JP2014531910A - 再構成後の精製第viii因子の安定性を改善するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
古典的血友病又は血友病Aは遺伝性の出血性障害である。これは染色体X連鎖性血液凝固第VIII因子欠損から生じ、そして10,000人あたり1人と2人との間の発生率でほとんど男性のみに影響を及ぼす。X染色体欠損は、それら自体血友病ではない女性キャリアにより伝達される。血友病Aの臨床症状は増加した出血傾向である。第VIII因子濃縮物での処置が導入される以前は、重篤な血友病を有する人物の平均寿命は20年未満であった。血漿由来の第VIII因子濃縮物の使用は、平均寿命を広く増加させて血友病患者の状況をかなり改善し、かれらの大部分に事実上通常の生活を送る可能性を与えてきた。しかし、血漿由来濃縮物及びそれらの使用に伴う特定の問題があり、それらのうち最も深刻なものはウイルスの伝染であった。これまでに、AIDS、B型肝炎、及び非A型非B型肝炎を引き起こすウイルスがその集団に深刻な被害を与えた。それ以来、近年、様々なウイルス不活化方法及び新しい高度に精製された第VIII因子濃縮物が開発され、それにより血漿由来第VIII因子に関して非常に高い安全基準も確立されてきた。
第一の局面において、本発明は、精製、凍結乾燥及び再構成の後の第VIII因子分子の安定性を増大させるための方法に関し、この方法は、本質的にA1ドメイン及びA2ドメインを含む第一のフラグメント、並びに本質的にA3ドメイン、C1ドメイン及びC2ドメインを含む第二のフラグメントへの第VIII因子分子のタンパク質分解切断を防止することを含む。
(i)Arg1648とGlu1649との間のタンパク質分解切断部位、及びArg1313とAla1314との間のタンパク質分解切断部位が不活化されている改変第VIII因子分子をコードする核酸を提供する工程、
(ii)宿主細胞を該核酸で形質転換する工程、
(iii)形質転換された宿主細胞を、改変第VIII因子分子が発現されるような条件下で培養する工程、
(iv)宿主細胞から、又は細胞培養培地から、改変第VIII因子分子を回収する工程
を含み得る。
該単鎖第VIII因子分子のバイオアベイラビリティは、同じ用量及び同じ方法で投与される、ヒト野生型第VIII因子と比較して、又はAsn745がPro1640に融合されているBドメイン欠失ヒト第VIII因子分子と比較して、少なくとも25%増加する]又は(ii)他方では、静脈内投与、[ここで(a)該単鎖第VIII因子分子の静脈内投与後の血漿半減期は、同じ用量及び同じ方法で投与されたヒト野生型第VIII因子と比較して少なくとも40%増加するか、又は(b)単鎖第VIII因子分子は、血友病Aマウスにおいて経時的にトロンビン生成アッセイにおいて決定されたトロンビンピークレベルが、同じ用量及び同じ方法で投与されたヒト野生型第VIII因子と比較して静脈内投与後に50nMを下回るまでに、少なくとも10時間延長された期間を示す]によるものである。
本発明は、精製、凍結乾燥、及び再構成の後の第VIII因子分子の安定性を増大させるための方法に関し、この方法は、本質的にA1ドメイン及びA2ドメインを含む第一のフラグメント、及び本質的にA3ドメイン、C1ドメイン及びC2ドメインを含む第二のフラグメントへの第VIII因子分子のタンパク質分解切断を防止することを含む。
用語「血液凝固第VIII因子」、「第VIII因子」及び「FVIII」は本明細書において交換可能に使用される。成熟ヒト第VIII因子は、以下のドメイン構造で配置された2332のアミノ酸からなる:
本発明の方法は、本質的にA1ドメイン及びA2ドメインを含む第一のフラグメント並びに本質的にA3ドメイン、C1ドメイン及びC2ドメインを含む第二のフラグメントへの第VIII因子分子のタンパク質分解切断を防止することを含む。用語「タンパク質分解切断を防止すること」は、部分的にタンパク質分解切断を防止すること、及び完全にタンパク質分解切断を防止することを含む。これはさらに、実施態様「タンパク質分解切断を減少させること」を含む。換言すると、「第VIII因子分子のタンパク質分解切断を防止すること」は、宿主細胞により発現及び分泌される第VIII因子分子の実質的に100%が単鎖分子であるように完全にいずれのタンパク質分解切断も廃止すること(この実施態様は本発明の方法により包含されるが)を必要としない。通常は、第VIII因子分子のタンパク質分解切断は、宿主細胞により発現及び分泌された第VIII因子分子の少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%が単鎖分子であるような方法で防止される。切断の不完全な防止は、たとえ主な切断部位(R1313及びR1648におけるもの)が存在しなくとも、第VIII因子分子のごく一部のタンパク質分解切断をもたらし得るBドメイン内のいくつかの少数の切断部位が存在し得るという事実に少なくとも部分的に起因し得る。この少数の切断は本発明に従って防止されるかもしれないし、されないかもしれない。
− アミノ酸740がアミノ酸1650に融合され、それによりアミノ酸741〜1649が除去される;
− アミノ酸740がアミノ酸1690に融合され、それによりアミノ酸741〜1689が除去される;
− アミノ酸740がアミノ酸1669に融合され、それによりアミノ酸741〜1668が除去される;
− アミノ酸743がアミノ酸1650に融合され、それによりアミノ酸744〜1649が除去される;
− アミノ酸764がアミノ酸1650に融合され、それによりアミノ酸765〜1649が除去される;
− アミノ酸764がアミノ酸1653に融合され、それによりアミノ酸765〜1652が除去される;
− アミノ酸764がアミノ酸1656に融合され、それによりアミノ酸765〜1655が除去される;
− アミノ酸745がアミノ酸1650に融合され、それによりアミノ酸746〜1649が除去される;
− アミノ酸745がアミノ酸1653に融合され、それによりアミノ酸746〜1652が除去される;
− アミノ酸745がアミノ酸1656に融合され、それによりアミノ酸746〜1655が除去される;
− アミノ酸757がアミノ酸1650に融合され、それによりアミノ酸758〜1649が除去される;
− アミノ酸757がアミノ酸1653に融合され、それによりアミノ酸758〜1652が除去される;
− アミノ酸757がアミノ酸1656に融合され、それによりアミノ酸758〜1655が除去される;
− アミノ酸793がアミノ酸1649に融合され、それによりアミノ酸794〜1648が除去される;
− アミノ酸793がアミノ酸1690に融合され、それによりアミノ酸794〜1689が除去される;
− アミノ酸747がアミノ酸1649に融合され、それによりアミノ酸748〜1648が除去される;
− アミノ酸751がアミノ酸1649に融合され、それによりアミノ酸752〜1648が除去される;
− アミノ酸776がアミノ酸1649に融合され、それによりアミノ酸777〜1648が除去される;
− アミノ酸770がアミノ酸1667に融合され、それによりアミノ酸771〜1666が除去される。
「タンパク質分解切断を防止する」工程又は「タンパク質分解切断部位を不活化する」工程は、第VIII因子の精製、凍結乾燥及び再構成の前に行われる。「タンパク質分解切断を防止する」工程又は「タンパク質分解切断部位を不活化する」工程は、典型的には第VIII因子分子の製造の間に行われる。本発明の方法は、(宿主細胞における)第VIII因子分子の発現の間にタンパク質分解切断を防止すること、又は第VIII因子分子をコードする核酸の製造の間にArg1313及び/若しくはArg1648におけるタンパク質分解切断部位を不活化することを含み得る。
本発明に従って製造された第VIII因子分子は、全長第VIII因子と比較して、及び/又はAsn745がPro1640に融合されているBドメイン欠失第VIII因子分子(すなわち、本質的に配列番号2のアミノ酸1〜745及び1640〜2332からなるBドメイン欠失第VIII因子分子)と比較して、増強された安定性を示す。
L−ヒスチジン 25mM
NaCl 225mM
塩化カルシウム 4mM
Tween(R)80 0.03%(質量/質量)
スクロース 2%(質量/質量)
D−マンニトール 8%(質量/質量)
pH7.0。
別の実施態様において、本発明に従って安定化された第VIII因子分子は、二本鎖ヒト野生型第VIII因子と比較して、又は二本鎖ヒトBドメイン欠失第VIII因子と比較して、非静脈内注射後に改善されたバイオアベイラビリティを示す。非静脈内注射は、好ましくは皮下、経皮又は筋内注射である。最も好ましくは、非静脈内注射は皮下注射である。
別の実施態様において、本発明に従って安定化された第VIII因子分子は増加した薬物動態(PK)パラメータを示す。
別の実施態様において、本発明に従って安定化された第VIII因子分子は、血友病Aマウスにおいて経時的にトロンビン生成アッセイにおいて決定された場合に、トロンビンピークレベルがヒト野生型第VIII因子と比較して静脈内投与後に50nMを下回るまでにより長い期間を示す。この試験は、FVIIIの機能性が本発明に従う分子において安定化されるということも示す。
別の実施態様において、本発明に従って安定化された第VIII因子分子は、ヒト血漿中37℃にて4日間インキュベートされた後に一段階FVIII:Cアッセイにより決定された場合に、ヒト血漿中37℃にて4日間インキュベートされた後のヒト野生型第VIII因子と比較して、より高い活性を保持し;好ましくはここで、第VIII因子の保持された活性は、ヒト血漿中で37℃にて4日間インキュベートされた後のヒト野生型第VIII因子と比較して少なくとも10%高い。
再構成後の増大した安定性を有する本発明に従う単鎖第VIII因子構築物は、出血性障害の処置又は予防において投与され得る。
以下の第VIII因子製剤をこの実施例において使用した:
Beriate(R)、凍結乾燥ヒト凝固第VIII因子濃縮物をCSL Behring GmbHから入手した。Beriate(R)は血漿由来第VIII因子をヘテロダイマー形態で含む。
以下の第VIII因子製剤をこの実施例において使用した:
ReFacto(R)及び「scFVIII」は、CSL Behring GmbHにより提供された「scFVIII」が異なる添加剤を含有する製剤で適用されたことは異なるが、実施例1において使用されたものと同じであった。Advate(R)は、凍結乾燥形態でBaxterから購入された全長ヘテロダイマー組み換え第VIII因子製剤である。
って再構成した。「scFVIII」を、注射用水で再構成し、20mM L−ヒスチジン、280mM NaCl、3.4mM CaCl2、0.02%Tween80、0.6%スクロースを含有する組成物(pH7.0)を得た。サンプル「scFVIII 001」は100IU/mlの初期FVIII活性を有しており、サンプル「scFVIII 0006」は400IU/mlの初期FVIII活性を有していた。再構成されたFVIII生成物を25℃でインキュベートした。生成物のFVIII活性を、発色性基質アッセイ(Coamatic(R)第VIII因子、Chromogenix)により以下の時点で二重に決定した:0時間、6時間、1日、2日、4日、8日。活性値は時点0に対して正規化した。
Advate(R)、ReFacto(R)及び「scFVIII」は実施例2において使用されたものと同じであり、そして実施例2に記載されるように再構成された。
結果を表4及び図3にまとめる。
異なるFVIII製品(Advate(R)、ReFacto AF(R)及び実施例2で使用されたscFVIIIの2つのロット)を、FVIII欠乏血漿(Siemens Healthcare Diagnostics)を用いて1IU/mL FVIII:C(発色性基質アッセイにより決定された値に基づく)に希釈した。FVIIIサンプルを、37℃で様々な期間(0、0.25、1、2、4及び8日)0.05% Na−アジドの存在下でインキュベートした。各インキュベーション期間の後、FVIII:Cを一段階凝固アッセイによりPathromtin−SL(Siemens Healthcare Diagnostics)を活性化因子として使用して測定し、t=0での値に対して正規化し(% FVIII:C)、そしてインキュベーション時間に対してプロットした。示された値は2つのサンプルの平均及び標準偏差を表す(1つのサンプルのみの0.25日を除く)。
scFVIII及び全長rFVIII(Advate(R)、Baxter Healthcare)の薬物動態(PK)プロフィールを、カニクイザル(図5及び表6)及び血友病Aマウス(図6及び表7)へのそれぞれ250IU/kg及び100IU/kgの用量での単回静脈内(I.V.)注射後に決定した。試験品をAdvate(R)について表示されている活性及びscFVIIIについて発色活性(FVIII:C)に従って投薬した。血液サンプルを投薬前(サルのみ)そして血友病Aマウスにおいて投与後72時間(hrs)まで、及びカニクイザルにおいて24hrsまでの様々な時点で抜き取った。クエン酸血漿を直ちに調製し、そして発色アッセイ系(FVIII:C)(Chromogenix−Instrumentation Laboratory SpA,Milan,Italy)によるFVIII:Cの定量のために使用した。
scFVIII又は全長rFVIII(Advate(R))を250IU/kgのレベルで投薬した場合に、クエン酸−(10%体積/体積)血友病Aマウス血液を深麻酔下で異なる時点に(1〜8日)最後に集めた。リン脂質(Rossix,Moelndal,Sweden)/Pathromtin(R)SL(Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH,Marburg,Germany)(1:30)の存在下で内因性活性化後に較正トロンビノグラフィー(CAT、Thrombinoscope,Netherlands)によりTGAを行った。トロンビンピークレベルを記録した。1〜8日目からのピークトロンビンレベルの平均AUCを、線形台形規則により計算した。2つの第VIII因子製品のAUCを、時点及び処置群ごとの可変分散を用いて線形モデルにおいてAUCの差について近似F検定を使用して、トロンビンのピークレベルが50〜250nMの間の基底限界範囲を下回るまでの推定時間を得て比較した。
scFVIIIを2.5mL注射用水中で再構成した。ReFacto AF(R)及びAdvate(R)を添付文書の記載に従って再構成した。全ての試験品を等分して約−70℃で直ちに凍結させて保存した。投与前に、試験品をCSL 627について製剤化緩衝液で希釈して、信頼性のある投与を確実にする最小実用体積を得た。
Claims (23)
- 精製、凍結乾燥及び再構成の後の第VIII因子分子の安定性を増大させるための方法であって、第VIII因子分子の製造全体を通して、本質的にA1ドメイン及びA2ドメインを含む第一のフラグメント並びに本質的にA3ドメイン、C1ドメイン及びC2ドメインを含む第二のフラグメントへの第VIII因子分子のタンパク質分解切断を防止することを含む、上記方法。
- Arg1648とGlu1649との間のタンパク質分解切断部位、及びFVIII分子中に存在する場合はArg1313とAla1314との間のタンパク質分解切断部位を不活化することを含む、請求項1に記載の方法。
- 不活化工程が、少なくともArg1648を第VIII因子配列から除去することを含む、請求項2に記載の方法。
- 不活化工程が、少なくともArg1313〜Arg1648のアミノ酸配列を第VIII因子配列から除去することを含む、請求項3に記載の方法。
- 第VIII因子配列の位置741〜1647におけるアミノ酸から選択される第一のアミノ酸が、第VIII因子配列の位置1649〜1690におけるアミノ酸から選択される第二のアミノ酸と融合され、それによりArg1648とGlu1649との間のタンパク質分解切断部位、及びFVIII分子中に存在する場合はArg1313とAla1314との間のタンパク質分解切断部位が不活化される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 除去されたアミノ酸が、1〜50アミノ酸長を有するペプチドスペーサーで置き換えられる、請求項3〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 不活化工程が、Arg1648、及び第VIII因子分子中に存在する場合はArg1313を異なるアミノ酸と置き換えることを含む、請求項2に記載の方法。
- 水溶液での再構成及び7日間25℃での貯蔵後の、第VIII因子分子の活性の損失が15%未満である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 水溶液での再構成後の第VIII因子のインビトロ安定性が、前記切断部位の不活化により増大する、請求項2〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 同じ用量及び同じ方法で投与された、ヒト野生型第VIII因子と比較して、又はAsn745がPro1640に融合されているBドメイン欠失ヒト第VIII因子分子と比較して、第VIII因子が非静脈内注射後に改善されたバイオアベイラビリティを示し;好ましくは非静脈内注射後のバイオアベイラビリティが、同じ用量及び同じ方法で投与された、ヒト野生型第VIII因子と比較して、又はAsn745がPro1640に融合されているBドメイン欠失ヒト第VIII因子分子と比較して、少なくとも25%増加する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非静脈内注射が、皮下、経皮又は筋内注射である、請求項10に記載の方法。
- (i)第VIII因子が、ヒト野生型第VIII因子と比較して、静脈内投与後に改善された血漿半減期を示し;好ましくは該血漿半減期は、ヒト野生型第VIII因子と比較して少なくとも40%改善され、
又は
(ii)第VIII因子が、血友病Aマウスにおいて経時的にトロンビン生成アッセイにおいて決定された場合に、ヒト野生型第VIII因子と比較して、トロンビンピークレベルが静脈内投与後に50nMを下回るまでにより長い期間を示し;好ましくは、この期間はヒト野生型第VIII因子と比較して少なくとも10時間延長され、
又は
(iii)第VIII因子が、一段階FVIII:Cアッセイにより決定された場合に、ヒト血漿中で37℃にて4日間インキュベートされた後のヒト野生型第VIII因子と比較して、ヒト血漿中で37℃にて4日間インキュベートされた後により高い活性を保持し;好ましくは、第VIII因子の保持された活性は、ヒト血漿中で37℃にて4日間インキュベートされた後のヒト野生型第VIII因子の活性と比較して少なくとも10%高い、
請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。 - (i)Arg1648とGlu1649との間のタンパク質分解切断部位、及びArg1313とAla1314との間のタンパク質分解切断部位が不活化されている改変第VIII因子分子をコードする核酸を提供する工程、
(ii)宿主細胞を該核酸で形質転換する工程、
(iii)形質転換された宿主細胞を、改変第VIII因子分子が発現されるような条件下で培養する工程、
(iv)宿主細胞から、又は細胞培養培地から、改変第VIII因子分子を回収する工程
を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。 - ヒト野生型第VIII因子と比較して、又はAsn745がPro1640に融合されているBドメイン欠失ヒト第VIII因子分子と比較して、非静脈内投与後の第VIII因子分子のバイオアベイラビリティを改善するための方法であって、Arg1648とGlu1649との間のタンパク質分解切断部位、及びFVIII分子中に存在する場合はArg1313とAla1314との間のタンパク質分解切断部位を不活化することを含む、上記方法。
- 前記非静脈内投与が皮下、経皮又は筋内注射である、請求項14に記載の方法。
- ヒト野生型第VIII因子と比較して、静脈内投与後の第VIII因子分子の血漿半減期を改善するための方法であって、Arg1648とGlu1649との間のタンパク質分解切断部位、及びFVIII分子中に存在する場合はArg1313とAla1314との間のタンパク質分解切断部位を不活化することを含む、上記方法。
- 血友病Aマウスにおいて経時的にトロンビン生成アッセイにおいて決定された場合のトロンビンピークレベルが、ヒト野生型第VIII因子と比較して、第VIII因子分子の静脈内投与後に50nMを下回るまでの期間を延長するための方法であって、Arg1648とGlu1649との間のタンパク質分解切断部位、及びFVIII分子中に存在する場合はArg1313とAla1314との間のタンパク質分解切断部位を不活化することを含む、上記方法。
- ヒト血漿中で37℃にて4日間インキュベートされた後のヒト野生型第VIII因子と比較して、ヒト血漿中で37℃にて4日間インキュベートされた後の一段階FVIII:Cアッセイにより決定された場合に第VIII因子分子についてより高い活性を保持するための方法であって、Arg1648とGlu1649との間のタンパク質分解切断部位、及びFVIII分子中に存在する場合はArg1313とAla1314との間のタンパク質分解切断部位を不活化することを含む、上記方法。
- 第VIII因子配列の位置741〜1647におけるアミノ酸から選択される第一のアミノ酸が、第VIII因子配列の位置1649〜1690におけるアミノ酸から選択される第二のアミノ酸に融合され、それによりArg1648とGlu1649との間のタンパク質分解切断部位、及びFVIII分子中に存在する場合はArg1313とAla1314との間のタンパク質分解切断部位が不活化される、請求項14〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 出血性障害、好ましくは血友病Aの処置又は予防における使用のための、単鎖第VIII因子分子を含む医薬製剤であって、該処置又は予防が、
(i)非静脈内投与、[ここで
該単鎖第VIII因子分子のバイオアベイラビリティは、同じ用量及び同じ方法で投与される、ヒト野生型第VIII因子と比較して、又はAsn745がPro1640に融合されているBドメイン欠失ヒト第VIII因子分子と比較して、少なくとも25%増加する]
又は
(ii)静脈内投与、[ここで
(a)該単鎖第VIII因子分子の静脈内投与後の血漿半減期は、同じ用量及び同じ方法で投与されたヒト野生型第VIII因子と比較して少なくとも40%増加するか、
又は
(b)単鎖第VIII因子分子は、血友病Aマウスにおいて経時的にトロンビン生成アッセイにおいて決定されたトロンビンピークレベルが、同じ用量及び同じ方法で投与されたヒト野生型第VIII因子と比較して静脈内投与後に50nMを下回るまでに、少なくとも10時間延長された期間を示す]
によるものである、上記医薬製剤。 - 出血性障害、好ましくは血友病Aの処置又は予防における使用のための、単鎖第VIII因子分子を含む医薬製剤であって、ここで単鎖第VIII因子分子は、ヒト血漿中で37℃にて4日間インキュベートされた後のヒト野生型第VIII因子と比較して、ヒト血漿中で37℃にて4日間インキュベートされた後に、一段階FVIII:Cアッセイにより決定された場合に少なくとも10%高い活性を保持する、上記医薬製剤。
- 非静脈内投与による、出血性障害、好ましくは血友病Aの処置又は予防における使用のための、単鎖第VIII因子分子を含む医薬液剤であって、ここで同じ用量及び同じ方法で投与された、Asn745がPro1640に融合されているBドメイン欠失第VIII因子分子の用量と比較して、血液における同じ止血活性を達成するために、該FVIII分子の用量は少なくとも25%減少され得る、上記医薬液剤。
- 出血性障害を処置するための医薬製剤の再構成後の増大した安定性又はより長い貯蔵寿命を達成するための単鎖第VIII因子分子の使用であって、ここで
(i)再構成及び再構成後7日間室温での貯蔵の後の、単鎖第VIII因子分子を含む医薬製剤の第VIII因子活性は、同じ量の、Asn745がPro1640に融合されているBドメイン欠失第VIII因子分子を含む医薬製剤の第VIII因子活性と比較して少なくとも10%高いか、又は
(ii)単鎖第VIII因子分子は、ヒト血漿中で37℃にて同じ濃度で4日間インキュベートされた後のヒト野生型第VIII因子と比較して、ヒト血漿中で37℃にて4日間インキュベートされた場合に一段階FVIII:Cアッセイにより決定された場合少なくとも10%高い活性を保持する、
上記使用。
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