ES2743458T5 - Eliminación fotocontrolada de dianas in vitro e in vivo - Google Patents

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Description

DESCRIPCIÓN
Eliminación fotocontrolada de dianas in vitro e in vivo
Campo
Esta solicitud se refiere a conjugados de IR700 y métodos de su uso para eliminar (por ejemplo, separar o aislar) un agente diana in vivo o in vitro. Por ejemplo, los métodos y conjugados de IR700 divulgados proporcionan formas fotocontroladas para controlar la farmacocinética de un fármaco in vivo, y se puede usar para eliminar agentes no deseados de muestras ambientales o de alimento o para aislar moléculas diana en un laboratorio.
Antecedentes
La separación de biomoléculas de mezclas complejas es deseable en muchas aplicaciones, incluyendo la eliminación de toxinas, patógenos o fármacos de un sujeto in vivo, o de otras muestras in vitro. Además, muchas técnicas in vitro, incluyendo métodos de diagnóstico, monitorización ambiental o técnicas de investigación se basan en la separación o el aislamiento de moléculas de mezclas complejas. Con las tecnologías actuales, es difícil de modificar, aislar y/o eliminar una biomolécula seleccionada entre una mezcla de biomoléculas en entornos tales como soluciones, células y organismos completos.
Sumario de la divulgación
Con las tecnologías actuales, es difícil aislar y eliminar una proteína seleccionada u otra molécula diana entre una mezcla de proteínas en entornos tales como soluciones, células y organismos completos. Los métodos divulgados aquí pueden eliminar o aislar una molécula marcada con IR700 o un grupo de moléculas asociadas con la molécula marcada con IR700 (por ejemplo, complejo de IR700-anticuerpo-antígeno). El IRDye700DX (IR700) de ftalocianina, cuando se conjuga con un agente de unión específico (por ejemplo, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, hapteno, proteína, molécula de ácido nucleico, ácido nucleico funcional y similares) se usa para marcar agentes diana mediante la unión entre el agente de unión específico y la diana. De modo similar, cuando IR700 se conjuga a una molécula, tal como un agente farmacológico o fármaco, permite controlar la eliminación del agente, por ejemplo en un sujeto. Tras la exposición a la luz infrarroja cercana (NIR) (por ejemplo, 690 nm /- 20 nm), el colorante IR700 se escinde, cambiando la molécula de hidrófila a hidrófoba, y dando como resultado la agregación de la molécula. Esto permite la eliminación de la diana de una solución, célula o un organismo. Es más, este cambio puede afectar a la diana unida al complejo de IR700-agente de unión específico, en donde la diana (por ejemplo, proteína) puede perder su función y formar agregados en solución, dañar una membrana celular e inducir citotoxicidad en las células a las que está unida la diana o dar como resultado la eliminación de dichas células, por ejemplo, por macrófagos en el hígado.
En el presente documento se proporcionan métodos in vitro, ex vivo, e in vivo para eliminar, tal como aislar o separar, una o más moléculas diana o agentes de una muestra o un sujeto. Por ejemplo, el método puede permitir la eliminación o separación de proteínas, péptidos, lectinas, carbohidratos, metales (tales como metales pesados), moléculas de ácido nucleico, moléculas orgánicas pequeñas, fármacos, patógenos (por ejemplo, virus, bacteria, parásito u hongo) y células. Sin embargo, según la invención, el método permite la eliminación de una molécula diana seleccionada de una proteína, péptido, lecitina, carbohidrato, metal, molécula de ácido nucleico, molécula orgánica pequeña, fármacos, fármaco recreativo, agente farmacológico, quimioterapéutico, agente biológico, antibiótico, fármaco antihipertensivo, antidepresivo, analgésico, hormona reproductiva, anticoagulante, esteroide, estatina, patógeno o espora. En algunos ejemplos, el método también incluye detectar la diana eliminada. Por ejemplo, los métodos se pueden usar para eliminar agentes no deseados (tales como impurezas, metales, organismos patógenos, esporas y similares) de un proceso de fabricación (tal como un proceso de fabricación de fármacos), por ejemplo, para mejorar un proceso de purificación. De modo similar, los métodos se pueden usar para eliminar patógenos, toxinas, esporas o metales de una fuente o muestra ambiental, o de una muestra o artículo de alimento. Además, los métodos divulgados se pueden usar para controlar la farmacocinética de un fármaco in vivo, tal como la administración controlada de fármacos, por ejemplo, eliminando un fármaco de un paciente in vivo. En otro ejemplo, los métodos se pueden usar para eliminar agentes no deseados in vivo, por ejemplo, eliminando un material potencialmente peligroso o venenoso En algunos ejemplos, estos métodos se usan en combinación con aféresis, por ejemplo, para eliminar una diana (por ejemplo, célula diana) de la sangre, o en combinación con un método que usa un órgano aislado vascularmente para la perfusión. Además, se pueden usar los métodos ex vivo, por ejemplo, para aislar o eliminar dianas (por ejemplo, células) de una muestra, tal como una muestra de sangre, muestra de médula ósea o cultivo de tejido.
En el presente documento se proporcionan métodos para eliminar (por ejemplo, aislar o separar) una diana de una muestra. Dichos métodos pueden incluir poner en contacto la muestra con un conjugado de IR700-molécula, en donde la molécula conjugada con el IR700 es un agente de unión específico (por ejemplo, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, hapteno, proteína, molécula de ácido nucleico, ácido nucleico funcional, y similares) que se une preferentemente a la diana. La muestra se incuba con el conjugado de IR700-molécula en condiciones que permitan que la diana se una a la molécula del conjugado de IR700-molécula, dando como resultado un complejo de dianaconjugado de IR700-molécula. La muestra se irradia con luz NIR, por ejemplo, a una longitud de onda de 660 a 710 nm a una dosis de al menos 1 J cm-2 en condiciones suficientes para generar un complejo de diana-conjugado de IR700-molécula hidrófobo. Por ejemplo, la irradiación del complejo de diana-conjugado de IR700-molécula escinde o elimina una porción del IR700, cambiando el complejo de diana-conjugado de IR700-molécula de un complejo de diana-conjugado de IR700-molécula hidrófilo a hidrófobo.
A continuación, la muestra se incuba en condiciones que permitan que el complejo de diana-conjugado de IR700-molécula hidrófobo se agregue. Por ejemplo, la muestra se puede hacer reaccionar o mezclarse en condiciones que permitan que se forme el agregado o precipitado, que en algunos ejemplos se acumula o deposita en el fondo de un recipiente. En algunos ejemplos, la muestra se centrifuga para recoger el agregado resultante. El complejo de dianaconjugado de IR700-molécula hidrófobo se elimina o separa de la muestra, eliminando, aislando o separando así la diana de la muestra. En algunos ejemplos, el método también incluye detectar o medir la diana eliminada de la muestra. En algunos ejemplos, el método también incluye detectar otras moléculas (tales como otras proteínas, ácidos nucleicos, lectinas, carbohidratos, etc.) unidas a la diana. En algunos ejemplos, el método incluye eliminar células no deseadas de un cultivo celular (2D o 3D), como por ejemplo en la regeneración de tejidos.
También se proporcionan métodos in vivo que se pueden usar para eliminar una molécula diana de. una proteína, péptido, lecitina, carbohidrato, metal, molécula de ácido nucleico, molécula orgánica pequeña, fármacos, fármaco recreativo, agente farmacológico, quimioterapéutico, agente biológico, antibiótico, fármaco antihipertensivo, antidepresivo, analgésico, hormona reproductiva, anticoagulante, esteroide, estatina, patógeno o espora de un sujeto, como un mamífero. En algunos ejemplos, los métodos incluyen administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado de IR700-molécula, en donde la molécula conjugada con el IR700 incluye la molécula diana (por ejemplo, un agente farmacológico) o en donde el conjugado de IR700-molécula se une específicamente a la molécula diana (por ejemplo, incluye IR700 conjugado con un agente de unión específico). El sujeto se irradia con luz NIR en condiciones suficientes para escindir o eliminar una porción del IR700, cambiando el conjugado de IR700-molécula o el complejo de diana-conjugado de IR700-molécula de hidrófilo a hidrófobo. Los ejemplos de dichas condiciones incluyen la irradiación a una longitud de onda de 660 a 710 nm, por ejemplo a una dosis de al menos 10 J cirr2. Por ejemplo, la irradiación puede ser realizada por un dispositivo que lleva puesto el sujeto, en donde el dispositivo incluye un diodo emisor de luz (LED) NIR. Dichos dispositivos pueden incluir una prenda de vestir, joyas, o una cubierta, que pueden incluir además fuentes de energía y/o refrigeración. Se permite que el conjugado de IR700-molécula hidrófobo o el complejo de diana-conjugado IR700-molécula se agregue y se elimine del sujeto (por ejemplo, a través del hígado y/o el bazo), eliminando así la molécula diana del sujeto. El método también puede incluir detectar una disminución en la cantidad de la molécula diana en el sujeto (por ejemplo, realizando un análisis de sangre que permita la detección de la diana, tal como un inmunoensayo, hibridación, secuenciación de ácidos nucleicos o ensayo PCR).
Las características anteriores y otras de la divulgación serán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de varias realizaciones que procede con referencia a las figuras adjuntas.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 es un dibujo esquemático que muestra el resultado de exponer el IR700 a la luz NIR. Después de esta exposición, se escinde una porción de IR700. El compuesto restante (la porción más grande) es "superhidrófobo", lo que conduce a su agregación.
La figura 2 es un dibujo esquemático que muestra IR700 marcado con un anticuerpo (Ab), que cuando se expone a la luz NIR, la porción rodeada por un círculo de IR700 se escinde. El compuesto resultante (porción sin círculo) es "superhidrófobo", lo que conduce a la agregación del anticuerpo (y cualquier cosa unida al anticuerpo). Este agregado no se disocia después del tratamiento con SDS (véase la figura 9).
La figura 3 es un dibujo esquemático que muestra una membrana celular básica, con un complejo de anticuerpos unido a una proteína de superficie. El anticuerpo se puede conjugar con IR700. Después de la exposición a NIR, los IR700 unidos al anticuerpo se modifican químicamente induciendo hidrofobicidad, lo que destruye la integridad de la membrana celular conduciendo a daño en la membrana.
La figura 4 es una imagen digital de una imagen de fluorescencia de un gel de electroforesis SDS-PAGE (arriba) y un gel azul de Coomassie (abajo). Ambos muestran el conjugado Pan-IR700 antes (sin luz NIR) y después de la exposición a la luz NIR. Como se muestra en el gel superior, los conjugados Pan-IR700 formaron agregados y la fluorescencia se extinguió, pero no se mostró fluorescencia aparte de la proteína (sin liberación de IR700 como molécula pequeña). La banda azul de Pan-IR700 muestra que existe una ruptura del complejo Pan-IR700 después de la exposición a la luz NIR (LED o láser).
La figura 5 proporciona imágenes fluorescentes digitales que muestran que, a pesar de la escisión de IR700 después de la exposición a la luz NIR, el componente fluorescente de la molécula no resulta afectado.
La figura 6 es una imagen digital de una imagen de fluorescencia de un gel de electroforesis SDS-PAGE (arriba) y un gel azul de Coomassie (abajo). Ambos muestran el conjugado Pan-IR700 antes y después de la exposición a la luz NIR, con (sin tratamiento) o sin (NaN3 u O2-) oxígeno.
La figura 7 es una imagen digital de una imagen de fluorescencia de un gel de electroforesis SDS-PAGE (arriba) y un gel azul de Coomassie (abajo). Todos muestran el conjugado Pan-IR700 antes y después de la exposición a la luz NIR, con o sin exceso de oxígeno. El nivel y la configuración de la ventana son diferentes para mostrar mejor la cantidad de agregación. Con 100 % de O2, la agregación, la formación de agregados es menos eficiente. Esto apoya la reacción química que se muestra en las figuras 1 y 2.
La figura 8 es un gráfico de barras que muestra lo que sucede con Pan-IR700 después de la administración a un ratón con un tumor que expresa EGFR. El gráfico muestra la biodistribución del Pan-IR700 radiomarcado después de la exposición a la luz NIR ex vivo (antes de la inyección, láser), o in vivo (exponer gran parte del abdomen, vientre) en los órganos extirpados del cuerpo después del tratamiento. Normal (n=5): sin láser, Láser (n=5): láser de 16 J, Vientre (n=4): Irradiación con láser de 30 J al vientre. * p<0,05 y # p<0,01 en comparación con normal. La figura 9 es una imagen digital de imágenes de fluorescencia de geles de electroforesis SDS-PAGE (arriba) y un gel azul de Coomassie (abajo). El gel azul de Coomassie muestra que con una exposición de 16 J/cm2 de luz NIR, la banda EGFR desapareció y se incorporó a las bandas de agregación Pan-IR700 (banda de mayor peso molecular, véase también Pan-IR700 solo con 16 J/cm2).
Las figuras 10A-10C muestran la caracterización de la línea celular A431. (A) Las células A431 se transfectaron de manera estable con luciferasa y GFP (ambas en el mismo plásmido) según lo confirmado por FACS. (B) Las células Balb/3T3 se transfectaron de manera estable con RFP según lo confirmado por FACS. (C) Las células A431-luc-GFP demuestran expresión de EGFR. La unión específica se demostró con un estudio de bloqueo. Balb/3T3-RFP que no expresan EGFR también se incubaron con Pan-IR700, pero no se observó unión.
Las figuras 11A-11C muestran la observación y cuantificación del efecto de PIT en cultivos 2D de células A431-luc-GFP. (A) Las células A431-luc-GFP se incubaron con Pan-IR700 durante 6 horas y se observaron con un microscopio antes y después de la irradiación de luz NIR (2 J/cm2). Se observó muerte celular necrótica después de la exposición a la luz NIR (1 h después de PIT). Barra = 10 pm El daño a la membrana y la necrosis inducida por PIT se confirmaron mediante tinción con PI de células muertas. (B) El daño en la membrana y la necrosis inducida por PIT se midieron mediante el recuento de células muertas usando tinción con PI en FACS. (C) La destrucción de células aumentó de manera dependiente de la dosis de luz NIR.
Las figuras 12A-12C muestran la cuantificación del efecto de PIT en el cultivo 2D de células A431-luc-GFP mediante actividad de luciferasa. (A, B) La bioluminiscencia en células A431-luc-GFP se midió como unidad relativa de luz (URL) y disminuyó de forma dependiente de la dosis de luz NIR (1 h después de PIT). (C) Las imágenes de bioluminiscencia (BLI) de una placa de 10 cm demostraron que la actividad de la luciferasa en las células A431-luc-GFP disminuyó de manera dependiente de la dosis de luz NIR.
Las figuras 13A-13C muestran que la fluorescencia de GFP disminuyó 1 h después de PIT en cultivo celular 2D. (A) Las células A431-luc-GFP se incubaron con Pan-IR700 durante 6 horas y se irradiaron con luz NIR (0,5 J/cm2). La intensidad de fluorescencia de GFP disminuyó en las células muertas (*) pero no cambió en las células vivas 1 h después de PIT. Barra = 50 pm. (B) La disminución de la intensidad de fluorescencia de GFP 1 h después de que se produjera PIT de forma dependiente de la dosis de luz NIR. La línea negra en la esquina superior derecha era el marcador para asegurar que la observación tuvo lugar de manera consistente. (C) La cuantificación de la intensidad de fluorescencia de GFP mostró una disminución de una manera dependiente de la dosis de luz NIR (píxeles totales de fluorescencia de GFP en el mismo campo) (n = 12 campos).
Las figuras 14A-14B muestran la disminución de fluorescencia de GFP 1 h después de evaluar PIT con citometría de flujo. (A, B) La intensidad de fluorescencia de GFP disminuyó después de PIT de una manera dependiente de la dosis de luz NIR según lo medido por FACS.
Las figuras 15A-15E muestran la caracterización de esferoides 3D in vitro. (A) Imagen representativa de esferoides 3D A431-luc-GFP/ Balb/3T3-RFP. Barra = 200 pm. (B) Los esferoides 3D crecieron hasta aproximadamente 500 pm (n = 10). (C) Imagen de reconstrucción 3D de un esferoide 3D en el día 7. Barra = 100 pm. (D) Sección congelada de esferoide 3D. Las células se acumulan dentro del núcleo del esferoide. Barra = 100 pm. (E) Pan-IR700 permea centralmente de manera dependiente del tiempo (intensidad media de fluorescencia de IR700 en un esferoide) (n = 10).
La figura 16muestra la observación del efecto de PIT sobre esferoides 3D. Esferoide 3D en el día 7 después de 6 horas de incubación con Pan-IR700, antes y 1 h después de la irradiación de luz NIR (2 J/cm2). Se observó muerte celular necrótica 1 h después de la luz NIR. Barra = 100 pm. Las regiones de fluorescencia de GFP disminuida se colocalizan con tinción de PI.
Las figuras 17A-17E muestran la evaluación del efecto de PIT sobre esferoides 3D in vitro. (A) Día 7 esferoide 3D después de 6 horas de incubación con Pan-IR700, antes y 1 día después de la irradiación de luz NIR. Se observó muerte celular necrótica 1 día después de la luz NIR (teñidas con PI). Barra = 100 pm. La intensidad de fluorescencia de GFP disminuyó y el esferoide disminuyó de tamaño ("descamación") de una manera dependiente de la dosis de luz. (B) Las imágenes de bioluminiscencia (BLI) de un esferoide en una placa con fondo de vidrio demostraron que la actividad de luciferasa en los esferoides 3D A431-luc-GFP disminuyó de manera dependiente de la dosis de luz NIR 1 día después de PIT. Barra = 5 mm. También se demostró la vista macroscópica de la fluorescencia de IR700 (Pearl Imager). (C) La cuantificación de la fluorescencia de GFP demostró una disminución de la intensidad dependiente de la dosis de luz NIR (píxeles totales de fluorescencia de GFP en el mismo esferoide) (n = 10). (D) La bioluminiscencia en esferoides 3D A431-luc-GFP se midió como unidades relativas de luz (URL) y disminuyó de manera dependiente de la dosis de luz NIR (n = 10). (E) El volumen de esferoides 3D A431-luc-GFP también disminuyó de manera dependiente de la dosis de luz NIR (n = 10).
Las figuras 18A-18F muestran los efectos de PIT repetida sobre esferoides 3D. (A) Se muestra el régimen de PIT que incorpora exposiciones repetidas a la luz NIR. (B) Día 7 Los esferoides 3D A431-luc-GFP se dividieron en 4 grupos como se muestra. Barra = 100 pm. (C) Las imágenes de bioluminiscencia (BLI) de cada grupo demostraron que la actividad de luciferasa disminuyó después de PIT repetida. Barra = 5 mm. También se demostró la vista macroscópica de la fluorescencia de IR700 (mediante Pearl Imager). (D) La cuantificación de la intensidad de fluorescencia de GFP mostró disminuciones progresivas después de PIT repetida que finalmente no produjo fluorescencia detectable (píxeles totales de fluorescencia de GFP en el mismo esferoide) (n = 10 esferoides en cada grupo). (E) La bioluminiscencia se midió como unidades relativas de luz (URL), que disminuyó progresivamente después de PIT repetida, lo que eventualmente dio como resultado cerca de 0 URL (por debajo del nivel de fondo) (n = 10). (F) El volumen de esferoides 3D A431-luc-GFP también disminuyó después de PIT repetida (n = 10).
Las figuras 19A-19D muestran la evaluación de PIT en un tumor en el flanco A431-luc-GFP in vivo. (A) Se muestra el régimen de PIT que incorpora exposiciones repetidas a la luz NIR. (B) Imágenes de fluorescencia de GFP/ IR700 y BLI in vivo de tumores en el flanco bilaterales en respuesta a PIT. El tumor tratado con PIT demostró pérdida de fluorescencia de GFP y bioluminiscencia. (C) La cuantificación de la fluorescencia de GFP mostró una disminución progresiva de la intensidad después de PIT repetida, lo que eventualmente dio como resultado una pérdida completa de la señal (n = 10 en cada grupo). (D) La bioluminiscencia se midió como unidades relativas de luz (URL) y disminuyó progresivamente después de PIT, lo que eventualmente dio como resultado una pérdida completa de URL (n = 10).
La figura 20 muestra el efecto de PIT sobre tumor en el flanco A431-luc-GFP in vivo. Imágenes de fluorescencia de GFP/IR700 y BLI in vivo de tumores en el flanco bilaterales en dos ratones adicionales. El tumor tratado con PIT demostró pérdida de fluorescencia de GFP y bioluminiscencia después de PIT.
Las figuras 21A-21B muestran el efecto de PIT sobre tumor en el flanco A431-luc-GFP ex vivo. (A) Se muestra el régimen de PIT que incorpora exposiciones repetidas a la luz NIR. (B) Las imágenes de fluorescencia de GFP/IR700 y BLI ex vivo de un tumor en el flanco en respuesta a PIT confirmaron la desaparición tanto de la fluorescencia de GFP como de la bioluminiscencia.
Las figuras 22A-22B muestra la fluorescencia selectiva/específica en células estables y el efecto letal específico de PIT. (A) FACS demuestra la clasificación de las dos líneas celulares (A431 y Balb/3T3) por su fluorescencia de GFP y RFP. (B) La mezcla de células A431-luc-GFP y células Balb/3T3-RFP se incubaron con Pan-IR700 durante 6 h. Las imágenes microscópicas de referencia y 1 hora después de PIT (2 J/cm2) demuestran la destrucción celular específica de A431-luc-GFP. Barra = 20 pm. El daño a la membrana y la necrosis inducida por PIT se confirmaron mediante tinción con Cytox de células muertas.
Las figuras 23A-23E muestran la eliminación de células diana en cultivo celular 2D. (A) La imagen representativa demuestra que las células A431-luc-GFP se eliminaron 1 h después de PIT. Barra = 200 pm. Se usó un cultivo celular mixto casi confluente de A431-luc-GFP y Balb/3T3-RFP. Las células se incubaron con Pan-IR700 durante 6 h y se observaron antes y después de la irradiación con luz NIR (2 J/cm2). (B) Se muestra (2 J/cm2) el régimen de PIT repetida (2 J/cm2). (D) PIT repetida eliminó por completo las células diana sin dañar las células no diana, hasta que las células no diana se volvieron confluentes. Se cultivaron mezclas de relación 100:10 de células A431-luc-GFP y Balb/3T3-RFP. Barra = 200 pm. (D) La cuantificación de las relaciones de fluorescencia mostró la eliminación completa de las células diana y ningún efecto sobre las células no diana. (n = 10 campos en cada grupo) (E) La cuantificación de las actividades de luciferasa (relación de URL) demuestra la eliminación completa de células diana (n = 10 en cada grupo).
Las figuras 24A-24C muestran la destrucción de células diana en cultivo celular 2D. (A) Se muestra el régimen de PIT que incorpora exposiciones repetidas a la luz NIR. (B) PIT repetida eliminó por completo las células diana sin dañar las células no diana, hasta que las células no diana se volvieron confluentes. Se cultivó una relación de 100:10 de células mixtas A431-luc-GFP y Balb/3T3-RFP. Se demuestra el grupo de control y la línea negra en el borde es un marcador para mantener un posicionamiento uniforme. Barra = 200 pm. (C) La BLI de una placa de 35 mm demostró que la actividad de la luciferasa en las células A431-luc-GFP disminuyó progresivamente después de PIT repetida y finalmente desapareció por completo.
Las figuras 25A-25B muestran la caracterización del esferoide 3D mixto. (A) El efecto de PIT sobre un esferoide que contiene células A431-luc-GFP mientras que no se daña el esferoide que contiene células Balb/3T3-RFP. Barra = 200 pm. (B) Caracterización de diversas relaciones de esferoide mixto en el día 7. Barra = 200 pm. Las figuras 26A-26D muestran la eliminación de células diana en esferoides de células 3D. (A) Se muestra el régimen de PIT (2 J/cm2). (B) PIT repetida eliminó por completo las células diana sin dañar las células no diana, en un esferoide 3D mixto. Barra = 200 pm. (C) La cuantificación de las relaciones de fluorescencia mostró la eliminación completa de las células diana y ningún efecto sobre las células no diana. (n = 10 esferoides en cada grupo). (D) La cuantificación de las actividades de luciferasa (relación de URL) demostró la eliminación completa de las células diana (n = 10 esferoides en cada grupo).
Las figuras 27A-27C muestran la eliminación de células diana en esferoides de células mixtas 3D. (A) Se muestra el régimen de tratamiento. (B) PIT repetida eliminó por completo las células diana mientras que no daño las células no diana, en un cultivo celular 3D mixto. Se muestra la microscopía del grupo de control (solo control y luz). Barra = 200 pm. (C) La BLI de un esferoide en una placa con fondo de vidrio demostró reducciones en la actividad de luciferasa en esferoides 3D mixtos después de PIT, lo que eventualmente llevó a la desaparición completa. Barra = 5 mm. También se demostró la vista macroscópica de la fluorescencia de IR700 (Pearl Imager).
Las figuras 28A-28B muestran la eliminación de células diana (células diana HER2 y que expresan PSMA) en esferoides 3D. (A) El régimen de PIT repetida (2 J/cm2) se muestra encima de la imagen. PIT repetida eliminó por completo las células que expresan HER2 sin dañar las células no diana. Barra = 200 pm. (B) Régimen de PIT repetida (2 J/cm2) mostrado encima de la imagen. Repetir PIT eliminó por completo las células diana de PSMA sin dañar las células no diana. Barra = 200 pm.
Las figuras 29A-29B muestran la caracterización de tumor in vivo. (A) Se muestra el régimen de PIT repetida. (B) PIT tuvo una respuesta en el tumor diana, pero ningún efecto sobre el tumor no diana.
Las figuras 30A-30E muestran la eliminación de células diana dentro de un modelo de tumor mixto in vivo. (A) Se muestra el régimen de PIT (2 J/cm2). (B) PIT repetida eliminó por completo las células diana de tumores mixtos in vivo. (C) La cuantificación de las relaciones de fluorescencia mostró la eliminación completa de las células diana en tumores mixtos. (n = 10 en cada grupo). (D) La cuantificación de las actividades de luciferasa (relación de URL) demostró la eliminación completa de las células diana in vivo. (n = 10 en cada grupo). (E) La imagen representativa de tumores ex vivo mostró una eliminación completa de las células diana de los tumores mixtos.
La figura 31 muestra la eliminación de células diana in vivo. PIT repetida eliminó por completo las células diana en tumores mixtos. Imágenes de fluorescencia de GFP/IR700 y BLI in vivo de tumor en el flanco bilateral (2 ratones adicionales). El tumor tratado por PIT demostró la desaparición tanto de la fluorescencia de GFP como de la bioluminiscencia después de PIT.
Las figuras 32A-32B muestran la eliminación celular en tumor mixto ex vivo (tumor de control). (A) Se muestra el régimen de PIT que incorpora exposiciones repetidas a la luz NIR. (B) Imágenes de fluorescencia de GFP/ IR700 y BLI ex vivo de un tumor mixto en respuesta a PIT. Se muestran imágenes ex vivo de tumores de control.
Descripción detallada de varias realizaciones
A menos que se explique de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia a la que pertenece una invención divulgada. Los términos en singular "un", "uno/una", y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De modo similar, se pretende que la palabra "o" incluya "y", a menos que el contexto indique claramente lo contrario. "Que comprende" significa "que incluye". Por tanto, "que comprende A o B" significa "que incluye A" o "que incluye B" o "que incluye A y B".
A continuación, se describen métodos y materiales adecuados para la práctica y/o el ensayo de realizaciones de la divulgación. Los métodos convencionales bien conocidos en la técnica a los que se refiere la divulgación se describen en diversas referencias generales y más específicas, incluyendo, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (y Suplementos hasta el 2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4a ed., Wiley & Sons, 1999; Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990; y Harlow y Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.
Las secuencias asociadas con todos los números de registro de GenBank® a los que se hace referencia en el presente documento estuvieron disponibles el 8 de agosto de 2014.
Para facilitar la revisión de las diversas realizaciones de la divulgación, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos específicos:
Administración: Proporcionar o dar a un sujeto un agente, tal como un conjugado de IR700-molécula, mediante cualquier vía eficaz. Las vías de administración de ejemplo incluyen, pero sin limitación, tópica, inyección (tal como subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intratumoral, intraarterial e intravenosa), oral, ocular, sublingual, rectal, transdérmica, intranasal, vaginal y de inhalación. En algún ejemplo, la administración se logra durante una perfusión, tal como una perfusión de órganos.
Anticuerpo (Ab): Incluye inmunoglobulinas intactas (tales como anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales), variantes (tales como anticuerpos quiméricos) y porciones de anticuerpos, tales como un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de origen natural o recombinante. Generalmente, un Ab es un ligando polipeptídico que comprende al menos una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera o de cadena pesada que reconoce de manera específica, y se une, a un epítopo de un antígeno, tal como una proteína diana. Cada cadena pesada y una cadena ligera tienen una región variable, denominadas región variable pesada (Vh) y región variable ligera (Vl). En conjunto, la región Vh y la región Vl son responsables de la unión al antígeno reconocido por el anticuerpo. Los anticuerpos se pueden conjugar con moléculas de IR700 usando métodos de rutina y se pueden usar en los métodos proporcionados en el presente documento, por ejemplo para eliminar, aislar o separar una molécula diana in vitro o in vivo.
Antígeno (Ag): Un compuesto, composición o sustancia que puede estimular la producción de anticuerpos o una respuesta de linfocitos T en un animal, incluyendo composiciones (tales como una que incluye una proteína específica de tumor) que se inyectan o absorben en un animal. Los ejemplos de antígenos incluyen, pero sin limitación, péptidos, lípidos, polisacáridos y ácidos nucleicos que contienen determinantes antigénicos, tales como los reconocidos por una célula inmunitaria. En algunos ejemplos, un antígeno incluye un péptido específico de tumor (tal como uno que se encuentra en la superficie de una célula cancerosa) o un fragmento inmunogénico del mismo.
Un antígeno reacciona con los productos de inmunidad humoral o celular específica, incluidos los inducidos por antígenos heterólogos, tales como los antígenos divulgados. "Epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a la región de un antígeno a la que responden los linfocitos B y/o T. En una realización, los linfocitos T responden al epítopo, cuando el epítopo se presenta junto con una molécula de MHC. Los epítopos pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como a partir de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos normalmente se conservan al exponerlos a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario normalmente se pierden al tratarlos con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, y más habitualmente, al menos 5, aproximadamente 9, o aproximadamente 8-10 aminoácidos en una conformación espacial exclusiva. Los métodos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear.
La unión de un anticuerpo a un antígeno diana o un epítopo del mismo se puede usar para eliminar la diana usando los métodos proporcionados en el presente documento.
Aptámero: Moléculas de ácido nucleico monocatenario (ss) (tales como ADN o el ARN) que se unen a un agente diana específico (tal como una proteína o una molécula orgánica pequeña) con alta afinidad y especificidad (por ejemplo, hasta 10'14 M), y al unirse a la diana, la molécula de ácido nucleico ss sufre un cambio conformacional y forma una estructura terciaria. Normalmente tienen entre 15 y 60 nucleótidos (nt) de longitud, pero algunos son más largos (por ejemplo, más de 200 nt). Por tanto, en algunos ejemplos, los aptámeros tienen al menos 15 nt, al menos 20 nt, al menos 25 nt, al menos 30 nt, al menos 50 nt, al menos 60 nt, al menos 75 nt, al menos 100 nt, al menos 150 nt, al menos 200 nt, tal como de 15 a 250 nt, 15 a 200 nt o 20 a 50 nt. Los aptámeros se pueden conjugar con moléculas de IR700 usando métodos de rutina y se pueden usar en los métodos proporcionados en el presente documento, por ejemplo para eliminar, aislar o separar una molécula diana in vitro o in vivo.
Los aptámeros son conocidos y se han obtenido a través de un proceso de selección combinatoria llamado evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEx ) (véase por ejemplo Ellington et al., Nature 1990, 346, 818-822; Tuerk y Gold Science 1990, 249, 505-510; Liu et al., Chem. Rev. 2009, 109, 1948-1998; Shamah et al., Acc. Chem. Res. 2008, 41, 130-138; Famulok, et al., Chem. Rev. 2007, 107, 3715-3743; Manimala et al., Recent Dev. Nucleic Acids Res. 2004, 1, 207-231; Famulok et al., Acc. Chem. Res. 2000, 33, 591-599; Hesselberth, et al., Rev. Mol. Biotech. 2000, 74, 15-25; Wilson et al., Annu. Rev. Biochem. 1999, 68, 611-647; Morris et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998, 95, 2902-2907). En tal proceso, las moléculas de ADN o ARN que son capaces de unirse a una molécula diana de interés se seleccionan de una biblioteca de ácidos nucleicos que consiste en 1014-1015 diferentes secuencias a través de etapas iterativas de selección, amplificación y mutación. Se han identificado aptámeros que son específicos para una amplia gama de dianas de pequeñas moléculas orgánicas tales como la adenosina, para proteínas tales como trombina, e incluso virus y células (Liu et al., Chem. Rev. 2009,109:1948-98; Lee et al., Nucleic Acids Res. 2004, 32, D95-D100; Navani y Li, Curr. Opin. Chem. Biol. 2006, 10, 272-281; Song et al., TrAC, Trends Anal. Chem. 2008, 27:108-17). La afinidad de los aptámeros hacia sus dianas puede rivalizar con la de los anticuerpos, con constantes de disociación tan bajas como el intervalo picomolar (Morris et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998, 95:2902-7; Green et al., Biochemistry 1996, 35:14413-24).
Enfermedad autoinmunitaria: Una enfermedad en la que el sistema inmunitario produce una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta de linfocitos B o linfocitos T) contra un antígeno que forma parte del hospedador normal (es decir, un autoantígeno), con la consiguiente lesión a tejidos. Un autoantígeno puede derivarse de una célula hospedadora, o puede derivarse de un organismo comensal tal como los microorganismos (conocidos como organismos comensales) que normalmente colonizan superficies de las mucosas.
Ejemplos de enfermedades autoinmunitarias que afectan a los mamíferos incluyen artritis reumatoide, oligoartritis juvenil, artritis inducida por colágeno, artritis inducida por adyuvantes, síndrome de Sjogren, esclerosis múltiple, encefalomielitis autoinmunitaria experimental, enfermedad inflamatoria intestinal (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa), atrofia gástrica autoinmunitaria, pénfigo vulgar, psoriasis, vitíligo, diabetes de tipo 1, diabetes no obesa, miastenia grave, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, colangitis esclerosante, sialadenitis esclerosante, lupus eritematoso sistémico, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Addison, esclerosis sistémica, polimiositis, dermatomiositis, anemia hemolítica autoinmunitaria, anemia perniciosa, y similares.
Unión: Una asociación entre dos sustancias o moléculas, tales como la hibridación de una molécula de ácido nucleico con otra (o con ella misma), la asociación de un anticuerpo, molécula Affibody®, hapteno, o ácido nucleico funcional con una proteína o molécula orgánica pequeña, la asociación de una proteína con otra proteína o molécula de ácido nucleico, la asociación de una lectina con un carbohidrato, o la asociación entre un hapteno y un anticuerpo. La unión puede detectarse mediante cualquier procedimiento conocido por un experto en la materia, incluyendo, pero sin limitación: transferencia de Western, inmunotransferencia, ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoprecipitación, resonancia del plasmón superficial, quimioluminiscencia, polarización fluorescente, fosforescencia, análisis inmunohistoquímico, espectrometría de masas de desorción ionización láser asistida por matriz, microcitometría, micromatriz, microscopía, separación de células activadas por fluorescencia (FACS) y citometría de flujo.
Se dice que una molécula "se une específicamente" a otra molécula cuando un agente particular (un "agente de unión específico") puede reaccionar específicamente con una diana en particular, pero no con moléculas no relacionadas, por ejemplo, para inmuno reaccionar específicamente con una diana, para hibridarse específicamente con una diana, o unirse específicamente a una diana. Por ejemplo, un agente de unión específico de plomo se une sustancialmente solo al plomo in vitro o in vivo y un agente de unión específico de CD45 se une sustancialmente solo a la proteína CD45 in vitro o in vivo. La unión es una reacción de unión no aleatoria, por ejemplo, entre un agente de unión específico (tal como un anticuerpo o fragmento funcional del mismo, molécula Affibody®, hapteno, lectina, proteína, molécula de ácido nucleico o molécula de ácido nucleico funcional) y una diana (tal como una célula, proteína, carbohidrato, patógeno, molécula orgánica pequeña, metal, ADN o ARN). La especificidad de unión se puede determinar a partir del punto de referencia de la capacidad del agente de unión específico para unirse de forma diferencial a la diana y a una molécula no relacionada y, por lo tanto, distinguir entre dos moléculas diferentes. Por ejemplo, una molécula de oligonucleótido se une o se une de forma estable a una molécula de ácido nucleico diana si una cantidad suficiente de la molécula de oligonucleótido forma pares de bases o se hibrida con su molécula de ácido nucleico diana, para permitir la detección de esa unión.
En algunos ejemplos, una molécula (tal como la molécula de un conjugado de IR700-molécula) se une específicamente a una diana (tal como una proteína) con una constante de unión de al menos 103 M-1 mayor, 104 M-1 mayor o 105 M-1 mayor que una constante de unión para otras moléculas en una muestra o sujeto. En ejemplos particulares, se dice que dos compuestos se unen específicamente cuando la constante de unión para la formación de complejos entre los componentes es al menos 104 l/mol, por ejemplo, al menos 106 l/mol, al menos 108 l/mol, o al menos 1010 l/mol. La constante de unión para dos componentes se puede determinar usando métodos que son bien conocidos en la técnica.
En ejemplos particulares, se dice que dos compuestos se unen específicamente cuando la afinidad de unión es de al menos aproximadamente 0,1 x 10-8 M, al menos aproximadamente 0,3 x 10-8 M, al menos aproximadamente 0,5 x 10­ 8 M, al menos aproximadamente 0,75 x 10-8 M, al menos aproximadamente 1,0 x 10-8 M, al menos aproximadamente 1,3 x 10-8 M o al menos aproximadamente 1,5 x 10-8 M, al menos aproximadamente 2,0 x 10-8 M, al menos aproximadamente 2,5 x 10-8, al menos aproximadamente 3,0 x 10-8, al menos aproximadamente 3,5 x 10-8, al menos aproximadamente 4,0 x 10-8, al menos aproximadamente 4,5 x 10-8 o al menos aproximadamente 5,0 x 10-8 M.
En ciertas realizaciones, un agente de unión específico que se une a la diana tiene una constante de disociación (Kd) de <104 nM, <100 nM, <10 nM, <1 nM, <0,1 nM, <0,01 nM o <0,001 nM (por ejemplo, 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M). En una realización, la Kd se mide mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA, por sus siglas en inglés) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno (véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881, 1999). En otro ejemplo, la Kd se mide utilizando ensayos de resonancia de plasmón superficial utilizando un BIACORES-2000 o un B iaCo RES-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.) a 25 °C con chips c M5 de antígeno inmovilizados en aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR).
Cáncer: Un tumor maligno caracterizado por un crecimiento celular anormal o descontrolado. Otras características asociadas a menudo con el cáncer incluyen metástasis, interferencia con el funcionamiento normal de las células vecinas, liberación de citocinas u otros productos secretores a niveles anormales y supresión o agravamiento de la respuesta inflamatoria o inmunitaria, invasión de tejidos u órganos circundantes o distantes, tales como ganglios linfáticos, etc. "Enfermedad metastásica" puede hacer referencia a células cancerosas que han abandonado el sitio del tumor original y migran a otras partes del cuerpo, por ejemplo, a través del torrente sanguíneo o del sistema linfático. En un ejemplo, una célula diana para eliminación por los métodos divulgados es una célula cancerosa.
Contacto: Colocación en asociación física directa, incluyendo una forma sólida o líquida. El contacto puede producirse in vitro o ex vivo, por ejemplo, añadiendo un reactivo a una muestra, o in vivo mediante la administración a un sujeto.
Disminución: Reducir la calidad, la cantidad o la intensidad de algo. En un ejemplo, los métodos en el presente documento disminuyen una cantidad de diana en una muestra, fuente, o en un sujeto. Por ejemplo, el uso de un complejo de IR700-molécula disminuye la cantidad de una diana, que puede ser el agente al que se une específicamente el IR700-molécula, o puede ser la molécula del complejo de IR700-molécula. En algunos ejemplos, la disminución o reducción de la diana es de al menos un 20 %, al menos un 50 %, al menos un 75 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 %, en relación con la cantidad de diana observada si no se añade ningún IR700-molécula y no se aplica luz NIR. En otros ejemplos, las disminuciones se expresan como un cambio múltiplo, tal como una disminución en la diana de al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 8 veces, al menos 10 veces o incluso al menos 15 o 20 veces, en relación con la cantidad de diana observada si no se añade ningún IR700-molécula y no se aplica luz NIR. Dichas disminuciones se pueden medir usando métodos de rutina en la técnica, así como los métodos divulgados en el presente documento.
Detectar: Determinar si un agente en particular (por ejemplo, una diana) está presente o ausente y, en algunos ejemplos, incluye además la semi cuantificación o la cuantificación del agente si se detecta.
Desoxirribozima (ADNzima): Moléculas de ADN funcionales que muestran actividad catalítica hacia una diana específica. También denominados ADN catalíticos. Las ADNzimas normalmente contienen una cadena de sustrato que incluye una única base de ARN y una cadena de enzima. Las ADNzimas muestran una alta actividad de escisión hidrolítica catalítica hacia sustratos específicos (por ejemplo, dianas). En presencia de la diana específica, la diana se unirá a la cadena de enzima, dando como resultado un cambio conformacional en la ADNzima y la escisión de la cadena de sustrato en la base de ARN. Las ADNzimas se pueden conjugar con moléculas de IR700 usando métodos de rutina y se pueden usar en los métodos proporcionados en el presente documento, por ejemplo para eliminar, aislar o separar una molécula diana in vitro o in vivo.
Hay ADNzimas disponibles que tienen una alta especificidad hacia diversos iones metálicos tales como Pb2+ (Breaker y Joyce, Chem. Biol. 1994, 1:223-9; Li y Lu, J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 10466-7), Cu2+ (Carmi et al., Chem. Biol.
1996, 3:1039-46; Cuenoud et al., Nature 1995, 375:611-14), Zn2+ (Santoro et al., J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 2433­ 243; Li et al., Nucleic Acids Res. 2000, 28, 481-488), Co2+(Mei et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125:412-20; Bruesehoff et al., Comb. Chem. High Throughput Screening 2002, 5:327-35), Mn2+ (Wang et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 6880-1), y UO22+ (Liu et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 2007, 104:2056-61).
Cantidad eficaz: Una cantidad de una composición que sola, o junto con uno o varios agentes terapéuticos adicionales (tales como un agente quimioterapéutico) suficiente para lograr un efecto deseado, por ejemplo, in vitro, in vivo, o ex vivo. La cantidad eficaz del agente (tal como un conjugado de IR700-molécula o luz NIR) puede depender de varios factores, incluyendo, aunque sin limitarse a la muestra, fuente, sujeto, o células que están siendo tratadas, la fuente aplicada, la gravedad y el tipo de la afección que está siendo tratada, el agente terapéutico particular (por ejemplo, el conjugado de IR700-molécula particular) y la forma de administración. También pueden determinarse cantidades eficaces mediante diversos inmunoensayos in vitro, in vivo o in situ. El conjugado de IR700-molécula y/o la luz NIR se pueden administrar en una dosis única o en varias dosis, según sea necesario para obtener la respuesta deseada.
En un ejemplo, una cantidad o concentración eficaz es aquella que es suficiente para eliminar o separar una diana de una muestra, fuente o sujeto. En un ejemplo, una cantidad o concentración terapéuticamente eficaz es aquella que es suficiente para retrasar la progresión o provocar la regresión de una enfermedad, o que es capaz de reducir los síntomas causados por la enfermedad, tal como cáncer. En un ejemplo, una cantidad o concentración terapéuticamente eficaz es aquella que es suficiente para aumentar el tiempo de supervivencia de un paciente con un tumor.
En un ejemplo, una cantidad o concentración eficaz es aquella que es suficiente para eliminar o separar una diana de una muestra, fuente o sujeto. No es necesario eliminar por completo una o más dianas para que el método sea eficaz. Por ejemplo, poner en contacto o administrar una composición que contiene un conjugado de IR700-molécula con una muestra, una fuente o un sujeto seguido de la irradiación con luz NIR puede disminuir sustancialmente la cantidad de la diana presente en la muestra, fuente o sujeto, tal como una disminución de al menos un 20 %, al menos un 50 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o incluso al menos un 100 %, en comparación con la cantidad de la diana presente antes del contacto o la administración del conjugado de IR700-molécula.
En un ejemplo, una cantidad o concentración eficaz es aquella que es suficiente para reducir o eliminar (y en algunos ejemplos destruir) una célula diana de una población mixta de células in vivo o in vitro. No es necesario eliminar por completo una o más células diana para que el método sea eficaz. Por ejemplo, poner en contacto o administrar una composición que contiene un conjugado de IR700-molécula con una muestra, una fuente o un sujeto seguido de la irradiación con luz NIR puede disminuir sustancialmente la cantidad de células diana presentes en la mezcla de células en una muestra, fuente o sujeto, tal como una disminución de al menos un 20 %, al menos un 50 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o incluso al menos un 100 %, en comparación con la cantidad de células diana presentes antes del contacto o la administración del conjugado de IR700-molécula.
En un ejemplo, una cantidad o concentración eficaz es aquella que es suficiente para aislar o purificar una diana de una muestra, fuente o sujeto. No es necesario aislar o purificar por completo una o más dianas para que el método sea eficaz. Por ejemplo, poner en contacto o administrar una composición que contiene un conjugado de IR700-molécula con una muestra, una fuente o un sujeto seguido de la irradiación con luz NIR puede aumentar sustancialmente la pureza de la diana, tal como una pureza de al menos un 20 %, al menos un 50 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o incluso al menos un 100 %, en comparación con la cantidad de la pureza de la diana presente antes del contacto o la administración del conjugado de IR700-molécula.
En un ejemplo particular, una cantidad o concentración eficaz es aquella que es suficiente para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto, por ejemplo, reduciendo o inhibiendo uno o más síntomas asociados con la enfermedad o trastorno. No es necesario eliminar por completo el uno o más síntomas para que la composición sea eficaz. Por ejemplo, administrar una composición que contiene un conjugado de IR700-molécula a un sujeto seguido de irradiación con luz NIR puede disminuir sustancialmente uno o más signos o síntomas de la enfermedad o trastorno en al menos un 20 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos el 98 %, o incluso al menos el 100 % en comparación con los signos o síntomas antes del contacto o la administración del conjugado de IR700-molécula.
En ejemplos particulares, una cantidad eficaz de un conjugado de IR700-molécula para fines in vitro o ex vivo es de al menos 0,5 pg/m2, tal como al menos 1 pg/m2, al menos 2 pg/m2, al menos 5 pg/m2, al menos 10 pg/m2, al menos 25 pg/m2, al menos 50 pg/m2, al menos 100 pg/m2, al menos 250 pg/m2, o al menos 500 pg/m2, por ejemplo de 0,5 pg/m2 a 500 pg/m2, 1 pg/m2 a 500 pg/m2, 1 pg/m2 a 50 pg/m2, o 2 pg/m2 a 20 pg/m2. Sin embargo, un experto en la materia reconocerá que también se podrían utilizar cantidades más altas o más bajas, por ejemplo, dependiendo del conjugado de IR700-molécula en particular o de la muestra.
En ejemplos particulares, una cantidad eficaz de conjugado de IR700-molécula para fines in vivo 0,5 miligramos por 60 kilogramos (mg/kg), al menos 5 mg/60 kg, al menos 10 mg/60 kg, al menos 20 mg/60 kg, al menos 30 mg/60 kg, al menos 50 mg/60 kg, por ejemplo de 0,5 a 50 mg/60 kg, tal como una dosis de 1 mg/ 60 kg, 2 mg/60 kg, 5 mg/60 kg, 20 mg/60 kg, o 50 mg/60 kg, por ejemplo cuando se administra i.v. En otro ejemplo, una dosis eficaz de un conjugado de IR700-molécula es de al menos 10 pg/kg, tal como al menos 100 pg/kg, al menos 500 pg/kg o al menos 500 pg/kg, por ejemplo, de 10 pg/kg a 1000 pg/kg, tal como una dosis de 100 pg/kg, 250 pg/kg, aproximadamente 500 pg/kg, 750 pg/kg o 1000 pg/kg, por ejemplo, cuando se administra por vía intratumoral o i.p. En un ejemplo, una dosis eficaz del conjugado de IR700-molécula es de al menos 1 pg/ml, tal como al menos 5000 pg/ml, tal como de 20 pg/ml a 100 pg/ml, 100 pg/ml a 500 pg/ml, 100 pg/ml a 5000 pg/ml, tal como 10 pg/ml, 20 pg/ml, 30 pg/ml, 40 pg/ml, 50 pg/ml, 60 pg/ml, 70 pg/ml, 80 pg/ml, 90 pg/ml, 100 pg/ml, 500 pg/ml, 1000 pg/ml, 2500 pg/ml o 5000 pg/ml, por ejemplo cuando se administra como una solución tópica. Sin embargo, un experto en la materia reconocerá que también se podrían utilizar dosis más altas o más bajas, por ejemplo, dependiendo del conjugado de IR700-molécula particular. En ejemplos particulares, dichas dosis diarias se administran en una o más dosis divididas (tales como 2, 3 o 4 dosis) o en una sola formulación. Los conjugados de IR700-molécula divulgados se pueden administrar solos, en presencia de un portador farmacéuticamente aceptable, en presencia de otros agentes terapéuticos (tales como agentes antineoplásicos).
En general, una dosis adecuada de irradiación después de poner en contacto el conjugado de IR700-molécula con una muestra o fuente, o la administración del conjugado de IR700-molécula a un sujeto, es de al menos 1 J cm-2 a una longitud de onda de 660-710 nm, al menos 2 J cm-2 a una longitud de onda de 660-710 nm, al menos 4 J cm-2 a una longitud de onda de 660-710 nm, al menos 8 J cm-2 a una longitud de onda de 660-710 nm, al menos 10 J cm-2 a una longitud de onda de 660-710 nm, al menos 16 J cirr2 a una longitud de onda de 660-710 nm, al menos 50 J cirr2 a una longitud de onda de 660-710 nm o al menos 100 J cm-2 a una longitud de onda de 660-710 nm, por ejemplo, de 1 a 500 J cm'2 a una longitud de onda de 660-710 nm. En algunos ejemplos, la longitud de onda es de 680 - 690 nm. En ejemplos particulares, se realizan múltiples irradiaciones (tales como al menos 2, al menos 3 o al menos 4 irradiaciones, tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 administraciones separadas), después de poner en contacto el conjugado de IR700-molécula con una muestra o fuente, o la administración del conjugado de IR700-molécula a un sujeto.
Ácidos nucleicos funcionales (FNA): Moléculas de ácido nucleico (tales como moléculas de ADN o ARN) que pueden usarse como enzimas (para catálisis), receptores (para unión a una diana), o ambos. Las FNA incluyen ribozima y ADNzimas (por ejemplo, véase Robertson y Joyce, Nature 1990, 344:467; Breaker y Joyce, Chem. Biol.
1994, 1, 223-229), aptámeros (por ejemplo, véase Tuerk y Gold, Science 1990, 249, 505), aptazimas (por ejemplo, véase Breaker, Curr. Opin. Biotechnol. 2002, 13, 31), y aptámeros. En el presente documento se proporcionan ejemplos adicionales y son conocidos en la técnica. Los FNA se pueden conjugar con moléculas de |R700 usando métodos de rutina y se pueden usar en los métodos proporcionados en el presente documento, por ejemplo para eliminar, aislar o separar una molécula diana in vitro o in vivo.
IR700 (IRDye® 700DX): Un colorante de ftalocianina que tiene la siguiente fórmula:
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Este compuesto está disponible en el mercado de LI-COR (Lincoln, NE). IR700 es un colorante relativamente hidrófilo y se puede conjugar covalentemente con un anticuerpo (u otra proteína) usando el éster NHS de IR700, y se puede conjugar con una molécula de ácido nucleico usando otra química enlazadora como IR700 funcionalizado con psoraleno o química click. el IR700 también tiene un coeficiente de extinción más de 5 veces superior (2,1 * 105 M-1cm-1 al máximo de absorción de 689 nm) al de los fotosensibilizadores convencionales tales como el derivado de la hematoporfirina Photofrin® (1,2 * 103 M-1cm-1 a 630 nm), la metatetrahidroxifenilclorina; Foscan® (2,2 * 104 M-1cm-1 a 652 nm) y la mono-L-aspartilclorina e6; NPe6/Laserphyrin® (4,0 * 104 M-1cm-1 a 654 nm).
Una molécula de IR700 escindida o hidrófoba es la que resulta después de la exposición a la luz NIR (véanse las figuras 1 y 2). Por ejemplo, las moléculas de IR700 escindidas o hidrófilas de ejemplo incluyen uno o más de:
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que puede tener una molécula conjugada (tal como una molécula o un agente de unión específico). El trozo eliminado de IR700 después de la exposición a la luz NIR es
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Conjugado de IR700-molécula: Una molécula que incluye tanto un colorante IR700 como otra molécula, tal como un fármaco (por ejemplo, un agente farmacéutico) o un agente de unión específico (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo, molécula Affibody®, hapteno, proteína, lectina, molécula de ácido nucleico, ácido nucleico funcional, etc.). Por ejemplo, un Conjugado de IR700-anticuerpo es una molécula que incluye un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, tal como un anticuerpo específico de diana, conjugado a IR700.
Aislado: Un agente "aislado" (tal como una proteína o una molécula de ácido nucleico) se ha separado sustancialmente, producido aparte o purificado de otros componentes en los que se produce el componente. Por ejemplo, el agente, tal como una diana, puede separarse de otros componentes de una muestra o fuente en la que se produce el componente (tal como una muestra biológica, una muestra/fuente de alimento o una muestra/fuente ambiental). Por ejemplo, el agente, tal como una diana, se puede separar de otros componentes de una célula o muestra biológica (tal como una muestra de sangre), tales como otros ADN y ARN cromosómico y extracromosómico, y proteínas. En algunos ejemplos, una célula, proteína o molécula purificada o aislada de ácido nucleico puede ser al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % pura.
Composición o agente farmacéutico: Un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico o profiláctico deseado cuando se administra adecuadamente a un sujeto en una cantidad eficaz. Una composición farmacéutica puede incluir un agente terapéutico, tal como uno o más conjugados de IR700-molécula (en algunos ejemplos, la molécula es un agente terapéutico, tal como un agente quimioterapéutico). Un agente terapéutico o farmacéutico es aquel que solo o junto con un compuesto adicional induce la respuesta deseada (tal como inducir un efecto terapéutico o profiláctico cuando se administra a un sujeto). En un ejemplo particular, una composición farmacéutica incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un complejo de IR700-molécula.
Portadores farmacéuticamente aceptables: Los portadores (vehículos) farmacéuticamente aceptables útiles en la presente divulgación son convencionales. Remington's Pharmaceutical Sciences, de E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pensilvania, 19.a edición (1995) describe composiciones y formulaciones adecuadas para la administración farmacéutica de uno o más compuestos, tales como uno o más conjugados de IR700-molécula.
En general, la naturaleza del excipiente dependerá del modo particular de administración que se emplee. Por ejemplo, las formulaciones parenterales por lo general comprenden líquidos inyectables que incluyen líquidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como vehículo. Para composiciones sólidas (por ejemplo, polvo, píldora, comprimido o cápsula), los excipientes sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de los portadores biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas a administrar pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes tamponadores del pH y similares, por ejemplo, acetato de sodio o monolaurato de sorbitán.
Fotoinmunoterapia (PIT): Una terapia dirigida molecular que utiliza un fotosensibilizador específico de diana basado en un colorante de ftalocianina en el infrarrojo cercano (NIR), IR700, conjugado con agentes de unión específicos tales como anticuerpos monoclonales (MAb) dirigidos a receptores de la superficie celular. En un ejemplo, el receptor de la superficie celular se encuentra específicamente en una célula diana en una población celular mixta, tal como una célula diana en un tumor y, por tanto, PIT se puede usar para destruir dichas células. La muerte celular de las células se produce cuando la molécula de anticuerpo-IR700 se une a las células y las células se irradian con NIR, mientras que las células que no expresan el receptor de la superficie celular reconocido por el conjugado de IR700-molécula no son destruidas en cantidades significativas.
Eliminar o separar: Dividir o separar, por ejemplo, quitando algo.
Muestra: Cualquier muestra (o fuente) biológica, de alimento o ambiental que puede contener (o se sabe que contiene o se sospecha que contiene) un agente diana puede usarse en los métodos en el presente documento.
Sujeto o paciente: Un término que incluye mamíferos humanos y no humanos. En un ejemplo, el sujeto es un ser humano o sujeto veterinario, tal como un ratón, primate no humano, gato, perro, y similares. En algunos ejemplos, el sujeto es un mamífero (tal como un ser humano) que tiene cáncer, o está siendo tratado para cáncer. En algunos ejemplos, el sujeto es un mamífero que tiene una diana no deseada, tal como infección por un patógeno, exposición a una toxina, veneno o espora, y similares. En algunos ejemplos, el sujeto es un mamífero que recibirá un agente farmacológico.
Diana (o agente diana): En un ejemplo, es una sustancia cuya eliminación o separación se desea. Según el método in vitro de la invención, una diana incluye , pero sin limitación, un compuesto químico, metal (tal como un metal pesado), patógeno, toxina, veneno, ácido nucleico (tal como ADN o ARN) o proteína (tal como una citocina, una hormona o un antígeno), así como células particulares (tales como una célula cancerosa, una célula bacteriana o una célula específica en la sangre) o esporas. Según el método terapéutico in vivo de la invención, la diana es seleccionada de una proteína, una proteína, péptido, lecitina, carbohidrato, metal, molécula de ácido nucleico, molécula orgánica pequeña, fármacos, fármaco recreativo, agente farmacológico, quimioterapéutico, agente biológico, antibiótico, fármaco antihipertensivo, antidepresivo, analgésico, hormona reproductiva, anticoagulante, esteroide, estatina, patógeno o espora. En un ejemplo, la diana es una sustancia cuya farmacocinética debe ser controlada, tal como un agente farmacéutico terapéutico, tal como un agente quimioterapéutico.
Tumor, neoplasia, malignidad o cáncer: Una neoplasia es un crecimiento anormal de tejido o células que es resultado de una división celular excesiva. El crecimiento neoplásico puede producir un tumor. La cantidad de un tumor en un individuo es la "carga tumoral" que puede medirse como el número, el volumen o el peso del tumor. Un tumor que no metastatiza se denomina "benigno". Un tumor que invade el tejido circundante o puede metastatizar (o ambos) se denomina "maligno". Un "tejido no canceroso" es un tejido del mismo órgano en donde se formó la neoplasia maligna, pero no tiene la patología característica de la neoplasia. Generalmente, el tejido no canceroso parece histológicamente normal. Un "tejido normal" es tejido de un órgano, en donde el órgano no está afectado por cáncer u otra enfermedad o trastorno de ese órgano. Un sujeto "libre de cáncer" no ha sido diagnosticado con un cáncer de ese órgano y no tiene cáncer detectable.
Los tumores de ejemplo, tales como cánceres, que se pueden tratar con los métodos reivindicados incluyen tumores sólidos, tales como carcinomas de mama (por ejemplo, carcinomas lobulillares y de conductos), sarcomas, carcinomas de pulmón (por ejemplo, carcinoma no microcítico, carcinoma macrocítico, carcinoma escamoso y adenocarcinoma), mesotelioma del pulmón, adenocarcinoma colorrectal, carcinoma de estómago, adenocarcinoma de próstata, carcinoma de ovario (tal como cistoadenocarcinoma seroso y cistoadenocarcinoma mucinoso), tumores de células germinales ováricas, carcinomas testiculares y tumores de células germinales, adenocarcinoma pancreático, adenocarcinoma biliar, carcinoma hepatocelular, carcinoma de vejiga (incluyendo, por ejemplo, carcinoma de células transicionales, adenocarcinoma y carcinoma escamoso), adenocarcinoma de células renales, carcinomas de endometrio (incluyendo, por ejemplo, adenocarcinomas y tumores de Müller mixtos (carcinosarcomas)), carcinomas del endocérvix, exocérvix y vagina (tales como adenocarcinoma y carcinoma escamoso de cada uno de los mismos), tumores de la piel (por ejemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular, melanoma maligno, tumores del apéndice de la piel, sarcoma de Kaposi, linfoma cutáneo, tumores anexiales de piel y varios tipos de sarcomas y carcinoma de células de Merkel), carcinoma esofágico, carcinomas de la nasofaringe y la orofaringe (incluyendo carcinoma escamoso y adenocarcinomas de los mismos), carcinomas de las glándulas salivales, tumores de cerebro y del sistema nervioso central (incluyendo, por ejemplo, tumores de la glía, de origen neuronal y meníngeo), tumores del nervio periférico, sarcomas de tejidos blandos y sarcomas de hueso y cartílago, y tumores linfáticos (incluyendo linterna maligno de linfocitos B y linfocitos T). En un ejemplo, el tumor es un adenocarcinoma.
Los métodos también se pueden utilizar para tratar tumores líquidos, tales como uno linfático, de glóbulos blancos u otro tipo de leucemia. En un ejemplo específico, el tumor tratado es un tumor de la sangre, tal como una leucemia (por ejemplo leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), tricoleucemia (HCL, del inglés "hairy cell leukemia"), leucemia prolinfocítica de linfocitos T (LPL-T), leucemia linfocítica granular grande y leucemia de linfocitos T adultos), linfomas (tales como el linfoma de Hodgkin y el linfoma no Hodgkin) y mielomas).
En condiciones suficientes para (que permitan): Una expresión que se usa para describir cualquier entorno que permita o haga posible la actividad deseada. En un ejemplo, "en condiciones suficientes para" incluye poner en contacto un conjugado de IR700-molécula con una muestra, tal como una muestra biológica, ambiental o de alimento, suficiente para permitir que el conjugado de IR700-molécula se una a una o más dianas en la muestra. En ejemplos particulares, la actividad deseada es formar un agregado, lo que permite la eliminación de un agente diana, después de exponer la muestra a la luz NIR. En un ejemplo, "en condiciones suficientes para" incluye administrar un conjugado de IR700-molécula a un sujeto suficiente para permitir que el conjugado de IR700-molécula se una a una diana in vivo. En ejemplos particulares, la actividad deseada es la eliminación de una diana no deseada a la que está unido el conjugado de IR700-molécula, después de la irradiación del sujeto con luz NIR. En un ejemplo, "en condiciones suficientes para" incluye administrar un conjugado de IR700-molécula a un sujeto suficiente para permitir que el IR700-molécula tenga un efecto terapéutico in vivo. En ejemplos particulares, la actividad deseada es la eliminación del conjugado de IR700-molécula después del tratamiento, irradiando al sujeto con luz NIR.
Sin tratar: Una célula, muestra, o sujeto que no ha sido puesto en contacto con un agente deseado, tal como un conjugado de IR700-molécula. En un ejemplo, una célula, muestra o sujeto no tratado es aquel que recibe el vehículo o portador en el que se administró el conjugado de IR700-molécula.
La divulgación de ciertos ejemplos específicos no pretende excluir otras realizaciones. Además, cualquier método o tratamiento descrito en el presente documento no es necesariamente exclusivo de otros métodos, sino que se puede combinar con otros agentes bioactivos o modalidades de tratamiento.
Descripción general de la tecnología
El colorante IR700 es un fotosensibilizante, excitado en el intervalo del infrarrojo cercano (NIR). Los inventores han determinado que la exposición del colorante IR700 a la luz NIR de la longitud de onda apropiada da como resultado la escisión de la porción de la molécula de IR700 (figura 1). Esta escisión fabrica los uno o más de los compuestos de IR700 "superhidrófobos" resultantes:
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Esta hidrofobicidad conduce a la agregación del compuesto de IR700 hidrófobo que se muestra anteriormente y de cualquier molécula asociada. Por ejemplo, como se muestra en la figura 2, un anticuerpo conjugado con IR700 (conjugado de IR700-anticuerpo) permanece unido al compuesto de IR700 hidrófobo resultante. Además, cualquier proteína unida específicamente al conjugado de IR700-anticuerpo hidrófobo también permanecería unida. Como se muestra en la figura 3, si el conjugado IR700-anticuerpo se une a una proteína en la superficie celular, después de la exposición a NIR, el IR700 unido al anticuerpo se modifica químicamente induciendo hidrofobicidad, lo que destruye la integridad de la membrana celular, conduciendo al daño a la membrana y la muerte celular. Los derivados hidrófilos de sílice-ftalocianina con una estructura similar basada en enlaces sílice-oxígeno tendrán un resultado similar al IR700. Un ejemplo de tal compuesto es La Jolla Blue (véase Peng y Braney, Fluorescence Labeling, 2004).
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Basándose en esta observación, la presente divulgación proporciona métodos para la eliminación (por ejemplo, separación o aislamiento) del complejo de IR700 hidrófobo resultante de la solución (por ejemplo, por precipitación o centrifugación) o eliminación (por ejemplo, separación o aislamiento) del complejo de IR700 hidrófobo de la circulación en un sujeto, por ejemplo, mediante el tráfico del complejo de IR700 hidrófobo al hígado y la subsiguiente degradación del complejo por el hígado.
Métodos para eliminar una diana de una muestra
En el presente documento se proporcionan métodos para eliminar, tal como aislar o separar, una o más moléculas o agentes diana de una muestra, tal como una muestra (o fuente) de alimento, muestra (o fuente) ambiental, muestra (o fuente) de fermentación o de reactor, o muestra obtenida de un sujeto. Por ejemplo, el método se puede usar para eliminar o aislar al menos dos dianas diferentes, tal como al menos 3, al menos 4 o al menos 5 dianas diferentes, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dianas diferentes de la muestra. Por ejemplo, al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 (tal como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) diferentes conjugados de IR700-molécula pueden usarse en la misma muestra (por ejemplo, simultáneamente o al mismo tiempo), donde cada uno es específico para una diana diferente. Esto permite la eliminación de múltiples dianas de la muestra. Las dianas de ejemplo que se pueden eliminar o separar de la muestra incluyen, pero sin limitación, proteínas, péptidos, lectinas, carbohidratos, metales (tales como metales pesados), moléculas de ácido nucleico, moléculas orgánicas pequeñas, fármacos, veneno, patógenos (por ejemplo, virus, parásito, bacteria u hongo) o una célula (tal como una célula diana en una población mixta de células). En algunos ejemplos, el método también incluye detectar la diana eliminada.
En un ejemplo, dichos métodos se usan para eliminar agentes no deseados (tales como impurezas, metales, organismos patógenos, esporas, toxinas, fármacos, células y similares), de una muestra. Por ejemplo, las impurezas se pueden eliminar o separar de una muestra o fuente generada como parte de un proceso de fabricación (tal como un proceso de fabricación de fármacos). En otro ejemplo, patógenos, toxinas, esporas, metales u otros agentes indeseables se eliminan de una muestra o fuente ambiental. En un ejemplo, patógenos, toxinas, esporas, antibióticos u otros agentes indeseables se eliminan de una muestra o fuente de alimento. En un ejemplo, células diana indeseables se eliminan (y en algunos ejemplos se destruyen) de un cultivo de tejido u órgano que incluye una pluralidad de tipos de células diferentes.
En un ejemplo, dichos métodos se usan para eliminar los agentes deseados (tales como una célula, patógeno, metal, espora, proteína, molécula de ácido nucleico diana y similares), de una muestra. Por ejemplo, dichos métodos se pueden usar para eliminar, separar o aislar una célula deseada de un paciente, tal como de una muestra de sangre. Por ejemplo, las PBMC o las células madre (tales como las células madre humanas) se pueden eliminar de una muestra de sangre usando anticuerpos específicos de CD apropiados (en donde las PBMC o las células madre se pueden manipular ex vivo si se desea, y reintroducirse en un sujeto, tal como uno que recibe un trasplante). En un ejemplo, dichos métodos se usan para eliminar una diana de una muestra (por ejemplo, similar a una inmunoprecipitación), que en algunos ejemplos se usa además para identificar otros agentes que se unen a la diana (por ejemplo, similar a una coinmunoprecipitación). Por tanto, por ejemplo, los métodos se pueden usar para eliminar una proteína, lectina, carbohidrato, patógeno, molécula de ácido nucleico, célula o anticuerpo diana de una muestra, tal como una muestra en un laboratorio. En algunos ejemplos, se identifican otros agentes que se unen a la proteína, lectina, carbohidrato, patógeno, molécula de ácido nucleico, célula o anticuerpo diana. En algunos ejemplos, dichos métodos pueden usarse para concentrar o enriquecer una célula diana o un reactivo presente en una muestra, tal como una célula, patógeno, metal, espora, proteína, veneno, molécula de ácido nucleico diana, y similares (tal como enriquecer o concentrar la diana al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces o al menos 500 veces). En algunos ejemplos, contaminantes no deseados o células mutadas en un cultivo celular, durante por ejemplo, aplicaciones de regeneración de tejidos, puede eliminarse con el uso de los métodos divulgados.
No se requiere la eliminación, el aislamiento o la separación completos de la diana de la muestra para que el método sea eficaz. Por ejemplo, el método puede incluir reducir una cantidad de agente diana en la muestra (o fuente) en al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, al menos un 99,9 % (y en algunos ejemplos un 100 %), por ejemplo, en comparación con una cantidad de diana presente antes de añadir un conjugado de IR700-molécula a la muestra y la irradiación de la muestra con luz NIR. En algunos ejemplos, el método aísla o enriquece o concentra una diana, de modo que la diana sea al menos un 20 % pura, tal como al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % pura, por ejemplo, en comparación con la pureza o la concentración de la diana sin añadir un conjugado de IR700-molécula a la muestra y la irradiación de la muestra con luz NIR.
En ejemplos particulares, el método incluye poner en contacto la muestra con un conjugado de IR700-molécula. La molécula del conjugado de IR700-molécula puede ser un agente de unión específico que tiene especificidad por la diana y, por tanto, se une preferentemente a la diana en relación con otras moléculas. Los ejemplos no limitantes de agentes de unión específicos incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos, moléculas Affibody®, haptenos, moléculas de ácido nucleico funcionales (tales como aptámeros y ADNzimas), moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, aquellas que tienen una secuencia complementaria a una molécula de ácido nucleico diana tal que las moléculas de ácido nucleico se hibridan entre sí), lectinas (proteínas de unión a carbohidratos), proteínas y similares. Si la diana está presente en la muestra, esto dará como resultado la formación de un complejo de diana-conjugado de IR700-molécula. En ejemplos particulares, el conjugado de IR700-molécula y el complejo de diana-conjugado de IR700-molécula son hidrófilos antes de la exposición a la luz NIR.
La muestra se irradia con NIR, tal como a una longitud de onda de 660 nm a 710 nm (tal como 680 o 690 nm), por ejemplo a una dosis de al menos 1 J cirr2, en condiciones suficientes para escindir (eliminar) una porción de la parte IR700 del complejo de diana-conjugado de IR700-molécula (por ejemplo, véase la parte rodeada por un círculo de la figura 2), generando así un complejo de diana-conjugado de IR700-molécula hidrófobo. En algunos ejemplos, lo siguiente se elimina del complejo de diana-conjugado de IR700-molécula después de la exposición a la luz NIR:
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Por tanto, el conjugado de IR700-molécula cambia de una molécula hidrófila a una que es hidrófoba, después de la exposición a la luz NIR. Como resultado, el conjugado de IR700-molécula se agrega después de la exposición a la luz NIR, permitiendo la separación o eliminación de la diana de la muestra (está en el agregado o precipitado). Las propiedades de solubilidad y agregación de las ftalocianinas de silicio están muy influenciadas por la naturaleza del sustituyente axial (colorantes y pigmentos, 2013, 99:59-66). Las ftalocianinas de silicio sin sustituyentes axiales, por ejemplo, el compuesto original de dihidróxido de ftalocianina de silicio (N.° CAS 19333-15-4), no tiene una solubilidad medible en una variedad de disolventes, incluyendo agua (Yang et al., J. Phys. Chem. A., 2011, 115:12474). Como se muestra en la figura 5, antes de la exposición a la luz NIR, IR700 puede disolverse en diferentes disolventes acuosos y orgánicos (hidrófilos).
El complejo de diana-conjugado de IR700-molécula hidrófobo resultante se puede eliminar (por ejemplo, aislar o separar) de la muestra. Por ejemplo, la muestra se puede incubar o hacer reaccionar en condiciones que permitan que el complejo de molécula diana-conjugado de IR700-molécula hidrófobo se agregue o forme un precipitado (por ejemplo, forme un sólido en solución). Dichas condiciones pueden incluir mezclar la solución (por ejemplo, por vórtice, mezclando con una barra agitadora, balanceando, o similar) que contiene el diana-conjugado IR700-molécula hidrófobo. En algunos ejemplos, simplemente se deja reposar a temperatura ambiente la solución que contiene el diana-conjugado de IR700-molécula hidrófobo hasta que el diana-conjugado de IR700-molécula hidrófobo forme un agregado o precipitado (al menos 30 segundos, al menos 1 minuto, al menos 2 minutos, al menos 5 minutos, al menos 10 minutos, al menos 15 minutos o al menos 30 minutos, tal como de 1 a 5 minutos, de 1 a 2 minutos, de 1 a 10 minutos o de 10 a 20 minutos). En algunos ejemplos, los métodos in vitro o ex vivo se realizan a una temperatura de al menos 4 °C, al menos 20 °C, al menos 30 °C, al menos 35 °C, al menos 37 °C o al menos 40 °C, tal como aproximadamente de 4 °C a 37 °C, o de 25 °C a 37 °C.
El diana-conjugado de IR700-molécula hidrófobo se separa o elimina de la muestra, aislando así la molécula diana de la muestra. Se conocen métodos para separar un precipitado o agregado de una solución y pueden incluir, pero sin limitación, centrifugación (por ejemplo, centrifugado), filtración, cromatografía, permitir que el precipitado se deposite, o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, la muestra se puede centrifugar en condiciones que permitan que el diana-conjugado de IR700-molécula hidrófobo se sedimente en el fondo de un recipiente o contenedor, y el sobrenadante resultante (que está sustancialmente libre de la diana) se recoja o elimine. Por tanto, el sobrenadante resultante puede estar libre (o sustancialmente libre) de una diana no deseada. En algunos ejemplos, el sedimento resultante se analiza, por ejemplo, para determinar si la diana estaba presente en la muestra o para identificar otros agentes unidos a la diana. Como alternativa (o además de) la centrifugación, en algunos ejemplos, la muestra se puede filtrar en condiciones que permitan que el diana-conjugado de IR700-molécula hidrófobo se una a o quede atrapado por el filtro, y el sobrenadante resultante (que está libre o sustancialmente libre de la diana) se recoja. En algunos ejemplos, se analiza el filtro, por ejemplo, para determinar si la diana estaba presente en la muestra o para identificar otros agentes unidos a la diana. En algunos ejemplos, la muestra simplemente se deja asentar o reposar en condiciones que permiten que el diana-conjugado de IR700-molécula hidrófobo sedimente o se agregue en el fondo de un recipiente, y se recoge el sobrenadante resultante (que está sustancialmente libre de la diana). En algunos ejemplos, se analiza el sedimento, por ejemplo, para determinar si la diana estaba presente en la muestra o para identificar otros agentes unidos a la diana.
En algunos ejemplos, el método implica tratar la muestra varias veces con el método, tal como repetir uno o más de la puesta en contacto con el conjugado de IR700-molécula, la irradiación con luz NIR, la agregación del conjugado de IR700-molécula hidrófobo y la separación del conjugado IR700-molécula hidrófobo de la muestra, al menos dos veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces o al menos 20 veces.
En algunos ejemplos, el método incluye además medir o detectar la diana eliminada de la muestra. Dichas mediciones pueden ser cuantitativas o cualitativas.
En algunos ejemplos, el método incluye además detectar o medir otras moléculas unidas a la diana. Por ejemplo, el sedimento o filtro, u otro material/recipiente que contenga la diana unida al IR700 hidrófobo, puede analizarse. En algunos ejemplos, el filtro u otro material se lava o se trata de otro modo para liberar cualquier diana-conjugado de IR700-molécula hidrófobo unido o adherido al filtro u otro material. En algunos ejemplos, el sedimento, filtro, o el material liberado del filtro se analiza usando métodos inmunológicos para identificar otras proteínas unidas a la diana, tales como inmunohistoquímica, transferencia de Western, espectrometría (tal como espectrometría de masas, IR, Raman o FT-IR), cromatografía (tal como cromatografía de líquidos) y similares. En algunos ejemplos, el sedimento, el filtro, o el material liberado del filtro se analiza usando métodos de hibridación o secuenciación para identificar las moléculas de ácido nucleico unidas a la diana, tales como hibridación in situ, transferencia de Northern, transferencia de Southern, PCR y similares.
Muestras de ejemplo
Cualquier muestra biológica, de alimento o ambiental que puede contener (o se sabe que contiene o se sospecha que contiene) un agente diana puede usarse en los métodos en el presente documento. Las muestras también pueden incluir líquido de fermentación, líquidos de reacción (como los que se usan para producir los compuestos deseados, tales como un agente farmacéutico), y líquido de cultivo de tejidos u órganos.
Las muestras biológicas generalmente se obtienen de un sujeto y pueden incluir ADN genómico, ARN (incluyendo ARNm), proteína, células, o combinaciones de los mismos. Los ejemplos incluyen una biopsia tisular o tumoral, aspirado con aguja fina, lavado broncoalveolar, líquido pleural, líquido espinal, saliva, esputo, espécimen quirúrgico, líquido linfático, líquido ascítico, sangre periférica (tal como suero o plasma), médula ósea, orina, saliva, frotis bucal y material de autopsia. Las técnicas para la adquisición de dichas muestras son bien conocidas en la técnica (por ejemplo, véase Schluger et al. J. Exp. Med. 176:1327-33, 1992, para la recogida de muestras de suero). El suero u otras fracciones de sangre se pueden preparar de manera convencional. Por tanto, usando los métodos proporcionados en el presente documento, las moléculas diana en el cuerpo pueden detectarse y/o pueden eliminarse (por ejemplo, pueden eliminarse de la sangre o la médula ósea), tal como una célula (por ejemplo, PBMC, HSC, linfocitos), proteína, ácido nucleico, carbohidrato, lectina, patógeno, toxina, metal, fármaco u otra diana. En algunos ejemplos, los métodos se usan para eliminar células normales de una muestra (tales como linfocitos, monocitos, macrófagos, células dendríticas y células madre) que pueden causar trastornos al amplificar o suprimir la respuesta inmunitaria normal. Al eliminar dichas células, la respuesta inmunitaria normal puede restaurarse localmente. Como alternativa, las células pueden ser eliminadas para permitir su reemplazo con otras células administradas por vía exógena como ocurre en las terapias basadas en células. La muestra con células diana agotadas se puede devolver al mismo sujeto o a uno diferente si se desea. En algunos ejemplos, la muestra es un cultivo tisular o un cultivo de órganos que contiene al menos dos tipos de células diferentes (tal como al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 10 tipos de células diferentes, en donde uno de los tipos de células es la célula diana a eliminar.
Las muestras ambientales incluyen aquellas obtenidas de un medio ambiental, tal como agua, aire, suelo, polvo fino, madera, plantas o alimento (tal como un frotis de dicha muestra). En un ejemplo, la muestra es un frotis obtenido de una superficie, tal como una superficie que se encuentra en un edificio o en una casa. Por tanto, usando los métodos proporcionados en el presente documento, los productos nocivos que se encuentran en el medio ambiente pueden detectarse y eliminarse (por ejemplo, eliminarse de una fuente ambiental), tal como un patógeno, toxina, metal u otro producto nocivo. En algunos ejemplos, los métodos divulgados detectan y/o eliminan uno o más contaminantes de medicamentos farmacéuticos (por ejemplo, aquellos en un ambiente acuático), tales como antibióticos, medicación hipertensiva, antidepresivos, analgésicos, hormonas reproductivas u otros fármacos recetados.
En un ejemplo, la muestra es una muestra de alimento, tal como una muestra de carne, lácteos, frutas o verduras. Por ejemplo, usando los métodos proporcionados en el presente documento, los adulterantes en los productos alimenticios pueden detectarse y eliminarse (por ejemplo, eliminarse de un producto alimenticio), tales como un patógeno o toxina u otro producto dañino. Por ejemplo, bebidas (tales como leche, crema, soda, agua embotellada, agua saborizada, zumo y similares), y otros productos líquidos o semilíquidos (tales como el yogur) se pueden tratar con los métodos proporcionados en el presente documento. En algunos ejemplos, el líquido usado para descontaminar un artículo alimenticio, tal como carne, verduras o frutas, se trata con los métodos divulgados para eliminar impurezas o agentes nocivos del líquido usado.
En un ejemplo, la muestra es una muestra de una reacción química, tal como la que se usa para producir los compuestos deseados, tal como un agente farmacéutico. Por ejemplo, usando los métodos proporcionados en el presente documento, se pueden detectar y se pueden eliminar agentes no deseados generados durante la reacción química o contaminantes. En algunos ejemplos, dichos métodos se usan para purificar aún más el producto final. Por ejemplo, los subproductos de metales pesados se pueden eliminar de dichas reacciones usando un conjugado de IR-700-molécula de unión específica, tal como un conjugado de IR700-molécula que incluye un grupo de coordinación de metales (por ejemplo, EDTA, DTPA, DOTA).
En otros ejemplos, una muestra incluye una muestra de control, tal como una muestra que se sabe que contiene, o no contiene, una cantidad particular de la diana.
Una que una muestra se ha obtenido, la muestra puede usarse directamente, concentrarse (por ejemplo, por centrifugación o filtración), purificarse, licuarse, diluirse en un líquido, o combinaciones de los mismos. En algunos ejemplos, proteínas, células, ácidos nucleicos o patógenos se extraen de la muestra, y la preparación resultante (tal como una que incluye células aisladas, patógenos, ADN, ARN y/o proteínas) se analiza usando los métodos proporcionados en el presente documento.
Irradiación de la muestra o fuente
Después de que la muestra se ponga en contacto con uno o más conjugados de IR700-molécula, se irradia con luz NIR. Los métodos de irradiación se conocen en la técnica. En algunos ejemplos, una muestra es irradiada in vitro, tal como en una placa de cultivo tisular, tubo de ensayo, placa de múltiples pocillos, reactor de fermentación, tubo Eppendorf, placa de Petri, tubos y bolsas médicas, y similares. En algunos ejemplos, se irradia una muestra de alimento o producto alimenticio (tal como un lote de leche, una pieza de fruta o verdura, o carne). En algunos ejemplos, una muestra o área ambiental (tal como un área de tierra, agua, suelo o aire) es irradiada. En algunos ejemplos, se irradia una solución de fermentación u otra reacción (tal como la que produce un producto deseado).
En otros ejemplos, una muestra es irradiada ex vivo, por ejemplo, irradiando una muestra obtenida de un sujeto (tal como una muestra de sangre o una fracción de la misma). En algunos de estos ejemplos, a ese sujeto se le han administrado previamente conjugados de IR700-molécula, o el conjugado de IR700-molécula se pone en contacto o se incuba con la muestra después de que se ha eliminado del sujeto.
La muestra se irradia con una dosis de radiación a una longitud de onda de 660 nm a 710 nm, tal como de 660 nm a 700 nm, de 670 nm a 710 nm, de 680 nm a 700 nm, de 670 nm a 690 nm, por ejemplo, 680 nm o 690 nm. En ejemplos específicos, la muestra se irradia con una NIR usando un LED o un láser, tal como un LED a 690 nm /-20 nm o un sistema láser a 690 nm /-4 nm. En ejemplos particulares, la muestra se irradia a una dosis de al menos 1 J cm-2, tal como al menos 2 J cm-2, al menos 4 J cm-2, al menos 8 J cm-2, al menos 10 J cm-2, al menos 15 J cm-2, al menos 30 J cm-2, al menos 50 J cm-2, al menos 100 J cm-2 o al menos 500 J cm-2, por ejemplo, de 1 a 1000 J cm-2, de 1 a 500 J cm-2, de 1 a 20 J cm'2, de 1 a 10 J cm'2, de 30 a 50 J cm'2, de 10 a 100 J cm'2, de 4 a 8 J cm'2, de 5 a 10 J cm'2, o de 10 a 50 J cm-2.
Las muestras se pueden irradiar una o más veces. Por tanto, la irradiación se puede completar en un solo día, o se puede realizar repetidamente en varios días con la misma dosis o una diferente (tal como la irradiación al menos 2 veces diferentes, 3 veces diferentes, 4 veces diferentes, 5 veces diferentes o 10 veces diferentes). Las irradiaciones repetidas pueden realizarse el mismo día, en días sucesivos o cada 1 a 3 días, cada 3 a 7 días, cada 1 a 2 semanas, cada 2 a 4 semanas, cada 1 a 2 meses o incluso a intervalos más prolongados.
Métodos para eliminar una diana de un sujeto
Métodos similares a los métodos in vitro descritos anteriormente se pueden realizar in vivo. En el presente documento se proporcionan métodos para eliminar, tal como aislar o separar, una o más moléculas o agentes diana de un sujeto, tal como un mamífero, tal como un ser humano, ratón, primate, gato, perro u otro sujeto veterinario. Por ejemplo, el método se puede usar para eliminar o aislar al menos dos dianas diferentes, tal como al menos 3, al menos 4 o al menos 5 dianas diferentes, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dianas diferentes del sujeto. Por ejemplo, al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 (tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) diferentes conjugados de IR700-molécula pueden usarse en el mismo sujeto (por ejemplo, simultáneamente o al mismo tiempo), donde cada uno es específico para una diana diferente. Esto permite la eliminación de múltiples dianas del sujeto. Las dianas de ejemplo que se pueden eliminar,aislar o separar del sujeto incluyen, , proteína, una proteína, péptido, lecitina, carbohidrato, metal, molécula de ácido nucleico, molécula orgánica pequeña, fármacos, fármaco recreativo, agente farmacológico, quimioterapéutico, agente biológico, antibiótico, fármaco antihipertensivo, antidepresivo, analgésico, hormona reproductiva, anticoagulante, esteroide, estatina, patógeno o espora. El método también incluye detectar la diana eliminada después de que se haya eliminado del sujeto, detectar una reducción de la diana en el sujeto después del tratamiento, o ambos.
En un ejemplo, dichos métodos se usan para eliminar agentes no deseados (tales como metales, organismos patógenos, esporas, toxinas, veneno, células, fármacos recreativos, un fármaco terapéutico, proteínas, moléculas de ácido nucleico y similares), de un sujeto. Por ejemplo, los agentes no deseados se pueden eliminar de un sujeto mediante el uso de un conjugado de IR700-molécula, en donde la molécula del conjugado es un agente de unión específico para la diana a eliminar. En algunos ejemplos, el agente no deseado que se elimina del sujeto es un metal que es tóxico para el paciente, tal como un metal pesado, en donde la molécula del conjugado de IR700-molécula es un agente de unión específi
ejemplos, el agente no deseado que se elimina del sujeto es un patógeno, tal como un virus, hongo, parásito, célula bacteriana y similares, en donde la molécula del conjugado de IR700-molécula es un agente de unión específico para el patógeno a eliminar (por ejemplo, se une a una proteína o ácido nucleico patógeno específico). En algunos ejemplos, el agente no deseado que se elimina del sujeto es un veneno, por ejemplo, de un sujeto que ha sido mordido o picado por un animal venenoso (por ejemplo, araña, escorpión, hormiga, serpiente, pez, abeja o avispa), en donde la molécula del conjugado de IR700-molécula es un agente de unión específico para el veneno a eliminar (por ejemplo, se une a veneno de serpiente). En algunos ejemplos, el agente no deseado que se elimina del sujeto es un fármaco recreativo, por ejemplo, de un sujeto que ha tomado una sobredosis, en donde la molécula del conjugado de IR700-molécula es un agente de unión específico para el fármaco a eliminar (por ejemplo, se une a la cocaína o la heroína).
En algunos ejemplos, el agente no deseado es una pluralidad de toxinas, tales como toxinas más pequeñas que no se eliminan durante la diálisis renal. Por tanto, el método se puede usar en lugar de, o además de, diálisis renal, para eliminar toxinas u otros agentes no deseados de la sangre (y, por tanto, se puede usar en sujetos con insuficiencia renal).
En algunos ejemplos, el agente no deseado que se elimina del sujeto es una proteína o una molécula de ácido nucleico (tal como una proteína o un ácido nucleico cuya presencia o aumento provoca o exacerba una enfermedad, tal como una enfermedad autoinmunitaria o un cáncer), en donde la molécula del conjugado de IR700-molécula es un agente de unión específico para la proteína o molécula ácido nucleico a eliminar (por ejemplo, se une o se hibrida con la proteína o molécula de ácido nucleico, respectivamente).
En algunos ejemplos, los agentes no deseados pueden eliminarse de un órgano en el sujeto, por ejemplo, perfundiendo el órgano con uno o más conjugados de IR700-molécula deseados.
En algunos ejemplos, el agente no deseado que se elimina del sujeto es un fármaco farmacéutico, tal como un agente quimioterapéutico, agente biológico (por ejemplo, mAb, conjugados de anticuerpo-fármaco, tales como los conjugados con toxinas, y similares), antibiótico (por ejemplo, penicilina, ampicilina, metronidazol, tetraciclina, cipro, y similares), fármacos antihipertensivos (por ejemplo, diuréticos de tiazida, inhibidores de ACE, bloqueadores de los canales de calcio, bloqueadores beta y antagonistas de los receptores de la angiotensina II), antidepresivos (por ejemplo, inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina (SSRI), inhibidores de la recaptación de serotonina y noradrenalina (SNRI), antidepresivos tricíclicos (ATC), inhibidores de la monoaminooxidasa (IMAO), buprenorfina, triptófano, antipsicóticos, hierba de San Juan, por ejemplo prozac), analgésicos (por ejemplo, acetaminofeno, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), inhibidores de COX-2 y fármacos opioides tales como morfina, codeína y oxicodona), hormonas reproductivas (por ejemplo, estrógeno, testosterona y progesterona), anticoagulantes (por ejemplo, warfarina), esteroides (por ejemplo, prednisona), estatinas para reducir el colesterol (por ejemplo, Mevacor, Zocor, Pravachol), y otros fármacos recetados, en donde la molécula del conjugado de IR700-molécula es la diana a eliminar (por ejemplo, es el agente quimioterapéutico). Por ejemplo, dichos métodos pueden usarse para controlar la farmacocinética (por ejemplo, la semivida) de un fármaco farmacéutico, por ejemplo, para inactivarlo y eliminarlo del sujeto después de un período de tiempo deseado. Al conjugar dichos fármacos con el IR700, después de la irradiación con luz NIR, el fármaco conjugado con el colorante IR700 se agregará y será la diana para eliminación del cuerpo, por ejemplo a través del hígado y/o el bazo. Por tanto, si la semivida de un fármaco es más prolongada de lo deseado (lo que, en algunos ejemplos, puede causar una acumulación no deseada del fármaco en el cuerpo o puede causar efectos secundarios no deseados), puede reducirse exponiendo al paciente a la luz NIR después de un período de tiempo deseado después de la administración del conjugado de IR700-fármaco, inactivando así el fármaco.
En un ejemplo, dichos métodos se usan para eliminar agentes deseados (tales como una proteína, una molécula de ácido nucleico y similares), de un sujeto. Por ejemplo, dichos métodos se pueden usar para eliminar, separar o aislar una célula deseada de un paciente, tal como de una muestra de sangre o de médula ósea. En algunos ejemplos, dicho método es parte de un procedimiento de aféresis. Por ejemplo, células, tales como las PBMC o las células madre (como las células madre humanas) se pueden extraer de una muestra de sangre durante o después de un procedimiento de aféresis. En un ejemplo, se extrae sangre de un sujeto y se extraen o aíslan las células deseadas de la muestra de sangre, por ejemplo, usando anticuerpos específicos de CD apropiados. Por ejemplo, si se desea HSC, la muestra de sangre puede ponerse en contacto con conjugados de IR700-anticuerpo CD34, que se unirán a las HSC. Si se desean PBMC, la muestra de sangre puede ponerse en contacto con conjugados de IR700-anticuerpo CD19, que se unirán a las PBMC. Las células extraídas del paciente se pueden manipular ex vivo si se desea (por ejemplo, ampliado, manipulado mediante métodos de terapia génica y similares), y reintroducir en el mismo sujeto o en uno diferente, tal como uno que recibe un trasplante). En otros ejemplos, se pueden eliminar las células contaminantes en un cultivo de células u órganos. En algunos ejemplos, se pueden eliminar las células inmunitarias que estimulan la enfermedad (por ejemplo, enfermedad autoinmunitaria o alergia) o las células que inhiben la respuesta del hospedador (por ejemplo, como en la tolerancia inmunitaria en el cáncer). En algunos ejemplos, dichos métodos se pueden usar para eliminar, separar o aislar una proteína deseada (por ejemplo, un anticuerpo) o una molécula de ácido nucleico de un sujeto (tal como un ser humano o un animal de laboratorio), tal como de una muestra de sangre o de médula ósea.
En algunos ejemplos, el conjugado de IR700-molécula y/o la luz NIR se pone en contacto con la muestra biológica después de que se he retirado del sujeto, y la muestra (o una porción de la misma) con la diana eliminada (por ejemplo, dianas deseables o dianas indeseables) se devuelve al mismo sujeto o un sujeto diferente. En algunos ejemplos, al sujeto se le puede administrar el conjugado de IR700-molécula y exponerlo a la luz NIR, y a continuación los agregados resultantes que contienen la diana se pueden eliminar del sujeto eliminándolos de una muestra obtenida del sujeto (por ejemplo, durante un procedimiento de aféresis en el que se extrae sangre del sujeto, los agregados de la sangre se eliminan, y la sangre libre de diana (o sustancialmente libre de diana) se devuelve al sujeto (o a un sujeto diferente).
En un ejemplo, dichos métodos se usan para eliminar una diana de un sujeto, que en algunos ejemplos se usa además para identificar otros agentes que se unen a la diana. Por tanto, por ejemplo, los métodos se pueden usar para eliminar un patógeno, toxina, fármaco, proteína, lectina, carbohidrato, ácido nucleico, anticuerpo, célula diana, y similares de un sujeto. En algunos ejemplos, otros agentes que se unen al patógeno, toxina, fármaco, proteína, lectina, carbohidrato, ácido nucleico, anticuerpo diana y similares se identifican después de la eliminación del sujeto.
No se requiere la eliminación, el aislamiento o la separación completos de la diana del sujeto para que el método sea eficaz. Por ejemplo, el método puede incluir la reducción de una cantidad de agente diana en el sujeto en al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 %, por ejemplo, en comparación con una cantidad de diana presente antes de la administración de un conjugado de IR700-molécula al sujeto y la irradiación del sujeto con luz NIR. En algunos ejemplos, el método aísla una diana, de modo que la diana sea al menos un 20 % pura, tal como al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % pura, por ejemplo, en comparación con la pureza o la concentración de la diana sin añadir un conjugado de IR700-molécula al sujeto y la irradiación del sujeto con luz NIR.
En ejemplos particulares, el método incluye administrar uno o más conjugados de IR700-molécula a un sujeto, en donde la molécula conjugada con el IR700 incluye la molécula diana o en donde la molécula conjugada con el IR700 se une específicamente a la molécula diana (por ejemplo, tiene especificidad por la diana y, por tanto, se une preferentemente a la diana en relación con otras moléculas). Los ejemplos no limitantes de agentes de unión específicos incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos, moléculas Affibody®, haptenos, moléculas de ácido nucleico funcionales (tales como aptámeros y ADNzimas), moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, aquellas que tienen una secuencia complementaria a una molécula de ácido nucleico diana tal que las moléculas de ácido nucleico se hibridan entre sí), lectinas (proteínas de unión a carbohidratos), proteínas y similares. Los conjugados de IR700-molécula se pueden administrar a un sujeto en presencia de un portador farmacéuticamente aceptable, tal como un líquido farmacéutica y fisiológicamente aceptable, por ejemplo, en condiciones que permitan que los conjugados de IR700-molécula se unan específicamente a una diana (por ejemplo, en los casos en que la molécula sea un agente de unión específico), o que tengan un efecto terapéutico (por ejemplo, en los casos en que la molécula sea la diana, tal como un fármaco farmacéutico). Por ejemplo, el conjugado de IR700-molécula puede estar presente en un portador farmacéuticamente eficaz, tal como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas equilibradas (tales como PBS/EDTA), dextrosa acuosa, aceite de sésamo, glicerol, etanol, combinaciones de los mismos, o similares, como vehículo. El portador y la composición pueden ser estériles y la formulación se adapta al modo de administración.
En los casos en los que la molécula del conjugado de IR700-molécula es un agente de unión específico, si la diana está presente en el sujeto, esto dará como resultado la formación de un complejo de diana-conjugado de IR700-molécula.
En ejemplos particulares, el conjugado de IR700-molécula y el complejo de diana-conjugado de IR700-molécula son hidrófilos antes de la exposición a la luz NIR. Después de poner en contacto o administrar los uno o más conjugados de IR700-molécula en condiciones que permitan que la molécula del conjugado de IR700-molécula se una a su diana o que permitan que la molécula del conjugado de IR700-molécula tenga un efecto terapéutico, el sujeto se irradia en condiciones que permiten la escisión del IR700, por ejemplo con luz NIR, tal como a una longitud de onda de 660 nm a 710 nm (por ejemplo, de 680 nm a 690 nm), por ejemplo a una dosis de al menos 10 J cm-2 Dichas condiciones escinden (eliminan) una porción de la parte de IR700 del conjugado de IR700-molécula o del complejo de dianaconjugado de IR700-molécula (por ejemplo, véase la porción rodeada por un círculo de la figura 2), generando así un conjugado de IR700-molécula hidrófobo o un complejo de diana-conjugado de IR700-molécula hidrófobo. En un ejemplo, hay al menos 10 minutos, al menos 30 minutos, al menos 1 hora, al menos 4 horas, al menos 8 horas, al menos 12 horas, al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas, al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas o al menos 4 semanas, (tal como de 1 a 4 horas o de 30 minutos a 1 hora, de 10 minutos a 60 minutos, o de 30 minutos a 8 horas) entre la puesta en contacto de la célula con el conjugado de IR700-molécula y la irradiación. La longitud de onda de la luz de excitación NIR permite la penetración de al menos varios centímetros en los tejidos. Por ejemplo, mediante el uso de diodos láser acoplados a fibra con puntas difusoras, La luz NIR se puede administrar dentro de varios centímetros de áreas ubicadas en profundidad en la superficie del cuerpo. Además, se pueden apuntar a dianas circulantes ya que se pueden excitar cuando atraviesan vasos superficiales (por ejemplo, usando los dispositivos portátiles LED NIR divulgados en el presente documento). En algunos ejemplos, el sujeto es irradiado por el uso de un dispositivo vestido por (o que cubre) el sujeto, en donde el dispositivo incluye un diodo emisor de luz (LED) NIR. En algunos ejemplos, lo siguiente se elimina del conjugado de IR700-molécula o del complejo de diana-conjugado de IR700-molécula después de la exposición a la luz NIR:
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Por tanto, el conjugado de IR700-molécula o el complejo de diana-conjugado de IR700-molécula cambia de una molécula hidrófila a una que es hidrófoba, después de la exposición a la luz NIR. Como resultado, el conjugado de IR700-molécula hidrófobo o el complejo de diana-conjugado de IR700-molécula hidrófobo se agrega después de la exposición a la luz NIR, permitiendo la separación o eliminación de la diana del sujeto. Por ejemplo, dichos agregados pueden alcanzar el hígado y/o el bazo, donde se degradan y se destinan a su eliminación (por ejemplo, excreción) del cuerpo.
El conjugado de IR700-molécula hidrófobo resultante o el complejo de diana-conjugado de IR700-molécula hidrófobo se puede eliminar (por ejemplo, excretar) del sujeto. El método también puede incluir la detección de una disminución en la cantidad de la molécula diana en el sujeto (por ejemplo, la medición de una cantidad absoluta o relativa de la diana en una muestra de sangre obtenida del sujeto) o la detección de un aumento en la cantidad de la molécula diana (o un producto de degradación de la misma) excretada por el sujeto (por ejemplo, después del catabolismo en el hígado, la diana excretada puede detectarse en la orina o en las heces). Dichas mediciones de la diana pueden ser cuantitativas o cualitativas.
En algunos ejemplos, el método incluye además detectar o medir otras moléculas unidas a la diana después de que se elimine del cuerpo. Por ejemplo, el conjugado de IR700-molécula hidrófobo excretado o el complejo de dianaconjugado de IR700-molécula hidrófobo, pueden analizarse, por ejemplo, usando métodos inmunológicos para identificar otras proteínas unidas a la diana, tales como inmunohistoquímica, transferencia de Western, espectrometría (tal como espectrometría de masas, IR, Raman o FT-IR), cromatografía (tal como cromatografía de líquidos) y similares. En algunos ejemplos, el sedimento, el filtro, o el material liberado del filtro se analiza usando métodos de hibridación o secuenciación para identificar las moléculas de ácido nucleico unidas a la diana, tales como hibridación in situ, transferencia de Northern, transferencia de Southern, PCR y similares.
En algunos ejemplos, el método implica tratar al sujeto varias veces con el método, tal como repetir uno o más de la administración del conjugado de IR700-molécula, la irradiación con luz NIR, la agregación del conjugado de IR700-molécula hidrófobo y la eliminación del conjugado IR700-molécula hidrófobo del sujeto, al menos dos veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces o al menos 20 veces.
Los métodos divulgados se pueden usar para eliminar agentes diana fijados en el cuerpo, así como dianas en la circulación (por ejemplo, células de leucemia, metástasis, células tumorales circulantes). Sin embargo, las dianas circulantes, debido a su naturaleza, no pueden ser expuestas a la luz por mucho tiempo. Por tanto, si la diana es una que circula por todo el cuerpo, los métodos se pueden lograr mediante el uso de un dispositivo que se puede llevar puesto o que cubre partes del cuerpo. Por ejemplo, dicho dispositivo se puede llevar puesto durante períodos de tiempo prolongados. Artículos que se pueden llevar puestos todos los días (por ejemplo, relojes de pulsera, joyas (tales como un collar o una pulsera), mantas, ropa (por ejemplo, ropa interior, calcetines y plantillas para zapatos) y otros artículos que se pueden llevar todos los días) que incorporan diodos emisores de luz (LED) NIR y/o un sistema láser (por ejemplo, un láser NIR de argón) y un paquete de baterías, se puede usar. Dichos dispositivos producen luz sobre la piel subyacente al dispositivo durante períodos prolongados, lo que conduce a una exposición continua de luz a los vasos superficiales durante períodos prolongados. Las dianas circulantes son expuestas a la luz a medida que transitan por el área subyacente al dispositivo. Como ejemplo, una versión de reloj de pulsera o una pulsera de este dispositivo puede incluir una serie de LED NIR y/o un láser (por ejemplo, un láser NIR de argón), con un módulo de batería para llevarlo puesto durante la mayor parte del día.
Por ejemplo, después de la administración de uno o más conjugados de IR700-molécula (por ejemplo, por vía intravenosa), si las dianas circulantes apropiadas (por ejemplo, células) se unen a los conjugados de IR700-molécula. A medida que estas células u otras dianas fluyen dentro de los vasos adyacentes al LED y/o al láser (po rejemplo., un láser NIR de argón) presente en el artículo que se puede llevar puesto todos los días (por ejemplo, pulsera o reloj de pulsera), estarían expuestas a la luz NIR, lo que haría que el IR700 y la molécula unida al mismo fueran susceptibles de escisión y agregación. La dosis de luz puede ajustarse de acuerdo con el diagnóstico y el tipo de diana.
En algunos ejemplos, el método también incluye administrar uno o más agentes o tratamientos terapéuticos adicionales. Los ejemplos de dichos agentes adicionales incluyen, pero no se limitan a: agentes antineoplásicos, tales como agentes o terapias quimioterapéuticos y antiangiogénicos, tales como radioterapia.
Sujetos de ejemplo
En algunos ejemplos, los métodos divulgados se usan para eliminar una diana de un sujeto. En un ejemplo, el conjugado de IR700-molécula incluye un agente de unión específico que puede unirse o hibridarse con la diana. Dichos conjugados de IR700-molécula son útiles para sujetos que tienen un trastorno que resulta de la presencia o aumento de la cantidad de la diana, tal como alguien que está infectado con un patógeno diana, alguien que ha sido mordido o picado por un animal venenoso, alguien que tiene un trastorno resultante de la presencia de células no deseadas (tal como cáncer o un trastorno autoinmunitario o una alergia), alguien que tiene un trastorno que resulta de la presencia o aumento de las cantidades de una proteína, célula o molécula de ácido nucleico diana, alguien que ha tenido una sobredosis de una diana farmacológica, y similares. En un ejemplo, el sujeto es un ser humano o animal de laboratorio, tal como un conejo o un ratón, que tiene un anticuerpo, proteína, célula o molécula de ácido nucleico diana deseada, a aislar.
En un ejemplo, el conjugado de IR700-molécula incluye un fármaco terapéutico. Dichos conjugados de IR700-fármaco son útiles para sujetos o, por ejemplo, un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría del tratamiento con el fármaco diana (por ejemplo, un fármaco farmacológico).
En un ejemplo, el sujeto tiene cáncer, tal como cáncer de mama, hígado, riñón, útero, colon, ovario, próstata, páncreas, cerebro, cuello uterino, hueso, piel o pulmón.
Los métodos divulgados se pueden usar en cualquier sujeto mamífero, tal como un sujeto humano o veterinario. En algunos ejemplos, el sujeto es alguien que ha recibido otras terapias, pero esas otras terapias no han proporcionado una respuesta terapéutica deseada. En algunos ejemplos, el método incluye seleccionar un sujeto que se beneficiará de las terapias divulgadas.
Administración de conjugados de IR700-molécula
Los conjugados de IR700-molécula y los agentes terapéuticos adicionales (tales como los agentes antineoplásicos) pueden ponerse en contacto con una muestra in vitro, por ejemplo, añadiendo los conjugados de IR700-molécula a los medios de crecimiento en los que las células crecen o pueden ponerse en contacto con una célula in vivo, por ejemplo, administrando los conjugados de IR700-molécula al sujeto a tratar.
Los conjugados de IR700-molécula se pueden administrar de manera local o sistémica usando cualquier método conocido en la materia. Aunque se proporcionan ejemplos específicos, un experto en la materia apreciará que se pueden usar métodos alternativos de administración de los conjugados de IR700-molécula divulgados y agentes terapéuticos adicionales. Dichos métodos pueden incluir, por ejemplo, el uso de catéteres o bombas implantables para proporcionar una infusión continua durante un período de varias horas a varios días en el sujeto que necesita tratamiento.
En un ejemplo, los conjugados de IR700-molécula se administran por vía parenteral, que incluye inyección directa o infusión en un tumor (por vía intratumoral). Además, o como alternativa, los conjugados de IR700-molécula divulgados se pueden administrar por vía sistémica, por ejemplo, por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía subcutánea, por vía intradérmica, por vía intraperitoneal, por vía subcutánea o por vía oral, a un sujeto que tiene un tumor (tal como cáncer).
La dosis de los conjugados de IR700-molécula que se administrarán a un sujeto no están sujetas a límites absolutos, pero dependerán de la naturaleza de la composición y sus principios activos y sus efectos secundarios no deseados (por ejemplo, respuesta inmunitaria contra un agente de unión específico), el sujeto que se está tratando y el tipo de afección que se está tratando y la forma de administración. Generalmente, la dosis será una cantidad terapéuticamente eficaz, tal como una cantidad suficiente para lograr un efecto biológico deseado, por ejemplo, una cantidad que sea eficaz para eliminar sustancialmente la diana del sujeto (por ejemplo, eliminar al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 %, tal como del 80 al 100 %, del 80 al 99,9 %, del 90 al 95 %, o del 90 al 99 %).
Dosis de agentes terapéuticos adicionales (tales como antibióticos, antivíricos, inmunosupresores y similares) que se pueden usar en combinación con los métodos divulgados son conocidas en la técnica.
Para la administración intravenosa de los conjugados de IR700-molécula, las dosis de ejemplo para la administración a un sujeto para un único tratamiento pueden variar de 0,5 a 100 mg/60 kg de peso corporal, de 1 a 100 mg/60 kg de peso corporal, de 1 a 50 mg/60 kg de peso corporal, de 1 a 20 mg/60 kg de peso corporal, por ejemplo de aproximadamente 1 o 2 mg/60 kg de peso corporal. En otro ejemplo más, una cantidad terapéuticamente eficaz de conjugados de IR700-molécula administrada por vía i.p. o intratumoral puede variar de 10 |jg a 5000 |jg de conjugados de IR700-molécula por 1 kg de peso corporal, tal como de 10 jg/kg a 1000 jg/kg, de 10 jg/kg a 500 jg/kg, o de 100 jg/kg a 1000 jg/kg.
En un ejemplo, la dosis de un conjugado de IR700-molécula administrada a un paciente humano es de al menos 50 mg, tal como al menos 100 mg, al menos 300 mg, al menos 500 mg, al menos 750 mg o incluso 1 g.
Los tratamientos con los conjugados de IR700-molécula divulgados (y agentes terapéuticos adicionales) se pueden completar en un solo día o se pueden realizar de manera repetida en varios días con la misma dosis o con una diferente. Los tratamientos repetidos se pueden realizar el mismo día, en días sucesivos o cada 1 a 3 días, cada 3 a 7 días, cada 1 a 2 semanas, cada 2 a 4 semanas, cada 1 a 2 meses o incluso a intervalos más prolongados.
Irradiación de sujetos o células
Después de que los sujetos y/o las células se pongan en contacto con uno o más conjugados de IR700-molécula, se irradian. Se conocen bien en la técnica los métodos de irradiación. En algunos ejemplos, las células son irradiadas in vitro después de la eliminación del sujeto, tal como en una placa de cultivo tisular o en un tubo o bolsa médica (por ejemplo, durante la aféresis). En otros ejemplos, un sujeto es irradiado in vivo, por ejemplo, irradiando a un sujeto al que se le han administrado previamente conjugados de IR700-molécula. En algunos ejemplos, una porción del sujeto es irradiada, por ejemplo, un órgano u otra área donde se sospecha que está la diana (por ejemplo, en el hígado, corazón, cerebro o estómago, por ejemplo) en el sujeto puede ser irradiado.
El sujeto o las células se irradian con una dosis terapéutica de radiación, tal como a una longitud de onda de 660 - 710 nm, tal como de 660 nm - 700 nm, de 680 nm - 700 nm, de 670 nm - 690 nm, por ejemplo, 680 nm o 690 nm. En ejemplos particulares, las células o el sujeto se irradian a una dosis de al menos 1 J cirr2, al menos 4 J cirr2, tal como al menos 10 J cirr2 al menos 30 J cirr2 al menos 50 J cirr2 al menos 100 J cirr2 o al menos 500 J cirr2 por ejemplo, 1 - 1000 J cm-2, 1 - 500 J cm-2, de 30 a 50 J cm-2, 4 - 8 J cm-2, 10 - 100 J cm-2 o 10 - 50 J cm-2.
Las células (o pacientes) pueden irradiarse una o más veces. Por tanto, la irradiación se puede completar en un solo día, o se puede realizar repetidamente en varios días con la misma dosis o una diferente (tal como la irradiación al menos 2 veces diferentes, 3 veces diferentes, 4 veces diferentes, 5 veces diferentes o 10 veces diferentes). Las irradiaciones repetidas pueden realizarse el mismo día, en días sucesivos o cada 1 a 3 días, cada 3 a 7 días, cada 1 a 2 semanas, cada 2 a 4 semanas, cada 1 a 2 meses o incluso a intervalos más prolongados.
Dispositivos de ejemplo que contienen LED y/o láseres NIR
Cualquier tipo de artículo que se pueda usar o colocar en el cuerpo, y que sea susceptible de incorporar sistemas LED y/o láser NIR (por ejemplo, un láser NIR de argón), puede usarse en los métodos descritos en el presente documento. En un ejemplo, el dispositivo es una cámara en la que se inserta el paciente. Dichos dispositivos se pueden usar para eliminar dianas presentes en el cuerpo, tales como las que se encuentran en la sangre o la linfa, o en la piel.
Para eliminar adecuadamente una cantidad suficiente de la o las dianas en el cuerpo, puede ser necesario usar los dispositivos durante un período prolongado de tiempo, tal como varias semanas o meses. Por tanto, estos dispositivos se pueden incorporar en la ropa de todos los días, joyas y ropa de dormir tal como mantas. Estos dispositivos permiten exponer al paciente a la luz NIR usando prendas de vestir y joyas portátiles de uso diario para que el tratamiento sea privado y no interfiera en las actividades cotidianas. Por ejemplo, un collar que incorpore LED NIR y/o un láser (por ejemplo, un láser NIR de argón) puede personalizarse según los gustos del paciente y usarse discretamente durante el día para la terapia (por ejemplo, escindir conjugados de IR700-molécula que pasan a través de la arteria carótida y otros vasculatura en el cuello). Múltiples dispositivos de naturaleza "cotidiana" similar (mantas, pulseras, collares, ropa interior, calcetines, plantillas para zapatos y similares) podría ser usadas por el mismo paciente durante el período de tratamiento. Por ejemplo, mientras duerme, un paciente podría usar la manta NIR. Los dispositivos también pueden incluir una fuente de alimentación, tal como una batería y un elemento de refrigeración para evitar el sobrecalentamiento de dispositivos tales como mantas.
En un ejemplo, el dispositivo es joyería, tal como un anillo, reloj, pulsera o collar. En otro ejemplo, el artículo es una prenda de vestir o un accesorio, tal como una camisa, cinturón, pantalones, ropa interior, calcetines, abrigo, plantilla para zapatos, bufanda, sombrero, muñequera, guantes, y similares. En otro ejemplo, el dispositivo es un artículo que puede cubrir el cuerpo, tal como una manta o una toalla. En otro ejemplo, el dispositivo es una cámara de luz de cuerpo entero que expone la piel directamente (dicho dispositivo también podría incluir una fuente de alimentación y/o fuente de refrigeración).
Al llevar puesto el dispositivo que incorpora uno o más LED NIR (tal como al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 10, al menos 20, o al menos 50 LED NIR) y/o un láser (por ejemplo, un láser NIR de argón), dianas presentes en el cuerpo (por ejemplo, sangre, linfa o piel) quedan expuestas a la luz generada por los LED NIR o el láser (tales como un LED NIR o láser que emite de 660 a 710 nm, tal como de 670 a 710 nm o de 680 a 700 nm). La luz emitida por el LED NIR y/o un láser (por ejemplo, un láser NIR de argón) puede penetrar la piel y los vasos sanguíneos (tales como la arteria carótida o la microvasculatura de la piel), permitiendo así que la luz active el conjugado de IR700-molécula (que puede incluir la diana o estar unido a la diana), escindiendo así el IR700 y haciendo que éste (y cualquier molécula unida al mismo) se agregue. Los LED NIR y/o un láser (por ejemplo, un láser NIR de argón) se pueden colocar en el dispositivo para garantizar que se apunte a la piel, los vasos sanguíneos o el sistema linfático.
Los dispositivos NIR LED y/o láser (por ejemplo, un láser NIR de argón) que se pueden usar en los métodos proporcionados en el presente documento están disponibles en el mercado. Los productos aplicables de un fabricante, Marubeni America, se enumeran a continuación. El primer producto, un LED moldeado, tiene poca potencia pero podría usarse durante un tiempo de exposición más largo. Las otras opciones tienen mayor potencia y, por tanto, pueden beneficiarse de provisiones para enfriamiento adicional. Salvo el último, que está empaquetado en una caja de metal de 25 mm x 18 mm, los otros son aplicables a dispositivos que se pueden llevar puestos tales como pulseras, collar, ropa interior, calcetines, guantes, sombreros y otros artículos que se pueden llevar puestos. Todos son utilizables en mantas, dispositivos portátiles o cámaras.
Por ejemplo, Marubeni America Corporation (tech-led.com/index.shtml) proporciona los siguientes LED NIR con opciones de lentes para configurar el patrón de irradiación: LED moldeado (www.techled.com/data/L680-AU.pdf) de 5 mm de diámetro, tiene una potencia radiada total de 4 mW, densidad de potencia calculada de 5 mW cirr2 y un requisito de potencia de 1,8 V 20 mA; LED de montaje en superficie de 3,5 mm x 2,7 mm, tiene una potencia radiada total de 3 mW, densidad de potencia calculada de 32 mW cirr2 y un requisito de potencia de 1,9 V 50 mA; Super Beam (techled.com/Superbeam_LEDs.shtml) de 7,6 mm x 7,6 mm, tiene una potencia radiada total de 20-52 mW, densidad de potencia calculada de 34-90 mW cirr2 y un requisito de potencia de 1,65 V 100 mA; Montaje en superficie de alta potencia (tech-led.com/SMB_BL_LEDs.shtml) de 5 mm x 5 mm o 7 mm de diámetro, tiene una potencia radiada total de 90 mW, densidad de potencia calculada de 360 mW cm-2 y un requisito de potencia de 2,4V 500 mA; e iluminadores de alta potencia (techled.com/High_Power_Illuminators.shtml) que es de 25 mm x 18 mm, tiene una potencia radiada total de 150 mW, densidad de potencia calculada de 33 mW cirr2 y un requisito de potencia de 10 V 120 mA. Como alternativa, se pueden fabricar dispositivos de este tipo que emitan luz a 690 nm con una potencia similar con un pulso intermitente corto e intenso.
Durante la experimentación in vitro, luz NIR con una densidad de potencia de 2,2 mW cm'2 (o 2,2 mJ s'1 cm'2) indujo muerte celular. Suponiendo un coeficiente de atenuación para tejido de 4 cm-1, la intensidad de la luz se reduciría al 10 % a 5,8 mm y al 1 % a 12 mm. Esto indica que para aplicaciones in vivo, la densidad de potencia requerida debe ser 10-100 veces mayor. Esto es, la dosis de luz emitida por el dispositivo LED NIR en algunos ejemplos es de al menos 20 mW cm-2, tal como a menos 50 mW cm-2, al menos 100 mW cm-2, al menos 150 mW cm-2, al menos 200 mW cm-2 o, al menos 300 mW cm-2. Se pueden organizar múltiples LED NIR en una matriz bidimensional para cubrir áreas más grandes. En un ejemplo, se usa un láser como fuente de luz NIR como alternativa a un LED.
Los LED NIR y/o un láser (por ejemplo, un láser NIR de argón) se pueden alimentar mediante una fuente de alimentación (que puede ser directa o indirectamente parte del dispositivo). El requisito de fuente de alimentación dependería de la cantidad de LED y láseres en el dispositivo. Por ejemplo, se pueden usar una o más baterías para alimentar el LED NIR. Para algunos LED, 4 pilas AA pueden alimentar 3 LED en serie. Una pila alcalina AA tiene una capacidad nominal máxima de 3000 mAh, por lo que esta configuración proporciona potencias de hasta 150, 60 y 30 horas a 20, 50 y 100 mA.
En algunos ejemplos, el dispositivo incluye además un dispositivo de refrigeración (que puede ser directa o indirectamente parte del dispositivo). Por ejemplo, se pueden usar disipadores de calor para refrigeración pasiva o activa. Otra alternativa es un efecto termoeléctrico (Peltier). Esto consumiría energía adicional, pero se puede usar en aplicaciones donde los requisitos de potencia necesitarían un adaptador de CA enchufable.
Otro tipo de dispositivo que se puede usar con los métodos divulgados es un dispositivo similar a una linterna con LED NIR y/o un láser (por ejemplo, un láser NIR de argón). Dicho dispositivo puede usarse para terapia focal durante la cirugía, o incorporarse a endoscopios para aplicar luz NIR a las superficies del cuerpo después de la administración del conjugado de IR700-molécula. Dichos dispositivos pueden ser usados por médicos o personal sanitario cualificado para dirigir el tratamiento a dianas particulares en el cuerpo.
Tratamiento usando LED NIR que se pueden llevar puestos
Como se describe en el presente documento, los métodos divulgados se pueden usar para eliminar dianas in vivo. En algunos ejemplos, para eliminar dianas circulantes en el cuerpo o presentes en la piel, el paciente puede llevar puesto un dispositivo que incorpore un LED NIR. En algunos ejemplos, el paciente usa al menos dos dispositivos, por ejemplo, una prenda de vestir o joyas durante el día y una manta durante la noche. En algún ejemplo, el paciente usa al menos dos dispositivos al mismo tiempo, por ejemplo, dos prendas de vestir. Estos dispositivos permiten exponer al paciente a la luz NIR usando prendas de vestir y joyas portátiles de uso diario para que el tratamiento sea privado y no interfiera en las actividades cotidianas. En algunos ejemplos, el dispositivo se puede llevar puesto discretamente durante el día para la terapia PIT.
En un ejemplo, al paciente se le administra uno o más conjugados de IR700-molécula (por ejemplo, una o más dosis) usando los métodos descritos en el presente documento. A continuación, el paciente lleva puesto un dispositivo que incorpora un LED NIR, permitiendo la terapia a largo plazo y la eliminación de dianas presentes en la sangre o la linfa o en la piel. En algunos ejemplos, la dosis es al menos 1 J cirr2, al menos 10 J cirr2, al menos 20 J cm-2 o al menos 30 J cm-2, tal como 20 J cm-2 o 30 J/cm2. En algunos ejemplos, la administración de los conjugados de IR700-molécula se repite durante un período de tiempo (por ejemplo, dos veces por semana, cada dos días, cada dos semanas, dos veces al mes, mensualmente o cada dos meses), para asegurar que los niveles terapéuticos/eficaces estén presentes en el cuerpo.
En algunos ejemplos, el paciente lleva puesto o usa el dispositivo, o combinación de dispositivos, durante al menos 1 semana, tal como al menos 2 semanas, al menos 4 semanas, al menos 8 semanas, al menos 12 semanas, al menos 4 meses, al menos 6 meses o incluso al menos 1 año. En algunos ejemplos, el paciente lleva puesto o usa el dispositivo, o combinación de dispositivos, durante al menos 4 horas al día, tal como de al menos 12 horas al día, al menos 16 horas al día, al menos 18 horas al día, o 24 horas al día. Es posible que múltiples dispositivos de naturaleza "cotidiana" similar (mantas, pulseras, collares, ropa interior, calcetines, plantillas para zapatos) podrían ser usados por el mismo paciente durante el período de tratamiento. Por la noche, el paciente puede usar la manta LED NIR u otra cobertura.
Dianas de ejemplo
Los métodos divulgados pueden diseñarse para eliminar o aislar cualquier agente diana de interés in vitro, ex vivo o in vivo. Por tanto, los métodos y los conjugados de IR700-molécula proporcionados en el presente documento se pueden usar para eliminar o aislar cualquier agente diana de interés, tales como los ejemplos específicos proporcionados en el presente documento. A continuación, se proporcionan agentes diana de ejemplo; sin embargo, un experto en la materia apreciará que se pueden eliminar otros agentes diana con los métodos divulgados y los conjugados de IR700-molécula. Como se describe en el presente documento, seleccionar un agente de unión específico apropiado que se una o se hibride con el agente diana, permite desarrollar un conjugado de IR700-agente de unión específico para eliminar, separar o aislar un agente diana en particular.
Metales
En un ejemplo, el agente diana es un metal (por ejemplo, elementos, compuestos o aleaciones que tienen alta conductividad eléctrica), tal como un metal pesado o un metal nutricional. Por tanto, los métodos divulgados y los conjugados de IR700-molécula permiten la eliminación de metales in vivo, ex vivo o in vitro. Los metales ocupan la mayor parte de la tabla periódica, mientras que los elementos no metálicos solo se pueden encontrar en el lado derecho de la Tabla Periódica de los Elementos. Una línea diagonal trazada desde el boro (B) hasta el polonio (Po) separa los metales de los no metales. La mayoría de los elementos de esta línea son metaloides, a veces llamados semiconductores. Los elementos en la parte inferior izquierda de esta línea divisoria se llaman metales, mientras que los elementos en la parte superior derecha de la línea divisoria se denominan no metales.
Los metales pesados diana incluyen cualquier elemento químico metálico que tenga una densidad relativamente alta y sea tóxico, altamente tóxico o venenoso a bajas concentraciones. Ejemplos de metales pesados diana incluyen mercurio (Hg), cadmio (Cd), arsénico (As), cromo (Cr), talio (Tl), uranio (U), plutonio (Pu) y plomo (Pb).
Los iones metálicos nutricionales diana incluyen aquellos importantes en la nutrición animal y pueden ser necesarios para funciones biológicas particulares, incluyen calcio, hierro, cobalto, magnesio, manganeso, molibdeno, cinc, cadmio, cloruro de sodio, potasio, litio y cobre.
Los anticuerpos específicos para metales particulares se conocen en la técnica y pueden conjugarse con IR700 y usarse para los métodos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, Zhu et al. describen mAb específicos para iones de cadmio quelados (J. Agric. Food Chem. 55:7648-53, 2007), Wylie et al. describen mAb específicos para iones mercúricos (PNAS 89:4104-8, 1992), y Love et al. describen mAb específicos para indio (Biochem. 32:10950-9, 1993). Además, derivados bifuncionales de quelantes de iones metálicos (EDTA, DTPA, DOTA) pueden conjugarse covalentemente con proteínas y cargarse con el ion metálico deseado. Estos conjugados se pueden usar para preparar líneas celulares de hibridoma que sintetizan anticuerpos monoclonales específicos de metales. Además, se han desarrollado aptámeros para reconocer iones metálicos tales como Zn(II) (Ciesiolka et al., RNA 1: 538-550, 1995) y Ni(II) (Hofmann et al., RNA, 3:1289-1300, 1997). Es más, se conocen ADNzimas específicas para iones metálicos particulares, tales como plomo, cobre, uranio, cinc, mercurio, cadmio y magnesio. Dichas moléculas se pueden usar para generar un conjugado de IR700-molécula para eliminar un metal diana.
Patógenos/Microbios
Cualquier patógeno o microbio se puede eliminar o aislar usando los métodos y los conjugados de IR700-molécula proporcionados en el presente documento. En algunos ejemplos, se elimina una célula u organismo microbiano particular, una espora particular, o un virus particular. Los patógenos diana de ejemplo incluyen, pero sin limitación, virus, bacterias, hongos, nematodos y protozoos. A continuación se proporciona una lista no limitante de patógenos que se pueden eliminar o aislar usando los métodos proporcionados en el presente documento.
Por ejemplo, los virus diana incluyen virus de ARN de cadena positiva y virus de ARN de cadena negativa. Los virus de a Rn de cadena positiva diana de ejemplo incluyen, pero no se limitan a: picornavirus (tales como Aphthoviridae [por ejemplo, el virus de la fiebre aftosa (FMDV)]), Cardioviridae; Enteroviridae (tales como los virus Coxsackie, ecovirus, enterovirus y poliovirus); Rhinoviridae (rinovirus)); Hepataviridae (virus de la hepatitis A); togavirus (ejemplos de los cuales incluyen rubéola; alfavirus (tales como el virus de la encefalitis equina occidental, el virus de la encefalitis equina oriental y el virus de la encefalitis equina venezolana)); flavivirus (ejemplos de los cuales incluyen el virus del dengue, el virus del Nilo occidental y el virus de la encefalitis japonesa); Calciviridae (que incluye norovirus y sapovirus); y coronavirus (ejemplos de los cuales incluyen coronavirus SARS, tales como la cepa Urbani). Los ejemplos de virus de ARN de cadena negativa incluyen, pero no se limitan a: ortomixiovirus (tales como el virus de la gripe), rabdovirus (tales como el virus de la rabia) y paramixovirus (ejemplos de los cuales incluyen el virus del sarampión, el virus respiratorio sincitial y los virus de la paragripe).
Los virus también incluyen virus de ADN. Los virus de ADN diana incluyen, pero no se limitan a: herpesvirus (tales como el virus de la varicela-zoster, por ejemplo la cepa Oka; citomegalovirus; y el virus del herpes simple (HSV) tipos 1 y 2), adenovirus (tales como adenovirus tipo 1 y adenovirus tipo 41), poxvirus (tales como el virus Vaccinia) y parvovirus (tales como el parvovirus B19).
Otro grupo de virus incluye los retrovirus. Los ejemplos de retrovirus diana incluyen, pero no se limitan a: virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1), tales como el subtipo C; HIV-2; virus de anemia infecciosa equina; virus de inmunodeficiencia felina (FIV); virus de la leucemia felina (FeLV); virus de la inmunodeficiencia de los simios (SIV); y virus de sarcoma aviar.
En un ejemplo, el virus detectado con los métodos o sensores divulgados es uno o más de los siguientes: HIV-1 (por ejemplo, un anticuerpo contra HIV, un antígeno p24 o un genoma del HIV); virus de la hepatitis A (por ejemplo, un anticuerpo contra hepatitis A o genoma viral de la hepatitis A); virus de la hepatitis B (HB) (por ejemplo, un anticuerpo contra el núcleo de HB, un anticuerpo contra la superficie de HB, antígeno de superficie de Hb , o genoma viral de h B); virus de la hepatitis C (HC) (por ejemplo, un anticuerpo contra HC o genoma viral de HC); virus de la hepatitis D (HD) (por ejemplo, un anticuerpo contra HD o genoma viral de HD); virus de la hepatitis E (por ejemplo, un anticuerpo contra la hepatitis E o genoma viral de HE); un virus respiratorio (tal como gripe A y B, virus respiratorio sincitial, virus de la paragripe humana o metapneumovirus humano), o el virus del Nilo Occidental.
Los patógenos también incluyen bacterias. Las bacterias se pueden clasificar como gramnegativas o grampositivas. Ejemplos de bacterias gramnegativas diana incluyen, pero no se limitan a: Escherichia coli (por ejemplo, K-12 y O157:H7), Shigella dysenteriae y Vibrio cholerae. Ejemplos de bacterias grampositivas diana incluyen, pero no se limitan a: Bacillus anthracis, Staphylococcus aureus, Listeria, neumococo, gonococo y meningitis estreptocócica. En un ejemplo, la bacteria eliminada con los métodos divulgados y los conjugados de IR700-molécula es una o más de las siguientes: Streptococcus del grupo A; Streptococcus del grupo B; Helicobacter pylori; Staphylococcus aureus resistente a meticilina; enterococos resistentes a vancomicina; Clostridium difficile; E. coli (por ejemplo, cepas productoras de toxina Shiga); Listeria; Salmonella; Campylobacter; B. antracis (tal como esporas); Chlamydia trachomatis; Ébola, y Neisseria gonorrhoeae.
Los protozoos, los nemátodos y los hongos también son tipos de patógenos. Los protozoos diana de ejemplo incluyen, pero sin limitación, Plasmodium (por ejemplo, Plasmodium falciparum para diagnosticar la malaria), Leishmania, Acanthamoeba, Giardia, Entamoeba, Cryptosporidium, Isospora, Balantidium, Trichomonas, Trypanosoma (por ejemplo, Trypanosoma brucei), Naeglería, y Toxoplasma. Los hongos diana de ejemplo incluyen, pero sin limitación, Coccidiodes immitis y Blastomyces dermatitidis.
En un ejemplo, se eliminan esporas bacterianas. Por ejemplo, las bacterias del género Bacillus y Clostridium producen esporas que se pueden detectar. Por tanto, se pueden detectar esporas de C. botulinum, C. perfringens, B. cereus, y B. antracis (por ejemplo, detectando esporas de ántrax). También se reconocerá que las esporas de las plantas verdes también se pueden eliminar usando los métodos y los conjugados de IR700-molécula proporcionados en el presente documento.
En algunos ejemplos, se eliminan microbios intactos, por ejemplo, al unirse a una proteína de superficie diana (tal como un receptor) en el microbio usando conjugados de IR700-molécula que incluyen, por ejemplo, anticuerpos, ADNzimas o aptámeros de ADN específicos para la proteína diana. Por ejemplo, los anticuerpos que se pueden usar con los métodos divulgados y los conjugados de IR700-molécula están disponibles de fuentes comerciales, tales como Novus Biologicals (Littleton, CO) y ProSci Incorporated (Poway, CA) proporcionan anticuerpos específicos para E. coli; KPL (Gaithersburg, MD) proporciona anticuerpos específicos de Listeria; Thermo Scientific/Pierce Antibodies (Rockford, IL) proporciona anticuerpos específicos para varios microbios, incluyendo bacterias y virus, tales como la gripe A, HIV-1, HSV 1 y 2, E. coli, Staphylococcus aureus, Bacillus anthracis y sus esporas, Plasmodium y Cryptosporidium. Además, los aptámeros específicos para proteínas microbianas se pueden usar con los métodos descritos y los conjugados de IR700-molécula, tales como los específicos para la transcriptasa inversa de HIV (Chaloin et al., Nucleic Acids Research, 30:4001-8, 2002) y la ARN polimerasa dependiente de ARN del virus de la hepatitis C (Biroccio et al., J. Virol. 76:3688-96, 2002); toxinas tales como la toxina completa del cólera y la enterotoxina B estafilocócica (Bruno y Kiel, BioTechniques, 32: págs. 178-180 y 182-183, 2002); y esporas bacterianas tales como ántrax (Bruno y Kiel, Biosensors & Bioelectronics, 14:457-464, 1999). Además, las ADNzimas específicas para proteínas microbianas se pueden usar con los métodos descritos y los conjugados de IR700-molécula, tales como los específicos para Escherichia coli-K12 (Ali et al., Angewandte Chemie International Edition. 50, 3751-4, 2011; Li, Future Microbiol. 6, 973-976, 2011; y Aguirre, et al., J. Visualized Experiments. 63, 3961,2012). Dichas moléculas se pueden usar para generar un conjugado de IR700-molécula para eliminar un patógeno o una espora diana.
Proteínas/péptidos
Los métodos divulgados y los conjugados de IR700-molécula también permiten la eliminación o el aislamiento de una variedad de proteínas y péptidos, tales como receptores de la superficie celular, citocinas, anticuerpos, hormonas, lectinas, así como toxinas y venenos. En algunos ejemplos, se selecciona una proteína diana que está asociada con una enfermedad o afección, de modo que la eliminación o reducción de la proteína diana se pueda usar para tratar la enfermedad o afección. En ejemplos particulares, el conjugado de IR700-molécula puede unirse específicamente a una proteína o péptido diana (tal como un conjugado de IR700-molécula que incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo funcional, molécula Affibody®, molécula de ácido nucleico, hapteno, o ácido nucleico funcional específico para la proteína). Por ejemplo, los agentes de unión específicos para proteínas particulares son conocidos en la técnica. Por ejemplo, dichos anticuerpos están disponibles de fuentes comerciales, tales como Invitrogen, Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); ABCam (Cambridge, MA) e IBL International (Hamburgo, Alemania). Dichas moléculas se pueden usar para generar un conjugado de IR700-molécula para eliminar una proteína diana.
En algunos ejemplos donde la molécula diana es una proteína, la muestra a ensayar puede tratarse con agentes que permitan la ruptura de células o patógenos. Las proteínas pueden extraerse o aislarse y a continuación exponerse a un conjugado de IR700-molécula divulgado en el presente documento, tal como un conjugado de IR700-molécula específico para la proteína diana, para permitir el aislamiento o la eliminación de la proteína diana de la mezcla de proteínas.
En un ejemplo, la proteína diana es una citocina. Las citocinas son pequeñas proteínas secretadas por las células inmunitarias que tienen efectos sobre otras células. Los ejemplos de citocinas diana incluyen interleucinas (IL) e interferones (IFN), y quimiocinas, tales como IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-y, IFN-p, factor de crecimiento transformante (TGF-p) y factor de necrosis tumoral (TNF)-a.
En un ejemplo, la proteína diana es una hormona. Una hormona es un mensajero químico que transporta una señal de una célula a otra. Los ejemplos de hormonas diana incluyen hormonas vegetales y animales, tales como hormonas endocrinas u hormonas exocrinas. Los ejemplos particulares incluyen la hormona estimulante del folículo (FSH), gonadotropina coriónica humana (hCG), hormona estimulante tiroidea (TSH), hormona del crecimiento, progesterona, y similares.
En un ejemplo, la proteína diana es una toxina. Las toxinas son sustancias venenosas producidas por células u organismos, tales como plantas, animales, microorganismos (incluyendo, pero sin limitación, bacterias, virus, hongos, rickettsias o protozoos). Los ejemplos particulares de toxinas diana incluyen la toxina botulínica, ricina, toxina diftérica, toxina Shiga, toxina colérica, Enterotoxina estafilocócica B y toxina del ántrax. En otro ejemplo, la toxina es una toxina ambiental. En un ejemplo, la toxina es una micotoxina, tal como: aflatoxina, citrinina, alcaloides de ergot, patulina, toxinas de fusarium u ocratoxina A. En un ejemplo, la toxina diana es una cianotoxina, tal como: microcistinas, nodularinas, anatoxina-a, aplisiatoxinas, cilindrospermopsinas, lingbiatoxina-a y saxitoxinas. En un ejemplo, la toxina diana es una endotoxina, hemotoxina, cardiotoxina, neurotoxina, necrotoxina, neurotoxina o citotoxina.
En un ejemplo, la proteína diana es un veneno (o un componente del veneno, tal como una toxina), tal como el producido por una avispa, hormiga, araña, escorpión, pez, serpiente, y similares. Los ejemplos incluyen proteínas fosfolipasa A1 y B de veneno de avispa, neurotoxinas, proteínas de veneno de serpiente tales como metaloproteinasa, fosfodiesterasa, fosfolipasa A2, oxidasa, proteasa e hialuronidasa, y clorotoxina proteica del veneno de escorpión.
En un ejemplo, la proteína diana es una lectina. Las lectinas son proteínas que reconocen y se unen a carbohidratos específicos en la superficie de las células. Una lectina normalmente contiene dos o más sitios de unión para unidades de carbohidrato. En los animales, las lectinas regulan la adhesión celular a la síntesis de glucoproteínas, controlan los niveles de proteína en la sangre y se unen a glucoproteínas extracelulares e intracelulares solubles. También, en el sistema inmunitario, las lectinas reconocen los carbohidratos que se encuentran específicamente en patógenos, o aquellos que no son reconocibles en las células hospedadoras. Clínicamente, las lectinas purificadas se pueden usar para identificar glucolípidos y glucoproteínas en los glóbulos rojos de un individuo para determinar el tipo de sangre. Las lectinas de ejemplo incluyen, pero sin limitación: concanavalina A, lectina de lentejas, lectina de campanilla de invierno (todas las cuales se unen a manosa); ricina, aglutinina de cacahuete, jacalina y lectina de veza vellosa (todas las cuales se unen a galactosa); aglutinina de germen de trigo (que se une a la N-acetilglucosamina); lectina de saúco, hemoaglutinina de Maackia amurensis (todas las cuales se unen al ácido N-acetilneuramínico); y aglutinina de Ulex europaeus y lectina de Aleuria aurantia (todas las cuales se unen a fucosa).
En un ejemplo, la proteína diana es un antígeno asociado a un tumor o específico de un tumor, tal como CA-125 (marcador de cáncer de ovario), alfafetoproteína (AFP, marcador de cáncer de hígado); antígeno carcinoembrionario (CEA; cánceres de intestino), BRCA1 y 2 (cáncer de mama), y similares. Dichas proteínas son útiles para eliminar células tumorales.
En un ejemplo, la proteína diana es un biomarcador relacionado con la fertilidad, tal como hCG, hormona luteinizante (LH), hormona estimulante del folículo (FSH) o fibrinógeno fetal.
En un ejemplo, la proteína diana es una proteína de diagnóstico, tal como el antígeno prostático específico (PSA, por ejemplo Número de registro de GenBank® NP_001025218), proteína C reactiva, péptidos de citrulinato cíclico (CCP, por ejemplo para diagnosticar artritis reumatoide) o hemoglobina glucosilada (Hb A1c). En otro ejemplo, la proteína se encuentra en la superficie de un microbio o célula diana, tal como una célula bacteriana, virus, espora o célula tumoral. Dichas proteínas, tales como receptores, puede ser específicas para el microbio o la célula (por ejemplo, HER2, IGF1R, EGFR u otro receptor específico de tumor indicado a continuación en "ácidos nucleicos"). En un ejemplo, la proteína es un antígeno prostático específico (PSA, por ejemplo, Número de registro de GenBank® NP_001025218), al que se puede apuntar usando un anticuerpo o un aptámero específico de PSA (por ejemplo, véase Savory et al., Biosensors & Bioelectronics 15:1386-91, 2010 y Jeong et al., Biotechnology Letters 32:378-85, 2010).
Moléculas de ácido nucleico
Los métodos divulgados también permiten la eliminación o el aislamiento de moléculas de ácido nucleico diana, dicho ADN o ARN (tal como ADNc, ADN genómico, ARNm, miARN, etc.), tal como una secuencia de ADN o ARN que es específica para un patógeno o célula particular de interés. Por ejemplo, los patógenos pueden tener secuencias de a Dn o ARN conservadas específicas para ese patógeno (por ejemplo, en la técnica se conocen las secuencias conservadas para el HIV, la gripe aviar y la gripe porcina), y las células pueden tener secuencias específicas de ADN o ARN exclusivas de esa célula. En algunos ejemplos, se selecciona una molécula de ácido nucleico diana que está asociada con una enfermedad o afección, de modo que la eliminación o reducción de la molécula de ácido nucleico diana se pueda usar para tratar la enfermedad o afección (por ejemplo, para regular a la baja la expresión. En un ejemplo, la molécula de ácido nucleico diana es aquella que domina una muestra y, por tanto, se puede eliminar de una muestra para permitir el análisis (por ejemplo, identificación o clonación) de moléculas de ácido nucleico más raras en la muestra (tales como una molécula de ácido nucleico de un organismo raro en la muestra).
En ejemplos particulares, el conjugado de IR700-molécula puede unirse específicamente a una molécula de ácido nucleico diana (tal como un conjugado de IR700-molécula que incluye una proteína o molécula de ácido nucleico específica para la molécula de ácido nucleico diana). Por ejemplo, los agentes de unión específicos para moléculas de ácido nucleico particulares son conocidos en la técnica y pueden diseñarse usando métodos de rutina. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que tenga suficiente complementariedad para hibridarse con una molécula de ácido nucleico diana (tal como una que tenga al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % de complementariedad de secuencia con la diana) se puede generar y conjugar con IR700. Dichas moléculas se pueden usar para generar un conjugado de IR700-molécula para eliminar una molécula de ácido nucleico diana.
En algunos ejemplos en los que la molécula diana es una molécula de ácido nucleico, la muestra a ensayar puede tratarse con agentes que permitan la ruptura de células o patógenos. Las moléculas de ácido nucleico pueden extraerse o aislarse y a continuación exponerse a un conjugado de IR700-molécula divulgado en el presente documento, tal como un conjugado de IR700-molécula específico para la molécula de ácido nucleico diana, para permitir el aislamiento o la eliminación de la molécula de ácido nucleico diana de la mezcla de moléculas de ácido nucleico.
En ejemplos específicos no limitantes, la secuencia de ácido nucleico diana está asociada con un tumor (por ejemplo, un cáncer). Numerosas anomalías cromosómicas (incluyendo translocaciones y otros reordenamientos, reduplicación (amplificación) o deleción) se han identificado en células neoplásicas, especialmente en células cancerosas, tales como leucemias de linfocitos B y linfocitos T, linfomas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de colon, cánceres neurológicos y similares.
Los ácidos nucleicos diana de ejemplo incluyen, pero no se limitan a: el gen SYT ubicado en la región del punto de ruptura del cromosoma 18q11.2 (común entre los tumores de tejido blando de sarcoma sinovial); HER2, también conocido como c-erbB2 o HER2/neu (se proporciona una secuencia genómica de HER2 humana representativa en Número de registro de GENBANK® NC_000017, nucleótidos 35097919-35138441) (HER2 se amplifica en cáncer de mama humano, ovario, gástrico y otros cánceres); p16 (incluyendo D9S1749, D9S1747, p16(TINTA4A), p14(ARF), D9S1748, p15(INK4B) y D9S1752) (delecionado en ciertos cánceres de vejiga); EGFR (7p12; por ejemplo, Número de Registro de GEn BAn K® NC_000007, nucleótidos 55054219-55242525), MET (7q31; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000007, nucleótidos 116099695-116225676), C-MYC (8q24.21; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000008, nucleótidos 128817498-128822856), IGF1R (15q26.3; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000015, nucleótidos 97010284-97325282), D5S271 (5p15.2), KRAS (12p12.1; por ejemplo, número de registro de GENBANK® NC_000012, complemento, nucleótidos 25249447-25295121), TYMS (18p11.32; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK™ NC_000018, nucleótidos 647651-663492), CDK4 (12q14; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000012, nucleótidos 58142003-58146164, complemento), CCND1 (11q13, Número de Registro de GENBANK® NC_000011, nucleótidos 69455873-69469242), MIB (6q22-q23, Número de Registro de GENBANK® NC_000006, nucleótidos 135502453-135540311), lipoproteína lipasa (LPL) (8p22; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000008, nucleótidos 19840862-19869050), RB1 (13q 14; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000013, nucleótidos 47775884-47954027), p53 (17p13.1; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000017, complemento, nucleótidos 7512445­ 7531642), N-MYC (2p24; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000002, complemento, nucleótidos 15998134-16004580), CHOP (12q13; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000012, complemento, nucleótidos 56196638-56200567), FUS (16p11.2; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000016, nucleótidos 31098954-31110601), FKHR (13p14; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000013, complemento, nucleótidos 40027817-40138734), aALK (2p23; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000002, complemento, nucleótidos 29269144-29997936), cadena pesada de Ig, CCND1 (11q13; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000011, nucleótidos 69165054-69178423), BCL2 (18q21.3; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000018, complemento, nucleótidos 58941559-59137593), BCL6 (3q27; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000003, complemento, nucleótidos 188921859-188946169), API (1p32-p31; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000001, complemento, nucleótidos 59019051­ 59022373), TOP2A (17q21-q22; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000017, complemento, nucleótidos 35798321-35827695), TMPRSS (21q22.3; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000021, complemento, nucleótidos 41758351-41801948), ERG (21q22.3; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000021, complemento, nucleótidos 38675671-38955488); ETV1 (7p213; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000007, complemento, nucleótidos 13897379-13995289), EWS (22q12.2; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK™ NC_000022, nucleótidos 27994017-28026515); FLI1 (11q24.1-q24.3; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000011, nucleótidos 128069199-128187521), PAX3 (2q35-q37; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000002, complemento, nucleótidos 222772851-222871944), PAX7 (1p36.2-p36.12; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000001, nucleótidos 18830087-18935219), PTEN (10q23.3; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000010, nucleótidos 89613175-89718512), AKT2 (19q13.1-q13.2; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000019, complemento, nucleótidos 45428064-45483105), MYCL1 (1 p34.2; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK™ NC_000001, complemento, nucleótidos 40133685­ 40140274), REL (2p13-p12; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000002, nucleótidos 60962256­ 61003682) y CSF1R (5q33-q35; por ejemplo, Número de Registro de GENBANK® NC_000005, complemento, nucleótidos 149413051-149473128).
Carbohidratos
Los métodos divulgados y los conjugados de IR700-molécula también permiten la eliminación de una variedad de carbohidratos (por ejemplo, sacárido). Los ejemplos incluyen monosacáridos y disacáridos. En ejemplos particulares, el agente de unión específico que se une específicamente al carbohidrato diana es una lectina. Por ejemplo, la concanavalina A, la lectina de lenteja y la lectina de campanilla de invierno se pueden usar para eliminar la manosa; la ricina, la aglutinina de cacahuete, la jacalina y la lectina de arveja vellosa se pueden usar para eliminar la galactosa; la aglutinina de germen de trigo se puede usar para eliminar la N-acetilglucosamina; la lectina de saúco y la hemoaglutinina de Maackia amurensis se pueden usar para eliminar el ácido N-acetilneuramínico); y la aglutinina de Ulex europaeus y la lectina de Aleuria aurantia se pueden usar para eliminar la fucosa. Dichas moléculas se pueden usar para generar un conjugado de IR700-molécula para eliminar un carbohidrato diana.
Fármacos recreativos
Los métodos divulgados y los conjugados de IR700-molécula también permiten la eliminación de una variedad de fármacos recreativos. Por ejemplo, dichos fármacos pueden eliminarse de un sujeto que ha tomado una sobredosis de dichos fármacos. Los anticuerpos específicos para fármacos particulares son conocidos en la técnica. Por ejemplo, anticuerpos contra tetrahidrocannabinol, heroína, cocaína, cafeína y metanfetamina están disponibles de AbCam (Cambridge, MA). En ejemplos particulares, el agente de unión específico que se une específicamente a la diana farmacológica es un ácido nucleico (tal como un ácido nucleico funcional, tal como un aptámero o ADNzima). Dichas moléculas se pueden usar para generar un conjugado de IR700-molécula para eliminar un fármaco recreativo diana.
Por ejemplo, cafeína, cocaína, opiáceos y opioides (tales como oxicodona), cannabis (por ejemplo, mediante la detección de tetrahidrocannabinol (THC)), heroína, metanfetaminas, crack, etanol, acetaminofeno, benzodiazepinas, metadona, fenciclidina o tabaco (por ejemplo, mediante la detección de nicotina), puede eliminarse o aislarse usando los métodos divulgados y los conjugados de IR700-molécula.
Células
Cualquier célula diana se puede eliminar o aislar in vivo, in vitro o ex vivo con los métodos divulgados y los conjugados de IR700-molécula. La célula diana a eliminar o aislar del sujeto puede ser una célula que no se desee o cuyo crecimiento no se desee (por ejemplo, célula tumoral, célula madre cancerosa, célula enferma, o célula que causa o exacerba una enfermedad o trastorno en un sujeto), o puede ser una célula deseada, tal como una PBMC o HSC. En algunos ejemplos, las células se eliminan o aíslan mediante el uso de un agente de unión específico que reconoce una proteína de la superficie, tal como un receptor en la superficie de la célula. Por ejemplo, la célula diana puede expresar una proteína de la superficie celular que no se encuentra de manera sustancial en la superficie de otras células no diana, se puede seleccionar un agente de unión específico que reconozca específicamente dicha proteína, y generar un conjugado de IR700-molécula para esa proteína. Por ejemplo, los anticuerpos y las moléculas de ácido nucleico funcional específicas para células particulares y proteínas de la superficie celular son conocidos en la técnica y están disponibles de fuentes comerciales, tales como AbCam y Santa Cruz Biotechnology.
En un ejemplo, la célula a eliminar es una célula de un tumor, que puede ser maligno o benigno, sólido o líquido (por ejemplo, hematógeno). En un ejemplo, la células diana es una célula no deseada a eliminar de un sujeto, tal como una célula cancerosa en un paciente con cáncer. Las células de ejemplo que se pueden eliminar en los métodos divulgados incluyen células de los siguientes tumores: un tumor líquido tal como una leucemia, que incluye leucemia aguda (tal como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemias mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia), leucemias crónicas (tales como leucemia mielocítica crónica (granulocítica), leucemia mielógena crónica y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (incluyendo los de grado bajo, intermedio y alto), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de la cadena pesada, síndrome mielodisplásico, linfoma de células del manto y mielodisplasia. En otro ejemplo, la célula eliminada es de un tumor sólido, tal como sarcomas y carcinomas, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular, adenocarcinoma (por ejemplo, adenocarcinoma de páncreas, colon, ovario, pulmón, mama, estómago, próstata, cuello uterino o esófago), carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de las vías biliares, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, carcinoma de vejiga, Tumores del SNC (como un glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma).
Por tanto, en algunos ejemplos, la proteína de la superficie celular es una proteína específica de tumor (también conocida en la técnica como antígeno específico de tumor), y el conjugado de IR700-molécula es un conjugado de IR700-agente de unión a proteína específica de tumor. Los ejemplos de antígenos específicos de tumores incluyen, pero sin limitación, miembros de la familia de receptores de EGF (por ejemplo, HERI, 2, 3 y 4) y receptores de citocinas (por ejemplo, CD20, CD25, IL-13R, CD5, CD52, etc.). Por ejemplo, HER2 se encuentra principalmente en cánceres de mama, mientras que HER1 se encuentra principalmente en adenocarcinomas, que se pueden encontrar en muchos órganos, tales como el páncreas, mama, próstata y colon. Proteínas específicas de tumores de ejemplo que se pueden encontrar en una célula diana (y para las que se puede usar un agente de unión específico para esa proteína para formular un conjugado de IR70o-agente de unión a proteína específica de tumor), incluyen, pero sin limitación: cualquiera de los diversos MAGE (antígeno E asociado al melanoma), incluyendo MAGE 1 (por ejemplo, números de registro de GenBank M77481 y AAA03229), MAGE 2 (por ejemplo, números de registro de GenBank L18920 y AAA17729), MAGE 3 (por ejemplo, números de registro de GenBank U03735 y AAA17446), MAGE 4 (por ejemplo, números de registro de GenBank D32075 y A06841.1), etc.; cualquiera de las diversas tirosinasas (por ejemplo, números de registro de GenBank U01873 y AAB60319); mutante ras; mutante p53 (por ejemplo, números de registro de GenBank X54156, CAA38095 y AA494311); antígeno de melanoma p97 (por ejemplo, números de registro de GenBank M12154 y AAA59992); glóbulo graso de leche humana (HMFG) asociado con tumores de mama (por ejemplo, números de registro de GenBank S56151 y AAB19771); cualquiera de los diversos BAGE (antígeno E asociado al melanoma humano B), incluyendo BAGEl (por ejemplo, número de registro de GenBank Q13072) y BAGE2 (por ejemplo, números de registro de GenBank n M_182482 y NP_872288), cualquiera de los diversos Ga GE (antígeno G), incluyendo GAGE1 (por ejemplo, número de registro de GenBank Q13065) o cualquiera de GAGE2-6; diversos gangliósidos y CD25 (por ejemplo, números de registro de GenBank NP_000408.1 y NM_000417.2). Otros antígenos específicos de tumores incluyen los antígenos HPV 16/18 y E6/E7 asociados con los cánceres de cuello uterino (por ejemplo, números de registro de GenBank NC_001526, FJ952142.1, ADB94605, ADB94606 y U89349), antígeno de mucina (MUC 1)-KLH asociado con carcinoma de mama (por ejemplo, números de registro de GenBank J03651 y AAA35756), CEA (antígeno carcinoembrionario) asociado con el cáncer colorrectal (por ejemplo, números de registro de GenBank X98311 y CAA66955), gp100 (por ejemplo, números de registro de GenBank S73003 y AAC60634) asociado con, por ejemplo, melanoma, antígenos MARTl asociados con melanoma (por ejemplo, número de registro de GenBank n P_005502), antígeno de cáncer 125 (CA125, también conocido como mucina l6 o MUC16) asociado con cáncer de ovario y otros cánceres (por ejemplo, números de registro de GenBank NM_024690 y NP_078966); alfa-fetoproteína (a Fp ) asociada con el cáncer de hígado (por ejemplo, números de registro de GenBank NM_001134 y NP_o01125); antígeno de Lewis Y asociado con cáncer colorrectal, biliar, de mama, de pulmón microcítico y otros cánceres; glucoproteína 72 asociada a tumores (TAG72) asociada con adenocarcinomas; y el antígeno p Sa asociado con el cáncer de próstata (por ejemplo, números de registro de GenBank X14810 y CAA32915). Otras proteínas específicas de tumores de ejemplo incluyen además, pero sin limitación, PMSA (antígeno prostático específico de membrana; por ejemplo, números de registro de GenBank AAA60209 y AAB81971.1) asociada con neovasculatura de tumor sólido, así como cáncer de próstata; HER-2 (el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano, por ejemplo, números de registro de GenBank M16789.1, M16790.1, M16791.1, M16792.1 y AAA58637) asociado con cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de estómago y cáncer de útero, HER-1 (por ejemplo, números de registro de GenBank NM_005228 y NP_005219) asociado con cáncer de pulmón, cáncer anal y glioblastoma así como adenocarcinomas; NY-ESO-1 (por ejemplo, números de registro de GenBank U87459 y AAB49693) asociado con melanoma, sarcomas, carcinomas testiculares y otros cánceres, hTERT (también conocido como telomerasa) (por ejemplo, números de registro de GenBank NM_198253 y NP_937983 (variante 1), NM_198255 y NP_937986 (variante 2)); proteinasa 3 (por ejemplo, números de registro de GenBank M29142, M75154, M96839, X55668, NM 00277, M96628, X56606, CAA39943 y AAA36342) y tumor de Wilms 1 (WT-1, por ejemplo. números de registro de GenBank NM_000378 y NP_000369 (variante A), NM_024424 y NP_077742 (variante B), NM_024425 y NP_077743 (variante C), y NM_024426 y NP_077744 (variante D)). En un ejemplo, la proteína específica de tumor es CD52 (por ejemplo, números de registro de GenBank AAH27495.1 y CAI15846.1) asociados con leucemia linfocítica crónica; CD33 (por ejemplo, números de registro de GenBank NM_023068 y CAD36509.1) asociados con leucemia mielógena aguda; y CD20 (por ejemplo, números de registro de GenBank NP_068769 NP_031667) asociado con linfoma no Hodgkin.
En algunos ejemplos, la célula eliminada o aislada tiene un impacto negativo en una enfermedad autoinmunitaria, tal como la célula que expresa CD4, CD25, un linfocito T y similares.
En algunos ejemplos, la célula eliminada o aislada es la que se desea, tal como una célula en la sangre o la médula ósea. En un ejemplo, la célula eliminada o aislada es una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC). Por ejemplo, el IR700-agente de unión específico de CD19 se puede usar para aislar o eliminar las PBMC de una muestra, tal como una muestra de sangre. El IR700-agente de unión específico de CD19 se incuba con la muestra en condiciones que permitan que el IR700-agente de unión específico de CD19 se una a las PBMC de la muestra, que a continuación se irradia con luz NIR en condiciones que permiten que se agregue el complejo de PBMC-IR700-agente de unión específico de CD19 resultante. El agregado resultante se recoge, aislando así las PBMC. Las PMBC aisladas de una muestra en algunos ejemplos se administran a un sujeto que recibe un trasplante.
En un ejemplo, la célula eliminada o aislada es una célula madre humana (HSC). Las HSC se pueden extraer o aislar de cordón umbilical, sangre y/o médula ósea. Por ejemplo, se puede usar un IR700-agente de unión específico de CD34 (tal como el n.° de catálogo ab8158 de abcam, o el n.° de catálogo sc19587 de Santa Cruz Biotechnlogy) y/o un IR700-agente de unión específico de CD133 (tal como el n.° de catálogo MBS856765 de MyBioSource.com) para aislar o eliminar HSC de una muestra, tal como una muestra de sangre. El IR700-agente de unión específico de CD34 y/o el IR700-agente de unión específico de CD133 se incuba con la muestra en condiciones que permitan que el IR700-agente de unión específico de CD34 y/o el IR700-agente de unión específico de CD133 se unan a las h Sc en la muestra, que a continuación se irradia con luz NIR en condiciones que permiten que se agregue el complejo resultante de HSC-IR700-agente de unión específico de CD34 y/o HSC-IR700-agente de unión específico de CD133. El agregado resultante se recoge, aislando así las HSC. Las HSC aisladas de una muestra en algunos ejemplos se administran a un sujeto que recibe un trasplante. En algunos ejemplos, antes de eliminar o aislar las HSC, a los sujetos donantes se les inyecta una citocina, tal como factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), para inducir a las células a salir de la médula ósea y circular en los vasos sanguíneos. Por ejemplo, al donante se le puede inyectar G-CSF solo o en combinación con un inhibidor de CXCR4 (por ejemplo, plerixafor) antes de la recogida de células. En un ejemplo, el G-CSF (por ejemplo, 10 pg/kg) se administra por vía subcutánea a los sujetos donantes diariamente durante cuatro días y el quinto día además del G-CSF, se administra por vía subcutánea un inhibidor de CXCR4 (por ejemplo, plerixafor) (por ejemplo, 240 pg/kg). A continuación, se puede recoger un concentrado de células madre de sangre periférica (PBSC) movilizadas mediante leucaféresis el día 5, doce horas después de la administración de plerixafor y 2 horas después de la última dosis de G-CSF. En otro ejemplo, El G-CSF (por ejemplo, 10 pg/kg) se administra por vía subcutánea a los sujetos donantes diariamente durante cinco días y a continuación se puede recoger un concentrado de PBSC movilizado mediante leucaféresis el día 5. Las PBSC expresan CD34 y/o CD133. En un ejemplo, el método de Bloan et al. se usa para obtener PBMC (Br. J. Haematol. 120:801-7, 2003). La muestra de PBMC resultante se puede usar para aislar HSC.
En un ejemplo, se usan métodos que agotan las no HSC de la muestra, permitiendo así el enriquecimiento de las HSC (es decir, selección negativa). Por ejemplo, Conjugados de IR700-molécula (por ejemplo, aquellos que incluyen agentes de unión específicos para CD2, CD3, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD56, CD123 y CD235a (Glicoforina A)) pueden usarse para reducir sustancialmente el número de linfocitos B, linfocitos T, linfocitos citolíticos naturales, células dendríticas, monocitos, granulocitos y/o glóbulos rojos. En un ejemplo, los conjugados de IR700-molécula específicos para las células no deseadas se pueden incubar con la muestra, permitiendo que los conjugados de IR700-molécula se unan a las células no deseadas. A continuación, la muestra se irradia con luz NIR en condiciones que permiten que se agregue el complejo de célula diana-IR700-molécula resultante. El agregado resultante se recoge, eliminando así las células no deseadas y enriqueciendo las HSC.
Las HSC aisladas de una muestra en algunos ejemplos se administran a un sujeto que recibe un trasplante. En algunos ejemplos, las HSC se obtienen del mismo sujeto a tratar (autólogas, el donante y el receptor son la misma persona). En otros ejemplos, las HSC se obtienen de un sujeto diferente al que se va a tratar (alogénicas, el donante y el receptor son individuos diferentes, o singénicas, el donante y el receptor son gemelos idénticos).
En un ejemplo, se usan métodos que agotan las células que expresan CD25 de la muestra, por ejemplo, para eliminar células asociadas con el rechazo de trasplantes. Por tanto, la muestra se puede obtener de un sujeto que recibe un trasplante o que dona un órgano para trasplante. Por ejemplo, los conjugados de IR700-agente de unión específico de CD25 se pueden usar para reducir sustancialmente la cantidad de células que expresan CD25 en una muestra, tal como usando Basiliximab o Daclizumab que se dirigen al receptor de IL-2Ra (CD25). En un ejemplo, los conjugados de IR700-agente de unión específico de CD25 se pueden incubar con la muestra, permitiendo que los conjugados de IR700-agente de unión específico de CD25 se unan a las células no deseadas. A continuación, la muestra se irradia con luz NIR en condiciones que permiten que se agregue el complejo de células CD25-IR700-agente de unión específico de CD25 resultante. El agregado resultante se recoge, eliminando así las células no deseadas.
En un ejemplo, las células madre cancerosas (CSC) se eliminan (y en algunos ejemplos se destruyen) de un sujeto, tal como un sujeto con cáncer. En un ejemplo, la CSC es una CSC de vejiga y el agente de unión específico del IR700-molécula reconoce uno o más de (o se usa más de un conjugado de IR700-molécula): aldehído deshidrogenasa 1-A1/ALDH1A1; CD47; CD44 y CEa Ca M-6/CD66c. En un ejemplo, la CSC es una CSC de mama y el agente de unión específico del IR700-molécula reconoce uno o más de (o se usa más de un conjugado de IR700-molécula): aldehído deshidrogenasa 1-A1/ALDH1A1, GLI-1, BMI-1, GLI-2, CD24, IL-1 alfa/IL-1F1, CD44, IL-6 R alfa, conexina 43/GJA1, CXCR1/IL-8 RA, CXCR4, Integrina alfa 6/CD49f, DLL4, PONI, EpCAM/TROPI, PTEN y ErbB2/Her2. En un ejemplo, la CSC es una CSC de colon y el agente de unión específico del IR700-molécula reconoce uno o más de (o se usa más de un conjugado de IR700-molécula): ALCAM/CD166, EpCAM/TROPI, aldehído deshidrogenasa 1-A1/ALDH1A1, GLI-1, CD44, Lgr5/GPR49, DPPIV/CD26 y Musashi-1. En un ejemplo, la CSC es una CSC gástrica y el agente de unión específico del IR700-molécula reconoce uno o más de (o se usa más de un conjugado de IR700-molécula): CD44, Lgr5/GPR49 y DLL4. En un ejemplo, la CSC es una CSC de glioma/meduloblastoma y el agente de unión específico del IR700-molécula reconoce uno o más de (o se usa más de un conjugado de IR700-molécula): A20/TNFAIP3, IL-6 R alfa, ABCG2, Integrina alfa 6/CD49f, aldehído deshidrogenasa 1-A1/ALDH1A1, L1CAM, BMI-1, c-Maf, CD15/Lewis X, Musashi-1, CD44, c-Myc, CX3CL1/fractalquina, Nestina, CX3CR1, Podoplanina, CXCR4, SOX2 y HIF-2 alfa/EPAS1. En un ejemplo, la CSC es una CSC de cabeza y cuello y el agente de unión específico del IR700-molécula reconoce uno o más de (o se usa más de un conjugado de IR700-molécula): ABCG2, CD44, aldehído deshidrogenasa 1-A1/ALDH1A1, HGF R/c-MET, BMI-1 y Lgr5/GPR49. En un ejemplo, la c Sc es una CSC de leucemia y el agente de unión específico del IR700-molécula reconoce uno o más de (o se usa más de un conjugado de IR700-molécula): BMI-1, GLI-1, CD34, GLI-2, CD38, IL-3 R alfa/CD123, CD44, MICL/CLEC12A, CD47, Musashi-2, CD96, TIM-3 y CD117/c-kit. En un ejemplo, la CSC es una CSC de hígado y el agente de unión específico del IR700-molécula reconoce uno o más de (o se usa más de un conjugado de IR700-molécula): alfa-fetoproteína (AFP), CD90/Thy1, aminopeptidasa N/CD13, NF2/Merlina y CD45. En un ejemplo, la CSC es una CSC de pulmón y el agente de unión específico del IR700-molécula reconoce uno o más de (o se usa más de un conjugado de IR700-molécula): ABCG2, c D117/c-kit, aldehído deshidrogenasa 1-A1/ALDH1A1, EpCAM/TROP1 y CD90/Thy1. En un ejemplo, la c Sc es una CSC de melanoma y el agente de unión específico del IR700-molécula reconoce uno o más de (o se usa más de un conjugado de IR700-molécula): ABCB5, MS4A1/CD20, ABCG2, Nestina, ALCAM/CD166 y NGF R/TNFRSF16. En un ejemplo, la CSC es una CSC de mieloma y el agente de unión específico del IR700-molécula reconoce uno o más de (o se usa más de un conjugado de IR700-molécula): ABCB5, CD38, CD19, MS4A1/CD20, CD27/TNFRSF7 y Sindecano-1/CD138. En un ejemplo, la CSC es una CSC de osteosarcoma y el agente de unión específico del IR700-molécula reconoce uno o más de (o se usa más de un conjugado de IR700-molécula): ABCG2, Nestina, CD44, STRO-1 y endoglina/CD105. En un ejemplo, la CSC es una CSC de ovario y el agente de unión específico del IR700-molécula reconoce uno o más de (o se usa más de un conjugado de IR700-molécula): alfa-metilacil-CoA racemasa/AMACR, CD117/c-kit, CD44, Endoglina/CD105. En un ejemplo, la CSC es una CSC pancreática y el agente de unión específico del IR700-molécula reconoce uno o más de (o se usa más de un conjugado de IR700-molécula): aldehído deshidrogenasa 1-A1/ALDH1A1, CXCR4, BMI-1, Ep-CAM/TROP1, CD24, PON1 y CD44. En un ejemplo, la CSC es una CSC de próstata y el agente de unión específico del IR700-molécula reconoce uno o más de (o se usa más de un conjugado de IR700-molécula): ABCG2, Cd 44, ALCAM/CD166, CD151, aldehído deshidrogenasa 1-A1/ALDH1A1, c-Maf, alfa-metilacil-CoA racemasa/AMACR, c-Myc, IMC-1 y TRA-1-60(R).
Fármacos farmacológicos
En algunos ejemplos, la diana es un fármaco cuya farmacocinética hay que controlar. Por ejemplo, el fármaco puede ser un fármaco farmacológico (tal como un fármaco recetado o los disponibles en una farmacia) que tiene un efecto terapéutico deseado, pero cuya presencia prolongada en el cuerpo puede ser indeseable. Los métodos divulgados y los conjugados de IR700-fármaco permiten la eliminación de los agentes farmacéuticos conjugados del cuerpo después de un período de tiempo deseado, tal como después de que el fármaco haya tenido el efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, los conjugados de IR700-fármaco se pueden administrar a un sujeto en una cantidad eficaz, durante un tiempo suficiente para que el fármaco tenga el efecto deseado. A continuación, el sujeto se irradia con luz NIR en condiciones que permiten que se agregue el complejo de IR700-fármaco. El agregado resultante es eliminado o degradado por el cuerpo, por ejemplo por el hígado, eliminando así el fármaco del cuerpo (o inactivándolo). En algunos ejemplos, el sujeto recibe múltiples rondas de administración de los conjugados de IR700-fármaco seguidas de exposición a la luz NIR, tal como al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10 o al menos 20, o más, rondas de dicho tratamiento.
Los fármacos de ejemplo que pueden conjugarse con IR700 y usarse en los métodos divulgados (que se administran en cantidades eficaces) incluyen, pero no se limitan a: agentes quimioterapéuticos antineoplásicos, antibióticos, agentes alquilantes y antioxidantes, inhibidores de cinasas y otros agentes. Otros ejemplos incluyen agentes de unión a microtúbulos, intercaladores o agentes de entrecruzamiento de ADN, inhibidores de la síntesis de ADN, inhibidores de la transcripción de ADN y/o ARN, anticuerpos, enzimas, inhibidores de enzimas y reguladores de genes. Dichos agentes son conocidos en la técnica. Agentes quimioterapéuticos de ejemplo se describen en Slapak y Kufe, Principles of Cancer Therapy, Capítulo 86 en Harrison's Principles of Internal Medicine, 14a edición; Perry et al., Chemotherapy, C. 17 en Abeloff, Clinical Oncology 2a ed., 2000 Churchill Livingstone, Inc; Baltzer y Berkery. (eds.): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2a ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995; y Fischer Knobf, y Durivage (eds.): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4a ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993).
Un "agente de unión a microtúbulos" se refiere a un agente que interactúa con la tubulina para estabilizar o desestabilizar la formación de microtúbulos, inhibiendo de este modo la división celular. Los ejemplos de agentes de unión a microtúbulos que se pueden usar junto con los métodos proporcionados en el presente documento incluyen, sin limitación, paclitaxel, docetaxel, vinblastina, vindesina, vinorelbina (navelbina), las epotilonas, colchicina, dolastatina 15, nocodazol, podofilotoxina y rizoxina. También pueden usarse análogos y derivados de dichos compuestos y son conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, se describen epotilonas y análogos de epotilona adecuados en la Publicación internacional N.° WO 2004/018478. Los taxoides, tales como paclitaxel y docetaxel, así como los análogos de paclitaxel enseñados por las Patentes de EE.UU. Nos. 6.610.860; 5,530,020; y 5.912.264 pueden usarse.
Las siguientes clases de compuestos pueden conjugarse con IR700 y usarse con los métodos divulgados en el presente documento: reguladores de la transcripción de ADN y ARN, incluyendo, sin limitación, actinomicina D, daunorrubicina, doxorrubicina y derivados y análogos de los mismos. Los intercaladores de ADN y los agentes de entrecruzamiento que se pueden usar incluyen, sin limitación, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, mitomicinas, tales como mitomicina C, bleomicina, clorambucilo, ciclofosfamida y derivados y análogos de los mismos. Los inhibidores de la síntesis de ADN adecuados para su uso incluyen, sin limitación, metotrexato, 5-fluoro-5'-desoxiuridina, 5-fluorouracilo y análogos de los mismos. Los ejemplos de inhibidores enzimáticos adecuados incluyen, sin limitación, camptotecina, etopósido, formestano, tricostatina y derivados y análogos de los mismos. Los compuestos adecuados que afectan a la regulación génica incluyen agentes que dan como resultado una expresión aumentada o disminuida de uno o más genes, tales como raloxifeno, 5-azacitidina, 5-aza-2'-desoxicitidina, tamoxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, mifepristona y derivados y análogos de los mismos. Los inhibidores de cinasas incluyen Gleevac, Iressa y Tarceva que evitan la fosforilación y la activación de factores de crecimiento.
En un ejemplo, el fármaco de quimioterapia es epirrubicina, topotecán, irinotecán, gemcitabina, iazofurina, valspodar, mitoxantrona o Doxil (doxiorrubicina encapsulada en liposomas). En un ejemplo, el fármaco es adriamicina, apigenina, zebularina, cimetidina, teofilina, o un derivado o análogos de los mismos.
En un ejemplo, el fármaco es un agente biológico (por ejemplo, mAb) o una molécula pequeña, tales como los que se muestran en la siguiente tabla:
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En un ejemplo, el fármaco es un agente biológico (por ejemplo, mAb) o una molécula pequeña, para el tratamiento de la artritis reumatoide, tal como tocilizumab o rituximab.
En un ejemplo, el fármaco es uno o más de los siguientes: antibiótico (porejemplo, penicilina, ampicilina, metronidazol, tetraciclina, cloranfenicol, tobramicina, cipro, y similares), fármaco antihipertensivo (por ejemplo, diuréticos de tiazida, inhibidores de ACE, bloqueadores de los canales de calcio, bloqueadores beta y antagonistas de los receptores de la angiotensina II), antidepresivo (porejemplo, inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina (SSRI), inhibidores de la recaptación de serotonina y noradrenalina (SNRI), antidepresivos tricíclicos (ATC), inhibidores de la monoaminooxidasa (IMAO), buprenorfina, triptófano, antipsicóticos y la hierba de San Juan, por ejemplo prozac), analgésicos (por ejemplo, acetaminofeno, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), inhibidor de COX-2 y fármacos opioides tales como morfina, codeína y oxicodona), hormona reproductiva (por ejemplo, estrógeno, testosterona y progesterona), anticoagulantes (por ejemplo, warfarina), esteroide (por ejemplo, prednisona), colorante para reducir el colesterol (por ejemplo, Mevacor, Zocor, Pravachol), inmunodepresor (por ejemplo, rapamicina, ciclosporina y metotrexato, azatioprina, rituximab, o un esteroide), o citocina (por ejemplo, GM-CSF) y otros fármacos recetados.
Agentes de unión específicos de ejemplo
La molécula en un complejo de IR700-molécula puede ser un agente de unión específico que permite la unión selectiva entre el agente de unión específico y un agente diana. Los agentes de unión específicos son conocidos en la técnica, y a continuación se proporcionan ejemplos no limitantes. Por ejemplo, el conjugado de IR700-molécula puede ser un conjugado de IR700-anticuerpo, conjugado de IR700-fragmento de anticuerpo, conjugado de IR700-molécula Affibody®, conjugado de IR700-hapteno, conjugado de IR700-lectina, conjugado de IR700-proteína, conjugado de IR700-molécula de ácido nucleico, o conjugado de IR700-ácido nucleico funcional en donde el anticuerpo, fragmento de anticuerpo, molécula Affibody®, hapteno, lectina, proteína, molécula de ácido nucleico, y el ácido nucleico funcional pueden unirse específicamente a la molécula diana. Agentes de unión específicos disponibles en el métodos y métodos conocidos para su generación, permiten fabricar cualquier complejo de IR700-agente de unión específico. Por ejemplo, anticuerpos (y fragmentos funcionales de los mismos), ADNzimas y aptámeros están disponibles para numerosos agentes, tales como proteínas (por ejemplo, citocinas, antígenos tumorales, etc.), metales, pequeños compuestos orgánicos y moléculas de ácido nucleico. Además, métodos de producción de anticuerpos, ácidos nucleicos funcionales y moléculas de ácido nucleico que son específicas para una diana particular son bien conocidos en la técnica.
Los métodos para unir un agente de unión específico a IR700 son rutinarios. Por ejemplo, IR700 se puede conjugar con una proteína (tal como un anticuerpo) usando el éster NHS de IR700. Además, IR700 se puede conjugar con un ácido nucleico (tal como un ácido nucleico funcional) mediante el uso de química enlazadora tal como IR700 funcionalizado con psoraleno o química click.
Anticuerpos y fragmentos de anticuerpos
Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos específicos para diversas moléculas son bien conocidos en la técnica. Por tanto, en algunos ejemplos, la molécula en un complejo de IR700-molécula es un anticuerpo o fragmento del mismo, permitiendo la unión específica entre el anticuerpo o fragmento de anticuerpo y una diana (tal como una proteína diana). Los anticuerpos que se pueden usar en los métodos proporcionados en el presente documento incluyen inmunoglobulinas intactas, variantes de inmunoglobulinas y porciones de anticuerpos, tales como un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de origen natural o recombinante.
Normalmente, una inmunoglobulina de origen natural tiene cadenas pesadas (H) y ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. Existen dos tipos de cadena ligera, lambda (A) y kappa (k). Existen cinco clases (o isotipos) principales de cadena pesada que determinan la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE.
Cada cadena pesada y ligera contiene una región constante y una región variable, (las regiones también se conocen como "dominios"). En combinación, las regiones variables de la cadena pesada y ligera se unen específicamente al antígeno. Las regiones variables de la cadena ligera y pesada contienen una región "marco conservada" interrumpida por tres regiones hipervariables, también denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". La extensión de la región marco conservada y las CDR se han definido (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud y Servicios Sociales de los EE.UU., 1991). La base de datos de Kabat actualmente se encuentra en línea. Las secuencias de las regiones marco de diferentes cadenas ligeras o pesadas están relativamente conservadas dentro de una especie, tales como en seres humanos. La región marco de un anticuerpo, es decir, las regiones marco combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para posicionar y alinear las CDR en el espacio tridimensional.
Las CDR son responsables principalmente de la unión a un epítopo de un antígeno. Las CDR de cada cadena se denominan normalmente CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente empezando desde el extremo N, y también se identifican normalmente por la cadena en la que está ubicada la CDR particular. Por tanto, una CDR3 Vh está ubicada en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo en el que se encuentra, mientras que una CDR1 Vl es la CDR1 del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en el que se encuentra. Los anticuerpos con diferentes especificidades (es decir, diferentes sitios de combinación para diferentes antígenos) tienen diferentes CDR. Aunque son las CDR las que varían de un anticuerpo a otro, solamente un número limitado de posiciones de los aminoácidos de las CDR están directamente implicadas en la unión al antígeno. Estas posiciones dentro de las CDR se denominan restos determinantes de la especificidad (SDR, del inglés "specificity determining residues").
Las referencias a "Vh" o "VH" se refieren a la región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina, que incluye la de un Fv, scFv, dsFv o Fab. Las referencias a "Vl" o "VL" se refieren a la región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, que incluye la de un Fv, scFv, dsFv o Fab.
Los ejemplos específicos no limitantes de fragmentos de unión incluidos en el término anticuerpo incluyen fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)'2, proteínas Fv monocatenarias ("scFv") y proteínas Fv estabilizadas con disulfuro ("dsFv"). Una proteína scFv es una proteína de fusión en la que una región variable de cadena ligera de una inmunoglobulina y una región variable de cadena pesada de una inmunoglobulina están unidas mediante un enlazador, mientras que en dsFv, las cadenas se han mutado para introducir un enlace disulfuro para estabilizar la asociación de las cadenas.
En un ejemplo, el Ab es un Ab modificado genéticamente, tal como anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados), anticuerpos heteroconjugados (tales como anticuerpos biespecíficos). Véase también, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3a ed., W. H. Freeman & Co., Nueva York, 1997. Un anticuerpo quimérico tiene restos marco de una especie, tal como la humana, y las CDR (que generalmente confieren la unión al antígeno) de otra especie, tal como un anticuerpo murino que se une de manera específica a EGFR humano.
En un ejemplo, el Ab es un Ab humanizado o una inmunoglobulina humanizada. Una inmunoglobulina humanizada es una inmunoglobulina que incluye una región marco humana y una o más CDR de una inmunoglobulina no humana (por ejemplo, de ratón, rata o sintética). La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina "donante", y la inmunoglobulina humana que proporciona el marco se denomina "aceptor". En una realización, todas las CDR son de la inmunoglobulina donante en una inmunoglobulina humanizada. No es necesario que estén presentes las regiones constantes, pero en caso de haberlas, deben ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de inmunoglobulina humana, es decir, al menos aproximadamente un 85-90 %, tal como aproximadamente un 95 % o más idénticas. Por tanto, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de secuencias de inmunoglobulinas humanas naturales. Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo que comprende una inmunoglobulina de cadena ligera humanizada y cadena pesada humanizada. Un anticuerpo humanizado se une al mismo antígeno que el anticuerpo donante que proporciona las CDR. El marco aceptor de una inmunoglobulina o anticuerpo humanizado puede tener un número limitado de sustituciones por aminoácidos tomados del marco donante. Los anticuerpos humanizados u otros monoclonales pueden tener sustituciones conservadoras de aminoácidos adicionales que no tengan sustancialmente ningún efecto sobre la unión a antígeno u otras funciones de las inmunoglobulinas. Las inmunoglobulinas humanizadas pueden construirse por medio de ingeniería genética (véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. N.° 5.585.089).
En un ejemplo, el Ab es un anticuerpo humano (también llamado anticuerpo completamente humano), que incluye regiones marco humanas y todas las CDR de una inmunoglobulina humana. En un ejemplo, el marco y las CDR son de la misma secuencia de aminoácidos de cadena ligera y/o pesada humana originaria. Sin embargo, las marco de un anticuerpo humano se pueden genomanipular para incluir CDR de un anticuerpo humano diferente. Todas las partes de una inmunoglobulina humana son sustancialmente idénticas a partes correspondientes de secuencias de inmunoglobulina humana natural.
En un ejemplo, el Ab es un anticuerpo monoclonal (mAb). Un mAb es un anticuerpo producido por un solo clon de linfocitos B o por una célula en la que se han transfectado los genes de cadena ligera y pesada de un solo anticuerpo. Los mAb se producen mediante métodos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, mediante la preparación de células híbridas formadoras de anticuerpos a partir de una fusión de células de mieloma con células inmunitarias del bazo. Los mAb incluyen mAb humanizados.
Como se usa en el presente documento, el término anticuerpo también incluye anticuerpos recombinantes producidos por la expresión de un ácido nucleico que codifica una o más cadenas de anticuerpo en una célula (por ejemplo, véase la patente de EE. UU. n.° 4.745.055; patente de EE. UU. n.° 4.444.487; WO 88/03565; EP 256654; EP 120694; EP 125023; Faoulkner et al., Nature 298:286, 1982; Morrison, J. Immunol. 123:793, 1979; Morrison et al., Ann Rev. Immunol. 2:239, 1984).
En un ejemplo específico, el anticuerpo es un biológico utilizado para tratar el cáncer, tal como uno específico para una proteína tumoral. Por ejemplo, pueden usarse los siguientes conjugados: conjugado de IR700-Panitumumab, conjugado de IR700-Trastuzumab, conjugado de IR700-conjugado, conjugado de IR700-Zenapax, conjugado de IR700-Simitect, conjugado de IR700-J591 o conjugado de IR700-Cetuximab.
Moléculas Affibody®
Las moléculas Affibody® específicas para diversas dianas son bien conocidas en la técnica (por ejemplo, de Affibody, Sona, Suecia). Por tanto, en algunos ejemplos, la molécula en un complejo de IR700-moléculas es una molécula Affibody®, permitiendo la unión específica entre las moléculas Affibody® y una diana (tal como una proteína diana). Las moléculas Affibody® son pequeñas proteínas miméticas de anticuerpos de aproximadamente 6 kDa. En algunos ejemplos, una molécula Affibody® consiste en tres hélices alfa con 58 aminoácidos. En cambio, un mAb tiene aproximadamente 150 kDa y un anticuerpo de dominio único aproximadamente 12-15 kDa. Las moléculas Affibody® con propiedades de unión únicas generalmente se generan mediante la aleatorización de 13 aminoácidos ubicados en dos hélices alfa involucradas en la actividad de unión del dominio de la proteína original. En algunos ejemplos, los aminoácidos fuera de la superficie de unión se sustituyen en el armazón para crear una superficie completamente diferente del dominio ancestral de la proteína A. Las moléculas Affibody® específicas que se unen a una proteína diana se pueden "pescar" de grupos (bibliotecas) que contienen miles de millones de variantes diferentes, usando la expresión en fago.
Haptenos
Un hapteno es una molécula pequeña que generalmente solo puede provocar una respuesta inmunitaria cuando se une a un transportador más grande (tal como una proteína). Los haptenos se conocen en la técnica como antígenos incompletos o parciales. Pero debido a que, al igual que los anticuerpos, pueden unirse a moléculas diana, en algunos ejemplos, la molécula en un complejo de IR700-molécula es un hapteno, permitiendo la unión específica entre el hapteno y una diana (tal como una proteína diana).
Lectinas
En un ejemplo, el agente de unión específico es una lectina. Las lectinas son proteínas que reconocen y se unen a carbohidratos específicos, por ejemplo, en la superficie celular. Por tanto, en algunos ejemplos, la molécula en un complejo de IR700-molécula es una lectina, permitiendo la unión específica entre la lectina y un carbohidrato diana. Las lectinas se pueden modificar para incluir una extensión de proteína o péptido que permita la conjugación/unión a IR700.
Las lectinas se encuentran en animales, plantas y microorganismos, y los ejemplos específicos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, como se muestra a continuación, la lectinas vegetales aglutinina de germen de trigo, lectina de cacahuete y fitohemaglutinina reconocen diferentes oligosacáridos.
GicNAc Gal Gal
l/H,4 /M .4 |
CIcMAc Gal I/M .4 I/M.4 l/M .J GltNAc GIcNAc
GlcMAc GalMAr /M ,e\ Man V>a1,2 Se une a aglutinina de germen de trigo Se une a lectina de cacahuete Se une a fitohemaglutinina
Los ejemplos de lectinas que se pueden usar para eliminar un carbohidrato particular incluyen, pero sin limitación: concanavalina A, lectina de lentejas, lectina de campanilla de invierno (todas las cuales se unen a manosa); ricina, aglutinina de cacahuete, jacalina y lectina de veza vellosa (todas las cuales se unen a galactosa); aglutinina de germen de trigo (que se une a la N-acetilglucosamina); lectina de saúco, hemoaglutinina de Maackia amurensis (todas las cuales se unen al ácido N-acetilneuramínico); y aglutinina de Ulex europaeus y lectina de Aleuria aurantia (todas las cuales se unen a fucosa).
Proteínas
En un ejemplo, el agente de unión específico es una proteína. Se pueden usar proteínas que reconozcan y se unan a proteínas específicas, moléculas de ácido nucleico y otros socios de unión. Por ejemplo, se puede usar un ligando de proteína para unirse a una proteína receptora específica en una superficie celular. Por tanto, en algunos ejemplos, la molécula en un complejo de IR700-molécula es una proteína, permitiendo la unión específica entre la proteína y una proteína diana, molécula de ácido nucleico u otra molécula de unión, y la eliminación de la molécula que se une a la proteína (tal como una que forma un enlace covalente con la proteína).
Las interacciones proteína-proteína son bien conocidas en la técnica e incluyen aquellas involucradas en la transducción de señales, el transporte celular, la función muscular (actina/miosina). Además, las interacciones proteína-molécula de ácido nucleico son bien conocidas en la técnica e incluyen aquellas que controlan la estructura y función de la molécula de ácido nucleico (ADN o ARN), tales como transcripción, traducción, replicación, reparación y recombinación de ADN y procesamiento y translocación de ARN.
Moléculas de ácido nucleico
En un ejemplo, el agente de unión específico es una molécula de ácido nucleico. Se pueden usar moléculas de ácido nucleico que reconocen y se unen a proteínas específicas, moléculas de ácido nucleico (mediante hibridación) y otros socios de unión. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que tiene suficiente complementariedad con una molécula de ácido nucleico diana puede hibridarse con la secuencia complementaria y eliminar la secuencia complementaria. Por tanto, en algunos ejemplos, la molécula en un complejo de IR700-molécula es una molécula de ácido nucleico, permitiendo la unión específica entre la molécula de ácido nucleico y una proteína diana, molécula de ácido nucleico u otra molécula de unión, y la eliminación de la molécula que se une a la molécula de ácido nucleico.
En un ejemplo, la diana es una molécula de ácido nucleico, y el conjugado de IR700-molécula incluye una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de complementariedad (identidad de secuencia) suficiente para permitir la hibridación entre las dos moléculas de ácido nucleico. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico puede tener al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con al menos una parte de una molécula de ácido nucleico diana, tal como este nivel de identidad de secuencia en al menos 30 nucleótidos contiguos de la diana, al menos 40, al menos 50, al menos 75, al menos 100, al menos 500, al menos 1000, o al menos 10.000 nucleótidos contiguos de la diana o más.
Además, las interacciones proteína-molécula de ácido nucleico son bien conocidas en la técnica e incluyen aquellas que controlan la estructura y función de la molécula de ácido nucleico (ADN o ARN), tales como transcripción, traducción, replicación, reparación y recombinación de ADN y procesamiento y translocación de ARN.
Ácidos nucleicos funcionales (FNA)
En un ejemplo, el agente de unión específico es una molécula de ácido nucleico funcional (FNA) (Liu et al, Chem. Rev.
2009, 109, 1948-1998). Los FNA, incluyendo ADNzimas y aptámeros de ADN, son moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) que reconocen y se unen a una amplia gama de dianas con alta afinidad y especificidad. Por tanto, en algunos ejemplos, la molécula en un complejo de IR700-molécula es un FNA, permitiendo la unión específica entre el FNA y una diana, y la eliminación de la diana que se une al FNA.
Secuencias de FNA que pueden modificarse o adaptarse para usarse en los métodos y conjugados de IR700-molécula proporcionados en el presente documento, son conocidas en la técnica (por ejemplo, véase el documento US 8.058.415). Un ejemplo de FNA es un ácido nucleico catalítico. Los ácidos nucleicos catalíticos activos pueden ser ADN/ARN catalíticos, también conocidas como ADNzimas/ARNzimas, desoxirribozimas/ribozimas, enzimas de ADN/enzimas de ARN. Los ácidos nucleicos catalíticamente activos también pueden contener ácidos nucleicos modificados. Las aptazimas, las ARNzimas y las ADNzimas se vuelven reactivas al unirse a un analito mediante una reacción química (por ejemplo, escindiendo una cadena de sustrato del FNA). En cada caso, el resultado de que el polinucleótido reactivo se vuelva reactivo es provocar la desagregación del agregado y la liberación de al menos un oligonucleótido. Otro ejemplo de FNA es un aptámero, que sufre un cambio conformacional al unirse a la diana. Los aptámeros se vuelven reactivos al unirse a un analito al sufrir un cambio conformacional.
Los FNA se pueden seleccionar de grupos de ADN (generalmente de 2 a 25 kDa) con ~1015 secuencias aleatorias a través de un proceso conocido como selección in vitro o Evolución sistemática de Ligandos por enriquecimiento Exponencial (SELEX). Las ADNzimas y los aptámeros exhiben una actividad catalítica específica y una fuerte afinidad de unión, respectivamente, a diversas dianas. Las dianas pueden variar desde iones metálicos y pequeñas moléculas orgánicas hasta biomoléculas e incluso virus o células.
Los métodos para identificar un FNA que es específico para un agente diana particular son habituales en la técnica y se han descrito en varias patentes. Por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos. 7.192.708; 7.332.283; 7.485.419; 7.534.560; y 7.612.185, y las Publicaciones de Patentes de EE. UU. Nos. 20070037171 y 20060094026, describen métodos para identificar moléculas de ADN funcionales que pueden unirse a iones particulares, tales como plomo y cobalto. Además, se proporcionan ejemplos específicos. Aunque algunos de los ejemplos describen moléculas de ADN funcionales con fluoróforos, dichas etiquetas no son necesarias para los métodos descritos en el presente documento.
Los aptámeros son ácidos nucleicos monocatenarios (ss) (tales como ADN o ARN) que reconocen dianas con alta afinidad y especificidad, que sufren un cambio conformacional en presencia de su diana. Por ejemplo, el aptámero de cocaína se une a la cocaína como su diana correspondiente. Por tanto, los aptámeros se pueden usar como un agente de unión específico. Los métodos de selección in vitro se pueden usar para obtener aptámeros para una amplia gama de moléculas diana con una afinidad excepcionalmente alta, teniendo constantes de disociación tan altas como en el intervalo picomolar (Brody y Gold, J. Biotechnol. 74: 5-13, 2000; Jayasena, Clin. Chem., 45:1628-1650, 1999; Wilson y Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68: 611-647, 1999). Por ejemplo, se han desarrollado aptámeros para reconocer iones metálicos tales como Zn(II) (Ciesiolka et al., RNA 1: 538-550, 1995) y Ni(II) (Hofmann et al., RnA, 3:1289-1300, 1997) ; nucleótidos tales como trifosfato de adenosina (ATP) (Huizenga y Szostak, Biochemistry, 34:656-665, 1995); y guanina (Figa et al., Nucleic Acids Research, 26:1755-60, 1998); cofactores tales como NAD (Figa et al., Nucleic Acids Research, 26:1755-60, 1998) y flavina (Lauhon y Szostak, J. Am. Chem. Soc., 117:1246-57, 1995); antibióticos tales como viomicina (Wallis et al., Chem. Biol. 4: 357-366, 1997) y estreptomicina (Wallace y Schroeder, RNA 4:112-123, 1998) ; proteínas tales como transcriptasa inversa del HIV (Chaloin et al., Nucleic Acids Research, 30:4001-8, 2002) y la ARN polimerasa dependiente de Ar N del virus de la hepatitis C (Biroccio et al., J. Virol. 76:3688-96, 2002); toxinas tales como la toxina completa del cólera y la enterotoxina B estafilocócica (Bruno y Kiel, BioTechniques, 32: págs. 178­ 180 y 182-183, 2002); y esporas bacterianas tales como el ántrax (Bruno y Kiel, Biosensors & Bioelectronics, 14:457-464, 1999). En comparación con los anticuerpos, los aptámeros basados en ADN/ARN son más fáciles de obtener y menos costosos de producir porque se obtienen in vitro en periodos de tiempo cortos (días frente a meses) y con coste limitado. Además, los aptámeros de ADN/ARN se pueden desnaturalizar y renaturalizar muchas veces sin perder su capacidad de biorreconocimiento.
Las enzimas de ADN/ARN normalmente contienen una cadena de sustrato que reconoce una diana (y puede incluir una base de ARN) y un dominio catalítico o enzimático. En algunos ejemplos, un cofactor, tal como un ion metálico, cataliza la escisión del sustrato. Por ejemplo, la ADNzima de plomo se une al plomo como su diana correspondiente. Por tanto, las ADN/ARNzimas se pueden usar como agentes de unión específicos. Las aptazimas son la combinación de aptámeros y ADNzimas o ribozimas. Las aptazimas funcionan cuando la diana se une a los aptámeros, lo que desencadena actividades de ADNzima/ribozima o inhibe actividades de ADNzima/ribozima. Por tanto, las aptazimas se pueden usar como agentes de unión específicos.
EJEMPLO 1
Síntesis de conjugado de IRDye 700-trastuzumab (anti-Her2)
Este ejemplo describe los métodos usados para conjugar el anticuerpo monoclonal Trastuzumab con IRDye 700DX NHS Ester. Los expertos en la materia reconocerán que cualquier anticuerpo, tal como cualquier anticuerpo monoclonal específico para una proteína de superficie celular diana, se puede conjugar con IRDye 700DX NHS Ester usando métodos similares.
El anticuerpo anti-HER2 humanizado, Trastuzumab (Tra; Genentech, San Francisco, CA) (1 mg, 6,8 nmol) se incubó con IRDye 700DX NHS Ester (IR700; LI-COR Bioscience, Lincoln, NE) (66,8 |jg, 34,2 nmol, 5 mmol/l en DMSO) en 0,1 mol/l de Na2HPO4 (pH 8,5) a temperatura ambiente durante de 30 a 120 minutos. Trastuzumab es un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante (mAb) dirigido contra el dominio extracelular del receptor de tirosina cinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGFR) 2 (HER2). La mezcla se purificó con una columna Sephadex G50 (PD-10; GE Healthcare, Piscataway, NJ). La concentración de proteína se determinó con el kit de ensayo de proteínas Coomassie Plus (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) midiendo la absorción a 595 nm con un sistema UV-Vis (8453 Value System; Agilent Technologies, Palo Alto, CA). La concentración de IR700 se midió por absorción con el sistema UV-Vis para confirmar el número de moléculas de fluoróforo conjugadas a cada molécula de Trastuzumab. El número de IR700 por Trastuzumab fue de aproximadamente 3.
La pureza del conjugado de Tra-IR700 se confirmó mediante HPLC analítica de exclusión por tamaño (SE-HPLC) y electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE). La SE-HPLC se realizó usando un Beckman System Gold (Fullerton, CA) equipado con un módulo de suministro de disolvente modelo 126, un detector UV modelo 168, y un detector de fluorescencia JASCO (excitación 689 nm y emisión a 700 nm) controlado por software 32 Karat. La cromatografía SE se realizó en una TSKgel G2000SWxl (Tosoh Bioscience LLC, Montgomeryville, PA) eluida durante 45 minutos usando solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 0,5 ml/min. La SDS-PAGE se realizó con un gradiente de gel de poliacrilamida del 4 % al 20 % (Invitrogen, Carlsbad, CA). Justo después de separar las proteínas, la intensidad de la fluorescencia se analizó con un escáner de fluorescencia Fujifilm FLA-5100 (Valhalla, NY) con un láser interno de 670 nm para la excitación y un filtro de paso largo de 705 nm para la emisión. La intensidad de fluorescencia de cada banda se analizó con el software Multigage (Fujifilm). A continuación, los geles se tiñeron con el kit de tinción azul coloidal (Invitrogen) y se escanearon digitalmente. La concentración de proteína en cada banda se analizó con el software ImageJ. Las preparaciones de trastuzumab-1R700 (Tra-1R700) y panitumumab-1R700 (Pan-1R700; véase el ejemplo 8) demostraron una fuerte asociación y no contenían agregados de MAb detectables según lo determinado por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio SDS-PAGE.
Para determinar las características de unión in vitro de los conjugados de IR700 se realizó el marcaje con 125I de los conjugados usando el procedimiento Indo-Gen. Las actividades específicas de los anticuerpos radiomarcados fueron 8,52 mCi/mg para Trastuzumab y 7,84 mCi/mg para panitumumab (véase el ejemplo 8 a continuación). Se observó que se logró el 73,38 ± 0,39 % (125I-Tra-IR700) y el 78,61 ± 0,89 % (125I-Pan-IR700) de unión con cada conjugado de MAb respectivamente y la especificidad de la unión se confirmó bloqueando con un exceso de MAb no conjugado nativo (menos del 1,4 %). Dado que la inmunorreactividad de 125I-Tra y 125I-Pan medida con el mismo método fueron 78 ± 2 % y 82 ± 3 %, respectivamente, se confirmó una pérdida mínima de MAb con conjugación a IR700. El ensayo de inmunorreactividad se realizó como se ha descrito anteriormente. En resumen, después de la tripsinización, 2x106 de células 3T3/HER2 o A431 se resuspendieron en PBS que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 1 %. Se añadió 125I-Tra-IR700 o 125I-Pan-IR700 (1 mCi, 0,2 |jg) y se incubó durante 1 h en hielo. Las células se lavaron, se sedimentaron, el sobrenadante se decantó y se contó en un contador y 2470 Wizard2 (Perkin Elmer, Shelton, CT). La unión no específica a las células se examinó en condiciones de exceso de anticuerpos (200 jg de trastuzumab o panitumumab no marcado).
EJEMPLO 2
Síntesis de conjugado de IRDye 700-Vectibix® (anti-HERI)
Panitumumab (Vectibix®), un MAb de IgG2 completamente humanizado dirigido contra el EGFR humano se adquirió de Amgen (Thousand Oaks, CA) y se conjugó con IR700 usando los métodos descritos en el ejemplo 1. Este compuesto se denomina Panitumumab-IR700 o Pan-IR700. El número de IR700 por Panitumumab fue de aproximadamente 3.
EJEMPLO 3
Síntesis de conjugado de IRDye 700-HuJ591
J591, un MAb de IgG2 completamente humanizado dirigido contra el PSMA humano se obtuvo del Prof. Neil Bander, Cornell Univ y se conjugó a IR700 usando los métodos descritos en el ejemplo 1. Este compuesto se denomina J591-IR700. El número de IR700 por J591 fue de aproximadamente 2.
EJEMPLO 4
Síntesis de conjugado de IRDye 700-cetuximab
Cetuximab (Erbitux®), un MAb quimérico (ratón/humano) dirigido contra el EGFR humano se adquirió de Bristol-Myers Squibb (Princeton, NJ) y se conjugó con IR700 usando los métodos descritos en el ejemplo 1. Este compuesto se denomina Cetuximab-IR700 o Cet-IR700. El número de IR700 por Cetuximab fue de aproximadamente 3.
EJEMPLO 5
Escisión de IR700 después de la exposición a NIR
Se generó Pan-IR700 como se describe en el ejemplo 2. Pan-IR700 (2 jg ) se suspendió en PBS y se expuso a luz NIR (690 nm /-20 nm para LED; 690 nm /-4 nm para láser) usando un LED o láser a 2, 4, 8 o 16 J/cm2. La solución resultante se corrió en un gel de poliacrilamida al 4-20 %, se tiñó con azul de Comassie y se visualizó con luz o fluorescencia a 700 nm. Algunas muestras no fueron expuestas a la luz NIR.
El gel Commassie en la parte inferior de la figura 4 muestra que el Pan IR700 (banda azul) se descompuso o escindió después de la exposición a la luz NIR (LED o láser). De modo similar, las bandas borrosas en el gel superior indican que Pan IR700 se escindió. El gel superior muestra que el láser funcionó mejor que el LED con la misma dosis de luz debido a una mejor absorción eficiente de la luz emitida por el láser que indicaba que la luz absorbida inducía esta reacción fotoquímica de forma dependiente de la dosis.
Esta agregación del complejo de Pan-IR700 escindido puede salirse de la solución, de modo que cualquier molécula a la que esté unido el complejo de Pan-IR700 pueda eliminarse de la solución.
EJEMPLO 6
IR700 no pierde fluorescencia después de la exposición a NIR
Se suspendió IR700 (0,5 jM ) en DMF o PBS y se expuso a luz NIR con un láser (690 nm /-4) a 2, 4, 8 o 16 J/cm2. La solución resultante se visualizó (en un tubo Eppendorf) con fluorescencia a 700 nm. Algunas muestras no fueron expuestas a la luz NIR.
Como se muestra en la figura 5, el IR700 sigue siendo fluorescente incluso después de la exposición a una luz NIR intensa. Por tanto, IR700 no se fotoblanquea aunque se libera un producto de degradación significativo después de la exposición a la luz NIR.
EJEMPLO 7
IR700 puede escindirse mediante NIR en ausencia de oxígeno
Se generó Pan-IR700 como se describe en el ejemplo 2. Pan-IR700 (2 |jg) se suspendió en PBS y se expuso a luz NIR (690 nm /-20 nm para LED; 690 nm /-4 nm para láser) usando un LED o láser a 0,8 o 16 J/cm2. Algunos ejemplos contenían NaN3 (azida de sodio), un eliminador de oxígeno reactivo, o sin oxígeno (usando una ráfaga de gas argón durante 20 minutos). La solución resultante se corrió en un gel SCS-PAGE, se tiñó con azul de Comassie y se visualizó con luz o fluorescencia a 700 nm. Algunas muestras no fueron expuestas a la luz NIR.
Como se muestra en la figura 6, se observa una banda de Pan IR700 intensa en los tres primeros carriles (sin NIR). Los carriles 4-6 están a 8 J/cm2 de NIR y mostrar desenfoque de la banda de Pan-IR700 incluso sin oxígeno (O2-). Esto también se ve en los carriles 7-9 a 16 J/cm2 de NIR. Por tanto, la escisión de IR700 se produce con oxígeno normal (sin tratamiento), con un eliminador de ROS (NaN3) y en condiciones de hipoxia, lo que indica que el proceso es independiente del oxígeno.
EJEMPLO 8
La saturación de oxígeno puede reducir la escisión de IR700 por NIR
Se generó Pan-IR700 como se describe en el ejemplo 2. Pan-IR700 (2 jg ) se suspendió en PBS y se expuso a luz NIR (690 nm /-20 nm para LED; 690 nm /-4 nm para láser) usando un Le D o láser a 0, 4, 8 o 16 J/cm2. Algunos ejemplos contenían exceso de oxígeno (usando una ráfaga de gas oxígeno al 100 % durante 20 minutos). La solución resultante se corrió en un gel SDS-PAGE al 4-20 %, se tiñó con azul de Comassie y se visualizó con luz o fluorescencia a 700 nm. Algunas muestras no fueron expuestas a la luz NIR.
Como se muestra en la figura 6, la presencia de exceso de oxígeno (100 %) dio como resultado una menor degradación del Pan1R700, lo que indica que la saturación de oxígeno reduce o inhibe la escisión de IR700 en presencia de NIR. El gel en el programa muestra diferentes niveles y configuraciones de ventana para mostrar mejor la cantidad de agregación. Con 100 % de O2, la formación de agregados es menos eficiente lo que apoya la reacción química que se muestra en las figuras 1 y 2.
EJEMPLO 9
Tráfico in vivo de IR700 escindido
Se generó 111In-DTPA-IR700-Pan como se describe en el ejemplo 2, excepto que SCN-Bz-PTPA se conjugó con Pan-IR700. SCN-Bz-DTPA se disolvió en Pan-IR700 en tampón borato pH 8,5. La purificación se realizó mediante filtración en gel con gel G25.
111In-DTPA-IR700-Pan se expuso a luz NIR ex vivo (antes de la inyección, láser), o in vivo después de la inyección (exponer gran parte del abdomen, vientre). Se inyectó 111In-DTPA-IR700-Pan (100 jg/ratón) en ratones portadores de A431. Una hora después de la administración de 111In-DTPA-IR700-Pan expuesto a NIR o la exposición NIR en el vientre, los órganos se recogieron y analizaron como sigue. Los ratones fueron sacrificados y diseccionados para separar todos los órganos principales. Los órganos se extrajeron, se pesaron y contaron con un contador gamma (Wizard 2') para cuantificar la radiactividad en los órganos.
Como se muestra en la figura 8, después de la exposición a la luz NIR ex vivo (antes de la inyección) o in vivo (exponer gran parte del abdomen), 111In-DTPA-IR700-Pan se redirigió al hígado y al bazo. Esto indica que los macrófagos formaron y atraparon un agregado en el sistema reticuloendotelial. En ausencia de NIR, hay acumulación del conjugado escindido en el hígado. Sin embargo, después de la exposición a NIR, la cantidad del conjugado escindido en el hígado aumenta dramáticamente, incluso si la NIR se administra al vientre del ratón (no donde está el tumor). Lo mismo se observa en el bazo. Esto es consistente con la agregación del Pan-IR700 que es captado por el hígado y el bazo, lo que indica un aumento en la hidrofobicidad del complejo después de la terapia con luz.
Por tanto, la conjugación de IR700 con un fármaco o agente de unión específico se puede usar para controlar la farmacocinética del fármaco o del agente de unión específico, depurándolos hacia el hígado y el bazo. Dichos métodos son útiles para "depurar" o "perseguir" un fármaco o un agente de unión específico del cuerpo, por ejemplo para evitar la toxicidad o, en efecto "apagarlo". Dichos métodos también se pueden usar para eliminar los agentes que se unen al fármaco o al agente de unión específico del cuerpo, depurándolos hacia el hígado y el bazo.
Ejemplo 10
Se mezcló Panitumumab-IR700 con EGFR soluble en una relación molar de 4:1, con o sin irradiación de NIR (16 J/cm2 con láser de 690 nm). Como se muestra en la figura 9, las moléculas de EGFR se agregan con el anticuerpo después de NIR y, por tanto, pueden eliminarse de la solución (confirmado por SDS-PAGE). Una vez que los agregados están completamente formados, la finalización de la formación de agregaciones se determinó apagando la fluorescencia de IR700.
Ejemplo 11
Materiales y métodos
Este ejemplo proporciona los materiales y métodos para los resultados descritos en el ejemplo 12.
Reactivos
El IRDye 700DX NHS Ester, derivado de silicio-ftalocianina, hidrosoluble fue de LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, EE. UU.). Panitumumab, un mAb de IgG2 completamente humanizado dirigido contra EGFR, fue de Amgen (Thousand Oaks, CA, EE.UU.). Trastuzumab, mAb de IgG1 humanizado al 95 % dirigido contra HER2, fue de Genentech (South San Francisco, CA, EE.UU.). Todos los demás productos químicos fueron de grado reactivo.
Síntesis de conjugado de IR700-trastuzumab, panitumumab o anticuerpo anti-PSMA
La conjugación de colorantes con mAb se realizó de acuerdo con informes previos (Mitsunaga et al., Nat. Med. 17, 1685-1691, 2011; Sato et al., Mol. Oncol. 8, 620-632, 2014). En resumen, se incubó panitumumab, trastuzumab o ab anti-PSMA (1 mg, 6,8 nmol) con IR700 NHS Ester (60,2 pg, 30,8 nmol) en 0,1 mol/l de Na2HPO4 (pH 8,6) a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla se purificó con una columna Sephadex G50 (PD-10; GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.). La concentración de proteínas se determinó con el kit de ensayo de proteínas Coomassie Plus (Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford, IL, EE. UU.) midiendo la absorción a 595 nm con espectroscopia (8453 Value System; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.). La concentración de IR700 se midió por absorción a 689 nm con espectroscopia para confirmar el número de moléculas de IR700 conjugadas con cada mAb. La síntesis se controló de modo que un promedio de cuatro moléculas de IR700 se unieron a un solo anticuerpo. Se usó SDS-PAGE como control de calidad para cada conjugado como se notificó previamente (Sano et al., ACS Nano 7, 717-724, 2013). IR700 conjugado con trastuzumab se abrevia como Tra-IR700, con panitumumab como Pan-IR700 y con anticuerpo anti-PSMA como PSMA-IR700.
Cultivo celular
Se establecieron células A431 con GFP y luciferasa expresadas de forma estable, 3T3/HER2 (Balb/3T3 con HER2 expresado de forma estable) o PC3-PIP (células PC3 con PSMA expresado de forma estable) con una transfección de RediFect Red-FLuc-GFP (PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU.). La alta expresión de GFP y luciferasa se confirmó con 10 pases. Se establecieron células Balb/3T3 con RFP expresada de forma estable con transfección por partículas lentivirales RFP (EF1a)-Puro (AMSBIO, Cambridge, MA, EE. UU.). Se confirmó una alta expresión de RFP en ausencia de un agente de selección con 10 pases. Estas células se abrevian como A431-luc-GFP, 3T3/Her2-luc-GFP, PC3-PIP-luc-GFP, Balb/3T3-RFP, respectivamente. Las células se cultivaron en RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD, EE. UU.) complementado con suero fetal bovino al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 % (Life Technologies) en frascos de cultivo de tejidos en una incubadora humidificada a 37 °C en una atmósfera del 95 % de aire y el 5 % de dióxido de carbono.
Cultivo de esferoides 3D
Los esferoides se generaron mediante el método de gota colgante en el que se suspendieron cinco mil células en 50 pl de medio y, a continuación, se distribuyeron en placas de 96 pocillos (3D Biomatrix Inc, Ann Arbor, MI, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante (Sato et al., Mol. Oncol. 8, 620-632, 2014). Se fabricaron esferoides mixtos con 5000 células de Balb/3T3-RFP y 500 células de A431-luc-GFP (100:10)). Después de la observación o el tratamiento, los esferoides se incubaron nuevamente con las placas de gota colgante que contenían nuevos medios. El volumen de los esferoides se calculó con la fórmula: volumen de esferoide = 4/3 nx radio3
Citometría de flujo
La fluorescencia que surge de las células después de la incubación con agentes APC se midió usando un citómetro de flujo (FACS Calibur, BD BioSciences, San Jose, CA, EE. UU.) y el software CellQuest (BD BioSciences). Se incubaron células (1x105) con cada APC durante 6 horas a 37 °C. Para validar la unión específica del anticuerpo conjugado, se usó exceso de anticuerpo (50 pg) para bloquear 0,5 pg de conjugados de colorante-anticuerpo (Sato et al., Mol. Oncol. 8, 620-632, 2014).
Microscopía de fluorescencia
Para detectar la localización específica del antígeno de los conjugados de IR700, se realizó microscopía de fluorescencia (IX61 o IX81; Olympus America, Melville, NY, EE. UU.). Se sembraron diez mil células en placas con fondo de vidrio y se incubaron durante 24 horas. A continuación, se añadió APC al medio de cultivo a 10 pg/ml y se incubó a 37 °C durante 6 horas. A continuación, las células se lavaron con PBS; Se usaron yoduro de propidio (PI)(1:2000)(Life Technologies) y Cytox Blue (1:500)(Life Technologies) para detectar células muertas. Estos se añadieron a los medios 30 minutos antes de la observación. A continuación, las células se expusieron a luz NIR y se obtuvieron imágenes en serie. El filtro se configuró para detectar la fluorescencia de IR700 con un filtro de excitación de 590-650 nm y un filtro de emisión de paso de banda de 665-740 nm.
Las reconstrucciones en 3D de los esferoides se obtuvieron con un microscopio láser confocal (LSM5 meta, Carl Zeiss, Jena, Alemania) después de una incubación durante 30 minutos con Hoechst 33342 (1:500) (Life Technologies). Las secciones de esferoides se fijaron primero con formaldehído al 3,7 % en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, se incluyeron con OCT (SAKURA, Tokio, Japón). A continuación, se congelaron a -80 °C y se cortaron a 10 pm con un criotomo (LEICA CM3050 S, Leica microsystems, Wetzlar Alemania). El análisis de las imágenes se realizó con el software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/).
PIT in vitro
Se sembraron doscientas mil células A431-luc-GFP en placas de 24 pocillos o se sembraron veinte millones de células en una placa de 10 cm y se incubaron durante 24 horas. El medio se reemplazó con medio de cultivo fresco que contenía 10 pg/ml de tra-IR700 que se incubó durante 6 horas a 37 °C. Después de lavar con PBS, se añadió medio de cultivo libre de rojo fenol. A continuación, las células se irradiaron con un láser NIR, que emite luz a una longitud de onda de 670 a 710 nm (L690-66-60; Marubeni America Co., Santa Clara, CA, EE.UU.). La densidad de potencia real (mW/cm2) se midió con un medidor de potencia óptica (PM 100, Thorlabs, Newton, NJ, EE.UU.).
Ensayo de citotoxicidad/fototoxicidad
Los efectos citotóxicos de PIT con APC se determinaron mediante la actividad de luciferasa y la tinción con PI con citometría de flujo o GFP. Para la actividad de luciferasa, 150 pg/ml de medios que contienen D-luciferina (Gold Biotechnology, St Louis, MO, EE. UU.) se administraron a células lavadas con PBS 1 hora después de PIT y se analizaron en un sistema de imágenes por bioluminiscencia (BLI) (Photon Imager; Biospace Lab, París, Francia). Para el ensayo de citometría de flujo, las células se tripsinizaron 1 hora después del tratamiento y se lavaron con PBS. Se añadió PI a la suspensión celular (2 pg/ml finales) y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos, antes de la citometría de flujo.
Estimación de la intensidad de fluorescencia de GFPIRFP in vitro
Se sembraron doscientas mil células en placas con fondo de vidrio y se incubaron durante 12 horas. A continuación, se añadió APC al medio de cultivo (libre de rojo fenol) a 10 pg/ml y se incubó a 37 °C durante 6 horas. Las células se lavaron con PBS y se reemplazó el medio por un nuevo medio de cultivo libre de rojo fenol y se marcó la parte inferior del cubreobjetos (para determinar la posición de observación). 1 hora después de PIT, las células se observaron de nuevo. La intensidad de GFP/RFP se evaluó con píxeles totales con el mismo umbral en el mismo campo de cada esferoide 20. El análisis de las imágenes se realizó con el software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). También se midió la fluorescencia de las células tratadas usando un citómetro de flujo (FACS Calibur).
Modelos animales y tumorales
Todos los procedimientos in vivo se llevaron a cabo de conformidad con la Guía para el cuidado y uso de recursos de animales de laboratorio (1996), Consejo Nacional de Investigación de EE. UU. y aprobado por el Comité local de Cuidado y Uso de Animales. Se adquirieron ratones lampiños atímicos homocigotos hembra de seis a ocho semanas de edad de Charles River (NCI-Frederick). Durante los procedimientos, los ratones fueron anestesiados con isoflurano.
Cuatro millones de células A431-luc-GFP se inyectaron por vía subcutánea en ambos costados (simétricamente derecho e izquierdo) de los ratones, para el modelo tumoral de monocultivo. Para el modelo tumoral mixto, se inyectaron por vía subcutánea células mixtas de 4x106 células A431-luc-GFP y 4x105 células Balb/3T3-RFP (100:10) en ambos flancos (derecho e izquierdo simétricamente).
PIT in vivo
Se inyectaron ratones con 100 pg de pan-IR700 o se irradiaron de la siguiente manera: (1) Se administró luz NIR a 50 J/cm2 el día 1 después de la inyección y 100 J/cm2 el día 2 al tumor derecho (2) no se administró luz NIR al tumor izquierdo que sirvió como control y fue protegido. Los controles incluyeron (1) solo exposición a la luz NIR a 50 J/cm2 el día 1 y 100 J/cm2 el día 2 en el tumor derecho; (2) ningún tratamiento para el tumor izquierdo. Estas terapias se realizaron solo una vez en el día 7 después de la implantación celular. Los ratones se monitorizaron diariamente y se realizó un análisis de imágenes en serie.
Imágenes de fluorescencia in vivo
Las imágenes de fluorescencia in vivo se obtuvieron con un Pearl Imager (LI-COR Bioscience) para detectar la fluorescencia de IR700 y un Maestro Imager (CRi, Woburn, MA, EE. UU.) para GFP/RFP. Para GFP/RFP, se usaron respectivamente un filtro de paso de banda de 445 a 490 nm (excitación) y un filtro azul de paso largo de más de 515 nm (emisión) para GFP, 503 a 555 nm (excitación), y un filtro verde de paso largo sobre 580 nm (emisión) para RFP. El filtro de emisión sintonizable se escalonó automáticamente en incrementos de 10 nm de 515 a 580 nm con una exposición constante (800 ms). Las imágenes de fluorescencia espectral consisten en espectros de autofluorescencia y los espectros de GFP/RFP (tumor), que después no se mezclaron, basándose en el patrón espectral característico de GFP, usando el software Maestro (CRi). Las regiones de interés (ROI) se dibujaron manualmente en el tumor en el flanco o sobre la región abdominal según fuera apropiado para el modelo y se midió la intensidad de la fluorescencia.
Imágenes de bioluminiscencia in vivo
Para BLI, se inyectó D-luciferina (15 mg/ml, 200 pl) por vía intraperitoneal y se analizó la actividad de la luciferasa en los ratones con un Photon Imager en el día 6. Se seleccionaron ratones para estudios adicionales en función del tamaño del tumor y la bioluminiscencia. Para cuantificar las actividades de luciferasa, se colocaron ROI de tamaño similar sobre todo el tumor.
Análisis estadístico
Los datos se expresan como medias ± s.e.m. de un mínimo de cuatro experimentos, salvo que se indique lo contrario. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando un programa estadístico (GraphPad Prism; GraphPad Software, La Jolla, CA, EE.UU.).
Ejemplo 12
Destrucción selectiva de subpoblaciones celulares
Los cultivos celulares y los tejidos a menudo contienen subpoblaciones celulares que potencialmente interfieren con o contaminan otras células de interés. Sin embargo, es difícil eliminar las células no deseadas sin dañar la misma población de células que se busca proteger. Este ejemplo demuestra que los métodos divulgados pueden usarse para reducir o eliminar significativamente una subpoblación específica de células de un cultivo celular mixto 2D o 3D y un modelo tumoral de población mixta in vivo mediante el uso de fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano (PIT).
Por razones tanto científicas como prácticas, la eliminación de un tipo particular de célula de un cultivo celular o de tejido in vivo es a menudo deseable, sin embargo, es difícil de lograr sin dañar las células adyacentes o todo el organismo. Cuando un cultivo celular está contaminado con bacterias, es relativamente sencillo eliminarlas con antibióticos, sin embargo, cuando la contaminación es con otro tipo de célula eucariota, la eliminación selectiva es más difícil. Por ejemplo, cultivos de tejidos basados en células madre (por ejemplo, células madre embrionarias: ES, o célula madre pluripotente inducida: iPS) juegan un papel clave en el campo de la medicina regenerativa, y están a punto de iniciarse ensayos clínicos (Yamanaka, Cell Stem Cell 10678-84, 2012; Yamanaka y Blau, Nature 465, 704­ 12, 2010; Birchall y Seifalian, Lancet 6736, 11-122014; Kamao et al., Stem cell reports 2, 205-18, 2014; y Klimanskaya et al., Nat. Rev. Drug Discov. 7, 131-42, 2008). Durante la regeneración de tejidos, una preocupación potencial es la contaminación con células transformadas que conducen a neoplasias (Okita, et al., Nature 448, 313-7, 2007; Ohnishi et al., Cell 156, 663-77, 2014; Ben-David y Benvenisty, Nat. Rev. Cancer 11, 268-77, 2011; y Knoepfler, Stem Cells 27, 1050-6, 2009). Sería muy deseable eliminar selectivamente estas células transformadas para mantener la integridad del injerto de tejido.
La fotoinmunoterapia (PIT) usa un conjugado de anticuerpo-fotosensibilizador (APC), compuesto por un anticuerpo monoclonal (mAb) (u otro agente de unión específico) conjugado con un fotosensibilizador a base de ftalocianina (IR700). Cuando se expone a la luz infrarroja cercana (NIR), la citotoxicidad se induce solo en células diana unidas a APC (Mitsunaga et al., Bioconjug. Chem. 23, 604-609, 2012).
Los resultados a continuación muestran la viabilidad de usar PIT para eliminar selectivamente un conjunto de células diana. Se usaron un cultivo celular (esferoide) mixto 2D y 3D, así como un modelo de xenoinjerto tumoral mixto. Usando los informadores ópticos, RFP, GFP y luciferasa, diferentes poblaciones de células fueron eliminadas selectivamente por PIT. Por tanto, los métodos divulgados se pueden usar para eliminar o reducir sustancialmente (tal como reducir en al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o al menos un 99,9 %, células diana de cultivo celular o tejido in vivo.
En estos experimentos se usaron dos poblaciones celulares, una línea celular tumoral que expresa EGFR (A431) y la otra línea celular de control, negativa para EGFR (Balb/3T3). El modelo A431 fue modificado genéticamente para expresar GFP y luciferasa (luc) mientras que, Balb/3T3 se modificó para expresar RFP (figuras 10A-10B). Se demostró la unión específica de panitumumab-IR700 (Pan-IR700) a las células A431-luc-GFP que expresan la diana, mientras que no se mostró unión para células Balb/3T3-RFP (figura 10C). La eficacia de destrucción de PIT en células A431-luc-GFP recién establecidas con Pan-IR700 se evaluó con tinción con PI de células muertas en cultivo celular 2D in vitro (figuras 11A-11C). Las células A431-luc-GFP se destruyeron de una manera dependiente de la dosis de luz. La PIT indujo una disminución en la bioluminiscencia (BLI) y la intensidad de fluorescencia de GFP también de una manera dependiente de la dosis de luz (figuras 12A-C, figuras 13A-13C, y figuras 14A-14B), que coincidía con la tinción con PI de células muertas. Estos datos indicaron que PIT podría monitorizarse con fluorescencia de GFP y BLI.
A continuación, se evaluó la eficacia de PIT en esferoides 3D que consisten en A431-luc-GFP o Balb/3T3-RFP (figura 15A). Estas células formaron esferoides tan grandes como aproximadamente 500 pm de diámetro (figura 15B). La microscopía confocal tridimensional mostró que estos esferoides eran, de hecho, esféricos (figura 15C). Las imágenes de fluorescencia de las secciones congeladas revelaron que las células estaban uniformemente dispersas por todo el esferoide (figura 15D). Pan-IR700 penetró gradualmente en esferoides desde el perímetro como se muestra en la microscopía de fluorescencia de IR700; el área teñida se extendió gradualmente hacia el centro del esferoide de manera dependiente del tiempo (figura 15E).
La PIT provocó la muerte celular necrótica en la capa unida a APC de células A431-luc-GFP en el esferoide 3D (figura 16). Los efectos destructivos de PIT sobre esferoides A431-luc-GFP monitorizados con fluorescencia de GFP, BLI y tamaño volumétrico, mostraron todos una dependencia de la dosis de luz (figuras 17A-17E). La PIT repetida diariamente logró la erradicación completa de las células A431-luc-GFP dentro de los esferoides (figuras 18A-18F). Estos resultados indican que PIT repetida podría erradicar las células que expresan la diana que crecen en esferoides 3D. Finalmente, el efecto de PIT se evaluó en un modelo de tumor en el flanco A431-luc-GFP en ratones (figuras 19A-D y figura 20). La PIT repetida (figura 19A) condujo a la desaparición tanto de la señal de GFP como de la actividad de luciferasa en el tumor A431-luc-GFP (figura 19B y figura 20) lo que sugiere la erradicación completa del tumor A431-luc-GFP (figuras 19C-19D). Las imágenes del tumor A431-luc-GFP ex vivo validaron los resultados in vivo (figuras 21A-21B).
Para demostrar la eliminación selectiva de células que expresan la diana de cultivos celulares mixtos 2D y 3D o modelos tumorales mixtos, se usaron las dos líneas celulares descritas previamente (A431-luc-GFP y Balb/3T3-RFP) (figura 22A). La destrucción celular selectiva de A431-luc-GFP se documentó con tinción de células muertas con Cytox (figura 22B). La eliminación de A431-luc-GFP de un cultivo celular mixto 2D casi confluente se demostró después de PIT (figura 23A). La PIT repetida (figura 23B) condujo a la eliminación completa de células diana sin afectar al crecimiento de células no diana (figura 23C y figuras 24A-24C). La cuantificación del crecimiento celular por señal de fluorescencia y actividad de luciferasa confirmó la destrucción selectiva de A431-luc-GFP (figuras 23D y 23E).
Con la PIT, no se detectó ningún cambio notable en el esferoide 3D que no expresa la diana, mientras que el esferoide 3D diana claramente disminuyó de tamaño (figura 25A). Para demostrar la eliminación de células diana del cultivo de células 3D, se estableció un esferoide 3D mixto (figura 25B). La PIT repetida (figura 25A) dio como resultado la eliminación completa de células diana del cultivo celular mixto 3D sin dañar las células no diana (figura 26B y figuras 27A-27C). Cada población celular se monitorizó mediante señal de fluorescencia y BLI (figuras 26C-26D).
Cuando se añadieron otras células diana al esferoide, los APC dirigidos apropiadamente con NIR dieron como resultado su eliminación selectiva de los esferoides mixtos 3D. Por ejemplo, los APC HER2 y PSMA dirigidos en un modelo mixto de células 3T3/HER2-luc-GFP y PC3-PIP-luc-GFP dieron como resultado la eliminación selectiva de estas células diana en cada caso (figuras 28A y 28B).
Finalmente, se demostró la eliminación completa de células diana dentro de un tumor mixto implantado en el flanco de un ratón. Al igual que con los cultivos celulares, las células tumorales que no expresan la diana mostraron un daño mínimo, mientras que las células que expresan la diana fueron erradicadas (figuras 29A y 29B). La PIT repetida (figura 30A) condujo a la eliminación completa de células que expresan la diana de tumores mixtos in vivo con daño mínimo a las células no diana (figuras 30B y 31). La cuantificación de la población celular se logró con señal de fluorescencia y actividad de luciferasa (figuras 30C, 30D). La eliminación celular completa de los tumores mixtos también se confirmó en imágenes ex vivo (figuras 30E y 32A-32B).
En conclusión, este ejemplo muestra que los métodos divulgados pueden usarse para eliminar selectivamente células diana de un cultivo 2D mixto, un esferoide 3D mixto y un tumor in vivo mixto. Por tanto, los métodos divulgados pueden usarse para eliminar selectivamente células de mezclas de células, esferoides y tumores in vivo.
En vista de las muchas realizaciones posibles a las que pueden aplicarse los principios de la divulgación, debe reconocerse que las realizaciones ilustradas son únicamente ejemplos de la divulgación y no deben considerarse una limitación del alcance de la invención. Más bien, el alcance de la invención se define por las siguientes reivindicaciones.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado de IR700-molécula para su uso en un régimen de tratamiento para eliminar una diana de un sujeto que comprende:
i) administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado de IR700-molécula, en donde la molécula del conjugado de IR700-molécula comprende la diana o en donde la molécula comprende un agente de unión específico que se une específicamente a la diana;
ii) formar un conjugado de IR700-molécula hidrófobo después de irradiar al sujeto en condiciones de irradiación a una longitud de onda de 660 nm a 710 nm y a una dosis de al menos 4 J cm-2 y permitir que el conjugado de IR700-molécula hidrófobo se agregue; y
iii) detectar una disminución en la cantidad de la molécula diana en el sujeto o detectar un aumento en la cantidad de la molécula diana eliminada del sujeto.
en donde la diana se selecciona entre los grupos:
una proteína, péptido, lectina, carbohidrato, metal, molécula de ácido nucleico, molécula orgánica pequeña, fármaco recreativo, agente farmacológico, agente quimioterapéutico, agente biológico, antibiótico, fármaco antihipertensivo, antidepresivo, analgésico, hormona reproductiva, diluyente de la sangre, esteroide, estatina, patógeno o espora.
2. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el conjugado de IR700-molécula comprende un conjugado de IR700-anticuerpo, conjugado de IR700-fragmento de anticuerpo, conjugado de IR700-molécula Affibody®, conjugado de IR700-hapteno, conjugado de IR700-lectina, conjugado de IR700-proteína, conjugado de IR700-molécula de ácido nucleico, o conjugado de IR700-ácido nucleico funcional en donde el anticuerpo, fragmento de anticuerpo, molécula Affibody®, hapteno, lectina, proteína, molécula de ácido nucleico, y el ácido nucleico funcional pueden unirse específicamente a la molécula diana.
3. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el sujeto tiene un cáncer de mama, hígado, riñón, útero, colon, ovario, próstata, páncreas, cerebro, cuello uterino, hueso, piel o pulmón.
4. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en donde detectar una disminución en la cantidad de la molécula diana en el sujeto comprende medir una cantidad de la diana en una muestra de sangre obtenida del sujeto.
5. Un método in vitro para eliminar una diana de una muestra, que comprende:
poner en contacto la muestra con un conjugado de IR700-molécula para formar un complejo de diana-conjugado de IR700-molécula, en donde la molécula del conjugado de IR700-molécula comprende un agente de unión específico que se une específicamente a la diana;
irradiar la muestra a una longitud de onda de 660 a 710 nm y a una dosis de al menos 1 J cirr2 en condiciones suficientes para generar un complejo de diana-conjugado de IR700-molécula hidrófobo;
incubar la muestra en condiciones que permitan que el complejo de diana-conjugado de IR700-molécula hidrófobo se agregue; y
separar el complejo de diana-conjugado de IR700-molécula hidrófobo de la muestra, eliminando así la diana de la muestra, caracterizado por que la diana es una proteína, péptido, lectina, carbohidrato, metal, molécula de ácido nucleico, fármaco recreativo, molécula orgánica pequeña, patógeno o espora.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5 en donde la diana de patógeno se selecciona entre el grupo que consiste en: un virus, una bacteria, parásito u hongo.
7. El método de la reivindicación 5 o 6, en donde el conjugado de IR700-molécula comprende un conjugado de IR700-anticuerpo, conjugado de IR700-fragmento de anticuerpo, conjugado de IR700-molécula Affibody®, conjugado de IR700-hapteno, conjugado de IR700-lectina, conjugado de IR700-proteína, conjugado de IR700-molécula de ácido nucleico, o conjugado de IR700-ácido nucleico funcional en donde el anticuerpo, fragmento de anticuerpo, molécula Affibody®, hapteno, lectina, proteína, molécula de ácido nucleico, y el ácido nucleico funcional pueden unirse específicamente a la molécula diana.
8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde la muestra es una muestra de alimento, muestra ambiental, muestra de reactor, muestra de fermentación, o muestra obtenida de un sujeto.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde la muestra se irradia a una longitud de onda de 690 nm /-20 nm o 690 nm /-4 nm.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en donde incubar la muestra en condiciones que permitan que el complejo de molécula diana-conjugado de IR700-molécula se agregue comprende centrifugar la muestra en condiciones que permitan que el complejo de molécula diana-conjugado de IR700-molécula forme un sedimento.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en donde incubar la muestra en condiciones que permitan que el complejo de molécula diana-conjugado de IR700-molécula se agregue comprende permitir que el complejo de molécula diana-conjugado de IR700-molécula se deposite en el fondo de un recipiente.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, en donde separar el complejo de molécula diana-conjugado de IR700-molécula de la muestra comprende eliminar un sobrenadante después de permitir que el complejo de molécula diana-conjugado de IR700-molécula se agregue.
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, que comprende además medir la diana eliminada de la muestra.
14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13, que comprende además detectar otras moléculas unidas a la diana.
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