JP6250282B2 - 出血性障害の治療および予防的治療における非静脈内投与のためのアルブミン融合凝固因子 - Google Patents

Description

本発明は、出血性障害の治療および予防的治療における非静脈内投与のためのアルブミン融合凝固因子を含む医薬製剤、ならびに凝固因子をアルブミンに融合することによって凝固因子の非静脈内投与後の生体内回収率（ｉｎ ｖｉｖｏ ｒｅｃｏｖｅｒｙ）を増加させるための方法に関する。

数種の組換え治療用ポリペプチドが、ヒトにおける治療および予防的な用途で市販されている。患者は、一般的に、組換えの活性成分の特異的な作用機序によって利益を得るが、現在市販の凝固因子は全て静脈内投与によるものであり、それはしばしば注射部位における感染を引き起こし、また一般的には患者が避けたい（特に凝固プロセスに欠陥のある子どもの処置において）手順である。

Ｂａｌｌａｎｃｅ等（特許文献１）は、ヒト血清アルブミンに融合させると、インビボでの機能的な半減期を高め貯蔵寿命を延長すると予想される、多数の様々な治療用ポリペプチドの融合ポリペプチドを説明している。可能性のある融合パートナーの長い一覧が説明されているが、これらのポリペプチドのほとんど全てに関して、それぞれのアルブミン融合タンパク質が実際に生物活性を保持し、改善された特性を有するという実験データを示していない。実施例として示されている治療用ポリペプチドの一覧のなかでも特に、第ＩＸ因子、および、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａが挙げられている。また、アルブミンとＦＩＸまたはＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａとの間にペプチドリンカーが存在するＦＩＸおよびＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａの融合体も説明されている。しかしながら、アルブミン融合が、各凝固因子が非静脈的に投与される場合に治療上の処置を向上し得ることは開示されていない。

第ＶＩＩ因子および第ＶＩＩａ因子
ＦＶＩＩは、５０ｋＤａの分子量を有する単鎖糖タンパク質であり、これは、肝細胞によって、４０６個のアミノ酸からなる不活性な酵素原として血流に分泌される。ＦＶＩＩは、Ａｒｇ１５２〜Ｉｌｅ１５３における単一のペプチド結合のタンパク質分解によってその活性型である第ＶＩＩａ因子に変換され、それにより、２種のポリペプチド鎖、Ｎ末端軽鎖（２４ｋＤａ）、および、Ｃ末端重鎖（２８ｋＤａ）の形成が起こるが、これらは、１個のジスルフィド架橋によって結合される。その他のビタミンＫ依存性凝固因子とは異なり、活性化ペプチドは、活性化中に切断されない。第ＶＩＩ因子の活性化による切断は、インビトロにおいて、例えば、第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、第７因子活性化プロテアーゼ（ＦＳＡＰ）、および、トロンビンによって達成できる。非特許文献１は、いくつかの切断は、Ａｒｇ２９０および／またはＡｒｇ３１５で重鎖でも起こることを報告している。

第ＶＩＩ因子は、血漿中に５００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。活性化された第ＶＩＩａ因子としては、約１％または５ｎｇ／ｍｌの第ＶＩＩ因子が存在する。第ＶＩＩ因子の末梢血漿における半減期は、約４時間であり、第ＶＩＩａ因子の末梢血漿における半減期は約２時間であることがわかっている。

超生理学的な濃度の第ＶＩＩａ因子を投与することによって、第ＶＩＩＩａ因子および第ＩＸａ因子への必要性が回避され止血を達成することができる。第ＶＩＩ因子に関するｃＤＮＡのクローニング（特許文献２）は、活性化された第ＶＩＩ因子を製薬として開発することを可能にしている。第ＶＩＩａ因子の投与は、１９８８年に初めて成功している。その後継続的に、第ＶＩＩａ因子に関する指標の数が徐々に増えてきており、これは、第ＶＩＩａ因子が出血を止めることができる万能な止血剤になる可能性を示している（非特許文献２）。しかしながら、約２時間という第ＶＩＩａ因子の短い末梢における半減期、および、インビボでの低い回収は、その適用を制限している。

ヒトＦＩＸ
ヒトＦＩＸは、ビタミンＫ依存性ポリペプチド群の１メンバーとして、５７ｋＤａの分子量を有する単鎖糖タンパク質であり、これは、肝細胞によって、４１５個のアミノ酸からなる不活性な酵素原として血流に分泌される。これは、ポリペプチドのＮ末端のＧｌａ−ドメインに局在している１２個のγ−カルボキシ−グルタミン酸残基を含む。Ｇｌａ残基は、それらの生合成のためにビタミンＫを必要とする。Ｇｌａドメインに続いて、２種の上皮増殖因子ドメイン、活性化ペプチド、および、トリプシン型セリンプロテアーゼドメインがある。ＦＩＸのさらなる翻訳後修飾としては、水酸化（Ａｓｐ６４）、Ｎ−（Ａｓｎ１５７およびＡｓｎ１６７）、加えてＯ型の糖付加（Ｓｅｒ５３、Ｓｅｒ６１、Ｔｈｒ１５９、Ｔｈｒ１６９、および、Ｔｈｒ１７２）、硫酸化（Ｔｙｒ１５５）、および、リン酸化（Ｓｅｒ１５８）が挙げられる。

ＦＩＸは、Ａｒｇ１４５〜Ａｌａ１４６、および、Ａｒｇ１８０〜Ｖａｌ１８１での活性化ペプチドのタンパク質分解によってその活性型である第ＩＸａ因子に変換され、それにより、２種のポリペプチド鎖、Ｎ末端軽鎖（１８ｋＤａ）、および、Ｃ末端重鎖（２８ｋＤａ）の形成が起こるが、これらは、１個のジスルフィド架橋によって結合される。第ＩＸ因子の活性化による切断は、インビトロで、例えば第ＸＩａ因子、または、第ＶＩＩａ因子／ＴＦによって達成できる。第ＩＸ因子は、ヒト血漿中に５〜１０μｇ／ｍｌの濃度で存在する。ヒトにおける第ＩＸ因子の末梢血漿における半減期は、約１５〜１８時間であることが見出された（非特許文献３；非特許文献４）。

血友病Ｂは、第ＩＸ因子が機能しないか、または、失われることによって引き起こされるものであり、これは、血漿由来の第ＩＸ因子の濃縮物、または、第ＩＸ因子の組換え型で治療される。血友病Ｂ患者は、自然出血を回避するために第ＩＸ因子の予防的な投与を少なくとも２週に１度受けることが多いため、適用された第ＩＸ因子製品の半減期を長くすることによって投与間のインターバルを長くすることが望ましく、第ＩＸ因子の静脈内投与を避けることが望ましい。

第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）
ＦＶＩＩＩは、哺乳動物の肝臓で産生される約２６０ｋＤａ分子質量の血漿糖タンパク質である。これは血液凝固をもたらす凝固反応のカスケードの必須成分である。このカスケード内には、第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）が、ＦＶＩＩＩと連動して第Ｘ因子（ＦＸ）を活性型のＦＸａに変換するステップがある。ＦＶＩＩＩはこのステップの補因子として作用し、ＦＩＸａの活性にはカルシウムイオン及びリン脂質が必須である。最も一般的な血友病性疾患は、機能的ＦＶＩＩＩの欠乏によって引き起こされ、血友病Ａと呼ばれる。

血友病Ａの処置の重要な進歩は、ヒトＦＶＩＩＩの完全な２，３５１アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡクローンの単離であり（特許文献３）、並びにヒトＦＶＩＩＩ遺伝子ＤＮＡ配列及びその生産のための組み換え法の提供であった。

クローン化ｃＤＮＡから決定されたヒトＦＶＩＩＩの推定一次アミノ酸配列分析の結果は、それが大きな前駆体ポリペプチドからプロセシングされたヘテロダイマーであることを示す。このヘテロダイマーは、約２１０ｋＤａのＮ末端重鎖フラグメントと金属イオン依存的に会合した約８０ｋＤａのＣ末端軽鎖から成る（非特許文献５の総説を参照）。ヘテロダイマーの生理的活性化は、トロンビンによるタンパク質鎖のタンパク質分解的切断を介して起こる。トロンビンは、重鎖を９０ｋＤａタンパク質に切断し、次いで５４ｋＤａ及び４４ｋＤａフラグメントに切断する。トロンビンは、また、８０ｋＤａ軽鎖を７２ｋＤａタンパク質に切断する。それは、後者のタンパク質でありそしてカルシウムイオンにより一緒に保持される、活性ＦＶＩＩＩを構成する２つの重鎖フラグメント（上記５４ｋＤａ及び４４ｋＤａ）である。不活性化は、７２ｋＤａ及び５４ｋＤａタンパク質が、トロンビン、活性化プロテインＣ又はＦＸａによって更に切断される場合に起こる。血漿中では、このＦＶＩＩＩ複合体は、上述のようにＦＶＩＩＩのタンパク質分解的破壊を阻害するように見える、５０倍過剰のＶＷＦタンパク質（「ＶＷＦ」）と結びつくことにより安定化される。

ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列は、３つの構造ドメイン：３３０アミノ酸の三重Ａドメイン、９８０アミノ酸の単一Ｂドメイン、及び１５０アミノ酸の二重Ｃドメインで構成されている。Ｂドメインは他のタンパク質と相同性を有さず、そして本タンパク質の２５の可能性あるアスパラギン（Ｎ）結合グリコシル化部位のうち１８を与える。Ｂドメインは明らかに凝固における機能はなく、そして尚凝固促進活性を有するＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ分子で欠失され得る。

フォン・ウィルブラント因子 （ｖＷＦ）
ＶＷＦは、哺乳動物の血漿に存在する多量体接着性糖タンパク質であり、多様な生理機能を有する。一次止血中、ＶＷＦは血小板表面の特異的受容体及びコラーゲンなどの細胞外マトリックス成分間のメディエータとして作用する。更に、ＶＷＦは、凝固促進ＦＶＩＩＩの担体及び安定化タンパク質としての機能を果たす。ＶＷＦは、内皮細胞及び巨核球内で２８１３アミノ酸前駆体分子として合成される。その前駆体ポリペプチドのプレ−プロ−ＶＷＦは、成熟血漿ＶＷＦに認められる２２残基シグナルペプチド、７４１残基プロペプチド及び２，０５０残基ポリペプチドから成る（非特許文献６）。血漿中に分泌されると、ＶＷＦは種々の分子サイズを有する多様な種の形態で循環する。これらのＶＷＦ分子は、２，０５０アミノ酸残基の成熟サブユニットのオリゴマー及びマルチマーから成る。ＶＷＦは、通常、１つのダイマーから５０〜１００個のダイマーから成るマルチマーまでの形態として血漿中に認めることができる（非特許文献７）。ヒト循環系におけるヒトＶＷＦのインビボ半減期は、おおよそ１２〜２０時間である。

ヒトの最も高頻度の遺伝性出血性疾患はフォンビルブラント病（ＶＷＤ）であり、これは血漿又は組み換え起源のＶＷＦを含有する濃縮液を用いる代償療法によって処置し得る。

ＶＷＦは、例えば特許文献３に記載のようにヒト血漿から調製することができる。特許文献４は、組み換えＶＷＦを分離する方法を記載している。

ＶＷＦはインビボでＦＶＩＩＩを安定化することが知られ、従って、血漿レベルのＦＶＩＩＩを調節する重要な役割を担い、そしてその結果として、一次及び二次止血を調節する主要因子となる。また、ＶＷＦ含有薬物製剤をＶＷＤ患者へ静脈内投与した後、２４時間で内因性ＦＶＩＩＩ：Ｃが１〜３単位／ｍｌ増加することを観察することができ、ＦＶＩＩＩに対するＶＷＦのインビボ安定化効果を示すことが知られている。

今日まで、血友病Ａ及びＶＷＤの標準治療は、ＦＶＩＩＩ及びＶＷＦ濃縮物の製剤の頻回静脈内注射を含む。血友病Ｂの治療は、第ＩＸ因子の隔週投与を必要とし、ＦＶＩＩａのインヒビター保有患者の治療においては、出血を避けるために１週間あたりＦＶＩＩａを複数回投与する必要がある。

これらの代償療法は、一般的に、例えば予防的処置を受ける重度血友病Ａの患者に有効であるが、第ＶＩＩＩ因子は、約１２時間の第ＶＩＩＩ因子の短い血漿内半減期のために、週当たり約３回静脈内投与（ｉ．ｖ．）する必要がある。健常非血友病患者のＦＶＩＩＩ活性の１％を超えるレベルに、例えば０．０１Ｕ／ｍｌずつのＦＶＩＩＩのレベル上昇により既に到達している場合、重度血友病Ａは中等度血友病Ａに変わる。予防的処置では、投与計画は、ＦＶＩＩＩのトラフレベルが、健常非血友病患者のＦＶＩＩＩ活性の２〜３％レベルを下回らないように設計される。

静脈内投与による凝固因子の投与は疼痛を伴って扱いにくく、そして特に投与が主に血友病Ａと診断された患者自身又は小児の親による在宅処置で行われるために、感染のリスクを伴う。加えて、頻回ｉ．ｖ．注射は必然的に瘢痕形成をもたらし、以後の注入を妨げる。重度血友病の予防的処置は、若年、しばしば２歳未満の小児で開始されることから、そのような小さな患者の静脈に週当り３回ＦＶＩＩＩを注射することは、尚更困難である。限られた期間、ポートシステムの移植は代替法を提供し得る。反復性感染症が発生し、そしてポートが運動時に不便を引き起こす可能性があるという事実にもかかわらず、それらはそれでも一般的に静脈内注射に比べて好ましいと考えられている。

従って、凝固因子を静脈内に注入する必要を避ける、大きな医療上の必要性が存在する。

ＷＯ０１／７９２７１ 米国特許第４，７８４，９５０号 米国特許第４７５７００６号 欧州特許第０５５０３９９１号 欧州特許第０７８４６３２号

Ｍｏｌｌｅｒｕｐ等．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９９５）４８：５０１〜５０５） Ｅｒｈａｒｄｔｓｅｎ，２００２ Ｗｈｉｔｅ ＧＣ等．１９９７．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．７８：２６１〜２６５ Ｅｗｅｎｓｔｅｉｎ ＢＭ等．２００２．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｌａｓｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｆ ＩＸ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ ｉｎ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｔｒｅａｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｏｄｅｒａｔｅ ｏｒ ｓｅｖｅｒｅ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ４２：１９０〜１９７ Ｋａｕｆｍａｎ， Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄ．Ｒｅｖｓ．６：２３５（１９９２）） Ｆｉｓｃｈｅｒ等，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５１：３４５−３４８，１９９４ Ｒｕｇｇｅｒｉ等．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２：５７６−５８４，１９９９

本発明は、出血性障害の治療および予防的治療における非静脈内投与のための、アルブミン融合凝固因子を含む医薬製剤、ならびに凝固因子をアルブミンに融合することによって凝固因子の非静脈内投与後の生体内回収率を増加させるための方法に関する。

好ましい凝固因子は、ビタミンＫ依存性凝固因子、ならびに、それらのフラグメントおよび変異体である。さらにより好ましくは、ＦＶＩＩａおよびＦＩＸ、ならびに、それらのフラグメントおよび変異体である。以下に限定されないが、アルブミン融合ＦＶＩＩＩおよびｖＷＦ、フィブリノゲン、第ＩＩ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、トロンビン、プロトロンビンおよびプロテインＣもまた好ましい。

好ましくは、アルブミン融合凝固因子を含む製剤は、皮下投与される。しかしながら、非静脈内投与の他の全ての様式が包含される（例えば筋肉内または経皮投与）。

この凝固因子は、ペプチドリンカーを介してアルブミンに融合し得、本発明の特定の実施態様においてプロテアーゼにより切断可能であり得る。

本発明の要点は、ビタミンＫ依存性ポリペプチド第ＶＩＩ因子、およびアルブミンによって具体的に実証される。本発明はまた、他の凝固因子に関する。本発明はまた、アルブミン融合凝固因子をコードするｃＤＮＡ配列に関する。この各凝固因子をコードするｃＤＮＡは、ヒト血清アルブミンをコードするｃＤＮＡ配列に遺伝学的に融合しており、プロテアーゼによって切断可能な介在するペプチドリンカーをコードするオリゴヌクレオチドで連結されている。本発明はまた、非静脈内投与のための、このような融合ｃＤＮＡ配列を含む組み換え発現ベクターの使用にも関する。これは、例えば、アルブミン融合凝固因子をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターの筋肉内注射による遺伝子治療であり得る。

発明の詳細な説明
「アルブミン融合凝固因子」は、本発明において、ヒトアルブミンと凝固因子との遺伝上の融合を意味し、得られた融合ポリペプチドの血漿内半減期は、同じであるが融合していない凝固因子と比較して増加しており、かつ非静脈内投与後の生体内回収率は、同じであるが融合していない凝固因子の非静脈内投与後の生体内回収率と比較して増加している。

本発明の好ましい実施態様は、非静脈内投与後の生体内回収率が、同じであるが融合していない凝固因子と比較して少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは５０％以上、より好ましくは１００％以上、およびさらにより好ましくは２００％以上増加している、アルブミン融合凝固因子である。

「非静脈内投与後の生体内回収率」は、非静脈内投与後の血漿において見出され得る生物学的に活性な凝固因子の量を意味する。

この非静脈内投与後の生体内回収率は、例えば当該分野で周知である、各凝固因子の生物活性を測定するための分析的な凝固関連アッセイによって、「曲線下面積」または「血漿ピーク濃度」として測定され得る。「生体内回収率」は、本発明の意味において、製品投与の直後に血液または血漿中に見出される製品の量を意味する。従って、生体内回収率を検出するためには、一般的に、製品投与の（例えば、１５分、または６０分、または２時間または４時間または８時間または１２時間または２０時間）後の血漿の含量が決定される。

「凝固関連の分析」は、本発明の意味において、凝固プロセスに関連する酵素活性または補因子活性を決定するあらゆる分析か、または、固有の、または、固有でない凝固カスケードのいずれかが活性化されているのかを決定することができるあらゆる分析のことである。従って「凝固関連の」分析は、直接的な凝固分析でもよく、例えば、ａＰＴＴ、ＰＴ、または、トロンビン生成分析が挙げられる。しかしながら、例えば、特定の凝固因子に適用される発色分析のようなその他の分析も含まれる。このような分析または対応する試薬の例としては、パトロムチン（Ｐａｔｈｒｏｍｔｉｎ（登録商標））ＳＬ（ａＰＴＴ分析，デイド・ベーリング（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ））、または、対応する凝固因子が欠乏した血漿（デイド・ベーリング）と共に、トロンボレル（Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ（登録商標））Ｓ（プロトロンビン時間の分析，デイド・ベーリング）、例えば凝固因子が欠乏した血漿を用いたトロンビン生成分析キット（テクノクローン（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ），トロンビンスコープ（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ））、発色分析、例えばバイオフェン（Ｂｉｏｐｈｅｎ）の第ＩＸ因子（ハイフェン・バイオメド（Ｈｙｐｈｅｎ ＢｉｏＭｅｄ））、スタクロット（Ｓｔａｃｌｏｔ（登録商標））ＦＶＩＩａ−ｒＴＦ（ロシュ・ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ））、コーテスト（Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標））第ＶＩＩＩ因子：Ｃ／４（クロモジェニックス（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ））、または、その他のものが挙げられる。

生物活性凝固因子を測定するための代替としてはまた、各凝固因子の抗原の量が測定され得る。抗原レベルは、好ましくはＥＬＩＳＡテストのような技術によって測定される。

本発明の意味での「凝固因子」は、一次止血または二次止血に寄与し得る任意のポリペプチドである。「凝固因子」は、これらに限定されないが、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、フォン−ウィルブラント因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、第Ｉ因子、第ＩＩ因子（プロトロンビン）、プロテインＣ、プロテインＳ、ＧＡＳ６、または、プロテインＺ、加えてそれらの活性型からなるポリペプチドが挙げられる。さらに、有用な凝固因子は、野生型ポリペプチドである場合もあり、または、突然変異を含むもの場合もある。糖付加またはその他の翻訳後修飾の程度および位置は、選択された宿主細胞、および、宿主細胞の環境の性質に応じて様々であってよい。特定のアミノ酸配列に言及される場合、このような配列の翻訳後修飾は、本願に包含される。

アルブミン
本明細書で用いられる「アルブミン」は、アルブミンポリペプチド若しくはアミノ酸配列、又はアルブミンの１つ若しくはそれ以上の機能的活性（例えば、生物活性）を有するアルブミンのフラグメント若しくは変異体を集合的に称する。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミン又はそのフラグメント、特に本明細書で配列番号１に示したようなヒトアルブミンの成熟形態若しくは他の脊椎動物由来アルブミン又はそのフラグメント、これらの分子の類似体若しくは変異体又はそれらのフラグメントを称する。

アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、上記したＨＡの配列の全長を含んでよく、又は治療的な活性を安定化又は延長することのできる、１つ若しくはそれ以上のフラグメントを含んでもよい。このようなフラグメントは、１０以上のアミノ酸長であるか、ＨＡ配列由来の約１５、２０、２５、３０、５０かそれ以上の連続したアミノ酸を含むか、又はＨＡの特異ドメインの一部若しくは全てを含んでよい。

本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は正常ＨＡ（天然または人工のいずれか）の変異体であってもよい。本発明の融合タンパク質の治療ポリペプチド部分も、また、本明細書に記載されるように対応する治療用ポリペプチドの変異体であってもよい。用語「変異体」は、保存的かまたは非保存的か、天然化または人工化を問わず、挿入、欠失及び置換を含み、この場合、そのような変更は、実質的に治療用ポリペプチドの治療活性を与える活性部位又は活性ドメインを変化させない。

特に、本発明のアルブミン融合タンパク質は、ヒトアルブミン及びヒトアルブミンのフラグメントの天然に存在する多型変異体を含んでよい。このアルブミンは何れの脊椎動物、特に何れの哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ヒツジ又はブタから由来したものでもよい。非哺乳動物アルブミンとしてはニワトリ及びサケ由来のものが挙げられるが、それらに限定されない。アルブミンが連結したポリペプチドのアルブミン部分は、治療用ポリペプチド部分とは別の動物に由来するものでもよい。

一般的に言えることは、アルブミンのフラグメント又は変異体は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも４０、最も好ましくは７０以上のアミノ酸長になる。アルブミンの変異体は、好ましくは、少なくともアルブミンの全ドメイン又は該ドメインのフラグメント、例えば、ドメイン１（配列番号１のアミノ酸１〜１９４）、２（配列番号１のアミノ酸１９５〜３８７）、３（配列番号１のアミノ酸３８８〜５８５）、１＋２（配列番号１のアミノ酸１〜３８７）、２＋３（配列番号１のアミノ酸１９５〜５８５）、又は１＋３（配列番号１のアミノ酸１〜１９４＋配列番号１のアミノ酸３８８〜５８５）から成るか、又は代わりにそれらを含むことができる。各ドメインは、それ自体、リジン１０６からグルタミン酸１１９、グルタミン酸２９２からバリン３１５及びグルタミン酸４９２からアラニン５１１の残基を含む、柔軟性のサブドメイン間リンカー領域を伴う、２つの相同的サブドメイン、即ち１〜１０５、１２０〜１９４、１９５〜２９１、３１６〜３８７、３８８〜４９１及び５１２〜５８５から出来ている。

本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、ＨＡの少なくとも１つのサブドメイン若しくはドメイン、又はその保存的修飾を含んでよい。治療用融合タンパク質の血漿内半減期が、融合していない凝固因子と比較して少なくとも２５％延長されるのであれば、あらゆるアルブミンのフラグメントおよび変異体が凝固因子の融合パートナーとして本発明に包含される。

本願で用いられる「アルブミン融合凝固因子」は、それぞれの凝固因子の非活性型および活性型を含むポリペプチドを意味する。本発明において用いられる場合の「アルブミン融合凝固因子」は、天然の凝固因子およびアルブミンそれぞれのアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。またわずかに改変されたアミノ酸配列（例えばＮ末端にアミノ酸欠失または付加を含む改変されたＮ末端）を有するタンパク質も含み、ただしこのようなタンパク質が、実質的に各凝固因子の生物活性を保持する場合である。「アルブミン融合凝固因子」はまた、上記の定義において、個体ごとに存在し、発生する可能性がある天然の対立遺伝子変異も含む。「アルブミン融合凝固因子」はさらに、上記の定義において、各凝固因子およびアルブミンの変異体を含む。このような変異体は、１個またはそれ以上のアミノ酸残基に関して野生型の配列とは異なる。このような差異の例としては、Ｎおよび／もしくはＣ末端における１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基（例えば１〜１０個のアミノ酸残基）のトランケーション、またはＮおよび／もしくはＣ末端における１個もしくはそれ以上の追加の残基の付加、例えばＮ末端におけるメチオニン残基の付加、加えて保存的アミノ酸置換、すなわち類似の特徴を持ったアミノ酸のグループ、例えば（１）小さいアミノ酸、（２）酸性アミノ酸、（３）極性アミノ酸、（４）塩基性アミノ酸、（５）疎水性アミノ酸、（６）芳香族アミノ酸の中で行われる置換が挙げられる。以下の表に、このような保存的置換の例を示す。

本発明の融合タンパク質のインビボでの半減期は、通常は末梢における半減期またはβ半減期として決定され、これらは一般的に、融合していないポリペプチドのインビボでの半減期よりも少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、および、より好ましくは１００％よりも長い。

好ましい実施態様において、リンカー領域は、発現された融合タンパク質の新抗原性の特性（ヒトタンパク質中には存在しない治療用抗原に含まれるペプチドが出現することによって、潜在的に免疫原性の新規のエピトープが形成されること）の危険が低減される、投与しようとする凝固因子またはそれらの変異体の配列を含む。さらにこの凝固因子が酵素原である（例えば、タンパク質分解による活性化を必要とする）ような場合においても、ペプチドリンカー切断の速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）は、酵素原の凝固に関連する活性化の速度をよりいっそう密接に反映すると予想される。従って、このような好ましい実施態様において、酵素原およびそれに相当するリンカーが活性化され、それぞれ匹敵する速度で切断される。この理由のために、本発明はまた、具体的には、酵素原とアルブミンとの融合タンパク質にも関する。

さらなる実施態様において、リンカーペプチドは、１種より多くのプロテアーゼのための切断部位を含む。これは、異なるプロテアーゼでも同じ位置で切断することができるリンカーペプチド、または、２種またはそれ以上の異なる切断部位を提供するリンカーペプチドのいずれかによって達成できる。これは、酵素活性を達成するために、治療用融合タンパク質をタンパク質分解的切断によって活性化しなければならない場合、および、この活性化工程に異なるプロテアーゼが寄与する可能性がある場合において有利な環境となることがある。これは、例えば、ＦＩＸが活性化されると、ＦＸＩａまたはＦＶＩＩａ／組織因子（ＴＦ）のいずれかによって達成することができる場合である。
本発明の好ましい実施態様は、リンカーがプロテアーゼによって切断され、凝固因子を活性化することができる治療用融合タンパク質であり、それによって、リンカー切断が、凝固が起こる部位における凝固因子の活性化に確実に関連付けられるようになる。

本発明に係るその他の好ましい治療用融合タンパク質は、リンカーが、治療用融合タンパク質の一部である凝固因子によって切断することができる治療用融合タンパク質であり、このような場合、このような凝固因子が一度活性化されると、融合タンパク質の切断も、凝固に関する事象と確実に関連するようになる。

本発明に係るその他の好ましい治療用融合タンパク質は、リンカーが、そのものが治療用融合タンパク質の一部である凝固因子の活性によって直接的または間接的に活性化されるプロテアーゼによって切断することができる治療用融合タンパク質であり、このような場合、融合タンパク質の切断も、凝固に関する事象と確実に関連するようになる。

最も好ましい治療用融合タンパク質の１つのクラスは、リンカーが、ＦＸＩａおよび／またはＦＶＩＩａ／ＴＦによって切断することができ、凝固因子がＦＩＸである治療用融合タンパク質である。

本発明の別の実施態様は、非静脈内投与のためのアルブミン融合凝固因子を含む、医薬組成物の使用である。投与方法は、優先的には皮下であるが、全ての血管外投与経路を包含する。上皮表面を経た投与（例えば皮膚に）も包含される。パッチ経由の投与は特に臨床的に有用である。この局所投与は、皮膚を介する取り込みを必要とするが、これは表在びらんだけでなく無傷の皮膚も完全に選ばれ、そして点眼薬及び鼻内投与を含む。上皮表面を介する投与としては吸入が含まれ、タンパク質で覆われた異常に大きい表面のために好適であり、迅速取込み及び肝臓の迂回をもたらす。上皮表面への投与としては、口腔内又は舌下に保持される剤形、即ちバッカル又は舌下剤形が含まれ、チューインガムとしてさえも可能である。口内のｐＨは相対的に中性（酸性の胃環境と対照的）なので、これはＦＶＩＩＩなどの不安定なタンパク質に対して有利である。また、腟内及び直腸投与でさえも、また、直腸から水分を抜く静脈のいくつかが直接全身循環系へ至るので考慮することができる。一般的に、これは小さな子供のように経口経路を経由して物質を取込むことができない患者に最も有用である。

皮内注射（皮膚内）はより侵襲的な投与方法であるが、介助又は経験者による実行さえない処置のために尚好適であり得る。皮内投与に続いて、皮下注射（皮膚直下）が行なわれる。一般的に取り込みは全く十分であり、そして注射部位を加温又はマッサージすることにより増加し得る。代わりに、血管収縮を起こすことができ、逆の挙動をもたらす、即ち吸着を低減するが効果を持続させることができる。

更により侵襲性の血管外投与としては、筋肉内送達（筋肉体内へ）が含まれる。これは脂肪組織を迂回することにより利点をもたらし得るが、しかし一般に皮下注射より痛みを伴い、そして特に注射で改善すべき欠乏凝固系によって特徴付けられる患者では、出血を引き起こす組織病変のリスクがある。

本発明の凝固因子は治療的有効用量で患者に投与されるが、治療的有効用量の意味するところは、所望の効果を生み出すのに十分で、耐えられない有害副反応をもたらす用量に到達することなしに、治療される病態又は適応症の重症度又は拡大を予防し又は軽減する用量である。的確な用量は、例えば適応症、製剤、投与方法のような多くの要素によって決まり、そしてそれぞれの適応症に対する前臨床及び臨床試験で決定されるべきである。

本発明の凝固因子は、血友病ＡおよびＢの家族性および後天性症例、家族性または後天性フォン−ウィルブランド病、単一の臓器や骨の損傷、または多発外傷のいずれかによる重症の出血を引き起こすあらゆるタイプの外傷（鈍的（ｂｌｕｎｔ）または穿通性）、周術期または術後の出血を含む外科手術中の出血、小児の心臓外科手術における体外循環および血液希釈を受けている患者を含む心臓外科手術に起因する出血、脳内出血、クモ膜下出血、硬膜下または硬膜外出血、罹患した患者における凝固因子レベルの低下に至らしめる、血漿以外の循環血代用液による血液損失および血液希釈に起因する出血、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）および消費性凝固障害に起因する出血、血小板機能異常、減少および凝固障害、肝硬変、肝機能不全および劇症肝不全に起因する出血、肝臓病を有する患者における肝生検、肝臓およびその他の臓器の移植後の出血、胃静脈瘤からの出血、および消化性潰瘍の出血、機能性不正子宮出血（ＤＵＢ）、早期胎盤剥離、低体重出生児における脳室内出血、分娩後出血、新生児仮死のような婦人科の出血、やけどに関連する出血、アミロイド症に関連する出血、血小板障害に関連する造血幹細胞移植、悪性疾患に関連する出血、出血性ウイルス感染、膵臓炎に関連する出血、の出血の治療のために用いられ得る。

本発明はさらに、本出願に記載されるようなアルブミン融合凝固因子をコードするポリヌクレオチドの使用に関する。用語「ポリヌクレオチド」は、未修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを一般的に指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡであり得る。本明細書において使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」はまた、１つ又はそれ以上の修飾塩基及び／又は通常でない塩基、例えばイノシンを含む、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む。様々な修飾が、当業者に公知の多くの有用な目的に役立つＤＮＡ及びＲＮＡに対してなされ得ることが認識される。用語「ポリヌクレオチド」は、それが本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチドのこのような化学的に、酵素的に又は代謝的に修飾された形態、並びに、例えば単純細胞及び複雑細胞を含む、細胞及びウイルスに特有のＤＮＡ及びＲＮＡの化学形態を包含する。

当業者は、遺伝暗号の縮重に起因して、所定のポリペプチドが、種々のポリヌクレオチドによってコードされ得ることを理解する。これらの「変異体」は、本発明によって包含される。

好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、精製されたポリヌクレオチドである。用語「精製された」ポリヌクレオチドは、他の核酸配列、例えばこれらに限定されないが、他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡを実質的に含まないポリヌクレオチドを指す。精製されたポリヌクレオチドは、宿主細胞から精製され得る。当業者に公知の従来の核酸精製方法が、精製されたポリヌクレオチドを得るために使用され得る。前記用語はまた、組換えポリヌクレオチド及び化学合成されたポリヌクレオチドを含む。

本発明のさらに別の局面は、本発明に従うポリヌクレオチドを含むプラスミド又はベクターである。好ましくは、プラスミド又はベクターは発現ベクターである。特定の実施態様において、ベクターは、ヒト遺伝子治療における使用のための導入ベクターである。

グリコシル化またはその他の翻訳後修飾の程度および位置は、選択された宿主細胞、および宿主細胞の環境の性質に応じて様々であってよい。特定のアミノ酸配列について述べる場合、このような配列の翻訳後修飾も本願に包含される。

用語「組み換え」とは、例えば、変異体が遺伝子工学技術により宿主生物中に生産されることを意味する。本発明のＦＶＩＩＩ又はＶＷＦ変異体は、通常は組み換え変異体である。

提唱される変異体の発現：
適切な宿主細胞中での組換えタンパク質を高レベルで生産するには、上述の改変されたｃＤＮＡを、組換え発現ベクター中で適切な調節因子と共に効率的な転写単位に構築することが必要であり、このようなベクターは、当業者によく知られている方法に従って様々な発現系で増殖させることが可能である。効率的な転写調節因子の要素は、ウイルスを有する動物細胞（それらの天然の宿主として）から誘導してもよいし、または、動物細胞の染色体ＤＮＡから誘導してもよい。好ましくは、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、もしくはラウス肉腫ウイルスのロングターミナルリピートから誘導されたプロモーター−エンハンサーの組み合わせを用いてもよいし、またはベータ−アクチンもしくはＧＲＰ７８のような動物細胞中で強く構成的に転写された遺伝子を含むプロモーター−エンハンサーの組み合わせを用いてもよい。ｃＤＮＡからの安定な高レベルのｍＲＮＡの転写を達成するために、転写単位は、その３’近位の部分に、転写終結ポリアデニル化配列をコードするＤＮＡ領域を含むはずである。好ましくは、この配列は、シミアンウイルス４０初期転写領域、ウサギベータ−グロビン遺伝子、またはヒト組織プラスミノゲン活性化因子の遺伝子から誘導される。

その後このｃＤＮＡは、本発明のアルブミン融合凝固因子を発現させるのに適した宿主細胞系のゲノムに組み込まれる。好ましくは、この細胞系は、確実に正しいフォールディング、Ｇｌａ−ドメイン合成、ジスルフィド結合形成、アスパラギン結合型糖付加、Ｏ−結合型グリコシル化、およびその他の翻訳後修飾、加えて培地への分泌を達成するために、脊椎動物起源の動物細胞系であり得る。その他の翻訳後修飾の例は、新しく生じたポリペプチド鎖の水酸化、およびタンパク質分解によるプロセシングである。用いることができる細胞系の例は、サルＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、ハムスターＢＨＫ２１細胞、ヒト胎児腎臓２９３細胞、およびハムスターＣＨＯ細胞である。

対応するｃＤＮＡをコードする組換え発現ベクターは、多種多様な方法で動物細胞系に導入することができる。例えば、組換え発現ベクターは、様々な動物ウイルスをベースとしたベクターから作製することができる。その例は、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、および好ましくは、ウシパピローマウイルスベースとしたベクターである。

また対応するＤＮＡをコードする転写単位は、細胞中で優勢な選択マーカーとして機能する可能性がある別の組換え遺伝子と共に動物細胞に導入することもでき、これは、組換えＤＮＡがそれらのゲノムに統合された特定の細胞クローンの単離を容易にするためである。このタイプの優勢な選択マーカー遺伝子の例は、Ｔｎ５アミノ配糖体ホスホトランスフェラーゼ（ゲネチシン（Ｇ４１８）耐性を付与する）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ハイグロマイシン耐性を付与する）、およびピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ピューロマイシン耐性を付与する）である。このような選択マーカーをコードする組換え発現ベクターは、望ましいタンパク質のｃＤＮＡをコードするものと同じベクターに存在していてもよいし、または別のベクターにコードされていてもよく、後者の場合、これらベクターは同時に導入されて宿主細胞のゲノムに統合され、異なる転写単位間に固い物理的な連結が生じることが多い。

望ましいタンパク質のｃＤＮＡと共に用いることができるその他のタイプの選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）をコードする様々な転写単位をベースとするものである。このタイプの遺伝子を内因性ｄｈｆｒ活性が欠失した細胞、優先的にはＣＨＯ細胞（ＤＵＫＸ−Ｂ１１、ＤＧ−４４）に導入すると、これらはヌクレオシドが欠失した培地中で増殖が可能になると予想される。このような培地の例は、ヒポキサンチン、チミジンおよびグリシンを含まないハムＦ１２（Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２）である。これらのｄｈｆｒ遺伝子は、同じベクターまたは異なるベクターのいずれかに連結させて凝固因子のｃＤＮＡ転写単位と共に上記のタイプのＣＨＯ細胞に導入することができ、このようにして組換えタンパク質を生産するｄｈｆｒ陽性の細胞系を形成することができる。

上記の細胞系を細胞毒性のｄｈｆｒ阻害剤のメトトレキセートの存在下で増殖させると、メトトレキセート耐性の新しい細胞系が出現することになる。これらの細胞系は、連結されたｄｈｆｒおよび望ましいタンパク質の転写単位の数が増幅されたために、高速で組換えタンパク質を生産することが可能である。高濃度（１〜１００００ｎＭ）のメトトレキセート中でこれらの細胞系を増殖させる場合、極めて高い速度で望ましいタンパク質を生産する新しい細胞系を得ることができる。

上記の望ましいタンパク質を生産する細胞系は、懸濁培養中または様々な固体支持体上のいずれかでラージスケールで増殖することができる。これらの支持体の例は、デキストランまたはコラーゲンマトリックスをベースとしたマイクロキャリアー、または中空糸の形態の固体支持体、または様々なセラミック材料である。細胞懸濁培養中またはマイクロキャリアー上で増殖させる場合、上記の細胞系の培養は、バッチ培養、または長期間にわたり調整培地を連続生産する潅流培養のいずれかとして行うことができる。従って、本発明によれば、上記の細胞系は、望ましい組換えタンパク質を生産するための工業プロセスの開発によく適している。

上記のタイプの分泌細胞の培地中に蓄積する組換えタンパク質は、様々な生化学およびクロマトグラフィー方法によって濃縮したり、精製したりすることができ、このような方法としては、細胞培地中で、望ましいタンパク質とその他の物質とのサイズ、電荷、疎水性、溶解性、特異的な親和性等の差を利用する方法が挙げられる。

このような精製の例は、固体支持体に固定したモノクローナル抗体への組換えタンパク質の吸着である。脱離後、さらにタンパク質を上記の特性に基づく様々なクロマトグラフィー技術によって精製することができる。

本発明の改変された生物活性アルブミン融合凝固因子は、≧８０％純度、より好ましくは≧９５％純度まで精製することが望ましく、そして夾雑高分子物質、特に他のタンパク質及び核酸に関して９９．９％純度より高く、且つ、感染及び発熱因子のない薬剤的に純粋な状態が特に好ましい。好ましくは、本発明の単離又は精製した改変された生物活性アルブミン融合凝固因子は、他の治療用タンパク質と併用して投与される場合を除いて、実質的に他のポリペプチドを含まない。

本発明で説明されているアルブミン融合凝固因子は、治療用途に応じた薬剤に製剤化することができる。精製したタンパク質は、一般的な生理学的に適合する水性緩衝溶液に溶解させてもよく、ここにおいて、医薬製剤を提供するために、水性緩衝溶液に場合により薬学的賦形剤が添加されていてもよい。

このような製薬キャリアーおよび賦形剤、加えて適切な医薬製剤は当該分野で公知である（例えば、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｆｒｏｋｊａｅｒ等，ＴａｙｌｏｒおよびＦｒａｎｃｉｓ（２０００）、または、“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ”，第３版，Ｋｉｂｂｅ等，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０００）を参照）。特に、本発明のポリペプチド変異体を含む薬剤組成物は、凍結乾燥した形態、または安定な可溶性の形態で製剤化されてもよい。このようなポリペプチド変異体は、様々な当業界既知の手法によって凍結乾燥させてもよい。凍結乾燥製剤は、使用前に、１種またはそれ以上の製薬上許容できる希釈剤（例えば滅菌注射用水、または滅菌生理食塩水）を添加することによって再溶解する。

本組成物の製剤は、あらゆる製薬的に適切な非静脈内投与手段によって個体に送達される。様々な送達システムが知られており、これらを用いて、あらゆる便利な経路によって本組成物を投与することができる。優先的には、本発明の組成物は、従来の方法に従って、皮下、筋肉内、腹腔内、大脳内、肺内、鼻腔内、または経皮投与のために、最も好ましくは皮下、筋肉内または経皮投与のために製剤化される。本製剤は、注入、またはボーラス注射によって連続的に投与することができる。いくつかの製剤は、遅延放出系を包含する。

本発明のアルブミン融合凝固因子は、治療上有効な用量で患者に投与され、ここにおいて治療上有効な用量は、耐え難い副作用を引き起こす用量に達することなく、望ましい作用を生じさせ、治療される状態または適応症の重症度または蔓延を予防したり、または減少させたりするのに十分な用量を意味する。正確な用量は、例えば適応症、製剤、投与様式のような多くの要因に依存し、それぞれ個々の適応症について臨床前試験および臨床試験で測定しなければならない。

本発明の医薬組成物は、単独でかまたは他の治療剤と組み合わせて投与され得る。これらの薬剤は、同じ医薬の部分として組み込まれ得る。

３００μｇ／ｋｇ ｒＶＩＩａ−ＦＰおよびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）後のＦＶＩＩ：Ａｇ血漿濃度の時間経過（プール；ｎ＝３／時点；線形スケール） ３００μｇ／ｋｇ ｒＶＩＩａ−ＦＰおよびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）後のＦＶＩＩ：Ａｇ血漿濃度の時間経過（プール；ｎ＝３／時点；対数線形スケール） ６１０μｇ／ｋｇ ｒＩＸ−ＦＰおよびＢｅｒｉｎｉｎ（登録商標）後のＦＩＸ：Ａｇ血漿濃度の時間経過（プール；ｎ＝５／時点；線形スケール） ６１０μｇ／ｋｇ ｒＩＸ−ＦＰおよびＢｅｒｉｎｉｎ（登録商標）後のＦＩＸ：Ａｇ血漿濃度の時間経過（プール；ｎ＝５／時点；対数線形スケール）

（実施例１）ラットにおいて皮下（ｓ．ｃ．）適用されたｒＶＩＩａ−ＦＰのバイオアベイラビリティの評価
最初の実施例に要約される実験の目的は、血管外注射がｒＶＩＩａ−ＦＰ（ヒト）による向上された治療のための選択肢となり得るか否かを評価するためのものであった。血管外治療のための典型的な代表として、皮下注射を選択した。参照製品であるＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）に対するｒＶＩＩａ−ＦＰの適合性を比較するために、表２に示されたデザインでの非臨床的な薬物動態研究を実施した。血漿中濃度の時間経過を等モル用量のｒＶＩＩａ−ＦＰ（ＷＯ ２００７／０９０５８４ ３０〜３１頁に記載された通りに製造されたｐＦＶＩＩ−９３７）およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）をラットに対して単回静脈内／皮下注射後に測定した。ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の用量は３００μｇ／ｋｇとした。ｒＶＩＩａ−ＦＰの用量は、ＯＤ測定（２８０〜３２０ｎｍ）によって測定されるタンパク質濃度に基づいた。ＦＰのアルブミン部分について校正した３００μｇ（ＦＶＩＩａ）／ｋｇの用量を同じように適用した。これにより、両方の製品が治療的に有効な成分であるＦＶＩＩａに関して同じ用量で施用された。ラットを本研究のための動物種として選択したのは、ラットがこの種の研究においてよく特徴づけられ、また頻繁に用いられる種であるからである。ラット（ＣＤ系統）はチャールズ・リバー（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から提供され、実験の間の重さは約２００ｇであった。ラットを標準的な飼育条件下においた。短期麻酔下で、血液サンプルを眼窩後部から（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌｌｙ）採取し、クエン酸カルシウムを用いて１０〜２０％のクエン酸血液に抗凝固処理し、血漿に処理し、そしてＦＶＩＩ血漿濃度の測定のために−２０℃で保存した。サンプリング時間は表２に詳述されている。ヒトＦＶＩＩの血漿中濃度を、捕捉抗体としてヒツジの抗ＦＶＩＩ ＩｇＧ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ／ Ｂｉｏｚｏｌ）および検出抗体としてＰＯＤ標識ヒツジ抗ＦＶＩＩ ＩｇＧ （Ｃｅｄａｒｌａｎｅ／ Ｂｉｏｚｏｌ）を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。標準的なヒト血漿を参照として用いた。ｒＶＩＩａ−ＦＰの発酵、精製および活性化は、他に記載している。

ｒＶＩＩａ−ＦＰの静脈内注射により、同じ用量のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）での処理と比較して約６０％高い初期血漿中濃度が得られた（表３、図１）。ｒＶＩＩａ−ＦＰで皮下処置されたグループについてのみ、ＦＶＩＩが血漿中で検出された。最大濃度は注射後約８時間で観察され、処理後１〜２日間で再びベースラインに到達した。ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）をｒＶＩＩａ−ＦＰと同じＦＶＩＩａ用量で注射したが、同じ用量のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）で皮下処置されたグループについては、血漿中濃度が観察期間を通して検出限界未満のままであった（図２）。

ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）をｒＦＶＩＩａ−ＦＰと同じ用量で注射したが、血漿
濃度は見られなかった。従って、注射後の比較的短い停滞期間（約８時間）および長く続く減衰（すなわち少なくとも１〜２日間）期間後に観察されたピーク濃度により、ｒＶＩＩａ−ＦＰでの皮下処置が十分に検出可能なＦＶＩＩａ血漿中濃度をもたらしたことがわかったことは驚くべきことである。これはさらに、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後のｒＶＩＩａ−ＦＰの時間経過を持続させた。ｒＶＩＩａ−ＦＰの約５０％というＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の低い分子量が、皮下組織からのその再吸収に好都合であったと予測される。この研究の結果は、反対の結果が生じたことを実証している。皮下投与されたｒＶＩＩａ−ＦＰの相対バイオアベイラビリティは約１０％に到達したが、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の皮下注射後の血漿中濃度は検出されなかった。

血液循環への再吸収または輸送に関してｒＶＩＩａ−ＦＰに特に有益な点が存在するか否かを判断するために、ｒＶＩＩａ−ＦＰとＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の相対バイオアベイラビリティを比較することは適切でない場合がある。なぜならば皮下（ｓ．ｃ．）投与されたｒＶＩＩａ−ＦＰのＡＵＣは、その長い末梢における半減期によって支配され得、皮下区画から血液循環へのｒＶＩＩａ−ＦＰの連続的な放出が得られるからである。ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）との比較において、静脈内注射後の末梢における半減期はすでに６倍以上延長していた。さらに、ｒＶＩＩａ−ＦＰおよびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の排出特性は、皮下空間から血液循環へのそれらの輸送または拡散によって差次的に影響を受け得る。従ってこのトピックにおける特有の結果は、ピーク濃度の評価に基づくほうがより確実である。ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）について、血漿濃度は検出限界である２５ｎｇ／ｍＬには決して到達しなかったが、注射後すぐの融合タンパク質については約１４０ｎｇ／ｍＬであった。

第一段階として、血液循環への再吸収または輸送がｒＶＩＩａ−ＦＰと同じであるという仮定のもとに、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）での処置後に期待される血漿濃度を推定することは可能である。静脈内注射でｒＶＩＩａ−ＦＰの回収が６０％高いと校正すると、ピーク血漿濃度は約９０ｎｇ／ｍＬと予測され得る。これは、明らかに検出限界を超えているため、根底にある方法論的な問題を排除し、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）によるｓ．ｃ．処置後の、血漿中のＦＶＩＩの観察を防ぐことができる可能性がある。アルブミンへの融合によって達成される最小の利点を推定する第２段階において、実質的にＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）に有利となるような最も良いケースシナリオを仮定してもよい。これは、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）が実際に血漿中に輸送されるが、達成されたピーク濃度が全ての時点において２５ｎｇ／ｍＬの検出レベルをごくわずかに下回ったままであったので観察することができなかったという仮定に基づく。ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）は血漿中に存在し得る持続期間に関して、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）にとっての最良のケースは、その末梢での半減期が約６倍短いにもかかわらず、ｒＶＩＩａ−ＦＰと同じ時間経過を仮定することである。得られたＡＵＤＣは、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）が５５０ｈ^*ｎｇ／ｍＬ、およびｒＶＩＩａ−ＦＰが約２２００ｈ^*ｎｇ／ｍＬであった。したがって、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）に非常に有利となるシナリオにおいて、血管外注射後のｒＶＩＩａ−ＦＰの生体内回収率は、少なくともＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）よりも約４倍高いということが結論付けられた。

（実施例２）血友病Ｂモデル（ＦＩＸノックアウトマウス）における皮下投与したｒＩＸ−ＦＰのバイオアベイラビリティの評価
血管外注射がｒＩＸ−ＦＰ（ヒト）による向上された治療の選択肢であり得るか否かを評価するために、血管外治療の典型的な代表である皮下注射を選択した。このような実施例を調査する非臨床的な薬物動態学研究のデザインを表４に詳述した。血漿中濃度の時間経過を、血友病Ｂモデルに対する６１０ＩＵ／ｋｇのＢｅｒｉｎｉｎ（登録商標）またはｒＩＸ−ＦＰの単回静脈内／皮下注射後に測定した。ｒＩＸ−ＦＰは、ＷＯ２００７／１４４１７３に従い、実施例１〜３（ｐＦＩＸ−１０８８）に記載されたとおりに生成した。対応群を同じ用量のＦＩＸ：凝固活性で処置した。約２５ｇの重さのＦＩＸノックアウト（ｋｏ）マウスを血友病Ｂモデルとして用いた。これらのマウスは、ＦＩＸ遺伝子のプロモーター領域が欠如しているため、ＦＩＸを発現しない（Ｌｉｎ等 １９９７，Ｂｌｏｏｄ，９０，３９６２−３９６６）。これにより、ノックアウトマウスの血漿中ＦＩＸ活性（すなわち機能的に活性なタンパク質）の定量化によって処置後のＦＩＸレベルを分析することが可能である。短期麻酔下で、血液サンプルを眼窩後部から（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌｌｙ）採取し、クエン酸カルシウムを用いて１０〜２０％のクエン酸血液に抗凝固処理し、血漿に処理し、そしてＦＩＸ活性の測定のために−２０℃で保存した。サンプリング時間は表５に詳述されている。血漿中のＦＩＸ活性の定量は、標準的なａＰＰＴに基づいたアプローチ（ベーリング凝固タイマー）によって実施した。これら動物を標準的な飼育条件下に置いておいた。

ＦＩＸノックアウトマウスに対する６１０Ｕ／ｋｇ Ｂｅｒｉｎｉｎ（登録商標）の皮下注射により、静脈内注射によって達成された血漿中レベルと比較して、血漿中レベルにおけるＦＩＸ活性のわずかな増加が得られた（図３）。皮下投与後のバイオアベイラビリティは約２５％であった。皮下注射後のＦＩＸは、約１〜２日間検出することができた。ｒＦＩＸ−ＦＰに関する結果は、いくつかの局面で明らかに異なっていた：
１）ｒＦＩＸ−ＦＰの皮下注射後のピーク濃度は、非融合野性型ＦＩＸであるＢｅｒｉｎｉｎで見られるよりも約２倍高かった。
２）ｒＦＩＸ−ＦＰでの皮下処置後のバイオアベイラビリティは、Ｂｅｒｉｎｉｎで観察されたものよりもほぼ２倍高かった（２５％と４５％）。
３）Ｂｅｒｉｎｉｎと対照的に、ｒＦＩＸ−ＦＰの皮下注射で達成された血漿中レベルは、後期のｒＦＩＸ−ＦＰ血管内注射で達成された血漿中レベルを超えた。

これらの結果をまとめると、血管外注射は、ｒＩＸ−ＦＰによる向上された治療の価値ある選択肢であることが実証されている。より高いピーク濃度は、出血事象を予防するだけでなくことによると急性の代替治療の可能性さえも切り開いている。バイオアベイラビリティが高いほどより低用量かつ低注射量での施用が可能となり、費用効果を高め、患者の耐容性および安全性を向上することができる。最終的に、予防的な設定において、皮下投与は、静脈内注射後よりもより遅い時点でトラフレベルを達成されるため、治療間隔を広げることさえも可能となる。

（実施例３）：血友病Ａモデル（ＦＶＩＩＩノックアウトマウス）における皮下投与したｒＶＩＩＩ−ＦＰのバイオアベイラビリティの評価
血管外注射がｒＶＩＩＩ−ＦＰ（ヒト）による向上された治療の選択肢であり得るか否かを評価するために、血管外治療の典型的な代表である皮下注射を選択した。実施された可能な非臨床的薬物動態学研究のデザインを表７に詳述した。血漿中濃度の時間経過を、血友病Ａモデルに対するＲｅＦａｃｔｏまたはｒＦＶＩＩＩ−ＦＰの単回静脈内／皮下注射後に測定した。対応群を同じ用量のＦＶＩＩＩ：凝固活性で処置した。約２５ｇの重さのＦＶＩＩＩノックアウト（ｋｏ）マウスを血友病Ａモデルとして用いた。これらのマウスは、エキソン１６および１７を欠いているので、ＦＶＩＩＩを発現しない（Ｂｉ Ｌ．等，Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９５，Ｖｏｌ１０（１），１１９−１２１；Ｂｉ Ｌ．等，Ｂｌｏｏｄ，１９９６，Ｖｏｌ８８（９），３４４６−３４５０）。これにより、ノックアウトマウスの血漿中ＦＶＩＩＩ活性の定量化によって処置後のＦＶＩＩＩレベルを分析することが可能である。処置の概要を表８に示す。短期麻酔下で、血液サンプルを眼窩後部から（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌｌｙ）採取し、クエン酸カルシウムを用いて１０〜２０％のクエン酸血液に抗凝固処理し、血漿に処理し、そしてＦＶＩＩＩ活性の測定のために−２０℃で保存した。サンプリング時間の概要は表７に詳述されている。血漿中のＦＶＩＩＩ活性の定量は、標準的なａＰＰＴに基づいたアプローチ（ベーリング凝固タイマー）によって実施した。その動物を標準的な飼育条件下に置いておいた。
ＦＶＩＩＩノックアウトマウスに対する２００Ｕ／ｋｇ ＲｅＦａｃｔｏの皮下注射により、静脈内注射後に予測された血漿中レベルと比較して、血漿中レベルにおけるＦＩＸ活性のわずかな増加が得られた。ｒＶＩＩＩ−ＦＰ（ヒト）（グループ２および４）での対応する処置との比較により、血管外注射がｒＶＩＩＩ−ＦＰによる向上された治療のための選択肢であるか否かの評価のための結果がもたらされる。

（実施例４）：ＶＷＤまたは血友病Ａモデル（ＶＷＦまたはＦＶＩＩＩノックアウトマウス）における皮下投与したｒＶＷＦ−ＦＰのバイオアベイラビリティの評価
血管外注射がｒＶＷＦ−ＦＰ（ヒト）による向上された治療の選択肢であり得るか否かを評価するために、血管外治療の典型的な代表である皮下注射を選択した。実施された可能な非臨床的薬物動態学研究のデザインを表１０に詳述した。グループ１、２および４〜６は、この表中に詳述したように処置し、適切な場合他の用量のＶＷＦ：Ａｇを注射した。血漿中レベルの時間経過を、血友病Ａまたはフォン・ウィルブランド病（ＶＷＤ）モデル動物に対するＨａｅｍａｔｅ（登録商標）Ｐ、ｒＶＷＦ−ＦＰまたはＶＷＦのグリコシル化変異体の単回静脈内／皮下注射後に測定した。対応群を同じ用量のＶＷＦ：Ａｇで処置した。約２５ｇの重さのＦＶＩＩＩノックアウト（ｋｏ）マウスを血友病Ａモデルとして用いた。これらのマウスは、エキソン１６および１７を欠いているので、ＦＶＩＩＩを発現しない（Ｂｉ Ｌ．等，Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９５，Ｖｏｌ１０（１），１１９−１２１；Ｂｉ Ｌ．等，Ｂｌｏｏｄ，１９９６，Ｖｏｌ８８（９），３４４６−３４５０）。約２５ｇの重さのＶＷＦノックアウト（ｋｏ）マウスをＶＷＤモデルとして用いた。これらのマウスは、ＶＷＦ遺伝子のエキソン４および５を欠いているので、ＶＷＦを発現しない（Ｄｅｎｉｓ Ｃ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，Ｖｏｌ９５，９５２４−９５２９）。

処置の概要を表６に示す。短期麻酔下で、血液サンプルを眼窩後部から（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌｌｙ）採取し、クエン酸カルシウムを用いて１０〜２０％のクエン酸血液に抗凝固処理し、血漿に処理し、そしてＦＶＩＩＩ活性の測定のために−２０℃で保存した。サンプリング時間は表７に詳述されている。血漿中のヒトＶＷＦ：Ａｇの定量は、市販されているＥＬＩＳＡ試験キット（Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ（登録商標）、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）によって実施した。これらの動物を標準的な飼育条件下に置いておいた。

マウスに対する約１４００Ｕ／ｋｇのＶＷＦ：Ａｇ Ｕ／ｋｇ Ｈａｅｍａｔｅ（登録商標）Ｐの皮下注射により、静脈内注射後に予測された血漿中レベルと比較して、血漿におけるヒトＶＷＦ：Ａｇの増加が得られた。ｒＶＷＦ−ＦＰ（ヒト）での対応する処置（グループ２および５）、ならびにＶＷＦグリコシル化変異体での対応する処置（グループ３および６）との比較により、血管外注射がｒＶＩＩＩ−ＦＰおよびＶＷＦグリコシル化変異体による向上された治療のための選択肢であるか否かの評価のための結果がもたらされる。

Claims (3)

1. 血友病Ｂの治療および予防処置における皮下投与のための、アルブミン融合凝固第ＩＸ因子を含んでなる医薬製剤であって、ここで、皮下投与後のアルブミン融合凝固第ＩＸ因子の生体内回収率が、非融合の凝固第ＩＸ因子の皮下投与後の生体内回収率と比較して、少なくとも１０％増加しており、ここで該生体内回収率が皮下投与後少なくとも６０分後に測定される、上記医薬製剤。
2. 凝固第ＩＸ因子がペプチドリンカーを介してアルブミンに結合する、請求項１に記載の医薬製剤。
3. ペプチドリンカーがタンパク質分解的切断可能である、請求項２に記載の医薬製剤。

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