JP2015084062A - 顕微鏡撮像装置、顕微鏡撮像方法および顕微鏡撮像プログラム - Google Patents

Abstract

【課題】画像の画質を低下させることなく任意のパターンを有する光を用いた撮像が可能な顕微鏡撮像装置、顕微鏡撮像方法および顕微鏡撮像プログラムを提供する。
【解決手段】投光変調素子１１２によりパターン測定光が生成され、測定対象物Ｓに照射される。生成されたパターンの空間的な位相が光変調素子１１２により所定量ずつ測定対象物Ｓ上で順次移動される。受光部１２０により測定対象物Ｓからの光が受光され、受光量を示す受光信号が出力される。受光部１２０から出力される受光信号に基づいてパターンの複数の位相で生成される複数の画像データに基づいて、測定対象物Ｓの画像を示すセクショニング画像データが生成される。光変調素子１１２の複数の変調画素間の非導光部の周期性に基づいて、画像データまたはセクショニング画像データにおける非導光部に相当する部分がフィルタ処理により除去される。
【選択図】図２

Description

本発明は、顕微鏡撮像装置、顕微鏡撮像方法および顕微鏡撮像プログラムに関する。

光学的セクショニング（切断）により３次元像を作るために使用可能な像を生成する顕微鏡撮像装置が提案されている（特許文献１参照）。

特許文献１に記載された顕微鏡撮像装置においては、空間的に周期的なパターンで物体が照明されるようにマスクが光源に備えられる。それにより、試料にマスクパターンが投影される。マスクパターンの空間位相を調整するために、キャリッジによりマスクが少なくとも３つの位置に移動される。マスクの少なくとも３つの位置で照明された物体の３つ以上の像を解析することにより、物体の３次元像が生成される。

特表２０００−５０６６３４号公報

キャリッジ等の機械的な機構に代えて光変調素子を用いることにより、任意のパターンを有する光を用いた撮像が可能となる。しかしながら、光変調素子を用いて得られた画像の画質は、機械的な機構を用いて得られた画像の画質よりも低下することがある。

本発明の目的は、画像の画質を低下させることなく任意のパターンを有する光を用いた撮像が可能な顕微鏡撮像装置、顕微鏡撮像方法および顕微鏡撮像プログラムを提供することである。

（１）第１の発明に係る顕微鏡撮像装置は、光を出射する投光部と、投光部により出射された光から任意のパターンを有する測定光を生成するように構成された複数の第１の画素を含む光変調素子と、光変調素子により生成された測定光を測定対象物に照射する投光光学系と、測定対象物からの光を受光し、受光量を示す受光信号を出力する受光部と、受光部から出力される受光信号に基づいて画像データを生成する画像データ生成部と、画像データ生成部により生成される画像データに画像処理を行う画像処理部と、パターンを有する測定光を生成するとともに生成されたパターンの空間的な位相を所定量ずつ測定対象物上で順次移動させるように光変調素子を制御し、パターンの複数の位相で生成される複数の画像データに基づいて測定対象物の画像を示すセクショニング画像データを生成するように画像データ生成部を制御する制御部とを備え、光変調素子は、複数の第１の画素間に周期的な非導光部を有し、画像処理部は、光変調素子の非導光部の周期性に基づいて、画像データまたはセクショニング画像データにおける非導光部に相当する部分を除去するフィルタ処理を実行するものである。

この顕微鏡撮像装置においては、投光部により出射された光から複数の第１の画素を含む光変調素子により任意のパターンを有する測定光が生成される。光変調素子により生成された測定光が投光光学系により測定対象物に照射される。生成されたパターンの空間的な位相が光変調素子により所定量ずつ測定対象物上で順次移動される。受光部により測定対象物からの光が受光され、受光量を示す受光信号が出力される。受光部から出力される受光信号に基づいてパターンの複数の位相で生成される複数の画像データに基づいて、測定対象物の画像を示すセクショニング画像データが生成される。

ここで、光変調素子は、複数の第１の画素に周期的な非導光部を含む。光変調素子の非導光部からは、測定光が生成されない。したがって、生成される画像データにより表わされる画像には、光変調素子の非導光部に相当する影パターンが映り込む。このような場合でも、光変調素子の非導光部の周期性に基づいて、画像データまたはセクショニング画像データにおける非導光部に相当する部分がフィルタ処理により除去される。これにより、画像の画質を低下させることなく任意のパターンを有する光を用いた撮像が可能になる。

（２）顕微鏡撮像装置は、フィルタ処理を実行するか否かを指示するための第１の指示部をさらに備え、制御部は、第１の指示部によりフィルタ処理の実行が指示された場合にはフィルタ処理を実行し、第１の指示部によりフィルタ処理の実行が指示されない場合にはフィルタ処理を実行しないように画像処理部を制御してもよい。

この場合、フィルタ処理を実行するか否かが第１の指示部により指示される。これにより、画像に光変調素子の非導光部に相当する影パターンが映り込まない場合のみフィルタ処理を実行することが可能になる。その結果、影パターンが映り込まない画像を表わす画像データまたはセクショニング画像データにフィルタ処理が行われることを防止することができる。

（３）顕微鏡撮像装置は、第１の動作モードまたは第２の動作モードを指示するための第２の指示部をさらに備え、光変調素子は、投光部により出射された光から任意のパターンを有する測定光およびパターンを有しない光を選択的に生成するように構成され、制御部は、第２の指示部により第１の動作モードが指示された場合には、パターンを有する測定光を生成するとともに生成されたパターンの空間的な位相を所定量ずつ測定対象物上で順次移動させるように光変調素子を制御し、パターンの複数の位相で生成される複数の画像データに基づいてセクショニング画像データを生成するように画像データ生成部を制御し、第２の指示部により第２の動作モードが指示された場合には、パターンを有しない測定光を生成するように光変調素子を制御し、パターンを有しない測定光が照射されたときの測定対象物の画像を示す通常画像データを生成するように画像データ生成部を制御してもよい。

この場合、第２の指示部により第１の動作モードまたは第２の動作モードが指示される。第１の動作モードにおいては、パターンを有する測定光が光変調素子により生成され、測定対象物に照射される。また、生成されたパターンの空間的な位相が光変調素子により所定量ずつ測定対象物上で順次移動される。パターンの複数の位相で生成される複数の画像データに基づいてセクショニング画像データが生成される。

一方、第２の動作モードにおいては、パターンを有しない測定光が光変調素子により生成され、測定対象物に照射される。これにより、パターンを有しない測定光が照射されたときの測定対象物の画像を示す通常画像データが生成される。

このように、光変調素子を用いることにより、共通の投光光学系により任意のパターンを有する測定光およびパターンを有しない測定光を測定対象物に照射することができる。これにより、任意のパターンを有する測定光を用いた場合のセクショニング画像データおよびパターンを有しない測定光を用いた場合の通常画像データを得ることができる。

また、画像データ、セクショニング画像データまたは通常画像データにおける非導光部に相当する部分がフィルタ処理により除去される。したがって、第１および第２の動作モードにおいて、画質の低下が防止された画像を示す画像データを生成することができる。

（４）フィルタ処理は、空間フィルタ処理を含んでもよい。この場合、画像データまたはセクショニング画像データにおける光変調素子の非導光部に相当する部分を容易に除去することができる。

（５）画像処理部は、フィルタ処理として、波形変換処理、空間フィルタ処理、および波形変換処理の逆変換処理を順次行ってもよい。

この場合、波形変換処理により光変調素子の非導光部に相当する画像データまたはセクショニング画像データの部分が他の部分から分離される。これにより、空間フィルタ処理により画像データまたはセクショニング画像データにおける光変調素子の非導光部に相当する部分を効率よく除去することができる。その結果、逆変換処理により光変調素子の非導光部に相当する部分が除去された画像を得ることができる。

（６）波形変換処理は、離散フーリエ変換または離散ウェーブレット変換を含んでもよい。

この場合、光変調素子の非導光部に対応する空間周波数に基づいて、画像データまたはセクショニング画像データにおける光変調素子の非導光部に相当する部分を他の部分から高い精度で分離することができる。

（７）空間フィルタ処理は、ぼかしフィルタ処理を含んでもよい。

この場合、ぼかしフィルタ処理により画像がぼかされる。これにより、画像の画質を大きく低下させることなく画像データまたはセクショニング画像データにおける光変調素子の非導光部に相当する部分を容易に除去することができる。

（８）ぼかしフィルタ処理は、ガウシアンフィルタ処理を含んでもよい。

この場合、ガウシアンフィルタ処理により光変調素子の非導光部に相当する部分が画像の他の部分よりも大きな重みでぼかされる。これにより、画像の画質をほとんど低下させることなく画像データまたはセクショニング画像データにおける光変調素子の非導光部に相当する部分を容易に除去することができる。

（９）光変調素子、受光部および投光光学系は、投光光学系の解像度が光変調素子の複数の第１の画素間の隙間の幅よりも低くなるように構成されてもよい。

この場合、投光光学系の解像度が光変調素子の複数の第１の画素間の隙間の幅よりも低いので、生成されるセクショニング画像データに基づく画像には光変調素子の非導光部に相当する影パターンが映り込まない。これにより、画質がほとんど低下しない画像を示すセクショニング画像データを生成することができる。

（１０）光変調素子および受光部の一方は、光変調素子および受光部の他方に対して、投光光学系を介して共役関係となる位置から投光光学系の解像度が光変調素子の複数の第１の画素間の隙間の幅よりも低くなるまでずれた位置に配置されてもよい。

この場合、投光光学系の解像度を光変調素子の複数の第１の画素間の隙間の幅よりも容易に低くすることができる。

（１１）投光光学系の変調伝達関数の値は、光変調素子の複数の第１の画素間の隙間の幅に対応する空間周波数において、予め定められたしきい値以下であってもよい。

この場合、投光光学系の解像度を光変調素子の複数の第１の画素間の隙間の幅よりも容易に低くすることができる。

（１２）受光部の受光面を含む平面上において、測定対象物から受光部への光の照射範囲が受光部の受光面を包含するように投光光学系が構成されてもよい。

投光光学系の配置のずれのため、測定対象物から受光部への光の照射範囲が受光部の受光面に相当する範囲より外れることがある。光が受光部の受光面の一部に照射されない場合、生成されるセクショニング画像データに基づく画像の一部に欠落が発生する。上記の構成によれば、測定対象物から受光部への光の照射範囲が受光部の受光面を包含する。そのため、光の大部分が受光部の受光面に入射する。これにより、投光光学系の配置のずれによる欠落が防止された画像を示すセクショニング画像データを生成することができる。

（１３）受光部は、互いに交差する第１および第２の方向に並ぶ複数の第２の画素を含み、受光部の受光面を含む平面上において、光変調素子の各１個の第１の画素に対応する測定対象物から受光部への光の部分が、第１の方向に並ぶ３個の第２の画素および第２の方向に並ぶ３個の第２の画素を含む領域以下の領域に照射されるように投光光学系が構成されてもよい。

測定対象物から受光部への光の照射範囲が受光部の受光面よりも大き過ぎる場合、光変調素子による測定光のパターンの最小の幅が大きくなることにより、測定対象物の細部を高い精度で撮像する性能（セクショニング性能）が低下する。上記の構成によれば、光変調素子の各１個の第１の画素に対応する光の部分の照射範囲は、第１の方向に並ぶ３個の第２の画素および第２の方向に並ぶ３個の第２の画素を含む領域以下の領域に制限される。これにより、光変調素子による測定光のパターンの最小の幅を小さくすることができる。その結果、セクショニング性能が低下することを防止することができる。

（１４）第２の発明に係る顕微鏡撮像方法は、投光部により光を出射するステップと、投光部により出射された光から複数の第１の画素を含む光変調素子により任意のパターンを有する測定光を生成するステップと、光変調素子により生成された測定光を投光光学系により測定対象物に照射するステップと、生成されたパターンの空間的な位相を光変調素子により所定量ずつ測定対象物上で順次移動させるステップと、受光部により測定対象物からの光を受光し、受光量を示す受光信号を出力するステップと、受光部から出力される受光信号に基づいてパターンの複数の位相で生成される複数の画像データに基づいて、測定対象物の画像を示すセクショニング画像データを生成するステップと、光変調素子の複数の第１の画素間の非導光部の周期性に基づいて、画像データまたはセクショニング画像データにおける非導光部に相当する部分を除去するステップとを含むものである。

この顕微鏡撮像方法によれば、投光部により出射された光から複数の第１の画素を含む光変調素子により任意のパターンを有する測定光が生成される。光変調素子により生成された測定光が投光光学系により測定対象物に照射される。生成されたパターンの空間的な位相が光変調素子により所定量ずつ測定対象物上で順次移動される。受光部により測定対象物からの光が受光され、受光量を示す受光信号が出力される。受光部から出力される受光信号に基づいてパターンの複数の位相で生成される複数の画像データに基づいて、測定対象物の画像を示すセクショニング画像データが生成される。

ここで、光変調素子は、複数の第１の画素に周期的な非導光部を含む。光変調素子の非導光部からは、測定光が生成されない。したがって、生成される画像データにより表わされる画像には、光変調素子の非導光部に相当する影パターンが映り込む。このような場合でも、光変調素子の非導光部の周期性に基づいて、画像データまたはセクショニング画像データにおける非導光部に相当する部分が除去される。これにより、画像の画質を低下させることなく任意のパターンを有する光を用いた撮像が可能になる。

（１５）第３の発明に係る顕微鏡撮像プログラムは、処理装置により実行可能な顕微鏡撮像プログラムであって、投光部により光を出射する処理と、投光部により出射された光から複数の第１の画素を含む光変調素子により任意のパターンを有する測定光を生成する処理と、光変調素子により生成された測定光を投光光学系により測定対象物に照射する処理と、生成されたパターンの空間的な位相を光変調素子により所定量ずつ測定対象物上で順次移動させる処理と、受光部により測定対象物からの光を受光し、受光量を示す受光信号を出力する処理と、受光部から出力される受光信号に基づいてパターンの複数の位相で生成される複数の画像データに基づいて、測定対象物の画像を示すセクショニング画像データを生成する処理と、光変調素子の複数の第１の画素間の非導光部の周期性に基づいて、画像データまたはセクショニング画像データにおける非導光部に相当する部分を除去する処理とを、処理装置に実行させるものである。

この顕微鏡撮像プログラムによれば、投光部により出射された光から複数の第１の画素を含む光変調素子により任意のパターンを有する測定光が生成される。光変調素子により生成された測定光が投光光学系により測定対象物に照射される。生成されたパターンの空間的な位相が光変調素子により所定量ずつ測定対象物上で順次移動される。受光部により測定対象物からの光が受光され、受光量を示す受光信号が出力される。受光部から出力される受光信号に基づいてパターンの複数の位相で生成される複数の画像データに基づいて、測定対象物の画像を示すセクショニング画像データが生成される。

ここで、光変調素子は、複数の第１の画素に周期的な非導光部を含む。光変調素子の非導光部からは、測定光が生成されない。したがって、生成される画像データにより表わされる画像には、光変調素子の非導光部に相当する影パターンが映り込む。このような場合でも、光変調素子の非導光部の周期性に基づいて、画像データまたはセクショニング画像データにおける非導光部に相当する部分が除去される。これにより、画像の画質を低下させることなく任意のパターンを有する光を用いた撮像が可能になる。

本発明によれば、画像の画質を低下させることなく任意のパターンを有する光を用いた撮像が可能になる。

本発明の一実施の形態に係る顕微鏡撮像装置の構成を示すブロック図である。 図１の顕微鏡撮像装置の測定部および測定光供給部の構成を示す模式図である。 図１の顕微鏡撮像装置の測定部における光路を示す模式図である。 ＣＰＵの構成を示すブロック図である。 パターン付与部により出射される測定光の例を示す図である。 測定対象物の通常画像を示す図である。 通常画像および変換画像の一例を示す図である。 影パターンの空間周波数の算出に用いられるパターン測定光の一例を示す図である。 投影解像サイズの調整方法を説明するための図である。 受光面を含む平面上における蛍光の照射範囲と受光面との関係を示す図である。 蛍光の照射範囲および受光面の一部の拡大図である。 受光部の模式的拡大図である。

（１）顕微鏡撮像装置の構成
図１は、本発明の一実施の形態に係る顕微鏡撮像装置の構成を示すブロック図である。図２は、図１の顕微鏡撮像装置５００の測定部および測定光供給部３００の構成を示す模式図である。図３は、図１の顕微鏡撮像装置５００の測定部における光路を示す模式図である。

以下、本実施の形態に係る顕微鏡撮像装置５００について、図１〜図３を参照しながら説明する。図１に示すように、顕微鏡撮像装置５００は、測定部１００、ＰＣ（パーソナルコンピュータ）２００、測定光供給部３００および表示部４００を備える。

図２に示すように、測定光供給部３００は、電源装置３１０、投光部３２０および導光部材３３０を含む。本例においては、導光部材３３０は液体ライトガイドである。導光部材３３０は、例えばガラスファイバまたは石英ファイバであってもよい。電源装置３１０は、投光部３２０に電力を供給するとともに、図示しない電源ケーブルを介して測定部１００に電力を供給する。

投光部３２０は、測定光源３２１、減光機構３２２および遮光機構３２３を含む。測定光源３２１は、例えばメタルハライドランプである。測定光源３２１は、水銀ランプまたは白色ＬＥＤ（発光ダイオード）等の他の光源であってもよい。以下、測定光源３２１により出射される光を測定光と呼ぶ。

減光機構３２２は、互いに透過率が異なる複数のＮＤ（Neutral Density）フィルタを含む。減光機構３２２は、複数のＮＤフィルタのいずれかが測定光源３２１から出射された測定光の光路上に位置するように配置される。測定光の光路上に位置するＮＤフィルタを選択的に切り替えることにより、減光機構３２２を通過する測定光の強度を調整することができる。減光機構３２２は、複数のＮＤフィルタに代えて、光の強度を調整可能な光変調器等の光学素子を含んでもよい。

遮光機構３２３は、例えばメカニカルシャッタである。遮光機構３２３は、減光機構３２２を通過した測定光の光路上に配置される。遮光機構３２３が開状態である場合には、測定光は遮光機構３２３を通過し、導光部材３３０に入力される。一方、遮光機構３２３が閉状態である場合には、測定光は遮断され、導光部材３３０に入力されない。遮光機構３２３は、光の通過および遮断を切り替え可能な光変調器等の光学素子を含んでもよい。

測定部１００は、例えば蛍光顕微鏡であり、蛍光照明レンズ１０１、パターン付与部１１０、受光部１２０、透過光供給部１３０、ステージ１４０、フィルタユニット１５０、レンズユニット１６０および制御基板１７０を含む。受光部１２０、フィルタユニット１５０、レンズユニット１６０、ステージ１４０および透過光供給部１３０は、下方から上方に向かってこの順で配置される。

ステージ１４０上には、測定対象物Ｓが載置される。本例においては、測定対象物Ｓは種々のタンパク質を含む生物標本である。測定対象物Ｓには、特定のタンパク質に融合する蛍光試薬が塗布されている。蛍光試薬は、例えばＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（テキサスレッド）およびＤＡＰＩ（ジアミジノフェニルインドール）を含む。

ＧＦＰは、４９０ｎｍ付近の光を吸収して５１０ｎｍ付近の波長の光を放出する。Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄは、波長５９６ｎｍ付近の光を吸収して波長６２０ｎｍ付近の光を放出する。ＤＡＰＩは、波長３４５ｎｍ付近の光を吸収して波長４５５ｎｍ付近の光を放出する。

測定対象物Ｓが載置されるステージ１４０上の平面（以下、載置面と呼ぶ）内で互いに直交する２方向をＸ方向およびＹ方向と定義し、載置面に対して直交する方向をＺ方向と定義する。本実施の形態においては、Ｘ方向およびＹ方向は水平方向であり、Ｚ方向は上下方向である。また、本実施の形態においては、ステージ１４０はＸ−Ｙステージであり、図示しないステージ駆動部によりＸ方向およびＹ方向に移動可能に配置される。

測定部１００には、測定光供給部３００から出射される測定光を測定対象物Ｓに導く光学系、透過光供給部１３０から出射される光を測定対象物Ｓに導く光学系および測定対象物Ｓからの光を受光部１２０に導く光学系が構成される。

パターン付与部１１０は、光出力部１１１、光変調素子１１２および複数（本例では２個）のミラー１１３を含む。光出力部１１１は、導光部材３３０に入力された測定光を出力する。光出力部１１１から出力された光は、複数のミラー１１３により反射され、光変調素子１１２に入射する。

光変調素子１１２は、例えばＤＭＤ（デジタルマイクロミラーデバイス）である。ＤＭＤは２次元状に配列された複数のマイクロミラーにより構成される。光変調素子１１２は、ＬＣＯＳ（Liquid Crystal on Silicon：反射型液晶素子）またはＬＣＤ（液晶ディスプレイ）であってもよい。光変調素子１１２に入射した光は、後述するパターン生成部２１２により予め設定されたパターンおよび予め設定された強度（明るさ）に変換され、蛍光照明レンズ１０１を通ってフィルタユニット１５０に出射される。

フィルタユニット１５０は、複数（本例では３個）のフィルタキューブ１５１およびフィルタターレット１５２を含む。複数のフィルタキューブ１５１は、測定対象物Ｓに塗布される複数種類の蛍光試薬に対応する。図３に示すように、各フィルタキューブ１５１は、フレーム１５１ａ、励起フィルタ１５１ｂ、ダイクロイックミラー１５１ｃおよび吸収フィルタ１５１ｄを含む。フレーム１５１ａは、励起フィルタ１５１ｂ、ダイクロイックミラー１５１ｃおよび吸収フィルタ１５１ｄを支持する立方体状の部材である。

図２の励起フィルタ１５１ｂは、第１の波長帯域の光を通過させる帯域通過フィルタである。吸収フィルタ１５１ｄは、第１の波長帯域と異なる第２の波長帯域の光を通過させる帯域通過フィルタである。ダイクロイックミラー１５１ｃは、第１の波長帯域を含む波長帯域の光を反射し、第２の波長帯域を含む波長帯域の光を通過させるミラーである。第１および第２の波長帯域は、蛍光試薬の吸収波長および放出波長に応じてフィルタキューブ１５１ごとに互いに異なる。

フィルタターレット１５２は、円板状を有する。本実施の形態においては、フィルタターレット１５２に略９０°間隔で４個のフィルタキューブ取付部１５２ａが設けられている。各フィルタキューブ取付部１５２ａは、フィルタキューブ１５１を取り付け可能に形成された開口である。

本実施の形態においては、３個のフィルタキューブ取付部１５２ａにそれぞれ３個のフィルタキューブ１５１が取り付けられ、残り１個のフィルタキューブ取付部１５２ａにはフィルタキューブ１５１が取り付けられない。そのため、フィルタキューブ１５１が取り付けられないフィルタキューブ取付部１５２ａを測定光の光路上に配置させることにより、フィルタキューブ１５１を用いない明視野観察を行うことが可能である。なお、図２の例においては、フィルタターレット１５２に２個のフィルタキューブ１５１が取り付けられている。

フィルタターレット１５２は、図示しないフィルタターレット駆動部によりＺ方向に平行な軸を中心に所定の角度間隔（本例では９０°間隔）で回転可能に配置される。使用者は、後述するＰＣ２００の操作部２５０を操作してフィルタターレット１５２を回転させることにより、測定対象物Ｓの測定に用いるフィルタキューブ１５１を選択する。

選択されたフィルタキューブ１５１は、測定光が励起フィルタ１５１ｂに入射するようにフィルタユニット１５０に取り付けられている。図３に示すように、励起フィルタ１５１ｂに測定光が入射すると、測定光のうち第１の波長帯域を有する成分のみが励起フィルタ１５１ｂを通過する。励起フィルタ１５１ｂを通過した測定光は、ダイクロイックミラー１５１ｃにより上方のレンズユニット１６０（図２）に向けて反射される。

レンズユニット１６０は、複数（本例では６個）の対物レンズ１６１、レンズターレット１６２および焦点位置調整機構１６３を含む。複数の対物レンズ１６１は、互いに異なる倍率を有する。レンズターレット１６２は、円板状を有する。本実施の形態においては、レンズターレット１６２上に略６０°間隔で６個の対物レンズ取付部１６２ａが設けられている。各対物レンズ取付部１６２ａは、対物レンズ１６１を取付可能に形成された開口である。

本実施の形態においては、６個の対物レンズ取付部１６２ａにそれぞれ６個の対物レンズ１６１が取り付けられる。なお、図２の例においては、レンズユニット１６０に３個の対物レンズ１６１が取り付けられている。

レンズターレット１６２は、図示しないレンズターレット駆動部によりＺ方向に平行な軸を中心に所定の角度間隔（本例では６０°間隔）で回転可能に配置される。使用者は、後述するＰＣ２００の操作部２５０を操作してレンズターレット１６２を回転させることにより、測定対象物Ｓの測定に用いる対物レンズ１６１を選択する。選択された対物レンズ１６１は、選択されたフィルタキューブ１５１と重なる。これにより、図３に示すように、フィルタキューブ１５１のダイクロイックミラー１５１ｃにより反射された測定光は、選択された対物レンズ１６１を通過する。

図２の焦点位置調整機構１６３は、図示しない焦点位置調整機構駆動部によりレンズターレット１６２をＺ方向に移動可能に配置される。これにより、ステージ１４０上の測定対象物Ｓと選択された対物レンズ１６１との相対的な距離が調整される。ステージ１４０は、略中央部に開口を有する。対物レンズ１６１を通過した測定光は、集光されつつステージ１４０の開口を通過して測定対象物Ｓに照射される。

測定光が照射された測定対象物Ｓは、測定光を吸収して、第２の波長帯域を含む波長帯域の蛍光を放出する。測定対象物Ｓの下方に放出された蛍光は、選択された対物レンズ１６１ならびに選択されたフィルタキューブ１５１のダイクロイックミラー１５１ｃおよび吸収フィルタ１５１ｄを通過する。これにより、蛍光のうち第２の波長帯域を有する成分が受光部１２０に入射する。

本実施の形態において、測定部１００は測定対象物Ｓからの蛍光を観察可能な蛍光顕微鏡であるが、これに限定されない。測定部１００は、例えば反射型顕微鏡であってもよい。この場合、フィルタターレット１５２のフィルタキューブ取付部１５２ａには、フィルタキューブ１５１に代えてハーフミラーが取り付けられる。

透過光供給部１３０は、測定対象物Ｓの明視野観察、位相差観察、微分干渉観察、暗視野観察、偏斜観察または偏光観察に用いられる。透過光供給部１３０は、透過光源１３１および透過光学系１３２を含む。透過光源１３１は、例えば白色ＬＥＤである。透過光源１３１は、ハロゲンランプ等の他の光源であってもよい。以下、透過光源１３１により出射される光を透過光と呼ぶ。

透過光学系１３２は、開口絞り、位相差スリット、リレーレンズ、コンデンサレンズおよびシャッタ等の光学素子を含む。透過光源１３１により出射された透過光は、透過光学系１３２を通過してステージ１４０上の測定対象物Ｓに照射される。

透過光は、測定対象物Ｓを透過して、対物レンズ１６１を通過する。その後、透過光は、フィルタキューブ１５１が取り付けられていないフィルタターレット１５２のフィルタキューブ取付部１５２ａを通過して受光部１２０に入射する。

受光部１２０は、カメラ１２１、カラーフィルタ１２２および結像レンズ１２３を含む。カメラ１２１は、例えば撮像素子を含むＣＣＤ（電荷結合素子）カメラである。撮像素子は、例えばモノクロＣＣＤである。撮像素子は、カラーＣＣＤであってもよいし、ＣＭＯＳ（相補性金属酸化膜半導体）イメージセンサ等の他の撮像素子であってもよい。撮像素子がカラーＣＣＤである場合には、受光部１２０にカラーフィルタ１２２は設けられない。

受光部１２０に入射した蛍光または透過光は、結像レンズ１２３により集光および結像された後、カラーフィルタ１２２を通ってカメラ１２１により受光される。これにより、測定対象物Ｓの画像が得られる。カメラ１２１の撮像素子の各画素からは、受光量に対応するアナログの電気信号（以下、受光信号と呼ぶ）が制御基板１７０に出力される。

制御基板１７０には、図示しないＡ／Ｄ変換器（アナログ／デジタル変換器）およびＦＩＦＯ（First In First Out）メモリが実装される。カメラ１２１から出力される受光信号は、ＰＣ２００による制御に基づいて、Ａ／Ｄ変換器により一定のサンプリング周期でサンプリングされるとともにデジタル信号に変換される。Ａ／Ｄ変換器から出力されるデジタル信号は、ＦＩＦＯメモリに順次蓄積される。ＦＩＦＯメモリに蓄積されたデジタル信号は画素データとして順次ＰＣ２００に転送される。

また、制御基板１７０は、ＰＣ２００による制御に基づいて、パターン付与部１１０、受光部１２０、透過光供給部１３０、ステージ１４０、フィルタユニット１５０およびレンズユニット１６０の動作を制御する。さらに、制御基板１７０は、ＰＣ２００による制御に基づいて、測定光供給部３００の投光部３２０の動作を制御する。

図１に示すように、ＰＣ２００は、ＣＰＵ（中央演算処理装置）２１０、ＲＯＭ（リードオンリメモリ）２２０、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）２３０、記憶装置２４０および操作部２５０を含む。操作部２５０は、キーボードおよびポインティングデバイスを含む。ポインティングデバイスとしては、マウスまたはジョイスティック等が用いられる。

表示部４００は、例えばＬＣＤパネルまたは有機ＥＬ（エレクトロルミネッセンス）パネルにより構成される。図２の例においては、ＰＣ２００および表示部４００は、１台のノート型パーソナルコンピュータにより実現される。

ＲＯＭ２２０には、システムプログラムが記憶される。ＲＡＭ２３０は、種々のデータの処理のために用いられる。記憶装置２４０は、ハードディスク等からなる。記憶装置２４０には、画像処理プログラムおよび顕微鏡撮像プログラムが記憶される。また、記憶装置２４０は、測定部１００から与えられる画素データ等の種々のデータを保存するために用いられる。

図４は、ＣＰＵ２１０の構成を示すブロック図である。図４に示すように、ＣＰＵ２１０は、画像データ生成部２１１、パターン生成部２１２、制御部２１３および画像処理部２１４を含む。画像データ生成部２１１は、測定部１００から与えられる画素データに基づいて画像データを生成する。画像データは複数の画素データの集合である。画像処理部２１４は、画像データ生成部２１１により生成される画像データを表わす画像に画像処理を行う。詳細は後述する。

パターン生成部２１２は、図２の光変調素子１１２により出射される測定光のパターンとして、空間的な位相を所定量ずつ順次移動させつつ前記測定対象物に照射すべきパターンを生成する。制御部２１３は、パターン生成部２１２により生成されたパターンに基づいて図２の制御基板１７０を介して光変調素子１１２を制御することにより、所定のパターンを有する測定光を測定対象物Ｓに照射しつつパターンの位相を移動させる。

また、制御部２１３は、制御基板１７０を介して受光部１２０、透過光供給部１３０、ステージ１４０、フィルタユニット１５０、レンズユニット１６０および投光部３２０の動作を制御する。さらに、制御部２１３は、生成した画像データにＲＡＭ２３０を用いて各種処理を行うとともに、画像データに基づく画像を表示部４００に表示させる。

測定部１００においては、測定対象物Ｓと図３の対物レンズ１６１との相対的な距離を変化させることにより、測定対象物Ｓに対する対物レンズ１６１の焦点の位置（以下、対物レンズ１６１の焦点位置と呼ぶ）が変化する。対物レンズ１６１の焦点位置が変化されつつ測定光が測定対象物Ｓに照射される。これにより、各焦点位置における測定対象物Ｓの画像データが生成される。

本実施の形態に係る顕微鏡撮像装置５００では、図２の投光部３２０を用いて測定対象物Ｓの落射観察を行うことができ、透過光供給部１３０を用いて測定対象物Ｓの透過観察を行うことができる。

落射観察としては、以下に説明するパターン化された測定光を用いるセクショニング観察および均一な測定光を用いる通常観察を行うことができる。

（２）セクショニング観察および通常観察
セクショニング観察では、１次元状または２次元状のパターンを有する測定光を測定対象物Ｓに照射しつつそのパターンの位相を一定量ずつ移動させる。１次元状のパターンを有する測定光は、ＸＹ平面上の一方向（例えばＹ方向）において周期的に変化する強度を有する。２次元状のパターンを有する測定光は、ＸＹ平面上の互いに交差する二方向（例えばＸ方向およびＹ方向）において周期的に変化する強度を有する。

以下、パターンを有する測定光をパターン測定光と呼ぶ。特に、１次元状のパターンを有する測定光を１次元状パターン測定光と呼び、２次元状のパターンを有する測定光を２次元状パターン測定光と呼ぶ。また、均一な強度を有する測定光を均一測定光と呼ぶ。

パターン測定光のパターンは、光変調素子１１２により制御される。以下、パターン測定光のパターンについて説明する。ここで、強度が所定の値以上のパターン測定光の部分を明部分と呼び、強度が所定の値より小さいパターン測定光の部分を暗部分と呼ぶ。図５は、パターン付与部１１０により出射される測定光の例を示す図である。

図５（ａ）は、１次元状パターン測定光の一例を示す。図５（ａ）の１次元状パターン測定光を矩形波状測定光と呼ぶ。矩形波状測定光の断面は、一方向（例えばＸ方向）に平行でかつ一方向に直交する他の方向（例えばＹ方向）に略等間隔で並ぶ複数の直線状の明部分を含み、複数の明部分の間に複数の直線状の暗部分を含む。

図５（ｂ）は、１次元状パターン測定光の他の例を示す。図５（ｂ）の１次元状パターン測定光を１次元正弦波状測定光と呼ぶ。１次元正弦波状測定光の断面は、例えばＸ方向に平行でかつＹ方向に強度が正弦波状に変化するパターンを含む。

図５（ｃ）は、２次元状パターン測定光の一例を示す。図５（ｃ）の２次元状パターン測定光をドット状測定光と呼ぶ。ドット状測定光の断面は、Ｘ方向およびＹ方向に略等間隔で並ぶ複数のドット状の明部分を含む。

２次元状パターン測定光の他の例として、パターン測定光は２次元正弦波状測定光であってもよい。２次元正弦波状測定光の断面は、Ｘ方向およびＹ方向に強度が正弦波状に変化するパターンを含む。２次元状パターン測定光のさらに他の例として、パターン測定光は格子状のパターンまたはチェッカーパターン（市松模様）を有してもよい。

セクショニング観察では、パターン測定光の明部分が測定光の照射範囲の全体に少なくとも１回照射されるようにパターン測定光のパターンの位相を一定量ずつ移動させつつ、測定対象物Ｓにより放出される蛍光を検出する。これにより、測定対象物Ｓの複数の画像データが生成される。

以下、測定対象物Ｓにパターン測定光が照射された場合に得られる画像データをパターン画像データと呼ぶ。パターン画像データに基づく画像をパターン画像と呼ぶ。

各パターン画像データにおいて、パターン測定光の明部分に対応する画素データは高い値（輝度値）を有し、パターン測定光の暗部分に対応する画素データは低い値（輝度値）を有する。そのため、各パターン画像において、パターン測定光の明部分に対応する画素は明るく、パターン測定光の暗部分に対応する画素は暗い。

複数のパターン画像データから画素ごとに複数の画素データの値を用いて明暗差の度合いを表わす成分（以下、合焦成分と呼ぶ）が算出される。合焦成分を有する画素をつなぎ合わせることにより生成される画像データをセクショニング画像データと呼ぶ。セクショニング画像データに基づく画像をセクショニング画像と呼ぶ。

矩形波状測定光またはドット状測定光を用いて生成されたパターン画像データにおいては、合焦成分は、例えば画素データの最大値（最大輝度値）と最小値（最小輝度値）との差、または画素データの値の標準偏差である。１次元正弦波状測定光または２次元正弦波状測定光を用いて生成されたパターン画像データにおいては、合焦成分は、例えば画素データの振幅（ピークトゥピーク）である。

最も簡単な方法では、各画素について、複数のパターン画像データから最大値を有する画素データを選択し、全画素について、選択された画素データをつなぎ合せることにより、セクショニング画像データを生成することが可能である。

ここで、各パターン画像は、迷光の影響を受ける。それにより、パターン画像のパターンにはボケが生じる。各パターン画像データにおいて迷光による成分をボケ成分と呼ぶ。ボケ成分は、パターン測定光の各明部分自体において発生する迷光によるボケ成分と、パターン測定光の各明部分に隣り合う他の明部分からの迷光によるボケ成分とを含む。

そこで、迷光の影響を除去するために、各画素について、パターン測定光の明部分および暗部分が照射されたときのパターン画像データの画素データの差を算出する。算出された全画素についての差をつなぎ合せることにより、セクショニング画像データを生成する。各画素について、パターン測定光の暗部分が照射されたときのパターン画像データの画素データの値は、ボケ成分に相当する。したがって、迷光の影響が除去されたセクショニング画像データを得ることができる。

セクショニング画像データの生成方法の一例として、本実施の形態では、各画素について、複数のパターン画像データの複数の画素データの最大値（最大輝度値）と最小値（最小輝度値）との差を算出する。算出された全画素についての差をつなぎ合せることにより、セクショニング画像データを生成する。他の方法により、複数のパターン画像データの複数の画素データに基づいてセクショニング画像が生成されてもよい。

例えば、各画素について、複数のパターン画像データの複数の画素データの値の標準偏差を算出する。算出された全画素についての標準偏差をつなぎ合せることにより、セクショニング画像データを生成してもよい。

セクショニング観察において、１次元状パターン測定光を用いる場合には、パターン測定光の位相が例えばＹ方向に移動されるので、Ｙ方向におけるボケ成分が除去されたセクショニング画像データが生成される。また、パターン測定光の位相は例えばＸ方向に移動される必要がないので、撮像回数が低減される。そのため、比較的高い画質を有するセクショニング画像を高速に得ることができる。

一方、セクショニング観察において、２次元状パターン測定光を用いる場合には、パターン測定光の位相がＸ方向およびＹ方向に移動されるので、Ｘ方向Ｙ方向におけるボケ成分が除去されたセクショニング画像データが生成される。そのため、１次元状パターン測定光を用いる場合よりも撮像回数が増加するが、非常に高い画質を有するセクショニング画像を得ることができる。

特に測定部１００が蛍光顕微鏡である場合には、多数回のパターン測定光を測定対象物Ｓに照射することにより測定対象物Ｓの蛍光試薬が褪色することがある。そのため、測定対象物Ｓによっては、撮像回数を低減させることが重視されることがある。

本実施の形態においては、光変調素子１１２を制御することにより、１次元状パターン測定光と２次元状パターン測定光とを容易かつ高速に切り替えることができる。したがって、使用者は、セクショニング画像データの生成に要する時間（撮像回数）と、得られるセクショニング画像の画質とを考慮して、セクショニング観察に用いるパターン測定光を選択することができる。

図５（ｄ）は、均一測定光の一例を示す。均一測定光は、均一な強度分布を有する。すなわち、均一測定光は明部分のみからなる測定光である。通常観察では、図５（ｄ）の均一測定光が測定対象物Ｓの全ての部分に照射され、測定対象物Ｓにより放出される蛍光が検出される。これにより、測定対象物Ｓの画像データが生成される。通常観察において得られる画像データを通常画像データと呼び、通常画像データに基づく画像を通常画像と呼ぶ。

（３）画像処理
光変調素子１１２は、２次元状に配列された複数の画素により構成される。以下、カメラ１２１の画素と区別するため、光変調素子１１２の画素を変調画素と呼ぶ。光変調素子１１２がＤＭＤである場合には、変調画素はマイクロミラーであり、光変調素子１１２がＬＣＯＳまたはＬＣＤである場合には、変調画素は液晶の画素である。

光変調素子１１２の複数の変調画素間には、非導光部として微小な隙間が存在する。光変調素子１１２の非導光部では測定光が反射または透過されない。そのため、光変調素子１１２の非導光部からは測定光は出射されない。したがって、光変調素子１１２の非導光部に相当する測定対象物Ｓの部分には、パターン測定光および均一測定光の明部分が照射されない。

図６は、測定対象物Ｓの通常画像を示す図である。なお、図６の例における測定対象物Ｓは白紙である。図６（ａ）は、光変調素子１１２を用いることなく均一測定光を測定対象物Ｓに照射した場合の通常画像である。図６（ｂ）は、光変調素子１１２を用いて均一測定光を測定対象物Ｓに照射した場合の通常画像である。図６（ｃ）は、図６（ｂ）のＡ部の拡大図である。

光変調素子１１２を用いない場合、測定対象物Ｓの全ての部分に均一測定光の明部分が照射される。そのため、図６（ａ）に示すように、測定対象物Ｓの全体の通常画像が得られる。一方、光変調素子１１２を用いた場合、変調素子間の非導光部に相当する測定対象物Ｓの部分には均一測定光の明部分が照射されない。そのため、図６（ｂ），（ｃ）に示すように、得られる通常画像に格子状の影パターンが映り込む。

図６（ｂ），（ｃ）の影パターンがセクショニング画像または通常画像に映り込む場合、セクショニング画像または通常画像の画質が低下する。そこで、本実施の形態においては、ＣＰＵ２１０の画像処理部２１４が以下の画像処理を実行することにより、セクショニング画像または通常画像から影パターンを除去する。以下の説明においては、通常画像から影パターンを除去する手順について説明するが、セクショニング画像から影パターンを除去する手順についても同様である。

まず、通常画像データに波形変換処理が実行される。本例においては、波形変換処理は例えばＤＦＴ（離散フーリエ変換）である。波形変換処理は、ＤＷＴ（離散ウェーブレット変換）等の他の波形変換処理であってもよい。これにより、波形変換処理が行われた画像データが生成される。以下、波形変換処理が行われた画像データを変換画像データと呼び、変換画像データに基づく画像を変換画像と呼ぶ。

図７は、通常画像および変換画像の一例を示す図である。図７（ａ）は光変調素子１１２を用いて得られた通常画像を示す。図７（ａ）の横軸はＸ方向の位置であり、縦方向はＹ方向の位置である。図７（ａ）の通常画像には、格子状の影パターンが映り込んでいる。

図７（ｂ）は変換画像を示す。図７（ｂ）の横軸はＸ方向の空間周波数であり、縦軸はＹ方向の空間周波数である。図７（ｂ）の変換画像の中央部分の画素を示す画素データは、波形変換処理における低周波成分（直流成分）に相当し、大きな値を有する。すなわち、変換画像の中央部分の画素は明るく表示される。

変調画素間の非導光部は略等間隔で存在するので、通常画像に移り込む影パターンは周期性を有する。したがって、影パターンに相当する画素データは、高い空間周波数でかつ比較的大きな値を有する。図７（ｂ）の例においては、枠で囲まれた４つの領域における画素を示す画素データが影パターンに対応する画素データである。これらの領域における画素は、比較的明るく表示される。なお、図７（ｂ）の変換画像においては、枠で囲まれた領域の画素の明るさを視認しやすくするために、明るさが対数表示されている。

次に、変換画像データにフィルタ処理が実行される。フィルタ処理としては、低域通過フィルタ処理または帯域遮断フィルタ処理等の公知のフィルタ処理を用いることができる。フィルタ処理のパラメータは、変換画像データの画素データのうち、影パターンに相当する画素データの値が０になるか、または低減されるように決定される。これにより、影パターンに相当する画素データの値が０になるか、または低減された変換画像データが生成される。

その後、フィルタ処理が実行された変換画像データに波形変換処理の逆変換処理が実行される。波形変換処理がＤＦＴであった場合には、逆変換処理はＩＤＦＴ（逆離散フーリエ変換）であり、波形変換処理がＤＷＴであった場合には、逆変換処理はＩＤＷＴ（逆離散ウェーブレット変換）である。これにより、通常画像データが生成される。

変換画像データにおいては、影パターンに相当する画素データの値が０になるか、または低減されるので、逆変換処理により得られる通常画像データにおいては、影パターンに相当する画素データの値が０になるか、または低減される。これにより、逆変換処理により得られる通常画像データに基づく通常画像から影パターンが除去される。

上記の画像処理に代えて、通常画像データにぼかしフィルタ処理が実行されてもよい。ぼかしフィルタ処理としては、ガウシアンフィルタ処理または移動平均フィルタ処理等の公知のぼかしフィルタ処理を用いることができる。ぼかしフィルタ処理のパラメータは、通常画像データの画素データのうち、影パターンに相当する画素データの値が０になるか、または低減されるように決定される。この場合、ぼかしフィルタ処理により得られる通常画像データに基づく通常画像から影パターンが除去される。

変換画像データに実行するフィルタ処理のパラメータまたは通常画像データに実行するぼかしフィルタ処理のパラメータは、影パターンの空間周波数等の周期性に基づいて決定される。影パターンの空間周波数は、光変調素子１１２の複数の変調画素間の間隔、カメラ１２１の複数の画素間の間隔、蛍光照明レンズ１０１の倍率および結像レンズ１２３の倍率に依存する。したがって、これらの光学素子の値に基づいて、影パターンの空間周波数を算出することが可能である。

なお、本実施の形態においては、対物レンズ１６１は、パターン付与部１１０から測定対象物Ｓへ向かう測定光と、測定対象物Ｓから受光部１２０へ向かう蛍光とに共通に用いられる。そのため、影パターンの空間周波数は、対物レンズ１６１の倍率には依存しない。

ここで、上記の手順により算出される影パターンの空間周波数は、実測される影パターンの空間周波数と僅かに異なることがある。これは、変調画素間の間隔の誤差、画素間の間隔の誤差、レンズの倍率の誤差、測定部１００の組み立ての誤差および光変調素子１１２に対する受光部１２０の傾きの誤差等が原因である。そこで、本実施の形態においては、以下の手順により影パターンの空間周波数が算出される。

図８は、影パターンの空間周波数の算出に用いられるパターン測定光の一例を示す図である。図８（ａ）はパターン付与部１１０から出射されるパターン測定光を示し、図８（ｂ）は受光部１２０により受光されるパターン測定光を示す。図８においては、パターン測定光の明部分が白抜きにより表わされ、暗部分がハッチングパターンにより表わされている。

図８（ａ）の例においては、パターン付与部１１０から出射されるパターン測定光は、Ｘ方向に距離Ｄ１だけ離間する２つの明部分を有する。距離Ｄ１の単位は変調画素数（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｐｉｘｅｌ）である。パターン付与部１１０から出射されたパターン測定光が複数のミラーおよびレンズを介して受光部１２０により受光される。

図８（ｂ）に示すように、受光部１２０により受光されるパターン測定光においては、２つの明部分は距離Ｄ２だけ離間し、２つの明部分を結ぶ直線はＸ方向に対して角度θをなす。距離Ｄ２の単位は画素数（ｉｍａｇｅ ｐｉｘｅｌ）である。

Ｘ方向およびＹ方向の空間周波数は、それぞれＤ２×ｃｏｓθ／（ｎ×Ｄ１）およびＤ２×ｓｉｎθ／（ｎ×Ｄ１）により与えられる。ここで、ｎはビニング数である。ビニング数とは、複数の画素データを擬似的に結合させて１つの画素データとして扱うビニング処理において結合される画素データの数を意味する。例えば、画素データに３×３のビニング処理が行われた場合、Ｘ方向およびＹ方向の空間周波数は、それぞれＤ２×ｃｏｓθ／（３×Ｄ１）およびＤ２×ｓｉｎθ／（３×Ｄ１）となる。

ぼかしフィルタ処理としてガウシアンフィルタ処理を実行する場合、ガウシアン曲線の標準偏差は、Ｄ２／（ｎ×Ｄ１）の値に基づいて決定される。本例においては、ガウシアン曲線の標準偏差は、ｋ×Ｄ２／（ｎ×Ｄ１）により与えられる。ここで、ｋは適当な比例係数であり、例えば０．５である。

本実施の形態においては、自動的にフィルタ処理が実行されることによりパターン画像データ、セクショニング画像データまたは通常画像データにおける光変調素子１１２の非導光部に相当する部分が除去される。ここで、光学系の条件によっては、パターン画像、セクショニング画像または通常画像に影パターンが映り込まないことがある。例えば、対物レンズ１６１の倍率および開口数が大きい場合には、パターン画像、セクショニング画像または通常画像に影パターンが映り込まない。

このような場合に、フィルタ処理を実行すると、パターン画像、セクショニング画像または通常画像の画質が低下する。そのため、フィルタ処理は自動的に実行されず、使用者の指示に基づいて実行されてもよい。あるいは、フィルタ処理を実行するか否かが使用者により選択されてもよい。この場合、使用者は、図１の操作部２５０を用いて、フィルタ処理を実行するか否かを指示または選択することができる。

（４）投影解像サイズの調整
光変調素子１１２により測定対象物Ｓにパターン測定光が照射された場合において、受光部１２０により測定対象物Ｓとともに認識可能なパターン測定光の明部分または暗部分の最小の幅を光変調素子１１２の投影解像サイズｄと呼ぶ。投影解像サイズｄを調整することにより、通常画像から影パターンを除去することも可能である。

光変調素子１１２を長期に渡って使用した場合、劣化により光変調素子１１２の変調画素に欠陥画素が発生することがある。この場合、測定光の明部分から欠陥画素に相当する部分が欠落する。また、複数の変調画素を一組の変調画素群として、測定光の明部分を生成することがある。ここで、変調画素群の複数の変調画素に欠陥画素が発生する場合、測定光の明部分から欠陥画素に相当する部分が大きく欠落する。変調画素または変調画素群の欠陥画素により測定光の明部分の一部が欠落する場合でも、投影解像サイズｄを調整することにより、通常画像から欠落部分を除去することが可能である。

図９は、投影解像サイズｄの調整方法を説明するための図である。図９に示すように、測定部１００には、光変調素子１１２を配置するための位置として、複数の位置Ｄ，Ｃ，Ｂ，Ａ，Ｂ’，Ｃ’，Ｄ’がこの順で並ぶように設けられる。ここで、光変調素子１１２の複数の変調画素間の隙間の寸法（幅）をａ１とし、変調画素の寸法をａ２とし、変調画素群の寸法をａ３とする。寸法ａ３は寸法ａ２よりも大きく、寸法ａ２は寸法ａ１よりも大きい。

光変調素子１１２が複数の位置Ｄ，Ｃ，Ｂ，Ａ，Ｂ’，Ｃ’，Ｄ’のいずれかに配置されることにより、光変調素子１１２の投影解像サイズｄが調整される。位置Ａは、蛍光照明レンズ１０１および結像レンズ１２３からなる光学系の解像度が最大になる位置である。すなわち、位置Ａは、光変調素子１１２の投影解像サイズｄが最小となる位置であり、蛍光照明レンズ１０１および結像レンズ１２３を挟んでカメラ１２１と共役関係となる位置である。

位置Ｂおよび位置Ｂ’は、光学系の解像度が寸法ａ１よりも低く、寸法ａ２以上となる位置である。位置Ｃおよび位置Ｃ’は、光学系の解像度が寸法ａ２よりも低く、寸法ａ３以上となる位置である。位置Ｄおよび位置Ｄ’は、光学系の解像度が寸法ａ３よりも低くなる位置である。

したがって、光変調素子１１２を位置Ｂまたは位置Ｂ’に配置することにより、光変調素子１１２の投影解像サイズｄを寸法ａ１よりも大きくかつ寸法ａ２以下に調整することができる。これにより、通常画像から影パターンを除去することができる。

光変調素子１１２を位置Ｃまたは位置Ｃ’に配置することにより、光変調素子１１２の投影解像サイズｄを寸法ａ２よりも大きくかつ寸法ａ３以下に調整することができる。これにより、通常画像から影パターンを除去するとともに、変調画素の欠陥画素による欠落部分を除去することができる。

光変調素子１１２を位置Ｄまたは位置Ｄ’に配置することにより、光変調素子１１２の投影解像サイズｄを寸法ａ３よりも大きく調整することができる。これにより、通常画像から影パターンを除去し、変調画素の欠陥画素による欠落部分を除去するとともに、変調画素群の欠陥画素による欠落部分を除去することができる。

本実施の形態においては、光変調素子１１２がカメラ１２１と共役関係になる位置（位置Ａ）とは僅かに異なる位置に配置されるが、これに限定されない。測定部１００に透過光供給部１３０が設けられない場合には、光変調素子１１２が位置Ａに配置された状態で、カメラ１２１の位置が光変調素子１１２と共役関係となる位置とは僅かに異なる位置に配置されてもよい。

上記の方法に代えて、または上記の方法と組み合わせて他の方法により光変調素子１１２の投影解像サイズｄが調整されてもよい。例えば、ＭＴＦ（変調伝達関数）の値が所望の空間周波数において予め設定されたしきい値よりも小さく（好ましくは０に）なるように蛍光照明レンズ１０１または結像レンズ１２３が構成されてもよい。これにより、光変調素子１１２の投影解像サイズｄが調整される。この場合、光変調素子１１２は、図９の位置Ａに配置されてもよい。

所望の空間周波数が１／（２×ａ１）である場合、通常画像から影パターンを除去することができる。所望の空間周波数が１／（２×ａ２）である場合、通常画像から変調画素の欠陥画素による欠落部分をさらに除去することができる。所望の空間周波数が１／（２×ａ３）である場合、通常画像から変調画素群の欠陥画素による欠落部分をさらに除去することができる。

（５）光学系の構成
測定光が測定対象物Ｓに照射されることにより、測定対象物Ｓから蛍光が放出される。測定対象物Ｓから放出される蛍光の強度は、測定対象物Ｓに照射される測定光の強度に比例する。したがって、測定対象物Ｓのうち測定光が照射された部分から蛍光が放出され、受光部１２０のカメラ１２１に照射される。なお、蛍光の強度は測定光の強度の１０^−６倍程度である。

カメラ１２１への蛍光の照射範囲は、カメラ１２１の受光面に一致することが好ましい。具体的には、カメラ１２１への蛍光の照射範囲の寸法（投影サイズ）および中心位置は、カメラ１２１の受光面の寸法（観察視野サイズ）および中心位置にそれぞれ一致することが好ましい。

しかしながら、測定部１００には、種々の光学系の配置のずれが存在する。光学系の配置のずれは、蛍光の光軸に対するフィルタターレット１５２の傾きを含む。また、光学系の配置のずれは、図３のフィルタキューブ１５１におけるフレーム１５１ａに対する励起フィルタ１５１ｂ、ダイクロイックミラー１５１ｃおよび吸収フィルタ１５１ｄの取り付けのずれをさらに含む。

これらの光学系の配置のずれのため、蛍光の照射範囲を受光面に一致させることは困難である。受光面の一部に蛍光が照射されない場合、生成された画像データに基づく画像の一部に欠落が発生する。そこで、本実施の形態においては、蛍光の照射範囲を受光面の寸法よりも僅かに大きくし、受光面の全てに蛍光の大部分が照射されるように光学系を構成する。

図１０は、受光面１２０Ｓを含む平面上における蛍光の照射範囲と受光面との関係を示す図である。図１１は、図１０の蛍光の照射範囲Ｒおよび受光面１２０Ｓの一部の拡大図である。図１１（ａ）は図１０のＢ部を示し、図１１（ｂ）は図１０のＣ部を示す。以下の説明で用いられる寸法は、すべて受光面１２０Ｓにおける等価寸法である。

図１０の例においては、蛍光の照射範囲Ｒは、Ｘ方向に平行な２辺とＹ方向に平行な２辺とからなる矩形状を有する。同様に、受光面１２０Ｓは、Ｘ方向に平行な２辺とＹ方向に平行な２辺とからなる矩形状を有する。図１０に示すように、蛍光の照射範囲Ｒは受光面１２０Ｓよりも大きく、受光面１２０Ｓは蛍光の照射範囲の略中央に位置する。以下の説明においては、光学系のＸ方向の寸法および数について説明するが、Ｙ方向の寸法および数についても同様である。

光変調素子１１２の変調画素数をＮ１とし、光変調素子１１２の複数の変調画素間の間隔をＬ１とし、蛍光照明レンズ１０１の焦点距離をＦ１とする。また、受光面の画素数をＮ２とし、受光面の複数の画素間の間隔をＬ２とし、結像レンズ１２３の焦点距離をＦ２とする。なお、変調画素間の間隔Ｌ１は、上記の複数の変調素子間の隙間の間隔をａ１と変調素子の寸法をａ２との和である。対物レンズ１６１の焦点距離をＦ０とすると、蛍光照明レンズ１０１による投光倍率Ｍ１はＭ１＝Ｆ０／Ｆ１となり、結像レンズ１２３による投光倍率Ｍ２はＭ２＝Ｆ２／Ｆ０となる。

図１１（ａ）に示すように、蛍光の照射範囲Ｒは拡大された複数の変調画素ｐ１を含み、各変調画素ｐ１の寸法はＬ１×Ｍ１×Ｍ２である。すなわち、各変調画素ｐ１の寸法はＬ１×Ｆ２／Ｆ１である。これに対し、図１１（ｂ）に示すように、受光面１２０Ｓの各画素ｐ２の寸法はＬ２である。

蛍光の照射範囲Ｒにおいて、複数の変調画素ｐ１はＮ１個並ぶので、蛍光の照射範囲Ｒの寸法はＮ１×Ｌ１×Ｆ２／Ｆ１である。受光面１２０Ｓにおいて、複数の画素ｐ２はＮ２個並ぶので、受光面１２０Ｓの寸法はＮ２×Ｌ２である。Ｘ方向における受光面１２０Ｓの一端から蛍光の照射範囲Ｒの一端までのマージンおよびＸ方向における受光面１２０Ｓの他端から蛍光の照射範囲Ｒの他端までのマージンをそれぞれΔとする。この場合、マージンΔはΔ＝（Ｎ１×Ｌ１×Ｆ２／Ｆ１−Ｎ２×Ｌ２）／２により与えられる。

光学系の配置のずれのため、測定対象物Ｓへの測定光がＺ軸に対して傾いた角度で対物レンズ１６１に入射する場合、または測定対象物Ｓからの蛍光がＺ軸に対して傾いた角度で受光部１２０に入射する場合、受光面１２０Ｓに対して蛍光の照射範囲ＲがＸ方向またはＹ方向にずれる。この場合でも、受光面１２０Ｓの全てに蛍光の大部分が照射されるように光学系が構成される。

図１２は、受光部１２０の模式的拡大図である。図１２の例においては、測定対象物Ｓからの蛍光がＺ軸に対して角度φだけ傾いている。この場合、受光面１２０Ｓ上のＸ方向における蛍光の照射位置のずれδは、δ＝Ｆ２×ｓｉｎφにより与えられる。

本例においては、フィルタキューブ１５１におけるフレーム１５１ａへのダイクロイックミラー１５１ｃの取り付けの個体差として、４分のずれが発生し得る。また、フィルタキューブ１５１のフィルタターレット１５２への取り付けの再現性として、３分のずれが発生し得る。さらに、フィルタターレット１５２の回転によるフィルタキューブ１５１の切り替えの再現性として、３分のずれが発生し得る。

図３に示すように、光変調素子１１２から測定対象物Ｓへの光軸は、フィルタキューブ１５１においてダイクロイックミラー１５１ｃにより９０°折り曲げられる。この場合、測定対象物Ｓへの測定光のＺ軸に対する傾きは、設置されたダイクロイックミラー１５１ｃの角度ずれの総和の２倍になる。したがって、角度φは、上記のずれの総和の２倍になる。すなわち、角度φはφ＝２×１０分＝０．００５８ラジアン程度である。このように、角度φは微小であるため、照射位置のずれδをδ＝Ｆ２×φに近似することが可能である。

照射位置のずれδがマージンΔ以下であれば、測定対象物Ｓからの蛍光がＺ軸に対して傾いた角度で受光部１２０に入射する場合でも、受光面１２０Ｓの全てに蛍光の大部分が照射される。したがって、照射位置のずれδとマージンΔとの関係は、下記式（１）により与えられる。

一方、１つの拡大された変調画素ｐ１に重なる画素ｐ２の数が多くなり過ぎる場合、光変調素子１１２による測定光のパターンの最小の幅が大きくなることにより、測定対象物の細部を高い精度で撮像する性能（セクショニング性能）が低下する。そこで、１つの拡大された変調画素ｐ１に重なる画素ｐ２の数の上限値αを設定する。したがって、１つの拡大された変調画素ｐ１に重なる画素ｐ２の数と上限値αとの関係は、下記式（２）により与えられる。なお、本例においては、値αは例えば１以上３以下である。

式（１）および式（２）を整理することにより、下記式（３）の関係が与えられる。蛍光照明レンズ１０１の焦点距離Ｆ１が式（３）により与えられる範囲内に設定される。これにより、測定対象物Ｓへの測定光がＺ軸に対して傾いている場合、または測定対象物Ｓからの蛍光がＺ軸に対して傾いている場合でも、セクショニング性能を低下させない範囲で受光面１２０Ｓの全てに蛍光の大部分を照射することができる。その結果、画像の画質の低下および画像の部分の欠落が防止された画像データを生成することができる。

（６）効果
本実施の形態に係る顕微鏡撮像装置５００においては、投光部３２０により出射された光から光変調素子１１２によりパターン測定光または均一測定光が生成される。セクショニング観察においては、光変調素子１１２により生成されたパターン測定光が測定対象物Ｓに照射される。また、生成されたパターンの空間的な位相が光変調素子１１２により所定量ずつ測定対象物Ｓ上で順次移動される。パターンの複数の位相で生成される複数のパターン画像データに基づいてセクショニング画像データが生成される。

一方、通常観察においては、均一測定光が光変調素子１１２により生成され、測定対象物Ｓに照射される。これにより、パターンを有しない測定光が照射されたときの測定対象物Ｓの画像を示す通常画像データが生成される。

このように、光変調素子１１２を用いることにより、共通の蛍光照明レンズ１０１、フィルタキューブ１５１および対物レンズ１６１を通して測定対象物Ｓにパターン測定光および均一測定光を照射することができる。また、共通の対物レンズ１６１および結像レンズ１２３を通して測定対象物Ｓからの蛍光を受光することができる。これにより、測定対象物Ｓのセクショニング観察および通常観察を行うことができる。

ここで、光変調素子１１２は、複数の変調画素に周期的な非導光部を含む。光変調素子１１２の複数の変調画素間の非導光部からは、測定光が生成されない。したがって、セクショニング画像または通常画像には、光変調素子１１２の複数の変調画素間の非導光部に相当する影パターンが映り込む。このような場合でも、セクショニング画像データまたは通常画像データにおける光変調素子１１２の非導光部に相当する部分がフィルタ処理により除去される。これにより、画像の画質を低下させることなくセクショニング観察および通常観察を行うことが可能になる。

（７）請求項の各構成要素と実施の形態の各部との対応関係
以下、請求項の各構成要素と実施の形態の各部との対応の例について説明するが、本発明は下記の例に限定されない。

上記実施の形態においては、投光部３２０が投光部の例であり、変調画素ｐ１が第１の画素の例であり、画素ｐ２が第２の画素の例であり、光変調素子１１２が光変調素子の例であり、測定対象物Ｓが測定対象物の例である。蛍光照明レンズ１０１、結像レンズ１２３、フィルタキューブ１５１および対物レンズ１６１が投光光学系の例であり、受光部１２０が受光部の例であり、制御部２１３が制御部および処理部の例であり、操作部２５０が第１および第２の指示部の例である。画像データ生成部２１１が画像データ生成部の例であり、画像処理部２１４が画像処理部の例であり、受光面１２０Ｓが受光面の例であり、照射範囲Ｒが照射範囲の例であり、顕微鏡撮像装置５００が顕微鏡撮像装置の例である。

請求項の各構成要素として、請求項に記載されている構成または機能を有する他の種々の要素を用いることもできる。

本発明は、種々の顕微鏡撮像装置、顕微鏡撮像方法および顕微鏡撮像プログラムに有効に利用することができる。

１００ 測定部
１０１ 蛍光照明レンズ
１１０ パターン付与部
１１１ 光出力部
１１２ 光変調素子
１１３ ミラー
１２０ 受光部
１２０Ｓ 受光面
１２１ カメラ
１２２ カラーフィルタ
１２３ 結像レンズ
１３０ 透過光供給部
１３１ 透過光源
１３２ 透過光学系
１４０ ステージ
１５０ フィルタユニット
１５１ フィルタキューブ
１５１ａ フレーム
１５１ｂ 励起フィルタ
１５１ｃ ダイクロイックミラー
１５１ｄ 吸収フィルタ
１５２ フィルタターレット
１５２ａ フィルタキューブ取付部
１６０ レンズユニット
１６１ 対物レンズ
１６２ レンズターレット
１６２ａ 対物レンズ取付部
１６３ 焦点位置調整機構
１７０ 制御基板
２００ ＰＣ
２１０ ＣＰＵ
２１１ 画像データ生成部
２１２ パターン生成部
２１３ 制御部
２１４ 画像処理部
２２０ ＲＯＭ
２３０ ＲＡＭ
２４０ 記憶装置
２５０ 操作部
３００ 測定光供給部
３１０ 電源装置
３２０ 投光部
３２１ 測定光源
３２２ 減光機構
３２３ 遮光機構
３３０ 導光部材
４００ 表示部
５００ 顕微鏡撮像装置
ｐ１ 変調画素
ｐ２ 画素
Ｒ 照射範囲
Ｓ 測定対象物

Claims (15)

1. 光を出射する投光部と、
   前記投光部により出射された光から任意のパターンを有する測定光を生成するように構成された複数の第１の画素を含む光変調素子と、
   前記光変調素子により生成された測定光を測定対象物に照射する投光光学系と、
   前記測定対象物からの光を受光し、受光量を示す受光信号を出力する受光部と、
   前記受光部から出力される受光信号に基づいて画像データを生成する画像データ生成部と、
   前記画像データ生成部により生成される画像データに画像処理を行う画像処理部と、
   パターンを有する測定光を生成するとともに生成されたパターンの空間的な位相を所定量ずつ前記測定対象物上で順次移動させるように前記光変調素子を制御し、前記パターンの複数の位相で生成される複数の画像データに基づいて前記測定対象物の画像を示すセクショニング画像データを生成するように前記画像データ生成部を制御する制御部とを備え、
   前記光変調素子は、前記複数の第１の画素間に周期的な非導光部を有し、
   前記画像処理部は、前記光変調素子の非導光部の周期性に基づいて、画像データまたはセクショニング画像データにおける前記非導光部に相当する部分を除去するフィルタ処理を実行する、顕微鏡撮像装置。
2. 前記フィルタ処理を実行するか否かを指示するための第１の指示部をさらに備え、
   前記制御部は、前記第１の指示部により前記フィルタ処理の実行が指示された場合には前記フィルタ処理を実行し、前記第１の指示部により前記フィルタ処理の実行が指示されない場合には前記フィルタ処理を実行しないように前記画像処理部を制御する、請求項１記載の顕微鏡撮像装置。
3. 第１の動作モードまたは第２の動作モードを指示するための第２の指示部をさらに備え、
   前記光変調素子は、前記投光部により出射された光から任意のパターンを有する測定光およびパターンを有しない光を選択的に生成するように構成され、
   前記制御部は、
   前記第２の指示部により前記第１の動作モードが指示された場合には、パターンを有する測定光を生成するとともに生成されたパターンの空間的な位相を所定量ずつ前記測定対象物上で順次移動させるように前記光変調素子を制御し、前記パターンの複数の位相で生成される複数の画像データに基づいてセクショニング画像データを生成するように前記画像データ生成部を制御し、
   前記第２の指示部により前記第２の動作モードが指示された場合には、パターンを有しない測定光を生成するように前記光変調素子を制御し、パターンを有しない測定光が照射されたときの前記測定対象物の画像を示す通常画像データを生成するように前記画像データ生成部を制御する、請求項１または２記載の顕微鏡撮像装置。
4. 前記フィルタ処理は、空間フィルタ処理を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の顕微鏡撮像装置。
5. 前記画像処理部は、前記フィルタ処理として、波形変換処理、前記空間フィルタ処理、および前記波形変換処理の逆変換処理を順次行う、請求項４記載の顕微鏡撮像装置。
6. 前記波形変換処理は、離散フーリエ変換または離散ウェーブレット変換を含む、請求項５記載の顕微鏡撮像装置。
7. 前記空間フィルタ処理は、ぼかしフィルタ処理を含む、請求項４記載の顕微鏡撮像装置。
8. 前記ぼかしフィルタ処理は、ガウシアンフィルタ処理を含む、請求項７記載の顕微鏡撮像装置。
9. 前記光変調素子、前記受光部および前記投光光学系は、前記投光光学系の解像度が前記光変調素子の前記複数の第１の画素間の隙間の幅よりも低くなるように構成される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡撮像装置。
10. 前記光変調素子および前記受光部の一方は、前記光変調素子および前記受光部の他方に対して、前記投光光学系を介して共役関係となる位置から前記投光光学系の解像度が前記光変調素子の前記複数の第１の画素間の隙間の幅よりも低くなるまでずれた位置に配置される、請求項９記載の顕微鏡撮像装置。
11. 前記投光光学系の変調伝達関数の値は、前記光変調素子の前記複数の第１の画素間の隙間の幅に対応する空間周波数において、予め定められたしきい値以下である、請求項９または１０記載の顕微鏡撮像装置。
12. 前記受光部の受光面を含む平面上において、前記測定対象物から前記受光部への光の照射範囲が前記受光部の前記受光面を包含するように前記投光光学系が構成される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の顕微鏡撮像装置。
13. 前記受光部は、互いに交差する第１および第２の方向に並ぶ複数の第２の画素を含み、
    前記受光部の受光面を含む平面上において、前記光変調素子の各１個の第１の画素に対応する前記測定対象物から前記受光部への光の部分が、前記第１の方向に並ぶ３個の第２の画素および前記第２の方向に並ぶ３個の第２の画素を含む領域以下の領域に照射されるように前記投光光学系が構成される、請求項１２記載の顕微鏡撮像装置。
14. 投光部により光を出射するステップと、
    前記投光部により出射された光から複数の第１の画素を含む光変調素子により任意のパターンを有する測定光を生成するステップと、
    前記光変調素子により生成された測定光を投光光学系により測定対象物に照射するステップと、
    生成されたパターンの空間的な位相を前記光変調素子により所定量ずつ前記測定対象物上で順次移動させるステップと、
    受光部により前記測定対象物からの光を受光し、受光量を示す受光信号を出力するステップと、
    前記受光部から出力される受光信号に基づいて前記パターンの複数の位相で生成される複数の画像データに基づいて、前記測定対象物の画像を示すセクショニング画像データを生成するステップと、
    前記光変調素子の前記複数の第１の画素間の非導光部の周期性に基づいて、画像データまたはセクショニング画像データにおける前記非導光部に相当する部分を除去するステップとを含む、顕微鏡撮像方法。
15. 処理装置により実行可能な顕微鏡撮像プログラムであって、
    投光部により光を出射する処理と、
    前記投光部により出射された光から複数の第１の画素を含む光変調素子により任意のパターンを有する測定光を生成する処理と、
    前記光変調素子により生成された測定光を投光光学系により測定対象物に照射する処理と、
    生成されたパターンの空間的な位相を前記光変調素子により所定量ずつ前記測定対象物上で順次移動させる処理と、
    受光部により前記測定対象物からの光を受光し、受光量を示す受光信号を出力する処理と、
    前記受光部から出力される受光信号に基づいて前記パターンの複数の位相で生成される複数の画像データに基づいて、前記測定対象物の画像を示すセクショニング画像データを生成する処理と、
    前記光変調素子の前記複数の第１の画素間の非導光部の周期性に基づいて、画像データまたはセクショニング画像データにおける前記非導光部に相当する部分を除去する処理とを、
    前記処理装置に実行させる、顕微鏡撮像プログラム。

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