JP2015136322A - 麹菌変異株 - Google Patents
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Abstract
Description
[1] アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)AOK1597株の栄養要求性変異株に対して、ligD遺伝子を欠損させたことを特徴とする、麹菌変異株。
[2] 前記栄養要求性変異株が、pyrF遺伝子の全長又は一部が欠損したウリジン要求性変異株である、前記[1]の麹菌変異株。
[3] 前記ウリジン要求性変異株が、アスペルギルス・アワモリHA1株(受託番号:NITE BP−01751)である、前記[2]の麹菌変異株。
[4] アスペルギルス・アワモリHA2株(受託番号:NITE BP−01752)である、前記[1]の麹菌変異株。
[5] 前記[2]〜[4]のいずれかの麹菌変異株に、pyrF遺伝子及び糖化酵素遺伝子が導入されたことを特徴とする、形質転換体。
[6] 前記糖化酵素遺伝子が、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、β−グルコシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、グルクロニダーゼ遺伝子、及びエンドグルカナーゼ遺伝子からなる群より選択される1種以上である、前記[5]に記載の形質転換体。
[7] 前記糖化酵素遺伝子が、アクレモニウム・セルロリティカス(Acremonium cellulolyticus)由来のセロビオハイドロラーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子、サーモアスカス(Thermoascus)属菌由来のエンドキシラナーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のアラビノフラノシダーゼ遺伝子、及びアクレモニウム・セルロリティカス由来のグルクロニダーゼ遺伝子からなる群より選択される1種以上である、前記[5]に記載の形質転換体。
[8] pyrF遺伝子及び前記糖化酵素遺伝子が、染色体中に組み込まれている、前記[5]〜[7]のいずれかの形質転換体。
[9] 前記[5]〜[8]のいずれかの形質転換体を固体培養することを特徴とする、糖化酵素の生産方法。
[10] 稲わら又はコーンストーバを用いて固体培養する、前記[9]の糖化酵素の生産方法。
本発明に係る麹菌変異株は、アスペルギルス・アワモリAOK1597株(株式会社秋田今野商店より入手可能である。)(以下、「AOK1597株」と略すことがある。)の栄養素の合成等に関する遺伝子の機能を欠損させることにより、栄養要求性を獲得した変異株に対して、ligD遺伝子を欠損させたことを特徴とする。ligD遺伝子は、ゲノムに生じるランダムな切れ目の修復に必要な酵素である。本発明に係る麹菌変異株では、ligD遺伝子が欠損しているため、非相同性組換えが生じず、染色体中のランダムな位置に導入されることが防止される。このため、相同組換えにより染色体中の目的の箇所に外来遺伝子を導入することができる。
本発明に係る麹菌変異株の親株である栄養要求性変異株は、AOK1597株の栄養素の合成等に関する遺伝子の全長又は一部を欠損させることにより、栄養要求性が付与された株である。後記参考例1に示すように、AOK1597株は、固体培養した際の酵素生産効率が、他のアスペルギルス・アワモリよりも優れている。つまり、本発明に係る麹菌変異株は、元々固体培養による酵素生産効率の高い株に栄養要求性を付与した上で、ligD遺伝子を欠損させた株である。
前記ウリジン要求性変異株等の栄養要求性変異株からligD遺伝子を欠損させた麹菌変異体を製造する方法としては、マーカーリサイクリング法を利用した方法が好ましい。図1に、前記ウリジン要求性変異株に対するpyrF遺伝子のリサイクリング法のスキームの模式図を示す。ligD遺伝子を欠損させるための相同組換えには、pyrF遺伝子配列を含むDNA断片(図中、「ligD欠損用断片」)を用いる。このligD欠損用断片は、pyrF遺伝子配列の上流側と下流側に、それぞれ、染色体中のligD遺伝子の上流側と下流側の配列と相同的な配列を付加し、さらにpyrF遺伝子配列の下流側に、pyrF遺伝子配列の上流側近傍の領域と相同的な領域を付加したものである。ウリジン要求性変異株に導入されたligD欠損用断片は、染色体中のligD遺伝子が存在する領域において相同組換えを起こす結果、ligD遺伝子に代えてpyrF遺伝子が組み込まれる。ウリジン不含培地で生育させることにより、pyrF遺伝子が組み込まれた形質転換体のみを選抜する。この選抜されたクローンを5’−FOA平板培地で培養することにより、分子内相同組換えによってpyrF遺伝子が切り出された結果、再び5−FOA耐性となり生育してきたコロニーを得ることにより、ligD遺伝子とpyrF遺伝子の両方が欠損している麹菌変異株(本発明に係る麹菌変異株)が得られる。
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る麹菌変異株のうち、pyrF遺伝子の全長又は一部を欠損させたウリジン要求性変異株に、pyrF遺伝子及び糖化酵素遺伝子が導入されたことを特徴とする。pyrF遺伝子と糖化酵素遺伝子の両方を導入することにより、形質転換体はウリジン不含培地でも生育可能となる。このため、遺伝子導入後の麹菌をウリジン不含培地で培養することにより、形質転換体のみが選抜できる。
本発明に係る糖化酵素の生産方法は、本発明に係る形質転換体を、草本類バイオマスを用いて固体培養することを特徴とする。本発明に係る形質転換体は、元々固体培養において酵素生産収率の高いAOK1597株を親株とするため、他のアスペルギルス・アワモリを親株として製造された形質転換体よりも、固体培養により糖化酵素を高収率で生産できる。
アスペルギルス・オリゼ及びアスペルギルス・アワモリの各株(RIB40株、RIB128株、AOK20株、AOK2P株、AOK27L株、AOK65株、AOK139株、AOK210株、AOK241株、AOK1597株、AOK1505株、AOK1506株、AOK1508株、AOK1509株、及びAOK1510株)(いずれも秋田今野商店より入手。)について、菌体外に分泌した全酵素量に基づいて酵素の生産収率を算出して比較した。ここで、「酵素の生産収率」とは、投入した炭素源当たりの生産酵素量であり、下記式により算出した。
式:[酵素の生産収率]=[分泌した全酵素量]÷[投入したデキストリン量]
これとは別に、各麹菌株を、Czapek−Dox(CD)培地(3質量/容量% デキストリン、0.1質量/容量%リン酸2水素カリウム、0.2質量/容量% 塩化カリウム、0.05質量/容量% 硫酸マグネシウム、0.001質量/容量% 硫酸鉄、0.3質量/容量% 硝酸ナトリウム)培地にて1週間培養し、胞子懸濁液を作製した。
次に、基質サンプル5gを50mL容プラスチックチューブ(ベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー社製)に測り取り、121℃、15分間の条件でオートクレーブ処理した。オートクレーブ後の基質サンプルに、1×106個の胞子を植菌し、撹拌した後に滅菌シャーレ(旭硝子社製)に移し、30℃、95%RHで40時間培養した。また同時に、胞子を植菌しないサンプル(ネガティブコントロール)も同様に実施した。
培養後の基質全量を50mL容プラスチックチューブに回収し、塩化ナトリウム(和光純薬工業社製)の0.5%溶液15mLを加えて撹拌し、4℃にて2時間静置した。静置後、4℃、10,000×gで10分遠心し、上清を滅菌フィルター(メルク社製)により処理することにより、酵素液を取得した。
取得した酵素液10μLを用いてSDS−PAGEを行い、得られたバンドの強度より分泌された全酵素量を算出した。ネガティブコントロールをHPLCにより分析し、投入したデキストリン量を算出した。得られた全分泌酵素量と投入したデキストリン量から、前記式に基づいて酵素の生産収率を算出した。
(HA1株の作製)
AOK1597株に対し、pyrF遺伝子を自然変異導入法により欠損させ、ウリジン要求性を持つ固体培養で酵素生産性の高い麹菌アスペルギルス・アワモリHA1株を得た。
次いで、CD培地に終濃度1mg/mLの5−フルオロオロチン酸一水和物(和光純薬工業社製)と終濃度20mM ウリジン(Sigma−Aldrich社製)を加えたプレート培地(ウリジン含有CDプレート培地)に、得られた胞子懸濁液を1×106個/プレートになるように植菌し、生育できる株を選択することにより、pyrF遺伝子(Aspergillus nidulansのpyrFオルソログ)欠損株であるHA1株を得た。
マーカーリサイクリング法を利用して、HA1株からligD遺伝子を欠損させることにより、ウリジン要求性を持つ固体培養で酵素生産性の高い麹菌アスペルギルス・アワモリHA2株(以下、「HA2株」と略すことがある。)を得た。
これとは別に、プラスミドpRI910(タカラバイオ社製)を制限酵素Sma I(タカラバイオ社製)により30℃で処理し、前記精製キットを用いて精製し、プラスミドの制限処理物(遺伝子断片)を取得した。
得られたプラスミドpRI−AaΔligDを制限酵素Not I(タカラバイオ社製)により37℃で処理し、前記精製キットを用いて精製し、プラスミドの制限処理物(遺伝子断片)を取得した。
得られたプラスミドpRI−AaΔligDの遺伝子断片とpyrF遺伝子断片とを、In−Fusion(登録商標) HD Cloningキット(タカラバイオ社製)を用いて処理し、E.coli HST08株(タカラバイオ社製)に形質転換し、ligD遺伝子の上流配列と下流配列の間にpyrF遺伝子を導入したプラスミドpRI−AaΔligD::pyrFを取得した。
得られたプラスミドpRI−AaΔligD::pyrFの遺伝子断片とマーカーリサイクリング用配列の遺伝子断片とを、In−Fusion(登録商標) HD Cloningキット(タカラバイオ社製)を用いて処理し、E.coli HST08株(タカラバイオ社製)に形質転換し、pyrF遺伝子とligD遺伝子の下流配列との間にマーカーリサイクリング用配列を導入したプラスミドpRI−AaΔligD::pyrFRを取得した。
AMT(Agrobacterium−mediated transformation)法を用いて、Michielseらの方法(非特許文献6参照。)に従って、取得したC58C1株の形質転換株を用い、HA1株を形質転換した。形質転換処理物からCDプレート培地で生育できる株を選択し、ligD遺伝子欠損株を得た。
NITE BP−01752
Claims (10)
- アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)AOK1597株の栄養要求性変異株に対して、ligD遺伝子を欠損させたことを特徴とする、麹菌変異株。
- 前記栄養要求性変異株が、pyrF遺伝子の全長又は一部が欠損したウリジン要求性変異株に対してligD遺伝子を欠損させたことを特徴とする、麹菌変異株。
- 前記ウリジン要求性変異株が、アスペルギルス・アワモリHA1株(受託番号:NITE BP−01751)である、請求項1に記載の麹菌変異株。
- アスペルギルス・アワモリHA1株(受託番号:NITE BP−01752)である、請求項1に記載の麹菌変異株。
- 請求項2〜4のいずれか一項に記載の麹菌変異株に、pyrF遺伝子及び糖化酵素遺伝子が導入されたことを特徴とする、形質転換体。
- 前記糖化酵素遺伝子が、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、β−グルコシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、グルクロニダーゼ遺伝子、及びエンドグルカナーゼ遺伝子からなる群より選択される1種以上である、請求項5に記載の形質転換体。
- 前記糖化酵素遺伝子が、アクレモニウム・セルロリティカス(Acremonium cellulolyticus)由来のセロビオハイドロラーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子、サーモアスカス(Thermoascus)属菌由来のエンドキシラナーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のアラビノフラノシダーゼ遺伝子、及びアクレモニウム・セルロリティカス由来のグルクロニダーゼ遺伝子からなる群より選択される1種以上である、請求項5に記載の形質転換体。
- pyrF遺伝子及び前記糖化酵素遺伝子が、染色体中に組み込まれている、請求項5〜7のいずれか一項に記載の形質転換体。
- 請求項5〜8のいずれか一項に記載の形質転換体を固体培養することを特徴とする、糖化酵素の生産方法。
- 稲わら又はコーンストーバを用いて固体培養する、請求項9に記載の糖化酵素の生産方法。
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