JP2012520862A - 化合物及び生物学的材料並びにそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
光線力学療法(PDT)は、疾患細胞及び疾患組織を除去する必要のある一連の状態に対する最も侵襲性が低い治療である[6、34、35]。電離放射線とは異なり、この療法は、同一部位に繰り返し投与することができる。化学療法、放射線療法又は手術などの従来のモダリティの使用がPDTの使用を妨げることはなく、その逆も同様なので、がん治療におけるPDTの使用は魅力的である。PDTはまた、特定の細胞集団を破壊しなければならないその他の用途、血管(加齢性黄斑変性症(AMD[36])又はがんにおける)、免疫障害[37]、心血管疾患[38]、及び微生物感染症[39、40]の治療などを見出しつつある。
本発明は、PPaの一連の新規誘導体を開示する。これらの疎水性光増感剤は、改善された水溶性、薬物効力、及びタンパク質/ペプチドへの改善された複合化のために開発された。該取組みは、コフェイシャル相互作用(水性緩衝液中での凝集及び沈殿に対して考えられる機構)を抑制するように、且つタンパク質への非共有結合を低減するように、その双方で作用する、反応性のあるたった1つのアミン又はチオール基及び水溶性化基を所持するポルフィリン、クロリン及びバクテリオクロリン類の調製を可能にするいくつかの鍵となる中間体の合成を含む。
bが二重結合を表す場合、Dは、-CH2-又はQを表し、Ra及びRbは双方とも存在せず;
bが単結合を表す場合、Dは、-C(O)-、-CH2-又はQを表し、Ra及びRbは、双方ともHであるか、又は双方とも-OHであり;
R1が、H、或いはカルボキシル、ヒドロキシル、アミノ又はチオール基と反応することができる官能基を含有する部分を表す場合、R2は、H又は可溶化基を表すか;或いは
R1がH又は可溶化基を表す場合、R2は、H、或いはカルボキシル、ヒドロキシル、アミノ又はチオール基と反応することができる官能基を含有する部分を表し;
Gは、O又は直接結合を表し;
Qは、式Ig又はIhの構造フラグメントを表す。
R1が、H、-(CH2)t-X、-(CH2)u-C(R3)=C(R4)-(CH2)v-X、又は-(CH2)w-C≡C-(CH2)x-Xを表し;
tが、1〜20(例えば、1〜12)を表し;
uとvとの和が、2〜6であり;
wとxとの和が、2〜15(例えば、2〜10)であり;
Xが、-C(O)-L1、-OH、スルホニルエステル(例えば、メシレート、トシレート)、-NO2、-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル(例えば、1,2,3,5,6-ペンタフルオロフェニル、4-スルホ-2,3,5,6-ペンタフルオロフェニル)、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、マレイミジル、アリール、又はヘテロアリール(後の2つの基は、-C(O)-L1、-OH、スルホニルエステル(例えば、メシレート、トシレート)、-NO2、-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、及びマレイミジルから選択される1つ以上の基で置換されている)を表し;
L1が、-OH、又は適切な脱離基(例えば、-O-C(O)-R5、ハロ、1-オキシベンゾトリアゾイルなどの活性化されたエステル、又はニトロ、フルオロ、クロロ、シアノ、及びトリフルオロメチルから選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよいアリールオキシ基)を表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官能基を表し;
R2が、H、1つ以上の-C(O)O-E+基、-SO3 -E+基、第4級アンモニウム塩、ピリジニウムイオン又は直鎖若しくは分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100(例えば約3〜約20)である)で独立に置換されたアルキル、シクロアルキル、アルキレニル(alkylenyl)、アルキニル、アリール、ベンジル、ヘテロアリール(ここで、後の3つの基は、-OH、-NH2、又は1つ以上のハロ原子で置換されたC1〜C6アルキルから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)を表すか、或いはR2が、-NR6(R7)又は-N(R6a)-(CH2)z-SO3 -E+を表し;
R3〜R5及びR3aが、独立に、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表し;
R6及びR7が、R6及びR7の少なくとも一方はHでないとの条件で、独立に、H、アルキニル、ピリジニウムイオン、-(CH2)z-NR8(R9)又は-(CH2)z-N+R8(R9)(R10)A-を表し;
R6aが、H、又は-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表し;
zが、1〜20(例えば、1〜10)を表し;
R8〜R10が、独立に、H、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはヘテロアリールを表し;
E+が、適切なカチオン基(例えば、Na+、K+)を表し;
A-が、適切なアニオン基(例えば、I-、Cl-、Br-)を表す;化合物がある。
bが二重結合を表す場合、Dが、-CH2-を表し、Ra及びRbが双方とも存在せず;
bが単結合を表す場合、Dが、-C(O)-又は-CH2-を表し、Ra及びRbが双方ともHであり;
Gが、Oを表し;
R1が、-(CH2)t-X、-(CH2)u-C(R3)=C(R4)-(CH2)v-X、又は-(CH2)w-C≡C-(CH2)x-Xを表し;
tが、1〜20(例えば、1〜12)を表し;
uとvとの和が、2〜6であり;
wとxとの和が、2〜15(例えば、2〜10)であり;
Xが、-C(O)-L1、-OH、スルホニルエステル(例えば、メシレート、トシレート)、-NO2、-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル(例えば、1,2,3,5,6-ペンタフルオロフェニル、4-スルホ-2,3,5,6-ペンタフルオロフェニル)、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、マレイミジル、アリール、又はヘテロアリール(後の2つの基は、-C(O)-L1、-OH、スルホニルエステル(例えば、メシレート、トシレート)、-NO2、-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、及びマレイミジルから選択される1つ以上の基で置換されている)を表し;
L1が、-OH、又は適切な脱離基(例えば、-O-C(O)-R5、ハロ、1-オキシベンゾトリアゾイルなどの活性化されたエステル、又はニトロ、フルオロ、クロロ、シアノ、及びトリフルオロメチルから選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよいアリールオキシ基を表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官能基を表し;
R2が、1つ以上の-C(O)O-E+基、-SO3 -E+基、第4級アンモニウム塩、ピリジニウムイオン又は直鎖若しくは分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100(例えば約3〜約20)である)で独立に置換されたアルキル、シクロアルキル、アルキレニル、アルキニル、アリール、ベンジル、ヘテロアリール(ここで、後の3つの基は、-OH、-NH2、又は1つ以上のハロ原子で置換されたC1〜C6アルキルから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)を表すか、或いはR2が、-NR6(R7)又は-N(R6a)-(CH2)z-SO3 -E+を表し;
R3〜R5及びR3aが、独立に、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表し;
R6及びR7が、R6及びR7の少なくとも一方はHでないとの条件で、独立に、H、ピリジニウムイオン、-(CH2)z-NR8(R9)又は-(CH2)z-N+R8(R9)(R10)A-を表し;
R6aが、H、又は-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表し;
zが、1〜20(例えば、1〜10)を表し;
R8〜R10が、独立に、H、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはヘテロアリールを表し;
E+が、適切なカチオン基(例えば、Na+、K+)を表し;
A-が、適切なアニオン基(例えば、I-、Cl-、Br-)を表す;化合物がある。
(a)bが二重結合を表し、DがQを表し、Qが式Igの構造フラグメントを表し、GがOを表し、R1が-(CH2)w-C≡C-(CH2)x-Xを表し、R2がアルキルを表す;
(b)bが二重結合を表し、DがQを表し、Qが式Igの構造フラグメントを表し、GがOを表し、R1が、-(CH2)w-C≡C-(CH2)x-Xを表し、R2が分枝ポリ-エチレンオキシ基で置換されたベンジルを表す;
(c)bが二重結合を表し、DがQを表し、Qが式Ihの構造フラグメントを表し、GがOを表し、R1がHを表し、R2がHを表す;
(d)bが二重結合を表し、Dが-CH2-を表し、Gが直接結合を表し、R1がハロ(とりわけBr)を表し、R2が-NR6(R7)を表し、R6がアルキニルを表し、R7がHを表す;
(e)bが単結合を表し、Ra及びRbが双方とも-OHを表し、Dが-CH2-を表し、GがOを表し、R1がハロ(とりわけBr)を表し、R2が分枝ポリ-エチレンオキシ基で置換されたベンジルを表す;
化合物が含まれる。
R1、R2は、本明細書中で定義される通りであり;
baが二重結合を表す場合、Daは-CH2-を表し;
baが単結合を表す場合、Daは-C(O)-又は-CH2-を表す。
R1が、-(CH2)t-X、-(CH2)u-C(R3)=C(R4)-(CH2)v-X、又は-(CH2)w-C≡C-(CH2)x-Xを表し;
tが、1〜20(例えば、1〜12)を表し;
uとvとの和が、2〜6であり;
wとxとの和が、2〜15(例えば、2〜10)であり;
Xが、-C(O)-L1、-OH、スルホニルエステル(例えば、メシレート、トシレート)、-NO2、-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル(例えば、1,2,3,5,6-ペンタフルオロフェニル、4-スルホ-2,3,5,6-ペンタフルオロフェニル)、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、マレイミジル、アリール、又はヘテロアリール(後の2つの基は、-C(O)-L1、-OH、スルホニルエステル(例えば、メシレート、トシレート)、-NO2、-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、及びマレイミジルから選択される1つ以上の基で置換されている)を表し;
L1が、-OH、又は適切な脱離基(例えば、-O-C(O)-R5、ハロ、1-オキシベンゾトリアゾイルなどの活性化されたエステル、又はニトロ、フルオロ、クロロ、シアノ、及びトリフルオロメチルから選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよいアリールオキシ基)を表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官能基を表し;
R2が、1つ以上の-C(O)O-E+基、-SO3 -E+基、第4級アンモニウム塩、ピリジニウムイオン、又は直鎖若しくは分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100(例えば約3〜約20)である)で独立に置換されたアルキル、シクロアルキル、アルキレニル、アルキニル、アリール、ベンジル、ヘテロアリール(ここで、後の3つの基は、-OH、-NH2、又は1つ以上のハロ原子で置換されたC1〜C6アルキルから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)を表すか、或いはR2が、-NR6(R7)又は-N(R6a)-(CH2)z-SO3 -E+を表し;
R3〜R5及びR3aが、独立に、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表し;
R6及びR7が、R6及びR7の少なくとも一方はHでないとの条件で、独立に、H、ピリジニウムイオン、-(CH2)z-NR8(R9)又は-(CH2)z-N+R8(R9)(R10)A-を表し;
R6aが、H、又は-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表し;
zが、1〜20(例えば、1〜10)を表し;
R8〜R10が、独立に、H、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール若しくはヘテロアリールを表し;
E+が、適切なカチオン基(例えば、Na+、K+)を表し;
A-が、適切なアニオン基(例えば、I-、Cl-、Br-)を表す;化合物がある。
R1が、式Ia、Ib、Ic、Id、Ie、Ifの構造フラグメント:
R11が、H、アルキル(-OH、ハロ、及び直鎖若しくは分枝エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100(例えば約3〜約20)である)から選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)、又は直鎖若しくは分枝エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100(例えば、約3〜約20)である)を表し;
R12〜R14が、独立に、H、又は-OH、ハロ及び直鎖若しくは分枝エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100(例えば約3〜約20)である)から選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表し;
Y-が、任意の適切なアニオン基(例えば、I-、Br-、Cl-)を表し;
tが、1〜20(例えば、1〜12)を表し;
uとvとの和が、2〜6であり;
wとxとの和が、2〜15(例えば、2〜10)であり;
Zが、-C(O)O-E+、-SO3 -E+、第4級アンモニウム塩、式Ia〜Ifの構造フラグメントを表すか、或いはZが、1つ以上の-C(O)O-E+基、-SO3 -E+基、第4級アンモニウム塩、ピリジニウムイオン、又は直鎖若しくは分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここでオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100(例えば、約3〜約20)である)で置換されたアリール、ベンジル、ヘテロアリール(ここで、後の3つの基は、-OH、-NH2、又は1つ以上のハロ原子で置換されたC1〜C6アルキルから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)を表し;
E+が、任意の適切なカチオン(例えば、Na+、K+)を表し;
R2が、-C(O)-L3、-OH、スルホニルエステル(例えば、メシレート、トシレート)、-NO2、-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル(例えば、1,2,3,5,6-ペンタフルオロフェニル、4-スルホ-2,3,5,6-ペンタフルオロフェニル)、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、マレイミジル、アリール、又はヘテロアリール(後の2つの基は、-C(O)-L1、-OH、スルホニルエステル(例えば、メシレート、トシレート)、-NO2、-CHO、-N3、-CN、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル及びマレイミジルから選択される1つ以上の基で置換されている)を表し;
L3が、-OH又は適切な脱離基(例えば、-O-C(O)-R15、ハロ、1-オキシベンゾトリアゾイルなどの活性化されたエステル、又はニトロ、フルオロ、クロロ、シアノ及びトリフルオロメチルから選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよいアリールオキシ基)を表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官能基を表し;
R15が、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表す;化合物がある。
R1が、-(CH2)u-C(R3)=C(R4)-(CH2)v-X又は-(CH2)w-C≡C-(CH2)x-Xを表し;
wとxとの和が2〜10であり;
Xが、-C(O)-L1、-OH、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、マレイミジル、アリール、又はヘテロアリール(後の2つの基は、-C(O)-L1、-OH、スルホニルエステル(例えば、メシレート、トシレート)、-NO2、-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、及びマレイミジルから選択される1つ以上の基で置換されている)を表し;
L1が、-OH又は-O-C(O)-R5を表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官能基を表し;
R2が、1つ以上の直鎖又は分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100(例えば、約3〜約20)である)で独立に置換されたアルキル、シクロアルキル、アルキレニル、アルキニル、アリール、ベンジル、ヘテロアリール(ここで、後の3つの基は、-OH、-NH2、又は1つ以上のハロ原子で置換されたC1〜C6アルキルから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)を表すか、或いはR2が、-NR6(R7)又はN(R6a)-(CH2)z-SO3 -E+を表し;
R6及びR7が、R6及びR7の少なくとも一方がHでないとの条件で、独立に、-(CH2)z-NR8(R9)又は-(CH2)z-N+R8(R9)(R10)A-を表し;
R6aが、H、又は-OH若しくはハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C3アルキルを表し;
zが、1〜10を表し;
R8〜R10が、独立に、H、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいアルキル又はアルケニルを表し;
A-が、I-、Cl-、Br-を表す;化合物がある。
R1が、-(CH2)wC≡C-(CH2)x-Xを表し;
wとxとの和が2〜10であり;
Xが、-C(O)-L1、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、又はマレイミジルを表し;
L1が、-OHを表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官能基を表し;
R2が、1つ以上の直鎖又は分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100(例えば、約3〜約20)である)で独立に置換されたアリール、ベンジル、ヘテロアリール(ここで、後の3つの基は、-OH、-NH2、又は1つ以上のハロ原子で置換されたC1〜C6アルキルから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)を表すか、或いはR2は、-NR6(R7)又は-N(R6a)-(CH2)z-SO3 -E+を表し;
R6及びR7が、R6及びR7の少なくとも一方がHでないとの条件で、独立に、-(CH2)z-NR8(R9)又は-(CH2)z-N+R8(R9)(R10)A-を表し;
R6aが、Hを表し;
zが、1〜10を表し;
R8〜R10が、独立に、H、又は-OH若しくはハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいアルキルを表し;
A-が、I-、Cl-、Br-を表す;化合物がある。
R1が、-(CH2)wC≡C-(CH2)x-Xを表し;
wとxとの和が2〜10であり;
Xが、-C(O)-L1、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、又はマレイミジルを表し;
L1が、-OHを表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官能基を表し;
R2が、1つ以上の直鎖又は分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100(例えば、約3〜約20)である)で独立に置換されたアリール、ベンジル、ヘテロアリール(ここで、後の3つの基は、-OH、-NH2、又は1つ以上のハロ原子で置換されたC1〜C6アルキルから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)を表す;化合物がある。
R1が、-(CH2)wC≡C-(CH2)x-Xを表し;
wとxとの和が2〜10であり;
Xが、-C(O)-L1、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、又はマレイミジルを表し;
L1が、-OHを表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官能基を表し;
R2が、-NR6(R7)を表し;
R6及びR7が、R6及びR7の少なくとも一方がHでないとの条件で、独立に、-(CH2)z-NR8(R9)又は-(CH2)z-N+R8(R9)(R10)A-を表し;
zが、1〜10を表し;
R8〜R10が、独立に、H、又は-OH若しくはハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいアルキルを表し;
A-が、I-、Cl-、Br-を表す;化合物がある。
R1が、先に定義した通りの式Ia、Ib、Ic、Id、Ie、Ifの構造フラグメントを表し;
R11が、H、アルキル(-OH、ハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)、又は直鎖又は分枝エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100(例えば、約3〜約20)である)を表し;
R12〜R14が、独立に、H、又はOH、ハロ、及び直鎖又は分枝エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100(例えば、約3〜約20)である)から選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表し;
Y-が、I-、Br-又はCl-を表し;
R2が、-C(O)-L3、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル(例えば、1,2,3,5,6-ペンタフルオロフェニル、4-スルホ-2,3,5,6-ペンタフルオロフェニル)、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、又はマレイミジルを表し;
L3が、-OH又は-O-C(O)-R15、ハロ、1-オキシベンゾトリアゾリルなどの活性化エステル、又はニトロ、フルオロ、クロロ、シアノ及びトリフルオロメチルから選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよいアリールオキシ基を表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化さるカルボン酸官能基を表し;
R15が、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表す;化合物がある。
R1が、先に定義した通りの式Ia、Ib、Ic、Id、Ie、Ifの構造フラグメントを表し;
R11が、アルキル、又は直鎖若しくは分枝エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は約3〜約20である)を表し;
R12〜R14が、独立に、H、又はOH、ハロ、及び直鎖又は分枝エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は約3〜約20である)から選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表し;
Y-が、I-、Br-又はCl-を表し;
R2が、-C(O)-L3、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル(例えば、1,2,3,5,6-ペンタフルオロフェニル、4-スルホ-2,3,5,6-ペンタフルオロフェニル)、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、又はマレイミジルを表し;
L3が、-OH又は-O-C(O)-R15、を表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官能基を表し;
R15が、-OHから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表す;化合物がある。
式中、
D、b、R1、R2、G、Ra及びRbは、先に定義した通りであり;
Mは、Zn(II)、Fe(II)、Ga(II)、Co(II)、Cu(II)、Mn(II)、Ni(II)、Ru(II)、Al(II)、Pt(II)又はPd(II)を表す。
(i)式I〜IIIのいずれか1つの化合物を含む光増感物質を提供する工程;
(ii)担体分子を提供する工程;
(iii)該光増感物質と該担体分子とを、第1及び第2の極性非プロトン性溶媒並びに水性緩衝液の存在下で複合させる工程;を含む製造方法を提供する。
(iv)調節剤を担体分子にカップリングさせる工程(ここで、該調節剤は、光増感物質の機能を調節する能力がある)。
(v)化合物を医薬として許容し得る担体と組み合わせて医薬製剤を形成する工程。
用語「抗体フラグメント」は、抗体、抗体フラグメント、又は抗体誘導体のいずれか1つを指すと解釈されるものとする。その用語は、野生型抗体(すなわち、4本のポリペプチド鎖を含む分子);合成抗体;組換え抗体;又は限定はされないが、免疫グロブリンの軽鎖及び/又は重鎖の可変及び/又は定常領域のファージディスプレイによって産生される修飾された単鎖抗体分子、或いは当業者にとって既知である免疫アッセイフォーマットにおいて抗原に結合する能力のあるその他の免疫相互作用性分子などの抗体ハイブリッドを包含すると解釈される。
(概説)
以下の実施例では、タンパク質への複合化のための、疎水性光増感剤であるPPaの一連の新規誘導体の開発について説明する。該取組みは、その双方ともコフェイシャル相互作用(水性緩衝液中での凝集及び沈殿の機構であろう)を抑制し、且つタンパク質への非共有結合を低減するように作用する、反応性のある単一のアミン又はチオール基、及び水可溶化基を所持するポルフィリン、クロリン及びバクテリオクロリン類の調製を可能にするいくつかの鍵となる中間体の合成を含む。
本発明者らは、ここに、標的指向化された光線力学療法(PDT)のための高い純度及び有効性のある光免疫複合体(PIC)を製造するために、種々の抗体フォーマット、とりわけ単鎖Fv上へ共有結合で連結するための光増感剤の設計が、
1.生理食塩水溶液への高い溶解性、それによる分子間凝集(及び、励起状態の消光)の回避;
2.タンパク質への最小の非特異的(非共有)結合形成;及び
3.複合化のための単一の反応性基の組込み、それによる架橋及び生成混合物の形成の回避;を含む多くの因子に依存することを示した。
空気及び/又は水に敏感な化合物の取扱いは、標準的なシュレンク技術を使用して実施した。DCM及びトリエチルアミンは、CaH2から蒸留することによって乾燥され、無水THFは、ナトリウム/ベンゾフェノンからの蒸留によって得られた。その他のすべての試薬は、特記しない限り、市販業者によって供給されるものを使用した
水酸化ナトリウム(8.07g、201ミリモル)の水(50mL)溶液に、撹拌しながら、トリエチレングリコールモノメチルエーテル(25g、152ミリモル)のTHF(50mL)の溶液を、窒素下で温度を5℃未満(氷-水-食塩)に維持しながら滴加した。添加を完了したら、同じ温度で、p-トルエンスルホニルクロリド(24.78g、130ミリモル)の溶液を1時間にわたって滴加した。水中に注いで反応を止め、DCM(200mL)を添加し、有機層を分離した。水層をDCM(3×200mL)で逆抽出した。合わせた有機層を、水(2×)及びブライン(2×)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、濾過、蒸発させて、無色のオイルとして(2)を得た(34g、82%)。
(2)(24.51g、76.9ミリモル)のアセトン(220mL)溶液に、3,4,5-トリヒドロキシ安息香酸メチル(4.5g、24.4ミリモル)、無水炭酸カリウム(16.85g、122ミリモル)及び18-クラウン-6(1.3g、4.88ミリモル)を添加した。生じたスラリーを、アルゴン下で2日間、撹拌、還流した。生じた淡褐色反応混合物を、濾過して不溶性無機物を除去し、真空下で濃縮して、褐色残留物を得た。これをクロロホルム(500mL)に再溶解し、飽和炭酸ナトリウム溶液(5×500mL)、飽和重炭酸ナトリウム溶液(3×250mL)、及び最後にブライン(250mL)で洗浄した。有機相を分離し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させて、淡褐色オイルとして粗製物質を得た。これを、5%MeOH/クロロホルムで溶離するシリカでのカラムクロマトグラフィー(Rf0.4)で精製して、微黄色オイルとして(3)を得た(10.6g、70%)。
撹拌され氷冷されたLiAlH4(0.86g、22.9ミリモル)の無水THF(35mL)懸濁液に、無水THF(85mL)に溶解されたエステル(3)(8.95g、14.4ミリモル)をアルゴン下で1時間にわたって滴加した。添加後、反応物を室温まで温め、6時間撹拌すると、この時点で、TLC(シリカゲル、10%MeOH/CHCl3、Rf0.56)は、なお出発原料の存在を示した。反応混合物を5℃未満に冷却し、さらなるLiAlH4(0.86g、22.9ミリモル)を添加した。添加後、混合物を再び室温まで温めさらに6時間撹拌すると、この時点ですべてのエステルが消費されていた。反応混合物を、THF(300mL)及び少量のNa2SO4・10H2O濃水溶液を添加して希釈し、水素化物が完全に消滅するまでセライトを添加した。反応混合物を、濾過、濃縮して、微黄色澄明オイルを得た(6.3g、93%、Rf 0.37)。
メチルピロフェオフォルビドa 5(1.2g)のジクロロメタン(90mL)溶液に、Zn(OAc)2・2
H2O(1.27g、5.78ミリモル)のメタノール(52mL)溶液を添加した。混合物をアルゴン下に室温で2時間撹拌し、UV/Vis分光法で追跡した。次いで、反応混合物を、水(4×100mL)で洗浄し、DCMで逆抽出し、合わせた有機層を集め、Na2SO4で乾燥した。溶媒を除去し、固体を高度真空ポンプでさらに乾燥した。残留物を無水THF(110mL)に溶解し、トリエチルアミン(312mL)、続いてPd/C(10%、120mg)を添加した。生じた混合物を室温で24時間水素化(水素風船を用いて)し、次いで、セライトの詰め物を通して濾過した。溶媒を除去し、残留物をTFA(33mL)でアルゴン下に室温で2時間処理した。反応混合物を氷水に注意して注ぐことによって反応を止め、水層が澄明になるまでDCMで抽出した。有機層を合わせ、水(2×200mL)及び5%NaHCO3(1×200mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。濾過した後に溶媒を除去し、残留物を10%酢酸エチル/DCMで溶離する中性アルミナ(BrockmannグレードIII)でのカラムクロマトグラフィーで精製して、暗紫色固体として所望の化合物を得た(1.17g、97%)。Rf 0.66。
濃塩酸(100mL)をメソ-メチルピロフェオフォルビドa(6)(0.20g、0.366ミリモル)に、少量に分割して添加し、遮光してアルゴン下に室温で2時間撹拌した。反応混合物を、氷水(600mL)中に注ぎ、クロロホルム(3×100mL)で抽出した。合わせた有機層を、5%NaHCO3(1×100mL)及び水(1×200mL)で洗浄し、乾燥(Na2SO4)し、濾過し、溶媒を除去して暗青色固体として(7)を得た(0.17g、86%)。Rf 0.24。
これを、全く精製しないで使用した。
メソピロフェオフォルビドa(7)(0.08g、0.149ミリモル)の無水DCM(40mL)溶液に、DMAP(0.033g、0.273ミリモル、触媒量)及びDCC(0.078g、0.376ミリモル)、続いて無水DCM(10mL)に溶解したベンジルアルコール(4)(0.13g、0.223ミリモル)を添加し、反応混合物を、遮光して窒素下で5時間、室温で撹拌した(Rf 0.58)。溶媒を除去して暗色固体を得た。それをDCMに再溶解し、0.5M HCl(1×)、水(2×)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濾過、濃縮して、粗製物質(8)を得た。これを、5%MeOH/CHCl3で溶離するシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーでさらに精製した。暗紫色オイルを得て、それをヘキサンと共に磨り潰した(0.073g、44%)。
化合物(8)(0.56g、0.5ミリモル)の無水DCM(120mL)溶液に、前以て高度真空ポンプで乾燥したピリジニウムペルブロミド(0.21g、0.65ミリモル)及び無水ピリジン(530μL)を添加し、反応混合物をアルゴン下に室温で撹拌した。反応は、UV/Visで監視すると30分で完結し、その時点で溶媒を除去し、粗製物質を、直ちに、5%MeOH/CHCl3で溶離するシリカゲルでのクロマトグラフィーで精製して、粘性紫色オイルとして所望の化合物を得た(0.41g、69%)。
メソ-メチルピロフェオフォルビドa(6)(0.27g、0.492ミリモル)の無水DCM(75mL)溶液に、前以て高度真空下で乾燥されたピリジニウムペルブロミド(0.2g、0.618ミリモル)及び無水ピリジン(500μL)を添加した。反応混合物を、遮光してアルゴン下に室温で20分間撹拌した。反応をUV/Visで監視し、完結したら、溶媒を除去して褐色固体として粗生成物を得た。これを、溶離液としてDCMを使用する中性酸化アルミニウム(Brockmann III)でのカラムクロマトグラフィーにより精製した。Rf 0.82(5%MeOH/CHCl3)。最終生成物を紫色固体として得た(0.24g、77%)。
メチルメソ-ブロモピロフェオフォルビドa(0.97g、1.54ミリモル)を濃塩酸(200mL)に徐々に溶解し、アルゴン下に室温で5時間撹拌した。反応混合物を、撹拌した氷-水の混合物上に徐々に注ぐことによって反応を止め、水層が澄明になるまでクロロホルムで徹底的に抽出した。合わせた有機層を、飽和NaHCO3、水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させて、紫色固体を得た(0.65g、70%)。Rf 0.16(5%MeOH/CHCl3)。
メソ-ブロモピロフェオフォルビドa(13)(0.08g、0.13ミリモル)を、無水DCM/10%THF(10mL)に溶解し、アルゴン覆いの下に置いた。撹拌されたこの溶液に、最少量の無水DCMに溶解したトリPEG化ベンジルアルコール(4)(0.12g、0.195ミリモル)、続いてDCC(0.17g、0.84ミリモル)、DMAP(0.062g、0.506ミリモル)及びDPTS(0.14g、0.48ミリモル)を添加した。生じた混合物を遮光し、10分間撹拌した後、N-エチルジイソプロピルアミン(79μL、0.46ミリモル)を添加し、さらに6時間撹拌を継続すると、TLC(シリカゲル)により、すべての出発原料の消費が確認された。反応混合物を、DCM(200mL)で希釈し、飽和塩化アンモニウム溶液(100mL)及び水(5×100mL)で洗浄し、有機層を分離し、水層をDCMで逆抽出した。合わせたDCM洗浄液を、Na2SO4で乾燥し、蒸発させて暗紫褐色オイルを得た。これを、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、5%MeOH/クロロホルム、Rf 0.46)で精製し、関連画分を合わせ、濃縮してオイルを得た。これを、最小量のクロロホルムに溶解し、その溶液をヘキサンで層にし、それを5℃で一夜放置することによってさらに精製した。生じた白色沈殿を濾取し、この手順を、さらなる沈殿が観察されなくなるまで繰り返した。所望の化合物(14)を粘性暗紫色オイルとして得た(0.11g、73%)。
5-ブロモ誘導体(14)(0.1g、0.0837ミリモル)を無水の脱酸素DMF/EtN3(2mL、10:1)混合物中に溶解した。アルゴン下で撹拌されたこの溶液に、トリ-(o-トリル)ホスフィン(0.03g、0.0973ミリモル)、続いてトリス(ジベンジリデンアセトン)二パラジウム(0)(0.012g、0.0127ミリモル)、続いて大過剰の5-ヘキシン酸(170μL、1.677ミリモル)を添加した。生じた暗紫色溶液をアルゴンでパージしてアルゴン雰囲気下に置き、遮光して室温で撹拌した。反応をTLC(シリカゲル、10%MeOH/CHCl3)で監視すると、生成物は、2〜4時間以内にプレート上に長波長光での照明下で赤色の蛍光も有する暗青色のスポットとして観察することができ(Rf 0.5)、出発原料(Rf 0.69)は、臭素原子の存在のため蛍光を発光しなかった。反応物を、12時間撹拌したままにし、ジエチルエーテルで希釈し、水/クエン酸溶液混合物で洗浄し、有機層を分離し、水層をエーテルで逆抽出した。次いで、合わせたエーテル抽出物を、Na2SO4で乾燥し、蒸発させて、暗紫色オイルを得た。これをクロマトグラフィー(シリカゲル、5%MeOH/CHCl3)で精製して粘性紫色オイルとして所望の化合物を得た(0.07g、70%)。
メソ5-エチニルヘキサン酸PPa誘導体(10)(0.03g、0.0245ミリモル)の無水DCM(5mL)溶液に、N-ヒドロキシスクシンイミド(3.7mg、0.0319ミリモル)及びDCC(7.6mg、0.0368ミリモル)を添加し、生じた混合物を12時間撹拌した。シリカゲル(5%MeOH/CHCl3、Rf 0.38)。溶媒を蒸発させ、残留物をカラムクロマトグラフィーで精製して粘性暗紫色オイルとして所望の化合物を得た。これを最小量の無水DCMに溶解し、十分な量のヘキサンを添加し、生じた溶液を5℃で一夜放置し、ジシクロヘキシルウレアを除去するために濾過し、蒸発させ、乾燥した(0.023g、71%)。
メチルメソ5-ブロモピロフェオフォルビドa(12)(0.03g、0.0477ミリモル)を無水の脱酸素DMF/EtN3(2mL、10:1)混合物中に溶解した。アルゴン下で撹拌されたこの溶液に、トリ-(o-トリル)ホスフィン(0.017g、0.0552ミリモル)、続いてトリス(ジベンジリデンアセトン)二パラジウム(0)(0.0066g、0.00722ミリモル)、続いて大過剰の5-ヘキシン酸(97μL、0.953ミリモル)を添加した。生じた暗紫色溶液をアルゴンでパージしてアルゴン雰囲気下に置き、遮光して室温で撹拌した。反応物を、12時間撹拌したままにし、ジエチルエーテルで希釈し、水/クエン酸溶液混合物で洗浄し、有機層を分離し、水層をエーテルで逆抽出した。次いで、合わせたエーテル抽出物を、Na2SO4で乾燥し、蒸発させて、暗紫色オイルを得た。これをクロマトグラフィー(シリカゲル、2%MeOH/CHCl3)で精製して紫色固体として所望の化合物を得た(0.023g、75%)。
メソ5-エチニルヘキサン酸メチルピロフェオフォルビドa(15)(0.02g、0.0303ミリモル)の無水DCM(2mL)溶液に、N-ヒドロキシスクシンイミド(4.2mg、0.0363ミリモル)及びDCC(7.5mg、0.0363ミリモル)を添加し、生じた混合物を12時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残留物をカラムクロマトグラフィーで精製して暗紫色オイルとして所望の化合物を得た(0.016g、70%)。
メソ-ブロモピロフェオフォルビドa(13)(0.1g、0.163ミリモル)を無水DCM/20%THF(10mL)に溶解し、アルゴンの覆いの下に置いた。撹拌されたこの溶液に、N-ヒドロキシスクシンイミド(0.0224g、0.0195ミリモル)、続いてDCC(0.0377g、0.0195ミリモル)を添加し、生じた混合物を、遮光して室温で18時間撹拌すると、TLC(5%MeOH/CHCl3、Rf 0.48)は、生成物の存在及び出発原料の消費を示した。この時点で、小量の無水DCMに溶解した過剰のビス-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]アミン(73μL、0.325ミリモル)を添加し、さらに12時間撹拌を継続した。TLC(シリカゲル、5%MeOH/CHCl3)は、インサイチュで生じた活性エステル誘導体(17)のすべてが、消費されたことを示し、且つTLC(中性酸化アルミニウム、10%MeOH/CHCl3)は、新たな主要成分の存在を示した。反応混合物を蒸発させて粘性紫色オイルを得た。これを、中性酸化アルミニウム(Brockmann III)でのカラムクロマトグラフィーで精製し、主要画分を集め、蒸発させて紫色固体として誘導体(18)を得た(0.1g、64%)。
ビス-アミン(18)(0.02g)を無水クロロホルムに溶解し、アルゴンの覆いの下に置いた。この溶液に過剰のヨウ化メチル(0.3mL)を添加し、反応混合物を12時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、油状残留物を、無水ジエチルエーテル(5×)と共に磨り潰し(各回ともエーテルを注意深くデカントで除去し、新たなバッチを添加して)、最後に、残留物を高度真空ポンプ下で乾燥して粘着性紫色固体を得た。HRMS(ESI) m/z C45H64N7O2BrI (M-I) 計算値 940.3350 実測値 940.3367; UV/Vis(MeOH) 410, 514, 547, 610, 668。この化合物は、水及びメタノールに易溶である。
5-ブロモアミド誘導体(18)(0.067g、0.00854ミリモル)を無水の脱酸素DMF/EtN3(2mL、10:1)混合物中に溶解した。アルゴン下で撹拌されたこの溶液に、トリ-(o-トリル)ホスフィン(0.03g、0.0973ミリモル)、続いてトリス(ジベンジリデンアセトン)二パラジウム(0)(0.012g、0.0127ミリモル)、続いて大過剰の5-ヘキシン酸(170μL、1.677ミリモル)を添加した。生じた暗紫色溶液をアルゴンでパージしてアルゴン雰囲気下に置き、遮光して室温で18時間撹拌すると、TLC(中性酸化アルミニウム、10%MeOH/CHCl3)は、出発原料のすべての消費を示した。反応混合物を蒸発乾固して粘性暗紫色オイルを得た。これを、中性酸化アルミニウム(Brockmann III)のカラムに添加し、20%MeOHで溶離した。一部の少量ポルフィリン画分は溶離したが、主要帯はカラムの上部に留まった。これを掻き取り、MeOH/CHCl3(1:1)中で撹拌し、暗紫色溶液を蒸発させて粘性紫色オイルを得た。HRMS (ESI) m/z C49H65N7O4B (M+1) 計算値 816.5098 実測値 816.5172; UV/Vis (THF) 416, 523, 558, 614, 673。
3-デビニル-20-ブロモ-メチルピロフェオフォルビド-a(0.2g、0.32ミリモル)及び4-ピリジルボロン酸(0.39g、3.18ミリモル)を乾燥窒素で15分間脱気した後、無水THF(80mL)を添加し、窒素バグリングによりさらに30分間脱気した。Pd(PPh3)4(約80mg)を添加し、混合物の脱気を15分間継続した。K3PO4(1.3g、6.35ミリモル)を添加し、反応物を、遮光して窒素下で、還流下に15分間加熱した。Pd(PPh3)4(約40mg)を添加し、還流下で加熱を9時間継続した後、混合物をクロロホルムで希釈し、水、飽和NaHCO3、ブライン、及び水で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。粗生成物を、CHCl3/THF(9/1)で溶離するシリカゲルで精製して、暗色オイルを得た。これを、CHCl3/ヘキサンから4℃で一夜にわたって再結晶させて、長い紫色結晶を得た(収率63%)。Rf(CHCl3/THF):0.3。
3-デビニル-20-ピリジル-メチルピロフェオフォルビド-a(108mg、0.172ミリモル)をオーブン中で乾燥したRBFに添加し、窒素で短時間パージした。窒素下で10M HCl(22mL)を添加して溶解し、遮光して室温で8時間撹拌した。氷水中に注いで反応を止め、クロロホルムで抽出し、続いて、飽和NaHCO3及び水で洗浄した。それを、Na2SO4で乾燥し、濾過、濃縮した後、シリカゲルで5〜10%MeOH/CHCl3のグラジエントで溶離して精製し、暗紫色固体を得た(収率71%)。Rf (5%MeOH/CHCl3):0.5。1H及び13C-NMRは幅が広く分析できなかったが、メチルエステルの加水分解が、3.58の単一ピークの消失(1H NMR)及びRf値の変化として観察された。MS ES(m/z)(C38H39N5O3 計算値 613.75) 実測値 614.31(M++H)。すべての酸PPa誘導体について観察される1H NMR(CDCl3、400MHz、25℃)は、幅が広く、解釈及び帰属を困難にする区別のつかないピークをもたらした。LCMS(C18) 保持時間 9.51分 (614.3132), UV/Vis(CH2Cl2):λmax 668nm。
メソ5-ピリジルPPa(0.033ミリモル)を窒素下で無水DMF(2.5mL)に溶解した。ヨウ化メチル(6.5ミリモル)を添加し、TLC(5%MeOH/CHCl3)で観察して出発原料が消費されてしまうまで、窒素下に室温で3.5時間撹拌した。ほとんどの溶媒を除去し、無水エーテルを添加し、4℃で一夜放置した後、濾過して暗褐色固体を得た(74%)。
メチルで第4級化された5-ピリジルメソPPa(0.017ミリモル)を無水DCM(3mL)及び無水THF(1mL)に溶解した。DCC(0.049ミリモル)及びN-ヒドロキシスクシンイミド(0.11ミリモル)を添加し、窒素下に遮光して室温で17時間撹拌したままにした。TLC(Rf (10%MeOH/CHCl3):0.1)で追跡した。溶媒を除去し、固体を、ヘキサン続いて無水エーテルで繰り返し洗浄した。
5-ピリジルメソMePPa(0.039ミリモル)を無水DMF(2.5mL)に溶解した。MeI(7.97ミリモル)を添加し、TLC(5%MeOH/CHCl3)で出発原料の消失を監視しながら、窒素下に室温で20時間撹拌した。溶媒のほとんどを除去し、無水エーテルを添加し、冷却後に褐色固体を得た(99%)。
3-デビニル-20-ピリジルピロフェオフォルビド-a(0.060g、0.098ミリモル)を無水DMF(5mL)に溶解した。ヨードトリエチレンオキシド(1.48g、5.4ミリモル)を添加し、反応物を、遮光して窒素下に80℃で4日間撹拌した。TLC(シリカゲル、MeCN:H2O:飽和K2NO3=60:10:10)で出発原料の消費を追跡することによって、反応を監視した。溶媒を除去し、残留オイルを無水DCMに再溶解し、冷却後に脱脂綿を通して濾過を数回繰り返した。無水DCMに再溶解し、無水エーテルで層にした。褐色固体を、遠心分離により捕集し、真空デシケーター中、P2O5で乾燥した。
MS ES (m/z) (C45H54IN5O6 計算値 887.84) 実測値 760.41 M+-I。
LCMS(C18) 保持時間 6.84分 (760.4090) UV/Vis λmax 677nm。
3-デビニル-20-ピリジル-メチルピロフェオフォルビド-a(0.100g、0.159ミリモル)を窒素下で無水RBF中に秤量し、無水DMF(10mL)で溶解した。ヨードトリエチレンオキシド(1.853g、6.76ミリモル)を添加し、遮光して窒素下に80℃で24時間撹拌した。TLC(シリカゲル、MeCN:H2O:飽和K2NO3=60:10:10)で出発原料の消費を追跡することによって、反応を監視した。溶媒を除去し、残留オイルを、無水エーテルで繰り返し洗浄し、無水DCMに溶解し、脱脂綿を通して濾過した。最後に、無水DCMに再溶解し、無水エーテルを使用して沈殿させて、褐色固体を得た。この固体を、遠心分離で捕集し、真空デシケーター中、P2O5で乾燥した。Rf (MeCN:H2O:飽和K2NO3=60:10:10):0.6。
3-デビニル-20-(4-トリエチレンオキシドピリジニウム)-メチルピロフェオフォルビド-aヨージド(0.0736g、0.082ミリモル)に10M HCl(8mL)を窒素下で添加し、遮光して室温で一夜撹拌した。TLC(シリカゲル、MeCN:H2O:飽和K2NO3=60:10:10)で出発原料の消費を追跡することによって、反応を監視した。5M NH4PF6溶液(約5mL)を添加し、短時間撹拌した。氷水、続いてCHCl3を添加し、水層を澄明になるまで数回抽出した。有機物を、さらに、水層が中性になるまで水で洗浄した。溶媒を除去して粗生成物を得た。これを、シリカゲル60で被覆された分取TLCプレート(20×20cm2、2000μ)上で、溶離液としてMeCM:H2O:飽和K2NO3=60:10:10を使用して精製した。生成物を、CHCl3に溶解し、水で洗浄した後、濃縮し、無水DCM及び無水エーテルに再溶解し、遠心分離で回収し、P2O5で乾燥した。
Rf (MeCN/H2O/KNO3): 0.33 LCMS (C18) (C46H56IN5O6 計算値 901.87) 保持時間 7.38(774.42)。
3-デビニル-20-(4-トリエチレンオキシドピリジニウム)ピロフェオフォルビド-aヨージド/PF6(0.010g、0.011ミリモル)を窒素下で無水MeOH(3mL)に溶解した。Dowex 1×8-400(約10mg)を添加し、遮光して室温で3時間撹拌した後、脱脂綿を通して濾過し、濃縮した。それを、無水DCM/無水エーテルに再溶解し、固体を得て、真空デシケーター中のP2O5上で乾燥して、最終生成物を得た(95%)。
(生物学的な材料及び方法)
細胞培養:
ヒト腫瘍細胞系(SKOV3)を、75cm3のフラスコ中で増殖させ、PBS(2×25mL)で洗浄し、トリプシン(10×)(150cm3のフラスコ当たり2mL)と共に5〜7分間インキュベートした。フェノールレッド不含DMEM(10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)(10mL)を添加し、細胞を、ピペット移送により再懸濁した。細胞を、ファルコンチューブに移送し、37℃、2000rpmで2分間遠心した。上清液を廃棄し、ペレットを5mLのフェノールレッド不含DMEM(10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)に再懸濁した。細胞を、血球計数器を使用して計数し、それに合うように希釈し、ウェル当たり200μLを播種した。
次のように播種した:
SKOV-3細胞3000個/ウェル、KS細胞2000個/ウェル、SKBr3細胞5000個/ウェル。
PPaPEGスクシンイミジルエステルを100%DMSO中に再懸濁し、室温で連続的に撹拌しながら1時間で、6%のアセトニトリルを含有するPBS中に592μM〜37μMのC6scFv濃度で(DMSO総含量を2%に維持しながら)添加した。次いで、光免疫複合体(PIC)をPBS/2%DMSOに対して緩衝液を2回交換して透析した。次いで、光免疫複合体(PIC)をPBSに対して緩衝液を2回交換して透析した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルでの電気泳動(SDS-PAGE)分析を実施し、クーマシーブルーで染色した。非染色のゲルを、半乾燥ブロッティング装置(Biorad)を使用してニトロセルロース上に移し、徐々に乾燥した。Fuji LAS3000を使用するUV光でPPaPEGを励起することによって、蛍光を可視化した。製造業者のソフトウェアを利用し、デンシトメトリーを使用して相対強度/バンドサイズを計算した。この比率を使用して非共有結合について補正した。UV照明下で(図1参照)、遊離の及び複合されたPPaPEGは、蛍光を発し、共有結合性カップリングを裏づけ、PPaPEGの約30%が非共有結合でタンパク質と会合していることを示した。
遊離の光増感剤(2%ジメチルスルホキシド-DMSO/PBS中に溶解された)及びscFvにカップリングされた光増感剤(PBS/2%DMSO中に溶解された)の吸光度プロファイルを、Hewlett Packerd UV-可視分光光度計で測定した(図2及び3)。scFvに結合させたいくつかのPPaPEG分子を、410nm及び670nmの吸光度を使用して測定し、PPaPEGの標準曲線と比較した。C6PPaPEG複合体の吸光プロファイル(図2)は、400nm付近に特徴的なピーク(Soret帯)を、500〜630nmに小さなピークを、及び670nm付近にクロリン類に特有である強い吸収(Q帯)を示す。該ピークは、遊離のPSに比較して、670nmのピークで3〜5nmの赤色移動を伴って僅かに広がったが(データは示さない)、すべて急峻であり、PSに関して非凝集状態を示唆している。670nm付近のこのピークを利用して、PPaPEG:scFvの比率を決定し、30%(デンシトメトリーで測定して)の非共有結合について補正した後、5〜10:1であるPS:scFvの効果的な比率範囲を得た。
細胞を、トリプシン処理し、96ウェルプレート中に3×103細胞/ウェルで播種し、37℃、5%CO2で一夜インキュベートした。翌日、細胞をPBSで1回洗浄し、50μLのPIC(適切に希釈された)又は遊離の光増感剤を、抑制照明下で適切なウェルに添加した。対照ウェルにはPBSを添加した。暗所において、37℃、5%CO2で30分間インキュベートした後、細胞をPBSで3回洗浄し、各ウェルに50μLのPBSを添加した。ウェルを、4つのウェル上に0.6W、10秒間の線量で、2Wからの光(680nm、HPD Inc、New Jersey、米国)に曝露した(対照ウェルにはscFv-PPaPEG又は遊離のPPaPEGを添加して光に曝露しないか、或いはPBSを添加して光に曝露する。総合対照として、scFv-PS又はPSを添加して光に曝露しない細胞を含めた)。細胞を、暗所にて37℃、5%CO2で48時間インキュベートした後、製造業者の説明書に従ってセルタイターアッセイを実施した。生存細胞によるテトラゾリウム化合物(MTS)の492nmでのその吸光度で測定可能なフォルマザン色素への転換を含む、Promega Cell Titer-96(商標)システムを使用した。C6.5含有PICの場合、SKOV-3細胞を抗原(HER2)陽性細胞系として使用し、KB細胞を抗原陰性細胞系として使用した。
(体内分布実験)
0.1mgの光増感剤を0.5mLのPBSに溶解した。ヨードゲン(Iodogen)で被覆されたチューブ(PierceChemicals)中の0.1mLのPBSに放射能標識化ヨウ素(Na125I、ICN Chemicals)を添加し、放射化させた。放射化ヨウ素-125を光増感剤に移し、室温で5〜10分間反応させた。放射能標識化光増感剤を、ヨウ素化剤を除去するための100%PBSで、続いて10%MeOH/PBSから100%MeOHまで徐々に切り替えて溶離するミニシリカゲルカラムで遊離ヨウ素から分離し、放射能標識化光増感剤を10%MeOH/クロロホルムで溶離した。放射能標識化光増感剤の溶液を、風乾し、2%DMSOを含有するPBS中に再懸濁した。
3種すべての光増感剤の血中クリアランスを図8にプロットする。カチオン性PPaPSは、PPa-PEGに比べてより急速に消失し、その双方ともPPaに比べてより速い。
PS(PPa及びPPa-PEG)をC6scFvへ化学的にカップリングさせ、5LのPBSに対して3回透析して遊離のヨウ素を除去したことを除いて前記のようにヨードゲン法で放射能標識化し、SKOV3腫瘍を有するBALB/cヌードマウス中に上記のように注入した。組織を切開し、上記のように計数した。
腫瘍を放射能について計数し、注入線量/腫瘍組織(g)の%として表現した(図10)。
腫瘍中のPS割合を血中の割合で除算して(グラム対グラム)、標的指向化又は腫瘍内:血液内比率を得た(高いほどより良好)。これを図11にプロットした。高い腫瘍内:血液内比率は、血液(及びその他の組織)中に比べて腫瘍中により多く存在することを意味する。これは、腫瘍内取込み及び血中クリアランスの関数である(図9及び10参照)。
腫瘍を上記のよう確立し、1日目及び4日目に0.2mLの遊離PPa-PEG1(0.1mg=33μM濃度)PSを注入した(マウス尾静脈中に静脈内で)。腫瘍内取込み(図10参照)に基づいて、4時間後に、HPDレーザーを使用して腫瘍を0.5Wで20分間照射した。マウスを事前に麻酔した。レーザー処置は、各薬物サイクルに続いて行った。腫瘍を3週間追跡し、腫瘍サイズの%増加をプロットした(0日目=100%)(図12参照)。
腫瘍(1群マウス6匹)を上記のように確立し、1日目及び4日目に0.2mLのC6-PPa-PEG PIC又は遊離PPa-PEG1 PS(1mg/mL PIC=33μM濃度のscFv又は330μMのPPa-PEG)を注入した。遊離PPa-PEG PSは同一濃度で存在した(0.5mg/mL=375μM)。腫瘍内取込み(図10参照)に基づいて、4時間後に、HPDレーザーを使用して腫瘍を0.5Wで20分間照射した。マウスを事前に麻酔した。レーザー処置は、各薬物サイクルに続いて行った。腫瘍を6週間追跡し、腫瘍サイズの%増加をプロットした(0日目=100%)(図13参照)。
(概観)
ピロフェオフォルビド-aのいくつかのさらなる誘導体を、マクロ環の周辺部付近の官能基の適切な取扱いによって合成し、PBSへの高められた溶解性及び自己凝集のさらなる低減を備えた一連の新規誘導体を提供することができる。これらの誘導体のすべては、金属で触媒されるクロスカップリング反応(薗頭カップリング)を利用してヘキシン酸のような生体分子複合化に適した係留鎖を結合させることができる基を含有する。
空気及び/又は水に敏感な化合物の取扱いは、標準的なシュレンク技術を使用して実施した。DCM及びトリエチルアミンは、CaH2から蒸留することによって乾燥し、無水THFは、ナトリウム/ベンゾフェノンからの蒸留によって得た。その他のすべての試薬は、特記しない限り、市販業者によって供給されるものを使用した。
これは、文献法の組合せ、主として小さな修正を伴う(Chem.Eur.J.2008,14(26),7791〜807)に従って調製された。メチルピロフェオフォルビドa(5)(0.5g、0.9ミリモル)の無水THF(120mL)溶液に、氷酢酸(1.5mL)及び水(1.5mL)を、続いて四酸化オスミウム(3mg、少数の小さな結晶)を添加した。反応混合物を室温で30分間撹拌した後に、澄明ではなかったが、TLC(シリカゲル、5%MeOH/DCM)は、ジヒドロキシル化中間体の形成を示した。さらに30分間撹拌した後、メタ過ヨウ素酸ナトリウムの飽和水溶液(25mL)を、等圧滴下ロートを使用し、ほぼ10mL/hの流速で徐々に添加した。続いて、メタ過ヨウ素酸ナトリウムのさらなる部分(25mL)を直接的に添加し、撹拌を1時間継続した。水(300mL)を添加して反応を止め、水相をジエチルエーテル(3×300mL)で抽出し、合わせた有機抽出物を、飽和重炭酸ナトリウム溶液(200mL)、水(300mL)で逐次的に洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して暗色固体を得た。これを文献法により精製する試みは、十分な成功ではなく、多くの組合せの後に、5%アセトン/DCMの混合物を使用するシリカゲルクロマトグラフィーを利用する精製が、最もよく機能し、所望の生成物が褐色粉末として得られた(0.3g、60%)。この化合物を、文献に従って特徴付けた。
ピロフェオフォルビド-d(32)(165mg、0.3ミリモル)、スルファミン酸(175mg、1.78ミリモル)、2-メチル-2-ブテン(2MのTHF溶液、7.5mL)及び水(0.75mL)の混合物を、アルゴン下に室温で10分間撹拌した。この溶液に、水(0.6mL)に溶解した亜塩素酸ナトリウム(135mg、0.015ミリモル)を10分間にわたって滴加した。添加が完結したら、反応物を室温でさらに30分間撹拌すると、TLC(シリカゲル、5%MeOH/DCM)は、反応が完結したことを示した。反応混合物を、水中(100mL)に注ぎ、クロロホルム(2×100mL)で抽出し、次いで、合わせた有機層を、水(3×)で洗浄し、乾燥(Na2SO4)、蒸発させた。残留物を、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、5%MeOH/DCM)で精製して、褐色固体として純粋な酸(33)を得た(51mg、30%)。Rf 0.25(化合物32はRf 0.61)。UV/Vis (CHCl3) λmax 419, 384, 685, 649, 517, 625。MS ES (m/z) (C33H34N4O5 計算値 566.61) 実測値 567.2607 (M++H)。
(33)(35mg、0.066ミリモル)の撹拌された無水DCM/THF混合物(9:1、10mL)溶液に、アルゴン下で、3,4,5-(トリエチレングリコールモノメチルエーテル)ベンジルアルコール(4)(56.5mg、0.095ミリモル)、ジイソプロピルカルボジイミド(64μL、0.412ミリモル)、DMAP(30mg、0.25ミリモル)、DPTS(71mg、0.24ミリモル)を添加し、ほぼ10分間撹拌した後、無水N-エチルジイソプロピルアミン(39μL、0.223ミリモル)を添加し、撹拌をさらに12時間継続した。反応混合物を蒸発乾固し、残留物をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、10%MeOH/CHCl3)で精製して赤色/褐色オイルとして所望の純粋な(34)を得た(46mg、61%)。Rf 0.43(化合物33はRf 0.34、10%MeOH/CHCl3)。UV/Vis (DCM) λmax 418, 384, 683, 648, 516, 621。MS ES (m/z) (C31H82N4O17 計算値 1142.32) 実測値 1143.5753 (M++H)。更なる実測値 1165.5573 (M++Na)。
撹拌された(34)(40mg、0.035ミリモル)の無水DCM(15mL)溶液に、アルゴン下で、無水ピリジン(28.3μL、0.35ミリモル)、続いて使用に先立って高度真空ポンプで乾燥したピリジニウムペルブロミド(14.5mg、0.045ミリモル)を添加した。反応混合物を室温で撹拌し、その間、反応をUV/Vis分光法で追跡すると、20分間内に完結した。反応混合物を蒸発乾固し、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、5%MeOH/CHCl3)で精製して、赤色/紫色オイルとして純粋な(35)を得た(13mg、30%)。Rf 0.14。UV/Vis (DCM) λmax 417, 388, 686, 521, 565, 627。MS ES (m/z) 1222 (M+) 1245(M++Na,100%)。
メチル3-デビニル-3-カルボキシピロフェオフォルビドa(33)(15mg、0.0272ミリモル)を極めて少量の無水THFに溶解し、アルゴン下に置いた。この溶液に、濃塩酸(10mL)を徐々に添加し、生じる緑色溶液を、遮光して室温で12時間撹拌した。反応混合物を大量の砕氷上に徐々に滴下することによって反応を止めると、着色が観察された。氷/水をクロロホルム(3×50mL)で抽出し、乾燥、蒸発させて、褐色固体を得た(11.2mg、74%)。Rf 0.23(10%MeOH/CHCl3)。UV/Vis (CHCl3) λmax 419, 383, 685, 549, 517, 626。MS ES (m/z) (C32H32N4O5 計算値 553.2451) 実測値 553.2449 (M+)。
無水DCM/THF(9:1)の混合物(5mL)中の3-デビニル-3-カルボキシピロフェオフォルビドa(37)に、アルゴン下で、3,4,5-(トリエチレングリコールモノメチルエーテル)ベンジルアルコール(4)(33.1mg、0.056ミリモル)、ジイソプロピルカルボジイミド(37.4μL、0.241ミリモル)、DMAP(17.7mg、0.145ミリモル)、DPTS(41.6mg、0.141ミリモル)を添加し、ほぼ10分間撹拌した後、無水N-エチルジイソプロピルアミン(22.6μL、0.13ミリモル)を添加し、撹拌をさらに12時間継続した。反応混合物を蒸発乾固し、残留物をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、10%MeOH/CHCl3)で精製して赤色/褐色結晶性固体として所望の純粋な(34)を得た(17.3mg、55%)。Rf 0.43。UV/Vis (DCM) λmax 416, 384, 683, 648, 516, 621。MS ES (m/z) 1706.9 (M+), 1729.9 (M++Na)。
化合物(38)(5mg、0.00293ミリモル)を無水DCM(2mL)に溶解し、アルゴン下に置いた。撹拌されたこの溶液に、無水ピリジン(2.4μL、0.029ミリモル)、続いてピリジニウムペルブロミド(1.2mg、0.0038ミリモル)を添加した。反応混合物を室温で撹拌し、その間、反応をUV/Vis分光法で追跡すると、20分間内に完結した。反応混合物を蒸発乾固し、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、10%MeOH/CHCl3)で精製して、赤色/紫色固体として純粋な(39)を得た(2mg、38%)。Rf 0.14。UV/Vis(DCM)λmax 417、389、687、521、564、627。MS ES (m/z) (C88H127BrN4O29 計算値 1185.8253) 実測値 1185.8661 (M++H)。更なる実測値1231.5673 (M++2Na)。
メソピロフェオフォルビドa(100mg、0.185ミリモル)を無水DCM/20%TFH(10mL)に溶解し、アルゴンの覆いの下に置いた。撹拌されたこの溶液に、N-ヒドロキシスクシンイミド(27mg、0.233ミリモル)、続いてジイソプロピルカルボジイミド(DIC)(37.4μL、0.242ミリモル)を添加し、生じた混合物を遮光して室温で12時間撹拌すると、TLC(シリカゲル、5%MeOH/CHCl3、Rf 0.47)は、活性エステルの存在及びすべての出発原料の消費を示した。この時点で、2倍過剰のプロパルギルアミン(25.6μL、0.373ミリモル)を添加し、撹拌をさらに6時間継続した。TLC(シリカゲル、5%MeOH/CHCl3)は、活性エステルのすべてが消費され、Rf 0.22を有する新たな主要成分が存在することを示した。反応混合物を蒸発させて暗緑色固体を得た。これを、ヘキサンと共に一夜磨り潰し、濾過、乾燥して暗緑色粉末を定量的収率で得た。UV/Vis (DCM) λmax 410, 395, 656, 601, 503, 635。MS ES (m/z) (C36H40N5O2 計算値 574.3182) 実測値 574.3186 (M++H)。
メソピロフェオフォルビドプロパルギルアミド(45)(50mg、0.087ミリモル)を無水DCM(20mL)に溶解し、アルゴン下に置いた。撹拌されたこの溶液に、無水ピリジン(70.5μL、0.871ミリモル)、続いてピリジニウムペルブロミド(36.2mg、0.113ミリモル)を添加した。反応混合物を室温で撹拌し、その間、反応をUV/Vis分光法で追跡すると、20分以内に完結した。反応混合物を蒸発乾固し、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、5%MeOH/CHCl3)で精製して、紫色粉末として純粋な(36)を得た(21mg、37%)。Rf 0.5。UV/Vis (DCM) λmax 415, 668, 549, 611, 516。MS ES (m/z) (C36H39BrN5O2 計算値 652.2287) 実測値 652.2290 (M++H)。
メソピロフェオフォルビドa(100mg、0.185ミリモル)を無水DCM/20%THF(10mL)に溶解し、アルゴンの覆いの下に置いた。撹拌されたこの溶液に、N-ヒドロキシスクシンイミド(27mg、0.233ミリモル)、続いてジイソプロピルカルボジイミド、DIC(37.4μL、0.242ミリモル)を添加し、生じた混合物を遮光して室温で12時間撹拌すると、TLC(シリカゲル、5%MeOH/CHCl3、Rf 0.47)は、活性エステルの存在及びすべての出発原料の消費を示した。この時点で、2倍過剰のN-Boc-1,6-ジアミン(84μL、0.373ミリモル)を添加し、撹拌をさらに6時間継続した。TLC(シリカゲル、5%MeOH/CHCl3)は、活性エステルのすべてが消費され、Rf 0.21を有する新たな主要成分が存在することを示した。反応混合物を蒸発させて暗緑色固体を得た。これを、ヘキサンと共に一夜磨り潰し、濾過、乾燥して暗緑色粉末を得た(95mg、68%)。UV/Vis (DCM) λmax 410, 395, 656, 601, 503, 635。MS ES (m/z) (C36H39N5O2, 計算値 735.4598) 実測値 735.4603 (M++H)。
メソピロフェオフォルビドa N-(6-N'-t-ブトキシカルボニル-アミノヘキシルアミド(59)(65mg、0.088ミリモル)を無水DCM(20mL)に溶解し、アルゴン下に置いた。撹拌されたこの溶液に、無水ピリジン(71.5μL、0.884ミリモル)、続いてピリジニウムペルブロミド(36.8mg、0.115ミリモル)を添加した。反応混合物を室温で撹拌し、その間、反応をUV/Vis分光法で追跡すると、20分間以内に完結した。反応混合物を蒸発乾固し、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、5%MeOH/CHCl3)で精製して、紫色粉末として純粋な(60)を得た(22mg、31%)。Rf 0.46。UV/Vis (DCM) λmax 416, 669, 549, 611, 516。MS ES (m/z) (C44H58BrN6O2 計算値 813.3703) 実測値 813.3706 (M++H)。
メソ5-ブロモピロフェオフォルビドaN-(6-N'-t-ブトキシカルボニル-アミノヘキシルアミド(60)(10mg、0.012ミリモル)を無水DCMに溶解し、TFA(1mL)を添加した。これにより、紫色から緑色へ直ちに変色した(UV/Vis(DCM) 423、662、611、581)。反応混合物を、室温で45分間撹拌し、次いで、飽和重炭酸ナトリウム溶液を添加して中和すると、色は、元の紫色に戻った。TLC(シリカゲル、10%MeOH/CHCl3)は、すべての保護された出発アミン(60)の消費、及びベースライン上のスポットとしての遊離アミンの存在を示した。反応混合物にDCM(100mL)を添加し、逆抽出した。次いで、合わせた有機抽出物を乾燥(Na2SO4)し、蒸発させた。ジエチレントリアミン-五酢酸二無水物caDTPA(2.5mg、0.006ミリモル)を無水DMF(0.5mL)に溶解し、トリエチルアミン(100μL)を添加した。この混合物に、次いで、無水DMF(0.5mL)に溶解したアミンの溶液を滴加した。生じた反応混合物を室温で12時間撹拌し、次いで、水(1mL)を添加し、反応混合物をさらに45分間撹拌した。その後、大量のジエチルエーテルを添加し、混合物を冷蔵庫中に一夜放置した。沈殿した固体を収集し、MeOH、ジエチルエーテル及びDCMで洗浄し、乾燥して紫色粉末を得た(8mg)。この固体に、ピリジン(1.5mL)及びメタノール(1mL)を、続いてGdCl3六水和物(2.8mg、0.0215ミリモル)の水溶液を添加し、室温で12時間撹拌した。溶媒を真空下に45℃で除去した後に、水(2mL)を添加し、混合物を濾過し、水、アセトニトリルで洗浄し、乾燥して紫色固体を得た。UV/Vis (DCM) λmax 417, 669, 549, 611, 516。MS FAB (m/z) 1227.3315。
(9)(10mg、0.0083ミリモル)の無水DCM(2mL)溶液にピリジン(10μL)を添加した。これに、四酸化オスミウム(10mg)を添加し、生じた混合物を、UV/Vis分光法で監視しながら室温で撹拌した。UV/Vis分光法及びTLC(シリカゲル、5%MeOH/CHCl3、Rf 0.38、化合物9はRf 0.5)によって示されるように、反応は6時間以内に完結した。反応混合物中にH2Sガスを5分間吹き込んで未反応のすべてのOsO4を分解することによって反応を止めた。反応物を一夜蒸発乾固させ、次いでDCMに再溶解し、セライトの短い詰め物を通して濾過した。蒸発後の残留物を、クロマトグラフィーで精製して、粘着性紫色固体としてバクテリオクロリン(48)を得た(7.7mg、75%)。UV/Vis (DCM) λmax 367, 714, 532, 667, 417, 500。MS ES (m/z) 1247.51 (M++23, 100%)。
ピロフェオフォルビドd(100mg、0.18ミリモル)の無水THF(15mL)と無水メタノール(15mL)中の溶液に、CsCO3(100mg、0.31ミリモル)及びBestmann-大平試薬(168mg、0.88ミリモル)を添加した。反応物をアルゴン下に室温で撹拌し、UV/Vis分光法で693nmのQ帯ピークが完全に消失するまで(ほぼ5時間)監視した。重炭酸ナトリウム水溶液中に注ぐことによって反応を止め、DCMで抽出した。DCM抽出物を、水で洗浄し、乾燥(Na2SO4)し、濃縮した。粗製物質を、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、7%ジエチルエーテル/DCM)で精製して、光沢のある結晶性固体として所望の化合物を得た(41mg、42%)。Rf 0.3。
UV/Vis (DCM) λmax 412, 675, 616, 510, 638。MS ES (m/z) (C34H35N4O3 計算値 547.2709) 実測値 547.2713 (M++H)。
これは、1-アミノ-4-ペンチンから、類似のN-プロパルギルマレイミドの調製のための方法(PCT国際公開第2006/050192号)を利用して合成した。
標的指向化薬物は、将来のがん治療に関して大きな有望性を保持している。しかし、前臨床(動物)及び臨床研究におけるこれらの分子の実際的評価に関して多くの難題が存在する。適切な生物学的投与量を投与すること、妥当な投与スケジュール、治療に最も応答するであろう患者集団を選択し診断すること、腫瘍の応答を把握及び評価すること(特に、早期指摘)などの問題は、すべて、分子的に標的指向化薬物療法及び「個別化薬剤」の新たな時代において取り組まれる必要がある。
空気及び/又は水に敏感な化合物の取扱いは、標準的なシュレンク技術を使用して実施した。DCM及びトリエチルアミンは、CaH2から蒸留することによって乾燥し、無水THFは、ナトリウム/ベンゾフェノンからの蒸留によって得た。その他のすべての試薬は、特記しない限り、市販業者によって供給されるものを使用した。
PPa(50mg、0.0935ミリモル)の撹拌された氷酢酸(2mL)溶液に、氷酢酸(3mL)に溶解されたMn(OAc)2・4H2O(110mg、0.468ミリモル)を添加し、反応混合物を60℃で2時間加熱すると、UV/Vis分光法は、メタレーションの完結を示し、溶液の色は、澄明鮮緑色に変化した。冷却後、反応混合物を、新鮮な酢酸を使用してコニカルフラスコ(100mL)に移送し、これに大量のヘキサンを添加し、内容物を激しく振盪し、静置した後、ヘキサン層をデカント分離した。この手順を4回繰り返すと、緑色オイル層は顆粒状になった。溶媒としてジエチルエーテルを使用して、この手順を3回繰り返した。双方の手順中に、酢酸の刺激臭が徐々に消失した。得られた緑色固体に、DCM(100mL)を添加し、懸濁液を分液ロートに移し、次いで、水を添加し、激しく振盪した。この手順を、固体の大部分が有機層中に溶解するまで繰り返した。合わせた有機層を蒸発させて、暗緑色非晶性粉末を得た(46mg、76%)。常磁性幅広化のため、NMR分光法を実施することができなかった。UV/Vis (THF) λmax 369, 472, 684, 439, 654, 621, 539。MS ES (m/z) 587 (M+-OAc, 100%)。
マンガン(III)PPa(55)(6mg、0.0093ミリモル)の暗緑色無水THF(5mL)溶液に、N-ヒドロキシスクシンイミド(1.6mg、0.14ミリモル)、続いてDCC(3.83mg、0.187mミリモル)を添加した。生じた混合物を、遮光してアルゴン下に室温で12時間撹拌した。TLC(シリカゲル、20%MeOH/CHCl3)は、(55、Rf 0.31)と(56、Rf 0.25)との間にRfの僅かな相違を示した。反応物を蒸発させて、暗緑色/褐色残留物を最小量のクロロホルムに溶解し、撹拌された大量のヘキサン中に滴下すると、直ちに綿状沈殿物が生じた。これを沈降させ、ヘキサンの大部分をデカントで分離し、新たなヘキサンで置き換え、15分間撹拌し、沈降させ、デカントで分離し、これを全部で4回繰り返した。残っている緑色残留物を乾燥して、緑色個体を得た(5mg、72%)。UV/Vis (THF) λmax 368, 472, 685, 438, 655, 621, 539。MS ES (m/z) 684 (M+-OAc, 100%)。
化合物(10)(9.5mg、0.0078ミリモル)の氷酢酸(2mL)溶液に、Mn(OAc)2・4H2O(9.5mg、0.0039ミリモル)を添加し、生じた混合物を60℃でほぼ2時間加熱した。反応物の色は、暗紫色から鮮緑色に変化し、これは、UV/Visスペクトルに対する劇的変化に関係する。反応物を蒸発させて、残留物を20%MeOH/CHCl3で溶離する短いシリカカラムを通した。得られた粘着性緑色残留物を、ヘキサンで繰り返し洗浄し、乾燥して緑色オイルを得た(8mg、79%)。UV/Vis (MeOH) λmax 373, 690, 685, 472, 645, 587。MS ES (m/z) 1271 (M+-OAc, 100%)。
化合物(57)(5.8mg、0.0043ミリモル)を無水DMF(0.5mL)に溶解し、N-ヒドロキシスクシンイミド(1mg、0.0052ミリモル)及びDCC(1.4mg、0.0065ミリモル)を添加し、反応混合物をアルゴン下に室温で一夜撹拌すると、この間に、若干の沈殿が観察された。反応混合物を高度真空下で蒸発させて、THFで抽出される「くすんだ」緑色残留物を得た。これらの抽出物を合わせ、蒸発させて、緑色の半固体を得た(2.9mg、47%)。UV/Vis(MeOH) λmax 371,693,685,471,646,587.
(方法)
(細胞培養)
2種の異なるヒト由来腫瘍細胞系:SKOV3及びKBを、欧州細胞バンク(European Collection of Cell Cultures)(ECACC)から入手し、10%ウシ胎児血清、ペニシリン及びストレプトマイシン抗生物質(1%)を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中で培養し、75cm2のフラスコ中で70〜90%の集密で継代した。細胞を、加湿した5%CO2雰囲気中に37℃で維持した。
C6.5scFvは、J.Marks教授(カリフォルニア大学、San Francisco)からpUC119で入手し、XL1ブルー細胞中で発現させた(Adamsらの文献、2000)。C6.5scFvは、抗体結合部位中のリシン-100を除去するように遺伝子操作された。このことは、低減された免疫反応性のPICを形成する可能性を低減するはずである(Adamsらの文献、2000)。培養物を上記のように増殖させた。
光増感剤のスクシンイミジルエステルを100%DMSO中に再懸濁し、6%のアセトニトリルを含有するPBS中の52.8μM〜3.3μMの濃度のscFvに添加し、4℃で120分間撹拌を継続した。次いで、光免疫複合体(PIC)を、緩衝液を2回変更してPBSに対して透析し、続いて遠心した。SDS-PAGE分析を実施し、クーマシーブルーで染色した。非染色ゲルを、セミドライブロッティング装置(Biorad)を使用してニトロセルロース上に移行させ、徐々に乾燥した。
細胞を、トリプシン処理し、96-ウェルプレート中にKBについては2×103細胞/ウェルで、SKOV3については3×103細胞/ウェルで播種し、37℃、5%CO2でKBでは2夜、SKOV3では一夜にわたってインキュベートした。次いで、細胞をフェノールレッド不含DMEM中で1回洗浄し、適切に希釈された光増感剤溶液又は光-免疫複合体(DMEM、2%DMSO中)を該当するウェルに、抑制照明下で添加した。対照ウェルにDMEM又はトリトンX-100(1%)を添加した。暗所において37℃、5%CO2で2時間インキュベートした後、細胞をPBSで3回洗浄し、100μLのDMEMを各ウェルに添加した。
造影は、FILM Imperial College LondonにおいてLEICA SP5 MP反転共焦点顕微鏡で、CO2補足雰囲気下に37℃で行った。すべての実験で水浸対物レンズ(63×)を使用した。画像は、Leicaソフトウェア、Image J及びPowerpointを使用して処理した。
光増感剤のフェノールレッド不含DMEM(10%FBS、1%P/S、0.5%DMSO)溶液を、新たに調製し、15分間で37℃まで前以て温めた。細胞を、培地(1×200μL)で洗浄した後、溶液(チャンバー当たり200μL)を添加した。特記しない限り、細胞を、加湿雰囲気(37℃、5%CO2)中で20時間にわたって増殖させた。細胞を、前以て温めたフェノールレッド不含DMEM(2×200μL)で洗浄した。
Lysotracker(登録商標)Green DND-26を製造業者の説明書に従って希釈し(1mM原液)、DMEM(10%FBS、1%P/S)中の作業濃度までさらに2回希釈した。単色染色に使用する場合、これを、DMEM(10%FBS、1%P/S)で1μMの最終濃度に希釈した。光増感剤との2色染色に使用する場合、2μMの溶液を、光増感剤溶液で2回希釈し、1μMの最終濃度を得た。
MitoTracker(登録商標)Greenを製造業者の説明書に従って希釈し(1mM原液)、DMEM(10%FBS、1%P/S)中の作業濃度までさらに2回希釈した。単色染色に使用する場合、これを、DMEM(10%FBS、1%P/S)で1μMの最終濃度に希釈した。光増感剤との2色染色に使用する場合、2μMの溶液を、光増感剤溶液で2回希釈し、1μMの最終濃度を得た。
ER-Tracker(商標)Dreen (BODIPY(登録商標)FLグリベンクラミド)を製造業社の説明に従って希釈し(1mM原液)、HBSS緩衝液(+2%HEPES)中の作業濃度までさらに2回希釈した。単色染色に使用する場合、これを、HBSS(2%HEPES)で3μMの最終濃度に希釈した。光増感剤との2色染色に使用する場合、6μM溶液を、光増感剤溶液で2回希釈し、3μMの最終濃度を得た。
BSAに複合化されたBodipy(登録商標)FL C5-セラミドを、製造業者の説明書に従って希釈し(0.5mM原液)、HBSS緩衝液(+2%HEPES)中の作業濃度までさらに2回希釈した。単色染色に使用する場合、これを、HBSS(2%HEPES)で5μMの最終濃度に希釈した。それを光増感剤との2色染色に使用する場合、10μM溶液を、光増感剤溶液で2回希釈し、5μMの最終濃度を得た。細胞を、4℃で15分、さらに37℃で30分間インキュベートした後、冷たいHBSS/HEPES(3×100μL)で洗浄し、HBSS/HEPES又は光増感剤溶液で置き換え、37℃でさらに30分間インキュベートした後、新たな緩衝液で置き換え、造影した。
基本的なMRI実験は、サンプルのT1緩和測定から構成した。本発明者らは、断熱反転パルスを用いる反転回復パルスシーケンスを使用した。T1緩和度を、標準(水中のオムニスキャンなど)及びサンプル濃縮物と比較した。化合物(56)及び(58)のscFv複合体を上記のように調製し、双方の免疫複合体のUV/Visスペクトル(図25)において、280nmのタンパク質の吸収及びポルフィリンの特徴的な吸収プロファイルの双方を観察できる。Mn複合体(56)は、対応するMn(58)複合体に比べて緩衝液に対する溶解性がより小さく、PPaへのトリPEG基の付加がより水溶性の光増感剤をもたらすという事実を反映している。C6-Mn(56)免疫複合体のゲルは、透析前に35kD付近の帯として複合体の存在を明確に示しでいる(図26)。
(腫瘍細胞系に対するPPa及び新規PPa-誘導体の細胞光毒性)
PPaは、培養中に増殖されたSKOV3及びKB腫瘍細胞系に対して、用量に依存した方式で光毒性がある(図15)。2つの水溶性PPa誘導体の例、PPa-PEG1(化合物11)(図16)及びカチオン性PPa(化合物31C)(図17)も、SKOV3及びKB細胞系に対して、異なる有効性で、単独の光増感剤として光毒性がある。このことは、物理化学的特性を修飾することが、細胞死滅機能の喪失につながらないことを示している。表4に、それらのIC50を示す。化合物(11)は、PPaに比べてより強力である。
化合物(11)を、細胞を標的にすることのできる光免疫複合体としてさらに試験した。抗HER2scFv、C6.5(Adamsらの文献、2007)を発現させ、Bhattiら(2007)の方法中に記載のように精製し、該方法に記載のように(11)に複合させた。結果を図18に示す。(11)は、HER2の標的指向性のためSKOV3腫瘍細胞に対して、ほぼ3倍より強力であることが観察された(IC50は1.1μMから0.3μMに改善された)。HER2で標的指向化されたPPa(Bhattiら、2007)のIC50は、7mM付近であった。したがって、PPaの標的指向化された溶性誘導体は、標的指向化されたPPaに比べてより強力であり、この例では、20倍を超えてより強力であった。
((a)PPaの物理化学的特性の改変は細胞内標的指向性及び光増感剤の局在性を変えることができる)
多くの親油性光増感剤と同様、PPaは、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体などの膜に富む細胞小器官中に集まり、より水性の小胞であるリソソーム中にはより少ない程度まで集まる(Macdonaldらの文献、1999)。文献は、膜-小胞へ、とりわけミトコンドリア及び小胞体(ER)への局在性は、これらの細胞小器官が反応性酸素種による傷害及びそれに続く細胞死により敏感であるので、より強力なPDT機能につながることを示唆している(参考文献108、111及び107)。図19は、2種の例(11)及び(31C)に比較してPPaの局在性を示す。光増感剤の固有の蛍光を追跡している。PPa及び(11)は、強い染色のポケットを伴う拡散性細胞内染色によって示されるように、類似の膜に富む細胞小器官への局在性を示す。正に帯電される(31C)は、エンドソーム(水性区画)への局在性を指摘する、より強調性の染色パターンを有する。
ゴルジ小胞ネットワークは、膜に富み、多くの動的セグメントを含有する。光増感剤の局在性をその固有の蛍光を測定することによって追跡した(図20中で赤色として観察される)。同時に、ボディピーセラミド色素を使用して腫瘍細胞を対比染色した。この色素は、ゴルジ細胞小器官に対する確立されたマーカーであり、図20中で緑色として観察される。共局在の研究は、PPa及び(11)に対してかなりの黄色染色を示し、ゴルジ体への局在性を示し、一方、正に帯電される(31C)は、極めて少ない黄色染色を示し、ゴルジ網への極めて低い局在性を示している(図20)。
ミトコンドリア細胞小器官は、高度に膜に富む構成要素であり、しばしば固有の経路を介する細胞アポトーシスのための開始中枢と見なされる。光増感剤の局在性をその固有の蛍光を測定することによって追跡した(図21中で赤色として観察される)。同時に、ミトトラッカー色素を使用して腫瘍細胞を対比染色した。この色素は、ミトコンドリア細胞小器官に対する確立されたマーカーであり、図21中で緑色として観察される。共局在の研究は、PPa及び(11)に対してかなりの黄色染色を示し、かなりのミトコンドリアへの局在性を示し、一方、正に帯電される(31C)は、極めて少ない黄色染色を示し、ミトコンドリアへの極めて低い局在性を示している(図21)。
リソソーム細胞小器官は、膜に乏しいに細胞構成要素であり、タンパク質分解のための水性区画を含有する。光増感剤の局在性をその固有の蛍光を測定することによって追跡した(図22中で赤色として観察される)。同時に、リソトラッカー色素を使用して腫瘍細胞を対比染色した。この色素は、リソソーム細胞小器官に対する確立されたマーカーであり、図22中で緑色として観察される。
小胞体(ER)細胞小器官ネットワークは、高度に膜に富む構成要素である。光増感剤の局在性をその固有の蛍光を測定することによって追跡した(図23中で赤色として観察される)。同時に、ERトラッカー色素を使用して腫瘍細胞を対比染色した。この色素は、ER細胞小器官に対する確立されたマーカーであり、図23中で緑色として観察される。
皮膚光感受性は、PDTにおいて解決すべき重要問題である。フォスキャンなどの確立された化合物は、かなりの皮膚光感受性を示す(参考文献109)。マウスモデルにおいて、フォスキャンを臨床用量で投与し、化合物11、及び化合物11の光免疫複合体と比較した(参考文献109)。皮膚光感受性を、尺度1〜4に従って観察することによって4日間にわたって監視した(図24)。フォスキャンは、かなりの皮膚光感受性を引き起こすことが観察され、一方、(11)及びその複合体は、ほとんど又は全く皮膚感受性を示さなかった(図24)。この結果は、本発明者らによるPPa新規誘導体は、改善された前臨床特性を有することを示唆している。
Claims (72)
- 式Iの化合物、或いは医薬として許容し得るその塩若しくは溶媒和物、又は医薬としての機能を有するその誘導体
bが二重結合を表す場合、Dは、-CH2-又はQを表し、Ra及びRbは双方とも存在せず;
bが単結合を表す場合、Dは、-C(O)-、-CH2-又はQを表し、Ra及びRbは、双方ともHであるか、又は双方とも-OHであり;
R1が、H、或いはカルボキシル、ヒドロキシル、アミノ又はチオール基と反応することができる官能基を含有する部分を表す場合、
R2は、H又は可溶化基を表すか;或いは
R1が、H又は可溶化基を表す場合、
R2は、H、或いはカルボキシル、ヒドロキシル、アミノ又はチオール基と反応することができる官能基を含有する部分を表し;
Gは、O又は直接結合を表し;
Qは、式Ig又はIhの構造フラグメントを表す)
- R1がH、或いはカルボキシル、ヒドロキシル、アミノ又はチオール基と反応することができる官能基を含有する部分を表し、且つR2がH又は可溶化基を表す、請求項1記載の化合物。
- R1が、H、-(CH2)t-X、-(CH2)u-C(R3)=C(R4)-(CH2)v-X、又は-(CH2)w-C≡C-(CH2)x-Xを表し;
tが、1〜20を表し;
uとvとの和が、2〜6であり;
wとxとの和が、2〜15であり;
Xが、-C(O)-L1、-OH、スルホニルエステル、-NO2、-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、マレイミジル、アリール、又はヘテロアリール(後の2つの基は、-C(O)-L1、-OH、スルホニルエステル、-NO2、-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、及びマレイミジルから選択される1つ以上の基で置換されている)を表し;
L1が、-OH、又は適切な脱離基を表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官能基を表し;
R2が、H、1つ以上の-C(O)O-E+基、-SO3 -E+基、第4級アンモニウム塩、ピリジニウムイオン又は直鎖若しくは分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100である)で独立に置換されたアルキル、シクロアルキル、アルキレニル、アルキニル、アリール、ベンジル、ヘテロアリール(ここで、後の3つの基は、-OH、-NH2、又は1つ以上のハロ原子で置換されたC1〜C6アルキルから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)を表すか、
或いはR2が、-NR6(R7)又は-N(R6a)-(CH2)z-SO3 -E+を表し;
R3〜R5及びR3aが、独立に、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表し;
R6及びR7が、R6及びR7の少なくとも一方はHでないとの条件で、独立に、H、アルキニル、ピリジニウムイオン、-(CH2)z-NR8(R9)、又は-(CH2)z-N+R8(R9)(R10)A-を表し;
R6aが、H、又は-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表し;
zが、1〜20を表し;
R8〜R10が、独立に、H、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、又はヘテロアリールを表し;
E+が、適切なカチオン基を表し;
A-が、適切なアニオン基を表す、請求項1又2記載の化合物。 - R1が、-(CH2)u-C(R3)=C(R4)-(CH2)v-X又は-(CH2)w-C≡C-(CH2)x-Xを表し;
wとxとの和が2〜10であり;
Xが、-C(O)-L1、-OH、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、マレイミジル、アリール、又はヘテロアリール(後の2つの基は、-C(O)-L1、-OH、スルホニルエステル、-NO2、-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、及びマレイミジルから選択される1つ以上の基で置換されている)を表し;
L1が、-OH又は-O-C(O)-R5を表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官能基を表し;
R2が、1つ以上の直鎖若しくは分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100である)で独立に置換されたアルキル、シクロアルキル、アルキレニル、アルキニル、アリール、ベンジル、ヘテロアリール(ここで、後の3つの基は、-OH、-NH2、又は1つ以上のハロ原子で置換されたC1〜C6アルキルから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)を表すか、
或いはR2が、-NR6(R7)又はN(R6a)-(CH2)z-SO3 -E+を表し;
R6及びR7が、R6及びR7の少なくとも一方がHでないとの条件で、独立に、-(CH2)z-NR8(R9)又は-(CH2)z-N+R8(R9)(R10)A-を表し;
R6aが、H、又は-OH若しくはハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C3アルキルを表し;
zが、1〜10を表し;
R8〜R10が、独立に、H、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいアルキル又はアルケニルを表し;
A-が、I-、Cl-、Br-を表す、請求項1〜3のいずれか一項記載の化合物。 - R1が、-(CH2)wC≡C-(CH2)x-Xを表し;
wとxとの和が2〜10であり;
Xが、-C(O)-L1、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、又はマレイミジルを表し;
L1が、-OHを表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官能基を表し;
R2が、1つ以上の直鎖若しくは分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100である)で独立に置換されたアリール、ベンジル、ヘテロアリール(ここで、後の3つの基は、-OH、-NH2、又は1つ以上のハロ原子で置換されたC1〜C6アルキルから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)を表すか、
或いはR2が、-NR6(R7)又は-N(R6a)-(CH2)z-SO3 -E+を表し;
R6及びR7が、R6及びR7の少なくとも一方がHではないとの条件で、独立に、-(CH2)z-NR8(R9)又は-(CH2)z-N+R8(R9)(R10)A-を表し;
R6aが、Hを表し;
zが、1〜10を表し;
R8〜R10が、独立に、H、又は-OH若しくはハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいアルキルを表し;
A-が、I-、Cl-、Br-を表す、請求項1〜4のいずれか一項記載の化合物。 - R1が、-(CH2)w-C≡C-(CH2)x-Xを表し;
wとxとの和が2〜10であり;
Xが、-C(O)-L1、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、又はマレイミジルを表し;
L1が、-OHを表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官能基を表し;
R2が、1つ以上の直鎖若しくは分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100である)で独立に置換されたアリール、ベンジル、ヘテロアリール(ここで、後の3つの基は、-OH、-NH2、又は1つ以上のハロ原子で置換されたC1〜C6アルキルから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)を表す、請求項1〜5のいずれか一項記載の化合物。 - R1が、-(CH2)w-C≡C-(CH2)x-Xを表し;
wとxとの和が2〜10であり;
Xが、-C(O)-L1、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、又はマレイミジルを表し;
L1が、-OHを表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官能基を表し;
R2が、-NR6(R7)を表し;
R6及びR7が、R6及びR7の少なくとも一方がHではないとの条件で、独立に、-(CH2)z-NR8(R9)又は-(CH2)z-N+R8(R9)(R10)A-を表し;
zが、1〜10を表し;
R8〜R10が、独立に、H、又は-OH若しくはハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいアルキルを表し;
A-が、I-、Cl-、Br-を表す、請求項1〜6のいずれか一項記載の化合物。 - R1が可溶化基を表し、且つR2が、カルボキシル、ヒドロキシル、アミノ又はチオール基と反応することができる官能基を含有する部分を表す、請求項1記載の化合物。
- R1が、式Ia、Ib、Ic、Id、Ie、Ifの構造フラグメント
R1が、-(CH2)t-Z、-(CH2)u-C(R3)=C(R4)-(CH2)v-Z、又は-(CH2)w-C≡C-(CH2)x-Zを表し、
R11が、H、アルキル(-OH、ハロ、及び直鎖若しくは分枝エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100である)から選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)、又は直鎖若しくは分枝エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100である)を表し;
R12〜R14が、独立に、H、又は-OH、ハロ及び直鎖若しくは分枝エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100である)から選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表し;
Y-が、任意の適切なアニオン基を表し;
tが、1〜20を表し;
uとvとの和が、2〜6であり;
wとxとの和が、2〜15であり;
Zが、-C(O)O-E+、-SO3 -E+、第4級アンモニウム塩、式Ia〜Ifの構造フラグメントを表すか、或いはZが、1つ以上の-C(O)O-E+基、-SO3 -E+基、第4級アンモニウム塩、ピリジニウムイオン、又は直鎖若しくは分枝のオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基(ここでオリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100である)で置換されたアリール、ベンジル、ヘテロアリール(ここで、後の3つの基は、-OH、-NH2、又は1つ以上のハロ原子で置換されているC1〜C6アルキルから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)を表し;
E+が、任意の適切なものを表し;
R2が、-C(O)-L3、-OH、スルホニルエステル、-NO2、-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、マレイミジル、アリール、又はヘテロアリール(後の2つの基は、-C(O)-L1、-OH、スルホニルエステル、-NO2、-CHO、-N3、-CN、-SH、-NHR3a、ハロ、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル及びマレイミジルから選択される1つ以上の基で置換されている)を表し;
L3が、-OH又は適切な脱離基を表すか、或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官能基を表し;且つ
R15が、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表す、請求項1又8記載の化合物。 - R1が、先に定義した通りの式Ia、Ib、Ic、Id、Ie、Ifの構造フラグメントを表し;
R11が、H、アルキル(-OH、ハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよい)、又は直鎖若しくは分枝エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100である)を表し;
R12〜R14が、独立に、H、又は-OH、ハロ及び直鎖若しくは分枝エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は2〜100である)から選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表し;
Y-が、I-、Br-、又はCl-を表し;
R2が、-C(O)-L3、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、又はマレイミジルを表し;
L3が、-OH又は-O-C(O)-R15、ハロ、1-オキシベンゾトリアゾイルなどの活性化されたエステル、又はニトロ、フルオロ、クロロ、シアノ及びトリフルオロメチルから選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよいアリールオキシ基を表すか、
或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官能基を表し;
R15が、-OH及びハロから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表す、請求項1、8又は9のいずれか一項記載の化合物。 - R1が、先に定義した通りの式Ia、Ib、Ic、Id、Ie、Ifの構造フラグメンを表し;
R11が、アルキル、又は直鎖若しくは分枝エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は約3〜約20である)を表し;
R12〜R14が、独立に、H、又は-OH、ハロ及び直鎖若しくは分枝エチレンオキシ基(ここで、オリゴ若しくはポリ-エチレンオキシ基の総数は約3〜約20である)から選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表し;
Y-が、I-、Br-、又はCl-を表し;
R2が、-C(O)-L3、ホスホルアミジチル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、フルオロフェニルエステル、イソチオシアナト、ヨードアセトアミジル、又はマレイミジルを表し;
L3が、-OH又は-O-C(O)-R15を表すか、
或いは-C(O)-L1が、カルボジイミドで活性化されるカルボン酸官能基を表し;
R15が、-OHから選択される1つ以上の基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルを表す、請求項1、又は8〜10のいずれか一項記載の化合物。 - bが、二重結合を表し、且つDが-CH2-を表すか;或いは
bが、単結合を表し、且つDが-C(O)-又は-CH2-を表す、請求項1〜10のいずれか一項記載の化合物。 - 抗体或いはそのフラグメント又は誘導体にカップリングされた請求項1〜15のいずれか一項記載の化合物を含む、光増感物質を含む化合物。
- 担体分子にカップリングされた請求項1〜15のいずれか一項記載の式Iの化合物を含む光増感物質を含む化合物の製造方法であって、
(i)式Iの化合物を含む光増感物質を提供する工程;
(ii)担体分子を提供する工程;
(iii)光増感物質と担体分子とを第1及び第2の極性非プロトン性溶媒及び水性緩衝液の存在下で複合する工程;を含む、前記製造方法。 - 前記化合物が、少なくとも3:1である式Iの化合物の担体分子に対する比率を含む、請求項17記載の製造方法。
- 前記化合物が、5:1〜40:1である式Iの化合物の担体分子に対する比率を含む、請求項18記載の製造方法。
- 前記光増感物質及び担体分子の機能的及び物理的特性が、カップリングの後に実質的に不変である、請求項17〜19のいずれか一項記載の製造方法。
- 前記第1及び第2の極性非プロトン性溶媒が、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、HMPA、ジオキサン、テトラヒドロフラン(THF)、二硫化炭素、グライム及びジグライム、2-ブタノン(MEK)、スルホラン、ニトロメタン、N-メチルピロリドン、ピリジン、並びにアセトンからなる群から選択される、請求項17〜20のいずれか一項記載の製造方法。
- 前記第1及び第2の極性非プロトン性溶媒が、DMSO、DMF、及びアセトニトリルからなる群から選択される、請求項21記載の製造方法。
- 前記第1及び第2の非プロトン性溶媒が、DMSO及びアセトニトリルである、請求項22記載の製造方法。
- 水性緩衝液と第1非プロトン性溶媒と第2非プロトン性溶媒との比率が、ほぼ50%:1〜49%:49〜1%である、請求項17〜23のいずれか一項記載の製造方法。
- 前記比率が、92%PBS:2%DMSO:6%アセトニトリルである、請求項24記載の製造方法。
- 光増感物質と担体分子とを複合する前記工程が、0℃〜30℃の温度で実施される、請求項17〜25のいずれか一項記載の製造方法。
- 前記温度が、0℃〜25℃である、請求項26記載の製造方法。
- 前記温度が、0℃〜5℃である、請求項27記載の製造方法。
- 光増感物質と担体分子とを複合する前記工程が、ほぼ30分間実施される、請求項17〜28のいずれか一項記載の製造方法。
- 前記担体分子が、抗体、そのフラグメント及び/又は誘導体である、請求項17〜28のいずれか一項記載の製造方法。
- 前記抗体フラグメント及び/又は誘導体が、単鎖抗体である、請求項30記載の製造方法。
- 前記単鎖抗体が、scFvである、請求項31記載の製造方法。
- 前記抗体、そのフラグメント及び/又は誘導体が、ヒト化されているか、又はヒトのものである、請求項30〜32のいずれか一項記載の製造方法。
- 光増感物質と担体分子とを複合する前記工程が、250μg/mL〜10mg/mLの担体分子の濃度で実施される、請求項17〜33のいずれか一項記載の製造方法。
- 担体分子の前記濃度が、1mg/mL〜10mg/mLである、請求項34記載の製造方法。
- 担体分子の前記濃度が、約5mg/mLである、請求項35記載の製造方法。
- 工程(iii)の後に実施される下記工程:
(iv)担体分子に、光増感物質の機能を調節する能力を有する調節性物質をカップリングさせる工程
をさらに含む、請求項17〜36のいずれか一項記載の製造方法。 - 前記調節性物質が、安息香酸、アジド基を含有する安息香酸、4-アジドテトラフルオロフェニル安息香酸、アジド部分を有する芳香族基を含有する安息香酸、アジド部分を有するヘテロ芳香族基を含有する安息香酸、ビタミンE類似体、トロロクス、ブチルヒドロキシルトルエン、没食子酸プロピル、デオキシコール酸、ウルサデオキシコール酸からなる群から選択される、請求項38記載の方法。
- 前記芳香族基又はヘテロ芳香族基が、ポリフルオロベンゼン、ナフタリン、ナフタキノン、アントラセン、アントラキノン、フェナントレン、テトラセン、ナフタセンジオン、ピリジン、キノリン、イソキノリン、インドール、イソインドール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピラジン、ベンズイミダゾール、ベンゾフラン、ジベンゾフラン、カルバゾール、アクリジン、アクリドン、フェナントリジン、キサンチン、キサントン、フラボン、クマリン、及びそれらのスルフェネートからなる群から選択される、請求項38記載の方法。
- 工程(iii)又は(iv)の後に実施される下記工程:
(v)前記化合物を医薬として許容し得る担体と合わせて医薬製剤を形成する工程
をさらに含む、請求項17〜39のいずれか一項記載の製造方法。 - 前記担体分子にカップリングされた光増感物質間の距離が、3.5オングストローム〜25nmである、請求項17〜40のいずれか一項記載の製造方法。
- 前記担体分子にカップリングされた光増感物質間の距離が、20〜25nmである、請求項41記載の製造方法。
- 工程(v)の前に実施される、可視化剤を前記担体分子、光増感物質、又はそれらの複合体にカップリングさせる工程をさらに含む、請求項17〜42のいずれか一項記載の製造方法。
- 前記可視化剤が、蛍光色素又は発光色素である、請求項43記載の製造方法。
- 前記可視化剤が、MRI用造影剤である、請求項43記載の製造方法。
- 請求項16〜44のいずれか一項記載の方法によって得ることのできる化合物。
- 前記光増感物質が、担体分子に少なくとも3:1のカップリング比率でカップリングされる、請求項46記載の化合物。
- 前記光増感物質及び担体分子の機能的及び物理的特性が、非カップリング形態の場合の特性に比較して、カップリングした形態において実質的に不変である、請求項46又は47記載の化合物。
- 前記担体分子が、抗体、そのフラグメント及び/又は誘導体、或いは非免疫原性ペプチドリガンドからなる群から選択される、請求項46〜48のいずれか一項記載の化合物。
- 前記抗体、そのフラグメント及び/又は誘導体が、単鎖抗体フラグメントである、請求項49記載の化合物。
- 前記単鎖抗体が、scFvである、請求項50記載の化合物。
- 前記抗体、そのフラグメント及び/又は誘導体が、ヒト化されているか、又はヒトのものである、請求項49〜51のいずれか一項記載の化合物。
- 前記光増感物質が、担体分子に、該担体分子上のアミノ酸残基又は糖分子の位置でカップリングされる、請求項46〜52のいずれか一項記載の化合物。
- 前記アミノ酸残基が、リシン、システイン、チロシン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、及びアルギニンからなる群から選択される、請求項53記載の化合物。
- 前記糖分子が、ヒドロキシル基を含む糖、アルデヒド基を含む糖、アミノ基を含む糖、カルボン酸基を含む糖からなる群から選択される、請求項53記載の化合物。
- 前記担体分子にカップリングされた光増感物質間の距離が、3.5オングストローム〜25nmである、請求項46〜55のいずれか一項記載の化合物。
- 前記担体分子にカップリングされた光増感物質間の距離が、20〜25nmである、請求項55記載の化合物。
- 前記光増感物質の機能を調節する能力を有する調節性物質をさらに含む、請求項46〜57のいずれか一項記載の化合物。
- 前記調節性物質が、安息香酸、アジド基を含有する安息香酸、4-アジドテトラフルオロフェニル安息香酸、アジド部分を有する芳香族基を含有する安息香酸、アジド部分を有するヘテロ芳香族基を含有する安息香酸、ビタミンE類似体、トロロクス、ブチルヒドロキシルトルエン、没食子酸プロピル、デオキシコール酸、ウルサデオキシコール酸からなる群から選択される、請求項58記載の化合物。
- 前記芳香族基又はヘテロ芳香族基が、ポリフルオロベンゼン、ナフタリン、ナフタキノン、アントラセン、アントラキノン、フェナントレン、テトラセン、ナフタセンジオン、ピリジン、キノリン、イソキノリン、インドール、イソインドール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピラジン、ベンズイミダゾール、ベンゾフラン、ジベンゾフラン、カルバゾール、アクリジン、アクリドン、フェナントリジン、キサンチン、キサントン、フラボン、クマリン、及びそれらのスルフェネートからなる群から選択される、請求項59記載の化合物。
- さらに、可視化剤を含む、請求項46〜60のいずれか一項記載の化合物。
- 前記可視化剤が、蛍光色素又は発光色素である、請求項61記載の化合物。
- 前記可視化剤が、MRI用造影剤である、請求項61記載の化合物。
- 前記担体分子がscFvであり、且つ前記光増感物質が、請求項1〜15のいずれか一項記載の化合物から選択される、請求項26〜44のいずれか一項記載の化合物。
- 標的細胞の破壊を必要とする疾患の診断及び/又は治療及び/又は予防における、請求項16又46〜64のいずれか一項記載の化合物の使用。
- 標的細胞の破壊を必要とする疾患の診断及び/又は治療及び/又は予防のための薬剤の製造における、請求項16又は46〜64のいずれか一項記載の化合物の使用。
- 標的細胞の破壊を必要とする疾患の診断及び/又は治療及び/又は予防で使用するための、請求項16又は46〜64のいずれか一項記載の化合物。
- 治療すべき前記疾患が、がん、加齢性黄斑変性症、免疫障害、心血管疾患、及びウイルス、細菌又は真菌感染症を含む微生物感染症、BSEなどのプリオン病、並びに歯肉炎などの口腔/歯科疾患からなる群から選択される、請求項65〜67のいずれか一項記載の使用又は化合物。
- 治療すべき前記疾患が、結腸、肺、***、頭頸部、脳、舌、口腔、前立腺、精巣、胃/消化管、膀胱のがん、並びにバレット食道などの前がん病変である、請求項68記載の使用又は化合物。
- 疾患の診断が、光増感物質又は任意選択の可視化剤の可視化によって実施される、請求項65〜69のいずれか一項記載の使用又は化合物。
- 前記化合物が、光線曝露に先立って患者に投与される、請求項65〜70のいずれか一項記載の使用又は化合物。
- 請求項1〜15、又は46〜64のいずれか一項記載の化合物、及び医薬として許容し得る担体、賦形剤又は希釈剤を含む医薬組成物。
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