくない場合、不十分に間隔をあけた(あまりに密に配置された)残基を除去するために
又は十分に間隔をあけた残基を導入するために、部位特異的突然変異誘発などの標準的な
分子生物学的技術を使用して、抗体フラグメントを改変することができる。
上記概念は、また、間隔あけ、及びリシン以外の他のアミノ酸残基への、又はタンパク
質にN-若しくはO-で連結されるグリコシル化によって結合された糖分子へのカップリング
に適用することができる。表1に、これらの残基、及び使用できる考え得るカップリング
化学を列挙する。
上記概念は、また、非抗体をベースにしたリガンドに適用することができる。光増感剤
を標的指向化に使用することができ、アミノ酸の間隔あけによって影響を及ぼすこともで
きるリガンドの例を表2に挙げる。
Figure 2015155442
このことは、それらの光物理学的特性及びその結果として良好な光線力学療法機能を保
持するカップリング型光増感剤につながる。多くのリシン残基が、一次配列中又は3次元
空間中で隣接している抗体の多くの例が存在する。分子モデリング及び部位特異的突然変
異誘発によって、これらのリシン残基の位置を遺伝子操作し、あまりに少ない場合さらな
る残基を付加し、隣接残基を除去、或いは他との距離を増加させることができる。
このことは、光増感剤のカップリングをより受け入れやすく、より高い装填(光増感剤:
抗体比率の増加)及びより強力なPDT効果を達成する能力のある抗体フラグメントにつなが
る。高めたれた光物理学的特性の1つの間接的尺度は、増大した蛍光である。
有利には、化合物は、さらに、担体分子にカップリングされる光増感剤の機能を調節す
る能力のある調節剤を含む。好ましくは、該調節剤は、安息香酸;4-アジドテトラフルオ
ロフェニル安息香酸のようにアジド基を含有する安息香酸誘導体;及びアジド部分(N3)を
含有する、ポリフルオロベンゼン、ナフタリン、ナフタキノン、アントラセン、アントラ
キノン、フェナントレン、テトラセン、ナフタセンジオン、ピリジン、キノリン、イソキ
ノリン、インドール、イソインドール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピラジン
、ベンズイミダゾール、ベンゾフラン、ジベンゾフラン、カルバゾール、アクリジン、ア
クリドン、フェナントリジン、キサンチン、キサントン、フラボン、及びクマリン類を含
めたその他の芳香族又はヘテロ芳香族基からなる群から選択される。芳香族及びヘテロ芳
香族スルフェネートが、上記の芳香族/へテロ芳香族基から誘導された。その他の具体的
な調節剤としては、トロロクスのようなビタミンE類似体、ブチルヒドロキシルトルエン
、没食子酸プロピル、デオキシコール酸、及びウルサデオキシコール酸が挙げられる。
好都合には、化合物は、さらに、可視化剤、例えば、蛍光色素又は発光色素(上記参照)
を含む。別法として又は付加的に、可視化剤は、MRI用造影剤でよい。
本発明の複合体の好ましい例は、担体分子がC6(抗Her-2)scFvであり、光増感物質が、
式中のR1がヘキシン酸でありR2が短いトリ(エチレングリコール)モノメチルエーテル(TEG
)鎖を有するベンジルエーテル単位である式Iの化合物(実施例1中のスキーム2の化合物(10
)、これは、複合化の前に化合物(11)に転換される)である。この好ましい例による化合物
は、インビトロで優れた細胞死滅を示し、標的細胞と非標的細胞とを識別することが可能
で、最小の暗所毒性を有した。該化合物は、また、C6-PPa光免疫複合体に比べて、急速な
腫瘍への取込み及びより高い腫瘍内:血液内比率をもたらす改善された薬物動態を提示し
、このことは、皮膚光感受性の危険が極めて少なく治療上極めて魅力的である可能性があ
る。総合的に、好ましい実施態様の化合物は、インビボで腫瘍細胞の極めて効果的な死滅
を示し、腫瘍をもつマウスにおける2回の投与/2回の光線処置の後に、完全な腫瘍退縮が
観察された。
本発明のさらなる態様において、標的細胞の破壊を必要とする疾患の診断及び/又は治
療及び/又は予防における本発明の化合物の使用が提供される。
また、標的細胞の破壊を必要とする疾患の診断及び/又は治療及び/又は予防のための薬
剤の製造における本発明の化合物の使用が提供される。
本発明は、さらに、標的細胞の破壊を必要とする疾患の診断及び/又は治療及び/又は予
防において使用するための本発明の化合物を提供する。
好ましくは、治療すべきの疾患は、がん、加齢性黄斑変性症、免疫障害、心血管疾患、
及びウイルス、細菌又は真菌感染症を含む微生物感染症、プリオン病、並びに口腔/歯科
疾患からなる群から選択される。プリオン病の例には、ウシ海綿状脳症(BSE)、スクレイ
ピー、クールー、クロイツフェルトヤコブ病(CJD)、及びその他の伝播性海綿状脳症が含
まれる。口腔/歯科疾患の例には、歯肉炎が含まれる。
最も好ましくは、治療予定の疾患は、結腸、肺、***、頭頸部、脳、舌、口腔、前立腺
、精巣、皮膚、胃/消化管、膀胱のがん、及びバレット食道などの前がん病変である。
好都合には、疾患の診断は、光増感物質、又は蛍光色素若しくは発光色素などの任意選
択の可視化剤のいずれかの可視化によって行われる。
有利には、化合物又は組成物は、光線曝露に先立って患者に投与される。
本発明のよりさらなる態様において、本発明の化合物及び医薬として許容し得る担体、
賦形剤又は希釈剤を含む組成物が提供される。
本発明のさらなる態様は、本発明による化合物を、医薬として又は獣医学的に許容し得
る補助剤、希釈剤又は担体との混合物の状態で含む医薬製剤を提供する。
好ましくは、該製剤は、活性成分の1日当たりの用量若しくは単位、その1日当たりの下
位用量又は適切な画分を含む単位投薬量である。
本発明の化合物は、通常、経口又は任意の非経口経路により、活性成分を含む医薬製剤
の形態で、任意選択で、非毒性の有機又は無機の酸又は塩基付加塩の形態で、医薬として
許容し得る剤形で投与される。治療予定の障害及び患者、並びに投与経路に応じて、組成
物を異なる用量で投与することができる。
ヒトの療法において、本発明の化合物は、単独で投与することができるが、一般には、
意図した投与経路及び標準的な薬学的実践を考慮して選択される適切な医薬賦形剤、希釈
剤又は担体との混合物の状態で投与される。
例えば、本発明の化合物は、経口、頬側又は舌下で、風味剤又は着色剤を含有し得る錠
剤、カプセル剤、胞嚢剤、エレキシル剤、溶液剤又は懸濁剤の形態で、即時、遅延又は制
御放出での適用のために投与することができる。本発明の化合物は、また、陰茎海綿体内
注射を介して投与することができる。
このような錠剤は、微結晶セルロース、乳糖、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、
二塩基性リン酸カルシウム及びグリシンなどの賦形剤;デンプン(好ましくはコーン、ポテ
ト又はタピオカデンプン)、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナト
リウム、及び特定の複合ケイ酸塩などの崩壊剤;並びにポリビニルピロリドン、ヒドロキ
シプロピルメチルセルロース(HPMC)、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、ショ糖、ゼ
ラチン及びアラビアゴムなどの造粒用結合剤を含有することができる。さらに、ステアリ
ン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル及びタルクなどの滑沢剤を含むこ
とができる。
類似タイプの固形組成物は、また、ゼラチンカプセル剤中の充填剤として採用できる。
これに関して好ましい賦形剤としては、乳糖、デンプン、セルロース、ミルク糖、又は高
分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。水性懸濁剤及び/又はエレキシル剤の場合
、本発明の化合物は、種々の甘味剤又は風味剤、着色用物質又は色素と;乳化剤及び/又は
懸濁剤と;並びに水、エタノール、プロピレングリコール、及びグリセリンなどの希釈剤
と、並びにこれらの組合せと、組合せることができる。
本発明の化合物は、また、非経口で、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、鞘内、脳室内
、胸骨内、頭蓋内、筋内又は皮下で投与することができ、或いはそれらは、点滴技術によ
り投与することができる。それらは、その他の物質、例えば、溶液剤を血液と等張にする
のに十分な塩類又はグルコースを含有することのできる滅菌水性溶液の形態で使用するの
が最良である。必要な場合、水性溶液剤を適切に(好ましくは3〜9のpHに)緩衝化すべきで
ある。適切な非経口製剤の滅菌条件下での調製は、当業者に周知の標準的な製剤技術によ
って容易に達成される。
非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び対象とする受容者
の血液と等張の製剤を与える溶質を含有し得る水性及び非水性滅菌注射用溶液剤;並びに
懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁剤が挙げられる。製剤は、単位用量
又は複数用量用容器、例えば、密閉アンプル及びバイアル瓶の状態で提供することができ
、使用直前に滅菌液体担体、例えば、注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ(
凍結乾燥)された状態で貯蔵することができる。即席注射用の溶液剤及び懸濁剤は、前に
説明した類の滅菌粉剤、顆粒剤、及び錠剤から調製することができる。
ヒト患者への経口及び非経口投与に関して、本発明の1日当たりの投与量レベルは、通
常、1mg/kg〜30mg/kgである。したがって、例えば、本発明化合物の錠剤又はカプセル剤
は、該当する場合、一度に1つ又は2つ以上での投与のために、ある用量の活性化合物を含
有することができる。医師は、任意の事象において、任意の個々の患者に対して最も適し
ており、且つ年齢、体重及び特定の患者の応答で変化する、実際の投与量を決定するであ
ろう。上記投与量は、平均的事例の典型である。もちろん、より多い又はより少ない投与
量範囲がふさわしい個別的事例が存在することがあり、このような場合も本発明の範囲に
包含される。
本発明の化合物は、また、鼻腔内又は吸入で投与することができ、好都合には乾燥粉末
吸入器、或いは加圧された容器、ポンプ、スプレー又はネブライザーから適切な噴射剤、
例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオ
ロエタン、1,1,1,2-テトラフルオロエタン(HFA134A3)又は1,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロ
プロパン(HFA227EA3)などのヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素、又はその他の適切な
気体を用いて提供されるエーロゾル噴霧の形態で送達される。加圧されたエーロゾルの場
合、投与量単位は、定量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定され
る。加圧された容器、ポンプ、スプレー又はネブライザーは、滑沢剤例えばトリオレイン
酸ソルビタンを付加的に含有することのできる、例えば、溶媒としてエタノールと噴射剤
との混合物を使用する、活性化合物の溶液剤又は懸濁剤を含有することができる。吸入器
又は空気吸入器中で使用するためのカプセル剤及びカートリッジ剤(例えばゼラチンから
作られた)は、本発明の化合物と乳糖又はデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物
を含有するように製剤することができる。
エーロゾル又は乾燥粉末製剤は、好ましくは、患者に送達するために、それぞれ定量さ
れた用量又は「1吹き(puff)」が、適切な用量の本発明の化合物を送達するように設計さ
れる。エーロゾルでの1日の全投与量は、患者によって異なり、単回投与で、又はより通
常的には分割された投与量でその日の間に投与することができる。
別法として、本発明の化合物は、坐剤又は膣坐剤の形態で投与することができ、或いは
、ローション剤、溶液剤、クリーム剤、軟膏剤又は粉剤の形態で局所適用することができ
る。本発明の化合物は、また、経皮で、例えば、皮膚パッチを使用して投与することがで
きる。それらは、また、とりわけ眼疾患を治療するために眼経路で投与することができる
。
眼に使用する場合、本発明の化合物は、等張の、pHを調整した滅菌生理食塩水中のミク
ロ化懸濁剤として、又は好ましくは、任意選択で塩化ベンジルアルコニウムなどの防腐剤
と組み合わせた等張の、pHを調整した滅菌生理食塩水中の溶液剤として製剤することがで
きる。別法として、それらは、ペトロラタムなどの軟膏の状態で製剤することもできる。
皮膚へ局所で適用する場合、本発明の化合物は、例えば、以下もの:ミネラルオイル、
液状ペトロラタム、白色ペトロラタム、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリ
オキシプロピレン化合物、乳化用ワックス、及び水の1種以上との混合物中に懸濁又は溶
解された活性化合物を含有する適切な軟膏剤として製剤することができる。別法として、
それらは、例えば、以下もの:ミネラルオイル、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチ
レングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート60、セチルエステルワックス、セテア
リールアルコール、2-オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水の1種以上の
混合物中に懸濁又は溶解された適切なローション剤又はクリーム剤として製剤することが
できる。
口腔内での局所投与に適した製剤としては、風味のある基剤、通常的にはショ糖及びア
ラビアゴム又はトラガカントゴム中に活性成分を含むロゼンジ剤;ゼラチン及びグリセリ
ンなどの不活性基剤、又はショ糖及びアラビアゴム中に活性成分を含むパステル剤:及び
適切な液状担体中に活性成分を含む含嗽剤が挙げられる。
一般に、ヒトにおいて、本発明の化合物の経口又は局所投与は、好ましい経路であり、
最も好都合である。受容者が、経口投与後の嚥下障害又は薬物吸収障害に罹患している状
況では、薬物を非経口で、例えば舌下又は頬側で投与することができる。
獣医学的使用の場合、本発明の化合物は、通常の獣医学的実践と一致した適切に許容し
得る製剤として投与され、獣医師は、特定の動物に最も適切である投与レジメン及び投与
経路を決定するであろう。
(使用される用語の意味)
用語「抗体フラグメント」は、抗体、抗体フラグメント、又は抗体誘導体のいずれか1
つを指すと解釈されるものとする。その用語は、野生型抗体(すなわち、4本のポリペプチ
ド鎖を含む分子);合成抗体;組換え抗体;又は限定はされないが、免疫グロブリンの軽鎖及
び/又は重鎖の可変及び/又は定常領域のファージディスプレイによって産生される修飾さ
れた単鎖抗体分子、或いは当業者にとって既知である免疫アッセイフォーマットにおいて
抗原に結合する能力のあるその他の免疫相互作用性分子などの抗体ハイブリッドを包含す
ると解釈される。
用語「抗体誘導体」は、抗体フラグメント(例えば、Fab又はFvフラグメント)、或いは
別のペプチド又はポリペプチドへの、大きな担体タンパク質への、又は固体支持体(例え
ば、数ある中でも、アミノ酸であるチロシン、リシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、
システイン及びそれらの誘導体、NH2-アセチル基、又はCOOH-末端アミド基)への抗体のカ
ップリングを促進するために、1つ以上のアミノ酸又はその他の分子の付加によって修飾
されている抗体分子などの、当業者にとって既知である免疫アッセイフォーマットにおい
て抗原に結合する能力のある任意の修飾された抗体分子を指す。
用語「scFv分子」は、VH及びVLパートナードメインが、柔軟性のあるオリゴペプチドで
連結されている任意の分子を指す。
用語「ヌクレオチド配列」又は「核酸」又は「ポリヌクレオチド」又は「オリゴヌクレ
オチド」は、互換的に使用され、ヌクレオチドのヘテロポリマー又はこれらのヌクレオチ
ドの配列を指す。これらの表現は、また、1本鎖又は2本鎖でよいゲノム又は合成起源のDN
A又はRNAを指し、ペプチド核酸(PNA)に対する又は任意のDNA様若しくはRNA様材料に対す
るセンス又はアンチセンス鎖を表すことができる。本明細書中の配列中で、Aはアデニン
であり、Cはシトシンであり、Tはチミンであり、Gはグアニンであり、NはA、C、G又はT(U
)である。ポリヌクレオチドがRNAである場合、本明細書中に示される配列中のT(チミン)
は、U(ウラシル)で置き替えられると考えられている。一般に、本発明によって提供され
る核酸セグメントは、ゲノムのフラグメント及び短いオリゴヌクレオチドリンカーから、
又は一連のオリゴヌクレオチドから、又は個々のヌクレオチドから編成され、微生物若し
くはウイルスのオペロン、又は真核生物の遺伝子に由来する調節エレメントを含む組換え
転写単位中で発現される能力のある合成核酸を提供することができる。
用語「ポリペプチド」又は「ペプチド」又は「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペ
プチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列、或いはこれらのフラグメントを、及び天然
に存在する又は合成の分子を指す。ポリペプチドの「フラグメント」、「部分」又は「セ
グメント」は、少なくとも約5個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約7個のアミノ酸、よ
り好ましくは少なくとも約9個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約17個以上のアミ
ノ酸からなる連続したアミノ酸残基である。活性を有するためには、いずれのポリペプチ
ドも、生物学的及び/又は免疫学的活性を提示するのに十分な長さを有さなければならな
い。
用語「精製された」又は「実質上精製された」は、本明細書中で使用する場合、指摘し
た核酸又はポリペプチドが、別の生物学的巨大分子、例えば、ポリヌクレオチド、タンパ
ク質などを実質的に含まない状態で存在することを意味する。一実施態様において、ポリ
ヌクレオチド又はポリペプチドは、それが、存在する指摘した生物学的巨大分子の少なく
とも95重量%、より好ましくは少なくとも99重量%を構成するように精製される(しかし、
水、緩衝剤、及びその他の小型分子、特に1000ダルトン未満の分子量を有する分子は存在
することができる)。
用語「単離された」は、本明細書中で使用する場合、その天然供給源中にその核酸又は
ポリペプチドと共に存在する少なくとも1種の別の成分(例えば、核酸又はポリペプチド)
から分離された核酸又はポリペプチドを指す。一実施態様において、その核酸又はポリペ
プチドは、(もしあれば)溶媒、緩衝剤、イオン、又は同じ溶液中に通常的に存在するその
他の成分のみが存在する状態で見出される。用語「単離された」及び「精製された」は、
それらの天然供給源中に存在する核酸又はポリペプチドを包含しない。
用語「組換えの」は、本明細書中で使用する場合、ポリペプチド又はタンパク質を指し
、ポリペプチド又はタンパク質が、組換え発現系(例えば、微生物、昆虫、又は哺乳動物)
に由来することを意味する。「微生物の」は、細菌又は真菌(例えば、酵母)の発現系中で
作られた組換えポリペプチド又はタンパク質を指す。産生物として、「組換え微生物の」
は、天然の内生物質を本質的に含まず、且つ関連する天然のグリコシル化を伴わないポリ
ペプチド又はタンパク質を説明する。ほとんどの細菌培養物、例えば大腸菌中で発現され
たポリペプチド又はタンパク質は、グリコシル化修飾を含まず、酵母中で発現されたポリ
ペプチド又はタンパク質は、哺乳動物細胞中で発現されたものと一般には異なるグリコシ
ル化のパターンを有する。
用語「発現ベクター」は、DNA(RNA)配列からポリペプチドを発現するためのプラスミド
又はファージ又はウイルス又はベクターを指す。発現媒体は、(1)遺伝子発現において調
節の役割を有する遺伝因子又は因子群、例えば、プロモーター及びしばしばエンハンサー
;(2)mRNAに転写され、タンパク質に翻訳される構造又はコード配列;及び(3)適切な転写及
び翻訳の開始及び終止配列の集まりを含む転写単位を含むことができる。酵母又は真核生
物の発現系中で使用するために意図された構造単位は、好ましくは、宿主細胞による翻訳
されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。別法として、組換えタ
ンパク質がリーダー又は輸送配列なしで発現される場合、それは、アミノ末端メチオニン
残基を含むことができる。この残基は、続いて、最終生成物を提供するために、発現され
た組換えタンパク質から開裂されても、されなくてもよい。
用語「選択的結合」及び「結合選択性」は、本発明の抗体の可変領域が、本発明のポリ
ペプチドを認識し、それに排他的に結合する(すなわち、ポリペプチドのファミリー中に
見出される配列の同一性、相同性、又は類似性にもかかわらず、他の類似のポリペプチド
から本発明のポリペプチドを識別することができる)が、抗体の可変領域外の、とりわけ
分子の定常領域中の配列との相互作用を介して他のタンパク質(例えば、ELISA技術におけ
る黄色ブドウ球菌のプロテインA又はその他の抗体)と相互に作用することもできることを
示す。本発明の抗体の結合選択性を判定するためのスクリーニングアッセイは、当技術分
野で周知であり、定型的に実施される。
用語「結合親和性」は、抗体分子と抗原との間の結合強度の尺度を含む。
用語「カップリング比率」は、1つの担体分子にカップリングされた光増感物質の分子
数を意味する。
用語「担体分子」は、光増感物質がカップリングされる任意の物質の意味を含む。とり
わけ、担体分子は、限定はされないが、抗体フラグメント及び非免疫性ペプチドなどの小
型化合物でよい。
用語「単官能性光増感剤」又は「単官能性光増感物質」は、当技術分野で既知である化
学を利用することによって活性化し、カップリングすることのできる、たった1つのプロ
ピオン酸側鎖を含有するPPaのような光増感剤を意味し、増感剤を、保護/脱保護の化学を
介して、活性化すること/カップリングすることができる基を所持するように修飾するこ
とができる。
「光増感物質」とは、本願の式Iの定義に包含される任意の化合物を意味する。
用語「非プロトン性溶媒」は、OH基をもたず、それゆえ水素結合を供与できない溶媒を
意味する。
用語「取っ手」又は「複合用取っ手」は、光増感物質を担体分子に共有結合で結合させ
るのに適した官能基を意味する。これには、例えば、タンパク質又はその他の担体への複
合化の準備ができている、対応する活性化されたスクシンイミジルエステルに転換できる
カルボン酸基が含まれる。当業者は、他の活性化された官能基が、光増感物質を担体に複
合させるのに適している可能性があり、それゆえ「取っ手」の定義に包含されることを認
識するであろう。
本明細書に引用される任意の文献は、引用により本明細書中に組み込まれている。本明
細書中での以前に刊行された文献に関する一覧又は考察は、該文献が最新技術の一部であ
る、又は共通の一般的知識であることの承認とは必ずしも解釈すべきでない。
本発明は、これより、以下の非限定的な図面及び実施例を参照してより詳細に説明され
る。
ニトロセルロースブロット上の複合化PPa-PEG及び非共有結合で拘束された遊離のPPa-PEGの蛍光を示す図である。ブロットは、PPa-PEGの約30%がタンパク質と非共有結合で会合していることを示す。 C6-PPaPEG複合体及び対照の分光学的分析を示す図である。 2%DMSO/PBS中の各種光増感剤の分光学的分析を示す図である。 C6scFv-PPaPEGによるインビトロでのSKOV3細胞の死滅を示す図である。C6PPaPEGは、C6受容体発現細胞を死滅させ、受容体陰性細胞を助命した。 SKOV3腫瘍マウスにおける24時間にわたるPPaの体内分布を示す図である。 SKOV3腫瘍マウスにおける24時間にわたるPPa-PEGの体内分布を示す図である。 SKOV3腫瘍マウスにおける24時間にわたるカチオン性PPaの体内分布を示す図である。 PPa及び溶性PPa誘導体光増感剤の血中クリアランスを示す図である。 C6と複合されたPPa及びPPa-PEG並びに遊離の光増感剤の血中クリアランスを示す図である。 C6と複合されたPPa及びPPa-PEG並びに遊離の光増感剤の腫瘍内取込みを示す図である。 C6と複合されたPPa及びPPa-PEG並びに遊離の光増感剤の腫瘍内:血液内比率を示す図である。 SKOV3腫瘍マウスにおけるPPa-PEG療法を示す図である。 SKOV3腫瘍マウスにおけるC6-PPa-PEG療法を示す図である。 オムニスキャンとの比較を示す図である。 PPa(ピロフェノフォルビド-a)の細胞死滅プロファイルを示す図である。PPaをある濃度範囲にわたって細胞に曝露し、方法中に記載のように光線に曝露した。細胞死滅は、MTTをベースにした細胞増殖アッセイを使用し、非処置及び完全溶解の対照細胞と比較して測定した。結果を、パーセント細胞生存としてプロットする。 化合物11の細胞死滅プロファイルを示す図である。11をある濃度範囲にわたって細胞に曝露し、方法中に記載のように光線に曝露した。細胞死滅は、MTTをベースにした増殖アッセイを使用し、非処置及び完全溶解対照細胞と比較して測定した。結果を、パーセント細胞生存としてプロットする。 化合物31Cの細胞死滅プロファイルを示す図である。31Cをある濃度範囲にわたって細胞に曝露し、方法中に記載のように光線に曝露した。細胞死滅は、MTTをベースにした増殖アッセイを使用し、非処置及び完全溶解対照細胞と比較して測定した。結果を、パーセント細胞生存としてプロットする。 SKOV3腫瘍マウスに対するC6.5scFv-化合物11の細胞死滅プロファイルを示す図である。C6.5scFv-11複合体をある濃度範囲(正味の光増感剤として示す)にわたって細胞に曝露し、方法中に記載のように光線に曝露した。細胞死滅は、MTTをベースにした増殖アッセイを使用し、非処置及び完全溶解対照細胞と比較して測定した。結果を、パーセント細胞生存としてプロットする。 SKOV3細胞に対するPPa由来光増感剤の共焦点蛍光顕微鏡検査を示す図である。左パネルは白色光透過画像であり、中央パネルは光増感剤の蛍光画像であり、右パネルは拡大された細胞を示す。パネルA〜C(PPa)、D〜F(化合物11)、及びG〜I(化合物31C)。PPa及び11は、拡散した小胞-細胞内染色を示し、一方、31Cは区切りのある染色を示す。 SKOV3細胞に対するPPa由来光増感剤の、ボディピー(Bodipy)セラミドで共染色した共焦点蛍光顕微鏡検査を示す図である。左パネルは白色光透過画像であり、2番目のパネルは光増感剤の蛍光画像(赤色蛍光)であり、3番目のパネルはボディピーセラミド共染色を示し(緑色蛍光)、右側パネルは重ね合わせた画像を示す。パネルA〜D(PPa)、E〜H(化合物11)、及びI〜L(化合物31C)。D及びHは共局在を示唆するかなりの黄色蛍光を示す。 SKOV3細胞に対するPPa由来光増感剤の、ミトトラッカー(MitoTracker)で共染色した共焦点蛍光顕微鏡検査を示す図である。左パネルは白色光透過画像であり、2番目のパネルは光増感剤の蛍光画像(赤色蛍光)であり、3番目のパネルはミトトラッカー共染色を示し(緑色蛍光)、2つの右側パネルは重ね合わせた画像を示す。パネルA〜E(PPa)、F〜J(化合物11)、及びK〜O(化合物31C)。D〜E及びI〜Jは共局在を示唆するかなりの黄色蛍光を示す。 SKOV3細胞に対するPPa由来光増感剤の、リソトラッカー(LysoTracker)で共染色した共焦点蛍光顕微鏡検査を示す図である。左パネルは白色光透過画像であり、2番目のパネルは光増感剤の蛍光画像(赤色蛍光)であり、3番目のパネルはリソトラッカー共染色を示し(緑色蛍光)、右側パネルは重ね合わせた画像を示す。パネルA〜D(PPa)、E〜H(化合物11)、及びI〜L(化合物31C)。Hは少しの共局在を示唆する僅かな黄色蛍光を示し、一方、Lは共局在を示唆するかなりの黄色蛍光を示す。 SKOV3細胞に対するPPa由来光増感剤の、ER-トラッカー(ER-tracker)で共染色した共焦点蛍光顕微鏡検査を示す図である。左パネルは白色光透過画像であり、2番目のパネルは光増感剤の蛍光画像(赤色蛍光)であり、3番目のパネルはER-トラッカー共染色を示し(緑色蛍光)、右側パネルは重ね合わせた画像を示す。パネルA〜D(化合物11)、E〜H(化合物31C)。Dは共局在を示唆するかなりの黄色蛍光を示す。 化合物11と比較したフォスキャン(Foscan)の皮膚光感受性を示す図である。光増感剤を、t=0(hrs)の時点で投与し、1時間後に皮膚にレーザーを照射した。皮膚の反応を長時間にわたって追跡し、結果を、示した尺度によりプロットした。フォスキャンは、グレード2の皮膚光感受性を示し、一方、11及びその抗体複合体。 免疫複合体のUV/可視スペクトルを示す図である。 C6-Mn(56)免疫複合体のゲルが透析前に複合体が存在することを示している図である。
(実施例1:PPaの新規誘導体の開発)
（概説）
以下の実施例では、タンパク質への複合化のための、疎水性光増感剤であるPPaの一連
の新規誘導体の開発について説明する。該取組みは、その双方ともコフェイシャル相互作
用(水性緩衝液中での凝集及び沈殿の機構であろう)を抑制し、且つタンパク質への非共有
結合を低減するように作用する、反応性のある単一のアミン又はチオール基、及び水可溶
化基を所持するポルフィリン、クロリン及びバクテリオクロリン類の調製を可能にするい
くつかの鍵となる中間体の合成を含む。
一例で、短いトリ(エチレングリコール)モノメチルエーテル(TEG)鎖をもつベンジルエ
ーテル単位を、PPaのプロピオン酸側鎖に結合させて、それをPBSに極めて可溶性にし、ま
た、この側鎖がマクロ環の平面上に突き出ると、自己凝集も最小化される。ヘキシン酸の
生体分子複合化可能な係留鎖(bioconjugatable tether)を、金属で触媒されるクロスカッ
プリング反応(薗頭カップリング)を介してPPaの5-メソ位に結合させ、スクシンイミジル
エステル誘導体(活性エステル)を合成することによって活性化させた。この活性化誘導体
の生体分子複合化(bioconjugation)を、PBS/アセトニトリル/DMSO中で、5mg/mLまでのタ
ンパク質でC6(抗Her-2)scFvに対して実施し、8〜10個の共有結合で結合させた光増感剤を
含有する高い活性の光免疫複合体(PIC)をもたらした。生じるPICは、標的細胞と非標的細
胞とを区別してインビトロでの優れた細胞死滅、及び最小の暗所毒性を示す。該新規PIC
は、また、改善された薬物動態を提示し、急速な腫瘍内取込み、及びC6-PPa PICに比較し
て皮膚光感受性の危険が極めて少なく治療上極めて魅力的である、より高い腫瘍内:血液
内比率をもたらす。総合的に、このことは、腫瘍細胞のインビボでの極めて効果的な死滅
につながり、腫瘍保持マウスにおける2回投与/2回照射処置の後に完全な腫瘍退縮が観察
された。
（結果及び考察）
本発明者らは、ここに、標的指向化された光線力学療法(PDT)のための高い純度及び有
効性のある光免疫複合体(PIC)を製造するために、種々の抗体フォーマット、とりわけ単
鎖Fv上へ共有結合で連結するための光増感剤の設計が、
1.生理食塩水溶液への高い溶解性、それによる分子間凝集(及び、励起状態の消光)の回避
;
2.タンパク質への最小の非特異的(非共有)結合形成;及び
3.複合化のための単一の反応性基の組込み、それによる架橋及び生成混合物の形成の回避
;を含む多くの因子に依存することを示した。
水溶性化する官能基は、一般に、帯電される官能基(アニオン性又はカチオン性)、及び
オリゴ(エチレングリコール)(OEG)鎖のように中性である官能基に類別される。ポルフィ
リン類及びその他の色素上へのOEG鎖の連結は、高い水溶性を付与し、同時に、それらの
中性である特徴は、それらの合成上の取り扱いを容易にさせることを示した。
本研究中で選択される最初の水溶化単位は、短いトリ(エチレングリコール)モノメチル
エーテル(TEG)鎖をもつベンジルエーテルである。この官能基は、文献法により合成され(
スキーム1に示したように)、修飾されたピロフェオフォルビド-a誘導体(7)のプロピオン
酸側鎖のエステル化により結合させた(スキーム2)。可溶化基を結合させるのに先立って
、市販のメチルピロフェオフォルビドa(MPPa、5)のビニル側鎖を還元し(副反応を防ぐた
めに)、それに続く強酸中でのプロピオン酸エステル側鎖の加水分解により、本発明者ら
の鍵となる中間体の1つ(7)を得た。
プロピオン酸側鎖の存在は、多くの基(中性及び帯電基の双方)の導入を可能にする。誘
導体(8)の5-メソ位を、ピリジニウムペルブロミドを使用して好収率でブロム化した。こ
のことは、金属で触媒されるクロスカップリング化学を介するマクロ環上への潜在的取っ
手の導入を可能にする。5-ブロモ誘導体上でこのような化学を実施できることは以前に示
されていたが、本発明者らは、アルキンの賢明な選択が、この立体的に込み合った5-ブロ
ム位への迅速で効率的なカップリングを可能にし、多数の基の導入を可能にすることを確
立した。
市販の5-ヘキシン酸を、銅を含まない薗頭カップリングを介して誘導体(9)の5-メソ位
に、12時間以内に高収率で結合させた。薄層クロマトグラフィーは、数時間以内に所望の
アルキン(10)の存在を示唆した。最終ステップには、結合させた側鎖のカルボン酸基を、
N-ヒドロキシスクシンイミド及びジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)を用いて対応す
る活性化スクシンイミジルエステルへ転換することを含めた。生じる化合物は、そこで、
タンパク質への複合化の準備が整った。
Figure 2015155442
Figure 2015155442
スキーム2でもたらされる誘導体を製造するために、代わりの戦略も採用した。スキー
ム2に概略を示したブロム化/加水分解の順序を変えることによって、トリPEG化されたメ
ソ-5-ブロモ誘導体(14)を、好収率で且つより少ない副生物を伴って得た(スキーム3)。
新規な二官能性メソ-5-ブロモPPa誘導体(13)は、可溶化基及び/又は複合化可能な取っ
手の双方の導入を可能にする、鍵となる中間体である(構造A)。
Figure 2015155442
Figure 2015155442
ヘキシン酸をメソ5-ブロム化メチルエステル誘導体(12)にカップリングさせることによ
って、さらなるPPa誘導体を合成した。生じる酸(15)及び対応する活性化エステル誘導体(
16)により、プロピオン酸側鎖と比較した場合のメソ5-位を介するカップリングの効果及
び有効性を調べるための、並びにトリ-PEG側鎖の可溶化効果を定量するためのモデル研究
を実施することが可能になった(スキーム4)。
Figure 2015155442
化合物(13)を利用できることは、広範な種類の置換された第1級及び第2級アミンと反応
させることによって、PPaの種々のカチオン性誘導体の合成を可能にした。
本発明者らは、最も効率的で高収率の方法は、無水DCM/THF(9:1)中でDCCを使用して化
合物(13)をN-ヒドロキシスクシンイミドと反応させることによって、スクシンイミジル誘
導体(17)をインサイチュで形成することであることを見出した。少量のTHFの存在は、す
べてを溶液状態に保持する上で決定的に重要であった。反応を、薄層クロマトグラフィー
で監視し、スクシンイミジルエステルへの完全な転換が観察されたら、所望のアミンを過
剰に添加した。
一例では、アミンとしてビス-[3-(ジメチルアミノ)-プロピル]アミンを使用した(スキ
ーム5)。所望のアミド(18)が、酸化アルミニウム(中性、Brockmannグレード3)でのクロマ
トグラフィーの後に紫色固体として得られた。水溶性誘導体(19)を得るための第2級アミ
ンの第4級化は、無水クロロホルム中で過剰のヨウ化メチルを使用して達成され、無水エ
ーテルと共に磨り潰した後に固体として単離された。金属で触媒される前記のようなカッ
プリングを介してヘキシン酸の取っ手を結合させて、化合物(20)を得た。
代わりの取組みでは、ヘキシン酸を、(18)のメソ5-ブロモ位でカップリングさせて化合
物(21)を得て、次いで、それをヨウ化メチルと反応させてジカチオン性誘導体(22)を得た
(スキーム6)。
Figure 2015155442
Figure 2015155442
本発明者らが複合化可能な取っ手としてプロピオン酸側鎖の維持を決定し、次いで、化
合物(12)のメソ5-ブロモ位での誘導体化を介して可溶化基を結合させる化学も開発された
。
本発明者らは、文献中に報告されているように、4-ピリジルボロン酸を使用して、金属
で触媒されるクロスカップリング(鈴木カップリング)を介して4-ピリジル基を結合させる
ことによって開始した(スキーム7)。ピリジルの窒素は、容易に第4級化され、そのため正
電荷を導入することができる。
本発明者らは、最初に、DMF中、室温でヨウ化メチルを使用する簡単な第4級化を検討し
、さらに、本発明者らは、DNF中、80℃で短いPEG鎖で第4級化することができた(スキーム
7、8及び9)。
得られるモノカチオン性誘導体はすべて水溶性であり、化合物(31)が最良の溶解性を提
示した。
Figure 2015155442
スキーム8中の代わりの戦略は、容易に始まるが、プロピルエステル側鎖の加水分解工
程中にあまりにも多くの副生物をもたらした。
Figure 2015155442
スキーム9における短いPEG鎖での第4級化は、少量のアルキル化されたプロピオン酸側
鎖をもたらす。
Figure 2015155442
（合成の経路及び方法）
空気及び/又は水に敏感な化合物の取扱いは、標準的なシュレンク技術を使用して実施
した。DCM及びトリエチルアミンは、CaH2から蒸留することによって乾燥され、無水THFは
、ナトリウム/ベンゾフェノンからの蒸留によって得られた。その他のすべての試薬は、
特記しない限り、市販業者によって供給されるものを使用した。
分析薄層クロマトグラフィー(TLC)は、ガラスで裏打ちされたMerckシリカゲル60 GF254
プレート又はアルミニウムで裏打ちされた酸化アルミニウム(中性)上で実施され、可視化
は、必要な場合、UV光を使用して達成され、場合によっては化学染色剤を使用した。カラ
ムクロマトグラフィーは、加圧空気を使用し、シリカゲル60、又は5%の水で不活性化され
た酸化アルミニウム(中性又は塩基性)(BrockmannグレードIIIと呼ばれる)で実施した。溶
媒混合物を使用する場合、比率は容積で報告した。
NMRスペクトルは、Bruker DPX400(400MHz)を使用し、周囲温度のプローブ温度で記録し
た。化学シフトは、内部標準としてCDCl3(1H NMRの場合、7.26ppm)を使用し、パーツパー
ミリオン(ppm)として示し、カップリング定数(J)は、ヘルツ(Hz)で示す。UV/Visスペクト
ルは、Hewlett Packard8450ダイオードアレイ分光計で記録した。質量スペクトルは、い
くつかの技術を使用して実施し、分子イオン及び主要ピークのみ報告する。
LCMSは、逆相C18カラム(直径2.1mm、長さ30mm、粒径3μm)で、10〜15分にわたる95%水(
ギ酸0.1%):5%MeCNから5%水:95%MeCNまでの線形溶媒グラジエントで実行した。
Figure 2015155442
(トリエチレングリコールモノメチルエーテルトシレート(2))
水酸化ナトリウム(8.07g、201ミリモル)の水(50mL)溶液に、撹拌しながら、トリエチレ
ングリコールモノメチルエーテル(25g、152ミリモル)のTHF(50mL)の溶液を、窒素下で温
度を5℃未満(氷-水-食塩)に維持しながら滴加した。添加を完了したら、同じ温度で、p-
トルエンスルホニルクロリド(24.78g、130ミリモル)の溶液を1時間にわたって滴加した。
水中に注いで反応を止め、DCM(200mL)を添加し、有機層を分離した。水層をDCM(3×200mL
)で逆抽出した。合わせた有機層を、水(2×)及びブライン(2×)で洗浄し、MgSO4で乾燥し
、濾過、蒸発させて、無色のオイルとして(2)を得た(34g、82%)。
Figure 2015155442
（3,4,5-(トリエチレングリコールモノメチルエーテル)ベンゾアート(3)）
(2)(24.51g、76.9ミリモル)のアセトン(220mL)溶液に、3,4,5-トリヒドロキシ安息香酸
メチル(4.5g、24.4ミリモル)、無水炭酸カリウム(16.85g、122ミリモル)及び18-クラウン
-6(1.3g、4.88ミリモル)を添加した。生じたスラリーを、アルゴン下で2日間、撹拌、還
流した。生じた淡褐色反応混合物を、濾過して不溶性無機物を除去し、真空下で濃縮して
、褐色残留物を得た。これをクロロホルム(500mL)に再溶解し、飽和炭酸ナトリウム溶液(
5×500mL)、飽和重炭酸ナトリウム溶液(3×250mL)、及び最後にブライン(250mL)で洗浄し
た。有機相を分離し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させて、淡褐色オイルとして粗製物質を得た
。これを、5%MeOH/クロロホルムで溶離するシリカでのカラムクロマトグラフィー(Rf0.4)
で精製して、微黄色オイルとして(3)を得た(10.6g、70%)。
Figure 2015155442
(3,4,5-(トリエチレングリコールモノメチルエーテル)ベンジルアルコール(4))
撹拌され氷冷されたLiAlH4(0.86g、22.9ミリモル)の無水THF(35mL)懸濁液に、無水THF(
85mL)に溶解されたエステル(3)(8.95g、14.4ミリモル)をアルゴン下で1時間にわたって滴
加した。添加後、反応物を室温まで温め、6時間撹拌すると、この時点で、TLC(シリカゲ
ル、10%MeOH/CHCl3、Rf0.56)は、なお出発原料の存在を示した。反応混合物を5℃未満に
冷却し、さらなるLiAlH4(0.86g、22.9ミリモル)を添加した。添加後、混合物を再び室温
まで温めさらに6時間撹拌すると、この時点ですべてのエステルが消費されていた。反応
混合物を、THF(300mL)及び少量のNa2SO4・10H2O濃水溶液を添加して希釈し、水素化物が
完全に消滅するまでセライトを添加した。反応混合物を、濾過、濃縮して、微黄色澄明オ
イルを得た(6.3g、93%、Rf 0.37)。
Figure 2015155442
(メチルメソピロフェオフォルビドa(6))
メチルピロフェオフォルビドa 5(1.2g)のジクロロメタン(90mL)溶液に、Zn(OAc)2・2
H2O(1.27g、5.78ミリモル)のメタノール(52mL)溶液を添加した。混合物をアルゴン下に室
温で2時間撹拌し、UV/Vis分光法で追跡した。次いで、反応混合物を、水(4×100mL)で洗
浄し、DCMで逆抽出し、合わせた有機層を集め、Na2SO4で乾燥した。溶媒を除去し、固体
を高度真空ポンプでさらに乾燥した。残留物を無水THF(110mL)に溶解し、トリエチルアミ
ン(312mL)、続いてPd/C(10%、120mg)を添加した。生じた混合物を室温で24時間水素化(水
素風船を用いて)し、次いで、セライトの詰め物を通して濾過した。溶媒を除去し、残留
物をTFA(33mL)でアルゴン下に室温で2時間処理した。反応混合物を氷水に注意して注ぐこ
とによって反応を止め、水層が澄明になるまでDCMで抽出した。有機層を合わせ、水(2×2
00mL)及び5%NaHCO3(1×200mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。濾過した後に溶媒を除去し
、残留物を10%酢酸エチル/DCMで溶離する中性アルミナ(BrockmannグレードIII)でのカラ
ムクロマトグラフィーで精製して、暗紫色固体として所望の化合物を得た(1.17g、97%)。
Rf 0.66。
Figure 2015155442
(メソピロフェオフォルビドa(7))
濃塩酸(100mL)をメソ-メチルピロフェオフォルビドa(6)(0.20g、0.366ミリモル)に、少
量に分割して添加し、遮光してアルゴン下に室温で2時間撹拌した。反応混合物を、氷水(
600mL)中に注ぎ、クロロホルム(3×100mL)で抽出した。合わせた有機層を、5%NaHCO3(1×
100mL)及び水(1×200mL)で洗浄し、乾燥(Na2SO4)し、濾過し、溶媒を除去して暗青色固体
として(7)を得た(0.17g、86%)。Rf 0.24。
Figure 2015155442
 HSMS (ESI) m/z C33H37N4O3 (M+) 計算値 537.3315: 実測値: 537.2873。
これを、全く精製しないで使用した。
(メソピロフェオフォルビドa-3,4,5-(トリエチレングリコールモノメチルエーテル)ベン
ジルエステル(8))
メソピロフェオフォルビドa(7)(0.08g、0.149ミリモル)の無水DCM(40mL)溶液に、DMAP(
0.033g、0.273ミリモル、触媒量)及びDCC(0.078g、0.376ミリモル)、続いて無水DCM(10mL
)に溶解したベンジルアルコール(4)(0.13g、0.223ミリモル)を添加し、反応混合物を、遮
光して窒素下で5時間、室温で撹拌した(Rf 0.58)。溶媒を除去して暗色固体を得た。それ
をDCMに再溶解し、0.5M HCl(1×)、水(2×)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濾過、濃縮して
、粗製物質(8)を得た。これを、5%MeOH/CHCl3で溶離するシリカゲルでのカラムクロマト
グラフィーでさらに精製した。暗紫色オイルを得て、それをヘキサンと共に磨り潰した(0
.073g、44%)。
Figure 2015155442
 LC/MS 水/メタノール 10/90→90/10 10分間。1113.59 [M+]単一ピーク。
(メソ5-ブロモピロフェオフォルビドa-3,4,5-(トリエチレングリコールモノメチルエーテ
ル)ベンジルエステル(9))
化合物(8)(0.56g、0.5ミリモル)の無水DCM(120mL)溶液に、前以て高度真空ポンプで乾
燥したピリジニウムペルブロミド(0.21g、0.65ミリモル)及び無水ピリジン(530μL)を添
加し、反応混合物をアルゴン下に室温で撹拌した。反応は、UV/Visで監視すると30分で完
結し、その時点で溶媒を除去し、粗製物質を、直ちに、5%MeOH/CHCl3で溶離するシリカゲ
ルでのクロマトグラフィーで精製して、粘性紫色オイルとして所望の化合物を得た(0.41g
、69%)。
Figure 2015155442
(メチルメソ5-ブロモピロフェオフォルビドa(12))
メソ-メチルピロフェオフォルビドa(6)(0.27g、0.492ミリモル)の無水DCM(75mL)溶液に
、前以て高度真空下で乾燥されたピリジニウムペルブロミド(0.2g、0.618ミリモル)及び
無水ピリジン(500μL)を添加した。反応混合物を、遮光してアルゴン下に室温で20分間撹
拌した。反応をUV/Visで監視し、完結したら、溶媒を除去して褐色固体として粗生成物を
得た。これを、溶離液としてDCMを使用する中性酸化アルミニウム(Brockmann III)でのカ
ラムクロマトグラフィーにより精製した。Rf 0.82(5%MeOH/CHCl3)。最終生成物を紫色固
体として得た(0.24g、77%)。
Figure 2015155442
 MS ES: 629.2, 631.2 [M, M+2]。
(メソ5-ブロモピロフェオフォルビドa(13))
メチルメソ-ブロモピロフェオフォルビドa(0.97g、1.54ミリモル)を濃塩酸(200mL)に徐
々に溶解し、アルゴン下に室温で5時間撹拌した。反応混合物を、撹拌した氷-水の混合物
上に徐々に注ぐことによって反応を止め、水層が澄明になるまでクロロホルムで徹底的に
抽出した。合わせた有機層を、飽和NaHCO3、水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させて、
紫色固体を得た(0.65g、70%)。Rf 0.16(5%MeOH/CHCl3)。
Figure 2015155442
 HSMS (ESI) m/z C33H36N4O3Br (M+1) 計算値 615.1971: 実測値: 615.1987。
(メソ5-ブロモピロフェオフォルビドa-3,4,5-(トリエチレングリコールモノメチルエーテ
ル)ベンジルエステル(14))
メソ-ブロモピロフェオフォルビドa(13)(0.08g、0.13ミリモル)を、無水DCM/10%THF(10
mL)に溶解し、アルゴン覆いの下に置いた。撹拌されたこの溶液に、最少量の無水DCMに溶
解したトリPEG化ベンジルアルコール(4)(0.12g、0.195ミリモル)、続いてDCC(0.17g、0.8
4ミリモル)、DMAP(0.062g、0.506ミリモル)及びDPTS(0.14g、0.48ミリモル)を添加した。
生じた混合物を遮光し、10分間撹拌した後、N-エチルジイソプロピルアミン(79μL、0.46
ミリモル)を添加し、さらに6時間撹拌を継続すると、TLC(シリカゲル)により、すべての
出発原料の消費が確認された。反応混合物を、DCM(200mL)で希釈し、飽和塩化アンモニウ
ム溶液(100mL)及び水(5×100mL)で洗浄し、有機層を分離し、水層をDCMで逆抽出した。合
わせたDCM洗浄液を、Na2SO4で乾燥し、蒸発させて暗紫褐色オイルを得た。これを、カラ
ムクロマトグラフィー(シリカゲル、5%MeOH/クロロホルム、Rf 0.46)で精製し、関連画分
を合わせ、濃縮してオイルを得た。これを、最小量のクロロホルムに溶解し、その溶液を
ヘキサンで層にし、それを5℃で一夜放置することによってさらに精製した。生じた白色
沈殿を濾取し、この手順を、さらなる沈殿が観察されなくなるまで繰り返した。所望の化
合物(14)を粘性暗紫色オイルとして得た(0.11g、73%)。
Figure 2015155442
(メソ5-エチニルヘキサン酸ピロフェオフォルビドa-3,4,5-(トリエチレングリコールモノ
メチルエーテル)ベンジルエステル(10))
5-ブロモ誘導体(14)(0.1g、0.0837ミリモル)を無水の脱酸素DMF/EtN3(2mL、10:1)混合
物中に溶解した。アルゴン下で撹拌されたこの溶液に、トリ-(o-トリル)ホスフィン(0.03
g、0.0973ミリモル)、続いてトリス(ジベンジリデンアセトン)二パラジウム(0)(0.012g、
0.0127ミリモル)、続いて大過剰の5-ヘキシン酸(170μL、1.677ミリモル)を添加した。生
じた暗紫色溶液をアルゴンでパージしてアルゴン雰囲気下に置き、遮光して室温で撹拌し
た。反応をTLC(シリカゲル、10%MeOH/CHCl3)で監視すると、生成物は、2〜4時間以内にプ
レート上に長波長光での照明下で赤色の蛍光も有する暗青色のスポットとして観察するこ
とができ(Rf 0.5)、出発原料(Rf 0.69)は、臭素原子の存在のため蛍光を発光しなかった
。反応物を、12時間撹拌したままにし、ジエチルエーテルで希釈し、水/クエン酸溶液混
合物で洗浄し、有機層を分離し、水層をエーテルで逆抽出した。次いで、合わせたエーテ
ル抽出物を、Na2SO4で乾燥し、蒸発させて、暗紫色オイルを得た。これをクロマトグラフ
ィー(シリカゲル、5%MeOH/CHCl3)で精製して粘性紫色オイルとして所望の化合物を得た(0
.07g、70%)。
Figure 2015155442
 HRMS (ESI) m/z C67H91N4O17 (M+1) 計算値 1223.6379 実測値 1223.6400; UV/Vis (DCM)
UV/Vis (DCM) 417, 524, 558, 614, 673。
(メソ5-エチニルヘキサノイルスクシンイミドエステルピロフェオフォルビドa-3,4,5-(ト
リエチレングリコールモノメチルエーテル)ベンジルエステル(11))
メソ5-エチニルヘキサン酸PPa誘導体(10)(0.03g、0.0245ミリモル)の無水DCM(5mL)溶液
に、N-ヒドロキシスクシンイミド(3.7mg、0.0319ミリモル)及びDCC(7.6mg、0.0368ミリモ
ル)を添加し、生じた混合物を12時間撹拌した。シリカゲル(5%MeOH/CHCl3、Rf 0.38)。溶
媒を蒸発させ、残留物をカラムクロマトグラフィーで精製して粘性暗紫色オイルとして所
望の化合物を得た。これを最小量の無水DCMに溶解し、十分な量のヘキサンを添加し、生
じた溶液を5℃で一夜放置し、ジシクロヘキシルウレアを除去するために濾過し、蒸発さ
せ、乾燥した(0.023g、71%)。
Figure 2015155442
 HRMS (ESI) m/z C71H93N5O19 (M+Na) 計算値 1342.6254 実測値 1342.6378; LCMSは単一
の構成要素を正確な質量で確認する; UV/Vis (DCM) UV/Vis (DCM) 417, 524, 558, 614,
673。
(メソ5-エチニルヘキサン酸メチルピロフェオフォルビドa(15))
メチルメソ5-ブロモピロフェオフォルビドa(12)(0.03g、0.0477ミリモル)を無水の脱酸
素DMF/EtN3(2mL、10:1)混合物中に溶解した。アルゴン下で撹拌されたこの溶液に、トリ-
(o-トリル)ホスフィン(0.017g、0.0552ミリモル)、続いてトリス(ジベンジリデンアセト
ン)二パラジウム(0)(0.0066g、0.00722ミリモル)、続いて大過剰の5-ヘキシン酸(97μL、
0.953ミリモル)を添加した。生じた暗紫色溶液をアルゴンでパージしてアルゴン雰囲気下
に置き、遮光して室温で撹拌した。反応物を、12時間撹拌したままにし、ジエチルエーテ
ルで希釈し、水/クエン酸溶液混合物で洗浄し、有機層を分離し、水層をエーテルで逆抽
出した。次いで、合わせたエーテル抽出物を、Na2SO4で乾燥し、蒸発させて、暗紫色オイ
ルを得た。これをクロマトグラフィー(シリカゲル、2%MeOH/CHCl3)で精製して紫色固体と
して所望の化合物を得た(0.023g、75%)。
Figure 2015155442
 HRMS (ESI) m/z C40H45N4O5 (M+1) 計算値 661.3390 実測値 669.3392; UV/Vis (DCM) UV
/Vis (DCM) 417, 524, 558, 614, 673。
(メソ5-エチニルヘキサノイルスクシンイミドエステル酸メチルピロフェオフォルビドa(1
6))
メソ5-エチニルヘキサン酸メチルピロフェオフォルビドa(15)(0.02g、0.0303ミリモル)
の無水DCM(2mL)溶液に、N-ヒドロキシスクシンイミド(4.2mg、0.0363ミリモル)及びDCC(7
.5mg、0.0363ミリモル)を添加し、生じた混合物を12時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残
留物をカラムクロマトグラフィーで精製して暗紫色オイルとして所望の化合物を得た(0.0
16g、70%)。
Figure 2015155442
 HRMS (ESI) m/z C44H48N5O7 (M+1) 計算値 758.3554 実測値 758.3552; UV/Vis (DCM) 41
7, 524, 558, 614, 673。
(N-ビス-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-メソ5-ブロモピロフェオフォルビドaアミド(18)
)
メソ-ブロモピロフェオフォルビドa(13)(0.1g、0.163ミリモル)を無水DCM/20%THF(10mL
)に溶解し、アルゴンの覆いの下に置いた。撹拌されたこの溶液に、N-ヒドロキシスクシ
ンイミド(0.0224g、0.0195ミリモル)、続いてDCC(0.0377g、0.0195ミリモル)を添加し、
生じた混合物を、遮光して室温で18時間撹拌すると、TLC(5%MeOH/CHCl3、Rf 0.48)は、生
成物の存在及び出発原料の消費を示した。この時点で、小量の無水DCMに溶解した過剰の
ビス-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]アミン(73μL、0.325ミリモル)を添加し、さらに12
時間撹拌を継続した。TLC(シリカゲル、5%MeOH/CHCl3)は、インサイチュで生じた活性エ
ステル誘導体(17)のすべてが、消費されたことを示し、且つTLC(中性酸化アルミニウム、
10%MeOH/CHCl3)は、新たな主要成分の存在を示した。反応混合物を蒸発させて粘性紫色オ
イルを得た。これを、中性酸化アルミニウム(Brockmann III)でのカラムクロマトグラフ
ィーで精製し、主要画分を集め、蒸発させて紫色固体として誘導体(18)を得た(0.1g、64%
)。
Figure 2015155442
 HRMS (ESI) m/z C43H58N7O2Br (M+1) 計算値 784.3914 実測値 784.3900; UV/Vis (MeOH)
410, 514, 547, 610, 669。
(N-ビス-[3-(トリメチルアミノ)プロピル]-メソ5-ブロモピロフェオフォルビドaアミドジ
ヨウジド(19))
ビス-アミン(18)(0.02g)を無水クロロホルムに溶解し、アルゴンの覆いの下に置いた。
この溶液に過剰のヨウ化メチル(0.3mL)を添加し、反応混合物を12時間撹拌した。溶媒を
蒸発させ、油状残留物を、無水ジエチルエーテル(5×)と共に磨り潰し(各回ともエーテル
を注意深くデカントで除去し、新たなバッチを添加して)、最後に、残留物を高度真空ポ
ンプ下で乾燥して粘着性紫色固体を得た。HRMS(ESI) m/z C45H64N7O2BrI (M-I) 計算値 9
40.3350 実測値 940.3367; UV/Vis(MeOH) 410, 514, 547, 610, 668。この化合物は、水
及びメタノールに易溶である。
(N-ビス-[3-(トリメチルアミノ)プロピル]-メソ5-エチニルヘキサン酸ピロフェオフォル
ビドaアミド(21))
5-ブロモアミド誘導体(18)(0.067g、0.00854ミリモル)を無水の脱酸素DMF/EtN3(2mL、1
0:1)混合物中に溶解した。アルゴン下で撹拌されたこの溶液に、トリ-(o-トリル)ホスフ
ィン(0.03g、0.0973ミリモル)、続いてトリス(ジベンジリデンアセトン)二パラジウム(0)
(0.012g、0.0127ミリモル)、続いて大過剰の5-ヘキシン酸(170μL、1.677ミリモル)を添
加した。生じた暗紫色溶液をアルゴンでパージしてアルゴン雰囲気下に置き、遮光して室
温で18時間撹拌すると、TLC(中性酸化アルミニウム、10%MeOH/CHCl3)は、出発原料のすべ
ての消費を示した。反応混合物を蒸発乾固して粘性暗紫色オイルを得た。これを、中性酸
化アルミニウム(Brockmann III)のカラムに添加し、20%MeOHで溶離した。一部の少量ポル
フィリン画分は溶離したが、主要帯はカラムの上部に留まった。これを掻き取り、MeOH/C
HCl3(1:1)中で撹拌し、暗紫色溶液を蒸発させて粘性紫色オイルを得た。HRMS (ESI) m/z
C49H65N7O4B (M+1) 計算値 816.5098 実測値 816.5172; UV/Vis (THF) 416, 523, 558, 6
14, 673。
(3-デビニル-20ピリジル-メチルピロフェオフォルビド-a(23))
3-デビニル-20-ブロモ-メチルピロフェオフォルビド-a(0.2g、0.32ミリモル)及び4-ピ
リジルボロン酸(0.39g、3.18ミリモル)を乾燥窒素で15分間脱気した後、無水THF(80mL)を
添加し、窒素バグリングによりさらに30分間脱気した。Pd(PPh3)4(約80mg)を添加し、混
合物の脱気を15分間継続した。K3PO4(1.3g、6.35ミリモル)を添加し、反応物を、遮光し
て窒素下で、還流下に15分間加熱した。Pd(PPh3)4(約40mg)を添加し、還流下で加熱を9時
間継続した後、混合物をクロロホルムで希釈し、水、飽和NaHCO3、ブライン、及び水で洗
浄し、Na2SO4で乾燥した。粗生成物を、CHCl3/THF(9/1)で溶離するシリカゲルで精製して
、暗色オイルを得た。これを、CHCl3/ヘキサンから4℃で一夜にわたって再結晶させて、
長い紫色結晶を得た(収率63%)。Rf(CHCl3/THF):0.3。
Figure 2015155442
 MS ES (m/z) (C39H41N5O3 計算値 627.32) 実測値 628.32 M++H。 LCMS (C18) 保持時間
11.12分 (628.3306) UV/Vis (CH2C12): λmax 668nm。
(3-デビニル-20-ピリジルピロフェオフォルビド-a(24))
3-デビニル-20-ピリジル-メチルピロフェオフォルビド-a(108mg、0.172ミリモル)をオ
ーブン中で乾燥したRBFに添加し、窒素で短時間パージした。窒素下で10M HCl(22mL)を添
加して溶解し、遮光して室温で8時間撹拌した。氷水中に注いで反応を止め、クロロホル
ムで抽出し、続いて、飽和NaHCO3及び水で洗浄した。それを、Na2SO4で乾燥し、濾過、濃
縮した後、シリカゲルで5〜10%MeOH/CHCl3のグラジエントで溶離して精製し、暗紫色固体
を得た(収率71%)。Rf (5%MeOH/CHCl3):0.5。1H及び13C-NMRは幅が広く分析できなかった
が、メチルエステルの加水分解が、3.58の単一ピークの消失(1H NMR)及びRf値の変化とし
て観察された。MS ES(m/z)(C38H39N5O3 計算値 613.75) 実測値 614.31(M++H)。すべての
酸PPa誘導体について観察される1H NMR(CDCl3、400MHz、25℃)は、幅が広く、解釈及び帰
属を困難にする区別のつかないピークをもたらした。LCMS(C18) 保持時間 9.51分 (614.3
132), UV/Vis(CH2Cl2):λmax 668nm。
(メチルで第4級化された5-ピリジルメソピロフェオフォルビドa(25))
メソ5-ピリジルPPa(0.033ミリモル)を窒素下で無水DMF(2.5mL)に溶解した。ヨウ化メチ
ル(6.5ミリモル)を添加し、TLC(5%MeOH/CHCl3)で観察して出発原料が消費されてしまうま
で、窒素下に室温で3.5時間撹拌した。ほとんどの溶媒を除去し、無水エーテルを添加し
、4℃で一夜放置した後、濾過して暗褐色固体を得た(74%)。
Figure 2015155442
 MS ES (m/z) (C39H42N5O3 計算値 755.65) 実測値 628.33 M+-I; UV/Vis (DCM) λmax 67
5nm。
(メチルで第4級化された5-ピリジルメソピロフェオフォルビドaスクシンイミジルエステ
ル(26))
メチルで第4級化された5-ピリジルメソPPa(0.017ミリモル)を無水DCM(3mL)及び無水THF
(1mL)に溶解した。DCC(0.049ミリモル)及びN-ヒドロキシスクシンイミド(0.11ミリモル)
を添加し、窒素下に遮光して室温で17時間撹拌したままにした。TLC(Rf (10%MeOH/CHCl3)
:0.1)で追跡した。溶媒を除去し、固体を、ヘキサン続いて無水エーテルで繰り返し洗浄
した。
Figure 2015155442
 MS ES (m/z) (C43H45N6O5I 計算値) 実測値 725.76 M+-I。
(メチルで第4級化された5-ピリジルメソメチルピロフェオフォルビドa(27))
5-ピリジルメソMePPa(0.039ミリモル)を無水DMF(2.5mL)に溶解した。MeI(7.97ミリモル
)を添加し、TLC(5%MeOH/CHCl3)で出発原料の消失を監視しながら、窒素下に室温で20時間
撹拌した。溶媒のほとんどを除去し、無水エーテルを添加し、冷却後に褐色固体を得た(9
9%)。
Figure 2015155442
 MS ES (m/z) (C40H44N5O3I 計算値 768.9) 実測値 642.34 M+-I UV/Vis (DCM) λmax 675
nm。
(3-デビニル-20-(4-トリエチレンオキシドピリジニウム)ピロフェオフォルビド-aヨウジ
ド(30))
3-デビニル-20-ピリジルピロフェオフォルビド-a(0.060g、0.098ミリモル)を無水DMF(5
mL)に溶解した。ヨードトリエチレンオキシド(1.48g、5.4ミリモル)を添加し、反応物を
、遮光して窒素下に80℃で4日間撹拌した。TLC(シリカゲル、MeCN:H2O:飽和K2NO3=60:10:
10)で出発原料の消費を追跡することによって、反応を監視した。溶媒を除去し、残留オ
イルを無水DCMに再溶解し、冷却後に脱脂綿を通して濾過を数回繰り返した。無水DCMに再
溶解し、無水エーテルで層にした。褐色固体を、遠心分離により捕集し、真空デシケータ
ー中、P2O5で乾燥した。
MS ES (m/z) (C45H54IN5O6 計算値 887.84) 実測値 760.41 M+-I。
LCMS(C18) 保持時間 6.84分 (760.4090) UV/Vis λmax 677nm。
(3-デビニル-20-(4-トリエチレンオキシドピリジニウム)-メチルピロフォルビド-aヨージ
ド(31A))
3-デビニル-20-ピリジル-メチルピロフェオフォルビド-a(0.100g、0.159ミリモル)を窒
素下で無水RBF中に秤量し、無水DMF(10mL)で溶解した。ヨードトリエチレンオキシド(1.8
53g、6.76ミリモル)を添加し、遮光して窒素下に80℃で24時間撹拌した。TLC(シリカゲル
、MeCN:H2O:飽和K2NO3=60:10:10)で出発原料の消費を追跡することによって、反応を監視
した。溶媒を除去し、残留オイルを、無水エーテルで繰り返し洗浄し、無水DCMに溶解し
、脱脂綿を通して濾過した。最後に、無水DCMに再溶解し、無水エーテルを使用して沈殿
させて、褐色固体を得た。この固体を、遠心分離で捕集し、真空デシケーター中、P2O5で
乾燥した。Rf (MeCN:H2O:飽和K2NO3=60:10:10):0.6。
Figure 2015155442
 LCMS (C18) (C46H56IN5O6 計算値 901.87) 保持時間 7.38 (774.42) UV/Vis λmax 677nm
。
(3-デビニル-20-(4-トリエチレンオキシドピリジニウム)ピロフェオフォルビド-aヨージ
ド(31B))
3-デビニル-20-(4-トリエチレンオキシドピリジニウム)-メチルピロフェオフォルビド-
aヨージド(0.0736g、0.082ミリモル)に10M HCl(8mL)を窒素下で添加し、遮光して室温で
一夜撹拌した。TLC(シリカゲル、MeCN:H2O:飽和K2NO3=60:10:10)で出発原料の消費を追跡
することによって、反応を監視した。5M NH4PF6溶液(約5mL)を添加し、短時間撹拌した。
氷水、続いてCHCl3を添加し、水層を澄明になるまで数回抽出した。有機物を、さらに、
水層が中性になるまで水で洗浄した。溶媒を除去して粗生成物を得た。これを、シリカゲ
ル60で被覆された分取TLCプレート(20×20cm2、2000μ)上で、溶離液としてMeCM:H2O:飽
和K2NO3=60:10:10を使用して精製した。生成物を、CHCl3に溶解し、水で洗浄した後、濃
縮し、無水DCM及び無水エーテルに再溶解し、遠心分離で回収し、P2O5で乾燥した。
Rf (MeCN/H2O/KNO3): 0.33 LCMS (C18) (C46H56IN5O6 計算値 901.87) 保持時間 7.38(77
4.42)。
(3-デビニル-20-(4-トリエチレンオキシドピリジニウム)ピロフェオフォルビド-aクロリ
ド(31C))
3-デビニル-20-(4-トリエチレンオキシドピリジニウム)ピロフェオフォルビド-aヨージ
ド/PF6(0.010g、0.011ミリモル)を窒素下で無水MeOH(3mL)に溶解した。Dowex 1×8-400(
約10mg)を添加し、遮光して室温で3時間撹拌した後、脱脂綿を通して濾過し、濃縮した。
それを、無水DCM/無水エーテルに再溶解し、固体を得て、真空デシケーター中のP2O5上で
乾燥して、最終生成物を得た(95%)。
Figure 2015155442
 LCMS (C18) (C45H54F6N5O6 計算値 905.90) 保持時間 6.80 (760.41 M+-PF6) UV/Vis (DC
M) λmax 676nm。
(実施例2:本発明化合物の担体分子への複合、及び新規光免疫複合体の生物学的分析)
(生物学的な材料及び方法)
細胞培養:
ヒト腫瘍細胞系(SKOV3)を、75cm3のフラスコ中で増殖させ、PBS(2×25mL)で洗浄し、ト
リプシン(10×)(150cm3のフラスコ当たり2mL)と共に5〜7分間インキュベートした。フェ
ノールレッド不含DMEM(10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)(10mL)を添加し、細
胞を、ピペット移送により再懸濁した。細胞を、ファルコンチューブに移送し、37℃、20
00rpmで2分間遠心した。上清液を廃棄し、ペレットを5mLのフェノールレッド不含DMEM(10
%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)に再懸濁した。細胞を、血球計数器を使用して
計数し、それに合うように希釈し、ウェル当たり200μLを播種した。
次のように播種した:
SKOV-3細胞3000個/ウェル、KS細胞2000個/ウェル、SKBr3細胞5000個/ウェル。
C6.5scFvを、J.Marks教授(カリフォルニア大学、San Francisco)からpUC119で入手し、
XL1ブルー細胞中で発現させた。C6.5scFvを遺伝子操作し、抗体結合部位中のリシン-100
を除去した。これによって、低減された免疫反応性のPICを形成する可能性を低下させた
。
精製したタンパク質を、25mLのスピンコンセントレーターを使用して1mg/mLのタンパク
質にまで濃縮し、10%グリセロール中、-80℃で貯蔵するか、或いは濃縮しないで精製直後
にカップリングに使用した。
(C6scFv-光増感剤、光免疫複合体(PIC)の合成)
PPaPEGスクシンイミジルエステルを100%DMSO中に再懸濁し、室温で連続的に撹拌しなが
ら1時間で、6%のアセトニトリルを含有するPBS中に592μM〜37μMのC6scFv濃度で(DMSO総
含量を2%に維持しながら)添加した。次いで、光免疫複合体(PIC)をPBS/2%DMSOに対して緩
衝液を2回交換して透析した。次いで、光免疫複合体(PIC)をPBSに対して緩衝液を2回交換
して透析した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルでの電気泳動(SDS-PAGE)
分析を実施し、クーマシーブルーで染色した。非染色のゲルを、半乾燥ブロッティング装
置(Biorad)を使用してニトロセルロース上に移し、徐々に乾燥した。Fuji LAS3000を使用
するUV光でPPaPEGを励起することによって、蛍光を可視化した。製造業者のソフトウェア
を利用し、デンシトメトリーを使用して相対強度/バンドサイズを計算した。この比率を
使用して非共有結合について補正した。UV照明下で(図1参照)、遊離の及び複合されたPPa
PEGは、蛍光を発し、共有結合性カップリングを裏づけ、PPaPEGの約30%が非共有結合でタ
ンパク質と会合していることを示した。
適切な複合化条件のさらなる詳細は、国際公開第2007/042775号及びBhattiらの文献(20
08)Int J Cancer Mar 1;122(5):1155〜63中に見出すことができる。
PPaの場合、カップリング比率は30〜50%で変化した。複合化条件における光増感剤(PS)
の溶解性を改善すること及びPS間の凝集を最小化することの意義は、PPaのような本質的
に疎水性のPSを使用して可能であるよりも、相当により高いPS濃度で複合化を実施するこ
とを可能にすることである。例として、本発明者らは、5mg/mLのタンパク質濃度で複合す
ることに目標を定め、これには、本質的にはPBS中でほぼ130mg/mLのPS濃度が必要とされ
る。PPaのような疎水性PSを使用すると、250μg/mLのタンパク質濃度で複合化を実施する
ことが可能になる。それゆえ、PSの溶解性を改善し、且つ凝集を最小化することによって
、複合化できる量の200倍の増加を達成することができ、より高い濃度の光免疫複合体に
つながる。
(分光学的測定)
遊離の光増感剤(2%ジメチルスルホキシド-DMSO/PBS中に溶解された)及びscFvにカップ
リングされた光増感剤(PBS/2%DMSO中に溶解された)の吸光度プロファイルを、Hewlett Pa
ckerd UV-可視分光光度計で測定した(図2及び3)。scFvに結合させたいくつかのPPaPEG分
子を、410nm及び670nmの吸光度を使用して測定し、PPaPEGの標準曲線と比較した。C6PPaP
EG複合体の吸光プロファイル(図2)は、400nm付近に特徴的なピーク(Soret帯)を、500〜63
0nmに小さなピークを、及び670nm付近にクロリン類に特有である強い吸収(Q帯)を示す。
該ピークは、遊離のPSに比較して、670nmのピークで3〜5nmの赤色移動を伴って僅かに広
がったが(データは示さない)、すべて急峻であり、PSに関して非凝集状態を示唆している
。670nm付近のこのピークを利用して、PPaPEG:scFvの比率を決定し、30%(デンシトメトリ
ーで測定して)の非共有結合について補正した後、5〜10:1であるPS:scFvの効果的な比率
範囲を得た。
(C6scFv-PPaPEG PICのインビトロ細胞毒性)
細胞を、トリプシン処理し、96ウェルプレート中に3×103細胞/ウェルで播種し、37℃
、5%CO2で一夜インキュベートした。翌日、細胞をPBSで1回洗浄し、50μLのPIC(適切に希
釈された)又は遊離の光増感剤を、抑制照明下で適切なウェルに添加した。対照ウェルに
はPBSを添加した。暗所において、37℃、5%CO2で30分間インキュベートした後、細胞をPB
Sで3回洗浄し、各ウェルに50μLのPBSを添加した。ウェルを、4つのウェル上に0.6W、10
秒間の線量で、2Wからの光(680nm、HPD Inc、New Jersey、米国)に曝露した(対照ウェル
にはscFv-PPaPEG又は遊離のPPaPEGを添加して光に曝露しないか、或いはPBSを添加して光
に曝露する。総合対照として、scFv-PS又はPSを添加して光に曝露しない細胞を含めた)。
細胞を、暗所にて37℃、5%CO2で48時間インキュベートした後、製造業者の説明書に従っ
てセルタイターアッセイを実施した。生存細胞によるテトラゾリウム化合物(MTS)の492nm
でのその吸光度で測定可能なフォルマザン色素への転換を含む、Promega Cell Titer-96
（商標）システムを使用した。C6.5含有PICの場合、SKOV-3細胞を抗原(HER2)陽性細胞系
として使用し、KB細胞を抗原陰性細胞系として使用した。
C6PPaPEG PICは、その受容体を発現する細胞系を死滅させ(図4参照)、受容体陰性細胞
系を助命した(データは示さない)。
(インビボ実験(体内分布、薬物動態、及び療法))
(体内分布実験)
0.1mgの光増感剤を0.5mLのPBSに溶解した。ヨードゲン(Iodogen)で被覆されたチューブ
(PierceChemicals)中の0.1mLのPBSに放射能標識化ヨウ素(Na125I、ICN Chemicals)を添加
し、放射化させた。放射化ヨウ素-125を光増感剤に移し、室温で5〜10分間反応させた。
放射能標識化光増感剤を、ヨウ素化剤を除去するための100%PBSで、続いて10%MeOH/PBSか
ら100%MeOHまで徐々に切り替えて溶離するミニシリカゲルカラムで遊離ヨウ素から分離し
、放射能標識化光増感剤を10%MeOH/クロロホルムで溶離した。放射能標識化光増感剤の溶
液を、風乾し、2%DMSOを含有するPBS中に再懸濁した。
雌性BALB/cヌードマウス(6〜8週齢)に、0.1mLの氷冷マトリゲル中で混合された107個の
SKOV3腫瘍細胞を皮下で埋め込み、腫瘍を異種移植片として3〜6週間増殖させた。マウス
は、クリーンルーム中のIVCケージ(個別換気ゲージ)中で飼育した。サンプルは、0.1mLの
量で外側尾静脈を介して静脈内で注入し、マウスを、十分な(照射済み)水及び食物と共に
暗光中で飼育した。いくつかの時点(1〜24時間)で、マウスを、終末麻酔下での心臓穿刺
によって処分し、血液及び組織を収集した。すべての組織を、ガンマ計数によって放射能
について計数し、重量を測定した。
結果は、組織1グラム当たりに注入された放射性物質の割合として示す。PPaの体内分布
を図5に示す。PPa-PEGの体内分布を図6に示す。カチオン性PPaの体内分布を図7に示す。
PPaは疎水性であり、血液中に長時間留まる。このことは、すべての主要組織中での高
い濃度につながり、多くの市販光増感剤に関する皮膚光感受性を説明する。これらのPSの
いずれかを用いた腫瘍への有意な局在化はない(図11の腫瘍内:血液内比率のプロットを参
照されたい)。より溶性のPSは、より急速に消失し、すべての組織中でより低い全体濃度
を有する。溶性PSの場合、いずれの組織に対しても特異的な局在化はない。
(3種すべての光増感剤の血中クリアランス)
3種すべての光増感剤の血中クリアランスを図8にプロットする。カチオン性PPaPSは、P
Pa-PEGに比べてより急速に消失し、その双方ともPPaに比べてより速い。
これらの結果は、本発明の新規な光増感剤の設計上の特徴が、望ましいより大きな溶解
性及びより速いクリアランスにつながることを示唆している。
(C6-PPAと比較したすべてのC6-PPA-PEG光増感剤の血中クリアランス)
PS(PPa及びPPa-PEG)をC6scFvへ化学的にカップリングさせ、5LのPBSに対して3回透析し
て遊離のヨウ素を除去したことを除いて前記のようにヨードゲン法で放射能標識化し、SK
OV3腫瘍を有するBALB/cヌードマウス中に上記のように注入した。組織を切開し、上記の
ように計数した。
血中クリアランスを監視し、結果を図9に示す。C6scFvは極めて速い血中クリアランス
を有する。PPaは極めて遅い血中クリアランスを有する。C6-PPaの血中クリアランスは、C
6PPa-PEGである2種の成分のそれの中間にあった。
このことは、複合化された特定のPSがscFvのクリアランス速度を調節すること、及びPS
が溶性/親水性であればあるほど(すなわち、PPa-PEG)、複合体はより急速に消失すること
を示している。このことは、本発明によって提供されるようなより溶性のscFv-PS複合体
が、より低い毒性及び皮膚光感受性、並びにより良好な組織内:血液内比率を有する可能
性があることを示唆している。
(腫瘍内取込み)
腫瘍を放射能について計数し、注入線量/腫瘍組織(g)の%として表現した(図10)。
PPaは、その長い血中半減期のため、高い腫瘍内(及び正常組織内)取込みを有する。PPa
PEGは、腫瘍中にPPaの約1/3のレベルで蓄積する。C6scFvは、その迅速なクリアランスの
ため、より低レベルで蓄積し、2時間の時点でピークに達する。2種のPS複合体は、腫瘍中
に、後者のより速いクリアランスのため、C6-PPa複合体の場合はC6-PPaPEGに比べてより
多く存在して蓄積する。
このデータは、さらに、本発明のPICがより低い副作用を有するが、腫瘍内に局在する
特性を保持していることを示唆している。腫瘍内:血液内比率も、より良好である(図11参
照)。
(PS及びPICの腫瘍内:血液内比率)
腫瘍中のPS割合を血中の割合で除算して(グラム対グラム)、標的指向化又は腫瘍内:血
液内比率を得た(高いほどより良好)。これを図11にプロットした。高い腫瘍内:血液内比
率は、血液(及びその他の組織)中に比べて腫瘍中により多く存在することを意味する。こ
れは、腫瘍内取込み及び血中クリアランスの関数である(図9及び10参照)。
C6scFvは、その結合形成及び最も速いクリアランスのため、最も高い比率を有する。例
えば、その比率は、24時間の時点で12:1である。腫瘍中で保持されるが血液から除去され
るため、その比率は、時間と共に増加している。遊離PSは、非標的指向性のため、乏しい
比率(1〜2付近)を有する。C6-PPaは、24時間の時点で3:1の比率を有し、48時間の時点で5
:1まで上昇する。C6-PPa-PEG PICの場合、この比率は、より速いクリアランスのため向上
する。その比率は、24時間の時点で7:1であり、48時間の時点でほぼ10:1まで上昇する。
これらの結果は、より溶性のPSが、遊離PSに比べてより良好な特異性及び標的指向性を
有するより溶性のPICにつながることを示唆している。しかし、標的指向化されていない
場合に比べて腫瘍中に存在するPIC(及びそれゆえ増感剤)はより少ない。
(PPa-PEG(scFv複合化のない)のみでの療法)
腫瘍を上記のよう確立し、1日目及び4日目に0.2mLの遊離PPa-PEG1(0.1mg=33μM濃度)PS
を注入した(マウス尾静脈中に静脈内で)。腫瘍内取込み(図10参照)に基づいて、4時間後
に、HPDレーザーを使用して腫瘍を0.5Wで20分間照射した。マウスを事前に麻酔した。レ
ーザー処置は、各薬物サイクルに続いて行った。腫瘍を3週間追跡し、腫瘍サイズの%増加
をプロットした(0日目=100%)(図12参照)。
PPa-PEGは、非処置(生理食塩水)対照に比較して、有意な腫瘍退縮をもたらさなかった
。これは、おそらくPSの急速なクリアランスのためであろう。
(C6 PPa-PEG療法)
腫瘍(1群マウス6匹)を上記のように確立し、1日目及び4日目に0.2mLのC6-PPa-PEG PIC
又は遊離PPa-PEG1 PS(1mg/mL PIC=33μM濃度のscFv又は330μMのPPa-PEG)を注入した。遊
離PPa-PEG PSは同一濃度で存在した(0.5mg/mL=375μM)。腫瘍内取込み(図10参照)に基づ
いて、4時間後に、HPDレーザーを使用して腫瘍を0.5Wで20分間照射した。マウスを事前に
麻酔した。レーザー処置は、各薬物サイクルに続いて行った。腫瘍を6週間追跡し、腫瘍
サイズの%増加をプロットした(0日目=100%)(図13参照)。
PPa-PEGは、非処置(生理食塩水)対照に比較して、有意な腫瘍退縮をもたらさなかった
。これは、おそらくPSの急速なクリアランスのためであろう。しかし、HER-2で標的指向
化されたPPa-PEGは、有意な腫瘍退縮をもたらし(p＜0.001)、マウスの5/6はそれらの腫瘍
を成功裡に治療された。
これらの結果は、C6-PPa-PEG PICの治療的有用性を示し、より良好な結果につながる可
能性のあるより高い投与量のPICをインビボで投与できることを示している。
(実施例3:PPAのさらなる誘導体)
(概観)
ピロフェオフォルビド-aのいくつかのさらなる誘導体を、マクロ環の周辺部付近の官能
基の適切な取扱いによって合成し、PBSへの高められた溶解性及び自己凝集のさらなる低
減を備えた一連の新規誘導体を提供することができる。これらの誘導体のすべては、金属
で触媒されるクロスカップリング反応(薗頭カップリング)を利用してヘキシン酸のような
生体分子複合化に適した係留鎖を結合させることができる基を含有する。
PPaの17-プロピオン酸側鎖は、マクロ環平面上に突き出ており(前に考察したように)自
己凝集を最小化するが、反対側が、なお周囲に対して大きな疎水性面を呈示する。これを
克服するために、本発明者らは、C-3炭素原子上にTEG-鎖及び帯電基の双方を導入した。
本発明者らは、このような基が17-プロピオン酸側鎖を含有する側から揺れ離れ、PPaの非
保護側上に在留すると予想する。
修飾の一例(スキーム10)では、MPPa(5)のビニル基をアルデヒドに転換し、好収率でメ
チルピロフェオフォルビド-d(32)を褐色微粉として得た。塩素原子捕捉剤2-メチル-2-ブ
テンの存在下で亜塩素酸ナトリウムを使用する既発表の方法(参考文献102)を利用するこ
とによって、アルデヒドを酸化して、対応するカルボン酸(33)を収率40〜50%で得た。次
いで、短いトリ(エチレングリコール)モノメチルエーテル(TEG)鎖を備えたベンジルエー
テル単位を3-カルボン酸のエステル化により結合させて、(34)を得て、次いで、それを、
ピリジニウムペルブロミドを使用してブロム化して誘導体(35)を得た。
Figure 2015155442
(33)中の17-プロピオン酸側鎖を強酸(HCl、H2SO4)で加水分解して、ジ-カルボン酸誘導
体(37)を得た(スキーム11)。双方のカルボン酸をTEG鎖でエステル化することによって、
マクロ環の双方の平面が保護され且つ自己凝集から防護された高水溶性誘導体(38)を得た
。ブロム化は、メソ5-ブロム誘導体(39)を与え、やはり生体分子複合化に適した係留鎖の
導入を可能にする。
Figure 2015155442
マクロ環の平面上に拡がる「ツバメの尾部」様の可溶化基を導入するさらなる試みには
、メチルピロフェオフォルビド-d(32)の3-アルデヒド基をエチニル基へ転換することを含
めた(スキーム12)。これは、炭酸セシウム及び無水メタノールの存在下でBestmann-大平
試薬を使用し(参考文献103)、1ステップで、ほどほどの収率で達成された。
反応を分光学的に追跡し、3-ホルミル誘導体(32)のピーク694nmの消失及び3-エチニル
化誘導体(41)に対応するピーク677nmの出現を監視し、クロマトグラフィーの後に紫色粉
末として単離した。(41)中にC3-エチニル基が存在すると、過剰の2-エトキシ(トリエチレ
ンオキシ)-ヨードベンゼン(42)との銅不含薗頭カップリングの実施が可能になり、フェニ
ル誘導体(43)が得られた。17-プロピオン酸エステル鎖の対応する酸への加水分解は、LiO
H/THF/MeOHを使用して達成され、複合化可能な取っ手が得られた。
Figure 2015155442
C3-エチニル基の存在は、アジド化合物との1,3-双極子付加環化(「クリック」化学)を
実施する可能性を開くが、このことは、化合物(41)で既に示されている(参考文献103)。
本発明者らは、メソ-PPa(17)の17-プロピオン酸側鎖にアルキン又はアジド官能基を結
合させることを試みることにした(スキーム13)。本発明者らが開発した2ステップ法を使
用して、メソ-PPa(17)をプロパルギルアミンでエステル化して、高収率でアミド(45)を得
た。この反応には、DCC又はDICなどの脱水剤の存在下で酸をNHSと反応させることによっ
て、インサイチュで酸のN-ヒドロキシスクシンイミド誘導体を前以て形成することが含ま
れる。反応をTLCで追跡し、出発酸(17)のすべてが消費され、より大きなRfのスポットが
出現したら、プロパルギルアミンを一度に添加し、室温での撹拌をさらに5時間継続する
と、TLCで判断して反応は完結していた。
プロパルギル誘導体(45)を、クロマトグラフィーの後に紫色粉末として単離し、ピリジ
ニウムペルブロミドを用いて臭素化して、メソ-5-ブロモ誘導体(46)を得た。これを、還
流しているクロロホルム/メタノール中で酢酸亜鉛を使用して、亜鉛でメタル化して(47)
を得た。これは、マクロ環中への銅の挿入を防止するために必須であり、アジドとアルキ
ンとの間の付加環化は、通常、硫酸銅及びアスコルビン酸ナトリウムの存在下で実施され
る。
Figure 2015155442
本発明者らは、また、ピロフェオフォルビド誘導体の吸光度プロファイルを、それらを
対応するバクテリオクロリン類へ転換することによって、より長波長(700〜800nm)へ拡げ
、腫瘍中へのより深い浸透の達成を可能にし、かくしてより大きな腫瘍塊を治療すること
を検討した。
Pandeyらは、フェオフォルビドa及びピロフェオフォルビドaの双方が、四酸化オスミウ
ムと反応して対応するvic-ジヒドロキシバクテリオクロリンを好収率で生成することを示
した(参考文献104)。メソ5-ブロモトリPEG誘導体(9)を、少量のピリジンを含有する無水D
CM中、OsO4と反応させることによって、対応するバクテリオクロリン誘導体(47)に転換し
た。反応物を室温で12時間撹拌し、UV/Vis分光法で監視した。その間に、双方ともバクテ
リオクロリンに特有である、Soret帯(415nmから361nmへの青色シフト)及び最も遠いQ帯(6
68nmから715nmへの赤色シフト)の双方にとって劇的変化が観察された。ヘキシン酸との薗
頭カップリングによって、水溶性の生体分子複合化可能なバクテリオクロリン誘導体が得
られた。
Figure 2015155442
本発明者らの取組みの有用性及びメソ5-ブロモ誘導体などの中間体の開発により、シス
テインのチオール基上での部位特異的カップリングのための光増感剤を容易に開発するこ
とが可能になった。システイン残基は、リシン残基と異なり、抗体上のシステインが結合
部位から遠いので、魅力的な生体分子複合化に適した標的になることができる。
チオールとのカップリングのための最も一般的且つ重要な反応基の1つがマレイミドで
あり、それは、チオールとのアルキル化反応を受けて、安定なチオエーテル結合を形成す
る。マレイミド基を含有する置換されたは直鎖アルキン誘導体(54)は、5-アミノヘキシン
(52)から、無水マレイン酸と反応させて中間体(53)を得て、それを酢酸ナトリウム及び無
水酢酸で処理してN-ペンチンマレイミド(54)にすることによって合成された。
化合物(54)を薗頭カップリングにより種々のメソ5-ブロム化誘導体に結合させることに
よって、本発明者らの光増感剤とのシステイン残基上での複合化を実施することができる
。化合物(52)は、文献法により調製した(参考文献105)。
Figure 2015155442
5-アジドペンチン(51)は、それをメソ5-ブロモの位置でカップリングさせることもでき
るので、有用な中間体であり、アジドとの付加環化反応により基を結合させることを可能
にする。
(合成の経路及び方法)
空気及び/又は水に敏感な化合物の取扱いは、標準的なシュレンク技術を使用して実施
した。DCM及びトリエチルアミンは、CaH2から蒸留することによって乾燥し、無水THFは、
ナトリウム/ベンゾフェノンからの蒸留によって得た。その他のすべての試薬は、特記し
ない限り、市販業者によって供給されるものを使用した。
分析薄層クロマトグラフィー(TLC)は、ガラスで裏打ちされたMerckシリカゲル60 GF254
プレート又はアルミニウムで裏打ちされた酸化アルミニウム(中性)上で実施され、可視化
は、必要な場合、UV光源を使用して達成され、場合によっては化学染色剤を使用した。カ
ラムクロマトグラフィーは、加圧空気を使用し、シリカゲル60、又は5%の水で不活化され
た酸化アルミニウム(中性又は塩基性)(BrockmannグレードIIIと呼ばれる)上で実施した。
溶媒混合物を使用する場合、比率は容積で報告した。
NMRスペクトルは、Bruker DPX400(400MHz)を使用し、周囲温度のプローブ温度で記録し
た。化学シフトは、内部標準としてCDCl3(1H NMRの場合、7.26ppm)を使用し、パーツパー
ミリオン(ppm)として示し、カップリング定数(J)は、ヘルツ(Hz)で示す。UV/Visスペクト
ルはHewlett Packard8450ダイオードアレイ分光計で記録した。質量スペクトルは、いく
つかの技術を使用して実施し、分子イオン及び主要ピークのみ報告する。
(ピロフェオフォルビド-d(32))
これは、文献法の組合せ、主として小さな修正を伴う(Chem.Eur.J.2008,14(26),7791〜
807)に従って調製された。メチルピロフェオフォルビドa(5)(0.5g、0.9ミリモル)の無水T
HF(120mL)溶液に、氷酢酸(1.5mL)及び水(1.5mL)を、続いて四酸化オスミウム(3mg、少数
の小さな結晶)を添加した。反応混合物を室温で30分間撹拌した後に、澄明ではなかった
が、TLC(シリカゲル、5%MeOH/DCM)は、ジヒドロキシル化中間体の形成を示した。さらに3
0分間撹拌した後、メタ過ヨウ素酸ナトリウムの飽和水溶液(25mL)を、等圧滴下ロートを
使用し、ほぼ10mL/hの流速で徐々に添加した。続いて、メタ過ヨウ素酸ナトリウムのさら
なる部分(25mL)を直接的に添加し、撹拌を1時間継続した。水(300mL)を添加して反応を止
め、水相をジエチルエーテル(3×300mL)で抽出し、合わせた有機抽出物を、飽和重炭酸ナ
トリウム溶液(200mL)、水(300mL)で逐次的に洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して
暗色固体を得た。これを文献法により精製する試みは、十分な成功ではなく、多くの組合
せの後に、5%アセトン/DCMの混合物を使用するシリカゲルクロマトグラフィーを利用する
精製が、最もよく機能し、所望の生成物が褐色粉末として得られた(0.3g、60%)。この化
合物を、文献に従って特徴付けた。
(メチル3-デビニル-3-カルボキシピロフェオフォルビドa(33))
ピロフェオフォルビド-d(32)(165mg、0.3ミリモル)、スルファミン酸(175mg、1.78ミリ
モル)、2-メチル-2-ブテン(2MのTHF溶液、7.5mL)及び水(0.75mL)の混合物を、アルゴン下
に室温で10分間撹拌した。この溶液に、水(0.6mL)に溶解した亜塩素酸ナトリウム(135mg
、0.015ミリモル)を10分間にわたって滴加した。添加が完結したら、反応物を室温でさら
に30分間撹拌すると、TLC(シリカゲル、5%MeOH/DCM)は、反応が完結したことを示した。
反応混合物を、水中(100mL)に注ぎ、クロロホルム(2×100mL)で抽出し、次いで、合わせ
た有機層を、水(3×)で洗浄し、乾燥(Na2SO4)、蒸発させた。残留物を、カラムクロマト
グラフィー(シリカゲル、5%MeOH/DCM)で精製して、褐色固体として純粋な酸(33)を得た(5
1mg、30%)。Rf 0.25(化合物32はRf 0.61)。UV/Vis (CHCl3) λmax 419, 384, 685, 649,
517, 625。MS ES (m/z) (C33H34N4O5 計算値 566.61) 実測値 567.2607 (M++H)。
(メチル3-デビニル-3-カルボキシベンジル-3,4,5-(トリエチレングリコールモノメチルエ
ーテル)ピロフェオフォルビドa(34))
(33)(35mg、0.066ミリモル)の撹拌された無水DCM/THF混合物(9:1、10mL)溶液に、アル
ゴン下で、3,4,5-(トリエチレングリコールモノメチルエーテル)ベンジルアルコール(4)(
56.5mg、0.095ミリモル)、ジイソプロピルカルボジイミド(64μL、0.412ミリモル)、DMAP
(30mg、0.25ミリモル)、DPTS(71mg、0.24ミリモル)を添加し、ほぼ10分間撹拌した後、無
水N-エチルジイソプロピルアミン(39μL、0.223ミリモル)を添加し、撹拌をさらに12時間
継続した。反応混合物を蒸発乾固し、残留物をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、1
0%MeOH/CHCl3)で精製して赤色/褐色オイルとして所望の純粋な(34)を得た(46mg、61%)。R
f 0.43(化合物33はRf 0.34、10%MeOH/CHCl3)。UV/Vis (DCM) λmax 418, 384, 683, 648,
516, 621。MS ES (m/z) (C31H82N4O17 計算値 1142.32) 実測値 1143.5753 (M++H)。更
なる実測値 1165.5573 (M++Na)。
(メチル3-デビニル-3-カルボキシベンジル-3,4,5-(トリエチレングリコールモノメチルエ
ーテル)メソ5-ブロモピロフェオフォルビドa(35))
撹拌された(34)(40mg、0.035ミリモル)の無水DCM(15mL)溶液に、アルゴン下で、無水ピ
リジン(28.3μL、0.35ミリモル)、続いて使用に先立って高度真空ポンプで乾燥したピリ
ジニウムペルブロミド(14.5mg、0.045ミリモル)を添加した。反応混合物を室温で撹拌し
、その間、反応をUV/Vis分光法で追跡すると、20分間内に完結した。反応混合物を蒸発乾
固し、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、5%MeOH/CHCl3)で精製して、赤色/紫色オ
イルとして純粋な(35)を得た(13mg、30%)。Rf 0.14。UV/Vis (DCM) λmax 417, 388, 686
, 521, 565, 627。MS ES (m/z) 1222 (M+) 1245(M++Na,100%)。
(3-デビニル-3-カルボキシピロフェオフォルビドa(37))
メチル3-デビニル-3-カルボキシピロフェオフォルビドa(33)(15mg、0.0272ミリモル)を
極めて少量の無水THFに溶解し、アルゴン下に置いた。この溶液に、濃塩酸(10mL)を徐々
に添加し、生じる緑色溶液を、遮光して室温で12時間撹拌した。反応混合物を大量の砕氷
上に徐々に滴下することによって反応を止めると、着色が観察された。氷/水をクロロホ
ルム(3×50mL)で抽出し、乾燥、蒸発させて、褐色固体を得た(11.2mg、74%)。Rf 0.23(10
%MeOH/CHCl3)。UV/Vis (CHCl3) λmax 419, 383, 685, 549, 517, 626。MS ES (m/z) (C3
2H32N4O5 計算値 553.2451) 実測値 553.2449 (M+)。
(メソピロフェオフォルビドa-3,4,5-(トリエチレングリコールモノメチルエーテル)3-デ
ビニル-3-カルボキシベンジル-3,4,5-(トリエチレングリコールモノメチルエーテル)プロ
フェオフォルビドa(38))
無水DCM/THF(9:1)の混合物(5mL)中の3-デビニル-3-カルボキシピロフェオフォルビドa(
37)に、アルゴン下で、3,4,5-(トリエチレングリコールモノメチルエーテル)ベンジルア
ルコール(4)(33.1mg、0.056ミリモル)、ジイソプロピルカルボジイミド(37.4μL、0.241
ミリモル)、DMAP(17.7mg、0.145ミリモル)、DPTS(41.6mg、0.141ミリモル)を添加し、ほ
ぼ10分間撹拌した後、無水N-エチルジイソプロピルアミン(22.6μL、0.13ミリモル)を添
加し、撹拌をさらに12時間継続した。反応混合物を蒸発乾固し、残留物をカラムクロマト
グラフィー(シリカゲル、10%MeOH/CHCl3)で精製して赤色/褐色結晶性固体として所望の純
粋な(34)を得た(17.3mg、55%)。Rf 0.43。UV/Vis (DCM) λmax 416, 384, 683, 648, 516
, 621。MS ES (m/z) 1706.9 (M+), 1729.9 (M++Na)。
(メソ5-ブロモピロフェオフォルビドa-3,4,5-(トリエチレングリコールモノメチルエー
テル)3-デビニル-3-カルボキシベンジル-3,4,5-(トリエチレングリコールモノメチルエー
テル)ピロフェオフォルビドa(39))
化合物(38)(5mg、0.00293ミリモル)を無水DCM(2mL)に溶解し、アルゴン下に置いた。撹
拌されたこの溶液に、無水ピリジン(2.4μL、0.029ミリモル)、続いてピリジニウムペル
ブロミド(1.2mg、0.0038ミリモル)を添加した。反応混合物を室温で撹拌し、その間、反
応をUV/Vis分光法で追跡すると、20分間内に完結した。反応混合物を蒸発乾固し、カラム
クロマトグラフィー(シリカゲル、10%MeOH/CHCl3)で精製して、赤色/紫色固体として純粋
な(39)を得た(2mg、38%)。Rf 0.14。UV/Vis(DCM)λmax 417、389、687、521、564、627。
MS ES (m/z) (C88H127BrN4O29 計算値 1185.8253) 実測値 1185.8661 (M++H)。更なる実
測値1231.5673 (M++2Na)。
(メソピロフェオフォルビドaプロパルギルアミド(45))
メソピロフェオフォルビドa(100mg、0.185ミリモル)を無水DCM/20%TFH(10mL)に溶解し
、アルゴンの覆いの下に置いた。撹拌されたこの溶液に、N-ヒドロキシスクシンイミド(2
7mg、0.233ミリモル)、続いてジイソプロピルカルボジイミド(DIC)(37.4μL、0.242ミリ
モル)を添加し、生じた混合物を遮光して室温で12時間撹拌すると、TLC(シリカゲル、5%M
eOH/CHCl3、Rf 0.47)は、活性エステルの存在及びすべての出発原料の消費を示した。こ
の時点で、2倍過剰のプロパルギルアミン(25.6μL、0.373ミリモル)を添加し、撹拌をさ
らに6時間継続した。TLC(シリカゲル、5%MeOH/CHCl3)は、活性エステルのすべてが消費さ
れ、Rf 0.22を有する新たな主要成分が存在することを示した。反応混合物を蒸発させて
暗緑色固体を得た。これを、ヘキサンと共に一夜磨り潰し、濾過、乾燥して暗緑色粉末を
定量的収率で得た。UV/Vis (DCM) λmax 410, 395, 656, 601, 503, 635。MS ES (m/z) (
C36H40N5O2 計算値 574.3182) 実測値 574.3186 (M++H)。
(メソ5-ブロモピロフェオフォルビドaプロパルギルアミド(46))
メソピロフェオフォルビドプロパルギルアミド(45)(50mg、0.087ミリモル)を無水DCM(2
0mL)に溶解し、アルゴン下に置いた。撹拌されたこの溶液に、無水ピリジン(70.5μL、0.
871ミリモル)、続いてピリジニウムペルブロミド(36.2mg、0.113ミリモル)を添加した。
反応混合物を室温で撹拌し、その間、反応をUV/Vis分光法で追跡すると、20分以内に完結
した。反応混合物を蒸発乾固し、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、5%MeOH/CHCl3)
で精製して、紫色粉末として純粋な(36)を得た(21mg、37%)。Rf 0.5。UV/Vis (DCM) λma
x 415, 668, 549, 611, 516。MS ES (m/z) (C36H39BrN5O2 計算値 652.2287) 実測値 652
.2290 (M++H)。
(メソピロフェオフォルビドaN-(6-N'-t-ブトキシカルボニル-アミノヘキシルアミド(59))
メソピロフェオフォルビドa(100mg、0.185ミリモル)を無水DCM/20%THF(10mL)に溶解し
、アルゴンの覆いの下に置いた。撹拌されたこの溶液に、N-ヒドロキシスクシンイミド(2
7mg、0.233ミリモル)、続いてジイソプロピルカルボジイミド、DIC(37.4μL、0.242ミリ
モル)を添加し、生じた混合物を遮光して室温で12時間撹拌すると、TLC(シリカゲル、5%M
eOH/CHCl3、Rf 0.47)は、活性エステルの存在及びすべての出発原料の消費を示した。こ
の時点で、2倍過剰のN-Boc-1,6-ジアミン(84μL、0.373ミリモル)を添加し、撹拌をさら
に6時間継続した。TLC(シリカゲル、5%MeOH/CHCl3)は、活性エステルのすべてが消費され
、Rf 0.21を有する新たな主要成分が存在することを示した。反応混合物を蒸発させて暗
緑色固体を得た。これを、ヘキサンと共に一夜磨り潰し、濾過、乾燥して暗緑色粉末を得
た(95mg、68%)。UV/Vis (DCM) λmax 410, 395, 656, 601, 503, 635。MS ES (m/z) (C36
H39N5O2, 計算値 735.4598) 実測値 735.4603 (M++H)。
(メソ5-ブロモピロフェオフォルビドaN-(6-N'-t-ブトキシカルボニル-アミノヘキシルア
ミド(60))
メソピロフェオフォルビドa N-(6-N'-t-ブトキシカルボニル-アミノヘキシルアミド(59
)(65mg、0.088ミリモル)を無水DCM(20mL)に溶解し、アルゴン下に置いた。撹拌されたこ
の溶液に、無水ピリジン(71.5μL、0.884ミリモル)、続いてピリジニウムペルブロミド(3
6.8mg、0.115ミリモル)を添加した。反応混合物を室温で撹拌し、その間、反応をUV/Vis
分光法で追跡すると、20分間以内に完結した。反応混合物を蒸発乾固し、カラムクロマト
グラフィー(シリカゲル、5%MeOH/CHCl3)で精製して、紫色粉末として純粋な(60)を得た(2
2mg、31%)。Rf 0.46。UV/Vis (DCM) λmax 416, 669, 549, 611, 516。MS ES (m/z) (C44
H58BrN6O2 計算値 813.3703) 実測値 813.3706 (M++H)。
(メソ5-ブロモピロフェオフォルビドaN-(6-アミノヘキシル)イミドGd(III)-DTPA(62))
メソ5-ブロモピロフェオフォルビドaN-(6-N'-t-ブトキシカルボニル-アミノヘキシルア
ミド(60)(10mg、0.012ミリモル)を無水DCMに溶解し、TFA(1mL)を添加した。これにより、
紫色から緑色へ直ちに変色した(UV/Vis(DCM) 423、662、611、581)。反応混合物を、室温
で45分間撹拌し、次いで、飽和重炭酸ナトリウム溶液を添加して中和すると、色は、元の
紫色に戻った。TLC(シリカゲル、10%MeOH/CHCl3)は、すべての保護された出発アミン(60)
の消費、及びベースライン上のスポットとしての遊離アミンの存在を示した。反応混合物
にDCM(100mL)を添加し、逆抽出した。次いで、合わせた有機抽出物を乾燥(Na2SO4)し、蒸
発させた。ジエチレントリアミン-五酢酸二無水物caDTPA(2.5mg、0.006ミリモル)を無水D
MF(0.5mL)に溶解し、トリエチルアミン(100μL)を添加した。この混合物に、次いで、無
水DMF(0.5mL)に溶解したアミンの溶液を滴加した。生じた反応混合物を室温で12時間撹拌
し、次いで、水(1mL)を添加し、反応混合物をさらに45分間撹拌した。その後、大量のジ
エチルエーテルを添加し、混合物を冷蔵庫中に一夜放置した。沈殿した固体を収集し、Me
OH、ジエチルエーテル及びDCMで洗浄し、乾燥して紫色粉末を得た(8mg)。この固体に、ピ
リジン(1.5mL)及びメタノール(1mL)を、続いてGdCl3六水和物(2.8mg、0.0215ミリモル)の
水溶液を添加し、室温で12時間撹拌した。溶媒を真空下に45℃で除去した後に、水(2mL)
を添加し、混合物を濾過し、水、アセトニトリルで洗浄し、乾燥して紫色固体を得た。UV
/Vis (DCM) λmax 417, 669, 549, 611, 516。MS FAB (m/z) 1227.3315。
(vic-7,8-ジヒドロキシメチルメソ5-ブロモピロフェオフォルビドa-3,4,5-(トリエチレン
グリコールモノメチルエーテル)ベンジルエステル(48))
(9)(10mg、0.0083ミリモル)の無水DCM(2mL)溶液にピリジン(10μL)を添加した。これに
、四酸化オスミウム(10mg)を添加し、生じた混合物を、UV/Vis分光法で監視しながら室温
で撹拌した。UV/Vis分光法及びTLC(シリカゲル、5%MeOH/CHCl3、Rf 0.38、化合物9はRf 0
.5)によって示されるように、反応は6時間以内に完結した。反応混合物中にH2Sガスを5分
間吹き込んで未反応のすべてのOsO4を分解することによって反応を止めた。反応物を一夜
蒸発乾固させ、次いでDCMに再溶解し、セライトの短い詰め物を通して濾過した。蒸発後
の残留物を、クロマトグラフィーで精製して、粘着性紫色固体としてバクテリオクロリン
(48)を得た(7.7mg、75%)。UV/Vis (DCM) λmax 367, 714, 532, 667, 417, 500。MS ES (
m/z) 1247.51 (M++23, 100%)。
(メチル3-エチニルピロフェオフォルビドa(41))
ピロフェオフォルビドd(100mg、0.18ミリモル)の無水THF(15mL)と無水メタノール(15mL
)中の溶液に、CsCO3(100mg、0.31ミリモル)及びBestmann-大平試薬(168mg、0.88ミリモル
)を添加した。反応物をアルゴン下に室温で撹拌し、UV/Vis分光法で693nmのQ帯ピークが
完全に消失するまで(ほぼ5時間)監視した。重炭酸ナトリウム水溶液中に注ぐことによっ
て反応を止め、DCMで抽出した。DCM抽出物を、水で洗浄し、乾燥(Na2SO4)し、濃縮した。
粗製物質を、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、7%ジエチルエーテル/DCM)で精製し
て、光沢のある結晶性固体として所望の化合物を得た(41mg、42%)。Rf 0.3。
UV/Vis (DCM) λmax 412, 675, 616, 510, 638。MS ES (m/z) (C34H35N4O3 計算値 547.2
709) 実測値 547.2713 (M++H)。
1-アミノ-4-ペンチン(52)は、1-ヒドロキシ-4-ペンチン(49)(市販品)から出発し、この
ヒドロキシル化合物をメシレートに転換し(無水エーテル中、メタンスルホニルクロリド
、Et3N)、該メシレートをアジドに転換し(アジ化ナトリウム、DMF)、該アジドをアミンに
還元する(トリフェニルホスフィン、THF)標準的な化学的方法を利用して調製することが
できる。
(N-ペンチンマレイミド(54))
これは、1-アミノ-4-ペンチンから、類似のN-プロパルギルマレイミドの調製のための
方法(PCT国際公開第2006/050192号)を利用して合成した。
(実施例4)-MRIで活性のある誘導体
標的指向化薬物は、将来のがん治療に関して大きな有望性を保持している。しかし、前
臨床(動物)及び臨床研究におけるこれらの分子の実際的評価に関して多くの難題が存在す
る。適切な生物学的投与量を投与すること、妥当な投与スケジュール、治療に最も応答す
るであろう患者集団を選択し診断すること、腫瘍の応答を把握及び評価すること（特に、
早期指摘）などの問題は、すべて、分子的に標的指向化薬物療法及び「個別化薬剤」の新
たな時代において取り組まれる必要がある。
解剖学的造影は、がん用医薬にとって相変わらず鍵であるが、分子イメージングは、薬
物開発をより成功的にし、治療をより効果的にする途方もない機会を提供する。標的指向
化され、非侵襲性で且つ定量的な造影の取組みは、新規薬物の開発を大きく補完し、且つ
最近の造影の取組みも補完する。磁気共鳴造影(MRI)は、しばしば常磁性造影剤の助けを
借りて、軟質組織を可視化するための安全でしかも強力な診断技術である。Gd3+、又はマ
ンガン(2+若しくは3+)及び鉄3+などのその他の常磁性イオンを含むキレート構造体は、T1
強調画像においてより明るく見える近接水プロトンの縦緩和時間(T1)を増加させることに
よって造影コントラストを改善する。
Magnevist(商標)及びOmniscan(商標)は、DTPAでキレート化されたGd3+を含有する、頻
繁に使用される2つのMRI用市販製品である。しかし、これらの及びその他のFDA承認の小
分子キレートは、インビボで小さな保持時間を有するだけでなく、それらは、また、細胞
造影及び医学的診断における応用のための感度の本質的欠如を欠点としてもつ。
造影剤の診断能力を改善することに向けた第1ステップは、それらを標的特異的にする
こと、及び特定の生物学的位置に蓄積することであり、抗体は、これらの目標の双方を達
成するための自然な方法を代表する。MRIのための標的指向化造影剤を創製する最初の努
力には、造影剤(典型的にはGd-DTPA)の全抗体上への直接的複合化を含めた。
しかし、この方法は、MRIの比較的低い感度及びほとんどの細胞標的の低い濃度のため
に、極めて成功的であることが判明しなかった。Mn(III)ポルフィリンは、潜在的造影剤(
CA)として研究されてきたが、PPaのようなクロロフィル-a誘導体中へのMnの挿入に関する
発表は極めて少ない。
本発明者らの当初の研究では、PPa中へのMnの挿入を検討した(スキーム16)。メタレー
ションは、氷酢酸中で酢酸Mn(II)の組合せを使用して高収率で達成され、生じるMn(II)誘
導体は、酸化して、不溶性生成物としてMn(III)錯体(55)を与え、次いで、それを、そのN
-ヒドロキシスクシンイミド誘導体(56)に転換した。マンガンの挿入は、PPaのUV/Visスペ
クトルに対して劇的な効果を有し、Soret帯は2つの幅の広いピーク(375及び476nm)に***
し、Q-帯は極めて幅広になった。
化合物(10)中へのマンガンの挿入に、同様の合成方法論を適用して、そのUV/Visスペク
トルがSoret帯の***(373及び472nm)並びに最も遠いQ-帯の赤色シフト(690nm)及び幅広化
の双方を示す、水溶性誘導体(57)を得た。活性エステル誘導体(58)を合成し、20%MeOH/CH
Cl3を使用するシリカ上のクロマトグラフィーの後に、暗緑色個体として単離した。
生理食塩水緩衝液中の1mM溶液を、T1プロトコールを使用して4.7Tの小型MRI造影チャン
バー中で造影し、既知のMRI用造影剤、オムニスキャンと比較した。3種すべてが、MRIシ
グナルを与え、2種のPPa誘導体は、オムニスキャンに比べてより強いシグナルを示した(
図14)。
Figure 2015155442
標的を指向する抗体の利点は、それゆえ、費用対効果の高い単一の「見て処置する(see
and treat)」取組みの中で2つのモダリティを組み合わせた新たな二機能性薬剤、すなわ
ち、CA(造影剤)で増強されたMR造影及び標的指向化されたPDTのために使用できる単一薬
剤と組み合わせることができる。
ポルフィリンコア中へのMnのような常磁性金属の挿入は、場合によっては、PPa蛍光の
消光をもたらすことがある。この制約を克服するために、本発明者らは、ポルフィリン周
辺部に結合させた適切な配位子を使用して常磁性金属を錯体化した(スキーム18)。
このアプローチは、PPaのガドリウムGd(III)錯体、及びこれらの錯体を抗体へ複合する
能力の双方への拡大を可能にする。その7つの不対電子及び大きな常磁性モーメントを有
するガドリウム(III)イオンは、最も広範に使用される造影剤である。メソ-PPa(17)を、
本発明者らによって開発された2ステップ法を利用して、モノBoc保護ヘキシルジアミンで
エステル化し、暗緑色粉末(59)を高収率で得た。
これは、DCC又はDICなどの脱水剤の存在下に酸をNHSと反応させることによって、酸のN
-ヒドロキシスクシンイミド誘導体をインサイチュで事前形成することを含む。反応をTLC
で追跡し、すべての出発酸(17)が消費され、且つより高いRfを有するスポットが現れたら
、アミンを一度に添加し、室温での撹拌をさらに5時間継続すると、TLCで判定して反応は
完結していた。次いで、これをブロム化して、メソ5-ブロモ誘導体(60)を好収率で得た。
次のステップの直前に、TFAを使用してBoc基を除去して遊離アミンを得て、反応混合物
を蒸発させ、生じた粗製物質を無水DMF中でDTPAビス-無水物と共に撹拌して、ジエチレン
トリアミン五酢酸誘導体(61)を好収率で得た。DTPA部分は、種々のGd(III)キレートを形
成するために久しく使用されており、化合物(61)をピリジン及びメタノール中でGdCl3と
撹拌することによって、ガドリウム錯体(62)が得られた(スキーム18)。
Figure 2015155442
(合成の経路及び方法)
空気及び/又は水に敏感な化合物の取扱いは、標準的なシュレンク技術を使用して実施
した。DCM及びトリエチルアミンは、CaH2から蒸留することによって乾燥し、無水THFは、
ナトリウム/ベンゾフェノンからの蒸留によって得た。その他のすべての試薬は、特記し
ない限り、市販業者によって供給されるものを使用した。
分析薄層クロマトグラフィー(TLC)は、ガラスで裏打ちされたMerckシリカゲル60 GF254
プレート又はアルミニウムで裏打ちされた酸化アルミニウム(中性)上で実施され、可視化
は、必要な場合、UV光を使用して達成され、場合によっては化学染色剤を使用した。カラ
ムクロマトグラフィーは、加圧空気を使用し、シリカゲル60、又は5%の水で不活化された
酸化アルミニウム(中性又は塩基性)(BrockmannグレードIIIと呼ばれる)で実施した。溶媒
混合物を使用する場合、比率は容積で報告した。
NMRスペクトルは、Bruker DPX400(400MHz)を使用し、周囲温度のプローブ温度で記録し
た。化学シフトは、内部標準としてCDCl3(1H NMRの場合、7.26ppm)を使用し、パーツパー
ミリオン(ppm)として示し、カップリング定数(J)は、ヘルツ(Hz)で示す。UV/Visスペクト
ルは、Hewlett Packard8450ダイオードアレイ分光計で記録した。質量スペクトルは、い
くつかの技術を使用して実施し、分子イオン及び主要ピークのみ報告する。
(マンガン(III)-ピロフェオフォルビド-a(55))
PPa(50mg、0.0935ミリモル)の撹拌された氷酢酸(2mL)溶液に、氷酢酸(3mL)に溶解され
たMn(OAc)2・4H2O(110mg、0.468ミリモル)を添加し、反応混合物を60℃で2時間加熱する
と、UV/Vis分光法は、メタレーションの完結を示し、溶液の色は、澄明鮮緑色に変化した
。冷却後、反応混合物を、新鮮な酢酸を使用してコニカルフラスコ(100mL)に移送し、こ
れに大量のヘキサンを添加し、内容物を激しく振盪し、静置した後、ヘキサン層をデカン
ト分離した。この手順を4回繰り返すと、緑色オイル層は顆粒状になった。溶媒としてジ
エチルエーテルを使用して、この手順を3回繰り返した。双方の手順中に、酢酸の刺激臭
が徐々に消失した。得られた緑色固体に、DCM(100mL)を添加し、懸濁液を分液ロートに移
し、次いで、水を添加し、激しく振盪した。この手順を、固体の大部分が有機層中に溶解
するまで繰り返した。合わせた有機層を蒸発させて、暗緑色非晶性粉末を得た(46mg、76%
)。常磁性幅広化のため、NMR分光法を実施することができなかった。UV/Vis (THF) λmax
369, 472, 684, 439, 654, 621, 539。MS ES (m/z) 587 (M+-OAc, 100%)。
(マンガン(III)ピロフェオフォルビド-aスクシンイミドエステル(56))
マンガン(III)PPa(55)(6mg、0.0093ミリモル)の暗緑色無水THF(5mL)溶液に、N-ヒドロ
キシスクシンイミド(1.6mg、0.14ミリモル)、続いてDCC(3.83mg、0.187mミリモル)を添加
した。生じた混合物を、遮光してアルゴン下に室温で12時間撹拌した。TLC(シリカゲル、
20%MeOH/CHCl3)は、(55、Rf 0.31)と(56、Rf 0.25)との間にRfの僅かな相違を示した。反
応物を蒸発させて、暗緑色/褐色残留物を最小量のクロロホルムに溶解し、撹拌された大
量のヘキサン中に滴下すると、直ちに綿状沈殿物が生じた。これを沈降させ、ヘキサンの
大部分をデカントで分離し、新たなヘキサンで置き換え、15分間撹拌し、沈降させ、デカ
ントで分離し、これを全部で4回繰り返した。残っている緑色残留物を乾燥して、緑色個
体を得た(5mg、72%)。UV/Vis (THF) λmax 368, 472, 685, 438, 655, 621, 539。MS ES
(m/z) 684 (M+-OAc, 100%)。
(マンガン(III)-5-エチニルヘキシン酸ピロフェオフォルビドa-3,4,5-(トリエチレングリ
コールモノメチルエーテル)ベンジルエステル(57))
化合物(10)(9.5mg、0.0078ミリモル)の氷酢酸(2mL)溶液に、Mn(OAc)2・4H2O(9.5mg、0.
0039ミリモル)を添加し、生じた混合物を60℃でほぼ2時間加熱した。反応物の色は、暗紫
色から鮮緑色に変化し、これは、UV/Visスペクトルに対する劇的変化に関係する。反応物
を蒸発させて、残留物を20%MeOH/CHCl3で溶離する短いシリカカラムを通した。得られた
粘着性緑色残留物を、ヘキサンで繰り返し洗浄し、乾燥して緑色オイルを得た(8mg、79%)
。UV/Vis (MeOH) λmax 373, 690, 685, 472, 645, 587。MS ES (m/z) 1271 (M+-OAc, 10
0%)。
(マンガン(III)-5-エチニルヘキシノイルスクシンイミドエステルピロフェオフォルビドa
-3,4,5-(トリエチレングリコールモノメチルエーテル)ベンジルエステル(58))
化合物(57)(5.8mg、0.0043ミリモル)を無水DMF(0.5mL)に溶解し、N-ヒドロキシスクシ
ンイミド(1mg、0.0052ミリモル)及びDCC(1.4mg、0.0065ミリモル)を添加し、反応混合物
をアルゴン下に室温で一夜撹拌すると、この間に、若干の沈殿が観察された。反応混合物
を高度真空下で蒸発させて、THFで抽出される「くすんだ」緑色残留物を得た。これらの
抽出物を合わせ、蒸発させて、緑色の半固体を得た(2.9mg、47%)。UV/Vis(MeOH) λmax 3
71,693,685,471,646,587.
(実施例5)-化合物及び光免疫複合体の光毒性の生物学的試験
(方法)
(細胞培養)
2種の異なるヒト由来腫瘍細胞系:SKOV3及びKBを、欧州細胞バンク(European Collectio
n of Cell Cultures)(ECACC)から入手し、10%ウシ胎児血清、ペニシリン及びストレプト
マイシン抗生物質(1%)を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中で培養し、75cm2のフ
ラスコ中で70〜90%の集密で継代した。細胞を、加湿した5%CO2雰囲気中に37℃で維持した
。
(C6.5scFvの発現及び精製)
C6.5scFvは、J.Marks教授(カリフォルニア大学、San Francisco)からpUC119で入手し、
XL1ブルー細胞中で発現させた(Adamsらの文献、2000)。C6.5scFvは、抗体結合部位中のリ
シン-100を除去するように遺伝子操作された。このことは、低減された免疫反応性のPIC
を形成する可能性を低減するはずである(Adamsらの文献、2000)。培養物を上記のように
増殖させた。
C6.5の精製は、次のように実施した。100μg/mLのアンピシリンを含有する500mLの2TY
培地の培養物を30℃で増殖させ、0.7の光学密度(600nm)で、IPTGを添加することによって
1mMの最終濃度まで誘導した。C6.5scFvを、濾過された培養上清液から回収し、限外濾過
、濃縮し、PBS緩衝液に対して徹底的に透析した。粗タンパク質を、NiCl2を詰めたキレー
ト化セファロースカラムに適用した。カラムを、10mM〜60mMのイミダゾールで補足された
結合緩衝液中で洗浄し、純粋なscFvを、100mMイミダゾールを含む結合緩衝液中に溶離さ
せた。精製されたタンパク質を、25mLのスピンコンセントレーターを使用して1mg/mLタン
パク質まで濃縮し、10%グリセロール中、-80℃で貯蔵するか、或いは精製直後に濃縮しな
いでカップリングに使用した。
(scFv-光増感剤光-免疫複合体(PIC)の合成)
光増感剤のスクシンイミジルエステルを100%DMSO中に再懸濁し、6%のアセトニトリルを
含有するPBS中の52.8μM〜3.3μMの濃度のscFvに添加し、4℃で120分間撹拌を継続した。
次いで、光免疫複合体(PIC)を、緩衝液を2回変更してPBSに対して透析し、続いて遠心し
た。SDS-PAGE分析を実施し、クーマシーブルーで染色した。非染色ゲルを、セミドライブ
ロッティング装置(Biorad)を使用してニトロセルロース上に移行させ、徐々に乾燥した。
ブロット上の光増感剤を短波長のUV-トランスイルミネーターで励起することによって
、蛍光を可視化した。遊離及び複合された光増感剤の蛍光を使用して、非共有結合で拘束
された光増感剤のレベル(典型的には30〜50%)を測定した。670nmでの光増感剤の吸光度の
標準曲線を使用して、光-免疫複合体中の光増感剤含有量を測定した。これを使用して、
抗体に共有結合でカップリングされた光増感剤分子の数(典型的には、光増感剤:scFvは6
〜10:1)を測定した。
(インビトロでの細胞毒性)
細胞を、トリプシン処理し、96-ウェルプレート中にKBについては2×103細胞/ウェルで
、SKOV3については3×103細胞/ウェルで播種し、37℃、5%CO2でKBでは2夜、SKOV3では一
夜にわたってインキュベートした。次いで、細胞をフェノールレッド不含DMEM中で1回洗
浄し、適切に希釈された光増感剤溶液又は光-免疫複合体(DMEM、2%DMSO中)を該当するウ
ェルに、抑制照明下で添加した。対照ウェルにDMEM又はトリトンX-100(1%)を添加した。
暗所において37℃、5%CO2で2時間インキュベートした後、細胞をPBSで3回洗浄し、100μL
のDMEMを各ウェルに添加した。
ウェルを、0.5Wで使用されるHigh Powered-Devices 670nmレーザーからの光に10秒間曝
露した。対照には、光増感剤は添加されるが光に曝露されないウェル、又はDMEMが添加さ
れ光に曝露されるウェル、並びに光曝露のある又は曝露のないトリトンX-100(1%)を含め
た。光増感剤が添加されず、且つ光に曝露されない細胞を総合対照として含めた。細胞を
、暗所において37℃、5%CO2で48時間インキュベートした後、細胞タイターアッセイを、
製造業者の説明書に従って実施した。生存細胞によるテトラゾリウム化合物(MTS)の、490
nmでのその吸光度によって測定できるフォルマザン色素への転換を含むPromega Cell Tit
re-96装置を使用した。
(共焦点顕微鏡法による造影)
造影は、FILM Imperial College LondonにおいてLEICA SP5 MP反転共焦点顕微鏡で、CO
2補足雰囲気下に37℃で行った。すべての実験で水浸対物レンズ(63×)を使用した。画像
は、Leicaソフトウェア、Image J及びPowerpointを使用して処理した。
注意:細胞に対して光増感剤を使用するいずれの実験においても、実験は、細胞をできる
限り僅かな光に曝露する抑制照明下で行い、ホイルで包んでインキュベートした。細胞に
PSを添加した後に、細胞は、もはや顕微鏡で観察されなかった。
細胞を、洗浄(3×100μL培地)し、200μLのフェノールレッド不含DMEM(10%FBS、1%P/S)
中にチャンバーにつき25000細胞を播種し、一夜増殖させた(集密度が小さい(60〜70%)ほ
ど、細胞は造影実験用により良好に結合されることが見出された)。細胞をLabt-Tek(登録
商標)8 Chambered #1.0ホウケイ酸カバーガラス系上に播種した。一部の細胞系では、ウ
ェルを最初に被覆するために付着因子(200μL、30分、37℃)を使用することが、しばしば
有用である。
(光増感剤(PPa、PS1及びPS4)を使用する細胞染色)
光増感剤のフェノールレッド不含DMEM(10%FBS、1%P/S、0.5%DMSO)溶液を、新たに調製
し、15分間で37℃まで前以て温めた。細胞を、培地(1×200μL)で洗浄した後、溶液(チャ
ンバー当たり200μL)を添加した。特記しない限り、細胞を、加湿雰囲気(37℃、5%CO2)中
で20時間にわたって増殖させた。細胞を、前以て温めたフェノールレッド不含DMEM(2×20
0μL)で洗浄した。
(リソソームの染色)
Lysotracker(登録商標)Green DND-26を製造業者の説明書に従って希釈し(1mM原液)、DM
EM(10%FBS、1%P/S)中の作業濃度までさらに2回希釈した。単色染色に使用する場合、これ
を、DMEM(10%FBS、1%P/S)で1μMの最終濃度に希釈した。光増感剤との2色染色に使用する
場合、2μMの溶液を、光増感剤溶液で2回希釈し、1μMの最終濃度を得た。
細胞を、4℃で15分間、さらに37℃で30分間インキュベートした後、新たな培地で置き
換え、造影した。
(ミトコンドリアの染色)
MitoTracker(登録商標)Greenを製造業者の説明書に従って希釈し(1mM原液)、DMEM(10%F
BS、1%P/S)中の作業濃度までさらに2回希釈した。単色染色に使用する場合、これを、DME
M(10%FBS、1%P/S)で1μMの最終濃度に希釈した。光増感剤との2色染色に使用する場合、2
μMの溶液を、光増感剤溶液で2回希釈し、1μMの最終濃度を得た。
細胞を、4℃で15分間、さらに37℃で1時間インキュベートした後、新たな培地で置き換
え、造影した。
(小胞体の染色)
ER-Tracker(商標)Dreen (BODIPY(登録商標)FLグリベンクラミド)を製造業社の説明に従
って希釈し(1mM原液)、HBSS緩衝液(+2%HEPES)中の作業濃度までさらに2回希釈した。単色
染色に使用する場合、これを、HBSS(2%HEPES)で3μMの最終濃度に希釈した。光増感剤と
の2色染色に使用する場合、6μM溶液を、光増感剤溶液で2回希釈し、3μMの最終濃度を得
た。
細胞を、4℃で15分、さらに37℃で1時間インキュベートした後、新たな緩衝液で置き換
え、造影した。
(ゴルジ装置の染色)
BSAに複合化されたBodipy(登録商標)FL C5-セラミドを、製造業者の説明書に従って希
釈し(0.5mM原液)、HBSS緩衝液(+2%HEPES)中の作業濃度までさらに2回希釈した。単色染色
に使用する場合、これを、HBSS(2%HEPES)で5μMの最終濃度に希釈した。それを光増感剤
との2色染色に使用する場合、10μM溶液を、光増感剤溶液で2回希釈し、5μMの最終濃度
を得た。細胞を、4℃で15分、さらに37℃で30分間インキュベートした後、冷たいHBSS/HE
PES(3×100μL)で洗浄し、HBSS/HEPES又は光増感剤溶液で置き換え、37℃でさらに30分間
インキュベートした後、新たな緩衝液で置き換え、造影した。
(新規PPa-誘導体のMR-特性)
基本的なMRI実験は、サンプルのT1緩和測定から構成した。本発明者らは、断熱反転パ
ルスを用いる反転回復パルスシーケンスを使用した。T1緩和度を、標準(水中のオムニス
キャンなど)及びサンプル濃縮物と比較した。化合物(56)及び(58)のscFv複合体を上記の
ように調製し、双方の免疫複合体のUV/Visスペクトル(図25)において、280nmのタンパク
質の吸収及びポルフィリンの特徴的な吸収プロファイルの双方を観察できる。Mn複合体(5
6)は、対応するMn(58)複合体に比べて緩衝液に対する溶解性がより小さく、PPaへのトリP
EG基の付加がより水溶性の光増感剤をもたらすという事実を反映している。C6-Mn(56)免
疫複合体のゲルは、透析前に35kD付近の帯として複合体の存在を明確に示しでいる(図26)
。
Figure 2015155442
(結果)
(腫瘍細胞系に対するPPa及び新規PPa-誘導体の細胞光毒性)
PPaは、培養中に増殖されたSKOV3及びKB腫瘍細胞系に対して、用量に依存した方式で光
毒性がある(図15)。2つの水溶性PPa誘導体の例、PPa-PEG1(化合物11)(図16)及びカチオン
性PPa(化合物31C)(図17)も、SKOV3及びKB細胞系に対して、異なる有効性で、単独の光増
感剤として光毒性がある。このことは、物理化学的特性を修飾することが、細胞死滅機能
の喪失につながらないことを示している。表4に、それらのIC50を示す。化合物(11)は、P
Paに比べてより強力である。
Figure 2015155442
(抗体で標的指向化された化合物-11の光増感剤の腫瘍細胞系に対する細胞光毒性)
化合物(11)を、細胞を標的にすることのできる光免疫複合体としてさらに試験した。抗
HER2scFv、C6.5(Adamsらの文献、2007)を発現させ、Bhattiら(2007)の方法中に記載のよ
うに精製し、該方法に記載のように(11)に複合させた。結果を図18に示す。(11)は、HER2
の標的指向性のためSKOV3腫瘍細胞に対して、ほぼ3倍より強力であることが観察された(I
C50は1.1μMから0.3μMに改善された)。HER2で標的指向化されたPPa(Bhattiら、2007)のI
C50は、7mM付近であった。したがって、PPaの標的指向化された溶性誘導体は、標的指向
化されたPPaに比べてより強力であり、この例では、20倍を超えてより強力であった。
(SKOV3腫瘍細胞系におけるPPa及び新規PPa-誘導体の細胞内局在性)
((a)PPaの物理化学的特性の改変は細胞内標的指向性及び光増感剤の局在性を変えること
ができる)
多くの親油性光増感剤と同様、PPaは、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体などの膜に
富む細胞小器官中に集まり、より水性の小胞であるリソソーム中にはより少ない程度まで
集まる(Macdonaldらの文献、1999)。文献は、膜-小胞へ、とりわけミトコンドリア及び小
胞体(ER)への局在性は、これらの細胞小器官が反応性酸素種による傷害及びそれに続く細
胞死により敏感であるので、より強力なPDT機能につながることを示唆している(参考文献
108、111及び107)。図19は、2種の例(11)及び(31C)に比較してPPaの局在性を示す。光増
感剤の固有の蛍光を追跡している。PPa及び(11)は、強い染色のポケットを伴う拡散性細
胞内染色によって示されるように、類似の膜に富む細胞小器官への局在性を示す。正に帯
電される(31C)は、エンドソーム(水性区画)への局在性を指摘する、より強調性の染色パ
ターンを有する。
((b)PPaの物理化学的特性の改変は、光増感剤のゴルジ体への局在性/標的指向性を変える
ことができる)
ゴルジ小胞ネットワークは、膜に富み、多くの動的セグメントを含有する。光増感剤の
局在性をその固有の蛍光を測定することによって追跡した(図20中で赤色として観察され
る)。同時に、ボディピーセラミド色素を使用して腫瘍細胞を対比染色した。この色素は
、ゴルジ細胞小器官に対する確立されたマーカーであり、図20中で緑色として観察される
。共局在の研究は、PPa及び(11)に対してかなりの黄色染色を示し、ゴルジ体への局在性
を示し、一方、正に帯電される(31C)は、極めて少ない黄色染色を示し、ゴルジ網への極
めて低い局在性を示している(図20)。
((c)PPaの物理化学的特性の改変は、光増感剤のミトコンドリアへの局在性/標的指向性を
変えることができる)
ミトコンドリア細胞小器官は、高度に膜に富む構成要素であり、しばしば固有の経路を
介する細胞アポトーシスのための開始中枢と見なされる。光増感剤の局在性をその固有の
蛍光を測定することによって追跡した(図21中で赤色として観察される)。同時に、ミトト
ラッカー色素を使用して腫瘍細胞を対比染色した。この色素は、ミトコンドリア細胞小器
官に対する確立されたマーカーであり、図21中で緑色として観察される。共局在の研究は
、PPa及び(11)に対してかなりの黄色染色を示し、かなりのミトコンドリアへの局在性を
示し、一方、正に帯電される(31C)は、極めて少ない黄色染色を示し、ミトコンドリアへ
の極めて低い局在性を示している(図21)。
((d)PPaの物理化学的特性の改変は、光増感剤のリソソームへの局在性/標的指向性を変え
ることができる)
リソソーム細胞小器官は、膜に乏しいに細胞構成要素であり、タンパク質分解のための
水性区画を含有する。光増感剤の局在性をその固有の蛍光を測定することによって追跡し
た(図22中で赤色として観察される)。同時に、リソトラッカー色素を使用して腫瘍細胞を
対比染色した。この色素は、リソソーム細胞小器官に対する確立されたマーカーであり、
図22中で緑色として観察される。
共局在の研究は、(31C)に対してかなりの黄色染色を示し、かなりのリソソームへの局
在性を示した。このことは、極めて溶性の帯電した光増感剤に対して予想されていた。よ
り少ない程度まで、中性であるがより水溶性の(11)光増感剤は、若干の黄色染色を示し、
やはり、リソソームへの局在性を示した(図22)。PPaは極めて親油性であり、僅かな黄色
染色を示し、僅かなリソソームへの局在性を示している(図22)。
((e)PPaの物理化学的特性の改変は、光増感剤の小胞体への局在性/標的指向性を変えるこ
とができる)
小胞体(ER)細胞小器官ネットワークは、高度に膜に富む構成要素である。光増感剤の局
在性をその固有の蛍光を測定することによって追跡した(図23中で赤色として観察される)
。同時に、ERトラッカー色素を使用して腫瘍細胞を対比染色した。この色素は、ER細胞小
器官に対する確立されたマーカーであり、図23中で緑色として観察される。
共局在の研究は、(11)に対してかなりの黄色染色を示し、かなりのERへの局在性を示し
、一方、正に帯電される(31C)は、黄色染色を示さず、ERへの局在性を示していない(図23
)。
(光増感剤の溶解性の増加は皮膚光感受性の低減につながる)
皮膚光感受性は、PDTにおいて解決すべき重要問題である。フォスキャンなどの確立さ
れた化合物は、かなりの皮膚光感受性を示す(参考文献109)。マウスモデルにおいて、フ
ォスキャンを臨床用量で投与し、化合物11、及び化合物11の光免疫複合体と比較した(参
考文献109)。皮膚光感受性を、尺度1〜4に従って観察することによって4日間にわたって
監視した(図24)。フォスキャンは、かなりの皮膚光感受性を引き起こすことが観察され、
一方、(11)及びその複合体は、ほとんど又は全く皮膚感受性を示さなかった(図24)。この
結果は、本発明者らによるPPa新規誘導体は、改善された前臨床特性を有することを示唆
している。
(参考文献)
Figure 2015155442
Figure 2015155442
Figure 2015155442
Figure 2015155442
Figure 2015155442
Figure 2015155442
Figure 2015155442
Figure 2015155442
Figure 2015155442
第1態様において、本発明は、式Iの化合物、或いは医薬として許容し得るその塩若しく
は溶媒和物、又は医薬として機能性のあるその誘導体を提供する。
Figure 2015155442
 式中、
bが二重結合を表す場合、Dは、-CH2-又はQを表し、Ra及びRbは双方とも存在せず;
bが単結合を表す場合、Dは、-C(O)-、-CH2-又はQを表し、Ra及びRbは、双方ともHであ
るか、又は双方とも-OHであり;
R1が、H、或いはカルボキシル、ヒドロキシル、アミノ又はチオール基と反応すること
ができる官能基を含有する部分を表す場合、R2は、H又は可溶化基を表すか;或いは
R1がH又は可溶化基を表す場合、R2は、H、或いはカルボキシル、ヒドロキシル、アミノ
又はチオール基と反応することができる官能基を含有する部分を表し;
Gは、O又は直接結合を表し;
Qは、式Ig又はIhの構造フラグメントを表す。
Figure 2015155442

Claims (72)

  1. 式Iの化合物、或いは医薬として許容し得るその塩若しくは溶媒和物、又は医薬として
    の機能を有するその誘導体
    Figure 2015155442
     (式中、
    bが二重結合を表す場合、Dは、-CH2-又はQを表し、Ra及びRbは双方とも存在せず;
    bが単結合を表す場合、Dは、-C(O)-、-CH2-又はQを表し、Ra及びRbは、双方ともHであ
    るか、又は双方とも-OHであり;
    R1が、H、或いはカルボキシル、ヒドロキシル、アミノ又はチオール基と反応すること
    ができる官能基を含有する部分を表す場合、
    R2は、H又は可溶化基を表すか;或いは
    R1が、H又は可溶化基を表す場合、
    R2は、H、或いはカルボキシル、ヒドロキシル、アミノ又はチオール基と反応すること
    ができる官能基を含有する部分を表し;
    Gは、O又は直接結合を表し;
    Qは、式Ig又はIhの構造フラグメントを表す)
    Figure 2015155442
     。
  2. R1がH、或いはカルボキシル、ヒドロキシル、アミノ又はチオール基と反応することが
    できる官能基を含有する部分を表し、且つR2がH又は可溶化基を表す、請求項1記載の化合
    物。
  3. R1が、H、-(CH2)t-X、-(CH2)u-C(R3)=C(R4)-(CH2)v-X、又は-(CH2)w-C≡C-(CH2)x-Xを
    表し;
    tが、1〜20を表し;
    uとvとの和が、2〜6であり;
    wとxとの和が、2〜15であり;
    Xが、-C(O)-L1、-OH、スルホニルエステル、-NO2、-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハ
    ロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキ
    シスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードア
    セトアミジル、マレイミジル、アリール、又はヘテロアリール(後の2つの基は、-C(O)-L1
    、-OH、スルホニルエステル、-NO2、-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミ
    ジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジ
    ルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、及
    びマレイミジルから選択される1つ以上の基で置換されている)を表し;
    L1が、-OH、又は適切な脱離基を表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化
    されるカルボン酸官能基を表し;
    R2が、H、1つ以上の-C(O)O-E+基、-SO3 -E+基、第4級アンモニウム塩、ピリジニウムイ
    オン又は直鎖若しくは分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若し
    くはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100である)で独立に置換されたアルキル、シクロ
    アルキル、アルキレニル、アルキニル、アリール、ベンジル、ヘテロアリール(ここで、
    後の3つの基は、-OH、-NH2、又は1つ以上のハロ原子で置換されたC1〜C6アルキルから選
    択される1つ以上の基で置換されていてもよい)を表すか、
    或いはR2が、-NR6(R7)又は-N(R6a)-(CH2)z-SO3 -E+を表し;
    R3〜R5及びR3aが、独立に、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていて
    もよいC1〜C6アルキルを表し;
    R6及びR7が、R6及びR7の少なくとも一方はHでないとの条件で、独立に、H、アルキニル
    、ピリジニウムイオン、-(CH2)z-NR8(R9)、又は-(CH2)z-N+R8(R9)(R10)A-を表し;
    R6aが、H、又は-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6
    アルキルを表し;
    zが、1〜20を表し;
    R8〜R10が、独立に、H、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよ
    いアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、又はヘテロアリールを表し;
    E+が、適切なカチオン基を表し;
    A-が、適切なアニオン基を表す、請求項1又2記載の化合物。
  4. R1が、-(CH2)u-C(R3)=C(R4)-(CH2)v-X又は-(CH2)w-C≡C-(CH2)x-Xを表し;
    wとxとの和が2〜10であり;
    Xが、-C(O)-L1、-OH、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシス
    クシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフ
    ェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、マレイミジル、アリール、
    又はヘテロアリール(後の2つの基は、-C(O)-L1、-OH、スルホニルエステル、-NO2、-CHO
    、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジル
    エステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル
    、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、及びマレイミジルから選択される1つ以上
    の基で置換されている)を表し;
    L1が、-OH又は-O-C(O)-R5を表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化され
    るカルボン酸官能基を表し;
    R2が、1つ以上の直鎖若しくは分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここで、
    オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100である)で独立に置換されたアルキ
    ル、シクロアルキル、アルキレニル、アルキニル、アリール、ベンジル、ヘテロアリール
    (ここで、後の3つの基は、-OH、-NH2、又は1つ以上のハロ原子で置換されたC1〜C6アルキ
    ルから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)を表すか、
    或いはR2が、-NR6(R7)又はN(R6a)-(CH2)z-SO3 -E+を表し;
    R6及びR7が、R6及びR7の少なくとも一方がHでないとの条件で、独立に、-(CH2)z-NR8(R
    9)又は-(CH2)z-N+R8(R9)(R10)A-を表し;
    R6aが、H、又は-OH若しくはハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1
    〜C3アルキルを表し;
    zが、1〜10を表し;
    R8〜R10が、独立に、H、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよ
    いアルキル又はアルケニルを表し;
    A-が、I-、Cl-、Br-を表す、請求項1〜3のいずれか一項記載の化合物。
  5. R1が、-(CH2)wC≡C-(CH2)x-Xを表し;
    wとxとの和が2〜10であり;
    Xが、-C(O)-L1、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スル
    ホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシア
    ナト、ヨードアセトアミジル、又はマレイミジルを表し;
    L1が、-OHを表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官
    能基を表し;
    R2が、1つ以上の直鎖若しくは分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここで、
    オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100である)で独立に置換されたアリー
    ル、ベンジル、ヘテロアリール(ここで、後の3つの基は、-OH、-NH2、又は1つ以上のハロ
    原子で置換されたC1〜C6アルキルから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)を
    表すか、
    或いはR2が、-NR6(R7)又は-N(R6a)-(CH2)z-SO3 -E+を表し;
    R6及びR7が、R6及びR7の少なくとも一方がHではないとの条件で、独立に、-(CH2)z-NR8
    (R9)又は-(CH2)z-N+R8(R9)(R10)A-を表し;
    R6aが、Hを表し;
    zが、1〜10を表し;
    R8〜R10が、独立に、H、又は-OH若しくはハロから選択される1つ以上の基で置換されて
    いてもよいアルキルを表し;
    A-が、I-、Cl-、Br-を表す、請求項1〜4のいずれか一項記載の化合物。
  6. R1が、-(CH2)w-C≡C-(CH2)x-Xを表し;
    wとxとの和が2〜10であり;
    Xが、-C(O)-L1、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スル
    ホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシア
    ナト、ヨードアセトアミジル、又はマレイミジルを表し;
    L1が、-OHを表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官
    能基を表し;
    R2が、1つ以上の直鎖若しくは分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここで、
    オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100である)で独立に置換されたアリー
    ル、ベンジル、ヘテロアリール(ここで、後の3つの基は、-OH、-NH2、又は1つ以上のハロ
    原子で置換されたC1〜C6アルキルから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)を
    表す、請求項1〜5のいずれか一項記載の化合物。
  7. R1が、-(CH2)w-C≡C-(CH2)x-Xを表し;
    wとxとの和が2〜10であり;
    Xが、-C(O)-L1、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スル
    ホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシア
    ナト、ヨードアセトアミジル、又はマレイミジルを表し;
    L1が、-OHを表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官
    能基を表し;
    R2が、-NR6(R7)を表し;
    R6及びR7が、R6及びR7の少なくとも一方がHではないとの条件で、独立に、-(CH2)z-NR8
    (R9)又は-(CH2)z-N+R8(R9)(R10)A-を表し;
    zが、1〜10を表し;
    R8〜R10が、独立に、H、又は-OH若しくはハロから選択される1つ以上の基で置換されて
    いてもよいアルキルを表し;
    A-が、I-、Cl-、Br-を表す、請求項1〜6のいずれか一項記載の化合物。
  8. R1が可溶化基を表し、且つR2が、カルボキシル、ヒドロキシル、アミノ又はチオール基
    と反応することができる官能基を含有する部分を表す、請求項1記載の化合物。
  9. R1が、式Ia、Ib、Ic、Id、Ie、Ifの構造フラグメント
    Figure 2015155442
     (ここで、破線は、分子の残部に対する結合点を示す)を表すか、或いは
    R1が、-(CH2)t-Z、-(CH2)u-C(R3)=C(R4)-(CH2)v-Z、又は-(CH2)w-C≡C-(CH2)x-Zを表し
    、
    R11が、H、アルキル(-OH、ハロ、及び直鎖若しくは分枝エチレンオキシ基(ここで、オ
    リゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100である)から選択される1つ以上の基
    で置換されていてもよい)、又は直鎖若しくは分枝エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若し
    くはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100である)を表し;
    R12〜R14が、独立に、H、又は-OH、ハロ及び直鎖若しくは分枝エチレンオキシ基(ここ
    で、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100である)から選択される1つ以
    上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表し;
    Y-が、任意の適切なアニオン基を表し;
    tが、1〜20を表し;
    uとvとの和が、2〜6であり;
    wとxとの和が、2〜15であり;
    Zが、-C(O)O-E+、-SO3 -E+、第4級アンモニウム塩、式Ia〜Ifの構造フラグメントを表す
    か、或いはZが、1つ以上の-C(O)O-E+基、-SO3 -E+基、第4級アンモニウム塩、ピリジニウ
    ムイオン、又は直鎖若しくは分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここでオリゴ
    若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100である)で置換されたアリール、ベンジル
    、ヘテロアリール(ここで、後の3つの基は、-OH、-NH2、又は1つ以上のハロ原子で置換さ
    れているC1〜C6アルキルから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)を表し;
    E+が、任意の適切なものを表し;
    R2が、-C(O)-L3、-OH、スルホニルエステル、-NO2、-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハ
    ロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキ
    シスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードア
    セトアミジル、マレイミジル、アリール、又はヘテロアリール(後の2つの基は、-C(O)-L1
    、-OH、スルホニルエステル、-NO2、-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミ
    ジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジ
    ルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル及び
    マレイミジルから選択される1つ以上の基で置換されている)を表し;
    L3が、-OH又は適切な脱離基を表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化さ
    れるカルボン酸官能基を表し;且つ
    R15が、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキ
    ルを表す、請求項1又8記載の化合物。
  10. R1が、先に定義した通りの式Ia、Ib、Ic、Id、Ie、Ifの構造フラグメントを表し;
    R11が、H、アルキル(-OH、ハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)、
    又は直鎖若しくは分枝エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基
    の総数は2〜100である)を表し;
    R12〜R14が、独立に、H、又は-OH、ハロ及び直鎖若しくは分枝エチレンオキシ基(ここ
    で、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100である)から選択される1つ以
    上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表し;
    Y-が、I-、Br-、又はCl-を表し;
    R2が、-C(O)-L3、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スル
    ホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシア
    ナト、ヨードアセトアミジル、又はマレイミジルを表し;
    L3が、-OH又は-O-C(O)-R15、ハロ、1-オキシベンゾトリアゾイルなどの活性化されたエ
    ステル、又はニトロ、フルオロ、クロロ、シアノ及びトリフルオロメチルから選択される
    1つ以上の置換基で置換されていてもよいアリールオキシ基を表すか、
    或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官能基を表し;
    R15が、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキ
    ルを表す、請求項1、8又は9のいずれか一項記載の化合物。
  11. R1が、先に定義した通りの式Ia、Ib、Ic、Id、Ie、Ifの構造フラグメンを表し;
    R11が、アルキル、又は直鎖若しくは分枝エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポ
    リ-エチレンオキシ基の総数は約3〜約20である)を表し;
    R12〜R14が、独立に、H、又は-OH、ハロ及び直鎖若しくは分枝エチレンオキシ基(ここ
    で、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は約3〜約20である)から選択される1つ
    以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表し;
    Y-が、I-、Br-、又はCl-を表し;
    R2が、-C(O)-L3、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スル
    ホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシア
    ナト、ヨードアセトアミジル、又はマレイミジルを表し;
    L3が、-OH又は-O-C(O)-R15を表すか、
    或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官能基を表し;
    R15が、-OHから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表す
    、請求項1、又は8〜10のいずれか一項記載の化合物。
  12. 式IB〜IGの化合物:
    Figure 2015155442
    Figure 2015155442
    Figure 2015155442
    (式中、E-は適切なアニオン基を表す)から選択される、請求項1記載の化合物。
  13. bが、二重結合を表し、且つDが-CH2-を表すか;或いは
    bが、単結合を表し、且つDが-C(O)-又は-CH2-を表す、請求項1〜10のいずれか一項記載
    の化合物。
  14. bが、単結合を表し、且つDが-C(O)-又は-CH2-を表し;
    立体化学が、下式IA:
    Figure 2015155442
     (式中、R1及びR2は、先に定義された通りである)中で定義される通りである、請求項1〜1
    0及び13のいずれか一項記載の化合物。
  15. 式IIの化合物:
    Figure 2015155442
     (式中、
    D、b、R1、R2、G、Ra及びRbは、請求項1〜10のいずれか一項中で定義された通りであり
    ;
    Mは、Zn(II)、Fe(II)、Ga(II)、Co(II)、Cu(II)、Mn(II)、Ni(II)、Ru(II)、Al(II)、P
    t(II)又はPd(II)を表す)。
  16. 抗体或いはそのフラグメント又は誘導体にカップリングされた請求項1〜15のいずれか
    一項記載の化合物を含む、光増感物質を含む化合物。
  17. 担体分子にカップリングされた請求項1〜15のいずれか一項記載の式Iの化合物を含む光
    増感物質を含む化合物の製造方法であって、
    (i)式Iの化合物を含む光増感物質を提供する工程;
    (ii)担体分子を提供する工程;
    (iii)光増感物質と担体分子とを第1及び第2の極性非プロトン性溶媒及び水性緩衝液の存
    在下で複合する工程;を含む、前記製造方法。
  18. 前記化合物が、少なくとも3:1である式Iの化合物の担体分子に対する比率を含む、請求
    項17記載の製造方法。
  19. 前記化合物が、5:1〜40:1である式Iの化合物の担体分子に対する比率を含む、請求項18
    記載の製造方法。
  20. 前記光増感物質及び担体分子の機能的及び物理的特性が、カップリングの後に実質的に
    不変である、請求項17〜19のいずれか一項記載の製造方法。
  21. 前記第1及び第2の極性非プロトン性溶媒が、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトニト
    リル、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、HMPA、ジオキサン、テトラヒドロフラン(THF)、
    二硫化炭素、グライム及びジグライム、2-ブタノン(MEK)、スルホラン、ニトロメタン、N
    -メチルピロリドン、ピリジン、並びにアセトンからなる群から選択される、請求項17〜2
    0のいずれか一項記載の製造方法。
  22. 前記第1及び第2の極性非プロトン性溶媒が、DMSO、DMF、及びアセトニトリルからなる
    群から選択される、請求項21記載の製造方法。
  23. 前記第1及び第2の非プロトン性溶媒が、DMSO及びアセトニトリルである、請求項22記載
    の製造方法。
  24. 水性緩衝液と第1非プロトン性溶媒と第2非プロトン性溶媒との比率が、ほぼ50%:1〜49%
    :49〜1%である、請求項17〜23のいずれか一項記載の製造方法。
  25. 前記比率が、92%PBS:2%DMSO:6%アセトニトリルである、請求項24記載の製造方法。
  26. 光増感物質と担体分子とを複合する前記工程が、0℃〜30℃の温度で実施される、請求
    項17〜25のいずれか一項記載の製造方法。
  27. 前記温度が、0℃〜25℃である、請求項26記載の製造方法。
  28. 前記温度が、0℃〜5℃である、請求項27記載の製造方法。
  29. 光増感物質と担体分子とを複合する前記工程が、ほぼ30分間実施される、請求項17〜28
    のいずれか一項記載の製造方法。
  30. 前記担体分子が、抗体、そのフラグメント及び/又は誘導体である、請求項17〜28のい
    ずれか一項記載の製造方法。
  31. 前記抗体フラグメント及び/又は誘導体が、単鎖抗体である、請求項30記載の製造方法
    。
  32. 前記単鎖抗体が、scFvである、請求項31記載の製造方法。
  33. 前記抗体、そのフラグメント及び/又は誘導体が、ヒト化されているか、又はヒトのも
    のである、請求項30〜32のいずれか一項記載の製造方法。
  34. 光増感物質と担体分子とを複合する前記工程が、250μg/mL〜10mg/mLの担体分子の濃度
    で実施される、請求項17〜33のいずれか一項記載の製造方法。
  35. 担体分子の前記濃度が、1mg/mL〜10mg/mLである、請求項34記載の製造方法。
  36. 担体分子の前記濃度が、約5mg/mLである、請求項35記載の製造方法。
  37. 工程(iii)の後に実施される下記工程：
    (iv)担体分子に、光増感物質の機能を調節する能力を有する調節性物質をカップリングさ
    せる工程
    をさらに含む、請求項17〜36のいずれか一項記載の製造方法。
  38. 前記調節性物質が、安息香酸、アジド基を含有する安息香酸、4-アジドテトラフルオロ
    フェニル安息香酸、アジド部分を有する芳香族基を含有する安息香酸、アジド部分を有す
    るヘテロ芳香族基を含有する安息香酸、ビタミンE類似体、トロロクス、ブチルヒドロキ
    シルトルエン、没食子酸プロピル、デオキシコール酸、ウルサデオキシコール酸からなる
    群から選択される、請求項38記載の方法。
  39. 前記芳香族基又はヘテロ芳香族基が、ポリフルオロベンゼン、ナフタリン、ナフタキノ
    ン、アントラセン、アントラキノン、フェナントレン、テトラセン、ナフタセンジオン、
    ピリジン、キノリン、イソキノリン、インドール、イソインドール、ピロール、イミダゾ
    ール、ピラゾール、ピラジン、ベンズイミダゾール、ベンゾフラン、ジベンゾフラン、カ
    ルバゾール、アクリジン、アクリドン、フェナントリジン、キサンチン、キサントン、フ
    ラボン、クマリン、及びそれらのスルフェネートからなる群から選択される、請求項38記
    載の方法。
  40. 工程(iii)又は(iv)の後に実施される下記工程：
    (v)前記化合物を医薬として許容し得る担体と合わせて医薬製剤を形成する工程
    をさらに含む、請求項17〜39のいずれか一項記載の製造方法。
  41. 前記担体分子にカップリングされた光増感物質間の距離が、3.5オングストローム〜25n
    mである、請求項17〜40のいずれか一項記載の製造方法。
  42. 前記担体分子にカップリングされた光増感物質間の距離が、20〜25nmである、請求項41
    記載の製造方法。
  43. 工程(v)の前に実施される、可視化剤を前記担体分子、光増感物質、又はそれらの複合
    体にカップリングさせる工程をさらに含む、請求項17〜42のいずれか一項記載の製造方法
    。
  44. 前記可視化剤が、蛍光色素又は発光色素である、請求項43記載の製造方法。
  45. 前記可視化剤が、MRI用造影剤である、請求項43記載の製造方法。
  46. 請求項16〜44のいずれか一項記載の方法によって得ることのできる化合物。
  47. 前記光増感物質が、担体分子に少なくとも3:1のカップリング比率でカップリングされ
    る、請求項46記載の化合物。
  48. 前記光増感物質及び担体分子の機能的及び物理的特性が、非カップリング形態の場合の
    特性に比較して、カップリングした形態において実質的に不変である、請求項46又は47記
    載の化合物。
  49. 前記担体分子が、抗体、そのフラグメント及び/又は誘導体、或いは非免疫原性ペプチ
    ドリガンドからなる群から選択される、請求項46〜48のいずれか一項記載の化合物。
  50. 前記抗体、そのフラグメント及び/又は誘導体が、単鎖抗体フラグメントである、請求
    項49記載の化合物。
  51. 前記単鎖抗体が、scFvである、請求項50記載の化合物。
  52. 前記抗体、そのフラグメント及び/又は誘導体が、ヒト化されているか、又はヒトのも
    のである、請求項49〜51のいずれか一項記載の化合物。
  53. 前記光増感物質が、担体分子に、該担体分子上のアミノ酸残基又は糖分子の位置でカッ
    プリングされる、請求項46〜52のいずれか一項記載の化合物。
  54. 前記アミノ酸残基が、リシン、システイン、チロシン、セリン、グルタミン酸、アスパ
    ラギン酸、及びアルギニンからなる群から選択される、請求項53記載の化合物。
  55. 前記糖分子が、ヒドロキシル基を含む糖、アルデヒド基を含む糖、アミノ基を含む糖、
    カルボン酸基を含む糖からなる群から選択される、請求項53記載の化合物。
  56. 前記担体分子にカップリングされた光増感物質間の距離が、3.5オングストローム〜25n
    mである、請求項46〜55のいずれか一項記載の化合物。
  57. 前記担体分子にカップリングされた光増感物質間の距離が、20〜25nmである、請求項55
    記載の化合物。
  58. 前記光増感物質の機能を調節する能力を有する調節性物質をさらに含む、請求項46〜57
    のいずれか一項記載の化合物。
  59. 前記調節性物質が、安息香酸、アジド基を含有する安息香酸、4-アジドテトラフルオロ
    フェニル安息香酸、アジド部分を有する芳香族基を含有する安息香酸、アジド部分を有す
    るヘテロ芳香族基を含有する安息香酸、ビタミンE類似体、トロロクス、ブチルヒドロキ
    シルトルエン、没食子酸プロピル、デオキシコール酸、ウルサデオキシコール酸からなる
    群から選択される、請求項58記載の化合物。
  60. 前記芳香族基又はヘテロ芳香族基が、ポリフルオロベンゼン、ナフタリン、ナフタキノ
    ン、アントラセン、アントラキノン、フェナントレン、テトラセン、ナフタセンジオン、
    ピリジン、キノリン、イソキノリン、インドール、イソインドール、ピロール、イミダゾ
    ール、ピラゾール、ピラジン、ベンズイミダゾール、ベンゾフラン、ジベンゾフラン、カ
    ルバゾール、アクリジン、アクリドン、フェナントリジン、キサンチン、キサントン、フ
    ラボン、クマリン、及びそれらのスルフェネートからなる群から選択される、請求項59記
    載の化合物。
  61. さらに、可視化剤を含む、請求項46〜60のいずれか一項記載の化合物。
  62. 前記可視化剤が、蛍光色素又は発光色素である、請求項61記載の化合物。
  63. 前記可視化剤が、MRI用造影剤である、請求項61記載の化合物。
  64. 前記担体分子がscFvであり、且つ前記光増感物質が、請求項1〜15のいずれか一項記載
    の化合物から選択される、請求項26〜44のいずれか一項記載の化合物。
  65. 標的細胞の破壊を必要とする疾患の診断及び/又は治療及び/又は予防における、請求項
    16又46〜64のいずれか一項記載の化合物の使用。
  66. 標的細胞の破壊を必要とする疾患の診断及び/又は治療及び/又は予防のための薬剤の製
    造における、請求項16又は46〜64のいずれか一項記載の化合物の使用。
  67. 標的細胞の破壊を必要とする疾患の診断及び/又は治療及び/又は予防で使用するための
    、請求項16又は46〜64のいずれか一項記載の化合物。
  68. 治療すべき前記疾患が、がん、加齢性黄斑変性症、免疫障害、心血管疾患、及びウイル
    ス、細菌又は真菌感染症を含む微生物感染症、BSEなどのプリオン病、並びに歯肉炎など
    の口腔/歯科疾患からなる群から選択される、請求項65〜67のいずれか一項記載の使用又
    は化合物。
  69. 治療すべき前記疾患が、結腸、肺、***、頭頸部、脳、舌、口腔、前立腺、精巣、胃/
    消化管、膀胱のがん、並びにバレット食道などの前がん病変である、請求項68記載の使用
    又は化合物。
  70. 疾患の診断が、光増感物質又は任意選択の可視化剤の可視化によって実施される、請求
    項65〜69のいずれか一項記載の使用又は化合物。
  71. 前記化合物が、光線曝露に先立って患者に投与される、請求項65〜70のいずれか一項記
    載の使用又は化合物。
  72. 請求項1〜15、又は46〜64のいずれか一項記載の化合物、及び医薬として許容し得る担
    体、賦形剤又は希釈剤を含む医薬組成物。
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